ES2209140T3

ES2209140T3 - Sustancias tkr2449 fisiologicamente activas, procedimientos para producir las mismas y microorganismo.

Info

Publication number: ES2209140T3
Application number: ES98923171T
Authority: ES
Inventors: Kazutoh Takesako; Mitsuhiro Ueno; Naoyuki Awazu; Yoko Uno; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-06-09
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2018-06-09
Also published as: AU7552098A; EP1002793A4; EP1002793B1; DE69818482D1; JP4091130B2; EP1002793A1; US6303350B1; DE69818482T2; WO1998056755A1

Abstract

La presente invención tiene como objetivo proporcionar nuevas sustancias biológicamente activas que tienen valor como agentes terapéuticos para infecciones fúngicas y trastornos inmunitarios. Esta invención se refiere a análogo/s de sustancias biológicamente activas TKR2449 representados por la siguiente fórmula general (A): *fórmula * (En la fórmula, R{sub,1}, R{sub,2} y R{sub,3} son iguales o diferentes entre sí y cada uno representa hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. R{sub,4} es un grupo alquilo o alquenilo lineal o ramificado de 1 a 8 átomos de carbono.

Description

Sustancias TKR2449 fisiológicamente activas, procedimientos para producir las mismas y microorganismo.

La presente invención se refiere a un(os) análogo(s) de sustancias TKR2449 biológicamente activas, que sean de utilidad para un agente terapéutico para enfermedades y trastornos inmunológicos por infección fúngica, un procedimiento para su producción, y microorganismos que sean capaces de producir las sustancias TKR2449 biológicamente activas.

Antecedentes de la técnica

Se sabe que los hongos causan una diversidad de enfermedades infecciosas en el hombre, en los animales y las plantas. En el hombre, por ejemplo, provocan micosis superficiales que afectan a la piel, la cavidad bucal, etc., y micosis sistémicas que afectan a las vísceras, al cerebro, etc. Provocan asimismo infecciones similares en los animales domésticos y de compañía. Además, los hongos infligen varios efectos peligrosos a plantas tales como los árboles del huerto y las verduras.

Como principales hongos patógenos que provocan micosis sistémicas en el hombre, se conocen aquellos de los géneros Candida, Cryptococcus, y Aspergillus, entre otros. En cuanto a las micosis superficiales, el género Candida que afecta a la piel, la cavidad bucal, y la vagina, y los Trychophyton que infectan la piel de las extremidades se consideran los principales hongos patógenos. Además de esos hongos, existen numerosos otros hongos en el entorno, de los que se sospecha que contaminan los animales y las plantas.

Recientemente, están aumentando rápidamente los trastornos alérgicos incluidos el asma, la dermatitis atópica, y la rinitis alérgica. Hay muchos trastornos alérgicos en los que diversas sustancias del entorno tales como ácaros y todo tipo de polen, o antígenos contenidos en alimentos se comportan como alérgenos. Asimismo, hay muchos trastornos alérgicos provocados por hongos, y alérgenos procedentes de Candida, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Malassezia, Penicillium, etc. actúan como sus causas. Además, se conocen cantidad de trastornos inmunológicos distintos de trastornos alérgicos, en los que las respuestas inmunológicas están exacerbadas.

Como antimicóticos de utilidad para la prevención y el tratamiento de tales infecciones y contaminaciones fúngicas, se conocen muy pocos actualmente. Entre ellos, como fármacos terapéuticos para las micosis sistémicas en animales, que incluyen al hombre en particular, se pueden mencionar, por ejemplo, la anfotericina B, la flucitosina, el miconazol, y el fluconazol. Sin embargo, estos compuestos no son enteramente satisfactorios en potencia, potencial tóxico, o espectro antifúngico, y por tanto no son intachables como fármacos terapéuticos.

Aunque existe cantidad de sustancias terapéuticas para los trastornos inmunológicos incluidas las enfermedades alérgicas, no pueden tratar suficientemente una diversidad de trastornos inmunológicos. En particular, sólo hay unos pocos fármacos que tienen buenas funciones plurales tales como la actividad para controlar trastornos inmunológicos y actividad antifúngica.

Resumen de la invención

Considerando la técnica anterior anteriormente mencionada, la presente invención tiene por objeto el proporcionar novedosas sustancias biológicamente activas que sean de utilidad como agentes terapéuticos para las infecciones fúngicas y los trastornos inmunológicos.

