WO2006016657A1 - Hcv感染症を治療または予防するための薬剤 - Google Patents

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Masayuki Sudo
Hiroshi Sakamoto
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus

Definitions

  • the present invention relates to a drug for treating or preventing HCV infection, comprising as an active ingredient a compound that blocks the biosynthesis process of sphingomyelin.
  • the present invention also relates to a method for screening a drug for treating or preventing HCV infection, and a kit for use in the method.
  • HCV was discovered in 1989 as a major causative virus for non-A non-B hepatitis after blood transfusion.
  • HCV is an enveloped RNA virus whose genome consists of single-stranded (+) RNA and is classified into the genus Hepacivirus of the Flaviviridae family.
  • HCV progresses to chronic hepatitis, liver cirrhosis, and liver cancer, where persistent infection is often established even when infected with an adult who has developed an immune system, in order to avoid the host's immune mechanism due to unclear reasons.
  • liver cancer recurrence due to inflammation that continues in non-cancerous areas even after surgery.
  • interferon treatment is known as the only effective treatment for HCV elimination.
  • about 1Z3 of all patients are effective for interferon.
  • the response rate of interferon against HCV genotype lb is very low. Therefore, development of an anti-HCV drug that can replace or be used in combination with interferon is strongly desired.
  • ribavirin 1— ⁇ -D-ribofuranosyl 1 ⁇ — 1, 2, 4-triazol (Lu-3-Carboxamide) is marketed as a therapeutic agent for hepatitis C in combination with interferon, but there is a need for a new therapeutic agent for hepatitis C whose effectiveness is still low.
  • attempts have been made to eliminate viruses by enhancing the immunity of people such as interferon agonists and interleukin 12 agonists, but no effective drugs have been found yet.
  • Non-Patent Document 1 The mechanism of HCV RNA replication in this system is thought to be identical to the replication of the full-length HCV RNA genome infected with hepatocytes. Therefore, this system can be said to be a cell-based accessory system useful for identifying compounds that inhibit HCV replication.
  • Patent Document 1 International Publication No. W098Z56755 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application 2003-34056
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application 2003-272420
  • Non-Patent Document 1 Buoy Roman et al., Science, 1999, No. 285, 110-113
  • Patent Document 1 a series of compounds derived from microorganisms such as the genus Aureobasidium. And found to have high HCV replication inhibitory activity ( Patent Document 2).
  • Patent Document 2 the present inventors have found that the compound has minimal in vitro cytotoxicity and is extremely useful as a prophylactic or therapeutic agent for HCV infection, and further constructed a method for synthesizing the compound and derivatives. (Patent Document 3).
  • These inhibitors are likely to be therapeutic agents for HCV infection. However, it has not been clarified so far about the power that HCV causes in vivo, and what kind of in vivo reaction these series of compounds inhibit. There was concern about the behavior when used as a drug. Further, when the compound is used as a pharmaceutical, it has been required to elucidate what kind of cascade the compound is involved in and causes anti-HCV replication inhibitory activity.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the purpose of the present invention is to determine how a series of compounds derived from microorganisms such as the genus Aureobasidium and their derivatives are in vivo. Is to elucidate whether it is involved in the cascade and causes anti-HCV replication inhibitory activity.
  • an agent for treating or preventing HCV infection which contains a compound that blocks the cascade as an active ingredient, is provided.
  • a screening method for drugs for treating or preventing HCV infection and kits for use in these are provided.
  • the present inventors first represented by the following formula (II), which is one of compounds derived from microorganisms such as the genus Aureobasi di awakening.
  • the compound and myriocin having a structure partially similar to the compound were subjected to HCV levulincon assembly.
  • Myriocin specifically inhibits serine palmitoyltransferase (SPT), which condenses serine and palmitoyl CoA to produce 3-ketodihydrosphingosine at the initial stage of sphingolipid biosynthesis ( Figure 1).
  • SPT serine palmitoyltransferase
  • Figure 1 Myriocin specifically inhibits serine palmitoyltransferase (SPT), which condenses serine and palmitoyl CoA to produce 3-ketodihydrosphingosine at the initial stage of sphingolipid biosynthesis.
  • the compound represented by the formula (II) or myriocin is given to the replicon cell Huh-3-l in the range of ⁇ to 100 ⁇ , cultured, and after extracting total RNA, the neomycin resistance gene is used as a probe. Analysis was performed. As a result, the effect of reducing replicon RNA by 50% at a concentration of 10 ⁇ was observed in the compound represented by myriocin and formula ( ⁇ ) (FIGS. 2 and 3).
  • myriocin or a compound represented by the formula (II) is given to the replicon cell Huh-3-1 in the range of ⁇ to lOOuM, cultured, and after recovering the protein, an anti-NS3 Usagi antibody derived from HCV protein is used. Western analysis was performed. As a result, the compound represented by myriocin and the formula ( ⁇ ) was found to have an effect of reducing the expression of HCV protein by 50% at a concentration of 1-lOnM (Figs. 4 and 5).
  • HCV replicon inhibitory activity of fumosin B1 which specifically inhibits dihydrosphingosine synthase, which produces dihydrosphingosin, dihydric oral ceramide, during the intermediate stage of sphingolipid biosynthesis was measured.
  • Fumosin B1 was given to the replicon cell Huh-3-l in the range of 1.37 uM to 1000 uM, and after culturing, luminescence measurement was performed. As a result, it was revealed that fumosin B1 exhibits HCV replicon inhibitory activity at a concentration of 10-lOOOOM (Fig. 6).
  • siRNAs were synthesized targeting one subunit LCB1 of serine palmitoyltransferase heterodimers.
  • siRNA showed inhibition of expression compared to control siRNA, and si246 showed particularly strong expression inhibition (Fig. 7).
  • LCB1 was knocked down with siRNA, and HCV replicon inhibitory activity was measured.
  • HCV replicon cells were treated with 100 nM of the compound represented by formula (II) for 96 hours, and inhibition of expression of HCV-NS3 protein was confirmed.
  • the compound represented by formula ( ⁇ ) The HCV-NS3 protein around the nucleus disappeared by the addition of ( Figure 10).
  • HCV replicon cells were treated with 100 nM of the compound represented by formula (II) for 48 hours and 96 hours, and Western blot analysis confirmed the expression of HCV nonstructural proteins NS3, NS5A, and NS5B. However, all proteins showed a decrease in expression (Fig. 11). From these results, it is clear that the compound force represented by formula (II) has an effect of suppressing the expression of the nonstructural proteins NS3, NS5A, and NS5B, which are involved in HCV viral replication. became.
  • HCV levulincon cells were treated with a known SPT inhibitor myriocin, ceramide synthesis inhibitor fumonisin Bl, and ceramide transport inhibitor HPA-12, and levulincon activity and viable cell count were measured. It was clarified that V and slippery compounds also inhibited HCV replication at concentrations without cytotoxicity (Fig. 15).
  • the present inventors have succeeded in developing a drug for treating or preventing HCV infection, which contains a compound that blocks the process of sphingomyelin biosynthesis as an active ingredient.
  • the present invention has been completed.
  • anti-HCV agents have unclear target cascades and are side effects
  • the target of the drug of the present invention is a sphingomyelin biosynthetic system and is clearer, it is considered that side effects can be easily eliminated and the effect of the drug can be easily adjusted.
  • the anti-HCV agent of the present invention may exhibit an anti-HCV action widely regardless of the HCV subtype and various protein mutations.
  • the present invention provides the following (1) to (23).
  • a drug for treating or preventing HCV infection comprising as an active ingredient a compound that blocks the biosynthesis process of sphingomyelin.
  • A represents-(CH 2) —, where n represents an integer of 0 to 10;
  • R is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms (a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, mono or Di-substituted And may be substituted with an amino group, or may represent);
  • D represents — (CH 2), wherein m represents an integer of 0 to 10, and R ′ represents a hydrogen atom
  • E represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group Represents a group;
  • G represents one (CH) —J, where p represents an integer from 0 to 4, J represents hydrogen, an OH group, SH
  • Bond Q represents a single bond or a double bond
  • R 3 are the same or different and are a hydroxyl group, an amino group (which may be mono- or di-substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms), OL, a linear chain or a branched chain.
  • RNA with ribozyme activity that specifically cleaves DNA transcripts encoding serine palmitoyltransferase
  • RNA with ribozyme activity that specifically cleaves DNA transcripts encoding dihydrosphingosine N-calyzing enzyme
  • RNA with ribozyme activity that specifically cleaves DNA transcripts encoding sphingomyelin synthase
  • a serine palmitolyltransferase inhibitor comprising a compound represented by the following formula (I) or a derivative thereof.
  • A represents-(CH 2) —, where n represents an integer of 0 to 10;
  • R is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms (a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, mono or Di-substituted or substituted with an amino group may represent);
  • D represents — (CH 2), wherein m represents an integer of 0 to 10, and R ′ represents a hydrogen atom
  • E represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group
  • G represents one (CH) —J, where p represents an integer from 0 to 4, J represents hydrogen, an OH group, SH
  • Bond Q represents a single bond or a double bond
  • R 3 are the same or different and are a hydroxyl group, an amino group (which may be mono- or di-substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms), OL, a linear chain or a branched chain.
  • a serine normitolyltransferase inhibitor comprising a compound represented by the following formula (II) or a derivative thereof.
  • a method for screening a drug for treating or preventing HCV infection comprising the following steps (a) to (c):
  • a method for screening a drug for treating or preventing HCV infection comprising the following steps (a) to (c):
  • test compound having a decreased expression level of the enzyme as a drug for treating or preventing HCV infection as compared with a case where the test compound is brought into contact with the test compound.
  • a method for screening a drug for treating or preventing HCV infection comprising the following steps (a) to (d):
  • Biosynthesis process power of sphingomyelin Palmitoyl CoA force is the biosynthesis process of sphingomyelin, The screening method according to any one of (16) to (20).
  • (22) The enzyme method involved in the process of biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA.
  • FIG. 1 is a diagram showing a sphingolipid synthetic pathway (synthetic pathway from palmitoyl CoA to sphingomyelin).
  • FIG. 2 Photograph showing the HCV RNA replication inhibitory activity of myriocin by Northern plot analysis. The horizontal axis represents the concentration of myriocin.
  • FIG. 3 is a photograph showing the HCV RNA replication inhibitory activity of a compound represented by formula (II) by Northern plot analysis.
  • the horizontal axis represents the concentration of the compound represented by the formula ( ⁇ ).
  • FIG. 4 Photograph showing the inhibitory activity of myriocin on HCV protein synthesis by Western plot analysis. The horizontal axis represents the concentration of myriocin.
  • FIG. 5 is a photograph showing the HCV protein synthesis inhibitory activity of the compound represented by formula ( ⁇ ) by Western plot analysis.
  • the horizontal axis represents the concentration of the compound represented by formula (II).
  • FIG. 6 is a graph showing the HCV replicon inhibitory activity of fumosin B1.
  • FIG. 7 is a photograph showing inhibition of protein expression of serine palmitoyltransferase (LCB1) by siRNA.
  • FIG. 8 is a graph showing the effects of siRNA on HCV levulincon inhibitory activity and cytotoxicity.
  • FIG. 9 is a graph showing the inhibition of HCV levicon and the toxicity to host cells by the compound represented by formula (II).
  • FIG. 10 is a photograph showing inhibition of HCV-NS3 protein expression by a compound represented by formula (II). After immunostaining, it was observed with a fluorescence microscope. White indicates NS3 protein, gray indicates nuclei stained with hex 33342.
  • FIG. 11 is a graph showing inhibition of NS3, NS5A, and NS-5B protein expression by a compound represented by formula (II). Each protein was expressed by Western plot analysis.
  • FIG. 12 is a graph showing SPT inhibitory activity of a compound represented by formula (II).
  • FIG. 13 is a graph showing inhibition of de novo synthesis of ceramide and sphingomyelin by the compound represented by formula (II).
  • FIG. 14 is a graph showing suppression of HCV replication inhibition of a compound represented by formula (II) by C2-ceramide.
  • FIG. 15 is a view showing inhibition of HCV replication by a raft biosynthesis-related low molecular weight compound.
  • FIG. 16 is a diagram showing the influence of a compound represented by formula (II) on raft protein.
  • FIG. 17 is a graph showing the influence of a compound represented by formula (II) on raft protein.
  • the present invention relates to a drug for treating or preventing HCV infection, comprising as an active ingredient a compound that blocks the biosynthesis process of sphingomyelin.
  • the biosynthesis process of sphingomyelin is more preferably a process of biosynthesis of sphingomyelin from palmitole CoA (Fig. 1).
  • a compound that blocks the process of sphingomyelin biosynthesis refers to directly or indirectly inhibiting in vivo reactions related to the process of sphingomyelin biosynthesis from palmitoyl CoA. Any compound can be used. It may be a compound that inhibits the activity of an enzyme involved in the biosynthesis process of sphingomyelin, a compound that inhibits the expression of an enzyme involved in biosynthesis, or a compound that produces or increases these inhibitors. A compound that indirectly inhibits an enzyme involved in biosynthesis may also be used.
  • the enzyme involved in the biosynthesis process of sphingomyelin is serine.
  • examples include lumitoyltransferase, 3-ketodihydrosphingosine reductase, dihydrosphingosine N-acyltransferase, dihydroceramide desaturase, and sphingomyelin synthase (Fig. 1), preferably serine palmitoyltransferase. Mention may be made of enzymes, dihydrosphingosine-N-acyltransferase, and sphingomyelin synthase.
  • the compound of the present invention includes a compound that blocks the biosynthesis process of palmitoyl CoA force 3-ketodihydrosphingosine, which is the initial stage of the sphingolipid biosynthesis process.
  • Examples of the compound that blocks the biosynthetic process include compounds that inhibit the enzyme activity of serine palmitoyltransferase involved in the biosynthesis, and compounds that suppress the expression of serine palmitoyltransferase.
  • the compound that inhibits the enzyme activity of serine palmitoyltransferase of the present invention may be any compound that inhibits the enzyme activity, but is preferably sphingofagin, myriocin, the following formula (I ) Or a derivative thereof.
  • A represents one (CH) —, where n represents an integer of 0 to 10;
  • R is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms (a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, mono or Di-substituted or substituted with an amino group may represent);
  • D represents — (CH 2), wherein m represents an integer of 0 to 10, and R ′ represents a hydrogen atom
  • Linear or branched alkyl group linear or branched alkynyl group, linear Or a branched alkenyl group, a cycloalkyl group, an optionally substituted heterocyclic group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted heteroaryl group, an OX group (where X is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group, a linear or branched alkyl group, a linear or branched alkenyl group, a cycloalkyl group, or an optionally substituted group. Represents a good aryl group), or represents a halogen atom;
  • E represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group
  • G represents one (CH) —J, where p represents an integer from 0 to 4, J represents hydrogen, an OH group, SH
  • Bond Q represents a single bond or a double bond
  • R 3 are the same or different and are a hydroxyl group, an amino group (which may be mono- or di-substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms), OL, a linear chain or a branched chain.
  • a linear or branched alkyl group means a linear or branched hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, unless otherwise defined in the present specification. Preferably, it means a linear or branched hydrocarbon group having 1 to 7 carbon atoms.
  • methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, t-butyl group, pentyl group, heptyl group and the like can be mentioned.
  • the cycloalkyl group means a cyclic hydrocarbon group having 3 to 8 carbon atoms.
  • the straight or branched alkenyl group means a straight or branched hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms and containing at least one double bond.
  • Bulle group, 1 Examples include propenyl group, aryl group, 2-butur group, 2-etulur 2-butur group and the like.
  • the linear or branched alkynyl group means a linear or branched hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms and containing at least one triple bond.
  • Etul group 1 propyl group, 2 propyl group, 1 butyl group, 3 butynyl group, 2 pentyl group, 3 pentyl group, 4 pentyl group, 2 hexyl group, 4 Monohexyl group, 2 decyl group, 6, 6 dimethylhepter 2, 4 diyne-1-yl group and the like.
  • the heterocyclic group described in the present specification means 1 to 4 heteroatoms independently selected from a nitrogen atom, a sulfur atom, and an oxygen atom (preferably 1 Or 2 to 4) as a ring member, 4 to 6-membered monocyclic or 7 to 10-membered bicyclic group (preferably monocyclic group) having at least one double bond
  • Specific groups such as pyran, morpholine, tetrahydrofuran, dihydrofuran, tetrahydropyran, dihydropyran, 1,3 dioxane, piperazine, piperidine, thiomorpholine.
  • the aryl group described in this specification means a monocyclic or polycyclic hydrocarbon group having aromaticity. Specific examples include force-induced groups such as benzene, naphthalene, anthracene, and fluorene.
  • the heteroaryl group described in the present specification has aromaticity and has 1 to 4 heteroatoms independently selected from a nitrogen atom, a sulfur atom, and an oxygen atom ( Preferably, it means a 4 to 6-membered monocyclic or 7 to 10-membered bicyclic group (preferably a monocyclic group) containing 1 or 2) as ring members.
  • examples include force-induced groups such as furan, thiophene, pyrrole, diazole, pyridine, thiazole, imidazole, pyrimidine, indole, quinoline, oxazole, isoxazole, pyrazine, triazole, thiadiazole, tetrazole, and pyrazole. it can.
  • the aralkyl group described in the present specification means the above linear or branched alkyl group substituted with the above aryl group, and specifically includes a benzyl group, a phenethyl group, and the like. Can be mentioned.
  • the heteroaryl alkyl group described herein is a heteroaryl group as defined above. It means the above-mentioned linear or branched alkyl group substituted with a group.
  • acyl group described herein is bonded via a carbo group, and the above linear or branched alkyl group, aryl group, heteroaryl group, or Means a bicyclic group.
  • alkyl group a linear or branched alkoxy group, a linear or branched alkenyl group, a linear or branched alkoxy group, a linear or branched alkyl group, Linear or branched alkyloxy group, cycloalkyl group, cycloalkyloxy group, cyano group, nitro group, trifluoromethyl group, trifluoromethoxy group, halogen atom, aryl group, aryloxy group, heteroaryl group A heteroaryloxy group, an aralkyl group, an aralkyloxy group, an amino group (which may be mono- or di-substituted by a linear or branched alkyl group), an Group, linear or branched alkylsulfonyl group, strong rubamoyl group, linear or branched alkyl group), an Group, linear or branched alkylsulfonyl group, strong rubamoyl group, linear or branched alkyl group
  • the aryl and heteroaryl moieties contained in these substituents further include a halogen atom, a linear or branched alkyl group, a linear or branched alkoxy group, a linear or branched alkenyl group, Linear or branched alkyloxy group, linear or branched alkyl group, linear or branched alkyloxy group, cycloalkyl group, cycloalkyloxy group, cyano group, nitro group Mono- or di-substituted with a trifluoromethyl group, a trifluoromethoxy group, a halogen atom, an aryl group, an aryloxy group, a heteroaryl group, an aralkyl group, an aralkyloxy group, a linear or branched alkyl group, Moyo!
  • Amino group acyl group, linear or branched alkylsulfonyl group, linear or branched chain It is di- or tri-substituted by a ruxoxy group, a strong rubamoyl group, a linear or branched alkylthio group, a carboxyl group, a linear or branched alkyl carbo group, a formyl group, an amino sulfo group, etc.
  • a ruxoxy group a strong rubamoyl group
  • a linear or branched alkylthio group a carboxyl group, a linear or branched alkyl carbo group, a formyl group, an amino sulfo group, etc.
  • Preferred examples of the compound of the formula (I) of the present invention include the following compounds.
  • each symbol is as described in the above formula (I), and P, pz, and P ⁇ represent a hydroxy protecting group.
  • the starting compound, Compound 1 can be synthesized according to literature methods (J. Org. Chem. 1989, 45, 5522, B.E. Marron, et al).
  • Compound 1 is mixed with bis (2-methoxyethoxy) aluminum hydride, aluminum hydride in various ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, etc., in solvents such as benzene, toluene, cyclohexane, etc. or in mixed solvents thereof.
  • Compound 2 can be obtained by reacting with a reducing agent such as lithium at room temperature or under cooling, preferably at ice temperature, followed by treatment with iodine under cooling, preferably at 78 ° C.
  • Step 1-2 Compound 2 is converted into a catalytic amount of pyridinium paraffin in a solvent such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, ethyl acetate, or a mixture thereof.
  • Compound 3 can be obtained by reacting with dihydropyran in the presence of an acid such as toluenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid acetic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, dilute hydrochloric acid, at room temperature or under cooling, preferably at ice temperature. it can
  • Compound 3 is mixed with various ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran and dioxane, benzene, toluene, cyclohexane and the like or mixed solvents thereof such as tert butyl lithium, n-butyl lithium and sec butyl lithium.
  • Compound 4 can be obtained by reacting with a strong base at room temperature or cooling, preferably at 78 ° C., and further reacting formaldehyde with vigorous cooling, preferably at ice temperature.
  • Compound 4 is preferably present at room temperature or under cooling in the presence of a base such as imidazole, trimethylamine, or pyridine.
  • Compound 5 can be obtained by reacting with tert butyl diphenylchlorosilane under ice temperature.
  • the compound 6 can be obtained by reacting at room temperature or under heating, preferably under reflux.
  • Compound 6 is dissolved in a solvent such as methylene chloride, black mouth form, or a mixed solvent thereof, Lewis acid such as titanium tetraisopropoxide, titanium tetraptoxide, etc. and L-(+) Jetyl monotartrate, L (+ ) Dipropyl tartrate or D (1) Jetyl tartrate, D (1) Peroxides such as tert butyl hydroperoxide and tamen hydroperoxide in the presence of dipropyl tartrate at room temperature or under cooling, preferably under cooling Compound 7 can be obtained by reaction.
  • a solvent such as methylene chloride, black mouth form, or a mixed solvent thereof
  • Lewis acid such as titanium tetraisopropoxide, titanium tetraptoxide, etc.
  • L-(+) Jetyl monotartrate L (+ ) Dipropyl tartrate or D
  • Jetyl tartrate D
  • Peroxides such as tert butyl hydroperoxide and tamen hydro
  • the metal derivative and compound 7 are mixed with various ethers such as diethyl ether, tetrahydrofuran and dioxane, in a solvent such as benzene, toluene and cyclohexane or in a mixed solvent thereof at room temperature or under cooling, preferably at 78 ° C.
  • Compound 8 can be obtained by the reaction.
  • Compound 8 is converted into a catalytic amount of pyridinium paratoluenesulfonic acid, toluene in a solvent such as jetyl ether, toluene, hexane, methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, or a mixture thereof.
  • a solvent such as jetyl ether, toluene, hexane, methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, or a mixture thereof.
  • an acid such as sulfonic acid, methanesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid or sulfuric acid at room temperature or under cooling, preferably at room temperature. You can get Item 9.
  • Compound 9 is dissolved in a solvent such as jetyl ether, tetrahydrofuran, hexane, methylene chloride, chloroform, or a mixed solvent thereof, such as tetraptyl ammonium fluoride, hydrofluoric acid, acetic acid, dilute hydrochloric acid, etc.
  • a solvent such as jetyl ether, tetrahydrofuran, hexane, methylene chloride, chloroform, or a mixed solvent thereof, such as tetraptyl ammonium fluoride, hydrofluoric acid, acetic acid, dilute hydrochloric acid, etc.
  • Compound 10 can be obtained by reacting in the presence at room temperature or under cooling.
  • the corresponding dicarboxylic acid can be obtained by subjecting compound 10 to an oxidation reaction such as manganese peroxide, nitric acid, diones oxidation and the like.
  • compound 10 may be potassium permanganate
  • the corresponding dialdehyde can be obtained by acid reactions such as Collins oxidation and TEMPO acid.
  • triethylamine Dialdehyde can be obtained by treatment with a base such as The resulting product can subsequently be converted to a dicarboxylic acid with an oxidizing agent such as potassium permanganate, sodium chlorite, chromic acid.
  • Dicarboxylic acid is obtained by reacting with an aqueous solution of sodium chlorite and sodium dihydrogen phosphate in 2-methyl-2-propanol, 2-methyl-2-butene, preferably at room temperature or under cooling, preferably under cooling. be able to.
  • N, N dimethylformamide in solvents such as N, N dimethylformamide, jetyl ether, tetrahydrofuran, hexane, methylene chloride, black mouth form or mixed solvents thereof or in the absence of solvent.
  • Compound 11 can be obtained by reacting tert-butyl in tert-butylacetal or 2,2,2-trichloroacetimidate at room temperature or under heating.
  • Compound 11 is preferably used in a solvent such as tetrahydrofuran and dioxane or in a mixed solvent thereof in the presence of an acid such as pyridinium paratoluenesulfonic acid, methanesulfonic acid and acetic acid in the presence of water at room temperature or under cooling. Can be obtained by reacting at room temperature.
  • Compound 12 can be converted to the corresponding dicarboxylic acid by an oxidation reaction such as manganese peroxide, nitric acid, diones oxidation.
  • Compound 13 is preferably obtained by reacting compound 12 with Diones reagent in acetone at room temperature or under cooling, preferably under cooling.
  • Compound 13 and ⁇ -amino acid tert-butyl ester hydrochloride are mixed with N, N diisopropyl ester in a solvent such as N, N dimethylformamide, tetrahydrofuran, jetyl ether, methylene chloride, chloroform, or a mixture thereof.
  • a solvent such as N, N dimethylformamide, tetrahydrofuran, jetyl ether, methylene chloride, chloroform, or a mixture thereof.
  • the compound 14 A which is one embodiment of the compound of formula (I), can be obtained by reacting with a coupling reagent such as) by reacting at room temperature! / ⁇ under cooling, preferably at room temperature. .
  • Compound 14A is reacted with methanesulfonic acid in the presence or absence of vaninol in a solvent such as ethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, hexane, methylene chloride, chloroform, ethyl acetate, water, or a mixed solvent thereof.
  • a solvent such as ethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, hexane, methylene chloride, chloroform, ethyl acetate, water, or a mixed solvent thereof.
  • the compounds of the formula (I) of the present invention in order to obtain a compound other than the above-mentioned compounds 14 A and 14 B, starting from compound 14-A or 14-B, hydrolysis may be performed as necessary. By subjecting it to reduction, amination or amidation, hydroxyiminolysis, and / or ester conversion, the desired compound of formula (I) can be obtained.
  • the compound of the formula (I) in which the bond Q is a single bond is obtained by reacting the compound 14 A or 14 B in a solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate, tetrahydrofuran, etc. It can also be obtained by hydrogenation at room temperature or under heating conditions in the presence of a catalyst such as nickel or platinum oxide.
  • This method is the method of step 17 of the above general production method 1.
  • Tylhydroxylamine hydrochloride is mixed with N, N diisopropylethylamine in a solvent such as jetyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, hexane, methylene chloride, chloroform, ethyl acetate, or a mixture thereof.
  • bases such as triethylamine, pyridine, 4-N, N dimethylaminopyridine, O— (7 azabenzotriazole 1 —Nyl) N, N, N ′, N ′ — Tetramethylu-umhexafluorophosphate, water-soluble carbodiimide hydrochloride (WSC'HCl), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), etc.
  • Compound b can be obtained by allowing the coupling reagent to act at room temperature.
  • Compound b obtained in the above step has a desired group D in a solvent such as jetyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, hexane or a mixed solvent thereof at room temperature or under cooling, preferably under cooling.
  • a solvent such as jetyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, hexane or a mixed solvent thereof at room temperature or under cooling, preferably under cooling.
  • Compound c and ethylene glycol obtained in the above step are mixed with an acid such as pyridinium paratoluenesulfonic acid, paratoluenesulfonic acid, methanesulfonic acid or acetic acid in a solvent such as benzene, toluene or 1,2-dichloroethane.
  • Compound d can be obtained by reacting in the presence of water formed by heating while azeotropically removing the water.
  • a compound corresponding to compound d can also be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • This compound can be produced by a method known to those skilled in the art by the reaction scheme of the following general production method 3 to general production method 5.
  • P ′ ′ ′ represents a protecting group for a carboxyl group
  • P ′′ represents a protecting group for an amino acid
  • M represents a linear or branched alkyl group, a linear or branched chain group, An alkynyl group, a linear or branched alkenyl group, or a cycloalkyl group.
  • Compound AA is protected by an amino-protecting group such as acetyl, trifluoroacetyl, t-butoxycarbol, benzyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethylcarbole and the like to give compound BB. be able to.
  • the reaction conditions at this time are appropriately selected depending on the kind of the protecting group P ′,.
  • Compound BB is mixed with potassium carbonate, hydroxide in a solvent such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, or a mixed solvent thereof.
  • a base such as sodium or sodium hydride
  • the compound CC is reacted with halogen or M substituted by a leaving group such as methanesulfonate ester, toluenesulfonate ester, etc.
  • compound CC can be obtained by reacting compound BB with M substituted with a hydroxyl group under Mitsunobu reaction conditions.
  • the compound DD can be obtained by deprotecting the protecting group P ′ ′ ′ ′ of the amino group of the compound CC.
  • the reaction conditions at this time are appropriately selected depending on the kind of the protecting group P ′, “.
  • P ' represents a protecting group for a carboxyl group
  • P "" represents a protecting group for an amino group
  • T represents a leaving group such as a sulfonate ester
  • U represents a substituted group. It may be a good aryl or a substituted aryl group.
  • Compound BB is converted into jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylform Bases such as N, N diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, 4-N, N dimethylaminopyridine in various solvents such as muamide, dioxane, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide or mixed solvents thereof
  • the compound EE can be obtained by reacting with methanesulfonic acid chloride, toluenesulfonic acid chloride, trifluorosulfonic anhydride, etc. in the presence of water at room temperature or under cooling, preferably under cooling.
  • Compound EE is mixed with palladium diacetate, tetrakistriphenylphosphine in various solvents such as jetyl ether, toluene, benzene, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, acetonitrile, water, or a mixture thereof.
  • solvents such as jetyl ether, toluene, benzene, dimethylformamide, dioxane, ethyl acetate, acetonitrile, water, or a mixture thereof.
