WO2006016657A1

WO2006016657A1 - Hcv感染症を治療または予防するための薬剤

Info

Publication number: WO2006016657A1
Application number: PCT/JP2005/014767
Authority: WO
Inventors: Masayuki Sudo; Hiroshi Sakamoto
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2006-02-16
Also published as: EP1795206A1; JP4849622B2; JPWO2006016657A1; US8183005B1; EP1795206A4

Abstract

　本願発明者らは、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する化合物、ミリオシン、フモニシンB1、およびセラミド輸送阻害剤HPA-12について、HCVレプリコン阻害活性の検討を行ったところ、これらの化合物はHCVレプリコンRNA の複製またはHCVタンパク質の発現を阻害する効果を持つことが認められた。さらに本願発明者らは、siRNAを用いたセリンパルミトイル転移酵素のノックダウン実験を行い、その結果、LCB1の発現を抑制した細胞では、有意にHCVレプリコン活性及びHCVタンパク質発現が阻害され、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与することがわかった。このことより、スフィンゴ脂質生合成過程に存在する酵素活性を、化合物の添加や遺伝子のノックダウンにより阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが出来ることを明らかにした。

Description

HCV感染症を治療または予防するための薬剤

技術分野

[0001] 本発明は、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットに関する。

背景技術

[0002] HCVの感染者は世界で 1〜2億人、日本国内では 200万人以上と推測されている。これらの患者の約 50%が慢性肝炎に移行しそのうち約 20%が感染後 30年以上たつて肝硬変、肝癌となる。肝癌の約 90%の原因が C型肝炎といわれている。日本国内では、毎年 2万人以上の患者が HCV感染に伴う肝癌により死亡している。

[0003] HCVは 1989年に輸血後の非 A非 B型肝炎の主要な原因ウィルスとして発見された。 HCVはエンベロープを有する RNAウィルスであり、そのゲノムは 1本鎖（ + )RN Aからなり、フラビウィルス科のへパチウィルス（Hepacivirus)属に分類される。

[0004] HCVは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多ぐ慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多、ことも知られて、る。

[0005] よって、 C型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓において HCVを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。

[0006] 現在、 HCV排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の 1Z3程度である。特に HCV ゲノタイプ lbに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフエロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗 HCV薬の開発が強く望まれている。

[0007] 近年、リバビリン（Ribavirin: 1— β— D—リボフラノシル一 1Η— 1, 2, 4—トリァゾールー 3—カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用による C型肝炎治療薬として巿販されているが、有効率は依然低ぐ更なる新規な C型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンァゴニスト、インターロイキン 12ァゴニストなど、唐、者の免疫力を増強させることによってウィルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。

[0008] HCV遺伝子がクローユングされて以来、ウィルス遺伝子の機構と機能、各ウィルスのタンパク質の機能などにっ、ての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウィルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、信頼できる培養細胞を用いた HCV感染実験系は構築されて、な力つた。従って従来、抗 HCV薬の評価をするにあたり他の近縁ウィルスを用いた代替ウィルスアツセィ法を用いなければならな力つた。

[0009] しカゝし近年、 HCVの非構造領域部分を用いてインビトロでの HCV複製を観測することが可能になったことにより、レブリコンアツセィ法によって抗 HCV薬を容易に評価することができるようになった (非特許文献 1)。この系での HCV RNA複製のメカ- ズムは、肝細胞に感染した全長 HCV RNAゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、 HCVの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアツセィ系ということができる。

[0010] 尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。

特許文献 1：国際公開公報 W098Z56755号パンフレット

特許文献 2：特願 2003-34056

特許文献 3：特願 2003-272420

非特許文献 1 :ブイ'ローマンなど著、サイエンス（Science) , 1999年、第 285卷、第 1 10— 113頁

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本願発明者らは、国際公開公報 W098Z56755号 (特許文献 1)に開示されており、オーレォバシディウム（Aureobasidium)属などの微生物に由来する一連の化合物力上記レブリコンアツセィ法で高い HCVの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献 2)。また本願発明者らは、該化合物がインビトロの細胞毒性については軽微であり、 HCV感染症の予防剤または治療剤として極めて有用であることを見出し、さらに該化合物および誘導体の合成方法を構築した (特許文献 3)。これら阻害剤は HCV感染症の治療薬となる可能性が高いと考えられる。しかし、 HCVが生体内にどのような異常を引き起こしているの力、また、これらの一連の化合物はどのような生体内反応を阻害するかについてはこれまで解明されておらず、該化合物を薬剤として使用した時の挙動が懸念されていた。また、該化合物を医薬品として使用する上で、該化合物が生体内のどのようなカスケードに関与し、抗 HCV複製阻害活性を引き起こすのかについての解明が求められていた。

[0012] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、オーレォバシディウム (Aureobasidium)属などの微生物に由来する一連の化合物およびそれらの誘導体が、生体内のどのようなカスケードに関与し、抗 HCV複製阻害活性を引き起こすのかについて解明することにある。また、該化合物の阻害するカスケードを特定することで、それらのカスケードを遮断する化合物を有効成分として含有する、 HCV 感染症を治療または予防するための薬剤を提供する。さらに、 HCV感染および抗 H CV複製阻害活性のメカニズムを解明することで、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットを提供する。課題を解決するための手段

[0013] 上記課題を解決するために、まず本願発明者らはオーレォバシディウム (Aureobasi di醒)属などの微生物に由来する化合物の一つである以下の式 (II)で表される化合物と、該化合物に部分的に類似した構造を持つミリオシンについて、 HCVレブリコンアツセィを行った。

[0014] 式（Π) :

[0015] ミリオシンはスフインゴ脂質生合成（図 1)の初段階で、セリンとパルミトイル CoAを縮合させて、 3-ケトジヒドロスフインゴシンを生成するセリンパルミトイル転移酵素（SPT) を特異的に阻害する化合物であり（Zweerink, M. M., Edison, A., M., Wells, G. B.， P into, W" Lester, R. L" J. Biol. Chem., 267, 25032—25038 (1992)、スフインゴ脂質生合成全体を停止させる活性を持つ。

[0016] 式（II)で表される化合物またはミリオシンを ΙρΜから 100 μ Μの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、培養し全 RNAを抽出した後で、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式 (Π)で表される化合物にト 10 ηΜの濃度でレプリコン RNAを 50%減少させる効果が認められた（図 2、 3)。さらに、ミリォシン又は式（II)で表される化合物を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3 -1に与え、培養しタンパク質を回収した後、 HCVタンパク由来の抗 NS3ゥサギ抗体を用いてウェスタン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式 (Π)で表される化合物に 1-lOnMの濃度で HCVタンパク質の発現を 50%減少させる効果が認められた（図 4、 5)

[0017] 次に、スフインゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフインゴシン力ジヒド口セラミドを生成するジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害するフモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性を測定した。フモ-シン B1を 1.37uMから 10 00uMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、培養した後に、ルミネッセンス測定を行った。その結果、フモ-シン B1は 10-lOOOuMの濃度で、 HCVレプリコン阻害活性を示すことが明らかになった（図 6)。

[0018] 以上の結果より、セリンパルミトイル転移酵素 (SPT)を特異的に阻害する化合物ミリォシンおよびジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害するフモ二シン Blは、抗 HCV複製阻害活性を持ち、スフインゴ脂質合成が HCV感染に関与していることが示唆された。そこで、本発明者らは、スフインゴ脂質生合成の一つの過程を触媒するセリンパルミトイル転移酵素の阻害力 HCVレブリコン活性の阻害と直接関与しているかを確認するために、 siRNAを用いたセリンパルミトイル転移酵素のノックダウン実験を行った。まず、セリンパルミトイル転移酵素のへテロダイマーのうち 1 サブユニット LCB1を標的として、 2種の特異的な siRNA(si246、 si633)を合成した。ゥエスタンブロット解析を用いて siRNAによる LCB1の発現阻害を測定したところ、コントロール siRNAと比較して、 2種類の siRNAで共に発現阻害を示し、 si246では特に強い発現阻害が認められた（図 7)。

[0019] さらに、 LCB1を siRNAによりノックダウンして、 HCVレプリコン阻害活性を測定した。

具体的には、 LCB1発現を低下させた条件下で、 Huh-3-l細胞における細胞毒性及び HCVレプリコン活性の影響を測定した。その結果、 LCB1の発現を抑制した si246、 s i633処理した細胞では、コントロール siRNA処理した細胞に対し有意に HCVレプリコン活性を阻害し、特に LCB1の発現を強く抑制した si246で阻害効果が強く認められた（図 8)。また、同条件下において siRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められな力つた。これらの結果より、スフインゴ脂質生合成が HCV感染に関与することがわかり、該生合成過程に存在する酵素活性を阻害することによって、 HCV感染症の治療または予防を行うことが可能であると示唆された。

[0020] 次に、 HCVレプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で 96時間処理し、 H CV-NS3タンパク質の発現阻害を確認したところ、式 (Π)で表される化合物の添加により核周辺の HCV-NS3タンパク質が消失した（図 10)。また、 HCVレプリコン細胞を 10 0 nMの式（II)で表される化合物で 48時間および 96時間処理し、ウェスタンブロット解祈により、 HCVの非構造タンパク質 NS3,NS5A,および NS5Bの発現を確認したところ、全てのタンパク質で発現の低下がみられた（図 11)。これらの結果により、式 (II)で表される化合物力 HCVのウィルス複製に関与して、る非構造タンパク質 NS3,NS5A,および NS5Bの発現を抑制させる効果を持つことが、明ら力となった。

[0021] 次に、ヒト組み換え SPT (ヘテロダイマー LCB1及び LCB2)タンパク質を調製し、式 (I I)で表される化合物の SPT阻害活性を測定したところ、式 (II)で表される化合物は IC5 0約 10 nMで SPT阻害活性を有していることが明ら力となった（図 12)。

