KR20010080749A - 가역적 수성 ｐＨ 감작성 지질화 반응시약, 조성물 및 용도 - Google Patents

가역적 수성 ｐＨ 감작성 지질화 반응시약, 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노기 함유 생물학적 활성 물질 및 생물학적 막을 침투할 수 있는 친유성기를 포함하는 지질화된 복합체에 관한 것이다. 중성 또는 약한 산성 조건(생체내에서 발견될 수 있는 조건을 포함함)하에서, 자유 아미노기 함유 생물학적 활성 물질은 아미드 결합의 가수분해 반응으로 상기 복합체로부터 방출된다. 또한, 본 발명은 지질화제 및 지질화된 복합체, 지질화된 복합체를 제조하는 방법,지질화된 복합체를 포함하는 약학 조성물, 및 세포내로 아미노기 함유 물질의 전달을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 아미노기 함유 물질은 펩티드, 단백질 또는 이들의 유도체를 포함한다.

Description

가역적 수성 ｐＨ 감작성 지질화 반응시약, 조성물 및 용도{REVERSIBLE AQUEOUS pH SENSITIVE LIPIDIZING REAGENTS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
생화학의 발전으로 인해 치료학적으로 활성인 순수한 단백질과 펩티드를 대량으로 생산하는 것이 가능해졌다. 현재, 대부분의 이들 약품의 치료 효과는 이들이 침투성 경로(예, 주사)를 통해 투여되는 경우에만 달성될 수 있다. 대부분의 단백질은 반감기가 매우 짧기 때문에, 잦은 주사에 의해 투여되는 경우에만 이들 약제의 유효 농도가 유지될 수 있다.
주사에 의한 단백질 투여는 생체내에서 가장 효과적인 단백질 전달 방법이기는 하지만, 잦은 주사는 환자의 인내심을 떨어뜨린다. 또한, 약제 주사는 항상 환자에게 옮겨지지는 않도록 훈련과 숙련도를 요한다. 단백질 약제가 구명(求命) 역할을 하는 경우, 주사에 의한 투여가 환자에게 허용될 수 있다. 그러나, 단백질 약제가 몇가지 가능한 요법들 중의 단지 하나인 경우, 단백질 및 펩티드 주사는 환자에게 허용되지 않는 경향이 있다. 그러므로, 단백질 및 펩티드 전달의 대안 경로 개발이 필요하다.
이러한 대안적 경로는 입, 코, 경구, 폐, 직장 및 눈을 포함할 수 있다. 예외 없이, 이들 경로는 비경구적 투여 경로보다 덜 효과적이나, 이들은 환자에게 편리함과 조절성을 제공하기 때문에 비경구적 경로보다 훨씬 더 관심을 끈다. 경구적 경로는 가장 편리하고 환자가 순응하기 쉽기 때문에 특히 관심을 끈다.
인체 내부를 외부로부터 분리하는 점막 장벽(예, 위장 점막, 눈 점막, 폐 점막, 직장 점막 및 비측 점막)은 분자 운반을 엄격하게 조절하는 밀착 연결된 세포 단층들 중 한 층을 포함한다. 장벽내 각 세포는 세포간 공간내로의 통관을 조절하는 밀착 연접에 의해 연결된다. 따라서, 점막은 제1 단계의 물리적 관문으로서, 이것을 통한 운반은 세포 통과(transcellular) 경로 또는 세포 부근(paracellular) 경로에 의존한다(Lee, V.H.L.,Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys., 5:69∼97(1998)).
물로 채워진 밀착 연접을 통한 세포 부근 운반은 작은 분자(MW < 1 kDa)로 제한되고, 본질적으로 농도 기울기에 의해 점막을 가로질러 구동되는 확산 과정이다(Lee, V.H.L.,Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys.,5:69∼97(1988); Artursson, P. 및 Magnusson, C.,J. Pharm. Sci., 79:595∼600(1990)). 밀착 연접은 점막 총 표면적의 0.5% 이하(Gonzalez-Mariscal, L. M. 등,J. Membrane Biol., 86:113∼125(1985); Vetvicka, V. 및 Lubor, F.,Critical Rev. Ther. Drug Deliv. Sys.,5:141∼170(1998))를 차지하므로, 이들은 점막을 가로질러 단백질 약제를 운반하는 데 단지 작은 역할을 할 뿐이다.
작은 약제의 세포 통과 운반은 약제의 물리 화학적 성질이 소수성 세포 장벽을 가로질러 운반하기에 적합한 경우에 효과적으로 발생한다. 그러나, 단백질 및 펩티드의 세포 통과 운반은 트랜스사이토시스(transcytosis) 과정으로 제한된다(Shen, W. C. 등,Adv. Drug. Deliv. Rev.,8:93∼113(1992)). 트랜스사이토시스는 단백질 및 펩티드가 세포의 한쪽 면으로부터 소포내로 유입되어, 이 후에 세포를 통해 세포의 반대쪽으로 운반되는데, 여기에서 이들은 세포내 이입성 소포로부터 방출된다(Mostov, K. E. 및 Semister, N. E.,Cell,43:389∼390(1985)). 점막 장벽의 세포막은 친수성의 하전된 거대 분자(단백질 및 펩티드)에 대해 친화력이 없는 소수성 지질 이중층이다. 또한, 점막 세포는 많은 거대 분자의 운반에 대한 장벽으로서 작용할 수 있는 점액질을 분비할 수 있다(Edwards, P.,British Med. Bull., 34:55∼56(1978)). 그러므로, 단백질 및 펩티드에 대한 특이적 운반 메카니즘이 존재하지 않으면, 점막 장벽을 가로지르는 단백질 및 펩티드의 고유 운반은 거의 무시할 수 있다.
단백질 및 펩티드 운반에 대한 완벽한 물리적 장벽을 제공하는 것 외에, 점막 장벽은 효소가 점막을 가로질러 통과하기 전, 후, 및 통과하는 동안 단백질 및 펩티드를 분해할 수 있는 효소를 갖는다. 이러한 장벽을 효소 장벽이라 한다. 효소 장벽은 효소의 말단에 또는 구조 내부에 단백질 및 펩티드를 분해하는 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제 효소로 이루어진다. 몇가지 점막의 효소 활성은 연구되어져 왔는데, 상당한 프로테아제 활성이 백변종 래빗의 입, 코, 직장 및 질 점막의균질화액에 존재한다는 것과, 이들 활성이 장골에 존재하는 프로테아제 활성에 필적한다는 것을 입증하였다(Lee, V.H.L.,Critical Rev. Ther. Drug Delivery Sys., 5:69∼97(1988)). 그러므로, 점막과는 별도로, 존재하는 효소 장벽은 단백질 및 펩티드 분자의 분해 반응에 강한 특징을 나타낼 것이다.
펩티드의 N 및 C 말단부는 하전되고, 하전된 측쇄는 이들 거대 분자에 높은 친수성을 부여한다. 또한, 하전된 측쇄의 존재는 단백질 및 펩티드가 강한 수소 결합 용량을 갖는 것을 의미하는데, 이러한 H-결합 용량은 심지어 작은 펩티드 조차도 세포막을 가로질러 운반되는 것을 억제하는데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다(Conradi, R. A. 등,Pharm. Res., 8:1453∼1460(1991)). 그러므로, 단백질 및 펩티드의 크기 및 소수성이 합쳐져서 단백질 및 펩티드가 점막 장벽을 가로질러 운반되는 것을 심각하게 제한한다.
