DE69233348T2 - Verwendung von allosterischen hämoglobinmodifikatoren zur verringerung der sauerstoffaffinität im blut - Google Patents

Verwendung von allosterischen hämoglobinmodifikatoren zur verringerung der sauerstoffaffinität im blut Download PDF

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Description

  • Vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Familie von Verbindungen und deren Anwendung als Medikament zur Einstellung des allosterischen Gleichgewichts von Hämoglobin in Richtung eines niederen Sauerstoffaffinitätszustands. Überdies zieht die Erfindung die Verwendung der Verbindungsfamilie für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten in Betracht, welche einen Sauerstoffmangel mit sich bringen, bei der Wundheilung und der Wiederherstellung der Sauerstoffaffinität von gelagertem Blut.
  • BESCHREIBUNG DES STANDS DER TECHNIK
  • Hämoglobin ist ein tetramäres Protein, weiches Sauerstoff über einen allosterischen Mechanismus liefert. Sauerstoff bindet sich an die vier Häme des Mämoglobinmoleküls. Jedes Häm enthält Porphyrin und Eisen in zweiwertigem Zustand. Die Eisen(II)-Sauerstoff-Bindung ist leicht reversibel. Das Binden des ersten Sauerstoffmoleküls an ein Häm erfordert eine viel größere Energie als des zweiten Sauerstoffmoleküls. Das Binden des dritten Sauerstoffs erfordert noch weniger Energie, und des vierten Sauerstoffs erfordert die geringste Energie für die Bindung. Hämoglobin hat zwei α- und zwei β-Untereinheiten, welche mit einem zweifachen Symmetrie angeordnet sind. Die α- und β-Dimeren drehen sich während der Sauerstofffreigabe, um einen zentralen Wasserhohlraum zu öffnen. Der allosterische Übergang, der die Bewegung des α-β-Dimeren mit sich bringt, tritt zwischen der Bindung des dritten und vierten Sauerstoffs auf. Die α1β1-Grenzflächenbindung ist dichter als α1α1 oder α1β2-Grenzflächen.
  • Im Blut ist Hämoglobin im Gleichgewicht zwischen zwei allosterischen Strukturen. Im Zustand „T" (für gespannt) ist Hämoglobin deoxygeniert. Im Zustand „R" (für Endstand) ist Hämoglobin oxygeniert. Es kann eine Sauerstoffbleichgewichtskurve abgetastet werden, unter Verwendung eines gut bekannten Geräts, wie z. B. des AMINCO® HEM-O-SCAN, die Affinität und den Grad der Zusammenarbeit (allosterische Wirkung) von Hämoglobin zu beobachten. Bei der Abtastung wird auf der Y-Achse der Prozentsatz der Hämoglobinoxygenierung aufgetragen, und auf der X-Achse der Sauerstoffpartialdruck in mm Quecksilbersäule (mm Hg). Wenn eine horizontale Linie von dem Punkt der 50%igen Sauerstoffsättigung zur abgetasteten Kurve gezogen wird, und eine vertikale Linie vom Schnittpunkt der horizontalen Linie mit der Kurve zur Partialdruck-X-Achse gezogen wird, wird ein allgemein als P50 bekannte Wert bestimmt (d.h., dieser ist der Druck in mm Hg, wenn die abgetastete Hämoglobinprobe zu 50% mit Sauerstoff gesättigt ist. Unter physiologischen Bedingungen (d.h. 37°C, pH-Wert = 7,4, und einen Kohlendioxidpartialdruck von 40 mmHg) ist der Wert P50 für normales adultes Hämoglobin (HbA) etwa 26,5 mm Hg. Wenn für das unter dem Test befindliche Hämoglobin ein P50-Wert erhalten wird, der geringer als normal ist, wird die abgetastete Kurve als „links verschoben" erachtet, und die Anwesenheit von Hämoglobin hoher Affinität wird angezeigt. Umgekehrt wird, wenn ein P50-Wert, der höher als normal ist, für das unter dem Test befindliche Hämoglobin erhalten wird, die abgetastete Kurve als „rechts verschoben" erachtet, und es wird die Anwesenheit von Hämoglobin niederer Affinität angezeigt.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass die Beeinflussung des allosterischen Gleichgewichts von Hämoglobin ein gangbarer Weg des Angriffs zur Behandlung von Krankheiten ist. Die Umwandlung von Hämoglobin zu einem Zustand hoher Affinität wird in der Regel als vorteilhaft für die Lösung von Problemen mit Deoxyhämoglobin-S (Sichelzellenanämie) angesehen. Es wird angenommen, dass die Umwandlung von Hämoglobin zu einem Zustand niederer Affinität eine allgemeine Brauchbarkeit bei den verschiedensten Krankheitszuständen hat, wo Gewebe unter geringer Sauerstoffspannung leiden, wie z. B. Ischämie und Strahlensensibilisierung von Tumoren. Es wurden mehrere synthetische Verbindungen identifiziert, welche bei der allosterischen Regulierung von Hämoglobin und anderen Proteinen Brauchbarkeit besitzen. Beispielsweise sind verschiedene neue Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von Sichelzellenanämie, welche die allosterische Regulierung von Hämoglobin mit sich bringen, in U.S.-Patent 4.699.926 von Abraham u.a., U.S.-Patent 4.731.381 von Abraham u.a., U.S. Patent 4.731.473 von Abraham u.a., U.S.-Patent 4.751.244 von Abraham u.a., und U.S.-Patent 4.887.995 von Abraham u.a. angegeben. Ferner werden in Perutz, „Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins", Quarterly Reviews of Biophysics 22, 2 (1989), S. 163–164, und auch Lalezari u.a. "LR16, a compound with potent effects on the oxygen affinity of hemoglobin, on blood cholesterol, and on low density lipoprotein", („LR16, eine Verbindung mit starken Wirkungen auf die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin, auf Blutcholesterin und Lipoprotein niederer Dichte") Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85 (1988), S. 6117–6121, Verbindungen, welche wirksame Modifikatoren allosterischen Hämoglobins sind, diskutiert. Ferner zeigte Perutz u.a., dass ein bekanntes Antihyperlipoproteinämie-Arzneimittel, Bezafibrat, in der Lage ist, die Affinität von Hämoglobin für Sauerstoff herabzusetzen (vgl. „Bezafibrate lowers oxygen affinity of hemoglobin", Lancet 1983, 881). Die Deutsche Patentanmeldung DE 21 49 070 von Witte u.a. offenbart Phenoxyalkylcarbonsäurederivate der Formel
    Figure 00030001
    worin R1 ein Wasserstoff oder ein Halogenatom ist, R2 ein Wasserstoffatom oder eine Methoxygruppe, R3 und R4 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe sind, n 1 bis 3 ist, und Z eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe mit bis zu 2 Kohlenstoffatomen ist.
  • Die Deutsche Patentanmeldung DE 24 32 560 von Witte u.a. offenbart Phenoxyalkylcarbonsäurederivate der Formel
    Figure 00040001
    worin R1 und R2 ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine niedere Methoxygruppe oder eine niedere Alkylgruppe sind, R3 und R4 ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe sind, n 1 bis 3 ist, und Z eine Hydroxy- oder niedere Alkoxygruppe ist. Jedoch ziehen die Patentanmeldung von Witte u.a. die Verwendung der Verbindungen zur Herabsetzung der Serumlipidspiegel in Betracht. Die Patentanmeldungen von Witte u.a. stellen keine Angaben des möglichen Gebrauchs der Verbindungen für eine Modifikation allosterischen Hämoglobins bereit.