[0022] 次に、 HCVレプリコン細胞を式（II)で表される化合物で 48時間処理し、 [14C]セリンで標識したところ、式 (II)で表される化合物が濃度依存的に細胞内のセラミド及びスフインゴミエリンの de novo合成を阻害することが明ら力となった（図 13)。また、細胞性浸透性セラミド (C2—セラミド）を式 (II)で表される化合物と同時に HCVレブリコン細胞に添加し培養したところ、式 (II)で表される化合物による HCV複製阻害は C2セラミドの濃度に依存して抑制された（図 14)。

[0023] 次に、 HCVレブリコン細胞を、既知の SPT阻害剤ミリオシン、セラミド合成阻害剤フモ二シン Bl、及びセラミド輸送阻害剤 HPA-12で処理し、レブリコン活性および生細胞数を測定したところ、 V、ずれの化合物も細胞毒性を認めな、濃度で HCVの複製を抑制することが明らかとなった（図 15)。

[0024] 次に、 HCVレプリコン細胞に 1 mMの式（II)で表される化合物を添カ卩し、ラフトタンパク質の発現を確認したところ、式 (Π)で表される化合物は可溶化剤耐性画分の NS5B のタンパク質発現を低下させた（図 16)。しかしながら、 NS5Aや宿主のラフト結合タンノク質力べオリンー 2にお、ては、式 (II)で表される化合物による影響は認められなかった。また、 HCVレプリコン細胞に 1 mMの式（II)で表される化合物を添カ卩し、ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質 (可溶化剤耐性)、非ラフトタンパク質を分離したところ、 NS5Bにお、て有意にラフト上力もの解離が認められた（図 17)。

[0025] 即ち、本発明者らは、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。

これまで、 HCV遺伝子の機構と機能の解明が行われ、 HCVの非構造タンパク質を標的とした HCV治療剤の開発が進められて、たが、非構造タンパク質自体が複製の過程で変異を起こす可能性があるため、効果的な治療剤の開発が困難であった。本発明により、スフインゴミエリンの生合成が HCVの複製に関与することがわかり、ホスト細胞内でのウィルスの複製のメカニズムが明ら力となった。本発明の知見は、スフインゴミエリン生合成系を新規なホストターゲットとした抗 HCV剤の開発に大きく貢献するものである。これまでの抗 HCV剤は、標的となるカスケードが不明確であり副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的がスフインゴミエリン生合成系であり、より明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。また、本発明の抗 HCV剤は、 HCVのサブタイプや種々のタンパク質の変異によらず、広く抗 HCVの作用を示す可能性がある。

本発明は、より具体的には、以下の（1)〜（23)を提供する。

(1)スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 H CV感染症を治療または予防するための薬剤。

(2)スフインゴミエリンの生合成過程力パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生合成過程である（1)に記載の薬剤。

(3)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。

(a)パルミトイル CoAから 3-ケトジヒドロスフインゴシンの生合成に関与する、セリンパルミトイル転移酵素 (SPT)の酵素活性を阻害する化合物

(b)セリンパルミトイル転移酵素（SPT)の発現を抑制する化合物

(4)セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、スフインゴファンギン、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体である、（3)に記載の薬剤。

式 (I) :

〔式中、 Aは、 - (CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；

2 n

Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N

2 2

OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されて、てもよ、ァミノ基で置換されて、てもよ、）を表し；

Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子

2 m

、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよいへテロアリール基、 OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し； Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；

Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH

2 p

基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置換されて、てもよ、複素環式基、または置換されて、てもよ、ヘテロァリール基を表し；

結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして

及び R³は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を示す。〕

(5)セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体である、 (3)に記載の薬剤。

式 (Π) :

(6)セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物力以下の（a)または (b)である、 (3)に記載の薬剤。

(a)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

(b)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA

(7)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。

(a)スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物

(b) (a)に記載のジヒドロスフインゴシン—N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合物

(8)スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物が、フモ-シン B 1またはその誘導体である（7)に記載の薬剤。

(9)ジヒドロスフインゴシン N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合物力以下の（ a)または (b)である、 (7)に記載の薬剤。

(a)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

(b)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA

(10)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。

(a)セラミドからスフインゴミエリンの生合成に関与する、スフインゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物 (b) (a)に記載のスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物

(11)スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（a)または (b) である、（10)に記載の薬剤。

(a)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA

(b)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA

(12) HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（1)〜（11) のいずれか〖こ記載の薬剤。

(13)以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤。

式 (I) :

2 n

2 2

2 m

、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、シクロアルケ-ル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよいヘテロァリール基、—OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ -ル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；

Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；

2 p

結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして

(14)以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンノルミトイル転移酵素阻害剤。

式 (Π) :

(15)ヒト由来のセリンパルミトイル転移酵素を阻害する、（13)または（14)に記載の阻害剤。 (16)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程

(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程

(c) (a)に記載の酵素と結合する被検化合物を選択する工程

(17)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

(b)スフインゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程

(c)被検化合物を接触させてヽな、場合と比較して、上記化合物の量を減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。

(18)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

(b)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程

(c)被検化合物を接触させて!ヽな!ヽ場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。

(19)以下の（a)〜（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素をコードする DNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程

(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程

(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程

(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。 (20)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(b)該スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程

(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。

(21)スフインゴミエリンの生合成過程力パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生合成過程である（16)〜（20)のいずれかに記載のスクリーニング方法。

(22)パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素力セリンパルミトイル転移酵素、 N—ァシル転移酵素およびスフインゴミエリン合成酵素である、 (21)に記載のスクリーニング方法。

(23) HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（16)〜（22 )のいずれかに記載のスクリーニング方法。

(24) (16)〜（23)の、ずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。図面の簡単な説明

[図 1]スフインゴ脂質合成経路 (パルミトイル CoAからスフインゴミエリンまでの合成経路)を示す図である。

[図 2]ノザンプロット解析によるミリオシンの HCV RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。

[図 3]ノザンプロット解析による式 (II)で表される化合物の HCV RNA複製阻害活性を示す写真である。横軸は式 (Π)で表される化合物の濃度を表す。

[図 4]ウェスタンプロット解析によるミリオシンの HCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。

[図 5]ウェスタンプロット解析による式 (Π)で表される化合物の HCVタンパク合成阻害活性を示す写真である。横軸は式 (II)で表される化合物の濃度を表す。

[図 6]フモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性を示す図である。

[図 7]siRNAによるセリンパルミトイル転移酵素（LCB1)のタンパク質発現阻害を示す写真である。 [図 8]siRNAによる HCVレブリコン阻害活性および細胞毒性の影響を示す図である。

[図 9]式 (II)で表される化合物による HCVレブリコンの阻害及び宿主細胞への毒性を示す図である。

[図 10]式 (II)で表される化合物による HCV-NS3タンパク質の発現阻害を示す写真である。免疫染色の後、蛍光顕微鏡にて観察した。白色は NS3タンパク質、灰色はへキスト 33342で染色された核を示す。

[図 11]式（II)で表される化合物による NS3、 NS5A、および NS-5Bタンパク質の発現阻害を示す図である。各タンパク質の発現は、ウェスタンプロット解析により行った。

[図 12]式 (II)で表される化合物による SPT阻害活性を示す図である。

[図 13]式 (II)で表される化合物によるセラミド、スフインゴミエリンの de novo合成阻害を示す図である。

[図 14]C2—セラミドによる式 (II)で表される化合物の HCV複製阻害の抑制を示す図である。

[図 15]ラフト生合成関連低分子化合物による HCV複製阻害を示す図である。

[図 16]式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。

[図 17]式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0028] 本発明は、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。

[0029] 本発明において、スフインゴミエリンの生合成過程としては、より好ましくはパルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程（図 1)を挙げることが出来る。

[0030] 本発明にお、て、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物とは、パルミトィル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関わる生体内反応を、直接的もしくは間接的に阻害するものであれば如何なる化合物であってもよ、。スフインゴミエリンの生合成過程に関わる酵素の活性を阻害する化合物、生合成に関わる酵素の発現を阻害する化合物であってもよぐまた、これらの阻害剤を生成または増加させる化合物であって、生合成に関わる酵素を間接的に阻害する化合物であってもよい。

[0031] 本発明において、スフインゴミエリンの生合成過程に関わる酵素としては、セリンパルミトイル転移酵素、 3—ケトジヒドロスフインゴシン還元酵素、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフインゴミエリン合成酵素等があるが（図 1)、好ましくは、セリンパルミトイル転移酵素、ジヒドロスフインゴシン一 N —ァシル転移酵素、スフインゴミエリン合成酵素を挙げることができる。

[0032] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の初段階である、パルミトイル CoA力 3-ケトジヒドロスフインゴシンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するセリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはセリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる。

[0033] 本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよ、が、好ましくはスフインゴファギン、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を挙げることができる。

[0034] 式（I) :

[0035] 式中、 Aは、一（CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；

2 n

2 2

2 m

、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、置換されていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよいへテロアリール基、 OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；

2 p

結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして

及び R³は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を示す。

本発明においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、特に本明細書中で定義している場合を除き、炭素数 1〜12の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意味し、好ましくは炭素数 1〜7の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、 n ブチル基、イソブチル基、 t ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基などが挙げられる。またシクロアルキル基とは、炭素数 3〜8の環状炭化水素基を意味する。たとえば、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロへプチル基、シクロへキセ-ル基などが挙げられる。また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基は、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基であって、少なくとも 1の二重結合を含むものを意味する。例えば、ビュル基、 1 プロぺニル基、ァリル基、 2—ブテュル基、 2—エテュルー 2—ブテュル基などが挙げられる。直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基であって、少なくとも 1の三重結合を含むものを意味する。例えば、ェチュル基、 1 プロピ-ル基、 2 プロピ-ル基、 1 プチ-ル基、 3 ブチニル基、 2 ペンチ-ル基、 3 ペンチ-ル基、 4 ペンチ-ル基、 2 へキシュル基、 4 一へキシュル基、 2 デシ-ル基、 6, 6 ジメチルーヘプター 2, 4 ジインー1ーィル基などが挙げられる。

