ES2220141T3 - Reactivos lipidizantes sensibles a ph acuosos reversibles, composiciones y metodos de uso. - Google Patents
Reactivos lipidizantes sensibles a ph acuosos reversibles, composiciones y metodos de uso.Info
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Abstract
Un compuesto de fórmula general I en la que R2 se selecciona del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi, alquilo o átomos de halógeno; R3 es un grupo lipófilo; uno de R4 y R5 es una substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de R4 y R5 es OR6, donde R6 se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa; X es oxígeno o azufre; Y es un aminoácido de unión natural o no natural; n es cero o 1; y m es un número entero de cero a 10.
Description
Reactivos lipidizantes sensibles a pH acuosos
reversibles, composiciones y métodos de uso.
La presente invención se refiere de manera
general a los campos de la biología y la medicina. Más
particularmente, la presente invención se refiere a compuestos,
métodos y composiciones útiles para aumentar el transporte y la
liberación de moléculas hidrófilas que tienen un grupo amino, en
particular péptidos y proteínas, en mamíferos.
Los avances en bioquímica han hecho posible la
producción de grandes cantidades de proteínas y péptidos
terapéuticamente activos y puros. Actualmente, los efectos
terapéuticos de la mayoría de estos agentes se pueden conseguir
sólo cuando se administran mediante vías invasivas, tales como
inyección. Como la mayoría de las proteínas tienen vidas medias muy
cortas, las concentraciones eficaces de estos agentes se pueden
mantener sólo cuando se administran mediante inyecciones
frecuentes.
Aunque la administración de proteínas mediante
inyección es el medio más eficaz para su liberación in vivo,
la tolerancia del paciente a múltiples inyecciones es muy mala.
Además, la inyección del fármaco necesita entrenamiento y
experiencia que no siempre se puede transferir a los pacientes. En
los casos en los que los fármacos proteicos tienen un papel de
salvamento, los pacientes pueden aceptar la administración mediante
inyección. Sin embargo, en los casos en los que los fármacos
proteicos sólo son una de varias terapias posibles, es probable que
los pacientes no acepten las inyecciones de proteínas y péptidos.
Por lo tanto, es necesario desarrollar vías alternativas de
liberación de proteínas y péptidos.
Tales vías alternativas pueden incluir las vías
bucal, nasal, oral, pulmonar, rectal y ocular. Sin excepción, estas
vías son menos eficaces que las vías de administración
parenterales, pero son bastante más atractivas que las vías
parenterales porque ofrecen comodidad y control para los pacientes.
La vía oral es particularmente atractiva porque es la más
conveniente y cómoda para los pacientes.
Las barreras mucosas, que separan el interior del
cuerpo del exterior (por ejemplo, la mucosa gastrointestinal,
ocular, pulmonar, rectal y nasal), comprenden una capa de monocapas
celulares unidas firmemente que regulan estrictamente el transporte
de moléculas. Las células individuales en las barreras están unidas
por uniones firmes que regulan la entrada en el espacio
intercelular. Por lo tanto, la mucosa es, en un primer nivel, una
barrera física, dependiendo el transporte a su través tanto de la
ruta transcelular como de la ruta paracelular (Lee, V.H.L.,
Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5:
69-97 (1988)).
El transporte paracelular a través uniones firmes
llenas de agua está restringido a moléculas pequeñas (PM < 1
kDa) y es básicamente un proceso de difusión dirigido por un
gradiente de concentración a través de la mucosa (Lee, V.H.L.,
Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys. 5:
69-97 (1988)); Artursson, P. y Magnusson, C., J.
Pharm. Sci. 79: 595-600 (1990)). Las uniones
firmes constituyen menos del 0,5% del área superficial total de la
mucosa (González-Mariscal, L.M., et al., J.
Membrana Biol. 86: 113-125 (1985); Vetvicka, V.
y Lubor, F., Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys. 5:
141-170 (1988)); por lo tanto, sólo juegan un papel
minoritario en el transporte de los fármacos proteicos a través de
la mucosa.
El transporte transcelular de fármacos pequeños
ocurre eficazmente siempre que las propiedades fisicoquímicas del
fármaco sean adecuadas para el transporte a través de barreras
celulares hidrófobas. Sin embargo, el transporte transcelular de
proteínas y péptidos está restringido por el proceso de
transcitosis (Shen, W.C., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 8:
93-113 (1992)). La transcitosis es un proceso
complejo en el que proteínas y péptidos se recogen conjuntamente en
vesículas desde un lado de una célula y posteriormente se
transportan a través de la células hasta el otro lado de la célula,
donde se descargan de las vesículas endocíticas (Mostov, K.E. y
Semister, N.E., Cell 43: 389-390 (1985)). La
membrana celular de las barreras mucosas es una bicapa lipídica
hidrófoba que no tiene afinidad por macromoléculas hidrófilas
cargadas tales como las proteínas y los péptidos. Además, las
células de la mucosa pueden secretar mucina, que puede actuar como
barrera para el transporte de muchas macromoléculas (Edwards, P.,
British Med. Bull. 34: 55-56 (1978)). Por lo
tanto, a menos que existan mecanismos de transporte específicos
para proteínas y péptidos, su transporte inherente a través de las
barreras de la mucosa es casi insignificante.
Además de proporcionar una barrera física firme
para el transporte de proteínas y péptidos, las barreras mucosas
poseen enzimas que pueden degradar las proteínas y los péptidos
antes, después y durante su paso a través de la mucosa. Esta barrera
se denomina barrera enzimática. La barrera enzimática consta de
enzimas endo y exopeptidasas que escinden proteínas y péptidos en
sus extremos terminales o dentro de sus estructuras. Se ha
estudiado la actividad enzimática de varias mucosas y los
resultados demostraron que existe una actividad proteasa substancial
en el homogeneizado de la mucosa bucal, nasal, rectal y vaginal de
conejos albinos y que estas actividades son comparables a las
presentes en el íleon (Lee, V.H.L., Critical Rev. Ther. Drug
Delivery Sys. 5: 69-97 (1988)). Por lo tanto,
cualquiera que sea la mucosa considerada, la barrera enzimática
presente participará fuertemente en la degradación de las moléculas
de proteínas y péptidos.
Los extremos N y C de los péptidos están
cargados, y la presencia de cadenas laterales cargadas imparte
características muy hidrófilas a estas macromoléculas. Además, la
presencia de cadenas laterales cargadas significa que las proteínas
y péptidos tienen fuertes capacidades de unión a hidrógeno; se ha
demostrado que esta capacidad de unión a hidrógeno juega un papel
fundamental en la inhibición del transporte incluso de pequeños
péptidos a través de las membranas celulares (Conrado, R.A. et
al., Pharm. Res. 8: 1453-1460 (1991)). Por lo
tanto, el tamaño y la naturaleza hidrófila de las proteínas y
péptidos se combina para restringir rigurosamente su transporte a
través de las barreras mucosas.
Una estrategia que se ha usado para alterar la
naturaleza física de las barreras mucosas es el uso de
potenciadores de la penetración. El uso de potenciadores de la
penetración se basa en la alteración de las barreras celulares por
agentes de bajo peso molecular que pueden fluidizar las membranas
celulares (Kaji, H., et al., Life Sci. 37:
523-530 (1985)), abrir uniones firmes (Inagaki, M.,
et al., Rhinology 23: 213-221 (1985)) y crear
poros en la membrana celular (Gordon, S., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 82: 7419-7423 (1985); Lee,
V.H.L., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 8:
91-192 (1991)). El uso de estos agentes conduce a
una pérdida no específica de integridad de la barrera y puede
conducir a la absorción de diversas moléculas grandes que pueden
ser tóxicas para las células in vivo.