  • Die Veröffentlichung von Randad, R. u.a., „Allosteric Modifiers of Hemoglobin 1. Design, Synthesis, Testing and Structure-Allosteric Activity Relationship of Novel Hemoglobin Oxygen Affinity Decreasing Agents" in J. Med. Chem. 1991, 34, 752-757 und die Veröffentlichung Wireko, F. u.a. „Allosteric Modifier of Hemoglobin 2.
  • Crystallographically Determined Binding Sites and Hydrophobic Binding/interaction Analysis of Novel Hemoglobin Oxygen Effectors" in J. Med. Chem. 1991, 34, 758–767 offenbart allosterische Modifikatoren von Hämoglobin der Formel
    Figure 00040002
    worin R2 ein Wasserstoff- oder Chloratom, R3 ein Wasserstoffatom, CH3 oder Chlor ist, R4 ein Wasserstoffatom, CH3, CF3, iPr oder Chlor ist, R5 ein Wasserstoffatom, CH3 oder ein Chloratom ist, R6 ein Wasserstoff- oder Chloratom ist, X CO, CH2 oder NH ist, Y NHCH2, NH oder CO ist, und Z CH2 oder NH ist.
  • Jedoch sind diese Verbindungen in ihrer Wirkung in vivo nicht befriedigend und zeigen eine zeitabhängige Veränderung ihres Werts P50.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Ziel vorliegender Erfindung ist infolgedessen die Bereitstellung einer Familie von Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verwendung zur allosterischen Modifizierung von Hämoglobin, so dass das Hämoglobin im Blut im Zustand einer geringeren Sauerstoffaffinität vorliegt.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verlängerung der Lagerungsdauer von Blut durch Zugabe von Verbindungen innerhalb einer speziellen Verbindungsfamilie zum Blut.
  • Gemäß der Erfindung ist eine Hämoglobin allosterisch modifizierende Verbindungsfamilie durch die Formel
    Figure 00050001
    definiert,
    worin X, Y und Z CH2, NH, CO, O oder N sind, mit dem Vorbehalt, dass die Reste X, Y und Z jeweils voneinander verschieden sind,
    wobei R2 ein substituierter oder unsubstituierter Alkylringrest oder ein substituierter oder unsubstituierter aromatischer Rest der Formel
    Figure 00060001
    ist,
    wobei R3-7 entweder Wasserstoff, Halogen, eine substituierte oder unsubstituierte C1-3-Alkylgruppe oder ein C1-3 Ether oder Ester sind, wobei diese Reste gleich oder unterschiedlich sein können, oder Alkylreste eines aromatischen oder aliphatischen Rings, der zwei der R3-7-Stellen umfasst, sind, dadurch gekennzeichnet, dass R1 die Formel
    Figure 00060002
    hat, wobei R1 an jede Stelle des Phenylrings gebunden sein kann und R8 und R9 Alkylreste als Teil eines aliphatischen Rings sind, der R8 und R9 verbindet, und wobei R10 Wasserstoff, Halogen, ein C1-3 Niederalkyl oder ein Salzkation ist.
  • Viele Verbindungen innerhalb dieser Familie wurden synthetisiert, und ihre Wirkung auf den P50-Wert von Hämoglobin wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass jede dieser getesteten Verbindungen den P50-Wert von Hämoglobin erhöht; deshalb sind die Verbindungen fähig, das allosterische Gleichgewicht von Hämoglobin in Richtung eines Zustands zu bringen, welcher den Zustand einer geringen Sauerstoffaffinität begünstigt. Ferner wurde gefunden, dass die Verbindungen den Grad der Sauerstoffdissoziierung von Hämoglobin in über ausgedehnte Zeiträume gelagertem Blut zu stabilisieren. Auch wurde gefunden, dass die Verbindungen von Mäusen gut toleriert werden, wenn sie als intraperitoneale Dosis verabreicht werden.
  • Weil die durch vorliegende Erfindung definierten Verbindungen innerhalb der Familie fähig sind, das allosterische Gleichgewicht von Hämoglobin in Richtung des Zustands „T" geringer Affinität zu verschieben, besitzen sie die Fähigkeit, zu bewirken, dass Hämoglobin mehr Sauerstoff an Gewebe abgibt. Somit sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen als antiischämische Mittel, als Sensibilisatoren für die Röntgenbestrahlung in der Krebstherapie als Wundheilmittel, bei der Behandlung von Erkrankungen, die sich auf niedere Sauerstofflieferung im Gehirn beziehen, wie z. B. bei der Alzheimer-Krankheit, Depression und Schizophrenie, bei der Herstellung von Blutersatz und bei der Lagerung von Blut wertvoll sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die vorhergehenden und anderen Ziele, Aspekte und Vorteile werden anhand der nachfolgenden detaillierten Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen besser verstanden, in denen:
  • 1a eine chemische Struktur ist, welche eine besonders bevorzugte Gruppe innerhalb der bei vorliegender Erfindung verwendeten Verbindungsfamilie ist;
  • 1b und 1c chemische Strukturen sind, welche zwei Untergruppen der in 1a definierten Familie sind;
  • 2a–b zeigen chemische Strukturen von Vorläuferverbindungen, angeordnet in Reaktionsschemen für die Herstellung von Verbindungen, welche als Zwischenprodukte für die Synthese von Verbindungen innerhalb einer ersten Gruppe von Vergleichsbeispielen brauchbar sind;
  • 2c zeigt chemische Strukturen, einschließlich der Zwischenprodukte, die wie in 2a bis 2b gezeigt, hergestellt wurden, angeordnet in einem Reaktionsschema zur Herstellung der ersten Gruppe von Vergleichsbeispielen;
  • 4 zeigt chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, zur Herstellung einer zweiten Gruppe der Vergleichsbeispiele;
  • 6a zeigt chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, das eine Alternative zu demjenigen ist, das in 4 gezeigt wird, zur Herstellung von Verbindungen innerhalb einer Gruppe bevorzugter Verbindungen;
  • 7a und 7b zeigen chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, zur Herstellung von Verbindungen innerhalb einer dritten Gruppe von Vergleichsbeispielen;
  • 8 ist eine Tabelle, welche die gemessenen P50-Werte für Hämoglobin in Lösung zeigt, wo die Zugabe eines jeden der Vergleichsbeispiele zur allosterischen Modifikation von Hämoglobin in Richtung des Zustands einer niederen Sauerstoffaffnität gezeigt wird;
  • 9 ist eine der in 8a gezeigten ähnlichen Tabelle mit der Ausnahme, dass die gemessenen P50-Werte für intakte, menschliche rote Blutkörperchen (im Gegensatz in einer Hämoglobinlösung) gelten, die einigen der Vergleichsbeispiele ausgesetzt wurden;
  • 10 ist ein Schaubild, welches die Sauerstoffdissoziationskurven veranschaulicht, gebildet, wenn eine 5,4 millimolare Lösung normalen Hämoglobins in Gegenwart und in Abwesenheit ausgewählter Vergleichsbeispiele beim pH-Wert 7,4 unter Verwendung von HEPES als Puffer in einem Analysengerät für die Sauerstoffdissoziation Hem-O-Scan getestet wird;
  • 11 ist ein 10 ähnliches Schaubild, welches die Sauerstoffdissoziationskurven für menschliches Vollblut in Gegenwart und Abwesenheit von ausgewählten Vergleichsbeispielen veranschaulicht;
  • 12 ist ein 10 ähnliches Schaubild, wo die gebildeten Sauerstoffdissoziationskurven für eine 5,4 millimolare Lösung normalen Hämoglobins in Gegenwart und Abwesenheit spezieller Vergleichsbeispiele gelten, einschließlich 2,3-Diphosphoglycerat, das die Substanz ist, welche der Bewirker des natürlichen allosterischen Hämoglobins ist, und beim pH-Wert 7,4 unter Verwendung von HEPES als Puffer in einem Analysengerät für die Sauerstoffdissoziation Hem-O-Scan getestet werden;
  • 13 ist eine Tabelle, welche die Wirkung einer 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) auf menschliche rote Blutzellen zeigt, die in einer Adsolfomulierung gelagert werden;
  • 14 ist ein Balkenschaubild, das den Prozentsatz Sauerstoff zeigt, der von frisch gelagerten bzw. in Gegenwart von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C2OH23NO4), gepackten Zellen, geliefert wird;
  • 15 ist eine Tabelle, welche diese Änderung in den P50-Werten von veralteten gepackten roten Blutzellen bei der Behandlung mit 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (genannt RSR-13) zeigt.
  • DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Um jetzt auf die Zeichnungen zurückzukommen und insbesondere auf die 1a bis c, welche die allgemeine Strukturformel von besonders bevorzugten Verbindungen veranschaulicht, die zur Verwendung in vorliegender Erfindung in Betracht gezogen werden, bzw. erste und zweite Untergruppen der allgemeinen Strukturformel zeigen. Unter Bezugnahme auf die allgemeinen Strukturformel der 1a können die Reste X und Z CH2, CO NH oder O sein, und der Rest Y kann CO oder NH sein, mit dem Vorbehalt, dass die Reste X, Y und Z jeweils voneinander verschieden sind. Ferner sind die Reste R3 bis R7 entweder Wasserstoff, Halogen, eine substituierte oder unsubstituierte C1- bis C3-Alkylgruppe (mit einer Länge von bis zu 3 Kohlenstoffen) oder ein C1- bis C3-Ester oder Ether, und diese Reste können gleich oder verschieden sein, oder Alkylreste aliphatischer oder aromatischer Ringe, welche zwei benachbarte Stellen R3- bis R7 umfassen. Die Stellungen R8- bis R9 sind Alkylreste als Teil eines aliphatischen Rings (wie z. B. eines Cyclobutyltings) welcher R8 und R9 verbindet. Die Stellung R10 ist ein Wasserstoff, Halogen, ein niederer Alkylrest mit 1–3 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl oder Propyl oder ein Salzkation wie Natrium, Kalium oder Ammonium.
  • In der ersten Untergruppe von Verbindungen, definiert in 1b, können X und Z jeweils CH2, NH oder O sein, mit dem Vorbehalt, dass, wenn X CH2 ist, Z entweder NH oder O ist, wenn X NH ist, Z entweder CH2 oder O ist, und wenn X O ist, Z NH oder CH2 ist.
  • Bei der zweiten Untergruppe in 1 c definierter Verbindungen kann X und Z jeweils CO oder CH2 sein, mit dem Vorbehalt, dass, wenn X CO ist, Z CH2 ist, und wenn X CH2 ist, Z CO ist.
  • Die Substituenten R3- bis R10 in den 1b bis c sind die gleichen wie diejenigen, welche unter Bezugnahme auf 1a definiert sind. Die Synthese spezieller Vergleichsbeispiele wird im Folgenden unter Bezugnahme auf 2 bis 7 bereit gestellt. Alle Verbindungen, die hergestellt wurden, wurden durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Reinheit getestet, und der Strukturerklärung lag NMR- und IR-Spektroskopie und Elementaranalyse zugrunde.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 1
  • 2A veranschaulicht ein Reaktionsschema zur Herstellung von 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure, eine Verbindung, die als ein Vorläufer bei der Herstellung der Vergleichsbeispiele der Gruppe I brauchbar ist. Gemäß dem Schema der 2A werden 8g (0,2 Mol) pulverisiertes Natriumhydroxid zu einer Suspension von 5,28 g (0,035 Mol) p-Acetaminophenol in 23 g (0,4 Mol) Aceton zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur eine halbe Stunde gerührt. Danach werden 3,58 g (0,03 Mol) Chloroform tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und das Aceton wird unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird in Wasser (10 ml) gelöst, gefolgt von Ansäuern mit 37%iger Salzsäure (HCl) zur Herstellung eines hellgelben Niederschlags von 2-(4-(Acetaminophenoxy)-2-methylpropionsäure (5 g, Ausbeute: 60%), die aus Methanol kristallisiert wird, Fp. 69°–71°C.
    1H NMR: (CD3OD) δ 7,1 (m, 4H) ArH, 2,05 (s, 3H), CH3, 1,45, (s, 6H) 2CH3
    1,18 g (0,005 Mol) der 2-(4-Acetaminophenoxy)-2-methylpropionsäure wird in 10%iger Kalilauge (60 ml) eine halbe Stunde zum Sieden erwärmt. Die Lösung wird sodann abgekühlt und mit Essigsäure angesäuert, wobei 0,6 g (Ausbeute: 62%) 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure als gelblichweißes Pulver vom Fp. 214°-216°C anfallen.
    1H NMR: (DMSOd6+TMS) δ 6,6 (m, 4H) ArH, 1,35 (s, 6H, 2CH3).
  • VERGLEICHSBEISPIEL 2
  • 2B veranschaulicht ein anderes Reaktionsschema zur Herstellung von 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure. Gemäß dem Schema der 2B werden 8g Kaliumhydroxid in 32 ml Wasser gelöst, und die erhaltene Kalilauge wird mit 280 ml 3%igem Wasserstoffperoxid vermischt. 11,3 g (0,058 Mol) 2-(4-Cyanphenoxy)-2-methylpropionsäure wird langsam zur KOH/H2O2-Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wird etwa 1 Stunde gerührt, bis die exotherme Reaktion und die Gasentwicklung aufhört. Das Gemisch wird sodann abgekühlt und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Die 2-[4-(Carboxamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure als Produkt wird als weißer Feststoff (9,8 g, Ausbeute: 79%) erhalten. Das Produkt wird aus Ethanol kristallisiert, um reine weiße Kristalle vom Fp. 202°–204°C zu ergeben.
  • 5,57 g (0,025 Mol) der 2-[4-(Carboxamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure wird allmählich zu 100 ml einer eiskalten wässerigen Lösung zugegeben, welche 4,4 g (0,025 Mol) Brm und 11 g (0,25 Mol) Natriumhydroxid enthält. Die so erhaltene Lösung wird ½ Stunde auf 75°C erwärmt. Nach Abkühlen der Lösung wird sie mit Essigsäure angesäuert, wobei die gewünschte 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure als 4,0 g (Ausbeute: 81 %) eines weißen Niederschlags vom Fp. 214°-216°C als Produkt anfällt. Die Verbindung ist mit dem im Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Produkt identisch.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 3
  • 2C veranschaulicht ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von 2-[4-(Arylacetamido)phenoxy]-2-methylpropionsäuren der Gruppe I. Gemäß dem veranschaulichten Schema wird 1 g (0,005 Mol) 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure unter Rühren in 10 ml Wasser mit einem Gehalt an 0,41 g (0,1 Mol) NaOH gelöst. Diese Lösung wird mit 0,79 g (0,005 Mol) Phenylacetylchlorid in 5 ml Tetrahydrofuran (THF) allmählich innerhalb eines Zeitraums von etwa 15 Minuten versetzt. Nach Abschluss der Zugabe sollte der pH-Wert des Reaktionsgemischs alkalisch sein (wenn nicht zur Gewährleistung der Alkalinität wenige Tropfen von 2N Natronlauge zugegeben werden). Das Reaktionsgemisch wird kontinuierlich 1 Stunde gerührt. Danach wird das THF im Vakuum abgedampft, und die Lösung wird sodann mit 5 ml Wasser verdünnt und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Produkt wird mit Ethylether (2 × 20 ml) extrahiert, mit Wasser (3 × 20 ml) gewaschen und sodann über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Nach Zugabe von Petrolether zur Etherlösung fallen 0,9 g (Ausbeute: 56%) der 2-[4-(Phenylacetamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure als Produkt als hellbrauner Feststoff vom Fp. 173°–175°C aus.