En la búsqueda de una sustancia novedosa biológicamente activa, los inventores aislaron una gran cantidad de microorganismos del reino de la naturaleza, aislaron las sustancias biológicamente activas que producían y escudriñaron sus propiedades biológicas. Como consecuencia, descubrieron que el caldo de cultivo de una cepa de microorganismo que pertenece al género Aureobasidium contiene una sustancia biológicamente activa que tiene actividad antifúngica frente a hongos patógenos incluidos Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Por lo tanto, los inventores aislaron esta sustancia biológicamente activa y estudiaron sus propiedades fisicoquímicas. Como consecuencia, descubrieron que la sustancia anterior es una sustancia novedosa que tiene características fisicoquímicas definidas y que no se ha mencionado en la bibliografía, y la nombraron TKR2449. Además, descubrieron que TKR2449 exhibe un efecto biológicamente activo sobre un sistema inmunitario y llevaron a cabo la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención va dirigida a un(os) análogo(s) de la sustancia TKR2449 biológicamente activa que está(n) representado(s) por la siguiente fórmula general (A);

1

(En la fórmula, R_{1}, R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes entre sí, y cada uno representa hidrógeno o un grupo alquilo de número de carbonos de 1 a 4. R_{4} es un grupo alquilo o alquenilo lineal o ramificado de número de carbonos de 1

\hbox{a 8).}

La presente invención va además dirigida a un procedimiento de preparación de la sustancia TKR2449 biológicamente activa que comprende el cultivo de una cepa de microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que sea capaz de producir la sustancia TKR2449 biológicamente activa, y el aislamiento de la sustancia objetivo del caldo de cultivo obtenido.

Además, la presente invención va dirigida a un microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que sea capaz de producir la sustancia TKR2449 biológicamente activa.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es un gráfico que muestra el espectro de absorción en ultravioleta de la sustancia TKR2449 biológicamente activa, en la que las ordenadas representan la absorbancia, y las abscisas representan la longitud de onda (nm).

La fig. 2 es un gráfico que muestra el espectro de absorción en los infrarrojos de la sustancia TKR2449 biológicamente activa, en la que las ordenadas representan la transmitancia (%) y las abscisas representan el número de onda (cm^{-1}).

La fig. 3 es un gráfico que muestra el espectro en RMN-^{1}H de la sustancia TKR2449 biológicamente activa, en la que las ordenadas representan la intensidad de las señales y las abscisas representan el desplazamiento químico (ppm).

La fig. 4 es un gráfico que muestra el espectro en RMN-^{13}C de la sustancia TKR2449 biológicamente activa, en la que las ordenadas representan la intensidad de las señales y las abscisas representan el desplazamiento químico (ppm).

La fig. 5 es un gráfico de una HPLC de la sustancia TKR2449 biológicamente activa que muestra su posición de elución, en la que las ordenadas representan la intensidad relativa en UV, y las abscisas representan el tiempo de retención (min).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al (a los) análogo(s) de las sustancias TKR2449 biológicamente activas representados por la fórmula general (A) descrita anteriormente.

En la fórmula general (A) descrita anteriormente, R_{1}, R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes entre sí, y cada uno representa un hidrógeno o un grupo alquilo que posee un número de carbonos de 1 a 4. El grupo alquilo que posee un número de carbonos de 1 a 4 no está restringido pero incluye los grupos metilo, etilo, propilo, n-butilo, e i-butilo. Preferentemente, R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno.

En la fórmula general (A) descrita anteriormente, R_{4} es un grupo alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene un número de carbonos de 1 a 8. El grupo alquilo lineal o ramificado que tiene un número de carbonos de 1 a 8 no está restringido pero incluye los grupos metilo, etilo, propilo, n-butilo, e i-butilo. El grupo alquenilo lineal o ramificado que tiene un número de carbonos de 1 a 8 no está restringido pero incluye los grupos vinilo y alijo. Preferentemente, R_{4} es -CH_{2}-CH=C-(CH_{3})_{2}.

En la fórmula general (A) anteriormente mencionada, la sustancia que lleva hidrógeno como R_{1}, R_{2} y R_{3}, y -CH_{2}-CH=C-(CH_{3})_{2} como R_{4} es la sustancia TKR2449 biológicamente activa que se representa por la siguiente fórmula (I).

2

La sustancia TKR2449 biológicamente activa descrita anteriormente posee las siguientes características fisicoquímicas (1), (2), (3), (4) y (5).

(1) El espectro de masas por FAB-MS da un pico a m/z 660 [M+H]^{+}

(2) El número de carbonos es 36 y el número de nitrógenos es uno.

(3) El espectro en UV en metanol muestra que las principales longitudes de onda de absorción (nm) son 226 nm y 277 nm y que sus E^{1}_{1}^{%}cm son 73 y 10, respectivamente.

(4) El espectro en IR por el procedimiento con KBr muestra que los principales números de longitud de onda son 3420 cm^{-1}, 2930 cm^{-1}, 2850 cm^{-1}, 1720 cm^{-1}, 1510 cm^{-1}, 1380 cm^{-1}, 1240 cm^{-1}, 1200 cm^{-1}, 1140 cm^{-1}, 1070 cm^{-1}, 840 cm^{-1}, y 720 cm^{-1}.

