-
Vorliegende
Erfindung betrifft allgemein eine Familie von Verbindungen und deren
Anwendung als Medikament zur Einstellung des allosterischen Gleichgewichts
von Hämoglobin
in Richtung eines niederen Sauerstoffaffinitätszustands. Überdies
zieht die Erfindung die Verwendung der Verbindungsfamilie für die Herstellung
eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten
in Betracht, welche einen Sauerstoffmangel mit sich bringen, bei
der Wundheilung und der Wiederherstellung der Sauerstoffaffinität von gelagertem
Blut.
-
BESCHREIBUNG
DES STANDS DER TECHNIK
-
Hämoglobin
ist ein tetramäres
Protein, weiches Sauerstoff über
einen allosterischen Mechanismus liefert. Sauerstoff bindet sich
an die vier Häme
des Mämoglobinmoleküls. Jedes
Häm enthält Porphyrin
und Eisen in zweiwertigem Zustand. Die Eisen(II)-Sauerstoff-Bindung
ist leicht reversibel. Das Binden des ersten Sauerstoffmoleküls an ein
Häm erfordert
eine viel größere Energie
als des zweiten Sauerstoffmoleküls.
Das Binden des dritten Sauerstoffs erfordert noch weniger Energie,
und des vierten Sauerstoffs erfordert die geringste Energie für die Bindung.
Hämoglobin
hat zwei α-
und zwei β-Untereinheiten,
welche mit einem zweifachen Symmetrie angeordnet sind. Die α- und β-Dimeren
drehen sich während
der Sauerstofffreigabe, um einen zentralen Wasserhohlraum zu öffnen. Der
allosterische Übergang,
der die Bewegung des α-β-Dimeren
mit sich bringt, tritt zwischen der Bindung des dritten und vierten
Sauerstoffs auf. Die α1β1-Grenzflächenbindung
ist dichter als α1α1 oder α1β2-Grenzflächen.
-
Im
Blut ist Hämoglobin
im Gleichgewicht zwischen zwei allosterischen Strukturen. Im Zustand „T" (für gespannt)
ist Hämoglobin
deoxygeniert. Im Zustand „R" (für Endstand)
ist Hämoglobin
oxygeniert. Es kann eine Sauerstoffbleichgewichtskurve abgetastet
werden, unter Verwendung eines gut bekannten Geräts, wie z. B. des AMINCO® HEM-O-SCAN,
die Affinität
und den Grad der Zusammenarbeit (allosterische Wirkung) von Hämoglobin
zu beobachten. Bei der Abtastung wird auf der Y-Achse der Prozentsatz
der Hämoglobinoxygenierung
aufgetragen, und auf der X-Achse der Sauerstoffpartialdruck in mm
Quecksilbersäule
(mm Hg). Wenn eine horizontale Linie von dem Punkt der 50%igen Sauerstoffsättigung
zur abgetasteten Kurve gezogen wird, und eine vertikale Linie vom
Schnittpunkt der horizontalen Linie mit der Kurve zur Partialdruck-X-Achse
gezogen wird, wird ein allgemein als P50 bekannte
Wert bestimmt (d.h., dieser ist der Druck in mm Hg, wenn die abgetastete
Hämoglobinprobe
zu 50% mit Sauerstoff gesättigt
ist. Unter physiologischen Bedingungen (d.h. 37°C, pH-Wert = 7,4, und einen
Kohlendioxidpartialdruck von 40 mmHg) ist der Wert P50 für normales
adultes Hämoglobin
(HbA) etwa 26,5 mm Hg. Wenn für
das unter dem Test befindliche Hämoglobin
ein P50-Wert erhalten wird, der geringer
als normal ist, wird die abgetastete Kurve als „links verschoben" erachtet, und die
Anwesenheit von Hämoglobin
hoher Affinität
wird angezeigt. Umgekehrt wird, wenn ein P50-Wert,
der höher
als normal ist, für
das unter dem Test befindliche Hämoglobin
erhalten wird, die abgetastete Kurve als „rechts verschoben" erachtet, und es
wird die Anwesenheit von Hämoglobin
niederer Affinität
angezeigt.
-
Es
wurde vorgeschlagen, dass die Beeinflussung des allosterischen Gleichgewichts
von Hämoglobin ein
gangbarer Weg des Angriffs zur Behandlung von Krankheiten ist. Die
Umwandlung von Hämoglobin
zu einem Zustand hoher Affinität
wird in der Regel als vorteilhaft für die Lösung von Problemen mit Deoxyhämoglobin-S (Sichelzellenanämie) angesehen.
Es wird angenommen, dass die Umwandlung von Hämoglobin zu einem Zustand niederer
Affinität
eine allgemeine Brauchbarkeit bei den verschiedensten Krankheitszuständen hat,
wo Gewebe unter geringer Sauerstoffspannung leiden, wie z. B. Ischämie und
Strahlensensibilisierung von Tumoren. Es wurden mehrere synthetische
Verbindungen identifiziert, welche bei der allosterischen Regulierung
von Hämoglobin
und anderen Proteinen Brauchbarkeit besitzen. Beispielsweise sind
verschiedene neue Verbindungen und Verfahren zur Behandlung von
Sichelzellenanämie,
welche die allosterische Regulierung von Hämoglobin mit sich bringen,
in U.S.-Patent 4.699.926 von Abraham u.a., U.S.-Patent 4.731.381
von Abraham u.a., U.S. Patent 4.731.473 von Abraham u.a., U.S.-Patent
4.751.244 von Abraham u.a., und U.S.-Patent 4.887.995 von Abraham
u.a. angegeben. Ferner werden in Perutz, „Mechanisms of Cooperativity and
Allosteric Regulation in Proteins", Quarterly Reviews of Biophysics 22,
2 (1989), S. 163–164,
und auch Lalezari u.a. "LR16,
a compound with potent effects on the oxygen affinity of hemoglobin,
on blood cholesterol, and on low density lipoprotein", („LR16,
eine Verbindung mit starken Wirkungen auf die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin,
auf Blutcholesterin und Lipoprotein niederer Dichte") Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 85 (1988), S. 6117–6121,
Verbindungen, welche wirksame Modifikatoren allosterischen Hämoglobins
sind, diskutiert. Ferner zeigte Perutz u.a., dass ein bekanntes
Antihyperlipoproteinämie-Arzneimittel,
Bezafibrat, in der Lage ist, die Affinität von Hämoglobin für Sauerstoff herabzusetzen
(vgl. „Bezafibrate
lowers oxygen affinity of hemoglobin", Lancet 1983, 881). Die Deutsche Patentanmeldung
DE 21 49 070 von Witte u.a.
offenbart Phenoxyalkylcarbonsäurederivate
der Formel
worin
R
1 ein Wasserstoff oder ein Halogenatom
ist, R
2 ein Wasserstoffatom oder eine Methoxygruppe,
R
3 und R
4 ein Wasserstoffatom
oder eine Methylgruppe sind, n 1 bis 3 ist, und Z eine Hydroxy-
oder Alkoxygruppe mit bis zu 2 Kohlenstoffatomen ist.
-
Die
Deutsche Patentanmeldung
DE 24
32 560 von Witte u.a. offenbart Phenoxyalkylcarbonsäurederivate
der Formel
worin
R
1 und R
2 ein Wasserstoff-
oder Halogenatom, eine niedere Methoxygruppe oder eine niedere Alkylgruppe
sind, R
3 und R
4 ein
Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe sind, n 1 bis 3 ist,
und Z eine Hydroxy- oder niedere Alkoxygruppe ist. Jedoch ziehen
die Patentanmeldung von Witte u.a. die Verwendung der Verbindungen
zur Herabsetzung der Serumlipidspiegel in Betracht. Die Patentanmeldungen
von Witte u.a. stellen keine Angaben des möglichen Gebrauchs der Verbindungen
für eine
Modifikation allosterischen Hämoglobins bereit.