점막 장벽의 물리적 성질을 바꾸기 위해 사용되어 온 한가지 접근법은 침투 강화제를 사용하는 것이다. 침투 강화제의 사용은, 세포 멤브레인을 유동화시키고(Kaji. H. 등,Life Sci., 37:523∼530(1985)), 밀착 연접을 개방시키고(Inagaki, M. 등,Rhinology,23:213∼221(1985)), 세포막에 공극을 형성(Gordon, S. 등,Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 82:7419∼7423(1985); Lee, V.H.L. 등,Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst.,8:91∼192(1991))시킬 수 있는 저분자량 제제에 의한 세포 장벽 붕괴에 기초한다. 이들 제제를 사용하면 장벽 완전성을 비특이적으로 손상시켜서, 생체내 세포에 유독할 수 있는 다양한 큰 분자를 흡수할 수 있다.
프로테아제 억제제는 단백질 및 펩티드와 함께 투여되는데, 생체내 이들 거대 분자의 흡수를 증가시키는데 약간의 제한된 활성을 보여주었다(Kindron, M. 등,Life Sci., 31:2837∼2841(1982); Takaroi, K. 등,Biochem. Biophys. Res. Comm.,137:682∼687(1986)). 이러한 접근법의 안정성 및 장기적 효과는 아직 철저히 연구되지 않았다.
프로드러그 접근법은 효소 분해 및 인식으로부터 펩티드를 보호하는 방식으로 펩티드의 변형에 기초한다. 이것은 아미드화 반응 및 아실화 반응으로 펩티드의 공격받기 쉬운 기를 차단시킴으로써 달성되었다. 따라서, 프로드러그 접근법은 쉽게 확인 가능한 활성 영역을 갖는 작은 펩티드에만 유용함이 입증되었다.
크기 감소가 단백질의 운반 잠재성을 증가시키는 또 다른 가능한 접근법이다. 그러나, 단백질의 활성 부위는 크기 감소를 하기 전에 계획될 필요가 있다. 일반적으로, 이러한 접근법은 대부분의 단백질에는 적용하기 어렵다.
리간드의 특성에 의하여, 담체 리간드는 단백질 및 펩티드의 세포 흡수 및 운반 특성을 바꿀 수 있다. 이러한 접근법의 본질은 세포-비침투성 단백질 또는 펩티드를 세포내로 잘 운반되는 담체에 공유 결합시키는 것이다. 담체 리간드가 엔도사이토스 및 트랜스사이토스 되는 메카니즘은 단백질 및 펩티드의 운반을 증가시키는 담체의 적합성을 결정하는데 중요하다. 거대 분자의 담체는 친수성이고, 막내로 분배되지 않는다. 그러므로, 세포내로의 큰 중합체 담체 운반은 세포막에 대한 담체의 친화력에 의해 조절된다. 일반적으로, 거대 분자 복합체의 흡수는 세포막에 결합시키는 것으로 시작한다. 세포에 대한 담체의 결합은 특이적(예, 세포표면 항원에 대한 항체의 결합), 비특이적(세포 표면 당에 대한 양이온 리간드 또는 렉틴의 결합), 또는 수용체 조절성(이들 수용체에 대한 전사 또는 인슐린의 결합)일 수 있다. 담체가 세포 표면에 결합되면, 소포내로 흡수된다. 이후, 이들 소포는 단계별로 진행되며 몇가지 경로로 경로가 정해질 수 있다. 그 중 한가지 경로는 소포가 막으로 되돌아가는 재순환 경로이다. 복합체에 파괴적인 또 다른 경로는 리소좀과의 융합이다. 복합체의 트랜스사이토시스로 이끄는 또 다른 대안적 경로는 소포가 유래된 측면의 반대쪽 막과 소포의 융합이다.
엔도사이토시스 과정 및 트랜스사이토시스 과정 사이의 올바른 균형이 단백질 복합체를 그것의 표적에 전달하는 것을 결정한다. 예를 들면, 엔도사이토시스는 복합체가 표적 세포에 의해 흡수되는 정도를 결정할 수 있지만, 트랜스사이토시스는 복합체가 그것의 표적에 도달할지, 도달하지 못할지를 결정한다(Shen, W. C. 등,Adv. Drug. Deliv. Rev.,8:93∼113(1992)). 위장관을 통해 성공적으로 흡수되기 위해, 복합체는 위장 점막의 첨단(尖端) 막에 결합해서, 점막 세포내로 흡수되어 세포를 가로질러 전달되고, 결국에는 기측부 막으로부터 방출되어야만 한다.
현재의 문헌은 비특이적 담체(예, 폴리리신[Shen, W. C. 및 Ryser, H.J.P.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7589∼7593(1981)] 및 렉틴[Broadwell, R.D. 등,Proc. Natl. Acad. Sci., USA,85:632∼646(1988)]) 및 특이적 담체(예, 트랜스페린[Wan, J. 등,J. Biol. Chem., 257:13446∼13450(1992)], 아시알로글리코단백질[Seth, R. 등,J. Infect. diseases,168:994∼999(1993)] 및 항체[Vitetta, E. S.,J. Clin. Immunol., 10:15S∼18S(1990)])가 세포내로 단백질의 엔도사이토시스를 증가시킬 수 있음을 입증하는 많은 보고를 포함한다. 단백질에 대한 세포 통과성(transcytotic) 담체를 다루는 보고서는 적지만, 극소수의 연구는 세포 장벽을 가로질러 단백질 복합체의 운반을 정량화하였다. 맥아 응집소(Broadwell, R. D. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:632∼646(1988)) 및 항트랜스페린/메토트렉세이트 복합체(Friden, P. M. 및 Walus, L. R.,Adv. Exp. Med. Biol., 331:129∼136(1993))는 생체내 혈액-뇌 장벽을 가로질러 트랜스사이토스 됨을 보여 주었다. 또한, 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)의 폴리리신 복합체 및 HRP의 트랜스페린 복합체는 시험관내 세포 단층을 가로질러 트랜스사이토스 됨을 보여 주었다(Wan, J. 및 Shem, W.C.,Pharm. Res.,8:S∼5(1991); Taub, M. E. 및 Shen, W. C.,J. Cell. Physiol., 150:283∼290(1992); Wan, J. 등,Biol. Chem.,267:13446∼13450(1992)).
인지질의 구성 성분인 지방산이 대부분의 세포막을 차지한다. 이들은 시판되고 있으며 비교적 값이 싸다. 지질 성질로 인해, 지방산은 세포막내로 쉽게 분배할 수 있고, 비독성 방식으로 세포막과 상호 작용할 수 있다. 그러므로, 지방산은 잠재적으로 단백질 및 펩티드 전달에 가장 유용한 담체 리간드를 나타낸다. 단백질 및 펩티드 전달에 지방산을 사용할 수 있는 방법은 단백질 및 펩티드의 공유 변형 및 지방산 에멀젼액의 사용을 포함한다.
몇가지 연구는 생체내 펩티드 및 단백질을 전달하는 지방산 에멀젼액의 성공적인 사용을 보고하였다(Yoshikawa, H. 등,Pharm. Res., 2:249∼251(1985); Fix, J. A. 등,Am. J. Physiol.,251:G332∼G340(1986)). 지방산 에멀젼이 단백질 및펩티드 흡수에 영향을 주는 메카니즘은 아직 공지되어 있지 않다. 지방산 에멀젼은 밀접 연접을 개방시켜, 막을 용해시켜서 위장 환경의 단백질 및 펩티드를 위장시켜 이들의 흡수의 일부분으로서 위 점막을 가로질러 단백질 및 펩티드를 운반할 수 있다(Smith, P. 등,Adv. Drug. Delivery Rev.,8:253∼290(1992)). 후자의 메카니즘은 제안되었지만, 지방 흡수 메카니즘에 대한 현재의 지식과는 일치하지 않는다.