Se han coadministrado inhibidores de proteasa con
proteínas y péptidos y han mostrado alguna actividad limitada para
potenciar la absorción de estas macromoléculas in vivo
(Kidron, M., et al., Life Sci. 31: 2837-2841
(1982); Takaroi, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
137: 682-687 (1986)). La seguridad y los efectos
a largo plazo de esta estrategia todavía se tienen que investigar
exhaustivamente.
La estrategia del profármaco se basa en la
modificación de péptidos de una manera que los proteja de la
degradación y el reconocimiento enzimático. Esto se ha conseguido
mediante el bloqueo de grupos vulnerables en péptidos mediante
amidación y acilación. La estrategia del profármaco ha resultado
ser útil sólo para péptidos pequeños que tienen dominios de
actividad fácilmente identificables.
La reducción de tamaño es otra estrategia posible
para aumentar el transporte potencial de proteínas. Sin embargo, es
necesario crear un mapa de los sitios activos de las proteínas
antes de que pueda intentarse la reducción de tamaño. En general,
esta estrategia es difícil de aplicar a la mayoría de las
proteínas.
Los ligandos de transporte, gracias a sus
propiedades, pueden alterar la captación celular y las
características de transporte de proteínas y péptidos. La esencia de
esta estrategia es que una proteína o péptido impermeable para la
célula se une covalentemente a un vehículo que se transporta en
gran medida al interior de las células. Los mecanismos mediante los
que los ligandos de transporte pueden someterse a endocitosis o
transcitosis son importantes para decidir la adecuabilidad del
vehículo para potenciar el transporte de proteínas y péptidos. Los
vehículos macromoleculares son hidrófilos y no se dividen dentro de
la membrana. Por lo tanto, el transporte de grandes vehículos
poliméricos al interior de las células está mediado por la afinidad
del vehículo por la membrana celular. Generalmente, la captación de
un conjugado macromolecular empieza con la unión a la membrana
celular. La unión del vehículo a las células puede ser específica
(por ejemplo, unión de anticuerpos a antígenos de la superficie
celular), no específica (unión de un ligando catiónico o lectinas a
azúcares de la superficie celular) o mediada por receptores (unión
de transferrina o insulina a sus receptores). Una vez que el
vehículo se ha unido a la superficie celular, se recoge en
vesículas. Después, estas vesículas se procesan progresivamente y se
pueden dirigir a varias rutas. Una ruta es el reciclado de la
vesícula de nuevo a la membrana. Otra ruta, que es destructiva para
el conjugado, es la fusión con lisosomas. Una ruta alternativa, y
una que conduce a la transcitosis del conjugado, es la fusión de la
vesícula con la membrana del lado opuesto del que procede.
El equilibrio correcto entre los procesos de
endocitosis y transcitosis determina la liberación de un conjugado
proteico a su diana. Por ejemplo, la endocitosis puede determinar la
extensión en la que un conjugado es recogido por la célula diana,
pero la transcitosis determina si un conjugado alcanza o no su
diana (Shen, W.C., et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 8:
93-113 (1992)). Para una absorción satisfactoria a
través del tracto gastrointestinal, un conjugado se debe unir a la
membrana apical de la mucosa gastrointestinal, internalizarse en
las células de la mucosa, suministrarse a través de las células y
finalmente liberarse de la membrana basolateral.
La bibliografía actual contiene muchos informes
que demuestran que ciertos vehículos no específicos, tales como
polilisinas (Shen, W.C. y Ryser, H.J.P., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78: 7589-7593 (1981)) y lectinas (Broadwell,
R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
632-646 (1988)), y vehículos específicos tales como
transferrina (Wan, J., et al., J. Biol. Chem. 257:
13446-13450 (1992)), asialoglicoproteína (Seth, R.,
et al., J. Infect. Diseases 168: 994-999
(1993)), y anticuerpos (Vitetta, E.S., J. Clin. Immunol. 10:
15S-18S (1990)) pueden potenciar la endocitosis de
las proteínas en las células. Los informes relacionados con los
vehículos de transcitosis para proteínas son menos numerosos, y muy
pocos estudios han cuantificado el transporte de conjugados
proteicos a través de barreras celulares. Se ha demostrado que la
aglutinina de germen de trigo (Broadwell, R.D., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 632-646 (1988)) y un
conjugado de anti-transferrina/metotrexato (Friden,
P.M. y Walus, L.R., Adv. Exp. Med. Biol. 331:
129-136 (1993)) pueden experimentar transcitosis a
través de la barrera hematoencefálica in vivo. También se ha
demostrado que los conjugados de polilisina de peroxidasa de rábano
picante (HRP) y un conjugado de transferrina de HRP pueden
experimentar transcitosis a través de monocapas celulares in
vitro (Wan, J. y Shen, W.C., Pharm. Res. 8:
S-5 (1991); Taub, M.E. y Shen, W.C., J. Cell.
Physiol. 150: 283-290 (1992); Wan, J., et
al., Biol. Chem 267: 13446-13450 (1992)).
Los ácidos grasos, como constituyentes de los
fosfolípidos, constituyen el grueso de las membranas celulares.
Están disponibles en el mercado y son relativamente baratos. Debido
a su naturaleza lipídica, los ácidos grasos pueden repartirse
fácilmente e interactuar con la membrana celular de una manera no
tóxica. Por lo tanto, los ácidos grasos representan potencialmente
el ligando de transporte más útil para la liberación de proteínas y
péptidos. Las estrategias que pueden usar ácidos grasos en la
liberación de proteínas y péptidos incluyen la modificación
covalente de proteínas y péptidos y el uso de emulsiones de ácidos
grasos.
Algunos estudios han informado sobre el uso
satisfactorio de emulsiones de ácidos grasos para liberar péptidos
y proteínas in vivo (Yoshikawa, H., et al., Pharm. Res.
2: 249-251 (1985); Fix, J.A., et al., Am. J.
Physiol. 251: G332-G340 (1986)). Aún se
desconoce el mecanismo mediante el cual las emulsiones de ácidos
grasos influyen sobre la absorción de proteínas y péptidos. Las
emulsiones de ácidos grasos pueden abrir las uniones firmes,
solubilizar membranas, simular las proteínas y péptidos del medio
gastrointestinal, y llevar proteínas y péptidos a través de la
mucosa gastrointestinal como parte de su absorción (Smith, P.,
et al., Adv. Drug Delivery Rev. 8: 253-290
(1992)). Se ha propuesto el último mecanismo, pero es inconsistente
con el conocimiento actual sobre el mecanismo de absorción de
grasas.
Una estrategia más lógica para liberar proteínas
y péptidos a través del epitelio gastrointestinal es utilizar
ácidos grasos como agentes de adsorción de membrana no específicos.
Varios estudios han demostrado que un agente de unión a la membrana
no específico unido a una proteína puede promover la transcitosis
de un conjugado proteico a través de las células in vitro
(Wan, J., et al., J. Cell Physiol. 145: 9-15
(1990); Taub, M.E. y Shen, W.C., J. Cell Physiol. 150:
283-290 (1992)). También se ha demostrado que la
conjugación con ácidos grasos mejora la captación de macromoléculas
hacia el interior y a través de las membranas celulares (Letsinger,
R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
6553-6556 (1989); Kabanov, A., et al., Protein
Eng. 3: 39-42 (1989)). Sin embargo, ha habido
dificultades en la conjugación de ácidos grasos a péptidos y
proteínas, incluyendo: (1) la falta de solubilidad de ácidos grasos
en la solución acuosa para la reacción de conjugación; (2) la
pérdida de actividad biológica de péptidos y proteínas después de
la acilación del ácido graso; y (3) la falta de solubilidad de los
péptidos conjugados con ácidos grasos en soluciones acuosas (véase,
por ejemplo, Hashimoto, M., et al., Pharm. Res. 6:
171-176 (1989); Martins, M.B.F., et al.,
Biochimie 72: 671-675 (1990); Muranishi, S.,
et al., Pharm. Res. 6: 171-176 (1989);
Martins, M.B.F., et al., Biochimie 72:
671-675 (1990); Muranishi, S., et al., Pharm.