(5) Soluble en metanol y cloroformo, y ligeramente soluble en agua y hexano.

La sustancia TKR2449 biológicamente activa anteriormente mencionada tiene el espectro en RMN-^{1}H presentado en la fig. 3 y el espectro en RMN-^{13}C presentado en la fig. 4 y características tales que su elución se produce en la posición indicada en la fig. 5 en la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa.

Se puede preparar la sustancia TKR2449 biológicamente activa anteriormente mencionada por cultivo de una cepa de microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que sea capaz de producir dicha sustancia TKR2449 biológicamente activa, y aislamiento de dicha sustancia del caldo de cultivo obtenido.

Además, se puede(n) obtener un(os) análogo(s) de TKR2449 representado(s) por la fórmula general (A) a partir de la sustancia TKR2449 biológicamente activa anteriormente mencionada usada como material de partida por los procedimientos descritos a continuación.

Por ejemplo, se puede obtener un derivado éster metílico (R_{1} = R_{2} = R_{3} = CH_{3}) mediante tratamiento de la sustancia TKR2449 biológicamente activa anteriormente mencionada con trimetilsilil diazometano (TMSCHN_{2}) en una mezcla de disolventes de benceno y metanol. Se puede obtener el derivado éster correspondiente (R_{1} = R_{2} = R_{3} = R) al hacerla reaccionar con diversos alcoholes (R-OH) en dimetilformamida (DMF) en presencia de un agente de condensación, incluida la diciclohexilcarbodiimida (DCC).

Se puede eliminar R_{4} en la fórmula general (A) anterior por tratamiento con un halogenuro de hidrógeno incluido el yoduro de hidrógeno (HI), o con una base incluido el metóxido de sodio (CH_{3}ONa), o por tratamiento con yoduro de sodio (NaI) y tetraclorosilano (SiCl_{4}) en una mezcla de disolventes de diclorometano y acetona. Después de dicha eliminación, la preparación de un derivado éster metílico (R_{1} = R_{2} = R_{3} = CH_{3}), se puede obtener el derivado éter correspondiente (-O-R_{4}) mediante la reacción con hidruro de sodio (NaH) y diversos halogenuros de alquilo (R_{4}-X; X = I, Br, Cl) o con diversos tricloracetoimido ésteres de alquilo (R_{4}OC(=NH)CCl_{3}). Después de eso, se eliminan -COOR_{1}, -COOR_{2} y -COOR_{3} para obtener grupos carboxilo libres, por ejemplo, mediante tratamiento con álcalis, incluido el NaOH en metanol.

No hay restricción en cuanto a la cepa de microorganismo que se puede usar en la presente invención a condición únicamente de que pertenezca al género Aureobasidium y de que pueda producir dicho TKR2449. Así, por ejemplo, se puede mencionar Aureobasidium sp. TKR2449 (denominada en lo sucesivo la cepa TKR2449).

La cepa TKR2449 anteriormente mencionada es una cepa novedosa que no se ha descrito con anterioridad en la bibliografía, y que fue aislada y caracterizada por vez primera por los inventores. La cepa posee la propiedad de producir TKR2449 con ventaja. Las características micológicas de la cepa TKR2449 anteriormente mencionada están descritas ahora con detalle.

Se presentan los colores de las colonias de dicha cepa TKR2449 en diversos medios en la tabla 1. Las descripciones de los colores en la tabla se basan en las prescritas en el documento Japanese Industrial Standard (JIS) Z 8102 (1985) y presentan los resultados de la observaciones en los días 4, 7 y 14 de cultivo a 25ºC después de la inoculación en los medios respectivos. Se midió el diámetro de las colonias al cabo de 14 días de cultivo.

TABLA 1

Medio	Diámetro de la	Color de la colonia	Color de la colonia	Color de la colonia
	colonia (mm)	(día 4)	(día 7)	(día 14)
Agar con extracto	58	Amarillo pálido	Grisáceo oscuro verde-	Grisáceo oscuro verde-
de malta		2,5Y9/2	amarillo 5GY3/2	amarillo 5GY3/2
Agar patata dextrosa	49	Marfil 5Y8/2	Marfil 5Y8/2	Marfil 5Y8/2
Agar de Sabouraud	64	Amarillo pálido	Amarillo pálido	Gris-verde oscuro
		2,5Y9/2	2,5Y9/2	5GY3/1
Agar YpSs	38	Grisáceo claro rojo-	Grisáceo claro rojo-	Grisáceo claro rojo-
		amarillo 5YR8/2	amarillo 5YR8/2	amarillo 5YR8/2

La cepa TKR2449 anterior crece moderadamente en agar con extracto de malta y en agar YpSs, etc. Su colonia tiene brillo en el centro, y es generalmente viscosa o pastosa, pero se vuelve a veces curtida según pasan los días de cultivo. A menudo se forman estructuras con aspecto rizoide alrededor de las colonias. El color de las colonias es blanco al principio del cultivo, cambiando luego gradualmente a amarillo pálido a marfil localmente, y se vuelve grisáceo oscuro verde-amarillo a gris-verde oscuro según pasa el tiempo. Después de días suplementarios, el color de las colonias se vuelve marrón a marrón oscuro. Este pigmento es insoluble.