위장 상피를 가로질러 단백질 및 펩티드를 전달시키는 더 논리적인 방법은 지방산을 비특이적 막 흡수제로서 사용하는 것이다. 몇몇 연구는 단백질에 결합된 비특이적 막 결합제가 시험관내 세포를 가로질러 단백질 복합체의 트랜스사이토시스를 촉진시킬 수 있음을 보여주었다(Wan, J. 등,J. Cell. Physiol., 145:9∼15(1990); Taub, M. E. 및 Shen, W. C.,J. Cell. Physiol.,150:283∼290(1992)). 지방산 복합체는 또한 세포 멤브레인 내로 및 세포 멤브레인을 가로질러 거대 분자의 흡수를 향상시키는 것을 입증하였다(Letsinger, R. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:6553∼6556(1989); Kabanov, A. 등,Protein Eng., 3:39∼42(1989)). 그럼에도 불구하고, (1) 접합화 반응을 위한 수성 용액내 지방산의 용해도 결핍, (2) 지방산 아실화 반응 후 펩티드 및 단백질의 생물학적 활성 상실, 및 (3) 수성 용액에서 지방산-접합 펩티드의 용해도 결핍을 포함하여, 지방산을 펩티드 및 단백질에 접합시키는데 어려움이 있다(예, Hashimoto, M. 등,Pharm. Res.,6:171∼176(1989); Martins, M. B. F. 등,Biochimie, 72:671∼675(1990); Muranishi, S. 등,Pharm. Res.,6:171∼176(1989); Martins,M. B. F. 등,Biochimie, 72:671∼675(1990); Muranishi, S. 등,Pharm. Res.,8:649∼652(1991); Robert, S. 등,Biochem. Biophys. Res. Commun.,196:447∼454(1993)).
세포내로 전달되면, 펩티드 및 단백질은 그들의 담체로부터 방출되어야 한다. PCT 출원 WO 96/22773 및 WO 98/13007은 설프히드릴 함유 펩티드 및 단백질의 세포 통과 전달 및 방출을 개시한다. 설프히드릴 함유 친수성 분자의 세포 흡수는 디설파이드 결합을 통해 지방산과의 접합에 의해 증가될 수 있다. 불안정한 디설파이드 결합은 쉽게 환원되어, 인체 내부에서 지방산 부분으로부터 친수성 화합물을 한차례 방출하는 메카니즘을 제공한다.
디설파이드 결합의 환원 외에, 담체 시스템으로부터 생물학적으로 활성인 친수성 화합물의 방출에 대한 다른 메카니즘은 가수분해 반응 및 광분해성 결합 해리 반응을 포함한다. (예를 들면, 미국 특허 제5,505,931호 및 본 명세서에 인용된 참고 문헌 참조). 생물학적 활성 아민이 특이 세포의 약물 표적화용 단일클론 항체 또는 다른 기질을 혼입한 유기산과 접합되는 가수분해 반응성 전달계가 공지되어 있다. (미국 특허 제4,764,368호, 제4,618,492호, 제5,505,931호 및 제5,563,250호 참조). 표적 세포에 대한 특이적 결합 후, 이들 복합체는 (아미드의) 가수분해 반응이 세포 내부에서 자유 아민을 방출하는 세포 내부에서 활성 아민을 (전형적으로 아미드 형태로) 전달한다.
선행 기술의 가수분해 반응성 전달계의 성공은 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 화합물을 세포 내부로 전달할 수 있는 개선된 약제-담체 복합체에 대한 연구를 고무시켰다. 개선된 합성 방법 및 치료 기술은 현재 개발 중이다.
발명의 개요
본 발명은 신규 약제-담체 복합체 및 이들 제조에 대한 손쉬운 합성 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 화합물의 흡수 및 방출에 유용한 합성 방법, 중간체 및 종국에는 최종 생성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되는데, 상기 알킬 또는 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
R4및 R5중 하나는 아민 함유 약제, 천연 또는 비천연 아미노산, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질이고, R4및 R5중 나머지 것은 OR6로서, R6가 수소, 알칼리 금속 또는 음전하물이며,
X는 산소 또는 황이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 II의 화합물에 관한 것이다:
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴로서, 상기 알킬 및 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
X는 O 또는 S이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 III의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴로서, 상기 알킬 및 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
X는 O 또는 S이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
본 발명은 또한 화학식 II의 화합물 및 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질로부터 화학식 I의 복합체를 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 말레산 유도체 및 상응하는 티올 또는 알콜로부터 화학식 II의 화합물을 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화학식 I의 복합체를 약학적으로 허용 가능한 형태로 포유 동물에게 투여하여, 포유 동물에서 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질의 흡수를 증가시키거나 또는 혈액 및 조직 보유를 연장시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 점막 장벽을 갖는 세포 내부로의 친수성 아민 함유 화합물 전달의 증가 방법에 관한 것으로서, 화학식 I의 복합체를 상기 세포와 접촉시킴으로써 복합체는 세포의 점막 장벽을 침투하고 자유 아민은 아미드 결합의 가수분해 반응에 의해 유리된다.
본 발명은 또한 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에 제시된 설명, 가르침 및 지시를 기초로 하여, 본 발명의 상기 및 기타 특징, 장점, 실시 형태, 양태 및 목적은 관련 기술 분야의 당업자에게 분명할 것이다.
본 발명은 일반적으로 생물학 및 약학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 포유 동물에서 아미노기를 갖는 친수성 분자, 특히 펩티드 및 단백질의 운반 및 전달을 증가시키는 데 유용한 화합물, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에서 지질화 담체 시약으로부터 티라민(REAL-티라민) 방출의 pH 의존성을 보여준다. 데이타는 3회 실험의 평균값 및 SD를 보여준다.
도 2는 본 발명에서 5 ㎍/kg의 AVP(아르기닌 바소프레신), 팔미틸-AVP 및 REAL-AVP를 피하 주사한 후 당뇨 래트의 누적 소변 산출량을 보여준다. 데이타는 3 마리 래트로부터 측정한 평균값 및 SD를 보여준다.
도 3은 본 발명에서 5 ㎍/kg의 AVP, 팔미틸-AVP 및 REAL-AVP를 피하 주사한 후 당뇨 래트의 누적 소변 산출량을 보여준다. 데이타는 3회 실험의 평균값 및 SD를 보여준다.
도 4는 본 발명의 REAL-인슐린 0.35 U/kg을 피하 주사한 것과 비교해서 인슐린 0.35 U/kg을 피하 주사한 후 단식된 당뇨 래트의 혈중 포도당 농도의 변화를 보여준다. 데이타는 2 마리의 래트로부터 측정한 평균값 및 SD를 보여준다.
도 5는 본 발명의 REAL-인슐린 0.5 U/kg을 피하 주사한 것과 비교해서 인슐린 0.5 U/kg을 피하 주사한 단식된 당뇨 래트의 혈중 포도당 농도에 대한 장기적 효과를 보여준다. 데이타는 2 마리의 래트로부터 측정한 평균값 및 SD를 보여준다.
도 6은 10 U/kg의 REAL-인슐린, 인슐린 및 위약을 경구 투여한 후 단식된 당뇨 래트의 혈중 포도당 농도에 대한 단기적 효과를 보여준다. 데이타는 4 마리의 래트로부터 측정한 평균값 및 SD를 보여준다.
본 발명에 따르면, 생물학적으로 활성인 아민 함유 화합물(예, 아미노산, 펩티드 또는 단백질)은 가역적 아미드 결합을 통해 친유성 유도체에 결합된다. 이러한 복합체의 친유성기는 세포막의 첨단부에 결합되어 세포막을 통해 복합체의 운반을 용이하게 한다. 일단 세포막 내부에서, 생물학적으로 활성인 아민 함유 화합물은 아미드 결합의 가수 분해 결과로서 간질액내로 방출된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 하기 화학식 I의 복합체가 제공된다:
화학식 I
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴기로서, 상기 알킬 및 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
R4및 R5중 하나는 아민 함유 약제, 천연 또는 비천연 아미노산, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질을 나타내고, R4및 R5중 나머지 것은 OR6로서, R6가 수소, 알칼리 금속 또는 음전하물이며,
X는 O 또는 S이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 II의 화합물이 제공된다:
화학식 II
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴로서, 상기 알킬 및 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐,알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
X는 O 또는 S이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하기 화학식 III의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 비독성 염이 제공된다:
화학식 III
상기 식 중, R2는 수소, 할로, 알킬 또는 아릴로서, 상기 알킬 및 아릴기는 1개 이상의 알콕시, 알콕시알킬, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알카노일옥시, 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
R3는 친유성기이며,
X는 O 또는 S이고,
Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
n은 0 또는 1이고,
m은 정수 0 내지 10이다.