  • a palladium catalyst such as palladium at room temperature or under heating, preferably under heating, a compound is obtained. You can get FF.
  • the compound GG can be obtained by deprotecting the protecting group P ′ ′ ′′ of the amino group of the compound FF.
  • the reaction conditions at this time are appropriately selected depending on the kind of the protecting group P ′ ′′.
  • P ′ ′ ′ represents a protecting group for a carboxyl group
  • P ′′ represents a protecting group for an amino acid
  • U represents an optionally substituted aryl, or an optionally substituted heteroaryl group.
  • Compound BB is converted into sodium hydride, potassium carbonate in various solvents such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, methylene chloride, chloroformate, dimethyl sulfoxide, or a mixed solution thereof.
  • solvents such as jetyl ether, toluene, cyclohexane, acetone, dimethylformamide, dioxane, methylene chloride, chloroformate, dimethyl sulfoxide, or a mixed solution thereof.
  • a base such as N, N diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine
  • 4- In the presence of a base such as N, N-dimethylaminopyridine and a catalyst such as dicetoxy cupric and cuprous iodide, at room temperature or under heating, preferably under heating, aryl or heteroaryl boric acid derivatives, aryl or
  • the compound HH can be obtained by reacting with a heteroaryl borate ester derivative, a halogenated arylene, a halogenated heteroaryl derivative or the like.
  • Compound II can be obtained by deprotecting the protecting group P ′ ′ ′ ′ of the amino group of compound HH.
  • the reaction conditions at this time are appropriately selected depending on the kind of the protecting group P ′ ′ ′ ′.
  • the compound (40) described in the above list of derivatives of the formula (I) (same as the compound represented by the formula (II)) is disclosed in International Publication No. W098Z56755, and is described in Aureobasidiu It is derived from microorganisms belonging to the genus Aureobasidium and is known to have antibacterial activity against pathogenic fungi such as Candida 'albicans, Taryptococcus' neoformans, and the effect of inhibiting immune reactions.
  • the compound (48) is disclosed in International Publication No. W094Z18157, and is known to be useful as a squalene synthesis inhibitor and antifungal agent.
  • This compound (40) is a filamentous fungus of the genus Fusarium, the genus Aureobasidium, etc., and a strain producing the above compound is cultured, and then the culture of the above strain is used. It can be produced by isolation.
  • the strains that can be used for the production of the compound (40) are those belonging to the filamentous fungi of the genus Fusarium, the genus Aureobasidium, etc. and capable of producing the above compound.
  • Fusarium sp. F1476 strain hereinafter referred to as “F1476 strain”
  • Aureobasidium sp. TKR2449 strain International Publication No. W098Z56755
  • the F1476 strain has the property of advantageously producing the compound (40).
  • the physiological properties of the F1476 strain are as follows:
  • the growth temperature range is 10 to 30 ° C, preferably 20 to 30 ° C.
  • F1476 strain is designated as Fusarium sp. F 1476 and has been deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of April 4, 2003 under the accession number FERM BP-8290. .
  • the compound (40) can be obtained by inoculating the F1476 strain in a nutrient source-containing medium and culturing the same.
  • a nutrient source-containing medium examples include glucose, fructose, saccharose, starch, dextrin, glycerin, molasses, starch syrup, fats and oils, and organic acids.
  • nitrogen sources include, for example, soy flour, cottonseed flour, corn steep liquor, casein, peptone, yeast extract, meat extract, germ, urea, amino acid, ammonia salt, etc.
  • the salts include inorganic salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, and phosphates. These may be used alone or in appropriate combination.
  • an antifoaming agent such as silicone oil and polyalkylene glycol ether, a surfactant, and the like can be added to the nutrient source-containing medium as necessary.
  • a solid culture method a liquid, which is generally used when the production of a physiologically active substance is performed by culturing a microorganism.
  • a culture method such as a culture method can be employed.
  • the compound (40) is accumulated in the culture by the above-described culture method.
  • the compound (40) accumulated in the culture is added to the culture by a known method. After separating the force, it can be further purified if necessary.
  • the separation can be carried out by extracting the whole culture with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, black mouth form, butanol, methyl isobutyl ketone and the like.
  • a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, black mouth form, butanol, methyl isobutyl ketone and the like.
  • the culture can be separated into a culture solution and cells by filtration or centrifugation, and then separated from each of the culture solution and cells.
  • a method of extracting with the non-hydrophilic organic solvent may be employed, or the culture solution is contacted with an adsorbent carrier.
  • the above compound (40) in the culture solution is adsorbed on a carrier and then eluted with a solvent.
  • Examples of the carrier include activated carbon, powdered cellulose, and adsorptive resin.
  • the solvent one or a combination of two or more can be used as appropriate depending on the type and nature of the carrier.
  • aqueous solution of a water-soluble organic solvent such as water-containing acetone or water-containing alcohol is appropriately combined. The thing etc. can be mentioned.
  • the crude extract of the compound (40) from which the medium strength of the culture has been separated in this way can be subjected to a further purification step as necessary.
  • the above purification can be carried out by a method usually used for separation and purification of a fat-soluble physiologically active substance.
  • a method usually used for separation and purification of a fat-soluble physiologically active substance examples include silica gel, activated alumina, activated carbon, and adsorbent coagulant.
  • column chromatography using a carrier such as high performance liquid chromatography.
  • examples of the elution solvent include black mouth form, ethyl acetate, methanol, acetone, water, etc., and these are used in combination of two or more. be able to.
  • the carrier may be, for example, a chemically bonded silica gel bonded with an otadecyl group, an octyl group, a phenol group, or the like; a polystyrene-based porous polymer gel, etc.
  • the mobile phase for example, an aqueous solution of a water-soluble organic solvent such as water-containing methanol or water-containing acetonitrile can be used.
  • derivatives represented by compounds (41) to (54) can be obtained using any one of production methods 1 to 11 described below using compound (40) as a starting material.
  • Production method 1 The above compound (40) is hydrogenated in a solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate, tetrahydrofuran, in the presence of a catalyst such as palladium carbon, palladium hydroxide, Raney-kettle, at room temperature or under heating conditions. As a result, the compound (46) which is a dihydro form can be obtained.
  • a solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate, tetrahydrofuran
  • Production method 2 Compound (40) above in a solvent such as methanol, ethanol, propanol or tetrahydrofuran, sodium borohydride, sodium trimethoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, lithium borohydride, hydrogenated
  • a solvent such as methanol, ethanol, propanol or tetrahydrofuran
  • sodium borohydride sodium trimethoxyborohydride
  • sodium cyanoborohydride sodium cyanoborohydride
  • lithium borohydride hydrogenated
  • the compound (47) which is an alcohol form can be obtained by reduction at room temperature or under cooling conditions in the presence of a reducing agent such as sodium jetyl aluminum or lithium aluminum hydride.
  • Production method 3 The above compound (40) is treated in a solvent such as methanol, dioxane, tetrahydrate, furan or water in the presence of hydrochloric acid, sulfuric acid, methanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or the like at room temperature or under cooling conditions. As a result, a dealkylated compound (48) and the like can be obtained. Further, the compound (48) is allowed to react at room temperature or in the presence of a catalyst such as radium carbon, palladium hydroxide, Raney-kettle, platinum oxide in a solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate, or tetrahydrate-furan.
  • the compound (49) which is a dihydro form can be obtained by hydrogenation under the following conditions.
  • Production method 4 The above compound (48) etc. is present in the presence of a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, potassium carbonate, etc., in a solvent such as dimethylformamide (DMF), tetrahydride mouth furan, etc.
  • a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, potassium carbonate, etc.
  • a solvent such as dimethylformamide (DMF), tetrahydride mouth furan, etc.
  • Tetraalkyl, tetraalkyl, and tetraalkyl isomers can be synthesized by treating with an alkylating agent such as alkyl halide, aryl halide, and alkyl halide at room temperature or under heating conditions.
  • This compound is treated in the presence of a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, potassium carbonate, etc., in a solvent such as methanol, dioxane, tetrahydride furan, water, etc. at room temperature or under heating conditions. By doing so, it is possible to synthesize compounds that are alkyl, alkyl, and alkenyl compounds.
  • a base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium carbonate, potassium carbonate, etc.
  • a solvent such as methanol, dioxane, tetrahydride furan, water, etc.
  • Production method 6 The above compound (40) is mixed with methanol, ethanol, Compound that is tetrahydro form by hydrogenation at room temperature or under heating condition in the presence of catalyst such as noradium carbon, palladium hydroxide, Raney-kettle, platinum oxide, etc. in solvent such as ethyl acetate, tetrahydrofuran, etc. A thing (51) etc. can be obtained.
  • catalyst such as noradium carbon, palladium hydroxide, Raney-kettle, platinum oxide, etc.
  • solvent such as ethyl acetate, tetrahydrofuran, etc.
  • Production method 7 The above compound (40) is reacted with various alcohols (R—OH) with a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in a solvent such as tetrahydrated furan, DMF and dichloromethane.
  • a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC)
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • the corresponding triester (R ⁇ R ⁇ RR) can be obtained at room temperature or under heating conditions.
  • the compound (40) is treated with amide dihydro form trimethylsilyl diazomethane (TM SCHN) in a mixed solvent such as methanol and dichloromethane to obtain a trimethyl ester form (R ⁇ R ⁇ R ⁇ CH). be able to.
  • TM SCHN trimethylsilyl diazomethane
  • Production method 8 By treating the trimethyl ester obtained in production method 7 with hydrazine derivatives such as 4 toluenesulfurhydrazide in a solvent such as methanol, ethanol and butanol, the corresponding hydrazide is obtained at room temperature or under heating conditions. After treating the hydrazide with a reducing agent such as force tecole borane, the presence of a base such as lithium hydroxide, sodium hydroxide or lithium hydroxide, in a solvent such as ethanol, methanol and water at room temperature. Alternatively, a deketo compound (52) or the like can be obtained under heating conditions.
  • a base such as lithium hydroxide, sodium hydroxide or lithium hydroxide
  • Process 9 Corresponding oxime ether by treating the above compound (40) with hydroxylamine or various O-substituted hydroxylamines in the presence of pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine, etc. at room temperature or under heating conditions. Further, compounds (53), (54) and the like which are oximes can be obtained.
  • Production method 10 The above compound (40) can be treated with jetylaminosulfur trifluoride (DAST) or the like in a solvent such as tetrano, iodofuran, dichloromethane or chloroform to obtain a halide.
  • Production method 11 Sodium cyanoborohydride or the above amine (40) and various amines in a solvent such as ethanol, methanol, and tetrahydran furan under neutral or weakly acidic conditions at room temperature or under heating conditions.
  • Examples of the compound that suppresses the expression of serine palmitoyltransferase of the present invention include RNA complementary to a transcription product of DNA encoding serylpalmitoyltransferase, or a ribozyme that specifically cleaves the transcription product. be able to.
  • the origin of serine palmitoyltransferase whose expression is suppressed is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal, and more preferably derived from a human.
  • DNA encoding serine palmitoyltransferase DNA encoding a DNA having a nucleotide sequence ability described in SEQ ID NO: 4 or 6 (LCB1 or LCB2), DNA encoding an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 5 or 7, And naturally-derived DNA that encodes a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 7. .
  • “Proteins with one or more amino acid substitutions, deletions, attached calories, and Z or inserted amino acid sequences” have the same functions as natural proteins and have high homology. is there. High homology means at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) of the entire amino acid sequence. Refers to sequence identity.
  • the naturally-derived DNA is a DNA that hybridizes to the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6.
  • the conditions in the hybridization can be appropriately selected by those skilled in the art. In the post-hybridization washing, for example, the conditions are 42 ° C., 5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 50 The conditions are ° C, 5 X SSC, 0.1% SDS. More preferable hybridization conditions are, for example, 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • the RNA complementary to the transcription product of DNA encoding serine palmitoyltransferase includes siRNAs represented by SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the compound of the present invention includes a sulfin, which is an intermediate stage in the process of sphingolipid biosynthesis.
  • a sulfin which is an intermediate stage in the process of sphingolipid biosynthesis.
  • examples include compounds that block the biosynthesis process of dihydroceramide such as ganin (dihydrosphingosine).
  • examples of the compound that blocks the biosynthetic process include a compound that inhibits the enzymatic activity of dihydrosphingosine N-acyltransferase involved in the biosynthesis, or a compound that suppresses the expression of dihydrosphingosine N-sacyltransferase.
  • the compound of the present invention that inhibits the enzyme activity of dihydrosphingosine 1-N-acyltransferase may be any compound as long as it inhibits the enzyme activity, preferably fumocin. Mention may be made of B1 or derivatives thereof.
  • the compound that suppresses the expression of dihydrosphingosine N-acyltransferase of the present invention includes RNA complementary to a transcription product of DNA encoding dihydrosphingosine N-sacyltransferase, or the transcription. There may be mentioned ribozymes that specifically cleave the product.
  • Examples of the compound of the present invention include compounds that block the process of biosynthesis of sphingomyelin from ceramide, which is an intermediate stage of the process of biosynthesis of sphingolipid.
  • Examples of the compound that blocks the biosynthetic process include compounds that inhibit the enzyme activity of sphingomyelin synthase involved in the biosynthesis, or compounds that suppress the expression of sphingomyelin synthase.
  • the compound that inhibits the enzyme activity of sphingomyelin synthase of the present invention may be any compound that inhibits the enzyme activity.
  • the compound that suppresses the expression of sphingomyelin synthase of the present invention includes RNA complementary to the transcription product of DNA encoding sphingomyelin synthase, or a ribozyme that specifically cleaves the transcript.
  • the DNA encoding the sphingomyelin synthase is DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 9.
  • naturally-occurring DNA encoding a protein having an amino acid sequence ability in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted.
  • suppressing enzyme expression includes suppression of gene transcription and tampering. Inhibiting translation into the quality. It also includes a decrease in expression as well as complete cessation of DNA expression.
  • RNA complementary to the transcript of the DNA encoding the enzyme is an antisense RNA complementary to the transcript of the DNA encoding the enzyme.
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of a gene would be effective for inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA to be used is linked downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by a known method.
  • the antisense DNA sequence is preferably complementary to the endogenous gene or part of the plant to be transformed U, but is completely complementary as long as it can effectively inhibit gene expression. It does not have to be.
  • Transcribed RNA is targeted It preferably has 90% or more complementarity, most preferably 95% or more complementarity to the gene transcript.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. is there. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb!
  • RNA complementary to the transcript of the DNA encoding the enzyme is a dsRNA complementary to the transcript of the DNA encoding the enzyme.
  • RNAi is a phenomenon in which when a double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Dicer RNaselll-like nuclease called Dicer with a helicase domain is present in the presence of ATP
  • dsRNA is about 21 to 23 base pairs from the 3 'end.
  • siRNA short interference RNA
  • a protein specific to this siRNA binds to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the mRNA of the target gene at the center of the siRNA by R Naselll-like enzyme activity.
  • the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA.
  • RsRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the RNA of the present invention comprises an antisense coding DNA that encodes an antisense RNA for any region of the target gene mRNA, and a sense code DNA that encodes a sense RNA in any region of the target gene mRNA! It can be expressed more. DsRNA can also be prepared from these antisense RNAs and sense RNAs.