-
Die
Veröffentlichung
von Randad, R. u.a., „Allosteric
Modifiers of Hemoglobin 1. Design, Synthesis, Testing and Structure-Allosteric
Activity Relationship of Novel Hemoglobin Oxygen Affinity Decreasing
Agents" in J. Med.
Chem. 1991, 34, 752-757
und die Veröffentlichung
Wireko, F. u.a. „Allosteric
Modifier of Hemoglobin 2.
-
Crystallographically
Determined Binding Sites and Hydrophobic Binding/interaction Analysis
of Novel Hemoglobin Oxygen Effectors" in J. Med. Chem. 1991, 34, 758–767 offenbart
allosterische Modifikatoren von Hämoglobin der Formel
worin R
2 ein
Wasserstoff- oder Chloratom, R
3 ein Wasserstoffatom,
CH
3 oder Chlor ist, R
4 ein
Wasserstoffatom, CH
3, CF
3,
iPr oder Chlor ist, R
5 ein Wasserstoffatom,
CH
3 oder ein Chloratom ist, R
6 ein
Wasserstoff- oder Chloratom ist, X CO, CH
2 oder
NH ist, Y NHCH
2, NH oder CO ist, und Z CH
2 oder NH ist.
-
Jedoch
sind diese Verbindungen in ihrer Wirkung in vivo nicht befriedigend
und zeigen eine zeitabhängige
Veränderung
ihres Werts P50.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Ein
Ziel vorliegender Erfindung ist infolgedessen die Bereitstellung
einer Familie von Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln
zur Verwendung zur allosterischen Modifizierung von Hämoglobin,
so dass das Hämoglobin
im Blut im Zustand einer geringeren Sauerstoffaffinität vorliegt.
-
Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Verlängerung der
Lagerungsdauer von Blut durch Zugabe von Verbindungen innerhalb
einer speziellen Verbindungsfamilie zum Blut.
-
Gemäß der Erfindung
ist eine Hämoglobin
allosterisch modifizierende Verbindungsfamilie durch die Formel
definiert,
worin
X, Y und Z CH
2, NH, CO, O oder N sind, mit
dem Vorbehalt, dass die Reste X, Y und Z jeweils voneinander verschieden
sind,
wobei R
2 ein substituierter oder
unsubstituierter Alkylringrest oder ein substituierter oder unsubstituierter
aromatischer Rest der Formel
ist,
wobei R
3-7 entweder Wasserstoff, Halogen, eine substituierte
oder unsubstituierte C
1-3-Alkylgruppe oder
ein C
1-3 Ether oder Ester sind, wobei diese
Reste gleich oder unterschiedlich sein können, oder Alkylreste eines
aromatischen oder aliphatischen Rings, der zwei der R
3-7-Stellen
umfasst, sind, dadurch gekennzeichnet, dass R
1 die
Formel
hat, wobei R
1 an
jede Stelle des Phenylrings gebunden sein kann und R
8 und
R
9 Alkylreste als Teil eines aliphatischen
Rings sind, der R
8 und R
9 verbindet,
und wobei R
10 Wasserstoff, Halogen, ein
C
1-3 Niederalkyl oder ein Salzkation ist.
-
Viele
Verbindungen innerhalb dieser Familie wurden synthetisiert, und
ihre Wirkung auf den P50-Wert von Hämoglobin
wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass jede dieser getesteten Verbindungen
den P50-Wert von Hämoglobin erhöht; deshalb
sind die Verbindungen fähig,
das allosterische Gleichgewicht von Hämoglobin in Richtung eines
Zustands zu bringen, welcher den Zustand einer geringen Sauerstoffaffinität begünstigt.
Ferner wurde gefunden, dass die Verbindungen den Grad der Sauerstoffdissoziierung
von Hämoglobin
in über ausgedehnte
Zeiträume
gelagertem Blut zu stabilisieren. Auch wurde gefunden, dass die
Verbindungen von Mäusen
gut toleriert werden, wenn sie als intraperitoneale Dosis verabreicht
werden.
-
Weil
die durch vorliegende Erfindung definierten Verbindungen innerhalb
der Familie fähig
sind, das allosterische Gleichgewicht von Hämoglobin in Richtung des Zustands „T" geringer Affinität zu verschieben, besitzen
sie die Fähigkeit,
zu bewirken, dass Hämoglobin
mehr Sauerstoff an Gewebe abgibt. Somit sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen
als antiischämische
Mittel, als Sensibilisatoren für
die Röntgenbestrahlung
in der Krebstherapie als Wundheilmittel, bei der Behandlung von
Erkrankungen, die sich auf niedere Sauerstofflieferung im Gehirn
beziehen, wie z. B. bei der Alzheimer-Krankheit, Depression und
Schizophrenie, bei der Herstellung von Blutersatz und bei der Lagerung
von Blut wertvoll sein.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die
vorhergehenden und anderen Ziele, Aspekte und Vorteile werden anhand
der nachfolgenden detaillierten Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen besser verstanden,
in denen:
-
1a eine
chemische Struktur ist, welche eine besonders bevorzugte Gruppe
innerhalb der bei vorliegender Erfindung verwendeten Verbindungsfamilie
ist;
-
1b und 1c chemische
Strukturen sind, welche zwei Untergruppen der in 1a definierten Familie
sind;
-
2a–b zeigen
chemische Strukturen von Vorläuferverbindungen,
angeordnet in Reaktionsschemen für
die Herstellung von Verbindungen, welche als Zwischenprodukte für die Synthese
von Verbindungen innerhalb einer ersten Gruppe von Vergleichsbeispielen
brauchbar sind;
-
2c zeigt
chemische Strukturen, einschließlich
der Zwischenprodukte, die wie in 2a bis 2b gezeigt,
hergestellt wurden, angeordnet in einem Reaktionsschema zur Herstellung
der ersten Gruppe von Vergleichsbeispielen;
-
4 zeigt
chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, zur Herstellung
einer zweiten Gruppe der Vergleichsbeispiele;
-
6a zeigt
chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, das eine
Alternative zu demjenigen ist, das in 4 gezeigt
wird, zur Herstellung von Verbindungen innerhalb einer Gruppe bevorzugter
Verbindungen;
-
7a und 7b zeigen
chemische Strukturen, angeordnet in einem Reaktionsschema, zur Herstellung
von Verbindungen innerhalb einer dritten Gruppe von Vergleichsbeispielen;
-
8 ist
eine Tabelle, welche die gemessenen P50-Werte
für Hämoglobin
in Lösung
zeigt, wo die Zugabe eines jeden der Vergleichsbeispiele zur allosterischen
Modifikation von Hämoglobin
in Richtung des Zustands einer niederen Sauerstoffaffnität gezeigt
wird;
-
9 ist
eine der in 8a gezeigten ähnlichen
Tabelle mit der Ausnahme, dass die gemessenen P50-Werte
für intakte,
menschliche rote Blutkörperchen
(im Gegensatz in einer Hämoglobinlösung) gelten,
die einigen der Vergleichsbeispiele ausgesetzt wurden;
-
10 ist
ein Schaubild, welches die Sauerstoffdissoziationskurven veranschaulicht,
gebildet, wenn eine 5,4 millimolare Lösung normalen Hämoglobins
in Gegenwart und in Abwesenheit ausgewählter Vergleichsbeispiele beim
pH-Wert 7,4 unter Verwendung von HEPES als Puffer in einem Analysengerät für die Sauerstoffdissoziation
Hem-O-Scan getestet wird;
-
11 ist
ein 10 ähnliches
Schaubild, welches die Sauerstoffdissoziationskurven für menschliches
Vollblut in Gegenwart und Abwesenheit von ausgewählten Vergleichsbeispielen
veranschaulicht;
-
12 ist
ein 10 ähnliches
Schaubild, wo die gebildeten Sauerstoffdissoziationskurven für eine 5,4
millimolare Lösung
normalen Hämoglobins
in Gegenwart und Abwesenheit spezieller Vergleichsbeispiele gelten,
einschließlich
2,3-Diphosphoglycerat, das die Substanz ist, welche der Bewirker
des natürlichen
allosterischen Hämoglobins
ist, und beim pH-Wert 7,4 unter Verwendung von HEPES als Puffer
in einem Analysengerät
für die
Sauerstoffdissoziation Hem-O-Scan
getestet werden;
-
13 ist
eine Tabelle, welche die Wirkung einer 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4)
auf menschliche rote Blutzellen zeigt, die in einer Adsolfomulierung
gelagert werden;
-
14 ist
ein Balkenschaubild, das den Prozentsatz Sauerstoff zeigt, der von
frisch gelagerten bzw. in Gegenwart von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C2OH23NO4),
gepackten Zellen, geliefert wird;
-
15 ist
eine Tabelle, welche diese Änderung
in den P50-Werten von veralteten gepackten
roten Blutzellen bei der Behandlung mit 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (genannt
RSR-13) zeigt.