Res. 8: 649-652 (1991); Robert, S., et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 447-454
(1993)).
Una vez liberado en el interior de la célula, los
péptidos y proteínas se deben liberar de su vehículo. Las
Solicitudes PCT Publicadas Nº WO 96/22773 y WO 98/13007 describen l
suministro transcelular y liberación de péptidos y proteínas que
contienen sulfhidrilo. La absorción celular de moléculas hidrófilas
que contienen sulfhidrilo puede aumentarse por la conjugación con un
ácido graso mediante un enlace disulfuro. El enlace disulfuro lábil
se reduce fácilmente, proporcionando un mecanismo para la
liberación de los compuestos hidrófilos del resto de ácido graso una
vez dentro del cuerpo.
Además de la reducción del enlace disulfuro,
otros mecanismos para la liberación de compuestos hidrófilos
biológicamente activos desde los sistemas de transporte incluyen la
hidrólisis y la escisión fotolítica del enlace. (Véase, por ejemplo,
la Patente de Estados Unidos Nº 5.505.931 y las referencias allí
citadas). Se conocen sistemas de liberación basados en la hidrólisis
en los que una amina biológicamente activa se conjuga con un ácido
orgánico que incorpora un anticuerpo monoclonal u otro substrato
para dirigirse a células específicas. (Véase las Patentes de Estados
Unidos Nº 4.764.368, 4.618.492, 5.505.931 y 5.563.250). Después de
la unión específica a la célula diana, estos conjugados suministran
la amina activa (típicamente en forma de una amida) dentro de la
célula, donde la hidrólisis (de la amida) libera la amina libre
dentro de la célula.
El éxito de los sistemas de liberación basados en
hidrólisis de la técnica anterior han inspirado la búsqueda de
conjugados fármaco-vehículo mejorados capaces de
liberar un grupo amino biológicamente activo que contiene el
compuesto en el interior de las células. Las estrategias de
síntesis mejoradas y las técnicas de tratamiento se están
desarrollando actualmente.
La presente invención se refiere a nuevos
conjugados de fármaco-vehículo y a estrategias de
síntesis convenientes para su producción. En consecuencia, la
presente invención se refiere a métodos de síntesis, intermedios y
por último a productos finales útiles para la absorción y
liberación de compuestos que contienen un grupo amino biológicamente
activo.
En particular, la invención se refiere a
compuestos de fórmula general I
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{2} se selecciona del grupo
compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde los grupos
alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más
alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo,
alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} es una substancia que
contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el
grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido
natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de
R^{4} y R^{5} es OR^{6} donde R^{6} es hidrógeno, un metal
alcalino o una carga negativa;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero entre cero y 10.
La presente invención se refiere también a
compuestos de fórmula general II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o
arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente
substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un
hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de
4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un
tensioactivo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
La presente invención se refiere también a
compuestos de fórmula general III
o una sal farmacéuticamente
aceptable de los
mismos,
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o
arilo, donde los grupos alquilo y arilo están opcionalmente
substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
La presente invención se refiere también a
métodos de formación de conjugados de fórmula general I a partir de
compuestos de fórmula general II y una substancia que contiene un
grupo amino biológicamente activo.
La presente invención se refiere también a
métodos de formación de compuestos de fórmula general II a partir
de derivados de ácido maleico y los tioles o alcoholes
correspondientes.
La presente invención se refiere también a
métodos para aumentar la absorción o prolongar la retención en
sangre y en tejidos en un mamífero de una substancia que contiene
un grupo amino biológicamente activo, en los que un conjugado de
fórmula general I se administra al mamífero en una forma
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere también a
métodos para aumentar la liberación de compuestos que contienen
amina hidrófila en el interior de una célula que tiene una barrera
mucosa, en los que un conjugado de fórmula general I se pone en
contacto con la célula con lo que el conjugado penetra la barrera
mucosa de la célula y la amina libre se libera mediante la
hidrólisis de un enlace amida.
La presente invención también se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula
general I.
Las anteriores y otras características, ventajas,
realizaciones, aspectos y objetos de la presente invención serán
evidentes para los especialistas en la técnica en las áreas de la
técnica pertinente, basándose en la descripción, contenido y
directrices presentadas en este documento.
La fig. 1 muestra la dependencia del pH de la
liberación de tiramina de un reactivo vehículo de lipidización
(REAL-tiramina) de acuerdo con la invención. Los
datos muestran la media y la desviación típica de 3
experimentos.
La fig. 2 muestra la producción acumulativa de
orina de ratas diabéticas después de la inyección subcutánea de 5
\mug/kg de AVP (arginina vasopresina),
palmitil-AVP y REAL-AVP de acuerdo
con la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica
de las mediciones de 3 ratas.
La fig. 3 muestra la producción acumulativa de
orina de ratas diabéticas durante 24 horas después de la inyección
subcutánea de 5 \mug/kg de AVP, palmitil-AVP y
REAL-AVP de acuerdo con la invención. Los datos
muestran la media y la desviación típica de 3 experimentos.
La fig. 4 muestra el cambio en el nivel de
glucosa en sangre en ratas diabéticas en ayunas después de la
inyección subcutánea de 0,35 U/kg de insulina en comparación con la
inyección subcutánea de 0,35 U/kg de REAL-insulina
de la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica
de las mediciones realizadas con 2 ratas.
La fig. 5 muestra el efecto prolongado sobre los
niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas en ayunas de la
inyección subcutánea de 0,5 U/kg de insulina en comparación con la
inyección subcutánea de 0,5 U/kg de REAL-insulina de
la invención. Los datos muestran la media y la desviación típica de
las mediciones realizadas con 2 ratas.
La fig. 6 muestra el efecto a corto plazo sobre
el nivel de glucosa en sangre de ratas diabéticas en ayunas después
de la administración oral de 10 U/kg de
REAL-insulina, insulina y placebo. Los datos
muestran la media y la desviación típica de las mediciones
realizadas con cuatro ratas.
De acuerdo con la presente invención, un
compuesto que contiene una amina biológicamente activa (por
ejemplo, un aminoácido, péptido o proteína) se une a un derivado
lipófilo mediante un enlace amida reversible. El grupo lipófilo de
tal conjugado se une al lado apical de una membrana celular y
facilita el transporte del conjugado a través de la membrana
celular. Una vez dentro de la membrana celular, el compuesto que
contiene la amina biológicamente activa se libera dentro del fluido
intersticial como resultado de la hidrólisis del enlace amida.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporcionan conjugados de fórmula general I
en la que R^{2} es hidrógeno,
halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están
opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo,
alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi,
alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} representa una
substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo
seleccionado entre el grupo compuesto por fármacos que contienen
amina, aminoácidos naturales o no naturales, péptidos y proteínas y
el otro de R^{4} y R^{5} es OR^{6}, donde R^{6} representa
hidrógeno, un metal alcalino o una carga negativa;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan compuestos de fórmula general II
en la que R^{2} es hidrógeno,
halo, alquilo o arilo, donde los grupos alquilo y arilo están
opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo,
alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi,
alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un
hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de
4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o éster del mismo, o un
tensioactivo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan compuestos de fórmula general III
o una sal inocua farmacéuticamente
aceptable de los
mismos,
en la que R^{2} es hidrógeno, halo, alquilo o
arilo, en la que los grupos alquilo y arilo están opcionalmente
substituidos con uno o más alcoxi, alcoxialquilo, alcanoílo, nitro,
cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, alcanoiloxi, alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es O o S;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
Los grupos alquilo típicos incluyen grupos
alquilo con 1 a 6 átomos de carbono que incluyen metilo, etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, pentilo, 2-pentilo,
3-pentilo, neopentilo, hexilo,
2-hexilo, 3-hexilo,
2-metil-1-pentilo,
3-metil-1-pentilo,
4-metil-1-pentilo y
similares.