  • the structure of the dsRNA expression system of the present invention when the vector or the like is maintained includes an antisense RNA and a sense RNA from the same vector and an antisense RNA and a sense RNA, respectively. May be expressed.
  • a configuration in which antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector is a short RNA such as a polIII system upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA.
  • An antisense RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette linked with a promoter capable of expressing the RNA can be constructed, and these cassettes can be inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
  • RNA-encoding DNA double-stranded DNA
  • antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired
  • antisense RNA and sense RNA are passed from each strand on both sides.
  • a promoter is provided oppositely so that it can be expressed.
  • a terminator is attached to the 3 'end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand) in order to avoid adding an extra sequence downstream of the sense RNA and antisense RNA.
  • this terminator a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used.
  • a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII system is linked upstream of the antisense code DNA and the sense code DNA, respectively.
  • An antisense RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette can be constructed, and these cassettes can be held in different vectors.
  • siRNA may be used as dsRNA.
  • siRNAj means a double-stranded RNA having a short-strength strength in a range that does not show toxicity in cells, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21
  • the length of the final double-stranded RNA portion when the expressed siRNA is transcribed can be, for example, 15-49 base pairs, preferably 15-35 base pairs, More preferably, it can be 21 to 30 base pairs.
  • the DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of sequence homology. Have sex.
  • the unpaired portion may be contained due to mismatch (the corresponding base is not complementary), bulge (there is no base corresponding to one strand), or the like.
  • both bulges and mismatches may be contained in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for the purpose of site-specific cleavage of RNA. Some ribozymes have a group I intron type or a force hammerhead type or hairpin type having an active domain of about 40 nucleotides such as M1RNA contained in RNaseP having a size of 400 nucleotides or more.
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves on the 3 'side of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to base pair with A at position 9 for activity. It has been shown that the base of can be cleaved by A or U in addition to C.
  • the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, a restriction enzyme-like RNA cleavage ribozyme that recognizes the UC, UU or UA and ⁇ ⁇ sequences in the target RNA is created. It is possible. For example, there are a plurality of sites that can be targets in the coding region of the enzyme of the present invention that is an inhibition target.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin-type ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot wingless (J.M.Buzayan Nature 323: 349, 1986). This ribozyme has also been shown to be designed to cause target-specific RNA cleavage.
  • Ribozymes designed to cleave targets are linked to promoters such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and transcription termination sequences so that they are transcribed in plant cells.
  • promoters such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and transcription termination sequences so that they are transcribed in plant cells.
  • ribozyme activity may be lost if extra sequences are added to the 5 'or 3' end of the transcribed RNA.
  • another trimming ribozyme that acts as a cis for trimming is provided on the 5 ′ side or 3 ′ side of the ribozyme part.
  • treatment refers to the disappearance or reduction of HCV, the suppression of further spread of HCV, or the infection of HCV by administering the drug of the present invention to a subject. Means alleviation of symptoms.
  • Symptoms caused by HCV infection preferably include hepatitis C, cirrhosis, liver fibrosis, and liver cancer.
  • the compound of the present invention can be used in medicine as it is or as a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the salt is not particularly limited as long as it is pharmacologically acceptable.
  • salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid; acetic acid, tartaric acid, lactic acid , Succinic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, salt with organic acid such as camphorsulfonic acid; sodium, potassium, calcium, etc.
  • salts with alkali metals or alkaline earth metals such as camphorsulfonic acid; sodium, potassium, calcium, etc.
  • the amount of the active ingredient-compound contained in the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is a force appropriately selected within a wide range. For example, 0.1 to 99.5 wt%, preferably 0.5 to 90 wt% %.
  • the compound of the present invention is used as a main agent according to a conventional method, and pharmaceutical preparation technical fields such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, etc.
  • pharmaceutical preparation technical fields such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, etc.
  • it can be formulated using known adjuvants that can be usually used.
  • conventionally known carriers can be widely used as carriers, such as lactose, sucrose, sodium salt sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, and key acids.
  • Excipients such as water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, binders such as carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polybutylpyrrolidone; dry starch, sodium alginate Disintegrants such as lithium, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose; white sugar, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, etc.
  • binders such as carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polybutylpyrrolidone
  • dry starch sodium alginate Disintegrants such as lithium, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stea
  • Disintegration inhibitors such as sodium lauryl sulfate; humectants such as glycerin and starch; adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal carboxylic acid; purified talc And lubricants such as stearate, boric acid powder, and polyethylene glycol.
  • absorption promoters such as sodium lauryl sulfate
  • humectants such as glycerin and starch
  • adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal carboxylic acid
  • purified talc And lubricants such as stearate, boric acid powder, and polyethylene glycol.
  • the tablets can be made into tablets with ordinary coatings, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets or double tablets, and multilayer tablets as necessary.
  • those conventionally known in this field can be widely used as a carrier.
  • excipients such as glucose, lactose, cocoa butter, starch, hydrogenated vegetable oil, kaolin, and tar
  • binders such as tragacanth powder, gelatin and ethanol
  • disintegrants such as laminaran agar.
  • conventionally known carriers can be widely used as carriers, such as polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, higher alcohol esters, gelatin, semi-synthetic glycerides and the like. it can.
  • solutions and suspensions should be sterilized and used as diluents in the form of these solutions, emulsions and suspensions, which are preferably isotonic with blood. Any of those commonly used in this field can be used, and examples thereof include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • a sufficient amount of sodium chloride, glucose, or glycerin to prepare an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and a normal solubilizing agent, buffering agent, soothing agent may be used.
  • An agent or the like may be added.
  • it may contain colorants, preservatives, fragrances, flavors, sweeteners, and other medicines as necessary.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered in a dosage unit form, such as oral administration, tissue administration (subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, etc.), local administration (transdermal administration, etc.) Can be administered rectally.
  • a dosage unit form such as oral administration, tissue administration (subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, etc.), local administration (transdermal administration, etc.) Can be administered rectally.
  • the pharmaceutical composition is an agent suitable for these administration methods. Of course, it is administered in a mold.
  • the dose as an antiviral agent is determined by the patient's condition such as age and weight, administration route, nature and degree of the disease.
  • the amount of the active ingredient of the present invention is 0.1 to 2000 mg per day for adults. In some cases, doses below the above range may be sufficient. Conversely, doses exceeding the above range may be required. When administering a large amount, it is desirable to divide the dose into several times a day.
  • the above oral administration can be carried out in solid, powder or liquid dosage units, for example, powders, powders, tablets, dragees, capsules, drops, sublinguals, other dosage forms, etc. I can.
  • the intra-tissue administration can be performed, for example, by using a liquid dosage unit form for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection such as a solution or suspension. These are obtained by suspending or dissolving a certain amount of a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof in a non-toxic liquid carrier suitable for injection purposes such as an aqueous or oily medium, and the like. Manufactured by sterilizing the above suspension or solution.
  • the topical administration can be carried out by using a form of external preparation such as a liquid, cream, powder, paste, gel, ointment and the like.
  • a form of external preparation such as a liquid, cream, powder, paste, gel, ointment and the like.
  • These compounds can be used to convert a certain amount of the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof into a fragrance, a colorant, a filler, a surfactant, a moisturizer, an emollient, a gelling agent that is suitable for the purpose of external preparation.
  • a form of external preparation such as a liquid, cream, powder, paste, gel, ointment and the like.
  • These compounds can be used to convert a certain amount of the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof into a fragrance, a colorant, a filler, a surfactant, a moisturizer, an emollient, a gelling agent that is suitable for the purpose of external preparation.
  • the above-mentioned rectal administration is carried out by subjecting a certain amount of the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for example, higher esters such as palmitic acid myristyl ester, polyethylene glycol, cocoa butter, and mixtures thereof. It can be carried out using a suppository mixed in a low-melting-point solid that has the same power.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof for example, higher esters such as palmitic acid myristyl ester, polyethylene glycol, cocoa butter, and mixtures thereof. It can be carried out using a suppository mixed in a low-melting-point solid that has the same power.
  • the administration can be carried out by using a liquid dosage unit form for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection such as a solution or suspension. These are used for determining a certain amount of the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof such as an aqueous or oily medium. Manufactured by suspending or dissolving in a non-toxic liquid carrier suitable for injection purposes and then sterilizing the suspension or solution.
  • the present invention relates to a serine palmitolyltransferase inhibitor comprising a compound represented by formula (I) or a derivative thereof.
  • the present invention also relates to a serine normitoyltransferase inhibitor comprising a compound represented by the formula (II) or a derivative thereof.
  • the inhibitor is not only used as a drug for preventing or treating HCV infection.
  • Diseases caused by abnormal sphingolipid synthesis for example, sphingolipidosis, Argno-Ima disease involving beta-amyloid protein with an ingolipid binding motif, increased ceramide in spinal motor neurons L # Amyotrophic lateral sclerosis causing transcellular death (Cutler, RG, et al., Ann. Neurol, 52, 448-457, 2002), HIV infections involving gpl20 protein, and prion diseases involving PrP protein, viral infections that bind rafts and infect host cells (eg influenza, HIV ) And other useful preventive or therapeutic agents.
  • sphingolipidosis Argno-Ima disease involving beta-amyloid protein with an ingolipid binding motif
  • increased ceramide in spinal motor neurons L # Amyotrophic lateral sclerosis causing transcellular death (Cutler, RG, et al., Ann. Neurol, 52, 448-457,
  • the present invention relates to a method for screening a drug for treating or preventing HCV infection.
  • a test compound is brought into contact with an enzyme involved in the biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA.
  • Enzyme involved in biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA in the screening method of the present invention refers to serine palmitoyl transfer. Examples include enzymes, 3-ketodihydrosphingosine reductase, dihydrosphingosine mono-N-sacyltransferase, dihydroceramide desaturase, and sphingomyelin synthase.
  • the origin of these enzymes is not particularly limited. For example, these enzymes may be derived from yeasts or mammals including humans.
  • the state of the biosynthetic enzyme used in the first embodiment is not particularly limited, for example, it may be a purified state, a state expressed in a cell, a state expressed in a cell extract, or the like. Good.
  • the cell expressing the biosynthetic enzyme include a cell expressing an endogenous biosynthetic enzyme or a cell expressing an exogenous biosynthetic enzyme.
  • Examples of cells that express a endogenous biosynthetic enzyme can include cultured cells, but are not limited thereto. For example, commercially available cells can be used as the cultured cells.
  • the cell expressing the exogenous biosynthetic enzyme can be prepared, for example, by introducing a vector containing DNA encoding the biosynthetic enzyme into the cell. Introduction of the vector into the cells can be carried out by a general method, for example, phosphoric acid precipitation method, electric pulse perforation method, ribophetamine method, microinjection method and the like.
  • the biological species from which the cells into which such exogenous biosynthetic enzymes are introduced are not limited to mammals, and any biological species that has established a technique for expressing foreign proteins in cells can be used. ,.
  • Examples of cell extracts expressing biosynthetic enzymes include cells obtained by adding a vector containing DNA encoding biosynthetic enzymes to cell extracts contained in an in vitro transcription / translation system. .
  • the in vitro transcription / translation system it is possible to use a commercially available in vitro transcription / translation kit without particular limitation.
  • test compound in the method of the present invention is not particularly limited, for example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, single compounds such as peptides, and compound libraries. Gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentation microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts or animal cell extracts, etc. Can be mentioned.
  • the above test compound can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • the “plurality of test compounds” is not particularly limited. For example, in addition to the above test compounds, a mixture of a plurality of these test compounds is also included.
  • “contact” is performed according to the state of the biosynthetic enzyme.
  • the biosynthetic enzyme if it is in a purified state, it can be carried out by adding a test compound to the purified sample.
  • it is a state expressed in a cell or a state expressed in a cell extract, it can be carried out by adding a test compound to the cell culture solution or the cell extract, respectively.
  • the cell in the present invention is not particularly limited, but a cell derived from a mammal including yeast or human is preferable.
  • test compound is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell in which a biosynthetic enzyme is expressed, or the vector is expressed by a biosynthetic enzyme! It can also be done by adding to the cell extract. Further, for example, a 2-node or hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the binding between the biosynthetic enzyme and the test compound is then detected.
  • the means for detecting or measuring the binding between the proteins can be performed, for example, by using a label attached to the protein.
  • the type of label include a fluorescent label and a radiolabel.
  • it can also be measured by a known method such as an enzyme two-hybrid method or a measurement method using BIACORE.
  • a test compound bound to the biosynthetic enzyme is then selected.
  • the selected test compounds include drugs for treating or preventing HCV infection.
  • a test compound is contacted with a cell holding an enzyme involved in the biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA.
  • biosynthetic enzyme and “test compound” and “contact” are as described above.
  • the amount of the compound synthesized from palmitoyl CoA in the biosynthesis process of sphingomyelin is measured in the following manner.
  • a compound to be synthesized it is possible to include intermediate products such as 3-ketodihydrosphingosine, dihydrosphingosine, dihydroceramide, ceramide, etc. More preferably, the final product, sphingomyelin can be mentioned.
  • the quantification of the synthesized compound can be measured by a known method such as GC-MS method, MS-MS method, LC-MS method.
  • the quantification can also be performed by quantifying the phosphoric acid in the phospholipid.
  • the test compound is then used to treat or prevent HCV infection when the amount of the synthesized compound is reduced compared to when the test compound is not contacted. Select as a drug.
  • test compound is contacted with a cell holding an enzyme involved in the biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA.
  • biosynthetic enzyme and test compound and contact are as described above.
  • the expression level of an enzyme involved in the biosynthesis process of sphingomyelin is then measured from palmitoyl CoA.
  • the expression level of the biosynthetic enzyme can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, the mRNA level of the biosynthetic enzyme is extracted according to a standard method, and the transcription level of the gene is measured by carrying out the Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA as a saddle type. Can do. Furthermore, the expression level of the biosynthetic enzyme can be measured using DNA array technology.
  • the fraction containing the biosynthetic enzyme is collected according to a standard method, and the expression level of the biosynthetic enzyme is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE to measure the translation level of the gene. You can also. It is also possible to measure the translation level of a gene by performing Western blotting using an antibody against the biosynthetic enzyme and detecting the expression of the biosynthetic enzyme.
  • the antibody used for detection of the biosynthetic enzyme is not particularly limited as long as it is a detectable antibody.
  • a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • the antibody can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. A recombinant protein expressed in a microorganism such as Escherichia coli or a partial peptide thereof as a fusion protein with the biosynthetic enzyme or GST is immunized to a small animal such as a rabbit and serum is obtained.
  • This is prepared by, for example, purifying with ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with the biosynthetic enzyme or synthetic peptide, or the like.
  • a monoclonal antibody for example, the biosynthetic enzyme or a partial peptide thereof is immunized to a small animal such as a mouse, the spleen is removed from the mouse, and this is ground to separate the cells.
  • a mouse myeloma cell is fused with a reagent such as polyethylene glycol, and a clone producing an antibody that binds to the biosynthetic enzyme is selected from the resulting fusion cells (hybridoma).