전형적인 알킬기로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸 등을 포함하는 C1∼6알킬기를 들 수 있다.
전형적인 알콕시기는 전술한 알킬기들 중 임의의 것으로 치환된 산소를 포함한다.
전형적인 알콕시알킬기는 메톡시메틸, 에톡시메틸, 프로폭시메틸, 부톡시메틸, 펜톡시메틸, 헥속시메틸, 메톡시에틸, 메톡시프로필, 메톡시부틸, 메톡시펜틸, 메톡시헥실 등과 같은 알콕시기에 의해 치환된 상기 알킬기들 중 임의의 것을 포함한다.
바람직한 아릴기는 C6∼14아릴기로서, 전형적으로 페닐, 나프틸, 플루오레닐, 페난트릴 및 안트라실기를 포함한다.
전형적인 알콕시 치환 아릴기로는 1개 이상의 상기 알콕시기(예, 3-메톡시페닐, 2-에톡시페닐 등)로 치환된 상기 아릴기를 들 수 있다.
전형적인 알킬 치환 아릴기로는 C1∼6알킬기들 중 임의의 것으로 치환된 상기 아릴기들 중 임의의 것을 포함하고, n이 1∼6인 Ph(CH2)n기(예, 톨릴, o-, m- 및 p-크실릴, 에틸페닐, 1-프로필페닐, 2-프로필페닐, 1-부틸페닐, 2-부틸페닐, t-부틸페닐, 1-펜틸페닐, 2-펜틸페닐, 3-페틸페닐)를 들 수 있다.
전형적인 알케닐 기로는 C2∼6알케닐 기(예, 에테닐, 2-프로페닐, 이소프로페닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 4-펜테닐, 3-펜테닐, 2-펜테닐, 5-헥세닐, 4-헥세닐, 3-헥세닐 및 2-헥세닐기)를 들 수 있다.
전형적인 알키닐 기로는 C2∼6알키닐 기(예, 에티닐, 2-프로피닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 4-펜티닐, 3-펜테닐, 2-펜티닐, 5-헥시닐, 4-헥시닐, 3-헥시닐 및 2-헥시닐기)를 들 수 있다.
전형적인 알케닐 또는 알키닐 치환 아릴기로는 상기 C2∼6알케닐 또는 C2∼6알키닐기 중 임의의 것으로 치환된 상기 C6∼14아릴기들 중 임의의 것을 포함하는데, 예를 들면 에테닐페닐, 1-프로페닐페닐, 2-프로페닐페닐, 1-부테닐페닐, 2-부테닐페닐, 1-펜테닐페닐, 2-펜테닐페닐, 3-펜테닐페닐, 1-헥세닐페닐, 2-헥세닐페닐, 3-헥세닐페닐, 에티닐페닐, 1-프로피닐페닐, 2-프로피닐페닐, 1-부티닐페닐, 2-부티닐페닐, 1-펜티닐페닐, 2-펜티닐페닐, 3-펜티닐페닐, 1-헥시닐페닐, 2-헥시닐페닐, 3-헥시닐페닐기이다.
전형적인 할로기는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함한다.
전형적인 할로 치환 알킬기는 1개 이상의 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자로 치환된 C1∼6알킬기를 들 수 있는데, 예를 들면 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 1,1-디플루오로에틸 및 트리클로로메틸 기이다.
전형적인 알카노일 기는 C1∼5C(O) 알카노일기(예, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 펜타노일 및 헥사노일기) 또는 아릴알카노일 기(예, 상기 아릴기들 중 임의의 것으로 치환된 C1∼5C(O) 알카노일기)를 포함한다.
전형적인 시클로알킬기로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸기를 포함하여 C3∼8시클로알킬기를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 화학식 II의 화합물 및 아미노기 함유 물질로부터 화학식 I의 복합체를 형성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 말레산 유도체와 티올 및 알콜로부터 화학식 II의 화합물을 형성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 포유 동물에서 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질의 흡수를 증가시키거나 또는 혈액 및 조직 보유를 연장시키는 방법이 제공되는데, 여기서 화학식 I의 복합체가 포유동물에게 (예를 들면, 에멀젼, 나노입자(예, 고체 지질 나노입자), 리포좀, 미소 구체, 마이크로캡슐, 에어로졸, 흡입 및 경피성 복용 형태로) 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 점막 장벽을 갖는 세포의 내부로 친수성 아민 함유 화합물의 전달을 증가시키는 방법이 제공되는데, 화학식 I의 복합체가 세포와 접촉됨으로써 상기 복합체는 세포의 점막 장벽을 침투하고, 자유 아민이 아미드 결합의 가수 분해 반응으로 유리된다.
본 명세서에 사용된 "친유성기"란 용어는 천연 생성 지질 자체, 탄소 원자수가 약 4개 내지 약 26개, 바람직하게는 탄소 원자수가 약 5개 내지 약 19개인 소수성 분지쇄 또는 비분지쇄 탄화수소, 이들의 지방산 또는 에스테르, 또는 계면활성제를 말한다. 적당한 친유성기는 팔미틸(C15H31), 올레일(C15H29), 스테아릴(C17H35), 라우릴(C11H23), 콜릴 및 미리스틸(C13H27)을 비롯한 장쇄 알카노일기를 포함하나, 이것으로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 "천연 또는 비천연 아미노산"이란 용어는 D 형 아미노산, 블록화된 L-형 및 D-형 아미노산(예, 아미드화 또는 아실화 반응에 의해 블록화된 것들), 치환으로 인해 아미노산에 형태적 제제를 초래하는 치환 아미노산(예, 입체적 장애를 받는 알킬기 또는 시클로알킬기(예, 시클로프로필 또는 시클로부틸)로 치환된 것들)뿐만 아니라 21개의 천연 생성 아미노산 중 임의의 것을 말한다. 본 발명에 아미노산 또는 펩티드 또는 단백질의 성분으로서 사용하기에 바람직한 천연 생성 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시트룰린, 시스테인, 시스틴, γ-글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 노르류신, 류신, 리신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닐, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, γ-카르복시글루타메이트 또는 O-포스포세린이다. 본 발명에 아미노산 또는 펩티드 또는 단백질의 성분으로서 사용하기에 바람직한 비천연 생성 아미노산은 β-아미노산류(예, β-알라닌, α-아미노부티르산, γ-아미노부티르산, γ-(아미노페닐)부티르산, α-아미노 이소부티르산, ε-아미노 카프로산, 7-아미노 헵탄산, 아미노벤조산, 아미노페닐 아세트산, 아미노페닐 부티르산, 시스테인(ACM), 메티오닌 설폰, 페닐글리신, 노르발린, 오르니틴, δ-오르니틴, p-니트로페닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복시산 및 티오프롤린)이다. 또한, 하기 식의 아미노산 유도체가 고려된다:
상기 식 중, p는 1 내지 10이다.