-
DETALLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
-
Um
jetzt auf die Zeichnungen zurückzukommen
und insbesondere auf die 1a bis c,
welche die allgemeine Strukturformel von besonders bevorzugten Verbindungen
veranschaulicht, die zur Verwendung in vorliegender Erfindung in
Betracht gezogen werden, bzw. erste und zweite Untergruppen der
allgemeinen Strukturformel zeigen. Unter Bezugnahme auf die allgemeinen
Strukturformel der 1a können die Reste X und Z CH2, CO NH oder O sein, und der Rest Y kann CO
oder NH sein, mit dem Vorbehalt, dass die Reste X, Y und Z jeweils
voneinander verschieden sind. Ferner sind die Reste R3 bis
R7 entweder Wasserstoff, Halogen, eine substituierte
oder unsubstituierte C1- bis C3-Alkylgruppe
(mit einer Länge
von bis zu 3 Kohlenstoffen) oder ein C1-
bis C3-Ester oder Ether, und diese Reste
können
gleich oder verschieden sein, oder Alkylreste aliphatischer oder
aromatischer Ringe, welche zwei benachbarte Stellen R3-
bis R7 umfassen. Die Stellungen R8- bis R9 sind Alkylreste
als Teil eines aliphatischen Rings (wie z. B. eines Cyclobutyltings)
welcher R8 und R9 verbindet.
Die Stellung R10 ist ein Wasserstoff, Halogen,
ein niederer Alkylrest mit 1–3
Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl oder Propyl oder ein
Salzkation wie Natrium, Kalium oder Ammonium.
-
In
der ersten Untergruppe von Verbindungen, definiert in 1b,
können
X und Z jeweils CH2, NH oder O sein, mit
dem Vorbehalt, dass, wenn X CH2 ist, Z entweder
NH oder O ist, wenn X NH ist, Z entweder CH2 oder
O ist, und wenn X O ist, Z NH oder CH2 ist.
-
Bei
der zweiten Untergruppe in 1 c definierter
Verbindungen kann X und Z jeweils CO oder CH2 sein,
mit dem Vorbehalt, dass, wenn X CO ist, Z CH2 ist,
und wenn X CH2 ist, Z CO ist.
-
Die
Substituenten R3- bis R10 in
den 1b bis c sind die gleichen wie diejenigen,
welche unter Bezugnahme auf 1a definiert
sind. Die Synthese spezieller Vergleichsbeispiele wird im Folgenden
unter Bezugnahme auf 2 bis 7 bereit
gestellt. Alle Verbindungen, die hergestellt wurden, wurden durch Dünnschichtchromatographie
(TLC) auf Reinheit getestet, und der Strukturerklärung lag
NMR- und IR-Spektroskopie und Elementaranalyse zugrunde.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 1
-
2A veranschaulicht
ein Reaktionsschema zur Herstellung von 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure, eine
Verbindung, die als ein Vorläufer
bei der Herstellung der Vergleichsbeispiele der Gruppe I brauchbar
ist. Gemäß dem Schema
der 2A werden 8g (0,2 Mol) pulverisiertes Natriumhydroxid
zu einer Suspension von 5,28 g (0,035 Mol) p-Acetaminophenol in
23 g (0,4 Mol) Aceton zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur
eine halbe Stunde gerührt.
Danach werden 3,58 g (0,03 Mol) Chloroform tropfenweise im Verlauf
von 30 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt,
und das Aceton wird unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand
wird in Wasser (10 ml) gelöst, gefolgt
von Ansäuern
mit 37%iger Salzsäure
(HCl) zur Herstellung eines hellgelben Niederschlags von 2-(4-(Acetaminophenoxy)-2-methylpropionsäure (5 g,
Ausbeute: 60%), die aus Methanol kristallisiert wird, Fp. 69°–71°C.
1H NMR: (CD3OD) δ 7,1 (m, 4H) ArH, 2,05 (s, 3H),
CH3, 1,45, (s, 6H) 2CH3
1,18
g (0,005 Mol) der 2-(4-Acetaminophenoxy)-2-methylpropionsäure wird
in 10%iger Kalilauge (60 ml) eine halbe Stunde zum Sieden erwärmt. Die
Lösung
wird sodann abgekühlt
und mit Essigsäure
angesäuert,
wobei 0,6 g (Ausbeute: 62%) 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure als
gelblichweißes
Pulver vom Fp. 214°-216°C anfallen.
1H NMR: (DMSOd6+TMS) δ 6,6 (m, 4H) ArH, 1,35 (s, 6H,
2CH3).
-
VERGLEICHSBEISPIEL 2
-
2B veranschaulicht
ein anderes Reaktionsschema zur Herstellung von 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure. Gemäß dem Schema
der 2B werden 8g Kaliumhydroxid in 32 ml Wasser gelöst, und
die erhaltene Kalilauge wird mit 280 ml 3%igem Wasserstoffperoxid
vermischt. 11,3 g (0,058 Mol) 2-(4-Cyanphenoxy)-2-methylpropionsäure wird
langsam zur KOH/H2O2-Lösung gegeben,
und das Reaktionsgemisch wird etwa 1 Stunde gerührt, bis die exotherme Reaktion
und die Gasentwicklung aufhört.
Das Gemisch wird sodann abgekühlt
und mit konzentrierter Salzsäure
angesäuert.
Die 2-[4-(Carboxamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure als Produkt wird als weißer Feststoff
(9,8 g, Ausbeute: 79%) erhalten. Das Produkt wird aus Ethanol kristallisiert,
um reine weiße
Kristalle vom Fp. 202°–204°C zu ergeben.
-
5,57
g (0,025 Mol) der 2-[4-(Carboxamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure wird
allmählich
zu 100 ml einer eiskalten wässerigen
Lösung
zugegeben, welche 4,4 g (0,025 Mol) Brm und 11 g (0,25 Mol) Natriumhydroxid
enthält.
Die so erhaltene Lösung
wird ½ Stunde
auf 75°C
erwärmt.
Nach Abkühlen
der Lösung
wird sie mit Essigsäure
angesäuert,
wobei die gewünschte
2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure als 4,0 g (Ausbeute: 81
%) eines weißen
Niederschlags vom Fp. 214°-216°C als Produkt
anfällt.