Los grupos alcoxi típicos incluyen oxígeno
substituido con cualquiera de los grupos alquilo mencionados
anteriormente.
Los grupos alcoxialquilo típicos incluyen
cualquiera de los grupos alquilo anteriores substituido con un
grupo alcoxi, tales como metoximetilo, etoximetilo, propoximetilo,
butoximetilo, pentoximetilo, hexoximetilo, metoxietilo,
metoxipropilo, metoxibutilo, metoxipentilo, metoxihexilo y
similares.
Los grupos arilo preferidos son grupos arilo con
6 a 14 átomos de carbono y típicamente incluyen grupos fenilo,
naftilo, fluorenilo, fenantrilo y antracilo.
Los grupos arilo substituidos con alcoxi típicos
incluyen los grupos arilo anteriores substituidos con uno o más de
los grupos alcoxi anteriores, por ejemplo,
3-metoxifenilo, 2-etoxifenilo y
similares.
Los grupos arilo substituidos con alquilo típicos
incluyen cualquiera de los grupos arilo anteriores substituidos con
cualquiera de los grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono,
incluyendo el grupo Ph(CH_{2})_{n}, donde n es
1-6, por ejemplo, tolilo, o-, m- y
p-xililo, etilfenilo, 1-propilfenilo,
2-propilfenilo, 1-butilfenilo,
2-butilfenilo, t-butilfenilo,
1-pentilfenilo, 2-pentilfenilo,
3-pentilfenilo.
Los grupos alquenilo típicos incluyen grupos
alquenilo con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, grupos etenilo,
2-propenilo, isopropenilo,
2-butenilo, 3-butenilo,
4-pentenilo, 3-pentenilo,
2-pentenilo, 5-hexenilo,
4-hexenilo, 3-hexenilo y
2-hexenilo.
Los grupos alquinilo típicos incluyen grupos
alquinilo con 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, grupos etinilo,
2-propenilo, 2-butinilo,
3-butinilo, 4-pentinilo,
3-pentinilo, 2-pentinilo,
5-hexinilo, 4-hexinilo,
3-hexinilo y 2-hexinilo.
Los grupos arilo substituidos con alquenilo o
alquinilo típicos incluyen cualquiera de los grupo arilo con 6 a 14
átomos de carbono anteriores substituidos con cualquiera de los
grupo alquenilo con 2 a 6 átomos de carbono o alquinilo con 2 a 6
átomos de carbono anteriores, por ejemplo, grupos etenilfenilo,
1-propenilfenilo, 2-propenilfenilo,
1-butenilfenilo, 2-butenilfenilo,
1-pentenilfenilo, 2-pentenilfenilo,
3-pentenilfenilo, 1-hexenilfenilo,
2-hexenilfenilo, 3-hexenilfenilo,
etinilfenilo, 1-propinilfenilo,
2-propinilfenilo, 1-butinilfenilo,
2-butinilfenilo, 1-pentinilfenilo,
2-pentinilfenilo, 3-pentinilfenilo,
1-hexinilfenilo, 2-hexinilfenilo y
3-hexinilfenilo.
Los grupos halo típicos incluyen flúor, cloro,
bromo y yodo.
Los grupos alquilo substituidos con halo típicos
incluyen grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono substituidos
con uno o más átomos de flúor, cloro, bromo o yodo, por ejemplo,
grupos fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo,
pentafluoroetilo, 1,1-difluoroetilo y
triclorometilo.
Los grupos alcanoílo típicos incluyen grupos
alcanoílo C_{1-5}C(O), por ejemplo, grupos
acetilo, propionilo, butanoílo, pentanoílo y hexanoílo, o con un
grupo arilalcanoílo, por ejemplo, un grupo alcanoílo
C_{1-5}C(O) substituido con cualquiera de
los grupos arilo anteriores.
Los grupos cicloalquilo típicos incluyen grupos
cicloalquilo con 3 a 8 átomos de carbono, e incluyen grupos
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y
ciclooctilo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan métodos de formación de conjugados de
fórmula general I a partir de compuestos de fórmula general II y
una substancia que contiene un grupo amino.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporcionan métodos de formación de compuestos de
fórmula II a partir de derivados de ácido maleico, tioles y
alcoholes.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporcionan métodos para aumentar la absorción o
prolongar la retención en sangre y tejidos en un mamífero de una
substancia que contiene un grupo amino biológicamente activo, en los
que un conjugado de fórmula general I se administra al mamífero
(por ejemplo, en forma de emulsiones, nanopartículas (por ejemplo,
nanopartículas lipídicas sólidas), liposomas, microesferas,
microcápsulas, aerosoles, por inhalación y formas de dosificación
transdérmica).
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención se proporcionan métodos para aumentar la liberación de
compuestos hidrófilos que contienen amina en el interior de una
célula que tiene una barrera mucosa, en los que un conjugado de
fórmula general I se pone en contacto con la célula con lo que el
conjugado penetra la barrera mucosa de la célula y la amina libre se
libera por hidrólisis de un enlace amida.
El término "grupo lipófilo" según se usa en
este documento se refiere a un lípido de origen natural per
se, un hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que
comprende de 4 a 26 átomos de carbono, preferiblemente de 5 a 19
átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un
tensioactivo. Los grupos lipófilos adecuados incluyen, pero sin
limitación, grupos alcanoílo de cadena larga incluyendo: palmitilo
(C_{15}H_{31}), oleílo (C_{15}H_{29}), estearilo
(C_{17}H_{35}), laurilo (C_{11}H_{23}), colilo y miristilo
(C_{13}H_{27}).
El término "aminoácido natural o no natural"
según se usa en este documento se refiere a cualquiera de los 21
aminoácidos de origen natural así como a la forma D de los
aminoácidos, a la forma L- y D- de aminoácidos bloqueados tales como
los bloqueados por amidación o acilación, aminoácidos substituidos
(por ejemplo, los substituidos con un grupo alquilo impedido
estéricamente o un grupo cicloalquilo tal como ciclopropilo o
ciclobutilo) en el que la substitución introduce una restricción
conformacional en el aminoácido. Los aminoácidos de origen natural
preferidos para uso en la presente invención como aminoácidos o
componentes de un péptido o proteína son alanina, arginina,
asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, ácido
\gamma-glutámico, glutamina, glicina, histidina,
isoleucina, norleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina,
fenilalanina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina,
triptófano, tirosina, valina,
\gamma-carboxiglutamato o
O-fosfoserina. Los aminoácidos de origen no natural
preferidos para uso en la presente invención como aminoácidos o
componentes de péptidos o proteínas son cualquiera de los
\beta-aminoácidos, por ejemplo,
\beta-alanina, ácido
\alpha-amino butírico, ácido
\gamma-amino butírico, ácido
\gamma-(aminofenil)butírico, ácido
\alpha-amino isobutírico, ácido
\varepsilon-amino caproico, ácido
7-amino heptanoico, ácido amino benzoico, ácido
aminofenil acético, ácido aminofenil butírico, cisteína (ACM),
metionina sulfona, fenilglicina, norvalina, ornitina,
\delta-ornitina,
p-nitro-fenilalanina, ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico
y tioprolina. También se contemplan derivados de aminoácido de la
fórmula:
en la que p es
1-10.