Las hifas tienen un diámetro de 2 a 3 mm y se alargan con buen crecimiento, sin embargo no forman micelios aéreos y se alargan dentro del medio de agar. Se forman a menudo conidios blásticos de tamaño de 3-4 \times 3-8 mm como yemas de dedo desde el ápice o los laterales de las hifas y a veces se observan aglomerados con aspecto de pelota. Las células vegetativas jóvenes tienen aspecto de levadura, un tamaño de 2-4 \times 5-14 mm, una forma elipsoide o con aspecto de limón, y crecen por gemación poliblástica. Se forman artrosporas de tamaño 4-6 \times 8-10 mm, y clamidiosporas de tamaño 4-8 \times 8-16 mm, y no se forman ascosporas.

Entre los rasgos micológicos de la cepa TKR2449, sus características fisiológicas se describen como sigue:

Intervalo de temperaturas para el crecimiento: el intervalo de temperaturas para el crecimiento es de 10 a 30ºC y el intervalo óptimo de temperaturas para el crecimiento es entorno a 25ºC.

El intervalo de pH para el crecimiento: el intervalo de pH para el crecimiento es pH 3 a 8 y el intervalo óptimo de pH para el crecimiento es pH 4 a 7.

Cuando se comparan los rasgos micológicos anteriores con las descripciones del género Aureobasidium en W. B. Cooke, Mycopathologia et Mycologia Applicata, 17, 1-43 (1962); J. A. von Arx, The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, J. Cramer, Lehre; E. J. Hermanides-Nijhoff, Studies in Mycology, 15, 141-166, CBS, Baarn (1977); y otras referencias bibliográficas, se puede identificar la cepa TJR2449 como una cepa perteneciente al género Aureobasidium.

Sin embargo, ningún informe ha mencionado una cepa de microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que tenga la capacidad de producir TKR2449. Por lo tanto, los inventores la consideraron una cepa novedosa y la llamaron Aureobasidium sp. TKR2449. Se depositó la cepa en el National Institute of Bioscience and Human Technology (Dirección, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón (Código postal 305-8566)) bajo el número de entrada FERM BP-6327 (fecha original de depósito: 4 de junio de 1997; fecha de solicitud de transferencia al depósito internacional: 20 de abril de 1998).

Se puede llevar la presente invención a la práctica no sólo con la cepa TKR2449 anteriormente mencionada, sino también con cualquier mutante espontáneo o artificial de dicha cepa TKR2449 o cualquier otra cepa de microorganismo que pertenezca al género Aureobasidium y que tenga la capacidad de producir TKR2449.

Según la presente invención, se prepara TKR2449 mediante la inoculación y el cultivo de una cepa productora de TKR2449 en un medio nutritivo. Los nutrientes que hay que usar para el medio incluyen diversas fuentes de carbón tales como la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, la dextrina, el glicerol, la melaza, el jarabe espeso de malta, aceites y grasas, y ácidos orgánicos. Se pueden usar esos materiales independientemente o en una combinación adecuada de los mismos.

Los nutrientes que hay que usar para el medio incluyen fuentes de nitrógeno, compuestos nitrogenados orgánicos e inorgánicos, tales como la harina de soja, la harina de semilla de algodón, el agua de remojo del maíz, la caseína, la peptona, el extracto de levadura, el extracto de carne, los gérmenes de trigo, la urea, los aminoácidos, las sales de amonio, etc. Las sales como nutrientes son diversas sales inorgánicas tales como sales de sodio, de potasio, de calcio, de magnesio, del ácido fosfórico, etc. Se pueden usar esos materiales independientemente o en una combinación adecuada de los mismos.

Cuando sea necesario, se puede complementar el medio nutritivo con sales de metales pesados, tales como sales de hierro, sales de cobre, sales de cinc, sales de cobalto, etc., vitaminas tales como la biotina, la vitamina B1, etc., y otras sustancias orgánicas e inorgánicas que ayudarían al crecimiento del microorganismo y favorecerían la producción de TKR2449.

Además de los nutrientes anteriores, se puede añadir un antiespumante y/o un tensioactivo, por ejemplo, aceite de silicona, éteres de polialquilenglicol, etc. al medio nutritivo anteriormente mencionado.