    1H NMR: (DMSOd6) 10 (s, 1H, COOH), 7,5–6,7 (m, 9H, ArH), 3,55 (s, 2H, CH2), 1,4 (s, 6H, 2CH3)
    Analyse: C18H19NO4
    ber. C 69,00 H 6,07 N 4,47
    gef. C 68,86 H 6,14 N 4,42
  • VERGLEICHSBEISPIEL 7
  • 4 veranschaulicht ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von Vergleichsbeispielen der Gruppe II der Erfindung. Gemäß dem veranschaulichten Schema werden 5,2 g (34 mMol) 4-Hydroxyphenylessigsäure (HPAA) mit einem Überschuss von Thionylchlorid (SOCl2) ½ Stunde zum Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird sodann abgekühlt, und überschüssiges SOCl2 wird unter Vakuum abgezogen. Der Rest wird 2 Stunden mit 6,3 g (68 mMol) Anilin in 50 ml rückfließendem Xylol umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird sodann abgekühlt, mit verdünnter Salzsäure, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und mit wässeriger 2N Natronlauge extrahiert. Die vereinte Alkalischicht wird mit Ether gewaschen, gekühlt und angesäuert, wobei 7 g festes N-Phenyl-4-hydroxybenrylamid (C14H12NO2) als Zwischenprodukt (Ausbeute: 90%, Fp. 138°C) anfallen. Das Zwischenprodukt wird aus einem Gemisch im Verhältnis 1:2 von Aceton und Petrolether umkristallisiert, und ein Anteil von 1,13 g (5 mMol) wird 12 Stunden unter Anwendung des Verfahrens des Vergleichsbeispiels 1 mit 20 ml Aceton 2,75 g NaOH und 1,25 ml CHCl3 O-alkyliert. Das Endprodukt ist 2-[4-((((Phenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18N19NO4), 1,2 g (Ausbeute: 76%) vom Fp. 198°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 8
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 8,6 g (68 mMol) 4-Chloranilin anstelle von Anilin wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Chlorphenyl)-4-hydroxybenzylamid (C14H12ClNO2), 7,5 g (Aus beute: 84%), vom Fp. 163°C. 1,3 g des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-(4-((((Chlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4), 0,86 g (Ausbeute: 50%), Fp. 196°C O-alkyliert.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 9
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 2,6 g (17 mMol) HPAA und von 5,67 g (35 mMol) 3,4-Dichloranilin anstelle von Anilin wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,4-Dichlorphenyl-4-hydroxybenzylamid (C14H11Cl2NO2). 1,48 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-(((3,4-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) O-alkyliert; 0,76 g (Ausbeute: 40%), Fp. 174°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 10
  • Unter Verwendung von 2,6 (17 mMol) HPAA und von 5,7 g (35 mMol) 3,5-Dichloranilin anstelle von Anilin wurde das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,5-Dichlorphenyl-4-hydroxybenzylamid (C14H11Cl2NO). Zur Herstellung von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4), 0,8 g (Ausbeute: 42%), Fp. 138°C, werden 1,48 g ( 5 mMol) des Zwischenprodukts O-alkyliert.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 11
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 0,95 g (6 mMol) HPAA, 2,6 g (12 mMol) 3,4,5-Trichloranilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,4,5-Trichlorphenyl)-4-hydroxybenzylamid. Unter Verwendung von 10 ml Aceton, 0,82 g NaOH und 0,37 ml CHCl3 werden 0,50 g (1,5 mMol) des Zwischenprodukts O-alkyliert, um 2-[4-((((3,4,5-Trichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H16Cl3NO4), 0,27 g (Ausbeute: 43%), Fp. 160°C, herzustellen.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 12
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04 g (32 mMol) HPAA, 6 ml (64 mMol) 4-Fluoranilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Fluorphenyl)-4-hydroxybenzylamid. 1,22 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird O-alkyliert, um 2-[4-((((4-Fluorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18FNO4), 0,74 g (Ausbeute: 45%), Fp. 198°C, herzustellen.
  • Vergleichsbeispiel 13
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04 (32 mMol) HPAA, 8,05 ml (64 mMol) 4-Trifluormethylanilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Trifluormethylphenyl)-4-hydroxybenzylamid. 1,5 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((4-Trifluormethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C19H18F3NO4), (0,85 g (Ausbeute: 44%), Fp. 197°C, verwendet.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 14
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04 g (32 mMol) HPAA, 8 g (65 mMol) 4-Methylanilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Methylphenyl)-4-hydroxybenzylamid. 1,2 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((4-Methylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxyl]-2-methylpropionsäure (C19H21NO4), 0,98 g (Ausbeute: 65%) Fp. 164°C, herzustellen.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 15
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 3,26 (21 mMol) HPAA, 5,3 ml (42 mMol) 3,5-Dimethylanilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,5-Dimethylphenyl)-4-hydroxybenzylamid. 1,27 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4), 1,15 g (Ausbeute: 68%), Fp. 85°C, verwendet. Alternativ kann das in der Deutschen Patentanmeldung 2.432.560 dargestellte Verfahren nachvollzogen werden, welche durch Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird, zur Herstellung der Verbindung dieses Vergleichsbeispiels 15 nachvollzogen werden.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 16
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04 g (32 mMol) HPAA, 10 ml (64 mMol) 4-Isopropylanilin anstelle von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Isopropylphenyl)-4-hydroxybenzylamid. 134 g (5 mMol der halbfesten, dicken, viskosen Flüssigkeit als Zwischenprodukt werden zur Herstellung von 2-[4-((((4-Isopropylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C21H25NO4), 1,1 g (Ausbeute: 61%) Fp. 141 °C, verwendet.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 18
  • Als eine Alternative zum im Vergleichsbeispiel 7 beschriebenen und in 4 gezeigten Reaktionsschema können die Vergleichsbeispiele der Gruppe 1 gemäß dem in 6a gezeigten Schema hergestellt werden. 5,2 g (32 mMol) HPAA, 6,3 g (68 mMol) Anilin und 25 ml Mesitylen werden unter Rückfluss erwärmt. 0,74 g (8 mMol) Phosphorpentachlorid wird zum Gemisch unter Rückfluss zugegeben und der Rückfluss wird weitere zwei Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird we sentlich gekühlt, mit verdünnter Salzsäure, Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und mit wässeriger 2N NaOH extrahiert. Die vereinte alkalische Schicht wird mit Ether gewaschen, gekühlt und angesäuert, um 7 g (Ausbeute: 90%) eines festen Zwischenprodukts vom Fp. 138°C, N-Phenyl-4-hydroxybenzylamid (C14H12NO2) zu erhalten. Das Zwischenprodukt wird aus einem Gemisch im Verhältnis 1:2 von Aceton zu Petrolether umkristallisiert, und ein Anteil von 1,13 g (5 mMol) wird O-alkyliert. 1,6 g (30 mMol) des pulverisierten Natriumhydroxids wird zu einer Lösung von N-Phenyl-4-hydroxybenzamid (1,13 g, 5 mMol) in 20 ml Aceton zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und das Aceton wird unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und mit 2 N Salzsäure unter Bildung eines hellgelben Feststoffs angesäuert. Der Feststoff wird abgetrennt, in Methanol gelöst, mit Aktivkohle behandelt, und das Lösungsmittel wird verdampft, um so 2-[4-((((Phenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H19NO4), 1,2 g (Ausbeute: 76%), Fp. 198°C zu ergeben. Die letzte Stufe beim in 6a gezeigten Verfahren ist die Umwandlung der Säure in das Natriumsalz über ihre Umsetzung mit Natriumbicarbonat. Ähnliche Umsetzungen mit anderen Salzkationen, wie Kalium und Ammonium oder Umsetzungen zur Bildung von Estern können auch durchgeführt werden.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 20