Die Verbindung ist mit dem im Vergleichsbeispiel 1 hergestellten
Produkt identisch.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 3
-
2C veranschaulicht
ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von 2-[4-(Arylacetamido)phenoxy]-2-methylpropionsäuren der
Gruppe I. Gemäß dem veranschaulichten
Schema wird 1 g (0,005 Mol) 2-(4-Aminophenoxy)-2-methylpropionsäure unter
Rühren
in 10 ml Wasser mit einem Gehalt an 0,41 g (0,1 Mol) NaOH gelöst. Diese
Lösung
wird mit 0,79 g (0,005 Mol) Phenylacetylchlorid in 5 ml Tetrahydrofuran
(THF) allmählich
innerhalb eines Zeitraums von etwa 15 Minuten versetzt. Nach Abschluss
der Zugabe sollte der pH-Wert des Reaktionsgemischs alkalisch sein
(wenn nicht zur Gewährleistung
der Alkalinität
wenige Tropfen von 2N Natronlauge zugegeben werden). Das Reaktionsgemisch
wird kontinuierlich 1 Stunde gerührt.
Danach wird das THF im Vakuum abgedampft, und die Lösung wird
sodann mit 5 ml Wasser verdünnt
und mit konzentrierter Salzsäure
angesäuert.
Das Produkt wird mit Ethylether (2 × 20 ml) extrahiert, mit Wasser
(3 × 20
ml) gewaschen und sodann über
wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Nach Zugabe
von Petrolether zur Etherlösung fallen
0,9 g (Ausbeute: 56%) der 2-[4-(Phenylacetamido)phenoxy]-2-methylpropionsäure als
Produkt als hellbrauner Feststoff vom Fp. 173°–175°C aus.
1H
NMR: (DMSOd6) 10 (s, 1H, COOH), 7,5–6,7 (m, 9H, ArH), 3,55 (s,
2H, CH2), 1,4 (s, 6H, 2CH3)
Analyse:
C18H19NO4
ber. C 69,00 H 6,07 N 4,47
gef.
C 68,86 H 6,14 N 4,42
-
VERGLEICHSBEISPIEL 7
-
4 veranschaulicht
ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von Vergleichsbeispielen der
Gruppe II der Erfindung. Gemäß dem veranschaulichten
Schema werden 5,2 g (34 mMol) 4-Hydroxyphenylessigsäure (HPAA)
mit einem Überschuss
von Thionylchlorid (SOCl2) ½ Stunde
zum Rückfluss
erwärmt. Das
Reaktionsgemisch wird sodann abgekühlt, und überschüssiges SOCl2 wird
unter Vakuum abgezogen. Der Rest wird 2 Stunden mit 6,3 g (68 mMol)
Anilin in 50 ml rückfließendem Xylol
umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird sodann abgekühlt, mit
verdünnter
Salzsäure,
Wasser und Kochsalzlösung
gewaschen und mit wässeriger
2N Natronlauge extrahiert. Die vereinte Alkalischicht wird mit Ether
gewaschen, gekühlt
und angesäuert,
wobei 7 g festes N-Phenyl-4-hydroxybenrylamid (C14H12NO2) als Zwischenprodukt
(Ausbeute: 90%, Fp. 138°C)
anfallen. Das Zwischenprodukt wird aus einem Gemisch im Verhältnis 1:2
von Aceton und Petrolether umkristallisiert, und ein Anteil von
1,13 g (5 mMol) wird 12 Stunden unter Anwendung des Verfahrens des
Vergleichsbeispiels 1 mit 20 ml Aceton 2,75 g NaOH und 1,25 ml CHCl3 O-alkyliert. Das Endprodukt ist 2-[4-((((Phenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18N19NO4),
1,2 g (Ausbeute: 76%) vom Fp. 198°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 8
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 8,6
g (68 mMol) 4-Chloranilin anstelle von Anilin wiederholt. In diesem
Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Chlorphenyl)-4-hydroxybenzylamid (C14H12ClNO2), 7,5 g (Aus beute: 84%), vom Fp. 163°C. 1,3 g
des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-(4-((((Chlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4), 0,86 g (Ausbeute: 50%), Fp. 196°C O-alkyliert.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 9
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 2,6
g (17 mMol) HPAA und von 5,67 g (35 mMol) 3,4-Dichloranilin anstelle
von Anilin wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,4-Dichlorphenyl-4-hydroxybenzylamid
(C14H11Cl2NO2). 1,48 g (5
mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-(((3,4-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) O-alkyliert; 0,76 g (Ausbeute: 40%), Fp.
174°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 10
-
Unter
Verwendung von 2,6 (17 mMol) HPAA und von 5,7 g (35 mMol) 3,5-Dichloranilin
anstelle von Anilin wurde das Verfahren des Vergleichsbeispiels
7 wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,5-Dichlorphenyl-4-hydroxybenzylamid
(C14H11Cl2NO). Zur Herstellung von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4), 0,8 g (Ausbeute: 42%), Fp. 138°C, werden
1,48 g ( 5 mMol) des Zwischenprodukts O-alkyliert.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 11
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 0,95
g (6 mMol) HPAA, 2,6 g (12 mMol) 3,4,5-Trichloranilin anstelle von
Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss
wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,4,5-Trichlorphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
Unter Verwendung von 10 ml Aceton, 0,82 g NaOH und 0,37 ml CHCl3 werden 0,50 g (1,5 mMol) des Zwischenprodukts
O-alkyliert, um 2-[4-((((3,4,5-Trichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H16Cl3NO4), 0,27 g (Ausbeute: 43%), Fp. 160°C, herzustellen.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 12
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04
g (32 mMol) HPAA, 6 ml (64 mMol) 4-Fluoranilin anstelle von Anilin
und 25 ml Xylol unter Rückfluss
wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Fluorphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
1,22 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird O-alkyliert, um 2-[4-((((4-Fluorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18FNO4),
0,74 g (Ausbeute: 45%), Fp. 198°C,
herzustellen.
-
Vergleichsbeispiel 13
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04
(32 mMol) HPAA, 8,05 ml (64 mMol) 4-Trifluormethylanilin anstelle
von Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss wiederholt. In diesem
Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Trifluormethylphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
1,5 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((4-Trifluormethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C19H18F3NO4), (0,85 g (Ausbeute: 44%), Fp. 197°C, verwendet.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 14
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04
g (32 mMol) HPAA, 8 g (65 mMol) 4-Methylanilin anstelle von Anilin
und 25 ml Xylol unter Rückfluss
wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Methylphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
1,2 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((4-Methylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxyl]-2-methylpropionsäure (C19H21NO4), 0,98
g (Ausbeute: 65%) Fp. 164°C,
herzustellen.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 15
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 3,26
(21 mMol) HPAA, 5,3 ml (42 mMol) 3,5-Dimethylanilin anstelle von
Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss
wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(3,5-Dimethylphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
1,27 g (5 mMol) des Zwischenprodukts wird zur Herstellung von 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4),
1,15 g (Ausbeute: 68%), Fp. 85°C,
verwendet. Alternativ kann das in der Deutschen Patentanmeldung
2.432.560 dargestellte Verfahren nachvollzogen werden, welche durch
Bezugnahme in vorliegende Beschreibung einbezogen wird, zur Herstellung
der Verbindung dieses Vergleichsbeispiels 15 nachvollzogen werden.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 16
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 7 wird unter Verwendung von 5,04
g (32 mMol) HPAA, 10 ml (64 mMol) 4-Isopropylanilin anstelle von
Anilin und 25 ml Xylol unter Rückfluss
wiederholt. In diesem Fall ist das Zwischenprodukt N-(4-Isopropylphenyl)-4-hydroxybenzylamid.