본 명세서에 사용된 "생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질"이란 용어는 세포 내부에 도입될 때 생물학적 활성을 가지며 구조적으로는 아실화 반응을 통해 아미드 결합을 형성할 수 있는 1차 또는 2차 아민을 포함하는 임의의 물질을 말한다. 1차 또는 2차 아민을 포함하지 않는 물질은 적당히 유도되어 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물과 접합될 수 있다. 예를 들면, 카복시기를 갖는 화합물은 적당한 디아민(예, 에틸렌 디아민, 프로필렌 디아민, 1,4-디아미노부탄, 스페르민, 또는 스페르미딘 등과 같은 C2∼C10디아민)과 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물 및 수용성 카르보디이미드(예, EDC) 커플링제의 존재하에서 반응될 수 있다. 이런 식으로, 상기 디아민은 1차 또는 2차 아민을 포함하지 않는 생물학적으로 활성인 화합물을 아미드 결합 형성을 통해 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물에 커플링하는 수단으로서 작용한다.
바람직한 아민 함유 약제는 티라민, 아르기닌 바소프레신, 인슐린(Czech, M. P.,Ann. Rev. Biochem., 46:359(1977)), 칼시토닌(Brown, E. M. 및 Aurbach, G.D.,Vitam. Horm., 38:236(1980)), 데스모프레신(Vavra 등,J. Pharmacol. Exp. Ther., 188:241(1974)), 인터페론-α, -β 및 -γ(Stiem, E. R.,Ann. Rev. Inter. Med., 96:80∼93(1982)), 인터류킨-2,-3,-4,-6 및 -11(Kluth, D. C. 및 Rees, A. J.,Semin. Nephrol., 16:576∼582(1996); Holyoake, T. L.,Blood Rev., 10:169∼200(1996)), G-CSF(Spiekermann, K. 등,Leukemia, 11:466∼478(1997)), GM-CSF(Jonuleit, H. 등,Arch. Dermatol. Res.,289:1∼8(1996)), 인간 성장 호르몬(Strobl, J. S. 및 Thomas, M. J.,Pharmaco. Rev., 46:1∼34(1994)), 에리트로포이에틴(Spivak, J. L.,Semin. Hematol., 30:2∼11(1993)), 바소프레신(Schroder, E. 및 Lubke, K.,The Peptide,2:336∼350(1966)), 옥트레오티드(Sheppard, M. C. 및 Stewart, P. M.,Metabolism: Clinical and Experimental, 45:63∼64(1996)), 아프로티닌(Haderland, G. 및 McConn, R.,Fed. Proc., 38:2760∼2767(1979)), 옥시토신(Nachtmann, F. 등,Anal., Prof. Drug Subst., Vol. 10, Florey, K. ed., Academic Press, New York, NY(1981),pp.563∼600), β-TGF(Moses, H. L. 및 Serra, R.,Curr. Opin. Genet. Dev.,6:581∼586(1996)), BDNF(Apfel, S. C. 및 Kessler, J. A.,Baillieres. Clin. Neurol.,4:593∼606(1995)), b-FGF(Bikfalvi, A. 등,Endocr. Rev., 18:26∼45(1997)), PDGF(Hughes, A. D. 등,Gen. Pharmacol., 27:1079∼1089(1996)), TNF(Majno, P. E. 등,Swiss. Surg., 4:182∼185(1995)), 심방 나트리우레틱 펩티드(Nakao, K.,Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 2:45∼50(1993)), 렐락신(Schwabe, C. 등,Recent Progr. Horm. Res., 34:123∼211(1978)),아미린(Rink, T.J. 등,Trends. Pharmacol. Sci.,14:113∼118(1993)), 데옥시리보뉴클레아제(Laskowski,The Enzymes, Vol. 2, Boyer, P. D., ed., Academic Press, New York, NY(1971), pp.289∼311), EGF(Carpenter, G.,Curr. Opin. Cell. Biol., 5:261∼264(1993)), 히루딘(Markwardt,Methods. Enzymol., 19:924(1970)), 네오카르지노스태틴(Dedon, P. C. 및 Goldberg, I. H.,Chem. Res. Toxicol., 311∼332(1992)), 혈조절 펩티드(Paukovits, W. R. 등,Cancer Treat. Rev.,17:347∼354(1990)) 및 소마토스태틴(Moss, R. L.,Ann. Rev. Physiol.,41:617(1979))을 포함하나, 이것으로 제한되지는 않는다.
본 발명의 목적상, "펩티드"란 용어는 2개 내지 100개의 아미노산을 포함하는 천연 및 비천연 아미노산 쇄를 말하고, "단백질"이란 용어는 100개 이상의 아미노산을 포함하는 천연 또는 비천연 아미노산 쇄를 말한다. 단백질 및 펩티드는 천연원으로부터 분리되거나 또는 당기술 분야에 공지된 방법(예, 재조합 DNA 기술 및 고체상 합성)으로 제조될 수 있다. 본 발명에 사용된 펩티드와 단백질은 단지 천연 생성 L-아미노산, L-아미노산과 다른 아미노산(D-아미노산 및 변형 아미노산을 포함함)의 조합물, 또는 L-아미노산을 제외한 아미노산을 포함할 수 있다. 화학식 I의 복합체를 형성하기 위해, 펩티드 또는 단백질은 1개 이상의 반응성 아민기를 가져야 한다. 반응성 아민기는 아미노산 측쇄의 일부 또는 펩티드 또는 단백질 주쇄의 말단 아미노기일 수 있거나, 또는 펩티드 또는 단백질 분자내 작용기의 화학적 변형에 의해 도입될 수 있다. 펩티드는 동종성 펩티드 또는 이종성 펩티드일 수 있고, 천연 아미노산, 합성 아미노산 또는 이들의 임의 조합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 비독성 염이 본 발명의 범주내에 포함된다. 구체적으로, 상응하는 카르복실산에 알칼리 금속 할로겐화물의 첨가와 같은 공지된 방법에 의해 생성된 알칼리 금속 카르복실산염이 고려된다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨, 리튬 및 암모늄 염을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "음전하"란 용어는 카르복실레이트 기에 음이온성을 부여할 수 있는 임의의 비용매화된, 용매화된 또는 착체화된 고립 전자쌍을 말한다.
본 명세서에 사용된 "알칼리 금속"이란 용어는 1족 또는 2족 금속(예, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 및 마그네슘) 중 임의의 것을 말한다.
본 발명의 바람직한 동물 피험자는 포유 동물이다. "포유 동물"이란 용어는 포유 강(綱)에 속하는 개체를 말한다. 본 발명은 인간 환자 치료에 특히 유용하다.
"치료"란 용어는 질병 또는 병의 예방, 완화 또는 치유를 위해 지질화 복합체를 피험자에게 투여하는 것을 말한다.
약제들은 환자에게 동시 투여되거나 또는 각 약제의 투여 간격 시간이 생물학적 활성의 중첩을 허용하는 경우라면 서로의 "조합물로" 제공되는 것을 고려한다.
바람직한 실시 형태에서, 1종 이상의 복합체는 약학 조성물의 일부로서 존재하거나 또는 투여된다.
본 발명의 투여용 약학 조성물은 1개 이상의 본 발명의 복합체를 약학적으로허용 가능한 담체와 임의 조합된 약학적으로 허용 가능한 형태로 포함할 수 있다. 이들 조성물은 의도된 목적을 달성하는 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 수막강내, 두개내 또는 비강내 경로로 투여될 수 있다. 투여량은 수령자의 나이, 건강, 및 체중, 병발 치료의 종류, 경우에 따라 치료의 빈도, 및 목적하는 효과의 특성에 좌우될 것이다. 본 발명의 투여량 및 투여 섭생은 임상 치료 분야의 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다.