La expresión "substancia que contiene un grupo
amino biológicamente activo" según se usa en este documento se
refiere a cualquier substancia que tiene actividad biológica cuando
se introduce dentro de una célula e incluye en su estructura una
amina primaria o secundaria capaz de formar un enlace amina
mediante acilación. Las substancias que no incluyen una amina
primaria o secundaria se pueden derivatizar adecuadamente de manera
que puedan conjugarse con compuestos de fórmula general II o III.
Por ejemplo, los compuestos que tienen grupos carboxi pueden
reaccionar con una diamina adecuada, por ejemplo, una diamina con 2
a 10 átomos de carbono tal como etilendiamina, propilendiamina,
1,4-diaminobutano, espermina o espermidina y
similares en presencia de un compuesto de fórmula general II o III
y un reactivo de acoplamiento de carbodiimida soluble en agua (por
ejemplo, EDC). De esta manera, la diamina sirve como medio para
acoplar un compuesto biológicamente activo, que no incluye una amina
primaria o secundaria, a un compuesto de fórmula general II o III
mediante la formación e un enlace amida.
Los fármacos que contienen amida preferidos
incluyen, pero sin limitación, tiramina, arginina, vasopresina,
insulina (Czech, M.P., Ann. Rev. Biochem. 46: 359 (1977)),
calcitonina (Brown, E.M. y Aurbach, G.D., Vitam. Horm. 38:
236 (1980)), desmopresina (Vavra, et al., J. Pharmacol. Exp.
Ther. 188: 241 (1974)), interferón \alpha, \beta y \gamma
(Stiem, E.R., Ann. Rev. Inter. Med. 96:
80-93 (1982)), interleuquina-2, -3,
-4, -6 y -11 (Kluth, D.C. y Rees, A.J., Semin. Nephrol. 16:
576-582 (1996)); Holyoake, T.L., Blood Rev.
10: 169-200 (1996)), G-CSF
(Spiekermann, K., et al., Leukemia 11:
466-478 (1997)), GM-CSF (Jonuleit,
H., et al., Arch. Dermatol. Res. 289: 1-8
(1996)), hormona del crecimiento humana (Strobl, J.S. y Thomas,
M.J., Pharmacol. Rev. 46: 1-34 (1994)),
eritropoyetina (Spivak, J.L., Semin. Hematol. 30:
2-11 (1993)), vasopresina (Schroder, E. y Lubke, K.,
The Peptide 2: 336-350 (1966)), octreotida
(Sheppard, M.C. y Stewart, P.M., Metabolism: Clinical and
Experimental 45: 63-64 (1996)), aprotinina
(Haderland, G. y McConn, R., Fed. Proc. 38:
2760-2767 (1979)), oxitocina (Nachtmann, F., et
al., en Anal. Prof. Drug Subst., Vol. 10, Florey, K.,
ed., Academic Press, New York, NY (1981), pág.
563-600), \beta-TGF (Moses, H.L.
y Serra, R., Curr. Opin. Genet. Dev. 6:
581-586 (1996)), BDNF (Apfel, S.C. y Kessler, J.A.,
Baillieres. Clin. Neurol. 4: 593-606 (1995)),
b-FGF (Bikfalvi, A., et al., Endocr. Rev. 18:
26-45 (1997)), PDGF (Hughes, A.D., et al., Gen.
Pharmacol. 27: 1079-1089 (1996)), TNF (Majno,
P.E., et al., Swiss. Surg. 4: 182-185
(1995)), péptido natriurético auricular (Nakao, K., Curr. Opin.
Nephrol. Hypertens. 2: 45-50 (1993)), relaxina
(Schwabe, C., et al., Recent. Progr. Horm. Res. 34:
123-211 (1978)), amirina (Rink, T.J., et al.,
Trenes. Pharmacol. Sci. 14: 113-118 (1993)),
desoxirribonucleasa (Laskowski, en The Enzymes, Vol. 2,
Boyer, P.D., ed., Academic Press, New York, NY (1971), pág.
289-311), EGF (Carpenter, G., Curr. Opin. Cell
Biol. 5: 261-264 (1993)), hirudina (Markwardt,
Methods. Enzymol. 19: 924 (1970)), neocarzinostatina (Dedon,
P.C. y Goldberg, I.H., Chem. Res. Toxicol.
311-332 (1992)), péptido hemorregulador (Paukovits,
W.R., et al., Cancer Treat. Rev. 17: 347-354
(1990)) y somatostatina (Moss, R.L., Ann. Rev. Physiol. 41:
617 (1979)).
Para los fines de la presente invención, el
término "péptido" se refiere a cadenas de aminoácidos
naturales o no naturales que comprende de dos a 100 aminoácidos y el
término "proteína" a cadenas de aminoácidos naturales o no
naturales que comprenden más de 100 aminoácidos. Las proteínas y
los péptidos se pueden aislar de fuentes naturales o se pueden
preparar por medios bien conocidos en la técnica, tales como
tecnología de ADN recombinante o síntesis en estado sólido. Se
contempla que los péptidos y proteínas usados de acuerdo con la
presente invención pueden comprender sólo
L-aminoácidos de origen natural, combinaciones de
L-aminoácidos y otros aminoácidos (incluyendo
D-aminoácidos y aminoácidos modificados) o solo
aminoácidos distintos de L-aminoácidos. Para formar
un conjugado de fórmula general I, el péptido o la proteína debe
llevar al menos un grupo amina reactivo. El grupo amina reactivo
puede ser parte de una cadena lateral de aminoácido, o un grupo
amino terminal de la estructura principal del péptido o proteína, o
se puede introducir por modificación química de grupos funcionales
en moléculas de péptidos o proteínas. Los péptidos pueden ser homo-
o hetero-péptidos y pueden incluir aminoácidos
naturales, aminoácido sintéticos o cualquier combinación de los
mismos.
También se incluyen en el alcance de la presente
invención las sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas de los
compuestos de la invención. En particular, se contemplan los
carboxilatos de metales alcalinos, formados por métodos conocidos
tales como la adición de un haluro de metal alcalino al ácido
carboxílico correspondiente. Tales sales incluyen las sales de
sodio, potasio, litio y amonio.
La expresión "carga negativa" como se usa en
este documento se refiere a cualquier par solitario de electrones
no solvatado, solvatado o complejado capaz de proporcionar carácter
aniónico a un grupo carboxilato.
La expresión "metal alcalino" como se usa en
este documento se refiere a cualquier metal del grupo I o del grupo
II, por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio y magnesio.
El sujeto animal preferido de la presente
invención es un mamífero. El término "mamífero" se refiere a
un individuo que pertenece a la clase Mammalia (mamíferos). La
invención es particularmente útil en el tratamiento de pacientes
humanos.
El término "tratar" se refiere a la
administración a los sujetos de un conjugado de lipidización para
propósitos que pueden incluir la prevención, mejora o cura de una
enfermedad o afección.
Se considera que los medicamentos se proporcionan
"en combinación" con otro si se proporcionan al paciente
simultáneamente o si el tiempo entre la administración de cada
medicamento es tal que permita un solapamiento de la actividad
biológica.