[0037] また、本明細書にお!、て記載される複素環式基とは、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子から独立して選択されるへテロ原子 1〜4個（好ましくは 1または 2個）を環員として含む 4〜6員の単環または 7〜10員の二環の環式基 (好ましくは単環基)であつて、少なくとも 1の二重結合を有していてもよい基を意味し、具体的にはピラン、モルホリン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、 1, 3 ジォキサン、ピぺラジン、ピぺリジン、チオモルホリンなど力誘導される基が挙げられる

[0038] 本明細書において記載されるァリール基は、芳香族性を有する単環または多環の炭化水素基を意味する。具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルォレンなど力誘導される基を挙げることができる。

[0039] 本明細書にぉ、て記載されるへテロァリール基は、芳香族性を有し、窒素原子、硫黄原子、および酸素原子から独立して選択されるへテロ原子 1〜4個 (好ましくは 1または 2個）を環員として含む 4〜6員の単環または 7〜10員の二環の環状基 (好ましくは単環基)を意味する。具体的には、フラン、チォフェン、ピロール、ジァゾール、ピリジン、チアゾール、イミダゾール、ピリミジン、インドール、キノリン、ォキサゾール、イソキサゾール、ピラジン、トリァゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピラゾールなど力誘導される基を挙げることができる。

[0040] 本明細書において記載されるァラルキル基は、上記のァリール基で置換されている上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体的にはべンジル基、フエネチル基などを挙げることができる。

[0041] 本明細書において記載されるへテロァリールアルキル基は、上記のへテロアリール基で置換されて!ヽる上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。

[0042] 本明細書にぉ、て記載されるァシル基は、カルボ-ル基を介して結合して、る、上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ァリール基、ヘテロァリール基、または複素環式基を意味する。

[0043] 本明細書において記載される「置換されていてもよい」は、特に本明細書中で定義されている場合を除き、このように付記されている基力直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ルォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ルォキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキルォキシ基、シァノ基、ニトロ基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基、ハロゲン原子、ァリール基、ァリールォキシ基、ヘテロァリール基、ヘテロァリールォキシ基、ァラルキル基、ァラルキルォキシ基、アミノ基 (直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、ァシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホニル基、力ルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボ-ル基、ホルミル基、アミノスルホ -ル基などの基で置換されて、てもよ、ことを意味する。これらの置換基に含まれるァリールおよびへテロアリール部分は、更にハロゲン原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ルォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ルォキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキルォキシ基、シァノ基、ニトロ基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基、ハロゲン原子、ァリール基、ァリールォキシ基、ヘテロァリール基、ァラルキル基、ァラルキルォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノもしくはジ置換されて、てもよ!/ヽアミノ基、ァシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、力ルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボ-ル基、ホルミル基、ァミノスルホ-ル基などによってモ入ジもしくはトリ置換されて、てもよ、。

[0044] 本発明の好まし、式 (I)の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。

[s濯]

61·

L9L l0/S00Zdr/13d .S99T0/900Z OAV

[9濯]

L9L lO/SOOZdr/13d .S99T0/900Z OAV

L9L lO/SOOZdr/13d .S99T0/900Z OAV

[8權]

zz

Z.9Z.M0/S00Zdf/X3d 9910/900 O/VV

L9L lO/SOOZdr/13d

i/:/ O-9/-i2Tl£ /-S90900ZAV

§0

、 ^_ノ

[0053]

本発明の式 (I)の化合物を合成する方法の一例を、以下の反応スキームにより説明する。

一般製法 1

工

12

10 11

工程 1-M

14-B

[0056] 上記式中、各記号は、上記式 (I)に記載したとおりであり、また、 P、 pz 、および P 〃は、ヒドロキシ保護基を示す。出発化合物である化合物 1は、文献記載の方法 (J. Org. Chem.1989, 45, 5522, B.E.Marron, et al)に従って合成することができる。

[0057] 工程 1—1

化合物 1を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で水素化ビス（2—メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化アルミニウムリチウムなどの還元剤で、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下で反応させた後、続いて冷却下、好ましくは 78°Cでヨウ素で処理することにより化合物 2を得ることができる。

[0058] 工程 1—2 化合物 2を、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、塩化メチレン、クロロホルム、 1, 2—ジクロ口エタン、酢酸ェチルなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、触媒量のピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸酢酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下でジヒドロピランと反応させることにより化合物 3を得ることができる

[0059] 工程 1—3

化合物 3を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、 tert ブチルリチウム、 n—ブチルリチウム、 sec ブチルリチウムなどの強塩基と室温あるいは冷却下、好ましくは 78°Cで反応させ、さらにホルムアルデヒドを力卩ぇ冷却下、好ましくは氷温下で反応させることによりィ匕合物 4を得ることができる。

[0060] 工程 1—4

化合物 4を、 N, N ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、イミダゾール、トリメチルァミン、ピリジンなどの塩基存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下で tert ブチルジフエニルクロロシランと反応させることによりィ匕合物 5を得ることができる。

[0061] 工程 1—5

化合物 5を、エタノール、メタノール、プロパノールなどの各種アルコール類溶媒中、触媒量のピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸酢酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは還流加熱下で反応させることによりィ匕合物 6を得ることができる。

[0062] 工程 1—6

化合物 6を、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、チタンテトライソプロポキシド、チタンテトラプチ口キシドなどのルイス酸及び L一 ( + )一酒石酸ジェチル， L （ + ) 酒石酸ジプロピルあるいは D （一）酒石酸ジェチル、 D （一）酒石酸ジプロピルの存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で tert ブチルヒドロペルォキシド、タメンヒドロペルォキシドなどの過酸化物と反応させることによりィ匕合物 7を得ることができる。

工程 1 7

以下に記載する一般製法— 2で合成された、所望の鎖 A (― (CH ) 一）および基 D

2 n

を有する、式：

で示される化合物の三重結合をノヽイドロメタレーシヨン（例えばハイドロジルコネーションゃハイドロボレーシヨン）した後、トランスメタレーシヨン (例えばグリニアール試薬やジアルキル亜鉛などを使用して）して得られるビュルメタル誘導体と化合物 7を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トルェン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で室温あるいは冷却下、好ましくは一 78°Cで反応させることにより化合物 8を得ることができる。

[0065] 工程 1—8

化合物 8を、ジェチルエーテル、トルエン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロロェタンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、触媒量のピリジ- ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルォ口酢酸、塩酸、硫酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で、 2, 2 ジメトキシプロパンまたはアセトンなどと反応させることによりィ匕合物 9を得ることができる。

[0066] 工程 1—9

化合物 9を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、フッ化テトラプチルアンモ -ゥム、フッ化水素酸、酢酸、希塩酸などの存在下、室温あるいは冷却下で反応させることによりィ匕合物 10を得ることができる。

[0067] 工程 1— 10

化合物 10を、過酸化マンガン、硝酸、ジヨーンズ酸化などの酸化反応により対応するジカルボン酸を得ることができる。或いは化合物 10を過マンガン酸カリ、スワン酸ィ匕、コリンズ酸化、 TEMPO酸ィ匕などの酸ィ匕反応により対応するジアルデヒドを得ることができる。好ましくは、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中、塩ィ匕ォキザリルとジメチルスルホキサイドの存在下、冷却下、好ましくは— 78°Cでィ匕合物 10を反応させた後、トリェチルァミンなどの塩基で処理することによりジアルデヒドを得ることができる。得られる生成物を、続いて過マンガン酸カリ、亜塩素酸ナトリウム、クロム酸などの酸化剤によりジカルボン酸とすることができる。好ましくは 2—メチル 2—プロパノール、 2—メチルー 2—ブテン中、室温或いは冷却下、好ましくは冷却下、亜塩素酸ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムの水溶液と反応させることによりジカルボン酸を得ることができる。得られる生成物を、続いて N, N ジメチルホルムアミド、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中又は無溶媒中で、 N, N ジメチルホルムアミドジ tert-ブチルァセタール中、或いは 2, 2, 2—トリクロロアセトイミダート tert-ブチルを室温或いは加熱下で反応させることによりィ匕合物 11を得ることができる。

[0068] 工程 1— 11

化合物 11を、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中、水共存下でピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより化合物 12を得ることができる。

[0069] 工程 1— 12

化合物 12を、過酸化マンガン、硝酸、ジヨーンズ酸化などの酸化反応により対応するジカルボン酸とすることができる。好ましくは化合物 12を、アセトン中、室温或いは冷却下、好ましくは冷却下でジヨーンズ試薬と反応させることによりィ匕合物 13を得ることがでさる。

[0070] 工程 1— 13

化合物 13と α アミノ酸 tert-ブチルエステル塩酸塩を、 N, N ジメチルホルムァミド、テトラヒドロフラン、ジェチルエーテル、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルアミン、ピリジン、 4-N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基存在下、 O— (7—ァザべンゾトリアゾール— 1—ィル） N, N, N' , N' —テトラメチルゥ口-ゥムへキサフルォロホスフェート、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC'HC1)、 1—ヒドロキシベンゾトリァゾル (HOBt)などのカツプリング試薬と作用させることにより、室温ある!/ヽは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより、式 (I)の化合物の一態様である化合物 14 Aを得ることができる。

[0071] 工程 1— 14

化合物 14 Aを、ェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、酢酸ェチル、水などの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、ァニノールの存在下或いは無存在下、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより、式 (I)の化合物の一態様である化合物 14 Bを得ることができる。

[0072] 本発明の式 (I)の化合物のうち、上記の化合物 14 Aおよび 14 B以外の化合物を得るには、化合物 14— Aまたは 14— Bから出発して、必要に応じて加水分解、還元、アミノ化もしくはアミド化、ヒドロキシイミノィ匕、および/またはエステル変換に付すことにより、目的とする式 (I)の化合物を得ることができる。また結合 Qが単結合である式（I)の化合物は、化合物 14 Aまたは 14 Bを、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、ノ《ラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによつても得ることができる。