En el cultivo de una cepa de microorganismo que sea capaz de producir TKR2449 en dicho medio nutritivo, se puede emplear una diversidad de procedimientos que se usan por lo general en la producción de sustancias biológicamente activas mediante el cultivo de microorganismos. Entre ellos, se prefiere el cultivo en medio líquido, en particular el cultivo con agitación o el cultivo aerobio sumergido.

El cultivo se lleva preferentemente a cabo a una temperatura de 15 a 25ºC. El pH del medio puede extenderse desde pH 3 a 8 y se encuentra preferentemente entorno a pH 5. Por lo que se refiere al tiempo de incubación, por lo general se puede esperar una producción suficiente de la sustancia al cabo de 3 a 15 días de cultivo.

Mediante el cultivo anteriormente mencionado, TKR2449 se encuentra contenido tanto intracelularmente como extracelularmente y acumulado dentro del caldo de cultivo. En la presente invención, el TKR2449 acumulado en el caldo de cultivo se puede obtener del caldo por aislamiento mediante el uso de sus características fisicoquímicas y, cuando es necesario, purificación adicional.

Se puede conseguir el aislamiento anteriormente mencionado por extracción del caldo entero con un disolvente orgánico no hidrófilo tal como el acetato de etilo, el acetato de butilo, el cloroformo, el butanol, la metilisobutilcetona o similares. Como alternativa, es posible someter el caldo a centrifugación o filtración para separarlo en medio y células y aislar las sustancias biológicamente activas de cada uno de las células y el medio.

Se puede aislar el TKR2449 del medio separado no sólo por el procedimiento de extracción mediante el uso del disolvente orgánico no hidrófilo anteriormente mencionado, sino también mediante el procedimiento que comprende la puesta en contacto del medio con un absorbente para dejar el TKRR2449 absorbido al absorbente y su elución con un disolvente. Los absorbentes incluyen, por ejemplo, el carbón activado, el polvo de celulosa y resinas absorbentes. Como el disolvente anteriormente mencionado, se puede usar selectivamente una diversidad de disolventes según el tipo y las propiedades del absorbente, y tanto de forma individual como en combinación. Por lo tanto, se puede emplear una combinación adecuada de una solución acuosa de disolventes orgánicos hidrosolubles tales como la acetona acuosa, el alcohol acuoso, etc.

Para el aislamiento de TKR2449 de los microorganismos separados, se puede emplear la técnica de extracción que usa un disolvente orgánico hidrófilo tal como la acetona.

En la presente invención, cuando sea necesario, se puede hacer seguir la extracción bruta de TKR2449 de un procedimiento de purificación. Dicha purificación puede llevarse a cabo mediante los procedimientos que se usan por lo general para el aislamiento y la purificación de sustancias biológicamente activas liposolubles. Como tales procedimientos, se puede mencionar la cromatografía en columna o la cromatografía líquida de alta resolución que usan una columna rellenada con una fase estacionaria tal como el gel de sílice, la alúmina activada, el carbón activado, una resina absorbente, etc. Los líquidos de elución que se pueden usar para la cromatografía en columna de gel de sílice incluyen el cloroformo, el acetato de etilo, el metanol, la acetona, el agua, etc. Se pueden usar en una combinación de dos o más tipos de los mismos.

La resina para cromatografía líquida de alta resolución incluye gel de sílice químicamente derivatizada tal como derivados de gel de sílice que llevan grupos octadecilo, octilo o fenilo; y geles polímeros porosos de poliestireno, mientras que la fase móvil que se puede usar incluye soluciones acuosas de disolventes orgánicos hidrosolubles tales como el metanol acuoso, el acetonitrilo acuoso, etc.

Se puede hacer uso del (de los) análogo(s) de TKR2449 de la presente invención cada uno tales cuales o en forma de una sal farmacológicamente aceptable en aplicaciones medicinales. No hay restricción particular en cuanto a dicha sal a condición de que sea una sal farmacológicamente aceptable. Por lo tanto, la sal incluye a las sales de ácidos minerales tales como el ácido clorhídrico, el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico, el ácido fluorhídrico, el ácido bromhídrico, etc.; sales de ácidos orgánicos tales como el ácido fórmico, el ácido acético, el ácido tartárico, el ácido láctico, el ácido cítrico, el ácido fumárico, el ácido maleico, el ácido succínico, el ácido metanosulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido bencenosulfónico, el ácido toluenosulfónico, el ácido naftalenosulfónico, el ácido canforsulfónico, etc.; y sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos tales como el sodio, el potasio, el calcio, etc.