En una realización preferida, hay presente al
menos un conjugado o se administra como parte de una composición
farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas para
administración de acuerdo con la presente invención pueden
comprender al menos un conjugado de acuerdo con la presente
invención en una forma farmacéuticamente aceptable opcionalmente en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas
composiciones se pueden administrar por cualquier medio que consiga
sus propósitos pretendidos. Por ejemplo, la administración puede
ser por vía oral, parenteral, subcutánea, intravenosa,
intramuscular, intra-peritoneal, transdérmica,
intratecal, intracraneal o intranasal. La dosificación administrada
dependerá de la edad, salud y peso del receptor, clase de
tratamiento simultáneo, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento,
y la naturaleza del efecto deseado. Los especialistas en la técnica
del tratamiento clínico pueden determinar fácilmente las cantidades
y regímenes de administración de acuerdo con la presente
invención.
La forma de administración también puede incluir
emulsiones, nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas
sólidas), liposomas, microesferas, microcápsulas, aerosoles,
mediante inhalación y formas de dosificación transdérmicas.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos en forma
soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos se
pueden administrar apropiadamente como suspensiones en aceite para
inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen
aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos
grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las
suspensiones acuosas para inyección pueden contener substancias que
aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo,
carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente,
las soluciones y/o suspensiones acuosas pueden contener también
estabilizantes y/o tampones, tales como tampón borato y
similares.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención se preparan de una manera ya conocida, por ejemplo,
mediante procesos convencionales de mezcla, granulación,
preparación de grageas, procesos de disolución o liofilización. De
esta forma, las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden
obtener combinando los compuestos activos con excipientes sólidos,
opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la
mezcla de gránulos, añadiendo después los compuestos auxiliares
adecuados, si se desea o es necesario, para obtener comprimidos o
núcleos de grageas.
Los excipientes adecuados son, por ejemplo,
cargas tales como sacáridos, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol;
preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, tales como fosfato
tricálcico o hidrogenofosfato cálcico; así como aglutinantes tales
como pasta de almidón, usando, por ejemplo, almidón de maíz,
almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,
tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa,
carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona. Si se desea,
se pueden añadir agentes disgregantes tales como los almidones
mencionados anteriormente y además carboximetilalmidón,
polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del
mismo, tal como alginato sódico. Los compuestos auxiliares son,
sobre todo, agentes de regulación del flujo y lubricantes, por
ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales
como estearato de magnesio o estearato cálcico y/o
polietilenglicol. Los núcleos de gragea se proporcionan con los
recubrimientos adecuados que, si se desea, son resistentes a los
jugos gástricos. Para este fin pueden usarse soluciones concentradas
de sacáridos que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco,
polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio,
soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de
disolventes. Para producir recubrimientos resistentes a los jugos
gástricos, se usan soluciones de preparaciones adecuadas de celulosa
tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa. Los recubrimientos también se pueden
proporcionar para proteger los conjugados de lipidización de la
presente invención de la exposición prematura a un medio
suficientemente ácido para hidrolizar el enlace amida formado entre
el fármaco activo, el péptido o proteína y el vehículo. Véanse las
Patentes de Estados Unidos Nº 4.786.505 y 4.853.230 para los
métodos de preparación de unidades de dosificación con núcleos que
están protegidos de los ácidos gástricos. Preferiblemente, el
núcleo es neutro o básico. Los núcleos básicos contienen uno o más
compuestos alcalinos reactivos, tales como los descritos en las
Patentes de Estados Unidos Nº 4.786.505 y 4.853.230. Se pueden
añadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los
comprimidos o grageas, por ejemplo, para la identificación con el
fin de caracterizar las combinaciones de dosis de los compuestos
activos.
Otras preparaciones farmacéuticas que se pueden
usar incluyen, pero sin limitación, cápsulas enchufables orales
hechas de gelatina, supositorios rectales, formulaciones de
inhalación para la administración oral y/o nasal, cremas nasales o
rectales o ungüentos, opcionalmente en combinación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, un potenciador de la penetración, un
excipiente y/o una carga. Los potenciadores de la penetración
adecuados para el uso incluyen potenciadores de la penetración
catiónicos, aniónicos, anfóteros y neutros, tales como cloruro de
benzalconio, clorbutanol, AZONE y otros conocidos en la
técnica.
La síntesis de compuestos ejemplares de la
fórmula general II se ilustra en los esquemas 1 y 2. En general, se
deja reaccionar un derivado de anhídrido bromometilmaleico o su sal
maleato con un grupo lipófilo que lleva alcohol o tiol para formar
un éter o un tiol éter de fórmula general III. El grupo lipófilo
que lleva alcohol o tiol opcionalmente incluye un resto aminoacídico
natural o no natural de unión que une el átomo de oxígeno o azufre
y el carbonilo unido al grupo lipófilo. El resto aminoacídico de
unión natural o no natural se puede conectar al átomo de oxígeno o
azufre o el carbonilo unido al grupo lipófilo en el extremo amino,
extremo carboxilo o cadena lateral del aminoácido. Con referencia al
esquema I, Pal-cisteína incluye eficazmente una
unión de glicina unida al carbonilo en el extremo amino y al átomo
de azufre mediante la cadena lateral. El uso de hexadecanotiol como
en el esquema 2 representa la formación de compuestos de fórmula
III sin el aminoácido de unión natural o no natural. Después, el
producto de fórmula general III se somete a condiciones de
deshidratación para reformar el anhídrido maleico ahora substituido
por la unión éter o tioéter con un grupo lipófilo, dando compuestos
de fórmula general II. Los especialistas en la técnica apreciarán
una diversidad de esquemas de síntesis alternativos que pueden dar
lugar a los compuestos deseados.
Esquema
1
Síntesis del reactivo
A
Esquema
2
Síntesis del reactivo
B
Los esquema 3-5 explican la
síntesis de conjugados de lipidización sensibles a pH ejemplares de
acuerdo con la presente invención. En general, se permite reaccionar
a un fármaco que contiene amina, un aminoácido, un péptido o una
proteína con un compuesto de fórmula II para formar una amida de
fórmula I. El enlace de amida se forma en condiciones alcalinas,
preferiblemente en una solución acuosa tamponada. A menor pH,
incluyendo el pH encontrado típicamente in vivo, el enlace de
amida se hidroliza liberando la amina libre y un compuesto de
fórmula III. La formación del enlace de amida reversible
proporciona un mecanismo para la conjugación de una amina hidrófila
con un reactivo de lipidización a un pH y liberación de tal amina
del reactivo de lipidización a un pH menor.
Esquema
3
Lipidización de tiramina
(REAL-tiramina)
Esquema
4
Lipidización de Arg. vasopresina
(REAL-AVP)
\newpage
Esquema
5
Lipidización de insulina
(REAL-insulina)
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado de disulfuro de piridina de
N-palmitil-cisteína
(Pal-CPD) se obtuvo por métodos conocidos.
Pal-CPD se sintetizó de acuerdo con el procedimiento
de Ekrami et al., FEBS Letters 371: 283-286
(1995). Se disolvió Pal-CPD (0,7 g, 0,0015 mol) en
10 ml de NaOH pH 11. Se disolvió ditiotreitol (DTT) (0,9 g, 0,006
mol) en 5 ml de agua. La solución de Pal-CPD se
añadió gota a gota a la solución de DTT con agitación continua y a
temperatura ambiente. La reacción finalizó después de 2 horas. El
pH de la mezcla se ajustó a 3 usando HCl 0,01 N, apareciendo un
precipitado blanco (Pal-cisteína). El precipitado
se lavó 5 veces usando HCl diluido para retirar la cantidad en
exceso de DTT.