[0073] 式 (I)の化合物を合成するために有用な中間体ィ匕合物である、式：

〔式中、 Dおよび nは、上記に記載のとおりであり、 Mおよび Mは同一または異なつ

1 2

て酸素原子または硫黄原子を表し、 Pおよび! ^ は、同一または異なってヒドロキシ保護基を表す〕で示される化合物は、式：

〔式中、 Pおよび! ^ は、上記に記載のとおりである〕で示される化合物を、式:

〔式中、 D、 n、 Mおよび Mは、上記に記載のとおりである〕で示される化合物と、反

1 2

応させ合成することが出来る。この方法は、上記一般製法 1の工程 1 7の方法である。

[0077] 上記の式 (I)の化合物を合成するための中間体化合物の 1つである化合物：

は、以下の反応スキームにより合成することができる。

[0079] 一般製法 2 工程 2-3 D

b

,

0 0 d

[0080] 工程 2— 1

末端に三重結合を有し、所望の鎖 A (- (CH ) -)を有する化合物 aと N, 0-ジメ

2 n

チルヒドロキシルァミン塩酸塩を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、酢酸ェチルなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、 4-N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基存在下、 O—（7 ァザべンゾトリァゾールー 1 —ィル） N, N, N' , N' —テトラメチルゥ口-ゥムへキサフルォロホスフェート、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC'HCl)、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ―ル（HOBt) などのカップリング試薬を室温下で作用させることにより、化合物 bを得ることができる

[0081] 工程 2— 2

上記工程で得られた化合物 bを、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、へキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、所望の基 Dを有するグリニャール試薬或いはアルキルリチウム試薬と反応させることにより、基 Dが導入されたィ匕合物 cを得ることができる。

[0082] 工程 2— 3

上記工程で得られた化合物 cとエチレングリコールを、ベンゼン、トルエン、 1, 2- ジクロロェタンなどの溶媒中で、ピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸などの酸の存在下、加熱下生成してくる水を共沸除去しながら反応させることにより、化合物 dを得ることができる。

[0083] ここで得られたィ匕合物 dは、上述した化合物 (I)の製造工程を示した一般製法— 1 の工程 1—7において使用することができる。なお Mおよび Zまたは Mが硫黄原子

1 2

である、化合物 dに相当する化合物も、当業者に公知の方法により得ることができる。

[0084] 上記式 (I)の化合物を合成するための原料化合物である式：

の化合物は、当業者に公知の方法、下記の一般製法 3〜一般製法 5の反応スキームにより製造することができる。

[0086] 一般製法 3

化合物番号 AA 化合物番号 BB 化合物番号 CC 化合物番号 DD [0087] 上記式中、 P' ' 'はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はアミノ酸の保護基を示し、 Mは直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基を示す。

[0088] 工程 3—1

化合物 AAをァセチル、トリフルォロアセチル、 t—ブトキシカルボ-ル、ベンジロキシカルボニル、 9 フルォレニルメチルカルボ-ル等のようなアミノ基の保護基によって保護することによりィ匕合物 BBを得ることができる。この時の反応条件は、保護基 P'，，，の種類により適宜選択される。

[0089] 工程 3— 2

ィ匕合物 BBを、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、シメチルスルホキサイドなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウムなどの塩基の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは室温で、ハロゲン或いはメタンスルホン酸エステル、トルエンスルホン酸エステル等の離脱基によって置換された Mと反応させることにより化合物 CCを得ることができる。或いは化合物 BBを光延反応条件下、水酸基で置換された Mと反応させることによりィ匕合物 CCを得ることができる。

[0090] 工程 3— 3

化合物 CCのァミノ基の保護基 P' ' ' 'を脱保護することによりィ匕合物 DDを得ることができる。この時の反応条件は、保護基 P'， "の種類により適宜選択される。

[0091] 一般製法 4

化合物番号 BB 化合物番号 EE 化合物番号 FF 化合物番号 GG

[0092] 上記式中、 P'，，はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はァミノ基の保護基を示し、 Tはスルホン酸エステルなどの離脱基を示し、 Uは置換されてもよいァリール、或いは置換されてもょ、ヘテロァリール基を示す。

[0093] 工程 4—1

ィ匕合物 BBを、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、 4— N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは冷却下で、メタンスルホン酸クロライド、トルエンスルホン酸クロライド、無水トリフルォロスルホン酸等と反応させることによりィ匕合物 EEを得ることができる。

[0094] 工程 4 2

ィ匕合物 EEを、ジェチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、水などの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、パラジウムジアセテート、テトラキストリフエ-ルホスフィンパラジウムなどのパラジゥム触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、ァリール或いはへテロアリールホウ酸誘導体、又はァリール或いはへテロアリールホウ酸エステル誘導体等と反応させることによりィ匕合物 FFを得ることができる。

[0095] 工程 4 3

化合物 FFのァミノ基の保護基 P' ' "を脱保護することによりィ匕合物 GGを得ることができる。この時の反応条件は、保護基 P' "の種類により適宜選択される。

[0096] 一般製法 5

化合物番号 BB 化合物番号 HH 化合物番号 I I

[0097] 上記式中、 P' ' 'はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はアミノ酸の保護基を示し、 Uは置換されてもよいァリール、或いは置換されてもよいへテロアリール基を示す

[0098] 工程 5—1

化合物 BBをジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジォキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶液中で、水素化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、又は、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリエチルァミン、ピリジン、 4— N, N—ジメチルァミノピリジンなどの塩基及びジァセトキシ第二銅、沃化第一銅等の触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、ァリール或いはへテロアリールホウ酸誘導体、ァリール或いはへテロアリールホウ酸エステル誘導体、又はハロゲン化ァリール或いはハロゲン化へテロァリール誘導体等と反応させることによりィ匕合物 HHを得ることができる。

[0099] 工程 5— 2

化合物 HHのァミノ基の保護基 P' ' ' 'を脱保護することによりィ匕合物 IIを得ることができる。この時の反応条件は、保護基 P' ' ' 'の種類により適宜選択される。

[0100] 上記の式 (I)の誘導体一覧に記載した化合物 (40) (式 (II)に示す化合物と同じものである）は、国際公開公報 W098Z56755号に開示されており、オーレォバシディウム（Aureobasidium)属の微生物に由来し、カンジダ 'アルビカンス、タリプトコッカス 'ネォホルマンス等の病原性真菌に対する抗菌活性、及び、免疫反応を阻害する効果を有することが知られている。上記化合物 (48)は、国際公開公報 W094Z18157号に開示されており、スクアレン合成阻害剤、抗真菌剤として有用であることが知られている。

[0101] この化合物（40)は、フザリウム（Fusarium)属、オーレォバシディウム（Aureobasidiu m)属等の糸状菌類で、上記化合物を産生する菌株を培養し、その後、上記菌株の培養物から単離することにより製造することができる。

[0102] 化合物 (40)の製造に用いることができる菌株としては、フザリウム (Fusarium)属、ォ一レオバシディウム (Aureobasidium)属等の糸状菌類に属し、上記化合物を産生することができるものであれば特に限定されず、例えば、フザリウム*エスピー（Fusarium sp.) F1476株（以下「F1476株」という）、オーレォバシディウム ·エスピー（Aureobasi dium sp.)TKR2449株（国際公開公報 W098Z56755号）等を挙げることができる

[0103] F1476株は、上記化合物 (40)を有利に産生する特性を有するものである。また、上記 F1476株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：

生育温度範囲は、 10〜30°Cであり、好ましくは、 20〜30°Cである。

生育可能 pH範囲は、 3〜11であり、好ましくは、 5〜7である。 [0104] F1476株は、 Fusarium sp. F 1476と表示し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、 2003年 2月 4日付で、受託番号 FERM BP— 8290として寄託されている。

[0105] 本発明においては、上記 F1476株の他に、 F1476株の自然又は人工的な突然変異体、あるいはフザリウム属、オーレォバシディウム属等の糸状菌類に属するその他の菌種等であって、 F1476株の産生能を有する微生物を使用することができる。

[0106] 本発明においては、上記化合物 (40)の化合物は、上記 F1476株を、栄養源含有培地に接種し、これを培養することによって培養物を得ることができる。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。

[0107] 上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカ一、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモ-ゥム塩等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。

[0108] 上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩類等を挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよぐ適宜組み合わせて使用されてもよい。

[0109] 上記栄養源は、単独か又は適宜組み合わせて使用することができる。

[0110] 上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コノレト塩等の重金属塩;ピオチン、ビタミン B1等のビタミン類;その他、菌の生育を助け、上記化合物 (4 0)の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。

[0111] 上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、界面活性剤等を添加することができる。

[0112] 上記化合物 (40)を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養法、液体培養法等の培養方法を採用することができる。

[0113] 上述の培養方法によって、上記化合物 (40)は、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積された上記化合物 (40)を、公知の方法により、培養物中力分離した後、必要に応じて更に精製することができる。

[0114] 上記分離は、培養物全体を、酢酸ェチル、酢酸ブチル、クロ口ホルム、ブタノール、メチルイソプチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる

。また、培養物を濾過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。

[0115] 上記分離した培養液から上記化合物 (40)を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の上記化合物 (40)を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することちでさる。

[0116] 上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性榭脂等を挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質等によって適宜 1種又は 2種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組み合わせたもの等を挙げることができる。

[0117] 上記分離した菌体から上記化合物 (40)を分離するには、アセトン等の親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。

[0118] 本発明においては、このようにして培養物中力も分離された上記化合物 (40)の粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。

[0119] 上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性榭脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法等を挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノール、アセトン、水等を挙げることができ、これらは 2種以上を併用することができる。

[0120] 上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オタタデシル基、ォクチル基、フエ-ル基等が結合したィ匕学結合型シリカゲル;ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができるさらに、上記化合物 (40)を出発物質として下記に記載の製法 1から 11のいずれかの方法を用いて化合物 (41)〜（54)で表される誘導体を得ることができる。