134 g (5 mMol der halbfesten, dicken, viskosen Flüssigkeit
als Zwischenprodukt werden zur Herstellung von 2-[4-((((4-Isopropylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C21H25NO4),
1,1 g (Ausbeute: 61%) Fp. 141 °C,
verwendet.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 18
-
Als
eine Alternative zum im Vergleichsbeispiel 7 beschriebenen und in 4 gezeigten
Reaktionsschema können
die Vergleichsbeispiele der Gruppe 1 gemäß dem in 6a gezeigten
Schema hergestellt werden. 5,2 g (32 mMol) HPAA, 6,3 g (68 mMol)
Anilin und 25 ml Mesitylen werden unter Rückfluss erwärmt. 0,74 g (8 mMol) Phosphorpentachlorid
wird zum Gemisch unter Rückfluss
zugegeben und der Rückfluss
wird weitere zwei Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird
we sentlich gekühlt,
mit verdünnter
Salzsäure, Wasser
und Kochsalzlösung
gewaschen und mit wässeriger
2N NaOH extrahiert. Die vereinte alkalische Schicht wird mit Ether
gewaschen, gekühlt
und angesäuert,
um 7 g (Ausbeute: 90%) eines festen Zwischenprodukts vom Fp. 138°C, N-Phenyl-4-hydroxybenzylamid
(C14H12NO2) zu erhalten. Das Zwischenprodukt wird aus
einem Gemisch im Verhältnis
1:2 von Aceton zu Petrolether umkristallisiert, und ein Anteil von
1,13 g (5 mMol) wird O-alkyliert.
1,6 g (30 mMol) des pulverisierten Natriumhydroxids wird zu einer
Lösung
von N-Phenyl-4-hydroxybenzamid (1,13 g, 5 mMol) in 20 ml Aceton
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt,
und das Aceton wird unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand
wird in 10 ml Wasser gelöst
und mit 2 N Salzsäure
unter Bildung eines hellgelben Feststoffs angesäuert. Der Feststoff wird abgetrennt,
in Methanol gelöst,
mit Aktivkohle behandelt, und das Lösungsmittel wird verdampft,
um so 2-[4-((((Phenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H19NO4),
1,2 g (Ausbeute: 76%), Fp. 198°C
zu ergeben. Die letzte Stufe beim in 6a gezeigten
Verfahren ist die Umwandlung der Säure in das Natriumsalz über ihre
Umsetzung mit Natriumbicarbonat. Ähnliche Umsetzungen mit anderen
Salzkationen, wie Kalium und Ammonium oder Umsetzungen zur Bildung
von Estern können
auch durchgeführt
werden.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 20
-
Unter
Bezugnahme auf die 7a, wird ein allgemeines Reaktionsschema
zur Herstellung von 2-[4-Aminomethyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure, eine
Verbindung, die als Vorläufer
für die
Herstellung der Vergleichsbeispiele der Gruppe III brauchbar ist,
vorgestellt. Gemäß dem veranschaulichten
Schema wurden 2-[4-Cyanophenoxy]-2-methylpropionsäure (2g,
9 mMol), hergestellt wie im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, und
75 ml Ethanol in eine 250 ml Parr-Hydrierungsflasche gefüllt. Die
Lösung
wurde mit konzentrierter Salzsäure
(3 ml) angesäuert,
wonach das Gemisch mit 10% Palladium auf Aktivkohle (0,2 g, 10 Gew.%)
versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Parr-Hydrierungsvorrichtung
bei 45 psi Wasserstoffdruck gebracht und während 2 Stunden geschüttelt. Das
Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert, und das
Filtrat unter Vakuum eingeengt. Die Zugabe von Ether fällte das
Chlorwasserstoffsalz des gewünschten Produkts
als weiße
glänzende
Kristalle (2,1 g, 87%) aus.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 21
-
7b veranschaulicht
ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung der Vergleichsbeispiele
der Gruppe III. In Übereinstimmung
mit der Veranschaulichung wurde ein Lösung von Benzoylchlorid (0,14
g, 1 mMol) in THF (3 ml) innerhalb von 15 Minuten zu einer gerührten Lösung von
2-[4-(Aminomethyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (0,24 g, 1 mMol) und NaOH
(0,08 g, 2 mMol) in 10 ml Wasser zugegeben. Nach Abschluss der Zugabe
des Benzoylchlorids wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur
gerührt. THF
wurde im Vakuum abgedampft. Das Ansäuern des Rückstands führte zur gewünschten
Verbindung als ein Öl,
das mit Ether extrahiert wurde. Die organische Schicht wurde mit
Wasser, Kochsalzlösung
gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Zugabe von Petrolether
fiel 2-[4-(Benzoylamino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H19NO4)
als weißer
Feststoff (0,15 g, 48%) vom Fp. 176°–179°C an.
NMR: (DMSO-d6) δ 1,45
(6H, s, 2CH3), 4,4 (2H, d, CH2),
6,8–7,2
(4H, dd, J=9 Hz, aromatischer H, 7,4–8 (5H, m, aromatischer H),
9, 1H, br t, NH).
-
VERGLEICHSBEISPIEL 22
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird unter Verwendung von 2-Chlorbenzoylchlorid
(1 mMol) anstelle von Benzoylchlorid wiederholt. In diesem Fall
ist das Produkt (Ausbeute: 58%) 2-[4-(((2-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) vom Fp. 135°–137°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 23
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird mit der Ausnahme wiederholt,
dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3-Chlorbenzoylchlorid ersetzt wird.
In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 53%) 2-[4-(((3-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) Fp. 145°–146°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 24
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 4-Chlorbenzoylchlorid
ersetzt wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 63%) 2-[4-(((4-Chlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) vom Fp. 186°–189°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 25
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit
der Ausnahme, dass anstelle von Benzoylchlorid 1 mMol 3,4-Dichlorbenzoylchlorid
verwendet wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 57%) 2-[4-(((3,4-Dichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) vom Fp. 186°–189°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 26
-
Es
wird das Verfahren des Vergleichsbeispiels 20 mit der Ausnahme wiederholt,
dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3,5-Dichlorbenzoylchlorid ersetzt
wird. In diesem Fall ist das Produkt (Ausbeute: 43%) 2-[4-(((3,5-Dichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) vom Fp. 110°–113°C.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 27
-
Das
Verfahren des Vergleichsbeispiels 20 wird wiederholt, mit der Ausnahme,
dass Benzoylchlorid durch 1 mMol 3,4,5-Trichlorbenzoylchlorid ersetzt
wird. In diesem Fall ist das Produkt 2-[4-(((3,4,5-Trichlorbenzoyl)amino)methyl)phenoxy)-2-methylpropionsäure (C18H16C13NO4) vom Fp. 151 °–152°C.
-
Die
Vergleichsbeispiele 1 bis 27 stellen die Syntheseverfahren zur Herstellung
verschiedener Verbindungen außerhalb
der Verbindungsfamilie, welche durch die allgemeine Strukturformel
der 1a definiert ist. Es sollte verstanden werden,
dass Verbindungen innerhalb der bei vorliegender Erfindung benutzten
Verbindungsfamilie leicht hergestellt werden können, indem man die Ausgangsmaterialien
verändert.
Alle Verbindungen innerhalb der Familie sollten eine ähnliche
Bindungsart besitzen und infolgedessen sollten alle die Wirkung
der Verschiebung des allosterischen Gleichgewichts von Hämoglobin
in Richtung der Begünstigung
des „T"-Zustands geringer
Affinität
aufweisen.
-
Die
breite Familie von Verbindungen, welche zur Verwendung bei vorliegender
Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen die im Patentanspruch
1 durch die Formel (I) definierten Verbindungen.
-
Zum
Testen der Vergleichsverbindungen und der erfindungsgemäßen Verbindungen
auf ihre physiologische Wirksamkeit wurde menschliches Blut, erhalten
von der zentralen Blutbank, RICHMOND; VIRGINIA; USA, erhalten. Die
Extraktion, Chromatographie und Charakterisierung von durch die
Erfinder benutzten Methoden isolierten Hämoglobins waren mit denjenigen
identisch, welche durch Dozy und Huisman in J. of Chromatography,
Bd. 32, (1968) S. 723 und in The Chromatography of Hemoglobin, H.J.