El material de partida, anhídrido
3-bromometil, 2-metil maleico
(Br-DMMA) se obtuvo por la adición de un
equivalente de radical bromuro a anhídrido
2,3-dimetil maleico (DMMA). Por consiguiente, se
calentaron DMMA (1,5 g, 0,012 mol), NBS (2,3 g, 0,013 mol), peróxido
de benzoílo (0,3 g, 0,0012 mol) y óxido de magnesio (0,02 g, 0,0005
mol) en 40 ml de cloroformo a reflujo durante 4 horas. La mezcla se
filtró y el cloroformo se evaporó a presión reducida. Al residuo
marrón se le añadieron 40 ml de tetracloruro de carbono y se
filtró. El filtrado se recogió y el disolvente se retiró a presión
reducida. Se obtuvo un aceite transparente con un color verdoso
claro, que solidificó después de almacenarlo a 4ºC.
Haciendo referencia al esquema 1, se hace
reaccionar Br-DMMA con Pal-cisteína
para dar un tiol éter de Pal-cisteína de fórmula III
donde R^{1} es hidrógeno, R^{2} es metilo, R^{3} es palmitilo
(C_{15}H_{31}), X es azufre, Y es un radical glicina
(-NHCH(CO_{2}H)-), n = 1 y m = 1. La reacción se realiza
por la adición de Br-DMMA (0,3 g, 0,0014 mol)
directamente a una suspensión de Pal-cisteína en 30
ml de HCl diluido a temperatura ambiente. El pH de la mezcla se
ajustó gradualmente a 7,9 y finalmente a 11 usando NaOH 1 N. El pH
de la mezcla se estabilizó después de 2 horas a pH 11. Después de 16
horas de agitación a 25ºC, la mezcla se filtró y el filtrado se
acidificó usando HCl 1 N. Apareció un precipitado blanco que se
extrajo con éter. El éter se evaporó a presión reducida. El aceite
verdoso restante se secó a alto vacío. Se obtuvo ácido
3-S-(N-palmitil
cisteinil)metil, 2-metil maleico (420 mg,
0,84 mmol) con un punto de fusión de 60-63ºC. El
rendimiento molar fue del 56%.
El ácido
3-S-(N-palmitil
cisteinil)metil, 2-metil maleico (420 mg,
0,84 mmol) se disolvió en 5 ml de THF seco. Se disolvió
N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (692 mg, 3,36
mmol) en 1 ml de THF y se añadió a la solución anterior en un baño
de hielo. La reacción se agitó en un baño de hielo durante 5 horas
y después se filtró. El filtrado se recogió y el THF se retiró a
presión reducida. El residuo (sólido pardusco) se disolvió en 1,5
ml de dioxano seco y se filtró. El filtrado se añadió a 30 ml de
hexano seco frío y se mantuvo a 4ºC durante 16 horas. El precipitado
obtenido se lavó usando hexano seco frío y se aplicó a alto vacío
para retirar el disolvente. Se obtuvo un producto pardusco claro
(reactivo A) con un punto de fusión de 46-49ºC. El
rendimiento molar fue del 54%.
Haciendo referencia al esquema 2, se hace
reaccionar Br-DMMA con hexadecanotiol para dar un
tiol éter de fórmula III donde R^{2} es metilo, R^{3} es
hexadecano (C_{16}H_{33}), n = 0 y m = 0. En condiciones de
deshidratación, se obtiene el anhídrido reactivo B de fórmula II,
donde R^{2}, R^{3}, n y m son como se han definido
anteriormente.
Por consiguiente, como se indica en el esquema 2,
se hidrolizó Br-DMMA (0,5 g, 0,0025 mol) en 10 ml
de agua a pH 8 y se añadió a 0,63 g de hexadecanotiol (0,0025 mol)
disuelto en 50 ml de THF. Se añadió trietilamina (1 ml) a la mezcla
y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se filtró y el filtrado se evaporó a presión reducida. El
residuo obtenido se disolvió en una solución diluida de NaOH (pH
11) y se lavó con éter (3 x 20 ml). El filtrado se ajustó a pH 2
usando HCl 1 N y apareció un precipitado blanco. El precipitado se
extrajo en éter y el éter se retiró a presión reducida. El producto
final, ácido 3-(hexadecaniltio)metil, 2-metil
maleico, se secó a alto vacío.
El ácido 3-(hexadecaniltio)metil,
2-metil maleico se deshidrató para dar el reactivo
B usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para el
reactivo A. El reactivo B se disolvió en DMF caliente y se mantuvo
a 4ºC durante 16 horas. Apareció un precipitado blanco que se lavó
usando DMF fría. El disolvente se retiró a alto vacío. Se obtuvo un
polvo blanco (73 mg) con un rendimiento molar del 16%.
Se disolvió el reactivo A (2 mg, 0,00426 mmol) en
60 \mul de DMF seca y se añadió a 0,2 mg (0,00146 mmol) de
tiramina en 200 \mul de tampón borato USP (pH 10, 0,1 M) en un
baño de hielo. La reacción se realizó durante 4 horas en un baño de
hielo y durante 16 horas a 4ºC.
Se determinó la dependencia al pH de la formación
del enlace amida controlando la concentración de la tiramina libre.
Se prepararon tampones fosfato 1 M a pH 6, 7 y 8. Se diluyó
REAL-tiramina 1:2 usando estos tampones. La solución
madre de tiramina también se diluyó para tener la misma
concentración de REAL-tiramina y se usó como
control. Las muestras se incubaron a 37ºC. La fluorescencia de la
tiramina libre liberada de REAL-tiramina se
determinó en diferentes momentos usando una reacción de
fluorescamina.
Después de la lipidización de tiramina, la
concentración de tiramina libre disminuyó hasta el 15% de la
concentración original. La incubación de
REAL-tiramina a bajo pH dio como resultado un
aumento en la concentración de tiramina libre indicando la escisión
del enlace amida. La velocidad de hidrólisis del enlace amida era
dependiente del pH (pH 6 > pH 7 > pH 8). Después de 1 hora de
incubación de REAL-tiramina a pH 6, el enlace amida
se había hidrolizado casi totalmente, sin embargo, a pH 7 se
hidrolizó aproximadamente el 45% y a pH 8 sólo el 7% del enlace
amida de REAL-tiramina (Fig. 1).
Se disolvió arginina vasopresina (AVP) (0,5 mg)
en 1 ml de tampón borato (pH 10, 0,1 M). Se hizo reaccionar una
alícuota de 0,5 ml (0,25 mg, 0,207 \mumol) de esta solución en un
baño de hielo con 1 mg (2,1 \mumol) del reactivo A disuelto en 50
\mul de dimetilformamida (DMF) seca. La mezcla se agitó durante
16 horas a 4ºC. La concentración final de REAL-AVP
fue de 0,455 mg/ml.
Se inyectó REAL-AVP por vía
subcutánea en animales (5 \mug/kg) y se recogió la orina a
diferentes puntos de tiempo. La figura 2 muestra el volumen
acumulativo de orina durante las primeras 8 horas después de la
inyección. AVP y Pal-AVP tienen efectos similares
con un retraso en la excreción de orina de 4 horas. Se observó un
retraso mayor en la excreción de orina, de hasta 6 horas, después
de la inyección de REAL-AVP. La lipidización directa
de AVP a ácido palmítico, Pal-AVP, no fue tan
eficaz como REAL-AVP. La cantidad de excreción de
orina volvió a la original 24 horas después de la inyección de
Pal-AVP y AVP. Sin embargo, el efecto de
REAL-AVP duró 3 días (Fig. 3).