Para administrar el (los) análogo(s) del TKR2449 o sus sales farmacológicamente aceptables como fármaco, se puede administrar el (los) análogo(s) del TKR2449 o sus sales farmacológicamente aceptables a animales incluido el ser humano, bien tal cual o bien en forma de una composición farmacéutica que contiene típicamente de 0,1 a 99,5%, preferentemente 0,5 a 90% del mismo en un vehículo inerte, no tóxico y farmacéuticamente aceptable.

El vehículo anteriormente mencionado incluye diluyentes, agentes de relleno, otros auxiliares de formulación, sólidos, semisólidos o líquidos, etc. y se pueden usar tales vehículos solos o en combinación.

La composición farmacéutica anteriormente mencionada se administra preferentemente en formas posológicas unitarias y puede administrarse por vía oral, parenteral, tópica (por ejemplo, por vía transdérmica) o rectal. Desde luego, esas composiciones farmacéuticas deberían administrarse en formas posológicas apropiadas para las respectivas vías de administración.

Para la administración del (de los) análogo(s) de TKR2449 de la presente invención o su sal farmacológicamente aceptable como fármaco, se selecciona preferentemente la dosis como agente antifúngico con referencia a factores del paciente tales como la edad y el peso corporal, la vía de administración, la naturaleza y la severidad de la enfermedad, etc. Sin embargo, habitualmente, en el hombre, la dosis diaria del ingrediente activo para un paciente adulto es de 10 a 2000 mg. Aunque una dosis diaria inferior al intervalo anterior pueda ser suficiente en algunos casos, una dosis superior al intervalo anterior puede ser necesaria en otros casos. Cuando se usa una dosis elevada, la posología diaria se administra preferentemente en varias dosis divididas.

Se puede realizar la administración oral mediante el uso de formas posológicas unitarias sólidas, pulverulentas o líquidas y se pueden usar, por ejemplo, polvos a granel, polvos, comprimidos, grageas, cápsulas, gotas, comprimidos sublinguales y otras formas posológicas.

Para la administración por vía parenteral, se pueden emplear formas posológicas unitarias líquidas para la administración por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, típicamente soluciones y suspensiones. Se pueden fabricar estas preparaciones mediante la suspensión o la disolución de una cantidad predeterminada de análogo(s) de TKR2449 de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del (de los) mismo(s) en un vehículo líquido no tóxico adecuado para inyecciones tal como un medio acuoso o un medio aceitoso, y esterilización de la suspensión o solución obtenida.

Se puede llevar a cabo la administración tópica (por ejemplo, la dministración por vía transdérmica) mediante el uso de formas posológicas tópicas tales como líquidos, cremas, polvos, pastas, geles y pomadas. Estas formas posológicas se pueden fabricar mediante el uso de una cantidad predeterminada de análogo(s) de TKR2449 o de una sal farmacológicamente aceptable del (de los) mismo(s) en combinación con uno o más de entre perfumes, colorantes, agentes de relleno, tensioactivos, humectantes, emolientes, gelificantes, vehículos, conservantes, estabilizantes, etc. adecuados para formulaciones posológicas para aplicación externa.

Se puede realizar la administración por vía rectal anteriormente mencionada mediante el uso, por ejemplo, de supositorios mediante mezcla en cada uno de una cantidad predeterminada de análogo(s) de TKR2449 o de su(s) sal(es) farmacológicamente aceptable(s) con una base sólida de bajo punto de fusión tal como los ésteres superiores, por ejemplo, el palmitato de miristilo, el polietilenglicol, la manteca de cacao o una mezcla de éstos.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Los siguientes ejemplos son más ilustrativos de la presente invención, pero de ningún modo restrictivos del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Se usó el contenido de un asa de la cepa TKR2449 (FERM BP-6327) procedente de un cultivo inclinado para inocularla en un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenía 100 ml de medio líquido (caldo patata dextrosa de Difco, 2,4% (p/v)) y se incubó sobre un agitador a 25ºC durante 3 días para preparar un cultivo de siembra. Se transfirió 1 ml de este cultivo de siembra a 8 matraces Erlenmeyer de 500 ml de capacidad que contenían cada uno 125 ml del mismo medio líquido que anteriormente y se incubaron (con agitación a 220 rpm) a 25ºC durante 12 días. Se centrifugó el caldo de cultivo obtenido y se separó el líquido sobrenadante de las células. Se aplicó el líquido sobrenadante a una columna (0,5 l) de Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), se lavó la columna con agua, y se produjo la elución con 2 l de metanol al 80% para dar una fracción activa. Se concentró la fracción bajo presión reducida para obtener 205 mg de un residuo.