Schroeder und D.H.J. Huisman, Herausg. Marcel Dekker Inc. N.Y. (1980)
beschrieben sind. Die Reinheit normalen Hämoglobins (HbA) wurde durch
Gelelektrophorese unter Verwendung einer Gelman-Semimikroelektrophoresekammer
bestimmt. Die Hämoglobinkonzentration
wurde gemäß dem Cyanmethhämoglobin-Verfahren
bestimmt, das in Zijlstra, Clin. Chem. Acta., Bd. 5, S. 719–726 (1960)
und Zijlstra und Van Kamper, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 19,
S. 521 (1981) beschrieben ist. Alle gereinigten Hämoglobinlösungen wurden
in flüssigem
Stickstoff gelagert. Die Reagenzien und Puffer wurden von folgenden
Quellen bezogen: Fischer Scientific, Sigma Chemical Company und
Pharmacia and Research Chemicals, Inc.
-
Die
Sauerstoffgleichgewichtskurven wurden mit einem Sauerstoffdissoziationsanalysegerät AMINCO® HEM-O-SCAN,
das von Travenol Laboratories erhältlich ist. HbA wurde wie folgt
hergestellt: 20 ml Vollblut von einem nicht-rauchenden Spender (Blutbank Richmond,
Virginia) wurde in einen heparinisierten Vakuumbehälter abgezogen.
Das Blut wurde unmittelbar in Eis gepackt (um die Bildung von MetHb
zu verhindern) und sodann zentrifugiert (10 Minuten bei 2.500 UpM),
um das Plasma und eine Leukozytenmanschette von den gepackten Erythrozyten
abzutrennen. Nach Abschluss der Zentrifugierung wurde das Plasma
und die Leukozytenmanschette durch Aspiration entfernt, und die
Zellen wurden dreimal mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung mit
einem Gehalt an 40 mg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Liter und danach
einmal mit 1,0%iger Kochsalzlösung
mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter gewaschen. Die Zellen wurden
durch Zugabe von einem bis zwei Volumina entionisiertem Wasser mit
einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter gelöst. Das Gemisch wurde 30 Minuten
unter gelegentlichem Vermischen vor dem Zentrifugieren während 2
Stunden bei 10.000 UpM bei 4°C
stehengelassen, um das restliche Zellstroma zu entfernen. Der Überstand
wurde weiter entweder durch Gelfiltration mit Sephadex G-25 oder
Dialyse gegen Trispuffer mit einem pH-Wert 8,6 (50 mMol), mit einem
Gehalt an 40 mg EDTA/Liter) gereinigt. Die natriumchloridfreie Hämoglobinlösung wurde
an dem Ionenaustauscherharz DEAE-Sephacel
(Sigma) chromatographiert, die zuvor mit Trispuffer (pH-Wert 8,6,
50 mMol mit einem Gehalt an 40 mg EDTA/Liter) abgeglichen, die HbA-Fraktion
wurde sodann mit Tris-Puffer vom pH-Wert 8,4 eluiert. Die reine
HbA-Fraktion (identifiziert durch Elektrophorese) wurde unter Verwendung
eines Schleicher und Schuell-Kollodeumbeutelgeräts (Schleicher und Schuell,
Inc.) mit NEPES-Puffer (150 mMol, pH- Wert 7,4) als Austauschpuffer eingeengt.
Die Hämoglobinkonzentration
wurde sodann unter Anwendung des zuvor erwähnten Cyanomethhämoglobinverfahrens
bestimmt. Üblicherweise
wurde gefunden, dass an diesem Punkt die Hämoglobinkonzentration etwa
35 g% oder annähernd
5,5 mMol war. Weniger als 5% mit Hämoglobin wurde auch nach mehreren
Tagen bei 4°C
festgestellt.
-
Alle
Verbindungen wurden mit einem Äquivalent
Natriumbicarbonat (NaHCO3) vermischt (dieses
Verfahren führt
den Carbonsäurerest
in ein Natriumsalz über;
vgl. 6a), sodann in dem HEPES-Puffer gelöst, um Lösungen von
20 mMol zu ergeben. Gerade vor dem Ablauf der Sauerstoffgleichgewichtskurve
wurden das Hämoglobin
und das Arzneimittel in einem Verhältnis von 1:1 (50 μl Hämoglobin
plus 50 μl
Arzneimittel) vermischt, um 2,75 mMol Hämoglobin mit einer Arzneimittelkonzentration
von 10 mMol zu ergeben. Die Kontrolle wurde durch Zugabe von 50 μl Hämoglobin
zu 50 μl
des HEPES-Puffers hergestellt.
-
8 gibt
den gemessenen P50-Wert, den P50-Kontrollwert,
und das Verhältnis
des gemessenen P50-Werts zur Kontrolle (P50/P50c) für normales
Hämoglobin,
behandelt mit verschiedenen hergestellten Vergleichsverbindungen,
wieder. Es wird darauf hingewiesen, dass der P50-Kontrollwert
weniger als für
normales Hämoglobin
unter physiologischen Bedingungen (zum Beispiel 26,5) ist, weil
hier der Wert P50 mit Hämoglobin in Lösung (außerhalb
der roten Blutzellen) gemacht wurde. Jede mit einer der Testverbindungen
behandelten Hämoglobinproben
hatte einen P50-Arzneimittelwert, der größer als
der P50-Kontrollwert war. Dieses Ansprechen
zeigt, dass das allosterische Gleichgewicht für Hämoglobin in Richtung der Begünstigung
des „T"-Zustands der niederen
Sauerstoffaffinität
von Hämoglobin
infolge der Anwesenheit der Vergleichsverbindungen verschoben war.
Am Ende der 8 ist unter (34) eine Reihe
für Bezafibrat
(BZF), ein bekanntes „nach
rechts verschiebendes" allosterisches
Hämoglobinmodifizierungsmittel,
dargestellt. Wie bei allen der neu entdeckten „rechts-verschiebenden" allosterischen Hämoglobin-Modifizierungsmitteln
hatte das mit BZF behandelte Hämoglobin
einen höheren
P50-Wert als der P50-Wert für die Kontrolle. 8 zeigt
die verschiedenen Reste R3 bis R7 für
die getes teten substituierten Phenylverbindungen. Die Reste R8 bis R9 waren für jede getestete
Vergleichsverbindung Methylgruppen, während der Rest R10 bei
jeder getesteten Vergleichsverbindung ein Natriumkation war (abgeleitet
von der NaHCO3-Behandlung vor dem Testen). Weil die
Verbindungen innerhalb der Familie eine ähnliche Bindungsart (beispielsweise
diejenigen mit unterschiedlichen Resten R2 bis
R9 eine ähnliche
Bindungsart besitzen, ist zu erwarten, dass ihre Wirkung auf den
Wert P50 der gleiche ist.
-
9 zeigt
die Wirkung einiger der Vergleichsverbindungen auf die Sauerstoffdissoziation
normalen Hämoglobins
in intakten menschlichen roten Blutzellen (RBCs). Die erste Querspalte
zeigt den Wert P50, erhalten für eine Kontrolle
menschlicher RBCs allein. Die nächsten
beiden Querspalten stellen die Werte P50 bereit,
wenn die RBCs zusammen mit einer Lösung von 10 mMol des Natriumsalzes
von entweder 2-[4-((((4,6-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) (diskutiert im Vergleichsbeispiel 10)
bzw. 2-[4-((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy)-2-methylpropionsäure (C20H23NO4)
(diskutiert im Vergleichsbeispiel 15) vermischt wurden. Es wird
darauf hingewiesen, dass die Werte P50 für das Hämoglobin
in intakten RBCs, behandelt mit den Verbindungen, viel größer als
die Werte P50 für unbehandeltes Hämoglobin
unter den physiologischen Bedingungen sind (wie z. B. die Kontrolle
27). Ferner wurde ermittelt, dass der Wert P50 von
27 bis 31 in Gegenwart von 1 mMol 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure und
bis 42 in Anwesenheit von 2 mMol 2-[4((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure anstieg.