  • Unter Bezugnahme auf die 7a, wird ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von 2-[4-Aminomethyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure, eine Verbindung, die als Vorläufer für die Herstellung der Vergleichsbeispiele der Gruppe III brauchbar ist, vorgestellt. Gemäß dem veranschaulichten Schema wurden 2-[4-Cyanophenoxy]-2-methylpropionsäure (2g, 9 mMol), hergestellt wie im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, und 75 ml Ethanol in eine 250 ml Parr-Hydrierungsflasche gefüllt. Die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure (3 ml) angesäuert, wonach das Gemisch mit 10% Palladium auf Aktivkohle (0,2 g, 10 Gew.%) versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Parr-Hydrierungsvorrichtung bei 45 psi Wasserstoffdruck gebracht und während 2 Stunden geschüttelt. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert, und das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Die Zugabe von Ether fällte das Chlorwasserstoffsalz des gewünschten Produkts als weiße glänzende Kristalle (2,1 g, 87%) aus.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 21
  • 7b veranschaulicht ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung der Vergleichsbeispiele der Gruppe III. In Übereinstimmung mit der Veranschaulichung wurde ein Lösung von Benzoylchlorid (0,14 g, 1 mMol) in THF (3 ml) innerhalb von 15 Minuten zu einer gerührten Lösung von 2-[4-(Aminomethyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (0,24 g, 1 mMol) und NaOH (0,08 g, 2 mMol) in 10 ml Wasser zugegeben. Nach Abschluss der Zugabe des Benzoylchlorids wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. THF wurde im Vakuum abgedampft. Das Ansäuern des Rückstands führte zur gewünschten Verbindung als ein Öl, das mit Ether extrahiert wurde. Die organische Schicht wurde mit Wasser, Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Zugabe von Petrolether fiel 2-[4-(Benzoylamino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H19NO4) als weißer Feststoff (0,15 g, 48%) vom Fp. 176°–179°C an.
    NMR: (DMSO-d6) δ 1,45 (6H, s, 2CH3), 4,4 (2H, d, CH2), 6,8–7,2 (4H, dd, J=9 Hz, aromatischer H, 7,4–8 (5H, m, aromatischer H), 9, 1H, br t, NH).
  • VERGLEICHSBEISPIEL 22
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird unter Verwendung von 2-Chlorbenzoylchlorid (1 mMol) anstelle von Benzoylchlorid wiederholt. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 58%) 2-[4-(((2-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) vom Fp. 135°–137°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 23
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird mit der Ausnahme wiederholt, dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3-Chlorbenzoylchlorid ersetzt wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 53%) 2-[4-(((3-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) Fp. 145°–146°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 24
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 4-Chlorbenzoylchlorid ersetzt wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 63%) 2-[4-(((4-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) vom Fp. 186°–189°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 25
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass anstelle von Benzoylchlorid 1 mMol 3,4-Dichlorbenzoylchlorid verwendet wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 57%) 2-[4-(((3,4-Dichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) vom Fp. 186°–189°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 26
  • Es wird das Verfahren des Vergleichsbeispiels 20 mit der Ausnahme wiederholt, dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3,5-Dichlorbenzoylchlorid ersetzt wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 43%) 2-[4-(((3,5-Dichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) vom Fp. 110°–113°C.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 27
  • Das Verfahren des Vergleichsbeispiels 20 wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3,4,5-Trichlorbenzoylchlorid ersetzt wird. In diesem Fall ist das Produkt 2-[4-(((3,4,5-Trichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy)-2-methylpropionsäure (C18H16C13NO4) vom Fp. 151 °–152°C.
  • Die Vergleichsbeispiele 1 bis 27 stellen die Syntheseverfahren zur Herstellung verschiedener Verbindungen außerhalb der Verbindungsfamilie, welche durch die allgemeine Strukturformel der 1a definiert ist. Es sollte verstanden werden, dass Verbindungen innerhalb der bei vorliegender Erfindung benutzten Verbindungsfamilie leicht hergestellt werden können, indem man die Ausgangsmaterialien verändert. Alle Verbindungen innerhalb der Familie sollten eine ähnliche Bindungsart besitzen und infolgedessen sollten alle die Wirkung der Verschiebung des allosterischen Gleichgewichts von Hämoglobin in Richtung der Begünstigung des „T"-Zustands geringer Affinität aufweisen.
  • Die breite Familie von Verbindungen, welche zur Verwendung bei vorliegender Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen die im Patentanspruch 1 durch die Formel (I) definierten Verbindungen.
  • Zum Testen der Vergleichsverbindungen und der erfindungsgemäßen Verbindungen auf ihre physiologische Wirksamkeit wurde menschliches Blut, erhalten von der zentralen Blutbank, RICHMOND; VIRGINIA; USA, erhalten. Die Extraktion, Chromatographie und Charakterisierung von durch die Erfinder benutzten Methoden isolierten Hämoglobins waren mit denjenigen identisch, welche durch Dozy und Huisman in J. of Chromatography, Bd. 32, (1968) S. 723 und in The Chromatography of Hemoglobin, H.J. Schroeder und D.H.J. Huisman, Herausg. Marcel Dekker Inc. N.Y. (1980) beschrieben sind. Die Reinheit normalen Hämoglobins (HbA) wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung einer Gelman-Semimikroelektrophoresekammer bestimmt. Die Hämoglobinkonzentration wurde gemäß dem Cyanmethhämoglobin-Verfahren bestimmt, das in Zijlstra, Clin. Chem. Acta., Bd. 5, S. 719–726 (1960) und Zijlstra und Van Kamper, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 19, S. 521 (1981) beschrieben ist. Alle gereinigten Hämoglobinlösungen wurden in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Reagenzien und Puffer wurden von folgenden Quellen bezogen: Fischer Scientific, Sigma Chemical Company und Pharmacia and Research Chemicals, Inc.