製法 1 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイドロフラン等の溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合物 (46)を得ることができる。

製法 2 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、プロパノール、テトラハイドロフラン等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、水素化シァノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジェチルアルミニウムナトリウム、リチウムアルミニウムハイドライド等の還元剤の存在下、室温または冷却条件下で還元することによりアルコール体である化合物 (47)等を得ることができる。

製法 3 :上記化合物 (40)を、メタノール、ジォキサン、テトラハイド口フラン、水等の溶媒中、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸等の存在下、室温または冷却件下で処理することにより脱アルキルィ匕体である化合物 (48)等を得ることができる。さらに上記化合物（48)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイド口フラン等の溶媒中、ノ《ラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル、酸化白金等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合物 (49)等を得ることができる。

製法 4 :上記化合物 (48)等を水酸ィ匕ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム等の塩基の存在化、ジメチルホルムアミド (DMF)、テトラハイド口フラン等の溶媒中、室温または加熱条件下で、アルキルノヽライド、ァリルノヽライド、アルキ-ルハライド等のアルキル化剤で処理することによりテトラアルキル、テトラアルキ-ル及びテトラァルケ-ルイ匕体を合成することができる。また本化合物を水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム等の塩基の存在化、メタノール、ジォキサン、テトラハイド口フラン、水等の溶媒中、室温または加熱条件下で処理することによりアルキル、アルキ-ル及びアルケ-ル化体である化合物を合成することができる。

製法 5：上記化合物 (40)と各種アミンをジメチルホルムアミド (DMF)、テトラノ、イド口フラン等の溶媒中で、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン等の塩基の存在下でジシクロへキシルカルボジイミド (DCC)、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC . H Cl)、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル (HOBt)等の縮合剤で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するトリアミド体である化合物（50)等を得ることができる製法 6 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイドロフラン等の溶媒中、ノラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル、酸化白金等の触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりテトラヒドロ体である化合物（51)等を得ることができる。

製法 7 :上記化合物（40)を、テトラハイド口フラン、 DMF及びジクロロメタンなどの溶媒中、ジシクロへキシルカルポジィミド (DCC)等の縮合剤により各種のアルコール（ R—OH)と反応させることによって、室温または加熱条件下で、対応するトリエステル (R^R^R R)を得ることができる。あるいは、上記化合物 (40)を、メタノール及びジクロロメタンなどの混合溶媒中、アミドジヒドロ体トリメチルシリルジァゾメタン (TM SCHN )等で処理し、トリメチルエステル体 (R^R^R^CH )を得ることができる。

2 3

製法 8：製法 7で得たトリメチルエステル体をメタノール、エタノール及びブタノール等の溶媒中で 4 トルエンスルフォ-ルヒドラジド等のヒドラジン誘導体で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するヒドラジド体を得、本ヒドラジド体を力テコールボラン等の還元剤で処理した後、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化力リウム等の塩基の存在化、エタノール、メタノール及び水等の溶媒中、室温または加熱条件下で、脱ケト体である化合物（52)等を得ることができる。

製法 9：上記化合物 (40)とヒドロキシルァミンまたは各種 O 置換ヒドロキシルァミンをピリジン、トリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン等の存在下で、室温または加熱条件下で処理することにより対応するォキシムエーテル及びォキシム体である化合物（53) , (54)等を得ることができる。

製法 10 :上記化合物（40)を、テトラノ、イド口フラン、ジクロロメタン、クロロフオルム等の溶媒中、ジェチルアミノサルファートリフルオライド（DAST)等で処理し、ハロゲン化体を得ることができる。製法 11：上記化合物 (40)と各種アミンをエタノール、メタノール及び、テトラハイド口フラン等の溶媒中で、中性あるいは弱酸性条件下で、室温または加熱条件下で、水素化シァノホウ素ナトリウムあるいは水素化トリァセトキシホウ素ナトリウム等還元剤で処理することによりにより、還元的アミノ化を行い対応するァミン体 (B=—N (R⁴) (R⁵) )を得ることができる。

[0122] 本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物としては、セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができる。本発明において、発現を抑制されるセリンパルミトイル転移酵素の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAとしては配列番号: 4または 6 (LCB1または LCB2)に記載の塩基配列力なる D NA、配列番号： 5または 7に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする DNA 、および配列番号： 5または 7に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする天然由来の DNA等も含まれる。「1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付カロ、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列力もなるタンパク質」は、天然型のタンパク質と同等の機能を有し、かつ高い相同性を持つものである。高い相同性とは、ァミノ酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90 %以上（例えば、 95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。

[0123] 上記天然由来の DNAは、配列番号: 4または 6に記載の塩基配列力なる DNAにハイブリダィズする DNAである。ハイブリダィゼーシヨンにおける条件は当業者であれば適宜選択することができる力ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、例えば 42°C 、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば 65°C、 0.1 X SSC及び 0 .1%SDSの条件である。

[0124] セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNAとしては、より好ましくは配列番号： 1および 2で表す siRNAを挙げることができる。

[0125] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の途中段階である、スフインガニン (ジヒロドスフインゴシン)カゝらジヒドロセラミドの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる

[0126] 本発明の、ジヒドロスフインゴシン一 N ァシル転移酵素の酵素活性を阻害するィ匕合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましくはフモ-シン B1またはその誘導体を挙げることができる。

[0127] 本発明の、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素の発現を抑制する化合物としては、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができる。

[0128] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の途中段階である、セラミドからスフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するスフインゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる。

[0129] 本発明の、スフインゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよい。

[0130] 本発明の、スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物としては、スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができる。スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAとしては配列番号： 8に記載の塩基配列力なる DNA、配列番号： 9に記載のアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする DNA、および配列番号： 9に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列力なるタンパク質をコードする天然由来の DNA等も含まれる。

[0131] 本発明の「酵素の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。

[0132] 本発明の「酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の一つの態様は、酵素をコードする DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAである。

[0133] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリッド形成による核力細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。

[0134] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DN Aも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DN Aは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ま U、が、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2.5kbよりも短!、。

[0135] 「酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の他の一つの態様は、酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な dsRNAである。 RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNA (以下 dsRNA)を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約 40〜数百塩基対の dsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー (Dicer)と呼ばれる RNaselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、 dsRNAを 3'末端から約 21〜23塩基対ずつ切り出し、 siRNA (short interference RNA)を生じる。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC : RNA-induced s ilencing complex)が形成される。この複合体は siRNAと同じ配列を認識して結合し、 R Naselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で標的遺伝子の mRNAを切断する。また、この経路とは別に siRNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ (RsRP)のプライマーとして作用し、 dsRNAが合成される。この dsRNAが再びダイサ一の基質となって、新たな siRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられてヽる。

[0136] 本発明の RNAは、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンス RNA をコードしたアンチセンスコード DNAと、標的遺伝子 mRNAの!、ずれかの領域のセンス RNAをコードしたセンスコード DNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンス RNAおよびセンス RNAより dsRNAを作成することもできる。

[0137] 本発明の dsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクタ一からそれぞれアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNA を発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコード DNAとセンスコード DNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となつた一つの二本鎖 DNA(siRNAコード DNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンス RNA、センス RNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センス RNA、アンチセンス RNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス RNAコード鎖、センス RNAコード鎖）の 3'末端にターミネータ一をそれぞれ備えることが好ましい。このターミネータ一は、 A ( アデニン)塩基を 4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好ましい。

[0138] また、異なるベクター力もアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させること〖こより構成することができる。

[0139] 本発明の RNAiにおいては、 dsRNAとして siRNAが使用されたものであってもよい。「 siRNAjは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖力なる二重鎖 RNAを意味し、例えば、 15〜49塩基対と、好適には 15〜35塩基対と、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現される siRNAが転写され最終的な二重鎖 RNA部分の長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 15〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。

[0140] RNAiに用いる DNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70 %以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の相同性を有する。

[0141] dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ (対応する塩基が相補的でない）、バルジ (一方の鎖に対応する塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、 dsR NAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。

[0142] 本発明の「酵素の発現の抑制」は、また、リボザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設計が可能となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。

[0143] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている。リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA配列と相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の U C、 UUまたは UAとヽぅ配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。

[0144] また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザィムは、例えばタバコリングスポットゥイノレスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される (J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されて、る。

[0145] 標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザィムを含む RNA力リボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能である (K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianotta nd J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.C ech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19 :5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる (N.Yuyama et al. Biochem.Biophy s.Res.Commun. l86:1271,1992)₀このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。

[0146] 本明細書における「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによつて、 HCVを消滅あるいは軽減させること、さらなる HCVの広がりを抑制すること、 H CVの感染による症状を軽減することを意味する。 HCVの感染による症状としては、好ましくは C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。

[0147] 本発明の化合物は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩;酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。

[0148] 上記医薬製剤に含まれる有効成分ィ匕合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択される力例えば、 0. 1-99. 5重量％、好ましくは 0. 5〜90重量％である。

[0149] 本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩ィ匕ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビュルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤;第 4級アンモ-ゥム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤;グリセリン、澱粉などの保湿剤;澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。

[0150] さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であるのが好ましぐこれら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすベて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有することちでさる。

[0151] 上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましぐ経口投与、組織内投与 (皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など)、局所投与 (経皮投与など)又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。

[0152] 本発明の化合物など又はそれの製薬上許容され得る塩を医薬として投与する場合、抗ウィルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、 0.1〜2000mgの範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もある力逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。

[0153] 上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行うことができる。

[0154] 上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。

[0155] 上記局所投与 (経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。

[0156] 上記経直腸的投与は、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、これらの混合物など力もなる低融点固体に混入した座剤などを用いて行うことができる。

[0157] 上記投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。

[0158] 本発明は、式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤に関する。また、式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンノルミトイル転移酵素阻害剤に関する。