Diese Daten begründen
die Durchlässigkeit
der Verbindungen durch die Zellmembran und ferner, dass Serum Albumin
den Einfluss des Arzneimittels auf die Sauerstoffdissoziationskurve
von Hämoglobin
nicht stört.
Die Positionen 23 und 24 in 9 stellen
die Werte P50 für intakte RBCs bereit, behandelt
mit 10 mMol der gleichen beiden Verbindung, welche in den Positionen
21 bzw. 22 benutzt wurden, mit der Ausnahme, dass die RBCs mit einem
240-fachen Überschuss
von 0,9%iger Kochsalzlösung
gewaschen wurden. Der verhältnismäßig leichte
Abfall der P50-Werte nach der Wäsche mit
Kochsalzlösung,
welcher eine hohe Beibehaltung der allosterischen Wirkung wiedergibt,
zeigt, dass die Vergleichsverbindungen eine hohe Bindungsaffinität für Hämoglobin
besitzen.
-
10 ist
eine graphische Veranschaulichung der Sauerstoffdissoziationskurven,
gebildet, wenn eine 5,4 millimolare Lösung normalen Hämoblogins
beim pH-Wert 7,4
unter Verwendung von HEPES als Puffer in einer Sauerstoffdissoziations-Analysenvorrichtung
Hem-O-Scan getestet wird. Wie weiter oben beschrieben, wurden die
in 8 aufgezeichneten P50-Werte
aus Kurven aufgezeichnet, wie diejenigen, welche in 10 gezeigt
sind. Mit besonderer Bezugnahme auf 10 ist
die prozentuale Sauerstoffsättigung
(SO2 an der vertikalen Achse) gegen den
partialen Sauerstoffdruck (PO2 an der horizontalen
Achse) aufgetragen. Die Kurve Nr. 1 zeigt die Sauerstoffdissoziationskurve
(ODC) in Abwesenheit eines allosterischen Modifizierungsmittels. Die
Kurve Nr. 2 zeigt, dass die ODC nach rechts verschoben wurde, wenn
10 mMol Bezafibrat (ein bekanntes rechts verschiebendes Mittel),
solubilisiert mit einer äquimolaren
Menge von NaHCO3, zum Hämoglobin zugegeben wird. Es
sollte darauf hingewiesen werden, dass da die Kurve zum Zustand
einer niedereren Sauerstoffaffinität nach rechts verschoben ist,
der P50-Wert ansteigt. Die Kurve Nr. 3 zeigt,
dass die Rechtsverschiebung, verursacht durch Zugabe einer 10 millimolaren
Konzentration von 2-[4-((((4-Chlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H18ClNO4) (beschrieben im obigen Beispiel 8) zum
Hämoglobin
verursacht wird. Die Kurve Nr. 4 zeigt die Rechtsverschiebung, die
durch Zugabe einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dimehylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4) (beschrieben
im Vergleichsbeispiel 15) zum Hämoglobin
bewirkt wird. Schließlich
zeigt die Kurve Nr. 5 die Rechtsverschiebung, welche durch Zugabe
einer 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C18H17Cl2NO4) (beschrieben im Beispiel 10) zum Hämoglobin
verursacht wird. Die Verschiebungswirkung nach rechts, welche in 10 gezeigt
ist, gibt an, dass die Vergleichsverbindungen benutzt werden können, um
die Sauerstoffaffinität
von Hämoglobin
herabzusetzen.
-
11 veranschaulicht
die Wirkung spezieller Vergleichsverbindungen auf die ODC menschlichen Vollbluts.
Wie in 10, ist die prozentuale Sauerstoff
sättigung
gegen den Sauerstoffpartialdruck aufgetragen. Wie zuvor beschrieben,
wurden die in 9 angegebenen P50-Werte
aus den Kurven wie diejenigen, welche in 11 gezeigt
sind, bestimmt. Für
diese Kurven wurden 50 μl
menschliches Gesamtblut mit einer 50 μl-Lösung der Testverbindung in
HEPES-Puffer beim pH-Wert
7,4 vermischt. Die Kurve Nr. 1 zeigt die ODC von Hämoglobin
in nicht-umgesetzten
Vollblut. Die Kurven Nr. 2 bzw. veranschaulichen die Rechtsverschiebungswirkung
der Salze einer 10 millimolaren Konzentration 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4)
(beschrieben im Vergleichsbeispiel 15) oder einer 10 millimolaren
Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dichlorphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure ((C18H17Cl2NO4) (beschrieben im Vergleichsbeispiel 10)
auf Hämoglobin
im Gesamtblut.
-
12 zeigt
ODC-Kurven menschlichen Hämoglobins
(5,4 mMol) in HEPES-Puffer
beim pH-Wert 7,4, welche auf eine Weise gezeichnet wurden, die derjenigen,
welche im Zusammenhang mit 10 beschrieben sind, ähnlich sind.
Wie in 10 und 11, ist
die prozentuale Sauerstoffsättigung
gegen den Sauerstoffpartialdruck aufgetragen. Die Kurve Nr. 1 zeigt
die ODC menschlichen Hämoglobins
in Abwesenheit irgendeines allosterischen Modifizierungsmittels.
Die Kurven 2 bzw. 3 veranschaulichen die Rechtsverschiebungswirkung einer
1 und 10 millimolaren Konzentration von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4)
(beschrieben im Vergleichsbeispiel 15) auf menschliches Hämoglobin. Deshalb
zwingt diese Verbindung Hämoglobin
in einen Zustand einer niedrigeren Sauerstoffaffinität. Die Kurve Nr.
4 zeigt die Rechtsverschiebungswirkung von 2,5 mMol 2,3-Diphospoglycerat
(2,3-DPG), das ein natürliches
Mittel zum Bewirken allosterischen Hämoglobins ist. Die Kurve Nr.
5 zeigt die kombinierte Wirkung von zwei Bewirkungsmitteln, nämlich von
1 mMol 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure und
2,5 mMol 2,3-DPG, die größer als
diejenige der beiden Mittel allein ist. Der synergistische Effekt
kann so ausgenutzt werden, dass geringere Arzneimittelmengen dem
Blut zugegeben werden.
-
13 veranschaulicht
die Brauchbarkeit von 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (bezeichnet
als RSR-13) bei der Aufrechterhaltung der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin
in gelagertem Blut. RSR-13, 1 mMol und 2 mMol, wurde zu Proben menschlichen
RBCs (gepackte Zellen) gegeben, welche bei 4°C in einer Standard-Adsol-Formulierung
40–70
Tage gelagert wurden. Wie aus 13 zu
ersehen ist, verschiebt sich die ODC von unbehandeltem Blut innerhalb
der Zeit (angegeben durch einen Abfall des P50-Werts)
zu einem Zustand hoher Sauerstoffaffinität. Der Anstieg der Sauerstoffaffinität gelagerten
Bluts ist einer herabgesetzten Konzentration von 2,3-DPG zuzuschreiben.
Der Wert P50 von 40 Tage alten unbehandelten
Proben ist auf 32 nach links verschoben; jedoch blieben mit 1 mMol
RSR-13 behandelte Proben verhältnismäßig unverändert (P50=90),
und diejenigen, welche mit 2 mMol RSR-13 behandelt waren, waren
nach rechts verschoben (P50=45). 13 zeigt ähnliche
konzentrationsabhängige
Wirkungen von RSR-13 auf die ODCs von 50-, 60-, 70-Tage alten gepackten
Zellen. Aufgrund des glycolytischen Stoffwechsels fiel der pH-Wert unbehandelter
roter Zellen innerhalb eines Zeitraums von 6,85 bei 40 und 6,6 bei
70 Tage alten Proben ab, und dies erklärt möglicherweise die geringe Rechtsverschiebung
unbehandelter 70 Tage alten Proben im Vergleich zu 40 Tage alten
Proben unter dem Bohr-Effekt. Der pH-Wert von roten Blutzellen,
behandelt mit RSR-13, war übereinstimmend
geringer als bei unbehandelten Proben, was nahelegt, dass RSR-13
die Rate des glycolytischen Stoffwechsels günstig herabsetzt. RSR-13 hatte
keine nachteilige Wirkung auf die Stabilität von RBCs, wie durch übereinstimmendes
RBC-Zählen
in behandelten und unbehandelten Proben belegt wurde. Auf ähnliche
Weise war das Ausmaß der
Hämolyse
bei behandelten und unbehandelten Proben gepackter Zellen übereinstimmend.