  • the resulting monoclonal antibody is purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, affinity column coupled with the biosynthetic enzyme or synthetic peptide, or the like.
  • Ammonium sulfate precipitation protein A
  • protein G column DEAE ion exchange chromatography
  • affinity column coupled with the biosynthetic enzyme or synthetic peptide, or the like.
  • the test compound when the expression level of the biosynthetic enzyme is decreased compared to when the test compound is not contacted, the test compound is treated or prevented for HCV infection. Select as a drug for.
  • a cell or a cell extract having DNA to which a reporter gene is functionally linked downstream of the promoter region of the biosynthetic enzyme is provided.
  • operably linked means that the biosynthetic enzyme promoter is such that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the biosynthetic enzyme. The region and the reporter gene are bound together. Therefore, even when the reporter gene is linked to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor must bind to the promoter region of the biosynthetic enzyme. Therefore, any expression that induces the expression of the fusion protein is included in the meaning of “functionally linked”.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression is detectable.
  • a CAT gene for example, a lacZ gene, a luciferase gene, a / 3-Darc mouth that is commonly used by those skilled in the art.
  • -Dase gene (GUS) and GFP gene are examples of the test compound.
  • the test compound is then brought into contact with the cells or the cell extract.
  • the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract is measured. The description of “test compound” and “contact” is as described above.
  • the expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the acetyl chloride of chloramphee-coal by the gene product.
  • the one-ter gene is a lacZ gene
  • the fluorescent compound by the catalytic action of the gene expression product
  • the fluorescent compound by the catalytic action of the gene expression product
  • the reporter gene by detecting the coloration of the mouth-3-indolyl-13-dalk mouth (X-Glue) and, in the case of the GFP gene, the fluorescence of the GFP protein The level can be measured.
  • the test compound is used for treating or preventing HCV infection when the expression level of the reporter gene is decreased compared to when the test compound is not contacted.
  • Select as a drug is used for treating or preventing HCV infection when the expression level of the reporter gene is decreased compared to when the test compound is not contacted.
  • test compound is brought into contact with an enzyme involved in biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA.
  • an enzyme involved in biosynthesis of sphingomyelin from palmitoyl CoA The description of the biosynthetic enzyme and the “test compound” and “contact” are as described above.
  • the activity of the biosynthetic enzyme is measured as follows.
  • Biosynthetic enzyme activity can be measured by a known method for each enzyme.
  • an activity measurement method is used in which the difference in spectroscopic properties between the substrate and the product is used to measure the change over time. (Amino acid residue, coenzyme, etc.) may be selected as a method for more directly measuring the enzymatic reaction using the stop flow method or various relaxation methods. Examples of spectroscopic methods used for measuring activity include absorption, fluorescence, CD, NMR, ESR, IR, and Raman.
  • the test compound is then selected as an agent for treating or preventing HCV infection when the activity of the biosynthetic enzyme is reduced compared to when the test compound is not contacted. .
  • the present invention relates to a kit for use in the five screening methods described above.
  • kits may include those used in the detection and measurement steps of the five screening methods described above.
  • palmitoyl CoA force Probes for example, palmitoyl CoA force Probes, primers, anti-antigens required to measure the expression level of enzymes involved in the biosynthesis of sphingomyelin Body, staining solution, and the like.
  • distilled water, salt, buffer solution, protein stabilizer, preservative and the like may be contained.
  • Example 1 Measurement of HCV RNA replication inhibitory activity of a compound represented by the formula (II) derived from microorganisms such as Myriocin or Aureobasidium by Northern blot analysis
  • Myriocin or a compound represented by the following formula (II) was given to replicon cells Huh-3-l in the range of ⁇ to lOOuM, and cultured at 37 ° C in the presence of 5% CO.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Phosphate solution 50 mM Tris—HCl (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na VO, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin
  • Pipette 50 mM Tris—HCl (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na VO, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin
  • the electrophoresed protein was transferred to a membrane (PROTRAN BA85, Nitrocellulose transfer membrane (Shleicher & Schue 11 # 10401196) in a mini-trans blot cell (BIO-RAD # l 70-3930) using an anti-NS3 Usagi antibody derived from HCV protein.
  • Western analysis was performed using anti-actin heron antibody as an internal standard, and as a result, the compound represented by myriocin and formula (II) was found to have an effect of reducing HCV protein expression by 50% at a concentration of 1-lOnM. (Figs. 4 and 5).
  • HCV replicon inhibitory activity of fumonisin B1 which specifically inhibits dihydrosphingosine synthase, which produces dihydrosphingosine, a dihydroceramide, was measured.
  • Firefly luciferase HCV replicon cells (Huh-3-1) were suspended in Dulbecco's MEM (G3 ⁇ 4co cat. No. 10569) containing 5% urine fetal serum (Hyclone cat. No. SH30071.03). The well plate was seeded with 5000 cells ZWell and cultured overnight at 37 ° C with 5% CO. About 20 hours later
  • Thin B1 was diluted three-fold in order, and adjusted to a final concentration of 1.37 uM to lOOOOuM, and further cultured for 3 days. Two assembly plates were prepared, one for the white plate and the other for the clear plate. After completion of the culture, the white plate was used for Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega cat. No. E2520). That is, 100 ⁇ l of reagent was added per well, mixed 3-4 times with a pipette, allowed to stand for 5 minutes, and then luminescence was measured with 1450 MicroBeta TRILUX (WALLAC).
  • WALLAC MicroBeta TRILUX
  • the IC50 (50% inhibitory concentration) of the drug was calculated by subtracting all values from the value with no cell added as the background and the value with no drug added as 0% inhibition.
  • Cell's Count Kit 8 (DOJIN Laboratories, cat.No.341-07771) was put in 10 ⁇ l per well, mixed 3-4 times with a pipette, and left at OD450nm power of about 1.0 after being left for about 30 minutes. It measured when it became.
  • the IC50 (50% inhibitory concentration) of the drug was calculated by subtracting all values from the value with no added cells as the background and the value with no drug added as 0% inhibition.
  • fumosin B1 exhibits HCV replicon inhibitory activity at a concentration of 10-lOOOOM (Fig. 6).
  • LCB1 SPT SiRNA targeting 1 subunit of the heterodimer was synthesized.
  • Two specific siRNAs (si246, si633) were designed based on the LCBlcDNA sequence (GenBank Accession No. Y08685) and synthesized by Qiagen.
  • SEQ ID NO: 3 As a control siRNA (SEQ ID NO: 3), a sequence that does not affect the expression of LC B1 was used.
  • the synthesized siRNA sequences are shown in SEQ ID NO: 1 (si246) and SEQ ID NO: 2.
  • 1.2 ⁇ 10 5 Huh-3-l cells were seeded in a 6-well plate and cultured at 37 ° C. and 5%.
  • the siRNA was culled to a final concentration of 35 nM and cultured for 4 days.
  • Cell lysis buffer 50 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 1 50 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na ⁇ O ⁇ , 0.5 (MmPMSF, 0.5 mM aporotinin) and left on ice for 10 minutes. The supernatant was collected by centrifugation at 15,000 X g for 10 minutes.
  • Example 5 Based on the results of Example 5, the effects of cell toxicity and HCV levulincon activity under conditions where Huh-3-l cells decrease LCB1 expression were measured by the following methods. That is, 3500 cells per well were seeded in a 96-well plate and cultured at 37 ° C and 5%. Add 1.75 L of 2 M 3 « ⁇ to 23.3 ⁇ L of ECR buffer (buffered in RNAiFect Kit), mix vigorously, and add 0.31 ⁇ L of RNAiFect transfection reagent gently. And allowed to stand at room temperature for 10 minutes. siRNA was added to a final concentration of 35 nM and cultured for 4 days.
  • the cells treated with si246 and si633 that suppressed the expression of LCB1 significantly inhibited the HCV replicon activity compared to the cells treated with control siRNA.
  • This inhibitory effect was strongly observed with si246, which strongly suppressed the expression of LCB1.
  • the cytotoxicity of siRNA treatment was examined. Almost no effect was observed.
  • the HCV replicon assay and cytotoxicity test were conducted on the compounds represented by formula (I) or their derivatives.
  • HCV-RNA in which a firefly-derived luciferase gene was introduced as a reporter gene was constructed.
  • Krieger et al. J. According to the method of Virol. 75: 4614
  • the luciferase gene was introduced in the form of fusing with the neomycin resistance gene directly under the IRES (Internal Ribosome Entry Site) of the HCV gene.
  • the RNA was synthesized in vitro, then introduced into Huh7 cells by the electopore method, and isolated as a G418 metaclone.
  • Firefly 'Luciferase HCV replicon cells (Huh-3-l) were suspended in Dulbecco's MEM (Gibco cat. No. 10569-010) containing 5% urine fetal serum (Hyclone cat. No. SH30071.03). Seed the well plate with 5000 cells Zwell, 5% CO
  • Cell counting kit-8 (Dojindo catalog No. CK04) was used for the measurement of cytotoxicity. That is, 10 1 Cell counting kit-8 was added to a clear plate and incubated at 37 degrees for 30-60 minutes. Absorbance was measured with a 96-well plate reader at a wavelength of 450 and a control wavelength of 630 nm. All values were subtracted from the value with no cell added, and the CC (50% cell inhibitory concentration) of the drug was calculated with the value without drug added as 0% inhibition.
  • Example 8 Inhibition of HCV levulincon by a compound represented by formula (II) and toxicity to host cells
  • HCV replicon cells were treated with the compound represented by the formula (II) at the concentration shown in FIG. 9, and the replicon replication inhibitory activity and cell survival inhibitory activity were measured.
  • Lebricon's Le, Nofev ' ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 "' Sex ⁇ MA Steady— GLO luciferase assay system Promega, cat. No. E2510) No.3 41-07761
  • HCV replicon cells were treated with 100 nM of the compound represented by formula (II) for 96 hours, and then the cells were fixed with 3.7% formaldehyde. After blocking with 3% BSA and incubating with NS3 antibody (provided by F. Hoffman Laroche), the washed cells were incubated with Texas-Red labeled Usagi IgG (Molecular probe) and analyzed with a fluorescence microscope (Fig. Ten). As a result, as shown in Fig. 10, the HCV-NS3 protein disappeared due to the addition of the compound represented by the force formula (II) present around the nucleus (the part shown in white is the NS3 protein). The part shown in gray shows the nucleus stained with Hoechst 33342 (Sigma, cat. No. B2261).)
  • Replicon cells were treated with 100 nM of the compound represented by formula (II) for the times shown in FIG. 11 (48 hours and 96 hours).
  • the Western plot analysis was performed in the same manner as in Example 5.
  • the non-structural proteins NS3, NS5A, and NS5B of HCV were detected with each antibody in a time-dependent manner.
  • LCBl and LCB2 cDNAs were obtained from human liver cDNA library (Clontech, cat. No. 639307) by RT-PCR, and His-tagged pBudCE4.1 vector (Invitogen, cat. No. V532-20) ).
  • the gene was introduced into HEK293 cells (ATCC, cat. No. CRL-1573). After 72 hours, the cells were lysed, and the protein was purified with N ⁇ NTA agarose (Qiagen, cat. No. 1018244).
  • SPT activity is reaction buffer [200 mM HEPES buffer (pH 8.0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.05 mM pyridoxal 5 -phosphate, 0.2 mM palmitoy CoA, 0.1 mM L-serine, and 1 mCi [3 H] Serine (Amer sham, cat. no. TRK308)] was added and the reaction was allowed to proceed at 37 ° C for 15 minutes. After extraction with black mouth form: methanol (1: 2, v / v), the organic layer was re-extracted twice with water, and then the radioactivity of the organic layer was measured with a liquid scintillation counter. As a result, as shown in Figure 12, It was revealed that the compound represented by the formula (II) has an SPT inhibitory activity with an IC50 of about 10 nM.
  • HCV replicon cells were treated with the compound represented by formula (II) at the concentration shown in FIG. 13 for 48 hours, and then labeled with [14C] serine for 3 hours. After extraction with black mouth form: methanol (1: 2, v / v), de novo synthesized ceramide (FIG. 13A) and sphingomyelin (FIG. 13B) were separated by thin layer chromatography. As a result, as shown in FIG. 13, the compound represented by the formula (II) inhibited de novo synthesis of intracellular ceramide and sphingomyelin in a concentration-dependent manner.
  • HCV replicon cells were separated from the known SPT inhibitor myriocin (Sigma, cat. No. M1177), ceramide synthesis inhibitor fumosin Bl (Sigma, cat. No. F1147), and ceramide transport inhibitor H PA-12 [ After treatment with Kobayashi et al., Org.lett. (2002), the levulincon activity and viable cell count were measured 72 hours later. As a result, none of the compounds showed cytotoxicity, and the effect of suppressing HCV replication at a concentration was observed (FIG. 15).
  • ImM compound (II) represented by the formula (II) was added to HCV replicon cells for 72 hours, and then the cell extract was treated with 1% NP-40 for 1 hour. Raft proteins (solubilizing agent resistance) and non-raft proteins were separated by sucrose density gradient fractionation, diluted with PBS, concentrated and quantified by ELISA analysis. As a result, the compound represented by the formula (II) was significantly dissociated from the raft in NS5B (FIG. 17).
  • sphingolipid biosynthesis is involved in HCV infection, and a compound that inhibits the activity and expression of an enzyme involved in sphingolipid biosynthesis is an extremely useful therapeutic agent for HCV infection or I was able to become a prophylactic agent.
  • Sphingomyelin a sphingolipid, is a component of rafts on cell membranes, and viruses such as influenza and HIV are replicated via rafts (Takeda M. et al. (2003) PNAS, 100, 25, Lucero HA, et al. (2004) Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208, Simons
  • a drug containing the compound of the present invention targeting rafts as an active ingredient may be used as a drug for preventing or treating HCV infection.
  • the drug of the present invention can be used as a drug for preventing or treating HCV infection. It is a disease caused by abnormal sphingolipid synthesis, for example, a disease in which lipid (sphingomyelin) accumulates abnormally.