Se disolvió el residuo en 0,8 ml de metanol y se sometió a cromatografía líquida de alta resolución para proporcionar una fracción activa. Se concentró la fracción bajo presión reducida para obtener 6,8 mg en forma de un polvo blanco. La cromatografía líquida de alta resolución se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

Equipo: LC-8A (Shimadzu)

Columna: YMCPack C18 (2,0 cm \times 25 cm) (YMC)

Fase móvil: acetonitrilo al 70% (v/v)/agua que contenía ácido trifluoracético al 0,05%.

Propiedades fisicoquímicas

Se llevó a cabo una espectrometría de masas mediante un espectrómetro de masas JMS-DX302 (Jeol Ltd.). Se realizaron una RMN-^{1}H (en metanol deuterado, con tetrametilsilano como referencia) y una RMN-^{13}C (en metanol deuterado, con metanol deuterado como referencia) mediante un espectrómetro de resonancia magnética nuclear JNM-A500 (Jeol Ltd.). Se llevó a cabo una espectrofotometría en el ultravioleta (en metanol) mediante un espectrofotómetro registrador UV-250 (Shimadzu), y una espectrometría de absorción en los infrarrojos (procedimiento con KBr) mediante un espectrofotómetro de infrarrojos 270-30 (Hitachi). Se describen a continuación las propiedades fisicoquímicas de la sustancia TKR2449.

(1) Espectrometría de masas

El producto pulverulento blanco purificado que se consiguió tras concentración al vacío de la fracción activa en dicha cromatografía líquida de alta resolución resultó ser una sustancia con una m/z de 660 [M+H]^{+} por espectrometría de masas FAB-MS.

(2) Números de átomos de carbono y nitrógeno

El producto pulverulento blanco purificado que se consiguió tras concentración al vacío de la fracción activa en dicha cromatografía líquida de alta resolución resultó tener un número de átomos de carbono de 36 y un número de átomos de nitrógeno de 1 por RMN-^{1}H, RMN-^{13}C y sus análisis. El espectro en RMN-^{1}H y el espectro en RMN-^{13}C de este producto se presentan en la fig. 3 y la fig. 4 respectivamente.

(3) Espectro de absorción en el ultravioleta

La absorción en el UV en metanol del producto pulverulento blanco purificado que se consiguió tras concentración al vacío de la fracción activa en la cromatografía líquida de alta resolución resultó ser la siguiente:

UV (nm) (E 1_{1}%_{cm} ): 226 (73), 277 (10)

El espectro de absorción en el UV se presenta en la fig. 1.

(4) Espectro de absorción en los infrarrojos

El resultado de la espectrofotometría de absorción en los IR por el procedimiento del KBr del producto pulverulento blanco purificado que se consiguió tras concentración al vacío de la fracción activa en la cromatografía líquida de alta resolución se mencionó en lo siguiente:

IR (KBr) (cm^{-1}): 3420, 2930, 2850, 1720, 1510, 1380, 1240, 1200, 1140, 1070, 840, 720.

El espectro de absorción en los IR se presenta en la fig. 2.

En cuanto a la solubilidad del TKR2449 obtenido en diversos disolventes, era soluble en el metanol y el cloroformo, pero ligeramente soluble en el hexano y el agua.

Basándose en los análisis anteriores, se identificó el producto pulverulento blanco purificado que se consiguió tras concentración al vacío de la fracción activa en la cromatografía líquida de alta resolución como TKR2449.

Se analizó el TKR2449 anterior por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de partición en fase inversa mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución LC-10A (Shimadzu). Este análisis por HPLC se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

Columna: CAPCELL PAK C_{18} (6 mm \times 150 mm) (Shiseido)

Fase móvil: acetonitrilo al 70% (v/v)/agua que contenía ácido trifluoracético al 0,05%

Temperatura de la columna: 40ºC

Longitud de onda de la detección por UV: 220 nm

Como resultado, la elución del TKR2449 anterior se produjo en la posición indicada en la fig. 5.

Características biológicas (1) Actividad antifúngica

Se determinaron los espectros antifúngicos del TKR2449 anterior frente a diversos microorganismos. Mediante el uso del procedimiento de dilución del medio líquido, se determinó la concentración que provocaba una inhibición esencialmente completa del crecimiento fúngico como la concentración mínima inhibidora (\mug/ml). Los resultados se presentan en la tabla 2. La concentración mínima que provocaba una inhibición parcial del crecimiento fúngico se definió como la concentración sub-inhibidora (\mug/ml) y se presenta entre paréntesis en la tabla 2.

En la tabla, YNBG significa un medio YNBG que comprende 0,67% de base nitrogenada para levaduras (Difco) y 1,0% de glucosa.

TABLA 2

Cepa de prueba	Medio	Concentración mínima inhibidora (\mug/ml)
Candida albicans TIMM0136	YNBG	12,5 (6,25)
Candida kefyr TIMM0301	YNBG	100 (25)
Cryptococcus neoformans TIMM0354	YNBG	6,25

Se ve claramente a partir de la tabla 2 que la sustancia TKR2449 biológicamente activa según la presente invención es activa frente a hongos patógenos tales como Candida albicans, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans, etc.