투여 형태는 또한 에멀젼액, 나노입자(예, 고체 지질 나노입자), 리포좀, 미소 구체, 마이크로캡슐, 에어로졸, 흡입 및 경피성 복용 형태를 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제형은 수용액 형태의 화합물 수성 용액을 포함한다. 또한, 적당하게 오일성인 주사 현탁액인 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 소포는 지방 오일(예, 참기름) 또는 합성 지방산 에스테르(예, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드)를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있는데, 예를 들면 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 들 수 있다. 임의로, 수성 용액 및/또는 현탁액은 또한 안정화제 및/또는 완충액(예, 붕산염 완충액 등)을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 자체 공지된 방법(예, 종래의 혼합, 과립화, 당의정 제조, 용해 또는 동결 건조 과정의 방법)으로 제조된다. 따라서, 경구용 약학 제제는 활성 화합물과 고체 부형제를 혼합하여 얻은 혼합물을 임의 분쇄하고, 경우에 따라 또는 필요에 따라 적당한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공 처리하여정제 또는 당의정 핵을 얻음으로써 제조될 수 있다.
적당한 부형제는, 예를 들면 충전재(예, 당류, 락토오스, 슈크로즈, 만니톨 또는 소르비톨), 셀룰로스 제제 및/또는 인산 칼슘(예, 인산 3칼슘 또는 인산수소칼슘) 및 바인더(예, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 타가란트, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈을 사용한 전분풀)이다. 경우에 따라서, 붕괴제가 전술한 전분 및 또한 카복시메틸 전분, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이것의 염(예, 알긴산나트륨)과 같이 첨가될 수 있다. 특히, 보조제는 유량 조절제 및 윤활제(예, 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이것의 염(예, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)이다. 당의정 핵에는, 경우에 따라 위액에 내성인 적당한 코팅물이 제공된다. 이런 목적으로, 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/ 또는 이산화티타늄, 라커 용액 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 포함할 수 있는 농축된 당 용액을 사용할 수 있다. 위액에 내성인 코팅물을 제조하기 위해, 아세틸 셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트와 같은 적당한 셀룰로스 제제의 용액을 사용한다. 코팅물은 또한 활성 약제, 펩티드 또는 단백질 및 담체 사이에 형성된 아미드 결합을 가수분해 하기에 충분한 산성 환경에 조기 노출로부터 본 발명의 지질화 복합체를 보호하기 위해 제공될 수 있다. (위산으로부터 보호되는 핵으로 복용 단위를 제조하는 방법에 대한 미국 특허 제4,786,505호 및 제4,853,230호 참조) 바람직하게, 상기 핵은 중성 또는 염기성이다. 염기성 핵은미국 특허 제4,786,505호 및 제4,853,230호에 기술된 것과 같은 1개 이상의 알칼리성 반응 화합물을 포함한다. 염료 또는 안료는, 예를 들면 활성 화합물 복용 조합물을 특성화하기 위해 확인용으로 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 다른 약학 제제는 약학적으로 적당한 담체, 침투 강화제, 부형제 및/또는 충전재와 임의 혼합된, 젤라틴으로 만들어진 경구용 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐, 직장용 좌약, 경구 및/또는 비측 투여용 흡입 제형, 비측 또는 직장용 크림 또는 연고를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 사용하기에 적당한 침투 강화제로는 염화 벤잘코늄, 클로로부탄올, 아존(AZONE) 및 당기술 분야에 공지된 기타물과 같은 양이온성, 음이온성, 양쪽성 및 중성 침투 강화제를 들 수 있다.
화학식 II의 예시적 화합물 합성법은 반응식 1 및 반응식 2에 도시된다. 일반적으로, 브로모메틸 말레산 무수물 유도체 또는 이것의 말레산염은 알콜 또는 티올 소지 친유성 기와 반응되어 화학식 III의 에테르 또는 티올 에테르를 형성하게 한다. 알콜 또는 티올 소지 친유성기는 친유성기에 결합된 산소 또는 황 원자 또는 카보닐기를 가교시키는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산 부분을 포함한다. 가교성 천연 또는 비천연 아미노산 부분은 아미노 말단부, 카르복시 말단부 또는 아미노산 측쇄부의 친유성기에 결합된 산소 또는 황 원자 또는 카보닐기에 연결될 수 있다. 반응식 1을 참고하면, Pal-시스테인은 아미노 말단부의 카보닐에, 그리고 측쇄를 통해 황 원자에 결합된 글리신 가교를 효과적으로 포함한다. 반응식 2에서와 같이 헥사데칸티올의 사용은 가교성 천연 또는 비천연 아미노산 없이 화학식 III의 화합물의 형성을 나타낸다. 이후, 화학식 III의 생성물은 탈수화 조건에서 처리되어 친유성 기를 갖는 에테르 또는 티오에테르 결합을 경유하여 치환된 말레산 무수물을 재생성하여, 화학식 II의 화합물을 제공한다. 당기술 분야의 당업자라면 소정의 화합물에 도달할 수 있는 다양한 대안적 합성 반응식을 알 것이다.
반응식 3 내지 5는 본 발명에 의한 예시적 pH 감작성 지질화 복합체의 합성법을 도시한다. 일반적으로, 아민 함유 약제, 아미노산, 펩티드 또는 단백질은 화학식 II의 화합물과 반응되어 화학식 I의 아미드를 형성한다. 아미드 결합은 알칼리성 조건하에서, 바람직하게는 완충성 수용액에서 형성된다. 낮은 pH(생체내에서 전형적으로 발견되는 pH를 포함함)에서, 아미드 결합은 가수분해되어 자유 아민과 화학식 III의 화합물을 방출한다. 가역적 아미드 결합 형성은 한 pH에서 친수성 아민과 지질화 반응시약과의 접합화 및 더 낮은 pH에서 지질화 반응시약으로부터 상기 아민의 방출에 대한 메카니즘을 제공한다.
실시예 1. 3-S-(N-팔미틸 시스테이닐)메틸, 2-메틸 말레산 무수물인 반응시약 A의 합성(반응식 1)
N-팔미틸-시스테인(Pal-CPD)의 피리딘 디설파이드 유도체를 공지된 방법에 의해 얻었다. 문헌[Ekrami 등,FEBS Letters, 371:283∼286(1995)]의 방법에 따라 Pal-CPD를 합성하였다. Pal-CPD(0.7 g, 0.0015 mole)를 NaOH 10 ml(pH 11)에 용해시켰다. 디티오트레이톨(DTT)(0.9 g, 0.006 mole)을 물 5 ml에 용해시켰다. PaL-CPD 용액을 실온의 연속 교반하에서 DTT 용액에 적가하였다. 2시간 후, 반응을 종료시켰다. 0.01 N HCl을 사용하여 혼합물의 pH를 3으로 조절한 결과, 백색 침전물(Pal-시스테인)이 생성되었다. 희석된 HCl을 사용하여 침전물을 5회 세척하여 과량의 DTT를 제거하였다.
1 당량의 브롬화물 라디칼을 2,3-디메틸 말레산 무수물(DMMA)에 첨가함으로써 출발 물질 3-브로모메틸, 2-메틸 말레산 무수물(Br-DMMA)을 얻었다. 따라서, DMMA(1.5 g, 0.012 mole), NBS(2.3 g, 0.013 mole), 과산화 벤조일(0.3 g, 0.0012 mole) 및 산화 마그네슘(0.02 g, 0.0005 mole)을 클로로포름 40 ml에서 4시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 여과하고 감압하에서 클로로포름을 증발시켰다. 갈색 잔류물에 사염화탄소 40 ml를 첨가하여 여과하였다. 여과액을 수거하여 감압하에서 용매를 제거하였다. 밝은 녹색의 투명 오일을 얻어서 4℃에서 저장한 후 고체화시켰다.