  • lipid sphingomyelin
  • viral infections eg influenza, HIV

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Abstract

　本願発明者らは、オーレオバシディウム（Aureobasidium）属などの微生物に由来する化合物、ミリオシン、フモニシンB1、およびセラミド輸送阻害剤HPA-12について、HCVレプリコン阻害活性の検討を行ったところ、これらの化合物はHCVレプリコンRNA の複製またはHCVタンパク質の発現を阻害する効果を持つことが認められた。さらに本願発明者らは、siRNAを用いたセリンパルミトイル転移酵素のノックダウン実験を行い、その結果、LCB1の発現を抑制した細胞では、有意にHCVレプリコン活性及びHCVタンパク質発現が阻害され、スフィンゴ脂質生合成がHCV感染に関与することがわかった。このことより、スフィンゴ脂質生合成過程に存在する酵素活性を、化合物の添加や遺伝子のノックダウンにより阻害することによって、HCV感染症の治療または予防を行うことが出来ることを明らかにした。

Description

HCV感染症を治療または予防するための薬剤
技術分野
[0001] 本発明は、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含 有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。また、 HCV感染症 を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるため のキットに関する。
背景技術
[0002] HCVの感染者は世界で 1〜2億人、日本国内では 200万人以上と推測されている 。これらの患者の約 50%が慢性肝炎に移行しそのうち約 20%が感染後 30年以上た つて肝硬変、肝癌となる。肝癌の約 90%の原因が C型肝炎といわれている。 日本国 内では、毎年 2万人以上の患者が HCV感染に伴う肝癌により死亡している。
[0003] HCVは 1989年に輸血後の非 A非 B型肝炎の主要な原因ウィルスとして発見され た。 HCVはエンベロープを有する RNAウィルスであり、そのゲノムは 1本鎖（ + )RN Aからなり、フラビウィルス科のへパチウィルス（Hepacivirus)属に分類される。
[0004] HCVは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機 構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多ぐ慢性肝炎、 肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のた め肝癌が再発する患者が多 、ことも知られて 、る。
[0005] よって、 C型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤に より炎症を抑える対処療法とは別に、患部である肝臓において HCVを減らすあるい は根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。
[0006] 現在、 HCV排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン治療が知られてい る。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の 1Z3程度である。特に HCV ゲノタイプ lbに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフエ ロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗 HCV薬の開発が強く望まれている。
[0007] 近年、リバビリン（Ribavirin: 1— β— D—リボフラノシル一 1Η— 1, 2, 4—トリァゾー ルー 3—カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用による C型肝炎治療薬として巿 販されているが、有効率は依然低ぐ更なる新規な C型肝炎治療薬が望まれている。 また、インターフェロンァゴニスト、インターロイキン 12ァゴニストなど、唐、者の免疫 力を増強させることによってウィルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効 とされる薬剤は見出されていない。
[0008] HCV遺伝子がクローユングされて以来、ウィルス遺伝子の機構と機能、各ウィルス のタンパク質の機能などにっ 、ての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト 細胞内でのウィルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明され ておらず、信頼できる培養細胞を用いた HCV感染実験系は構築されて 、な力つた。 従って従来、抗 HCV薬の評価をするにあたり他の近縁ウィルスを用いた代替ウィル スアツセィ法を用いなければならな力つた。
[0009] しカゝし近年、 HCVの非構造領域部分を用いてインビトロでの HCV複製を観測する ことが可能になったことにより、レブリコンアツセィ法によって抗 HCV薬を容易に評価 することができるようになった (非特許文献 1)。この系での HCV RNA複製のメカ- ズムは、肝細胞に感染した全長 HCV RNAゲノムの複製と同一であると考えられて いる。従って、この系は、 HCVの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づ くアツセィ系ということができる。
[0010] 尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
特許文献 1：国際公開公報 W098Z56755号パンフレット
特許文献 2：特願 2003-34056
特許文献 3：特願 2003-272420
非特許文献 1 :ブイ'ローマンなど著、サイエンス（Science) , 1999年、第 285卷、第 1 10— 113頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本願発明者らは、国際公開公報 W098Z56755号 (特許文献 1)に開示されてお り、オーレォバシディウム（Aureobasidium)属などの微生物に由来する一連の化合物 力 上記レブリコンアツセィ法で高い HCVの複製阻害活性を有することを見出した（ 特許文献 2)。また本願発明者らは、該化合物がインビトロの細胞毒性については軽 微であり、 HCV感染症の予防剤または治療剤として極めて有用であることを見出し、 さらに該化合物および誘導体の合成方法を構築した (特許文献 3)。これら阻害剤は HCV感染症の治療薬となる可能性が高いと考えられる。しかし、 HCVが生体内にど のような異常を引き起こしているの力、また、これらの一連の化合物はどのような生体 内反応を阻害するかについてはこれまで解明されておらず、該化合物を薬剤として 使用した時の挙動が懸念されていた。また、該化合物を医薬品として使用する上で、 該化合物が生体内のどのようなカスケードに関与し、抗 HCV複製阻害活性を引き起 こすのかについての解明が求められていた。
[0012] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、オーレォバシ ディウム (Aureobasidium)属などの微生物に由来する一連の化合物およびそれらの 誘導体が、生体内のどのようなカスケードに関与し、抗 HCV複製阻害活性を引き起 こすのかについて解明することにある。また、該化合物の阻害するカスケードを特定 することで、それらのカスケードを遮断する化合物を有効成分として含有する、 HCV 感染症を治療または予防するための薬剤を提供する。さらに、 HCV感染および抗 H CV複製阻害活性のメカニズムを解明することで、 HCV感染症を治療または予防する ための薬剤のスクリーニング方法、およびこれらに用いるためのキットを提供する。 課題を解決するための手段
[0013] 上記課題を解決するために、まず本願発明者らはオーレォバシディウム (Aureobasi di醒)属などの微生物に由来する化合物の一つである以下の式 (II)で表される化合 物と、該化合物に部分的に類似した構造を持つミリオシンについて、 HCVレブリコン アツセィを行った。
[0014] 式（Π) :
Figure imgf000005_0001
[0015] ミリオシンはスフインゴ脂質生合成（図 1)の初段階で、セリンとパルミトイル CoAを縮 合させて、 3-ケトジヒドロスフインゴシンを生成するセリンパルミトイル転移酵素（SPT) を特異的に阻害する化合物であり（Zweerink, M. M., Edison, A., M., Wells, G. B.， P into, W" Lester, R. L" J. Biol. Chem., 267, 25032—25038 (1992)、スフインゴ脂質 生合成全体を停止させる活性を持つ。
[0016] 式（II)で表される化合物またはミリオシンを ΙρΜから 100 μ Μの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、培養し全 RNAを抽出した後で、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブ としてノザン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式 (Π)で表される化合物にト 10 ηΜの濃度でレプリコン RNAを 50%減少させる効果が認められた（図 2、 3)。さらに、ミリ ォシン又は式（II)で表される化合物を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3 -1に与え、培養しタンパク質を回収した後、 HCVタンパク由来の抗 NS3ゥサギ抗体を 用いてウェスタン解析を行った。その結果、ミリオシン及び式 (Π)で表される化合物に 1-lOnMの濃度で HCVタンパク質の発現を 50%減少させる効果が認められた（図 4、 5)
[0017] 次に、スフインゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフインゴシン力 ジヒド 口セラミドを生成するジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害す るフモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性を測定した。フモ-シン B1を 1.37uMから 10 00uMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、培養した後に、ルミネッセンス測定を 行った。その結果、フモ-シン B1は 10-lOOOuMの濃度で、 HCVレプリコン阻害活性を 示すことが明らかになった（図 6)。
[0018] 以上の結果より、セリンパルミトイル転移酵素 (SPT)を特異的に阻害する化合物ミリ ォシンおよびジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害するフモ 二シン Blは、抗 HCV複製阻害活性を持ち、スフインゴ脂質合成が HCV感染に関与し ていることが示唆された。そこで、本発明者らは、スフインゴ脂質生合成の一つの過 程を触媒するセリンパルミトイル転移酵素の阻害力 HCVレブリコン活性の阻害と直 接関与しているかを確認するために、 siRNAを用いたセリンパルミトイル転移酵素のノ ックダウン実験を行った。まず、セリンパルミトイル転移酵素のへテロダイマーのうち 1 サブユニット LCB1を標的として、 2種の特異的な siRNA(si246、 si633)を合成した。ゥ エスタンブロット解析を用いて siRNAによる LCB1の発現阻害を測定したところ、コント ロール siRNAと比較して、 2種類の siRNAで共に発現阻害を示し、 si246では特に強い 発現阻害が認められた（図 7)。
[0019] さらに、 LCB1を siRNAによりノックダウンして、 HCVレプリコン阻害活性を測定した。
具体的には、 LCB1発現を低下させた条件下で、 Huh-3-l細胞における細胞毒性及 び HCVレプリコン活性の影響を測定した。その結果、 LCB1の発現を抑制した si246、 s i633処理した細胞では、コントロール siRNA処理した細胞に対し有意に HCVレプリコ ン活性を阻害し、特に LCB1の発現を強く抑制した si246で阻害効果が強く認められ た（図 8)。また、同条件下において siRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとん ど影響が認められな力つた。これらの結果より、スフインゴ脂質生合成が HCV感染に 関与することがわかり、該生合成過程に存在する酵素活性を阻害することによって、 HCV感染症の治療または予防を行うことが可能であると示唆された。
[0020] 次に、 HCVレプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で 96時間処理し、 H CV-NS3タンパク質の発現阻害を確認したところ、式 (Π)で表される化合物の添加に より核周辺の HCV-NS3タンパク質が消失した（図 10)。また、 HCVレプリコン細胞を 10 0 nMの式（II)で表される化合物で 48時間および 96時間処理し、ウェスタンブロット解 祈により、 HCVの非構造タンパク質 NS3,NS5A,および NS5Bの発現を確認したところ、 全てのタンパク質で発現の低下がみられた（図 11)。これらの結果により、式 (II)で表 される化合物力 HCVのウィルス複製に関与して 、る非構造タンパク質 NS3,NS5A,お よび NS5Bの発現を抑制させる効果を持つことが、明ら力となった。
[0021] 次に、ヒト組み換え SPT (ヘテロダイマー LCB1及び LCB2)タンパク質を調製し、式 (I I)で表される化合物の SPT阻害活性を測定したところ、式 (II)で表される化合物は IC5 0約 10 nMで SPT阻害活性を有していることが明ら力となった（図 12)。
[0022] 次に、 HCVレプリコン細胞を式（II)で表される化合物で 48時間処理し、 [14C]セリン で標識したところ、式 (II)で表される化合物が濃度依存的に細胞内のセラミド及びス フインゴミエリンの de novo合成を阻害することが明ら力となった（図 13)。また、細胞性 浸透性セラミド (C2—セラミド）を式 (II)で表される化合物と同時に HCVレブリコン細胞 に添加し培養したところ、式 (II)で表される化合物による HCV複製阻害は C2セラミド の濃度に依存して抑制された（図 14)。
[0023] 次に、 HCVレブリコン細胞を、既知の SPT阻害剤ミリオシン、セラミド合成阻害剤フモ 二シン Bl、及びセラミド輸送阻害剤 HPA-12で処理し、レブリコン活性および生細胞 数を測定したところ、 V、ずれの化合物も細胞毒性を認めな 、濃度で HCVの複製を抑 制することが明らかとなった（図 15)。
[0024] 次に、 HCVレプリコン細胞に 1 mMの式（II)で表される化合物を添カ卩し、ラフトタンパ ク質の発現を確認したところ、式 (Π)で表される化合物は可溶化剤耐性画分の NS5B のタンパク質発現を低下させた（図 16)。しかしながら、 NS5Aや宿主のラフト結合タン ノ ク質力べオリンー 2にお 、ては、式 (II)で表される化合物による影響は認められな かった。また、 HCVレプリコン細胞に 1 mMの式（II)で表される化合物を添カ卩し、ショ 糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質 (可溶化剤耐性)、非ラフトタンパク質を分 離したところ、 NS5Bにお 、て有意にラフト上力もの解離が認められた（図 17)。
[0025] 即ち、本発明者らは、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成 分として含有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤を開発することに 成功し、これにより本発明を完成するに至った。
これまで、 HCV遺伝子の機構と機能の解明が行われ、 HCVの非構造タンパク質を 標的とした HCV治療剤の開発が進められて 、たが、非構造タンパク質自体が複製の 過程で変異を起こす可能性があるため、効果的な治療剤の開発が困難であった。 本発明により、スフインゴミエリンの生合成が HCVの複製に関与することがわかり、ホ スト細胞内でのウィルスの複製のメカニズムが明ら力となった。本発明の知見は、スフ インゴミエリン生合成系を新規なホストターゲットとした抗 HCV剤の開発に大きく貢献 するものである。これまでの抗 HCV剤は、標的となるカスケードが不明確であり副作 用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的がスフインゴミエリン生合成系であり、よ り明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えら れる。また、本発明の抗 HCV剤は、 HCVのサブタイプや種々のタンパク質の変異によ らず、広く抗 HCVの作用を示す可能性がある。
本発明は、より具体的には、以下の（1)〜（23)を提供する。
(1)スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 H CV感染症を治療または予防するための薬剤。
(2)スフインゴミエリンの生合成過程力 パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生合 成過程である（1)に記載の薬剤。
(3)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。
(a)パルミトイル CoAから 3-ケトジヒドロスフインゴシンの生合成に関与する、セリンパ ルミトイル転移酵素 (SPT)の酵素活性を阻害する化合物
(b)セリンパルミトイル転移酵素（SPT)の発現を抑制する化合物
(4)セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、スフインゴファンギ ン、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体である、（3)に 記載の薬剤。
式 (I) :
Figure imgf000008_0001
〔式中、 Aは、 - (CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；
2 n
Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N
2 2
OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァ ルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換さ れて 、てもよ 、ァミノ基で置換されて 、てもよ 、）を表し；
Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子
2 m
、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、置換されていてもよい複素環 式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよいへテロアリール基、 OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしく は分岐鎖状のアルキ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル 基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し； Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH
2 p
基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖も しくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置 換されて 、てもよ 、複素環式基、または置換されて 、てもよ 、ヘテロァリール基を表 し；
結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして
及び R3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は 分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分 岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分 岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を 示す。〕
(5)セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、以下の式 (II)で表 される化合物またはそれらの誘導体である、 (3)に記載の薬剤。
式 (Π) :
Figure imgf000010_0001
(6)セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物力 以下の（a)または (b)で ある、 (3)に記載の薬剤。
(a)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA
(b)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリ ボザィム活性を有する RNA
(7)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。
(a)スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、 ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物
(b) (a)に記載のジヒドロスフインゴシン—N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合 物
(8)スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、 ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物が、フモ-シン B 1またはその誘導体である（7)に記載の薬剤。
(9)ジヒドロスフインゴシン N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合物力 以下の（ a)または (b)である、 (7)に記載の薬剤。
(a)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物と相補的 な RNA
(b)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物を特異 的に開裂するリボザィム活性を有する RNA
(10)以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、 (2)に記載の薬剤。
(a)セラミドからスフインゴミエリンの生合成に関与する、スフインゴミエリン合成酵素の 酵素活性を阻害する化合物 (b) (a)に記載のスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物
(11)スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（a)または (b) である、（10)に記載の薬剤。
(a)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA
(b)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボ ザィム活性を有する RNA
(12) HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（1)〜（11) のいずれか〖こ記載の薬剤。
(13)以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイ ル転移酵素阻害剤。
式 (I) :
Figure imgf000011_0001
〔式中、 Aは、 - (CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；
2 n
Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N
2 2
OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァ ルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換さ れて 、てもよ 、ァミノ基で置換されて 、てもよ 、）を表し；
Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子
2 m
、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、シクロアルケ-ル基、置換され ていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよい ヘテロァリール基、—OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状の アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ -ル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、または ハロゲン原子を表し；
Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH
2 p
基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖も しくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置 換されて 、てもよ 、複素環式基、または置換されて 、てもよ 、ヘテロァリール基を表 し；
結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして
及び R3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は 分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分 岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分 岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を 示す。〕
(14)以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンノルミトイ ル転移酵素阻害剤。
式 (Π) :
Figure imgf000012_0001
(15)ヒト由来のセリンパルミトイル転移酵素を阻害する、（13)または（14)に記載の 阻害剤。 (16)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤 のスクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程
(c) (a)に記載の酵素と結合する被検化合物を選択する工程
(17)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤 のスクリーニング方法。
(a)被検化合物を細胞に接触させる工程
(b)スフインゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、上記化合物の量を減少させた 被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
(18)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤 のスクリーニング方法。
(a)被検化合物を細胞に接触させる工程
(b)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させて!ヽな!ヽ場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少 させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
(19)以下の（a)〜（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬 剤のスクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素をコードする DNAのプロモーター 領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞 抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択 する工程。 (20)以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤 のスクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
(b)該スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検 化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
(21)スフインゴミエリンの生合成過程力 パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生 合成過程である（16)〜（20)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(22)パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素力 セリン パルミトイル転移酵素、 N—ァシル転移酵素およびスフインゴミエリン合成酵素である 、 (21)に記載のスクリーニング方法。
(23) HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、（16)〜（22 )のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(24) (16)〜（23)の 、ずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。 図面の簡単な説明
[図 1]スフインゴ脂質合成経路 (パルミトイル CoAからスフインゴミエリンまでの合成経 路)を示す図である。
[図 2]ノザンプロット解析によるミリオシンの HCV RNA複製阻害活性を示す写真であ る。横軸はミリオシンの濃度を表す。
[図 3]ノザンプロット解析による式 (II)で表される化合物の HCV RNA複製阻害活性を 示す写真である。横軸は式 (Π)で表される化合物の濃度を表す。
[図 4]ウェスタンプロット解析によるミリオシンの HCVタンパク合成阻害活性を示す写 真である。横軸はミリオシンの濃度を表す。
[図 5]ウェスタンプロット解析による式 (Π)で表される化合物の HCVタンパク合成阻害 活性を示す写真である。横軸は式 (II)で表される化合物の濃度を表す。
[図 6]フモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性を示す図である。
[図 7]siRNAによるセリンパルミトイル転移酵素（LCB1)のタンパク質発現阻害を示す 写真である。 [図 8]siRNAによる HCVレブリコン阻害活性および細胞毒性の影響を示す図である。
[図 9]式 (II)で表される化合物による HCVレブリコンの阻害及び宿主細胞への毒性を 示す図である。
[図 10]式 (II)で表される化合物による HCV-NS3タンパク質の発現阻害を示す写真で ある。免疫染色の後、蛍光顕微鏡にて観察した。白色は NS3タンパク質、灰色はへキ スト 33342で染色された核を示す。
[図 11]式（II)で表される化合物による NS3、 NS5A、および NS-5Bタンパク質の発現阻 害を示す図である。各タンパク質の発現は、ウェスタンプロット解析により行った。
[図 12]式 (II)で表される化合物による SPT阻害活性を示す図である。
[図 13]式 (II)で表される化合物によるセラミド、スフインゴミエリンの de novo合成阻害 を示す図である。
[図 14]C2—セラミドによる式 (II)で表される化合物の HCV複製阻害の抑制を示す図 である。
[図 15]ラフト生合成関連低分子化合物による HCV複製阻害を示す図である。
[図 16]式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。
[図 17]式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質への影響を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0028] 本発明は、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含 有する、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤に関する。
[0029] 本発明において、スフインゴミエリンの生合成過程としては、より好ましくはパルミトイ ル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程（図 1)を挙げることが出来る。
[0030] 本発明にお 、て、スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物とは、パルミト ィル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関わる生体内反応を、直接的もしくは 間接的に阻害するものであれば如何なる化合物であってもよ 、。スフインゴミエリンの 生合成過程に関わる酵素の活性を阻害する化合物、生合成に関わる酵素の発現を 阻害する化合物であってもよぐまた、これらの阻害剤を生成または増加させる化合 物であって、生合成に関わる酵素を間接的に阻害する化合物であってもよい。
[0031] 本発明において、スフインゴミエリンの生合成過程に関わる酵素としては、セリンパ ルミトイル転移酵素、 3—ケトジヒドロスフインゴシン還元酵素、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフインゴミエリン合成酵素等 があるが（図 1)、好ましくは、セリンパルミトイル転移酵素、ジヒドロスフインゴシン一 N —ァシル転移酵素、スフインゴミエリン合成酵素を挙げることができる。
[0032] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の初段階である、パルミトイル CoA力 3-ケトジヒドロスフインゴシンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。 該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するセリンパルミトイル転 移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはセリンパルミトイル転移酵素の発現を 抑制する化合物を挙げることができる。
[0033] 本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該 酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよ 、が、好ましくはスフインゴファ ギン、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を挙げること ができる。
[0034] 式（I) :
Figure imgf000016_0001
[0035] 式中、 Aは、一（CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；
2 n
Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N
2 2
OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァ ルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換さ れて 、てもよ 、ァミノ基で置換されて 、てもよ 、）を表し；
Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子
2 m
、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、置換されていてもよい複素環 式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよいへテロアリール基、 OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしく は分岐鎖状のアルキ-ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、シクロアルキル 基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、またはハロゲン原子を表し；
Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH
2 p
基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖も しくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置 換されて 、てもよ 、複素環式基、または置換されて 、てもよ 、ヘテロァリール基を表 し；
結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして
及び R3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は 分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分 岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分 岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を 示す。
本発明においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、特に本明細書中で 定義している場合を除き、炭素数 1〜12の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意 味し、好ましくは炭素数 1〜7の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素基を意味する。例 えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、 n ブチル基、イソブチル基 、 t ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基などが挙げられる。またシクロアルキル基と は、炭素数 3〜8の環状炭化水素基を意味する。たとえば、シクロペンチル基、シクロ へキシル基、シクロへプチル基、シクロへキセ-ル基などが挙げられる。また、直鎖も しくは分岐鎖状のアルケニル基は、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐鎖状の炭化水素 基であって、少なくとも 1の二重結合を含むものを意味する。例えば、ビュル基、 1 プロぺニル基、ァリル基、 2—ブテュル基、 2—エテュルー 2—ブテュル基などが挙げ られる。直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、炭素数 2〜8の直鎖もしくは分岐 鎖状の炭化水素基であって、少なくとも 1の三重結合を含むものを意味する。例えば 、ェチュル基、 1 プロピ-ル基、 2 プロピ-ル基、 1 プチ-ル基、 3 ブチニル 基、 2 ペンチ-ル基、 3 ペンチ-ル基、 4 ペンチ-ル基、 2 へキシュル基、 4 一へキシュル基、 2 デシ-ル基、 6, 6 ジメチルーヘプター 2, 4 ジインー1ーィ ル基などが挙げられる。
[0037] また、本明細書にお!、て記載される複素環式基とは、窒素原子、硫黄原子、および 酸素原子から独立して選択されるへテロ原子 1〜4個（好ましくは 1または 2個）を環員 として含む 4〜6員の単環または 7〜10員の二環の環式基 (好ましくは単環基)であつ て、少なくとも 1の二重結合を有していてもよい基を意味し、具体的にはピラン、モル ホリン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、 1, 3 ジ ォキサン、ピぺラジン、ピぺリジン、チオモルホリンなど力 誘導される基が挙げられる
[0038] 本明細書において記載されるァリール基は、芳香族性を有する単環または多環の 炭化水素基を意味する。具体的には、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フルォレ ンなど力 誘導される基を挙げることができる。
[0039] 本明細書にぉ 、て記載されるへテロァリール基は、芳香族性を有し、窒素原子、硫 黄原子、および酸素原子から独立して選択されるへテロ原子 1〜4個 (好ましくは 1ま たは 2個）を環員として含む 4〜6員の単環または 7〜10員の二環の環状基 (好ましく は単環基)を意味する。具体的には、フラン、チォフェン、ピロール、ジァゾール、ピリ ジン、チアゾール、イミダゾール、ピリミジン、インドール、キノリン、ォキサゾール、イソ キサゾール、ピラジン、トリァゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピラゾールなど 力 誘導される基を挙げることができる。
[0040] 本明細書において記載されるァラルキル基は、上記のァリール基で置換されている 上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味し、具体的にはべンジル基、フエ ネチル基などを挙げることができる。
[0041] 本明細書において記載されるへテロァリールアルキル基は、上記のへテロアリール 基で置換されて!ヽる上記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を意味する。
[0042] 本明細書にぉ 、て記載されるァシル基は、カルボ-ル基を介して結合して 、る、上 記の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ァリール基、ヘテロァリール基、または複 素環式基を意味する。
[0043] 本明細書において記載される「置換されていてもよい」は、特に本明細書中で定義 されている場合を除き、このように付記されている基力 直鎖もしくは分岐鎖状のアル キル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル 基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ルォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ルォキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキ ルォキシ基、シァノ基、ニトロ基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基、ハロゲ ン原子、ァリール基、ァリールォキシ基、ヘテロァリール基、ヘテロァリールォキシ基、 ァラルキル基、ァラルキルォキシ基、アミノ基 (直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で モノまたはジ置換されていてもよい）、ァシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルス ルホニル基、力ルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、カルボキシ ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボ-ル基、ホルミル基、アミノスルホ -ル 基などの基で置換されて 、てもよ 、ことを意味する。これらの置換基に含まれるァリー ルおよびへテロアリール部分は、更にハロゲン原子、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基 、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ルォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル 基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ルォキシ基、シクロアルキル基、シクロアルキル ォキシ基、シァノ基、ニトロ基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基、ハロゲン 原子、ァリール基、ァリールォキシ基、ヘテロァリール基、ァラルキル基、ァラルキル ォキシ基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノもしくはジ置換されて 、てもよ!/ヽ アミノ基、ァシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルスルホ-ル基、直鎖もしくは分 岐鎖状のアルコキシ基、力ルバモイル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルチオ基、 カルボキシル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキルカルボ-ル基、ホルミル基、ァミノ スルホ-ル基などによってモ入ジもしくはトリ置換されて 、てもよ 、。
[0044] 本発明の好まし 、式 (I)の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
[s濯]
61·
L9L l0/S00Zdr/13d .S99T0/900Z OAV
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
[9濯]
L9L lO/SOOZdr/13d .S99T0/900Z OAV
Figure imgf000022_0001
L9L lO/SOOZdr/13d .S99T0/900Z OAV
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
[8權]
zz
Z.9Z.M0/S00Zdf/X3d 9910/900 O/VV
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000024_0004
L9L lO/SOOZdr/13d
Figure imgf000025_0001
i/:/ O-9/-i2Tl£ /-S90900ZAV
§0
、 ^_ノ
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
[0053]
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
本発明の式 (I)の化合物を合成する方法の一例を、以下の反応スキームにより説明 する。
一般製法 1
工
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
12
10 11
工程 1-M
Figure imgf000030_0003
14-B
[0056] 上記式中、各記号は、上記式 (I)に記載したとおりであり、また、 P、 pz 、および P 〃 は、ヒドロキシ保護基を示す。出発化合物である化合物 1は、文献記載の方法 (J. Org. Chem.1989, 45, 5522, B.E.Marron, et al)に従って合成することができる。
[0057] 工程 1—1
化合物 1を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル 類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で 水素化ビス（2—メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化アルミニウムリチウム などの還元剤で、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下で反応させた後、続いて冷 却下、好ましくは 78°Cでヨウ素で処理することにより化合物 2を得ることができる。
[0058] 工程 1—2 化合物 2を、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、塩化メチレン、クロロホ ルム、 1, 2—ジクロ口エタン、酢酸ェチルなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中 で、触媒量のピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホ ン酸酢酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下 、好ましくは氷温下でジヒドロピランと反応させることにより化合物 3を得ることができる
[0059] 工程 1—3
化合物 3を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル 類、ベンゼン、トルエン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で 、 tert ブチルリチウム、 n—ブチルリチウム、 sec ブチルリチウムなどの強塩基と室 温あるいは冷却下、好ましくは 78°Cで反応させ、さらにホルムアルデヒドを力卩ぇ冷 却下、好ましくは氷温下で反応させることによりィ匕合物 4を得ることができる。
[0060] 工程 1—4
化合物 4を、 N, N ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、クロ口 ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、イミダゾール、トリメチルァミン、 ピリジンなどの塩基存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは氷温下で tert ブチル ジフエニルクロロシランと反応させることによりィ匕合物 5を得ることができる。
[0061] 工程 1—5
化合物 5を、エタノール、メタノール、プロパノールなどの各種アルコール類溶媒中 、触媒量のピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン 酸酢酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは加熱下、 好ましくは還流加熱下で反応させることによりィ匕合物 6を得ることができる。
[0062] 工程 1—6