Se puede concluir que la lipidización sensible al
pH de AVP prolonga la actividad biológica de AVP.
Se disolvió insulina (2 mg) en 2 ml de tampón
borato (pH 10, 0,1 M). El reactivo A (1 mg, 2,1 \mumol) se
disolvió en 100 \mul de DMF y se hizo reaccionar con 1 ml (1 mg,
aproximadamente 0,14 \mumol) de solución de insulina en un baño de
hielo. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a 4ºC y
después se dializó contra 500 ml de tampón borato (pH 10, 0,01 M)
durante 24 horas a 4ºC. El volumen de REAL-insulina
dializada se ajustó a 2 ml usando tampón borato (pH 10, 0,1 M) para
dar una concentración de 0,5 mg/ml de REAL-insulina.
El volumen de solución madre de insulina (1 ml) también se ajustó a
2 ml para dar una concentración de 0,5 mg/ml.
Se indujo diabetes en ratas Sprague Dawley usando
inyección i.v. de 60 mg/kg de estreptozotocina. Se prepararon
soluciones de 0,5 unidades/ml de insulina o
REAL-insulina en tampón borato (pH 10, 0,1 M). Las
ratas se dejaron en ayunas durante las 16 horas previas al
experimento y se les inyectaron por vía subcutánea 0,5 unidades/kg
de insulina o REAL-insulina. Se controló el nivel de
glucosa en sangre de las ratas en diferentes puntos de tiempo
durante 9 horas. Después de este periodo de tiempo, se administró
alimento a las ratas y se midió el nivel de glucosa en sangre
después de 15 horas de alimentación. Las ratas se dejaron en ayunas
de nuevo y se midió el nivel de glucosa en sangre después de 16
horas. El periodo de ayuno y alimentación continuó durante 3
días.
El nivel de glucosa en sangre de las ratas
aumentó una semana después de inducir la diabetes desde una media
de 100 mg/dl a 420 mg/dl (ratas sin ayuno). En las ratas tratadas
con insulina, se observó una caída significativa en el nivel de
glucosa en sangre en la primera hora. Sin embargo, en ratas
tratadas con REAL-insulina no hubo cambios en el
nivel de glucosa en sangre en la primera hora y se observó una
caída significativa de la glucosa en sangre en las primeras 2 horas
después de la inyección (fig. 4). Esto se debe posiblemente al
tiempo necesario para que la REAL-insulina se
hidrolice y libere la insulina libre. Después de la inyección de
insulina, el nivel de glucosa en sangre en ayunas de las ratas
volvió al original en 24 horas. Sin embargo, en el caso de ratas
tratadas con REAL-insulina, el efecto del fármaco
sobre el nivel de glucosa en sangre duró 3 días (fig. 5). A las
ratas diabéticas en ayunas también se les administraron por vía
oral 10 U/kg de insulina, REAL-insulina y placebo.
Las ratas se dejaron en ayunas durante las 16 horas previas a la
administración oral. Se usó una microemulsión de agua/aceite como
vehículo del fármaco. La figura 6 no muestra ninguna reducción
significativa en el nivel de glucosa en sangre observado después de
la administración oral de insulina o placebo. Sin embargo, en ratas
tratadas con REAL-insulina, se observó una
reducción del 28% del nivel de glucosa en sangre en 9 horas.
Puede concluirse que usando
REAL-insulina, se puede prolongar la actividad
biológica de la insulina. Usando una formulación apropiada,
REAL-insulina se puede administrar por vía oral
para reducir los niveles de glucosa en sangre.
Claims (17)
1. Un compuesto de fórmula general I
en la que R^{2} se selecciona del
grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el
alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o más
alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo,
aciloxi, alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
uno de R^{4} y R^{5} es una substancia que
contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionada entre el
grupo compuesto por un fármaco que contiene amina, un aminoácido
natural o no natural, un péptido y una proteína y el otro de
R^{4} y R^{5} es OR^{6}, donde R^{6} se selecciona entre el
grupo compuesto por hidrógeno, un metal alcalino o una carga
negativa;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicho fármaco que contiene amina es tiramina.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que dicho péptido se selecciona entre el grupo compuesto
por Arg. Vasopresina e insulina.
4. Un compuesto de fórmula general II
en la que R^{2} se selecciona
entre el grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo,
donde el alquilo o arilo están opcionalmente substituidos con uno o
más alcoxi, alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo,
aciloxi, alquilo o átomos de
halógeno;
R^{3} es un lípido de origen natural, un
hidrocarburo hidrófobo ramificado o no ramificado que comprende de
4 a 26 átomos de carbono, un ácido graso o un éster del mismo, o un
tensioactivo;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
5. Un compuesto de fórmula general III
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en la que R^{2} se selecciona entre el grupo
compuesto por hidrógeno, halo, alquilo o arilo, donde el alquilo o
arilo están opcionalmente substituidos con uno o más alcoxi,
alcanoílo, nitro, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, aciloxi,
alquilo o átomos de halógeno;
R^{3} es un grupo lipófilo;
X es oxígeno o azufre;
Y es un aminoácido de unión natural o no
natural;
n es cero o 1; y
m es un número entero de cero a 10.
6. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 4 y 5 en el que R^{2} es metilo y X es
azufre.
7. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 4 y 5 en el que n=0, m=0 y R^{3} es un
hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de 4 a 26 átomos de
carbono.
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
7, en el que dicho hidrocarburo de cadena lineal o ramificada tiene
de 5 a 19 átomos de carbono.
9. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 7 y 8, en el que dicho hidrocarburo de cadena
lineal o ramificado junto con el grupo carbonilo próximo se
selecciona entre el grupo compuesto por palmitilo, oleílo,
estearilo, miristilo, laurilo, colato y desoxicolato.
10. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 4 y 5, en el que dicho aminoácido natural o no
natural es un aminoácido de origen natural.
11. Un método in-vitro
para aumentar la absorción celular de una substancia que contiene
amina seleccionada entre el grupo compuesto por un fármaco que
contiene amina, un péptido y una proteína, que comprende
administrar un compuesto de la reivindicación 1 a dichas
células.
12. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en
la fabricación de un medicamento para aumentar la absorción celular
de una substancia que contiene amina seleccionada entre un fármaco,
un péptido y una proteína que contiene amina.
13. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en
la fabricación de un medicamento para prolongar la retención en
sangre y en tejidos de un mamífero de un compuesto que contiene una
amina biológicamente activa seleccionado entre el grupo compuesto
por fármacos, péptidos y proteínas que contienen amina.
14. Un método para formar un compuesto de la
reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar una substancia que
contiene un grupo amino biológicamente activo seleccionado entre el
grupo compuesto por un fármaco, un péptido y una proteína que
contiene amina, con un compuesto de la reivindicación 4, en
condiciones en las que se obtenga el compuesto de la reivindicación
1.
15. Un método in-vitro
para liberar una substancia que contiene un grupo amino
biológicamente activo en el interior de una célula, que comprende
exponer dicha célula al compuesto de la reivindicación 1, en el que
dicho compuesto se absorbe por dicha célula y se expone a un pH
dentro de dicha célula suficientemente bajo para hidrolizar un
enlace amida y liberar dicha substancia que contiene un grupo amino
biológicamente activo.
16. Una composición farmacéutica que
comprende:
(A) una cantidad eficaz de un compuesto de la
reivindicación 1; y
(B) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Una preparación farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 16, en la que dicha composición comprende un
recubrimiento entérico que protege dicho compuesto de la hidrólisis
del enlace amida, previniendo así la liberación de dicha substancia
que contiene el grupo amino biológicamente activo hasta que dicho
recubrimiento se retire o se disuelva.
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