반응식 1을 참고로 해서, Br-DMMA를 Pal-시스테인과 반응시켜 화학식 III의 Pal-시스테인 티올 에테르를 얻는데, 여기서 R1은 수소이고, R2는 메틸이며, R3는 팔미틸(C15H31)이며, X는 황이고, Y는 글리신 라디칼(-NHCH(CO2H)-)(n=1 및 m=1임)이다. Br-DMMA(0.3 g, 0.0014 mole)을 희석된 HCl 30 ml 중의 Pal-시스테인 현탁액에 직접 첨가함으로써 상기 반응을 수행한다. 1 N NaOH를 사용하여 상기 혼합물의 pH를 7.9로 점차 조절하여, 종국에는 pH 11이 되었다. 2시간 후에 혼합물은 pH 11에서 안정화되었다. 25℃에서 16시간 교반한 후, 상기 혼합물을 여과하고 1 N HCl을 사용하여 여과액을 산성화시켰다. 백색 침전물이 발생하는데, 이것을 에테르로 추출하였다. 감압하에서 에테르를 증발시켰다. 잔류하는 녹색 오일을 고진공하에서 건조시켰다. 3-S-(N-팔미틸 시스테이닐)메틸, 2-메틸 말레산(420 mg, 0.84 mmol, m.p. 60∼63℃)을 얻었다. 몰 수율은 56%이었다.
3-S-(N-팔미틸 시스테이닐)메틸, 2-메틸 말레산(420 mg, 0.84 mmol)을 무수 THF 5 ml에 용해시켰다. N,N-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(692 mg, 3.36 mmole)를 무수 THF 1 ml에 용해시킨 후, 얼음 중탕기내의 상기 용액에 첨가하였다. 반응물을 5시간 동안 얼음 중탕기에서 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 수거하여 감압하에서 THF를 제거하였다. 잔류물(갈색 고체)를 무수 디옥산 1.5 ml에 용해시켜 여과하였다. 여과액을 저온 무수 헥산 30 ml에 첨가하여 4℃에 16시간 동안 두었다. 침전물을 저온 무수 헥산으로 세척하고 고진공으로 용매를 제거하였다. 밝은 갈색 생성물(반응시약 A)을 얻었다(m.p. 46∼49℃). 몰 수율은 54%이었다.
실시예 2. 3S-(헥사데카닐)메틸 2-메틸 말레산 무수물인 반응시약 B의 합성(반응식 2)
반응식 2를 참고로 해서, Br-DMMA를 헥사데칸티올과 반응시켜 화학식 III의티올 에테르를 얻는데, 여기서 R2는 메틸이고, R3는 헥사데칸(C16H33)(n=0 및 m=0임)이다. 탈수 조건하에서, 화학식 II의 무수물 반응시약 B이 얻어지는데, 여기서 R2, R3, n 및 m은 상기와 같다.
따라서, 반응식 2에 도시된 바와 같이, Br-DMMA(0.5 g, 0.0025 mole)를 물 10 ml(pH 8)에서 가수분해시키고, THF 50 ml에 용해된 헥사데칸티올(0.63 g, 0.0025 mol)에 첨가하였다. 트리에틸아민(1 ml)을 상기 혼합물에 첨가하여 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 그 여과액을 감압하에서 증발시켰다. 얻은 잔류물을 희석된 NaOH 용액(pH 11)에 용해시킨 후, 에테르(3 x 20 ml)로 세척하였다. 1 N HCl을 사용하여 여과액을 pH 2로 조절한 결과, 백색 침전물이 생성되었다. 침전물을 에테르로 추출하여 감압하에서 에테르를 제거하였다. 최종 생성물인 3-(헥사데카닐티오)메틸 2-메틸 말레산을 고진공하에서 건조시켰다.
반응시약 A에 대해 전술한 바와 같은 방법을 사용하여, 3-(헥사데카닐티오)메틸 2-메틸 말레산을 탈수시켜서 반응 시약 B를 얻었다. 반응시약 B를 고온 DMF에 용해시킨 후, 4℃에 16시간 동안 두었다. 백색 침전물이 생성되는데, 이것을 저온 DMF를 사용하여 세척하였다. 용매를 고진공하에서 제거하였다. 백색 분말(73 mg)을 얻었다(몰 수율: 16%)
실시예 3. 반응시약 A를 사용한 가역성 지질화 티라민(REAL-티라민)의 제조법(반응식 3)
반응시약 A(2 mg, 0.00426 mmole)를 무수 DMF 60㎕에 용해시킨 후, 얼음 중탕기내 200 ㎕ 붕산염 완충액 USP(pH 10, 0.1 M)중의 티라민(0.2 mg, 0.00146 mmole)에 첨가하였다. 반응을 얼음 중탕기에서 4시간, 그리고 4℃에서 16시간 동안 수행하였다.
실시예 4. REAL-티라민의 pH 감응도 측정
자유 티라민의 농도를 모니터링함으로써 아미드 결합 형성의 pH 의존성을 측정하였다. 인산염 완충액 1 M(pH 6, 7 및 8)들을 제조하였다. 이들 완충액들을 사용하여 REAL-티라민을 1:2로 희석하였다. 또한, 티라민 원액을 REAL-티라민과 동일한 농도를 갖도록 희석하여 대조군으로서 사용하였다. 시료를 37℃에서 항온 처리하였다. 형광아민 반응을 사용하여 REAL-티라민으로부터 방출된 자유 티라민의 형광을 여러 시점에서 측정하였다.
티라민을 지질화한 후, 자유 티라민의 농도는 원 농도의 15%까지 감소된다. 낮은 pH에서 REAL-티라민을 항온 처리한 결과, 아미드 결합의 분해를 나타내는 자유 티라민의 농도가 증가하였다. 아미드 결합의 가수분해 속도는 pH에 의존하였다(pH 6> pH 7> pH 8). pH 6에서 REAL-티라민을 1시간 항온 처리한 후, 아미드 결합은 거의 완전히 가수분해되었지만, pH 7에서는 약 45%, 그리고 pH 8에서는 단지 7%의 REAL-티라민의 아미드 결합 만이 가수분해되었다(도 1).
실시예 5. 반응시약 A를 사용한 가역성 지질화 AVP(REAL-AVP)의 제조법(반응식 4)
아르기닌 바소프레신(AVP)(0.5 mg)을 붕산염 완충액(pH 10, 0.1 M) 1ml에 용해시켰다. 이 용액의 분취량 0.5 ml(0.25 mg, 0.207 μmole)을 얼음 중탕기에서 무수 디메틸포름아미드(DMF) 50 ㎕중에 용해된 반응시약 A(1 mg, 2.1 μmole)와 반응시켰다. 상기 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 교반하였다. REAL-AVP의 최종 농도는 0.455 mg/ml이었다.
실시예 6. 바소프레신 결핍성 브래틀보로 래트에서 REAL-AVP의 생체내 효과
REAL-AVP를 동물에게 정맥내 투여(5 ㎍/kg)한 후, 여러 시점에서 소변을 수거하였다. 도 2는 투여 후 처음 8시간 동안 소변의 누적 부피를 보여준다. AVP 및 Pal-AVP는 4시간의 소변 배출 지연에서 유사한 효과를 나타낸다. 더 긴 소변 배출 지연(최고 6시간)은 REAL-AVP의 주사 후에 관찰되었다. 팔미트산으로의 AVP 직접 지질화 반응의 생성물인 Pal-AVP는 REAL-AVP 만큼 효과적이지는 못하였다. 소변 배설량은 Pal-AVP 및 AVP를 주사한 지 24시간 후에 원래대로 돌아갔다. 그러나, REAL-AVP의 효과는 3일동안 지속되었다(도 3)
AVP의 pH 감응성 지질화는 AVP의 생물학적 활성을 지연시키는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 7. 반응시약 A를 사용한 가역성 지질화 인슐린(REAL-인슐린)의 제조법(반응식 5)
인슐린(2 mg)을 붕산염 완충액 2 ml(pH 10, 0.1 M)에 용해시켰다. 반응시약 A(1 mg, 2.1 μmol)를 DMF 100 ㎕에 용해시킨 후, 얼음 중탕기에서 인슐린 용액 1 ml(1 mg, 약 0.14 μmol)과 반응시켰다. 반응 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 교반한 후, 붕산염 완충액 500 ml(pH 10, 0.01 M)에 대해 4℃에서 24시간 동안 투석하였다. 붕산염 완충액(pH 10, 0.1 M)을 사용하여 투석된 REAL-인슐린의 부피를 2 ml로 조절하여 REAL-인슐린 0.5 mg/ml의 농도를 얻었다. 또한, 인슐린 원액의 부피(1 ml)를 2 ml로 조절하여 0.5 mg/ml의 농도를 얻었다.