  • Die Sauerstoffgleichgewichtskurven wurden mit einem Sauerstoffdissoziationsanalysegerät AMINCO® HEM-O-SCAN, das von Travenol Laboratories erhältlich ist. HbA wurde wie folgt hergestellt: 20 ml Vollblut von einem nicht-rauchenden Spender (Blutbank Richmond, Virginia) wurde in einen heparinisierten Vakuumbehälter abgezogen. Das Blut wurde unmittelbar in Eis gepackt (um die Bildung von MetHb zu verhindern) und sodann zentrifugiert (10 Minuten bei 2.500 UpM), um das Plasma und eine Leukozytenmanschette von den gepackten Erythrozyten abzutrennen. Nach Abschluss der Zentrifugierung wurde das Plasma und die Leukozytenmanschette durch Aspiration entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 40 mg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Liter und danach einmal mit 1,0%iger Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von einem bis zwei Volumina entionisiertem Wasser mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter gelöst. Das Gemisch wurde 30 Minuten unter gelegentlichem Vermischen vor dem Zentrifugieren während 2 Stunden bei 10.000 UpM bei 4°C stehengelassen, um das restliche Zellstroma zu entfernen. Der Überstand wurde weiter entweder durch Gelfiltration mit Sephadex G-25 oder Dialyse gegen Trispuffer mit einem pH-Wert 8,6 (50 mMol), mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter) gereinigt. Die natriumchloridfreie Hämoglobinlösung wurde an dem Ionenaustauscherharz DEAE-Sephacel (Sigma) chromatographiert, die zuvor mit Trispuffer (pH-Wert 8,6, 50 mMol mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter) abgeglichen, die HbA-Fraktion wurde sodann mit Tris-Puffer vom pH-Wert 8,4 eluiert. Die reine HbA-Fraktion (identifiziert durch Elektrophorese) wurde unter Verwendung eines Schleicher und Schuell-Kollodeumbeutelgeräts (Schleicher und Schuell, Inc.) mit NEPES-Puffer (150 mMol, pH- Wert 7,4) als Austauschpuffer eingeengt. Die Hämoglobinkonzentration wurde sodann unter Anwendung des zuvor erwähnten Cyanomethhämoglobinverfahrens bestimmt. Üblicherweise wurde gefunden, dass an diesem Punkt die Hämoglobinkonzentration etwa 35 g% oder annähernd 5,5 mMol war. Weniger als 5% mit Hämoglobin wurde auch nach mehreren Tagen bei 4°C festgestellt.
  • Alle Verbindungen wurden mit einem Äquivalent Natriumbicarbonat (NaHCO3) vermischt (dieses Verfahren führt den Carbonsäurerest in ein Natriumsalz über; vgl. 6a), sodann in dem HEPES-Puffer gelöst, um Lösungen von 20 mMol zu ergeben. Gerade vor dem Ablauf der Sauerstoffgleichgewichtskurve wurden das Hämoglobin und das Arzneimittel in einem Verhältnis von 1:1 (50 μl Hämoglobin plus 50 μl Arzneimittel) vermischt, um 2,75 mMol Hämoglobin mit einer Arzneimittelkonzentration von 10 mMol zu ergeben. Die Kontrolle wurde durch Zugabe von 50 μl Hämoglobin zu 50 μl des HEPES-Puffers hergestellt.
  • 8 gibt den gemessenen P50-Wert, den P50-Kontrollwert, und das Verhältnis des gemessenen P50-Werts zur Kontrolle (P50/P50c) für normales Hämoglobin, behandelt mit verschiedenen hergestellten Vergleichsverbindungen, wieder. Es wird darauf hingewiesen, dass der P50-Kontrollwert weniger als für normales Hämoglobin unter physiologischen Bedingungen (zum Beispiel 26,5) ist, weil hier der Wert P50 mit Hämoglobin in Lösung (außerhalb der roten Blutzellen) gemacht wurde. Jede mit einer der Testverbindungen behandelten Hämoglobinproben hatte einen P50-Arzneimittelwert, der größer als der P50-Kontrollwert war. Dieses Ansprechen zeigt, dass das allosterische Gleichgewicht für Hämoglobin in Richtung der Begünstigung des „T"-Zustands der niederen Sauerstoffaffinität von Hämoglobin infolge der Anwesenheit der Vergleichsverbindungen verschoben war. Am Ende der 8 ist unter (34) eine Reihe für Bezafibrat (BZF), ein bekanntes „nach rechts verschiebendes" allosterisches Hämoglobinmodifizierungsmittel, dargestellt. Wie bei allen der neu entdeckten „rechts-verschiebenden" allosterischen Hämoglobin-Modifizierungsmitteln hatte das mit BZF behandelte Hämoglobin einen höheren P50-Wert als der P50-Wert für die Kontrolle. 8 zeigt die verschiedenen Reste R3 bis R7 für die getes teten substituierten Phenylverbindungen. Die Reste R8 bis R9 waren für jede getestete Vergleichsverbindung Methylgruppen, während der Rest R10 bei jeder getesteten Vergleichsverbindung ein Natriumkation war (abgeleitet von der NaHCO3-Behandlung vor dem Testen). Weil die Verbindungen innerhalb der Familie eine ähnliche Bindungsart (beispielsweise diejenigen mit unterschiedlichen Resten R2 bis R9 eine ähnliche Bindungsart besitzen, ist zu erwarten, dass ihre Wirkung auf den Wert P50 der gleiche ist.
  • 9 zeigt die Wirkung einiger der Vergleichsverbindungen auf die Sauerstoffdissoziation normalen Hämoglobins in intakten menschlichen roten Blutzellen (RBCs). Die erste Querspalte zeigt den Wert P50, erhalten für eine Kontrolle menschlicher RBCs allein. Die nächsten beiden Querspalten stellen die Werte P50 bereit, wenn die RBCs zusammen mit einer Lösung von 10 mMol des Natriumsalzes von entweder 2-[4-((((4,6-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) (diskutiert im Vergleichsbeispiel 10) bzw. 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy)-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (diskutiert im Vergleichsbeispiel 15) vermischt wurden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Werte P50 für das Hämoglobin in intakten RBCs, behandelt mit den Verbindungen, viel größer als die Werte P50 für unbehandeltes Hämoglobin unter den physiologischen Bedingungen sind (wie z. B. die Kontrolle 27). Ferner wurde ermittelt, dass der Wert P50 von 27 bis 31 in Gegenwart von 1 mMol 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure und bis 42 in Anwesenheit von 2 mMol 2-[4((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure anstieg. Diese Daten begründen die Durchlässigkeit der Verbindungen durch die Zellmembran und ferner, dass Serum Albumin den Einfluss des Arzneimittels auf die Sauerstoffdissoziationskurve von Hämoglobin nicht stört. Die Positionen 23 und 24 in 9 stellen die Werte P50 für intakte RBCs bereit, behandelt mit 10 mMol der gleichen beiden Verbindung, welche in den Positionen 21 bzw. 22 benutzt wurden, mit der Ausnahme, dass die RBCs mit einem 240-fachen Überschuss von 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen wurden. Der verhältnismäßig leichte Abfall der P50-Werte nach der Wäsche mit Kochsalzlösung, welcher eine hohe Beibehaltung der allosterischen Wirkung wiedergibt, zeigt, dass die Vergleichsverbindungen eine hohe Bindungsaffinität für Hämoglobin besitzen.