[0159] 該阻害剤は HCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだけではなぐスフインゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質 (スフインゴミエリン)が異常蓄積する疾患であるスフインゴリビドーシス、スフインゴリピドバインディングモチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルッノヽイマ一病、脊髄運動ニューロン内のセラミドが増加 L#経細胞死を引き起こす筋萎縮性側索硬化症 (Cutl er, R. G.， et al.， Ann. Neurol, 52, 448-457, 2002)、 gpl20タンパク質が関与する HI V感染症、および PrPタンパク質が関与するプリオン病、ラフトに結合して宿主細胞に感染するウィルス感染症 (例えばインフルエンザ、 HIV)等の有用な予防または治療する薬剤として利用できる。

[0160] 本発明は、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に関する。

[0161] 本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。

[0162] 本発明のスクリーニング方法における「パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成に関与する酵素 (以下「該生合成酵素」として約して使用される場合もある)」としては、セリンパルミトイル転移酵素、 3—ケトジヒドロスフインゴシン還元酵素、ジヒドロスフインゴシン一 N—ァシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフインゴミエリン合成酵素等を挙げることができる。これら酵素の由来は、特に制限はなぐ例えばこれらの酵素は酵母またはヒトを含む哺乳動物等の由来のものであってもよい。

[0163] 第一の態様に用いられる生合成酵素の状態としては、特に制限はなぐ例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。該生合成酵素が発現している細胞としては、内在性の生合成酵素を発現している細胞、または外来性の生合成酵素を発現している細胞が挙げられる。上記内在性の生合成酵素を発現して!/、る細胞としては、培養細胞などを挙げることができる力これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなぐ例えば、市販のものを用いることが可能である。また、上記外来性の生合成酵素を発現している細胞は、例えば、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸力ルシゥム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフエタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。このような外来性の生合成酵素が導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されて、る生物種であればょ、。

[0164] 生合成酵素が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなぐ市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。

[0165] 本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然ィ匕合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。

[0166] 本発明において「接触」は、生合成酵素の状態に応じて行う。例えば、生合成酵素が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒトを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、生合成酵素が発現している細胞へ導入する、または該ベクターを生合成酵素が発現して！/ヽる細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ノ、イブリツド法を利用することも可能である。

[0167] 第一の態様では、次いで、上記生合成酵素と被検化合物の結合を検出する。タンノ^質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、 BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもょ、。

[0168] 本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる

。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

[0169] 第二の態様では、次、で、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する。合成される化合物としては、 3—ケトジヒドロスフィンゴシン、ジヒドロスフインゴシン、ジヒドロセラミド、セラミド等の中間生成物等も含まれる力より好ましくは最終生成物であるスフインゴミエリンを挙げることができる。合成された化合物の定量は、 GC- MS法、 MS-MS法、 LC- MS法等公知の方法によって測定することができる。また、合成されたィ匕合物力 Sスフインゴミエリンの様にリン脂質である場合には、リン酸脂質中のリン酸の定量を行うことによつても定量を行うことができる。本方法においては、ついで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、合成された化合物の量を減少させた場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0170] 本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

[0171] 第三の態様では、次いで、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する。該生合成酵素の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該生合成酵素の mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、または R T-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、 DNAアレイ技術を用いて、該生合成酵素の発現レベルを測定することも可能である。

[0172] また、該生合成酵素を含む画分を定法に従って回収し、該生合成酵素の発現を SD S-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、該生合成酵素に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッテイング法を実施し、該生合成酵素の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。

[0173] 該生合成酵素の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該生合成酵素、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、該生合成酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の中から、該生合成酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロティン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカツプリングしたァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能である

[0174] 第三の態様においては、ついで、該生合成酵素の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0175] 本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず該生合成酵素のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する

[0176] 第四の態様において、「機能的に結合した」とは、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、生合成酵素のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合して、ることを、う。従つて、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合すること〖こよって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。

[0177] 上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 /3 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)および GFP遺伝子等を挙げることができる。第四の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

[0178] レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポ一ター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、 j8 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による Glucuron (ICN社）の発光や 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- 13 -ダルク口-ド (X- Glue) の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 G FPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。

[0179] 第四の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベル力被検化合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0180] 本発明のスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。

[0181] 第五の態様では、次、で、上記生合成酵素の活性を測定する。生合成酵素の活性測定は、それぞれの酵素につき公知の方法で行うことができる。一般的には、基質と生成物との間の分光学的性質の差を利用して、その時間的変化を測定する活性測定法が使用されるが、酵素上の情報基 (例えばトリブトファンゃチロシンのようなァミノ酸残基、および補酵素等)力もの情報をストップフロー法や種々の緩和法を用いて、酵素反応をより直接的に測定する方法が選択されてもよい。活性測定法に用いられる分光学的方法としては、吸光、蛍光、 CD、 NMR、 ESR、 IR、ラマン等を挙げることができる。第五の態様においては、ついで、上記生合成酵素の活性が、被検化合物を接触させないときに比べ低下する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤として選択する。

[0182] 本発明は、上記に記載の 5つのスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。

このようなキットには、上記に記載の 5つのスクリーニング方法の検出工程や測定ェ程に使用されるものを含みうる。例えば、パルミトイル CoA力スフインゴミエリンの生合成に関与する酵素の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0183] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[0184] 〔実施例 1〕ノザンブロット解析によるミリオシンまたはオーレォバシディウム (Aureobasi dium)属などの微生物に由来する式 (II)で表される化合物の HCV RNA複製阻害活性の測定

ミリオシン又は以下の式（II)で表される化合物を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5%CO存在下、 37度にて培養した。

2

[0185] 式（Π) :

[0186] 72時間後に細胞を回収し、全 RNAを抽出した後で、 Ambion社のノザンマックスキットの方法に従いネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。

[0187] ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、 NorthernMax transfer buffer (Ambion

#8672),転写膜 BrightStar- Plus (Ambion #10100),ろ紙（Sigma P-6664) , ULTRAhy b (Ambion #8670)。プローブの標識は BiotinStar Psoralen- Biotin kit (Ambion #9860 G3)でビォチン化標識した。 High Stringency buffer (Amibion #8674); BrightStar BioD etect kit (Wash buffer, Ambion #8650G; Blocking buffer, Ambion #8651G; Streptavi din-Alkaline Phosphatase, Ambion #2374G; Assay buffer, Ambion #8652G;CDP— Sta r, Ambion #8653G) [0188] 1%ァガロースゲルで lugのトータル RNAを泳動し、泳動後ェチジゥムブ口ミドで RNA を染色して写真をとり、脱色後 NorthernMax transfer bufferを用いて転写膜に 2時間転写した。湿ったままの状態で UVクロスリンカ一にて RNAを転写膜に固定ィ匕した。ハイブリローターを用いて、 ULTRAhybにて 42度、 30分間の回転前処理の後、前処理液を捨て、ピオチン化したネオマイシン耐性遺伝子と 10mlの ULTRAhyb液を加えて 42 度一夜振とう処理した。

[0189] ULTRAhyb液を捨て、 42度に保温した High Stringency bufferを 15ml加え 42度で 30 分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。浸る程度の Wash bufferで転写膜を洗浄した。転写膜を Blocking bufferで 30分間振とうした。液を捨て、 10mlの Blocking bufferに 2ulの Streptavidin- Alkaline Phosphataseをカ卩えたもので室温 30分間振とうした。転写膜を浸る程度の Blocking bufferで 10分間振とうした。 Wash bufferで 5分間洗浄し、 Wash bufferで転写膜を洗浄した後、 CDP-Starで転写膜を覆い、 5分後に余分な液を除き、 1時間後に X線フィルムに感光させ、バンドの濃さから RNA量を比較した。その結果、ミリオシン及び式 (II)で表される化合物に 1-lOnMの濃度でレプリコン RN Aを 50%減少させる効果が認められた（図 2、 3)。

[0190] 〔実施例 2〕ウェスタンプロット解析によるミリオシンまたは式 (II)で表される化合物の H CVタンパク合成阻害の測定

ウェスタン解析は以下の方法でおこなった。ミリオシン又は式 (II)で表される化合物を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5%CO存在下、 37度に

2

て培養した。 72時間後に培地を捨て、 PBS(Phosphate buffered saline)を加え、ピぺッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。 Phosphate用溶解液 (50 m M Tris— HCl(pH7.5),0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12mM glycerophospha te, 50 mM NaF, 1 mM Na VO , 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin)をカロえてピぺッテ

3 4

イングにより細胞を破壊し、高速遠心により上清を回収した。 Dye Reagent (Nacalai te sque #074-27)にてタンパク定量をおこなった（ゥシ γグロブリン標準液、 BIO- RAD#5 00-0005)。得られたタンパク質 5ugを 9 11%グラジェントゲル（第一化学薬品、 # 317 552)でトリス-グリシン- SDS緩衝液（BIO-RAD # 161-0772)で電気泳動した。分子量サイズマ¹ ~~力' ~~は Rainbow molecular weight markers、 mershamBioscience#RPN75。 )を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO-RAD#l 70-3930) にてメンブレン（PROTRAN BA85, Nitrocellulose transfer membrane(Shleicher&Schue 11 #10401196)に転写した。 HCVタンパク由来の抗 NS3ゥサギ抗体を用いてウェスタン解析を行った。内部標準として抗ァクチンゥサギ抗体を用いた。その結果、ミリォシン及び式 (II)で表される化合物に 1-lOnMの濃度で HCVタンパク質の発現を 50%減少させる効果が認められた（図 4, 5)。

[0191] 〔実施例 3〕フモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性の測定

スフインゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフインゴシン力ジヒドロセラミドを生成するジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害するフモ二シン B1の HCVレプリコン阻害活性を測定した。

[0192] ホタル.ルシフェラーゼ HCVレプリコン細胞 (Huh- 3-1)を 5%ゥシ胎児血清（Hyclone c at. no. SH30071.03)を含むダルベッコ MEM (G¾co cat. no. 10569)に懸濁し 96穴プレートに 5000細胞 ZWellで蒔き、 5%CO、 37度で一夜培養した。約 20時間後、フモ-