실시예 8. 과혈당 래트에서 REAL-인슐린의 효과
스트렙토조토신 60 mg/kg를 정맥내 투여하여 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 래트에 당뇨병을 야기시켰다. 붕산염 완충액(pH 10, 0.1 M)중에서 0.5 유닛/ml의 인슐린 또는 REAL-인슐린 용액을 제조하였다. 실험 16시간 전에 래트를 단식시킨 후, 0.5 유닛/kg의 인슐린 또는 REAL-인슐린을 피하내 주사하였다. 래트의 혈중 포도당 농도를 9시간 동안 여러 시점에서 모니터하였다. 9 시간 이후에 래트에게 먹이를 주고 15시간 후에 혈중 포도당 농도를 측정하였다. 래트를 다시 단식시키고 16시간 후에 혈중 포도당 농도를 측정하였다. 단식 및 먹이 공급의 주기를 3일 동안 계속하였다.
당뇨병을 유발시킨지 1 주 후에 래트의 혈중 포도당 농도가 평균 100 mg/dl에서 420 mg/dl로 증가되었다(비-단식 쥐의 경우). 인슐린 치료된 래트의 경우, 1 시간 내에 혈중 포도당 농도의 급감이 관찰되었다. 그러나, REAL-인슐린 치료된 래트에서 1 시간 내에 혈중 포도당 농도의 변화가 없었고, 투여한 지 첫 2시간 후에 혈액 포도당의 급감이 관찰되었다(도 4). 이것은 아마도 REAL-인슐린이 가수분해되어 자유 인슐린을 방출하는데 필요한 시간에 기인한 것일 것이다. 인슐린 투여 후, 래트의 절식 혈중 포도당 농도는 24시간내에 원래대로 돌아갔다. 그러나,RELA-인슐린으로 치료한 래트의 경우에는 절식 혈중 포도당 농도에 대한 약제 효과는 3일 동안 지속되었다(도 5). 또한, 단식된 당뇨 래트에게 10 U/kg의 인슐린, REAL-인슐린 및 위약을 경구적 방법으로 투여하였다. 경구 투여 16시간 전에 래트를 단식시켰다. 물/오일 마이크로에멀젼액을 약제 담체로서 사용하였다. 도 6은 혈중 포도당 농도의 어떠한 급감도 인슐린 또는 위약의 경구 투여 후에 관찰되지 않았음을 보여준다. 그러나, REAL-인슐린으로 치료된 래트에서 혈중 포도당 농도의 28% 감소가 9시간이 지나서 관찰되었다.
REAL-인슐린을 사용함으로써, 인슐린의 생물학적 활성이 지연될 수 있다는 것을 결론을 내릴 수 있다. 적당한 제형을 사용하여, REAL-인슐린을 경구 투여하여 혈중 포도당 농도를 감소시킬 수 있다.
본 발명을 완전히 기술하였으므로, 본 발명의 범주 또는 이것의 임의 실시예에 어떠한 영향을 주지 않는한 광범위한 균등 범위의 조건, 제형 및 다른 파라미터로 동일하게 실시할 수 있음은 당기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 논문은 참고로 본 명세서에 전문 인용된다.

Claims (26)

  1. 하기 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    상기 식 중, R2는 수소, 저급 알킬 또는 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되는데, 상기 저급 알킬 또는 아릴은 1개 이상의 알콕시, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아실옥시, 저급 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
    R3는 친유성기이며,
    R4및 R5중 하나는 아민 함유 약제, 천연 또는 비천연 아미노산, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질이고, R4및 R5중 나머지 것은 OR6로서, R6가 수소, 알칼리 금속 및 음전하물로 이루어진 군 중에서 선택되며,
    X는 산소 또는 황이고,
    Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
    n은 0 또는 1이고,
    m은 정수 0 내지 10이다.
  2. 제1항에 있어서, R2는 메틸이고 X는 황인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, n=0이고, m=0이며, R3는 탄소 원자수가 4개 내지 26개인 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 탄소 원자수가 5개 내지 19개인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 카보닐기를 갖는 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 팔미틸, 올레일, 스테아릴, 라우릴, 미리스틸, 콜레이트 및 데옥시콜레이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 천연 또는 비천연 아미노산은 천연 생성 아미노산인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아민 함유 약제는 티라민인 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 Arg. 바소프레신 및 인슐린으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 하기 화학식 II의 화합물:
    화학식 II
    상기 식 중, R2는 수소, 저급 알킬 또는 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되는데, 상기 저급 알킬 또는 아릴은 1개 이상의 알콕시, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아실옥시, 저급 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
    R3는 친유성기이며,
    X는 산소 또는 황이고,
    Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
    n은 0 또는 1이고,
    m은 정수 0 내지 10이다.
  10. 제9항에 있어서, R2는 메틸이고 X는 황인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제9항에 있어서, n=0이고, m=0이며, R3는 탄소 원자수가 4개 내지 26개인 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 탄소 원자수가 5개 내지 19개인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제11항에 있어서, 인접 카보닐기를 갖는 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 팔미틸, 올레일, 스테아릴, 콜레이트 및 데옥시콜레이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 천연 또는 비천연 아미노산은 천연 생성 아미노산인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 하기 화학식 III의 화합물 또는 이것의 약학적으로 허용 가능한 염:
    화학식 III
    상기 식 중, R2는 수소, 저급 알킬 또는 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되는데, 상기 저급 알킬 또는 아릴은 1개 이상의 알콕시, 알카노일, 니트로, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아실옥시, 저급 알킬 또는 할로겐 원자로 임의 치환되고,
    R3는 친유성기이며,
    X는 산소 또는 황이고,
    Y는 가교성 천연 또는 비천연 아미노산이며,
    n은 0 또는 1이고,
    m은 정수 0 내지 10이다.
  16. 제15항에 있어서, R2는 메틸이고 X는 황인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제15항에 있어서, n=0이고, m=0이며, R3는 탄소 원자수가 4개 내지 26개인 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 탄소 원자수가 5개 내지 19개인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 인접 카보닐기를 갖는 상기 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소는 라우릴, 미리스틸, 팔미틸, 올레일, 스테아릴, 콜레이트 및 데옥시콜레이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 천연 또는 비천연 아미노산은 천연 생성 아미노산인 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 아민 함유 약제, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 아민 함유 물질의 세포 흡수를 증가시키는 방법에 있어서, 제1항에 의한 화합물을 상기 세포에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 아민 함유 약제, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 생물학적으로 활성인 아민 함유 화합물의 포유 동물내 혈액 및 조직 보유를 연장시키는 방법에 있어서, 제1항에 의한 화합물을 상기 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항에 의한 화합물을 생성하는 방법에 있어서, 아민 함유 약제, 펩티드 및단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질과 제9항에 의한 화합물을 제1항의 화합물이 얻어지는 조건하에서 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질을 세포 내부로 전달하는 방법에 있어서, 상기 세포를 제1항에 의한 화합물에 노출시킴으로써 상기 화합물이 상기 세포에 의해 흡수되고, 아미드 결합을 가수분해하고 상기 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질을 방출하기에 충분히 낮은 상기 세포내 pH에 노출되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. (a) 유효량의 제1항에 의한 화합물, 및 (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 아미드 결합 가수분해 반응으로부터 상기 화합물을 보호하는 장용 제피를 포함함으로써, 상기 제피가 제거되거나 또는 용해될 때까지 상기 생물학적으로 활성인 아미노기 함유 물질의 방출을 막는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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