  • 10 ist eine graphische Veranschaulichung der Sauerstoffdissoziationskurven, gebildet, wenn eine 5,4 millimolare Lösung normalen Hämoblogins beim pH-Wert 7,4 unter Verwendung von HEPES als Puffer in einer Sauerstoffdissoziations-Analysenvorrichtung Hem-O-Scan getestet wird. Wie weiter oben beschrieben, wurden die in 8 aufgezeichneten P50-Werte aus Kurven aufgezeichnet, wie diejenigen, welche in 10 gezeigt sind. Mit besonderer Bezugnahme auf 10 ist die prozentuale Sauerstoffsättigung (SO2 an der vertikalen Achse) gegen den partialen Sauerstoffdruck (PO2 an der horizontalen Achse) aufgetragen. Die Kurve Nr. 1 zeigt die Sauerstoffdissoziationskurve (ODC) in Abwesenheit eines allosterischen Modifizierungsmittels. Die Kurve Nr. 2 zeigt, dass die ODC nach rechts verschoben wurde, wenn 10 mMol Bezafibrat (ein bekanntes rechts verschiebendes Mittel), solubilisiert mit einer äquimolaren Menge von NaHCO3, zum Hämoglobin zugegeben wird. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass da die Kurve zum Zustand einer niedereren Sauerstoffaffinität nach rechts verschoben ist, der P50-Wert ansteigt. Die Kurve Nr. 3 zeigt, dass die Rechtsverschiebung, verursacht durch Zugabe einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((4-Chlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) (beschrieben im obigen Beispiel 8) zum Hämoglobin verursacht wird. Die Kurve Nr. 4 zeigt die Rechtsverschiebung, die durch Zugabe einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dimehylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (beschrieben im Vergleichsbeispiel 15) zum Hämoglobin bewirkt wird. Schließlich zeigt die Kurve Nr. 5 die Rechtsverschiebung, welche durch Zugabe einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) (beschrieben im Beispiel 10) zum Hämoglobin verursacht wird. Die Verschiebungswirkung nach rechts, welche in 10 gezeigt ist, gibt an, dass die Vergleichsverbindungen benutzt werden können, um die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin herabzusetzen.
  • 11 veranschaulicht die Wirkung spezieller Vergleichsverbindungen auf die ODC menschlichen Vollbluts. Wie in 10, ist die prozentuale Sauerstoff sättigung gegen den Sauerstoffpartialdruck aufgetragen. Wie zuvor beschrieben, wurden die in 9 angegebenen P50-Werte aus den Kurven wie diejenigen, welche in 11 gezeigt sind, bestimmt. Für diese Kurven wurden 50 μl menschliches Gesamtblut mit einer 50 μl-Lösung der Testverbindung in HEPES-Puffer beim pH-Wert 7,4 vermischt. Die Kurve Nr. 1 zeigt die ODC von Hämoglobin in nicht-umgesetzten Vollblut. Die Kurven Nr. 2 bzw. veranschaulichen die Rechtsverschiebungswirkung der Salze einer 10 millimolaren Konzentration 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (beschrieben im Vergleichsbeispiel 15) oder einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure ((C18H17Cl2NO4) (beschrieben im Vergleichsbeispiel 10) auf Hämoglobin im Gesamtblut.
  • 12 zeigt ODC-Kurven menschlichen Hämoglobins (5,4 mMol) in HEPES-Puffer beim pH-Wert 7,4, welche auf eine Weise gezeichnet wurden, die derjenigen, welche im Zusammenhang mit 10 beschrieben sind, ähnlich sind. Wie in 10 und 11, ist die prozentuale Sauerstoffsättigung gegen den Sauerstoffpartialdruck aufgetragen. Die Kurve Nr. 1 zeigt die ODC menschlichen Hämoglobins in Abwesenheit irgendeines allosterischen Modifizierungsmittels. Die Kurven 2 bzw. 3 veranschaulichen die Rechtsverschiebungswirkung einer 1 und 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (beschrieben im Vergleichsbeispiel 15) auf menschliches Hämoglobin. Deshalb zwingt diese Verbindung Hämoglobin in einen Zustand einer niedrigeren Sauerstoffaffinität. Die Kurve Nr. 4 zeigt die Rechtsverschiebungswirkung von 2,5 mMol 2,3-Diphospoglycerat (2,3-DPG), das ein natürliches Mittel zum Bewirken allosterischen Hämoglobins ist. Die Kurve Nr. 5 zeigt die kombinierte Wirkung von zwei Bewirkungsmitteln, nämlich von 1 mMol 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure und 2,5 mMol 2,3-DPG, die größer als diejenige der beiden Mittel allein ist. Der synergistische Effekt kann so ausgenutzt werden, dass geringere Arzneimittelmengen dem Blut zugegeben werden.
  • 13 veranschaulicht die Brauchbarkeit von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (bezeichnet als RSR-13) bei der Aufrechterhaltung der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin in gelagertem Blut. RSR-13, 1 mMol und 2 mMol, wurde zu Proben menschlichen RBCs (gepackte Zellen) gegeben, welche bei 4°C in einer Standard-Adsol-Formulierung 40–70 Tage gelagert wurden. Wie aus 13 zu ersehen ist, verschiebt sich die ODC von unbehandeltem Blut innerhalb der Zeit (angegeben durch einen Abfall des P50-Werts) zu einem Zustand hoher Sauerstoffaffinität. Der Anstieg der Sauerstoffaffinität gelagerten Bluts ist einer herabgesetzten Konzentration von 2,3-DPG zuzuschreiben. Der Wert P50 von 40 Tage alten unbehandelten Proben ist auf 32 nach links verschoben; jedoch blieben mit 1 mMol RSR-13 behandelte Proben verhältnismäßig unverändert (P50=90), und diejenigen, welche mit 2 mMol RSR-13 behandelt waren, waren nach rechts verschoben (P50=45). 13 zeigt ähnliche konzentrationsabhängige Wirkungen von RSR-13 auf die ODCs von 50-, 60-, 70-Tage alten gepackten Zellen. Aufgrund des glycolytischen Stoffwechsels fiel der pH-Wert unbehandelter roter Zellen innerhalb eines Zeitraums von 6,85 bei 40 und 6,6 bei 70 Tage alten Proben ab, und dies erklärt möglicherweise die geringe Rechtsverschiebung unbehandelter 70 Tage alten Proben im Vergleich zu 40 Tage alten Proben unter dem Bohr-Effekt. Der pH-Wert von roten Blutzellen, behandelt mit RSR-13, war übereinstimmend geringer als bei unbehandelten Proben, was nahelegt, dass RSR-13 die Rate des glycolytischen Stoffwechsels günstig herabsetzt. RSR-13 hatte keine nachteilige Wirkung auf die Stabilität von RBCs, wie durch übereinstimmendes RBC-Zählen in behandelten und unbehandelten Proben belegt wurde. Auf ähnliche Weise war das Ausmaß der Hämolyse bei behandelten und unbehandelten Proben gepackter Zellen übereinstimmend.
  • 14 zeigt den prozentualen gelieferten Sauerstoff, ΔY bei gepackten Zellen. Veränderungen in der Sauerstoffsättigung ΔY wurde nach der Gleichung von Hill (diskutiert in Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 1975, Kap. 4, S. 71–94 bei 100 bis 300 Torr berechnet. Die Spalte 1 zeigt den ΔY-Wert (59), welcher den unbehandelten, gepackten roten Blutzellen entspricht. Spalte 2 zeigt den ΔY-Wert (50) gepackter roter Blutzellen, die 40 Tage bei 4°C in der besten erhältlichen Adsolformulierung gelagert wurden. Die Spalte 3 zeigt, dass der ΔY-Wert für 40 Tage alte gepackte Zellen, behandelt mit RSR-13 (1 mMol) 58 ist, was mit frisch gepackten Zellen vergleichbar ist. Zu beachten ist, dass der Abfall (etwa 10%) bei der Sauerstoffabgabe durch gepackte Zellen durch die Zugabe von 1 mMol RSR-13 korrigiert wird.