2

シン B1を順次 3倍希釈し、終濃度 1.37uMから lOOOuMになるようにカ卩え、さらに 3日間培養した。アツセィプレートは 2系統用意し、 1つは白色プレート、他はクリアプレートでアツセィを行った。培養終了後、白色プレートは Steady- Glo Luciferase Assay Syst em (Promega cat. no. E2520)に用いた。すなわち、 Wellあたり 100 μ 1の試薬を入れ、 3 〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WALLAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算出した。一方、細胞毒性試験はセル'カウントキット 8 (DOJIN Laboratories, cat. No.341- 07761)を W ellあたり 10 μ 1入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、約 30分間放置後に OD450nm力 1.0程度になった時点で測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算出した。

[0193] その結果、フモ-シン B1は 10-lOOOuMの濃度で、 HCVレプリコン阻害活性を示すことがわかった（図 6)。

[0194] 〔実施例 4〕セリンパルミトイル転移酵素の siRNA合成

SPTの阻害が HCVレプリコン活性を阻害しているかを確認する目的で、 LCB1 (SPT のへテロダイマーのうち 1サブユニット）を標的とした siRNAを合成した。 2種の特異的な siRNA (si246、 si633)は、 LCBlcDNAの配列（GenBank Accession No. Y08685)をもとにデザインし、 Qiagen社により合成された。コントロール siRNA (配列番号： 3)は、 LC B1の発現に影響しない配列を使用した。合成した siRNA配列を配列番号： 1 (si246) および配列番号： 2に示した。

[0195] 〔実施例 5〕ウェスタンブロット解析を用いた siRNAによる LCB1のタンパク質発現阻害

6穴プレートに 1.2 X 10⁵個の Huh-3-l細胞をまき、 37°C、 5%でー晚培養した。 2.3 μ Lの 20 μ M siRNAを 100 μ Lの ECR buffer(RNAiFect Kit中に含まれる Buffer)に加え、激しく攪拌し、さらに 4 /z Lの RNAiFectトランスフエクシヨン試薬（Qiagen cat. No. 3 01605)を加え、緩やかに攪拌して室温にて 10分間放置した。 siRNAは、最終濃度が 35 nMになるようにカロえ、 4日間培養した。

[0196] 細胞を細胞溶解用緩衝液（50 mM Tris- HC1 (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 1 50 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na^O^, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin)に懸濁し、氷上で 10分間放置した。 15,000 X gで 10分間遠心し、上清を回収した。タンパク質の定量後、各サンプルの蛋白量を 10 gに調製し、 1/4 量の 5 X SDSサンプル緩衝液（125 mM Tris- HC1 (pH 6.5), 25 % Glycerol, 5% SDS, 0. 25 % BPB, 5% 2-Mercaptoethanol)〖こカロえ、 98°C5分処理する。ポリアクリルアミドゲル PAGミニ 9/11 (第一化学、 cat. No. 317552)で電気泳動後、ゲルを-トロセルロースメンブレン PROTRAN BA85 (Schleicher&Schuell cat. No. 10404496)にブロッテイング（ 70V、 3時間）する。メンブレンを Blocking Buffer(10% skim milk, 0.1% Tween 20/PBS) で Blockingを行う。 1000倍希釈した抗 LCB1抗体（Transduction cat. No. L89820)及び 250倍希釈した抗ァクチン (20-33)抗体（Sigma cat. No. A5060)で 2時間室温にて反応させる。メンブレンを 0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、二次抗体として、 1000倍希釈した抗マウス IgG- HRP (Cell Signaling cat. No. A7076)及び抗ゥサギ IgG- HRP (Cel 1 Signaling cat. No. A7074)を 1時間室温にてそれぞれ反応させる。メンブレンを 0.1%T ween 20/PBSにて洗浄後、 ECLで 1分間反応させ、オートラジオグラフィ一にてシグナルを検出した。

[0197] その結果、図 7に示すように、コントロール siRNAと比較して、 si246、 si633はともに L CB1のタンパク質発現量の減少が認められた。特に、 si246では強く発現阻害が認められた。

[0198] 〔実施例 6〕 LCB1のノックダウンによる HCVレブリコン阻害活性効果

実施例 5の結果にもとづいて、 Huh-3-l細胞が LCB1発現を低下する条件下での細胞毒性及び HCVレブリコン活性の影響を以下の方法にて測定した。すなわち、 96穴プレートに 1ゥエルあたり 3500個の細胞をまき、 37°C、 5%でー晚培養した。 1.75 L の 2 M 3«^ を23.3 μ Lの ECR緩衝液 (RNAiFect Kit中に含まれる緩衝液）に加え、激しく攪拌し、さらに 0.31 μ Lの RNAiFectトランスフエクシヨン試薬をカ卩え、緩やかに攪拌して室温にて 10分間放置した。 siRNAは、最終濃度が 35 nMになるように加え、 4日間培養した。細胞毒性による影響は、培地に 10 μ Lの Cell counting kit-8 (DOJI N Laboratories cat. No. 341-07761)をカ卩えて 3— 4回ピペットで混和し、 37°C、 1時間放置後、マイクロプレートリーダー Emax (Molecular devices)を用いて 450 nmの吸光度で測定した。 HCVレブリコン活性は、培養終了後、新しい培地に交換し、 Steady -Glo Luciferase Assay System (Promega cat. no. E2520)を用い、 Wellあたり 100 μ 1の試薬を入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WAL LAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添カロの値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算出した。

[0199] その結果、図 8に示すように、 LCB1の発現を抑制した si246、 si633処理した細胞では、コントロール siRNA処理した細胞に対し、有意に HCVレプリコン活性を阻害した。この阻害効果は、 LCB1の発現を強く抑制した si246で強く認められた。また、同条件下にお、て siRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められなかつた o

[0200] 〔実施例 7〕 HCVレブリコンアツセィおよび細胞毒性試験

式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体につ!、て、 HCVレプリコンアツセィぉよび細胞毒性試験を行った。

[0201] まず、 HCV—RNAのコピー数を定量するために HCV—RNAの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。 Kriegerら（J. Virol.75:4614)の方法に従い、 HCV遺伝子の IRES (Internal Ribosome Entry Site)の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。ィンビトロで当該 RNAを合成後、エレクト口ポレーシヨン法で Huh7細胞に導入し、 G418 而性クローンとして単離した。ホタル 'ルシフェラーゼ HCVレプリコン細胞（Huh-3-l) を 5%ゥシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03)を含むダルベッコ MEM (Gibco c at. no. 10569-010)に懸濁し、 96穴プレートに 5000細胞 Zゥエルで播種し、 5%CO

2

37°Cで一夜培養した。約 20時間後、希釈した試験化合物をゥエルあたり 10 1加え、さらに 3日間培養した。アツセィプレートを 2系統用意し、 1つは白色プレート、他はタリァープレートでアツセィを行った。培養終了後、白色プレートは Steady- Glo Luciferas e Assay System (Promega cat. no. E2520)に用いた。すなわち、ゥエルあたり 100 μ 1の試薬を入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WAL LAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添カロの値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、試験化合物未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC (50%阻害濃度

50

)を算出した。

[0202] また、細胞毒性の測定には Cell counting kit- 8 (同人堂カタログ No. CK04)を用いた。すなわち、 10 1の Cell counting kit- 8をクリア一プレートに添カ卩し、 37度で 30〜60 分間保温した。 96穴プレートリーダーにて波長 450應、対照波長 630nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の CC (50%細胞阻害濃度)を算出した。

50

[0203] 上記の HCVレプリコンアツセィおよび細胞毒性試験の結果を表 1および 2に示す。

[0204] [表 1] レブリコンアツセィ細胞毒性化合物番号 I C50 [ M] CC50 Ifl M]

(1 ) 0. 002 >5

(2) 0. 01 0 >5

(3) < 0. 001 >5

(4) 0. 001 >5

(5) 0. 002 >5

(6) 0. 007 >5

(7) 0. 004 > 1

(8) 0. 01 4 > 1

(9) 0. 01 7 > 1

( 1 0) 0. 01 1 > 1

( 1 1 ) 0. 009 > 1

( 1 2) 0. 01 7 > 1

(1 3) 0. 01 0 > 1

( 1 4) 0. 009 > 1

( 1 5) 0. 006 > 1

( 1 6) 0. 008 > 1

(1 7) 0. 01 2 > 1

( 1 8) 0. 068 > 1

( 1 9) 0. 01 2 > 1

(20) 0. 055 > 1

(21 ) 0. 080 > 1

(22) 0. 500 > 1

(23) 0. 21 0 > 1

(24) 0. 024 > 1

(25) 0. 020 > 1

(26) 0. 001 > 1

(27) 0. 002 > 1

レブリコンアツセィ細胞毒性

化合物番号 CC50 [jU M]

(28) 0. 001 > 1

(29) 0. 003 > 1

(30) 0. 001 > 1

(31 ) 0. 005 > 1

(32) 0. 800 >5

(33) 0. 250 > 1

(34) 0. 003 > 1

(35) 0. 004 > 1

o

(36) 0. 004 > 1

(37) 0. 01 7 > 1

(38) 0. 024 > 1

(39) 0. 002 > 1

(40) 0. 002 >5

(41 ) 0. 1 28 > 1

(42) 0. 076 > 1

(43) 0. 1 03 > 1

(44) 0. 082 > 1

(45) 0. 007 > 1

(46) 0. 002 >5

(47) 0. 005 >5

(48) 0. 020 >5

(49) 0. 245 >50

(50) 0. 262 >5

(51 ) 0. 072 >5

(52) 0. 1 > 50

(53) 0. 020 22

(54) 0. 020 > 50

[0206] 〔実施例 8〕式 (II)で表される化合物による HCVレブリコンの阻害及び宿主細胞への毒性

HCVレプリコン細胞に、図 9に示された濃度の式 (II)で表される化合物で処理を行レ、、レブリコン複製阻害活性及び細胞生存阻害活性を測定した。レブリコンによるル、ノフエフ' ι^ί¾" '性 ίま Steady— GLO luciferase assay system (Promega, cat. no. E2510) 、糸田胞生存阻害活 '性は、 Cell counting counting kit一 8 (Dojin Laboratories, cat. no.3 41-07761)を用いて測定したその結果図 9に示すように、式 (II)で表される化合物による処理により濃度依存的に HCVレブリコン阻害活性を認めた (IC50 = 2 nM)。また、式 (II)で表される化合物の細胞毒性は、認められな力つた（IC50 > 50nM)。