-
14 zeigt
den prozentualen gelieferten Sauerstoff, ΔY bei gepackten Zellen. Veränderungen
in der Sauerstoffsättigung ΔY wurde nach
der Gleichung von Hill (diskutiert in Stryer, Biochemistry, W.H.
Freeman and Co., San Francisco, 1975, Kap. 4, S. 71–94 bei
100 bis 300 Torr berechnet. Die Spalte 1 zeigt den ΔY-Wert (59),
welcher den unbehandelten, gepackten roten Blutzellen entspricht.
Spalte 2 zeigt den ΔY-Wert
(50) gepackter roter Blutzellen, die 40 Tage bei 4°C in der
besten erhältlichen
Adsolformulierung gelagert wurden. Die Spalte 3 zeigt, dass der ΔY-Wert für 40 Tage
alte gepackte Zellen, behandelt mit RSR-13 (1 mMol) 58 ist, was mit
frisch gepackten Zellen vergleichbar ist. Zu beachten ist, dass
der Abfall (etwa 10%) bei der Sauerstoffabgabe durch gepackte Zellen
durch die Zugabe von 1 mMol RSR-13 korrigiert wird.
-
15 zeigt
die Veränderung
der P50-Werte von alten gepackten roten
Blutzellen bei der Behandlung mit 2-[4-((((3,5-Dimethylphenyl)amino)carbonyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (RSR-13).
50 μl von 40,
50 und 60 Tage alten roten Blutzellen wurden mit 50 μl RSR-13
vermischt, um eine Endkonzentration von RSR-13 bei 1 mMol und 2 mMol zu ergeben.
Kontrollproben wurden durch Vermischen von gepackten Zellen und
Puffer im Verhältnis
1:1 hergestellt. Wie der 15 zu
entnehmen ist, waren die P50-Werte der unbehandelten
Proben übereinstimmend
geringer als Proben, welche mit RSR-13 behandelt waren. Ferner zeigt
ein Vergleich der Ergebnisse für
frische roten Zellen mit roten Zellen, welche 40, 50 und 60 Tage
gealtert waren, einen scharfen Abfall des P50-Wertes
mit dem Alter. Die P50-Werte von 40, 50
und 60 Tage alten roten Blutzellen-Proben, behandelt mit 1 mMol
RSR-13, waren mit
dem für
frische rote Zellen gefundenen P50-Wert
von 38 vergleichbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von
RSR-13 zu den gelagerten roten Zellen die Sauerstoffaffinität der Zellen
aufrecht erhielt. Da das Präparat,
welches die durch vorliegende Erfindung in Betracht gezogenen Verbindungen
umfasst, einer allosterischen Modifizierung von Hämoglobin
fähig ist,
so dass eine niedere Sauerstoffaffinität des Zustands „T" begünstigt wird
(die Rechtsverschiebung der Gleichgewichtskurve, wie durch die Spalte
P50 in 8–9 angezeigt),
sind diese Präparate
bei der Behandlung der verschiedensten Krankheitszustände bei
Säugetieren
einschließlich
Menschen brauchbar, wo Gewebe unter einer geringen Sauerstoffspannung
leiden, wie z. B. Krebs und Ischämie.
Wie durch Hirst u.a. in Radiat. Res. Bd. 112, (1987), S. 164 herausgestellt,
erwies sich eine Herabsetzung der Sauerstoffaffinität von Hämoglobin
in zirkulierendem Blut als vorteilhaft bei der Bestrahlungstherapie
von Tumoren. Die Präparate
können
den Patienten, bei denen die Affinität von Hämoglobin für Sauerstoff abnorm hoch ist,
verabreicht werden. Besondere Zustände umfassen bestimmte Hämoglobinopathien
und bestimmte Atmungsdistresssyndrome bei neugeborenen Kindern,
verschlimmert durch hohe fetale Hämoglobinspiegel, und wenn die
Zugänglichkeit
von Hämoglobin/Sauerstoff
zu den Geweben herabgesetzt ist (wie z. B. bei ischämischen
Zuständen
wie einer peripheren vaskulären
Erkrankung, Herzverschluss, cerebral-vaskulären Unfällen oder der Gewebetransplantation).
Die Präparate
können
auch zur Hemmung der Blutplättchenaggregation
und für
antithrombotische Zwecke und Wundheilung verwendet werden. Eine
topische Anwendung könnte
für die
Wundheilung benutzt werden. Ferner können die Präparate zur Behandlung von Erkrankungen,
die sich auf einen geringen Sauerstoff im Gehirn beziehen, wie bei
der Alzheimer Krankheit, einer Depression und Schizophrenie verwendet
werden. Es kann erwünscht
sein, die Präparate
dem Patienten vor/oder gleichzeitig mit der Transfusion des behandelten
Vollbluts oder roter Blutzellen zu verabreichen, um wesentliche
Veränderungen
der Sauerstoffaffinität
des Hämoglobins
infolge Verdünnung
zu vermeiden, welche auftreten, wenn das Blut verabreicht wird.
-
Die
Verbindungen können
zum Vollblut gegeben werden oder vorzugsweise zu abgepackten Blutzellen
zur Zeit der Lagerung oder zur Zeit der Transfusion zugegeben werden,
um die Dissoziation von Sauerstoff aus Hämoglobin zu erleichtern und
die Sauerstoffabgabefähigkeit
des Bluts zu verbessern. Vorzugsweise werden die Verbindungen in
einer Menge von etwa 50 mg bis 1 g pro Bluteinheit (473 ml) oder
Einheit abgepackter Zellen (235 ml) zugegeben. Wenn Blut gelagert
wird, tendiert Hämoglobin
im Blut zur Erhöhung
seiner Affinität für Sauerstoff
durch Verlust von 2,3-Diphosphoglyceriden. Wie zuvor beschrieben,
sind die erfindungsgemäßen Verbindungen
einer Umkehr und/oder einer Verhütung
der funktionellen Abnormalität
von Hämoglobin
fähig,
welche beobachtet wird, wenn Vollblut oder abgepackte Zellen gelagert
werden. Die Verbindungen können zum
Vollblut oder zu roten Blutzellenfraktionen in einem geschlossenen
System unter Verwendung eines geeigneten Behälters zugesetzt werden, in
den die Verbindung vor der Lagerung eingebracht ist, oder in dem
sie in der Antikoagulierungslösung
im Blutsammelbeutel vorliegt.
-
Die
Verabreichung kann oral, durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion
oder rektal durch Suppositorien erreicht werden, wo die Dosis und
die Dosierungsvorschrift gemäß der einzelnen
Empfindlichkeit und der Art des Krankheitszustands, der zu behandeln
ist, schwankt. Studien mit Mäusen
zeigten, dass eine mg/kg/Tagesdosis von 2-[4((((3,5-dimethylphenyl)amino)carbanyl)methyl)phenoxy]-2-methylpropionsäure (C20H23NO4)
(diskutiert im Vergleichsbeispiel 15) intrapentoneal verabreicht,
gut vertragen wird. Wenn die Verbindungen zur Wundheilung verwendet
werden, können
die Verbindungen vorteilhafterweise topisch direkt auf die Wundfläche aufgebracht
werden. Ferner können
die Verbindungen mit Blut außerhalb
des Körpers
eines Patienten vor und/oder gleichzeitig mit einer Transfusion
vermischt werden.