  • 15 zeigt die Veränderung der P50-Werte von alten gepackten roten Blutzellen bei der Behandlung mit 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (RSR-13). 50 μl von 40, 50 und 60 Tage alten roten Blutzellen wurden mit 50 μl RSR-13 vermischt, um eine Endkonzentration von RSR-13 bei 1 mMol und 2 mMol zu ergeben. Kontrollproben wurden durch Vermischen von gepackten Zellen und Puffer im Verhältnis 1:1 hergestellt. Wie der 15 zu entnehmen ist, waren die P50-Werte der unbehandelten Proben übereinstimmend geringer als Proben, welche mit RSR-13 behandelt waren. Ferner zeigt ein Vergleich der Ergebnisse für frische roten Zellen mit roten Zellen, welche 40, 50 und 60 Tage gealtert waren, einen scharfen Abfall des P50-Wertes mit dem Alter. Die P50-Werte von 40, 50 und 60 Tage alten roten Blutzellen-Proben, behandelt mit 1 mMol RSR-13, waren mit dem für frische rote Zellen gefundenen P50-Wert von 38 vergleichbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von RSR-13 zu den gelagerten roten Zellen die Sauerstoffaffinität der Zellen aufrecht erhielt. Da das Präparat, welches die durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogenen Verbindungen umfasst, einer allosterischen Modifizierung von Hämoglobin fähig ist, so dass eine niedere Sauerstoffaffinität des Zustands „T" begünstigt wird (die Rechtsverschiebung der Gleichgewichtskurve, wie durch die Spalte P50 in 8–9 angezeigt), sind diese Präparate bei der Behandlung der verschiedensten Krankheitszustände bei Säugetieren einschließlich Menschen brauchbar, wo Gewebe unter einer geringen Sauerstoffspannung leiden, wie z. B. Krebs und Ischämie. Wie durch Hirst u.a. in Radiat. Res. Bd. 112, (1987), S. 164 herausgestellt, erwies sich eine Herabsetzung der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin in zirkulierendem Blut als vorteilhaft bei der Bestrahlungstherapie von Tumoren. Die Präparate können den Patienten, bei denen die Affinität von Hämoglobin für Sauerstoff abnorm hoch ist, verabreicht werden. Besondere Zustände umfassen bestimmte Hämoglobinopathien und bestimmte Atmungsdistresssyndrome bei neugeborenen Kindern, verschlimmert durch hohe fetale Hämoglobinspiegel, und wenn die Zugänglichkeit von Hämoglobin/Sauerstoff zu den Geweben herabgesetzt ist (wie z. B. bei ischämischen Zuständen wie einer peripheren vaskulären Erkrankung, Herzverschluss, cerebral-vaskulären Unfällen oder der Gewebetransplantation). Die Präparate können auch zur Hemmung der Blutplättchenaggregation und für antithrombotische Zwecke und Wundheilung verwendet werden. Eine topische Anwendung könnte für die Wundheilung benutzt werden. Ferner können die Präparate zur Behandlung von Erkrankungen, die sich auf einen geringen Sauerstoff im Gehirn beziehen, wie bei der Alzheimer Krankheit, einer Depression und Schizophrenie verwendet werden. Es kann erwünscht sein, die Präparate dem Patienten vor/oder gleichzeitig mit der Transfusion des behandelten Vollbluts oder roter Blutzellen zu verabreichen, um wesentliche Veränderungen der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins infolge Verdünnung zu vermeiden, welche auftreten, wenn das Blut verabreicht wird.
  • Die Verbindungen können zum Vollblut gegeben werden oder vorzugsweise zu abgepackten Blutzellen zur Zeit der Lagerung oder zur Zeit der Transfusion zugegeben werden, um die Dissoziation von Sauerstoff aus Hämoglobin zu erleichtern und die Sauerstoffabgabefähigkeit des Bluts zu verbessern. Vorzugsweise werden die Verbindungen in einer Menge von etwa 50 mg bis 1 g pro Bluteinheit (473 ml) oder Einheit abgepackter Zellen (235 ml) zugegeben. Wenn Blut gelagert wird, tendiert Hämoglobin im Blut zur Erhöhung seiner Affinität für Sauerstoff durch Verlust von 2,3-Diphosphoglyceriden. Wie zuvor beschrieben, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen einer Umkehr und/oder einer Verhütung der funktionellen Abnormalität von Hämoglobin fähig, welche beobachtet wird, wenn Vollblut oder abgepackte Zellen gelagert werden. Die Verbindungen können zum Vollblut oder zu roten Blutzellenfraktionen in einem geschlossenen System unter Verwendung eines geeigneten Behälters zugesetzt werden, in den die Verbindung vor der Lagerung eingebracht ist, oder in dem sie in der Antikoagulierungslösung im Blutsammelbeutel vorliegt.
  • Die Verabreichung kann oral, durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion oder rektal durch Suppositorien erreicht werden, wo die Dosis und die Dosierungsvorschrift gemäß der einzelnen Empfindlichkeit und der Art des Krankheitszustands, der zu behandeln ist, schwankt. Studien mit Mäusen zeigten, dass eine mg/kg/Tagesdosis von 2-[4((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbanyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (diskutiert im Vergleichsbeispiel 15) intrapentoneal verabreicht, gut vertragen wird. Wenn die Verbindungen zur Wundheilung verwendet werden, können die Verbindungen vorteilhafterweise topisch direkt auf die Wundfläche aufgebracht werden. Ferner können die Verbindungen mit Blut außerhalb des Körpers eines Patienten vor und/oder gleichzeitig mit einer Transfusion vermischt werden.

Claims (7)

  1. Verbindung der allgemeinen Strukturformel (I)
    Figure 00300001
    wobei X, Y und Z CH2, NH, CO, O oder N sind, mit dem Vorbehalt, dass die Reste X, Y und Z jeweils voneinander verschieden sind, wobei R2 ein substituierter oder unsubstituierter Alkylringrest oder ein substituierter oder unsubstituierter aromatischer Rest mit der Formel
    Figure 00300002
    ist, wobei R3-7 entweder Wasserstoff, Halogen, eine substituierte oder unsubstituierte C1-3-Alkylgruppe oder ein C1-3 Ether oder Ester, wobei diese Reste gleich oder unterschiedlich sein können, oder Alkylreste eines aromatischen oder aliphatischen Rings, der zwei der R3-7 Stellen umfasst, sind, dadurch gekennzeichnet, dass R1 die Formel
    Figure 00300003
    hat, wobei R1 an jede Stelle des Phenylrings gebunden sein kann und R8 und R9 Alkylreste als Teil eines aliphatischen Rings sind, der R8 und R9 verbindet, und wobei R10 Wasserstoff, Halogen C1-3 Niederalkyl oder ein Salzkation ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X und Z CH2, NH CO oder O sind und Y CO oder NH ist.
  3. Mischung die eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 aufweist.
  4. Verwendung der Mischung nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Medikament zur Behandlung von Erkrankungen, die Sauerstoffdefizienz, Ischänie, Krebs, Hämoglobinopathien und Beschwerden in Bezug auf eine geringe Sauerstoffabgabe im Gehirn und zur Wundheilung einschließen.
  6. Verwendung der Mischung nach Anspruch 3 bei der Herstellung von Blutersatz außerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers.
  7. Verwendung der Mischung nach Anspruch 3 bei der Lagerung von Blut außerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers.
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