[0207] 〔実施例 9〕免疫染色法による式 (Π)で表される化合物の HCV-NS3タンパク質発現阻害の確認

HCVレプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で 96時間処理した後、細胞を 3.7%ホルムアルデヒドで固定した。 3% BSAでブロッキング後、 NS3抗体（Fホフマン ·ラロシュより供与）でインキュベートした後、洗浄した細胞を Texas- Redラベルしたゥサギ IgG (Molecular probe )でインキュベートし、蛍光顕微鏡で解析した (図 10)。その結果、図 10に示すように、 HCV-NS3タンパク質は核周辺に存在した力式 (II) で表される化合物の添カ卩によりそれが消失した (白色で示された部分は NS3タンパク質、灰色で示された部分はへキスト 33342 (Sigma, cat. no. B2261)で染色された核を示す。）。

[0208] 〔実施例 10〕ウェスタンブロット解析による式 (II)で表される化合物の NS3、 NS5A及び NS5Bタンパク質の発現阻害

レプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で図 11に示された時間（48時間および 96時間）処理した。ウェスタンプロット解析は、実施例 5と同様の方法にておこなった。その結果、時間依存的に HCVの非構造タンパク質 NS3、 NS5A及び NS5Bを各抗体で検出した結果、ウィルスタンパク質の発現レベルの低下が認められた（図 1

D o

[0209] 〔実施例 11〕式 (II)で表される化合物による SPT阻害活性

in vitr。における SPT阻害活性を測定するために、ヒト組み換え型 SPT (ヘテロダイマ一 LCB1及び LCB2)タンパク質を調製した。ヒト肝臓の cDNAライブラリー（Clontech, c at. no. 639307)から、 LCBl及び LCB2の cDNAを RT- PCRによって取得し、 Hisタグ付きの pBudCE4.1ベクター (Invitogen, cat. no. V532- 20)に組み込んだ。 HEK293細胞（ ATCC, cat. no. CRL- 1573)に遺伝子導入し、 72時間後、細胞を溶解し、 N卜 NTAァガロース（Qiagen, cat. no. 1018244)にてタンパク質を精製した。 SPT活性は反応緩衝液 [200 mM HEPES buffer (pH 8.0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.05 mM pyridoxal 5 -phosphate, 0.2 mM palmitoyト CoA, 0.1 mM L- serine, and 1 mCi [3 H] serine (Amer sham, cat. no. TRK308)]に精製した SPTを加え、 15分 37°Cにて反応した。クロ口ホルム:メタノール（1 : 2, v/v)で抽出後有機層を水で 2回再抽出した後、有機層の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一にて測定した。その結果、図 12に示すように、式 (II)で表される化合物は IC50約 10nMで SPT阻害活性を有していることが明らかとなった。

[0210] 〔実施例 12〕式 (II)で表される化合物によるセラミド、スフインゴミエリンの de novo合成阻害

HCVレプリコン細胞を、図 13に示された濃度の式 (II)で表される化合物で 48時間処理した後、 [14C]セリンで 3時間標識した。クロ口ホルム:メタノール（1 : 2, v/v)で抽出後、 de novo合成されたセラミド（図 13A)、スフインゴミエリン（図 13B)を薄層クロマトグラフィ一により分離した。その結果、図 13に示すように、式 (II)で表される化合物は濃度依存的に細胞内のセラミド及びスフインゴミエリンの de novo合成を阻害した。

[0211] 〔実施例 13〕C2—セラミドによる式 (II)で表される化合物の複製阻害の回復

式 (II)で表される化合物による HCVレブリコン阻害活性が、スフインゴ脂質生合成経路に依存する力否かを明らかにするために、細胞性浸透性セラミド: C2—セラミド (S igma, cat. no. A7191)を式（II)で表される化合物と同時に HCVレプリコン細胞に添カロし、 96時間培養した。細胞抽出物を用いて、実施例 5と同様の方法にてウェスタンブロット解析を行った。その結果 (図 14)、式 (II)で表される化合物による HCV複製阻害は C2セラミドの濃度に依存して抑制されることが明らかとなった。

[0212] 〔実施例 14〕ラフト生合成関連低分子化合物による HCV複製阻害

HCVレプリコン細胞を、既知の SPT阻害剤ミリオシン（Sigma, cat. no. M1177)、セラミド合成阻害剤フモ-シン Bl(Sigma, cat. no. F1147)、およびセラミド輸送阻害剤 H PA-12 [Kobayashiら Org.lett.(2002)の合成方法に準じて合成）で処理した後、 72時間後レブリコン活性及び生細胞数を測定した。その結果、いずれの化合物も細胞毒性を認めな、濃度で HCVの複製を抑制する効果が認められた (図 15)。

[0213] 〔実施例 15〕式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（1)

HCVレプリコン細胞に ImMの式 (II)で表される化合物を 72時間添加した後、細胞抽出液を可溶化剤 1% Nonidet P- 40 (Nacalai tesque, cat. no. 252- 23)にて 1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、フラクション 1—9まで分離し、ウェスタンプロット解析は、実施例 5と同様な方法にて行った。その結果、図 16に示すように式 (II)で表される化合物は可溶化剤耐性画分の NS5Bの発現レベルを低下させた。し力しながら、 NS5Aや宿主のラフト結合タンパク質力べオリン -2にお、て式 (II)で表される化合物による影響は認められなかった。力べォリン- 2の発現は力べォリン- 2抗体（BD Transduc tion, cat. no. 610684)により確認した。

[0214] 〔実施例 16〕式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質の影響 (2)

HCVレプリコン細胞に ImMの式 (II)で表される化合物を 72時間添加した後、細胞抽出液を 1% NP-40で 1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質（可溶化剤耐性)、非ラフトタンパク質を分離し、 PBSで希釈し濃縮後 ELISA解析により定量した。その結果、式 (II)で表される化合物は、 NS5Bにおいて有意にラフト上から解離が認められた (図 17)。

産業上の利用可能性

[0215] 本発明により、スフインゴ脂質生合成が HCV感染に関与することがわかり、スフインゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、 HCV感染症の極めて有用な治療剤または予防剤となりうることがわ力つた。また、スフインゴ脂質であるスフインゴミエリンは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、 HIV等のウイルスがラフトを介して複製されることから（Takeda M. et al. (2003) PNAS, 100, 25、 Lu cero H. A., et al. (2004) Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208、 Simons

K. (1997) Nature, 387, 569、 G.— Z. Leu et al. (2004))、 HCVはラフトを介して複製されていることが強く示唆された。よって、ラフトを標的とした本発明の化合物を有効成分とする薬剤は、 HCV感染症を予防または治療する薬剤として利用できる可能性がある。

[0216] これまでの HCV感染症を予防または治療する薬剤は、生体内のどのカスケードに作用するかが知られておらず、副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的が明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えられる。

[0217] また、本発明の薬剤は HCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだけではなぐスフインゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質 (スフインゴミエリン)が異常蓄積する疾患であるスフインゴリビドーシス、スフインゴリピドバインデイングモチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルツハイマー病、 gpl20タンパク質が関与する HIV感染症、および PrPタンパク質が関与するプリオン病、さらには、脊髄運動-ユーロン内のセラミドが増加し神経細胞死を引き起こす筋萎縮性側索硬化症（Cutler, R. G., et al., Ann. Neurol., 52, 448-457, 2002)、ラフトに結合して宿主細胞に感染するウィルス感染症（例えばインフルエンザ、 HIV)等の有用な予防または治療する薬剤として利用できると考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 HC

V感染症を治療または予防するための薬剤。

[2] スフインゴミエリンの生合成過程力パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程である請求項 1に記載の薬剤。

[3] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。

[4] セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物力スフインゴファンギン、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体である、請求項 3 に記載の薬剤。

式 (I) :

2 n

2 2

2 m

2 p

結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして

セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体である、請求項 3に記載の薬剤。

式 (Π) :

[6] セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物力以下の（a)または (b)である、請求項 3に記載の薬剤。

[7] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。

[8] スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物力フモ-シン B1 またはその誘導体である請求項 7に記載の薬剤。

[9] ジヒドロスフインゴシン N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合物力以下の（a) または (b)である、請求項 7に記載の薬剤。

[10] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。

(a)セラミドからスフインゴミエリンの生合成に関与する、スフインゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物

(b) (a)に記載のスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物

[11] スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（a)または (b)である、請求項 10に記載の薬剤。

(b)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する RNA [12] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 1〜11のいずれかに記載の薬剤。

[13] 以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤。

式 (I) :

2 n

2 2

2 m

2 p

結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして

以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転移酵素阻害剤。

式 (Π) :

[15] ヒト由来のセリンパルミトイル転移酵素を阻害する、請求項 13または 14に記載の阻害剤。

[16] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程

(c) (a)に記載の酵素と結合する被検化合物を選択する工程

[17] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

[18] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(a)被検化合物を細胞に接触させる工程

[19] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。

[20] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法。

(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。 [21] スフインゴミエリンの生合成過程力パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生合成過程である請求項 16〜20のいずれかに記載のスクリーニング方法。

[22] ノルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素力セリンノルミトィル転移酵素、 N—ァシル転移酵素およびスフインゴミエリン合成酵素である、請求項 21に記載のスクリーニング方法。

[23] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 16〜22 のいずれかに記載のスクリーニング方法。

[24] 請求項 16〜23のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。