(2) Actividad inhibidora de la reacción mixta linfocitaria (MLR)

Se tomaron los bazos de ratones C57BL/6 y de ratones BALB/c respectivamente, y se homogeneizaron en un medio para convertirlos en una suspensión de células. Se pasó la suspensión de células de ratones C57BL/6 por una columna de lana de nylon, consiguiéndose una preparación rica en células T (células respondedoras). Se irradió la suspensión de células de ratones BALB/c mediante rayos X y se usaron como células estimuladoras. Se mezclaron las células respondedoras y las células estimuladoras en una proporción de 1:1, y se incubaron en un incubador con CO_{2}. Después de 4 días de incubación, se añadió ^{3}H-timidina. Después de un día adicional de incubación, se recogieron las células. Se midió la cantidad de ^{3}H-timidina incorporada. Las muestras de prueba, que se prepararon por dilución con medio de cultivo de una solución en dimetilsulfóxido para que se conviertan en soluciones de 500, 125, 31,2 y 7,8 \mug/ml, se añadieron por 0,5% cuando las células respondedoras y las células estimuladoras se habían mezclado, y las concentraciones finales fueron de 25 a 0,039 \mug/ml. Se calculó la actividad inhibidora en comparación con la cantidad incorporada en ausencia de una muestra de prueba. El TKR2449 demostró una actividad inhibidora de la MLR dependiente de la dosis y la concentración que demostraba una inhibición del 50% era de 0,15 \mug/ml, lo cual demuestra que tiene una actividad inhibidora sobre la respuesta inmunológica.

La administración por vía intraperitoneal del TKR2449 obtenido anteriormente a una dosis de 50 mg/kg a ratones ICR no provocó síntomas de toxicidad.

Ejemplo 2 Preparación de un TKR2449 metilado (R_{1} = R_{2} = R_{3} = CH_{3})

Se disolvió TKR2449 (5,0 mg, 7,6 \mumoles) en metanol-benceno (2:8, 50 \mul). A la solución, se añadió trimetil diazometano (solución al 10% en hexano, 50 \mul, 44 \mumoles) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla de reacción durante 2,5 horas y se le añadió ácido acético al 10% hasta que se volviera clara para descomponer el trimetil diazometano. Después de eso, se concentró la mezcla bajo presión reducida. Se disolvió el residuo obtenido en 400 \mul de metanol y se le sometió a cromatografía líquida de alta resolución. Se concentró la fracción que contenía el TKR2449 metilado bajo presión reducida, consiguiéndose 1,9 mg de una sustancia purificada en forma de un polvo blanco. La cromatografía líquida de alta resolución se llevó a cabo en las siguientes condiciones:

Equipo: LC-8A (Shimadzu)

Columna: CAPCELL PAK C_{18} (10 mm x 250 mm) (Shiseido)

FAB-MS: m/z 701 [M+H]^{+}

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona análogo(s) de las sustancias TKR2449 biológicamente activas que son de utilidad en medicina clínica, por ejemplo en la terapia de enfermedades infecciosas fúngicas o de enfermedades inmunológicas, y un procedimiento de producción de los mismas.

Claims

1. Un análogo de la sustancia TKR2449 biológicamente activa que está representado por la siguiente fórmula general (A);

3

(en la fórmula, R_{1}, R_{2} y R_{3} son iguales o diferentes entre sí, y cada uno representa un hidrógeno o un grupo alquilo de número de carbonos de 1 a 4. R_{4} es un grupo alquilo o alquenilo lineal o ramificado de número de carbonos de 1 a 8).

2. El análogo de la sustancia TKR2449 biológicamente activa según la reivindicación 1, que posee un hidrógeno como R_{1}, R_{2} y R_{3}, y -CH_{2}-CH=C-(CH_{3})_{2} como R_{4}.

3. Un procedimiento para preparar la sustancia TKR2449 biológicamente activa que comprende el cultivo de una cepa de microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que sea capaz de producir una sustancia TKR2449 biológicamente activa como se ha definido en la reivindicación 1, y el aislamiento de la sustancia del caldo de cultivo obtenido.

4. Un microorganismo perteneciente al género Aureobasidium y que sea capaz de producir una sustancia TKR2449 biológicamente activa como se ha definido en la reivindicación 1.

5. Uso de una sustancia biológicamente activa según la reivindicación 1 en la fabricación de un agente terapéutico para trastornos inmunológicos.

6. El microorganismo según la reivindicación 4 que se selecciona del grupo formado por la cepa TKR2449, mutantes espontáneos de la misma y mutantes artificiales de la misma.