化合物 6を、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中 で、チタンテトライソプロポキシド、チタンテトラプチ口キシドなどのルイス酸及び L一 ( + )一酒石酸ジェチル， L （ + ) 酒石酸ジプロピルあるいは D （一） 酒石酸 ジェチル、 D （一） 酒石酸ジプロピルの存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは 冷却下で tert ブチルヒドロペルォキシド、タメンヒドロペルォキシドなどの過酸化物と 反応させることによりィ匕合物 7を得ることができる。
工程 1 7
以下に記載する一般製法— 2で合成された、所望の鎖 A (― (CH ) 一）および基 D
2 n
を有する、式：
Figure imgf000032_0001
で示される化合物の三重結合をノヽイドロメタレーシヨン（例えばハイドロジルコネーショ ンゃハイドロボレーシヨン）した後、トランスメタレーシヨン (例えばグリニアール試薬や ジアルキル亜鉛などを使用して）して得られるビュルメタル誘導体と化合物 7を、ジェ チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの各種エーテル類、ベンゼン、トル ェン、シクロへキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で室温あるいは冷却 下、好ましくは一 78°Cで反応させることにより化合物 8を得ることができる。
[0065] 工程 1—8
化合物 8を、ジェチルエーテル、トルエン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロロェタンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、触媒量のピリジ- ゥムパラトルエンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルォ 口酢酸、塩酸、硫酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で、 2, 2 ジメトキシプロパンまたはアセトンなどと反応させることによりィ匕合物 9を得ること ができる。
[0066] 工程 1—9
化合物 9を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロ口 ホルムなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、フッ化テトラプチルアンモ -ゥム 、フッ化水素酸、酢酸、希塩酸などの存在下、室温あるいは冷却下で反応させること によりィ匕合物 10を得ることができる。
[0067] 工程 1— 10
化合物 10を、過酸化マンガン、硝酸、ジヨーンズ酸化などの酸化反応により対応す るジカルボン酸を得ることができる。或いは化合物 10を過マンガン酸カリ、スワン酸ィ匕 、コリンズ酸化、 TEMPO酸ィ匕などの酸ィ匕反応により対応するジアルデヒドを得ること ができる。好ましくは、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中、塩ィ匕ォキザリルとジ メチルスルホキサイドの存在下、冷却下、好ましくは— 78°Cでィ匕合物 10を反応させ た後、トリェチルァミンなどの塩基で処理することによりジアルデヒドを得ることができ る。得られる生成物を、続いて過マンガン酸カリ、亜塩素酸ナトリウム、クロム酸などの 酸化剤によりジカルボン酸とすることができる。好ましくは 2—メチル 2—プロパノー ル、 2—メチルー 2—ブテン中、室温或いは冷却下、好ましくは冷却下、亜塩素酸ナト リウム及びリン酸二水素ナトリウムの水溶液と反応させることによりジカルボン酸を得る ことができる。得られる生成物を、続いて N, N ジメチルホルムアミド、ジェチルエー テル、テトラヒドロフラン、へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中もしくは それらの混合溶媒中又は無溶媒中で、 N, N ジメチルホルムアミドジ tert-ブチルァ セタール中、或いは 2, 2, 2—トリクロロアセトイミダート tert-ブチルを室温或いは加 熱下で反応させることによりィ匕合物 11を得ることができる。
[0068] 工程 1— 11
化合物 11を、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶 媒中、水共存下でピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸など の酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させることにより化合 物 12を得ることができる。
[0069] 工程 1— 12
化合物 12を、過酸化マンガン、硝酸、ジヨーンズ酸化などの酸化反応により対応す るジカルボン酸とすることができる。好ましくは化合物 12を、アセトン中、室温或いは 冷却下、好ましくは冷却下でジヨーンズ試薬と反応させることによりィ匕合物 13を得るこ とがでさる。
[0070] 工程 1— 13
化合物 13と α アミノ酸 tert-ブチルエステル塩酸塩を、 N, N ジメチルホルムァ ミド、テトラヒドロフラン、ジェチルエーテル、塩化メチレン、クロ口ホルムなどの溶媒中 もしくはそれらの混合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルアミ ン、ピリジン、 4-N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基存在下、 O— (7—ァザべ ンゾトリアゾール— 1—ィル） N, N, N' , N' —テトラメチルゥ口-ゥムへキサフル ォロホスフェート、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC'HC1)、 1—ヒドロキシベンゾト リァゾ ル (HOBt)などのカツプリング試薬と作用させることにより、室温ある!/ヽは冷 却下、好ましくは室温下で反応させることにより、式 (I)の化合物の一態様である化合 物 14 Aを得ることができる。
[0071] 工程 1— 14
化合物 14 Aを、ェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、へキサン、塩化 メチレン、クロ口ホルム、酢酸ェチル、水などの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で 、ァニノールの存在下或いは無存在下、メタンスルホン酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、 希塩酸などの酸の存在下、室温あるいは冷却下、好ましくは室温下で反応させること により、式 (I)の化合物の一態様である化合物 14 Bを得ることができる。
[0072] 本発明の式 (I)の化合物のうち、上記の化合物 14 Aおよび 14 B以外の化合物 を得るには、化合物 14— Aまたは 14— Bから出発して、必要に応じて加水分解、還 元、アミノ化もしくはアミド化、ヒドロキシイミノィ匕、および/またはエステル変換に付す ことにより、 目的とする式 (I)の化合物を得ることができる。また結合 Qが単結合である 式（I)の化合物は、化合物 14 Aまたは 14 Bを、メタノール、エタノール、酢酸ェチ ル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、ノ《ラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッ ケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによ つても得ることができる。
[0073] 式 (I)の化合物を合成するために有用な中間体ィ匕合物である、式：
Figure imgf000034_0001
〔式中、 Dおよび nは、上記に記載のとおりであり、 Mおよび Mは同一または異なつ
1 2
て酸素原子または硫黄原子を表し、 Pおよび! ^ は、同一または異なってヒドロキシ 保護基を表す〕で示される化合物は、式：
Figure imgf000035_0001
〔式中、 Pおよび! ^ は、上記に記載のとおりである〕で示される化合物を、式:
Figure imgf000035_0002
〔式中、 D、 n、 Mおよび Mは、上記に記載のとおりである〕で示される化合物と、反
1 2
応させ合成することが出来る。この方法は、上記一般製法 1の工程 1 7の方法で ある。
[0077] 上記の式 (I)の化合物を合成するための中間体化合物の 1つである化合物：
Figure imgf000035_0003
は、以下の反応スキームにより合成することができる。
[0079] 一般製法 2 工程 2-3 D
Figure imgf000035_0004
b
,
0 0 d
[0080] 工程 2— 1
末端に三重結合を有し、所望の鎖 A (- (CH ) -)を有する化合物 aと N, 0-ジメ
2 n
チルヒドロキシルァミン塩酸塩を、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、 へキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、酢酸ェチルなどの溶媒中もしくはそれらの混 合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、 4-N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基存在下、 O—（7 ァザべンゾトリァゾールー 1 —ィル） N, N, N' , N' —テトラメチルゥ口-ゥムへキサフルォロホスフェート、水 溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC'HCl)、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ―ル（HOBt) などのカップリング試薬を室温下で作用させることにより、化合物 bを得ることができる
[0081] 工程 2— 2
上記工程で得られた化合物 bを、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン 、へキサンなどの溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中で、室温あるいは冷却下、好ま しくは冷却下で、所望の基 Dを有するグリニャール試薬或いはアルキルリチウム試薬 と反応させることにより、基 Dが導入されたィ匕合物 cを得ることができる。
[0082] 工程 2— 3
上記工程で得られた化合物 cとエチレングリコールを、ベンゼン、トルエン、 1, 2- ジクロロェタンなどの溶媒中で、ピリジ-ゥムパラトルエンスルホン酸、パラトルエンス ルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸などの酸の存在下、加熱下生成してくる水を共沸 除去しながら反応させることにより、化合物 dを得ることができる。
[0083] ここで得られたィ匕合物 dは、上述した化合物 (I)の製造工程を示した一般製法— 1 の工程 1—7において使用することができる。なお Mおよび Zまたは Mが硫黄原子
1 2
である、化合物 dに相当する化合物も、当業者に公知の方法により得ることができる。
[0084] 上記式 (I)の化合物を合成するための原料化合物である式：
Figure imgf000036_0001
の化合物は、当業者に公知の方法、下記の一般製法 3〜一般製法 5の反応ス キームにより製造することができる。
[0086] 一般製法 3
Figure imgf000036_0002
化合物番号 AA 化合物番号 BB 化合物番号 CC 化合物番号 DD [0087] 上記式中、 P' ' 'はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はアミノ酸の保護基を示 し、 Mは直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基 、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基を示す。
[0088] 工程 3—1
化合物 AAをァセチル、トリフルォロアセチル、 t—ブトキシカルボ-ル、ベンジロキシ カルボニル、 9 フルォレニルメチルカルボ-ル等のようなアミノ基の保護基によって 保護することによりィ匕合物 BBを得ることができる。この時の反応条件は、保護基 P'，，， の種類により適宜選択される。
[0089] 工程 3— 2
ィ匕合物 BBを、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホル ムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、シメチルスルホキサイドなどの溶媒中もしくはそれ らの混合溶媒中で、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウムなどの塩基の 存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは室温で、ハロゲン或いはメタンスルホン酸 エステル、トルエンスルホン酸エステル等の離脱基によって置換された Mと反応させ ることにより化合物 CCを得ることができる。或いは化合物 BBを光延反応条件下、水酸 基で置換された Mと反応させることによりィ匕合物 CCを得ることができる。
[0090] 工程 3— 3
化合物 CCのァミノ基の保護基 P' ' ' 'を脱保護することによりィ匕合物 DDを得ることが できる。この時の反応条件は、保護基 P'， "の種類により適宜選択される。
[0091] 一般製法 4
Figure imgf000037_0001
化合物番号 BB 化合物番号 EE 化合物番号 FF 化合物番号 GG
[0092] 上記式中、 P'，，はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はァミノ基の保護基を示 し、 Tはスルホン酸エステルなどの離脱基を示し、 Uは置換されてもよいァリール、或 いは置換されてもょ 、ヘテロァリール基を示す。
[0093] 工程 4—1
ィ匕合物 BBを、ジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホル ムアミド、ジォキサン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキサイドなどの各種溶媒中もしくは それらの混合溶媒中で、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピリジ ン、 4— N, N ジメチルァミノピリジンなどの塩基の存在下、室温あるいは冷却下、好 ましくは冷却下で、メタンスルホン酸クロライド、トルエンスルホン酸クロライド、無水トリ フルォロスルホン酸等と反応させることによりィ匕合物 EEを得ることができる。
[0094] 工程 4 2
ィ匕合物 EEを、ジェチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、ジォキ サン、酢酸ェチル、ァセトニトリル、水などの各種溶媒中もしくはそれらの混合溶媒中 で、パラジウムジアセテート、テトラキストリフエ-ルホスフィンパラジウムなどのパラジ ゥム触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、ァリール或いはへテ ロアリールホウ酸誘導体、又はァリール或いはへテロアリールホウ酸エステル誘導体 等と反応させることによりィ匕合物 FFを得ることができる。
[0095] 工程 4 3
化合物 FFのァミノ基の保護基 P' ' "を脱保護することによりィ匕合物 GGを得ることが できる。この時の反応条件は、保護基 P' "の種類により適宜選択される。
[0096] 一般製法 5
Figure imgf000038_0001
化合物番号 BB 化合物番号 HH 化合物番号 I I
[0097] 上記式中、 P' ' 'はカルボキシル基の保護基を示し、 P" "はアミノ酸の保護基を示 し、 Uは置換されてもよいァリール、或いは置換されてもよいへテロアリール基を示す
[0098] 工程 5—1
化合物 BBをジェチルエーテル、トルエン、シクロへキサン、アセトン、ジメチルホル ムアミド、ジォキサン、塩化メチレン、クロ口ホルム、ジメチルスルホキサイドなどの各種 溶媒中もしくはそれらの混合溶液中で、水素化ナトリウム、炭酸カリウムなどの塩基の 存在下、又は、 N, N ジイソプロピルェチルァミン、トリエチルァミン、ピリジン、 4— N, N—ジメチルァミノピリジンなどの塩基及びジァセトキシ第二銅、沃化第一銅等の 触媒の存在下、室温あるいは加熱下、好ましくは加熱下で、ァリール或いはへテロア リールホウ酸誘導体、ァリール或いはへテロアリールホウ酸エステル誘導体、又はハ ロゲン化ァリール或いはハロゲン化へテロァリール誘導体等と反応させることによりィ匕 合物 HHを得ることができる。
[0099] 工程 5— 2
化合物 HHのァミノ基の保護基 P' ' ' 'を脱保護することによりィ匕合物 IIを得ることがで きる。この時の反応条件は、保護基 P' ' ' 'の種類により適宜選択される。
[0100] 上記の式 (I)の誘導体一覧に記載した化合物 (40) (式 (II)に示す化合物と同じもの である）は、国際公開公報 W098Z56755号に開示されており、オーレォバシディウ ム（Aureobasidium)属の微生物に由来し、カンジダ 'アルビカンス、タリプトコッカス 'ネ ォホルマンス等の病原性真菌に対する抗菌活性、及び、免疫反応を阻害する効果を 有することが知られている。上記化合物 (48)は、国際公開公報 W094Z18157号 に開示されており、スクアレン合成阻害剤、抗真菌剤として有用であることが知られて いる。
[0101] この化合物（40)は、フザリウム（Fusarium)属、オーレォバシディウム（Aureobasidiu m)属等の糸状菌類で、上記化合物を産生する菌株を培養し、その後、上記菌株の 培養物から単離することにより製造することができる。
[0102] 化合物 (40)の製造に用いることができる菌株としては、フザリウム (Fusarium)属、ォ 一レオバシディウム (Aureobasidium)属等の糸状菌類に属し、上記化合物を産生す ることができるものであれば特に限定されず、例えば、フザリウム*エスピー（Fusarium sp.) F1476株（以下「F1476株」という）、オーレォバシディウム ·エスピー（Aureobasi dium sp.)TKR2449株（国際公開公報 W098Z56755号）等を挙げることができる
[0103] F1476株は、上記化合物 (40)を有利に産生する特性を有するものである。また、 上記 F1476株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
生育温度範囲は、 10〜30°Cであり、好ましくは、 20〜30°Cである。
生育可能 pH範囲は、 3〜11であり、好ましくは、 5〜7である。 [0104] F1476株は、 Fusarium sp. F 1476と表示し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 2003年 2月 4日付で、受託番号 FERM BP— 8290とし て寄託されている。
[0105] 本発明においては、上記 F1476株の他に、 F1476株の自然又は人工的な突然変 異体、あるいはフザリウム属、オーレォバシディウム属等の糸状菌類に属するその他 の菌種等であって、 F1476株の産生能を有する微生物を使用することができる。
[0106] 本発明においては、上記化合物 (40)の化合物は、上記 F1476株を、栄養源含有 培地に接種し、これを培養することによって培養物を得ることができる。上記栄養源の うち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキス トリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。
[0107] 上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカ 一、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモ-ゥム塩 等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。
[0108] 上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、 マグネシウム塩、リン酸塩等の無機塩類等を挙げることができる。これらは、単独で使 用されてもよぐ適宜組み合わせて使用されてもよい。
[0109] 上記栄養源は、単独か又は適宜組み合わせて使用することができる。
[0110] 上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コノ レト塩等の重金 属塩;ピオチン、ビタミン B1等のビタミン類;その他、菌の生育を助け、上記化合物 (4 0)の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。
[0111] 上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイ ル、ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、界面活性剤等を添加することが できる。
[0112] 上記化合物 (40)を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては 、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体 培養法、液体培養法等の培養方法を採用することができる。
[0113] 上述の培養方法によって、上記化合物 (40)は、培養物中に蓄積される。本発明に おいては、培養物中に蓄積された上記化合物 (40)を、公知の方法により、培養物中 力 分離した後、必要に応じて更に精製することができる。
[0114] 上記分離は、培養物全体を、酢酸ェチル、酢酸ブチル、クロ口ホルム、ブタノール、 メチルイソプチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる
。また、培養物を濾過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、 菌体のそれぞれから分離することもできる。
[0115] 上記分離した培養液から上記化合物 (40)を分離するには、上記非親水性有機溶 媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、 培養液中の上記化合物 (40)を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用す ることちでさる。
[0116] 上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性榭脂等を挙げること ができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質等によって適宜 1種又は 2種以上を 組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類等の水 溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組み合わせたもの等を挙げることができる。
[0117] 上記分離した菌体から上記化合物 (40)を分離するには、アセトン等の親水性有機 溶媒で抽出する方法を採用することができる。
[0118] 本発明においては、このようにして培養物中力も分離された上記化合物 (40)の粗 抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。
[0119] 上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行 うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸 着性榭脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー 法等を挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法 を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノー ル、アセトン、水等を挙げることができ、これらは 2種以上を併用することができる。
[0120] 上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オタ タデシル基、ォクチル基、フエ-ル基等が結合したィ匕学結合型シリカゲル;ポリスチレ ン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノ ール、含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる さらに、上記化合物 (40)を出発物質として下記に記載の製法 1から 11のいずれか の方法を用いて化合物 (41)〜（54)で表される誘導体を得ることができる。
製法 1 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイドロフラ ン等の溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル等の触媒の存 在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合物 (46)を 得ることができる。
製法 2 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、プロパノール、テトラハイドロフラ ン等の溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、水素化 シァノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジェチルアルミニウムナトリウム 、リチウムアルミニウムハイドライド等の還元剤の存在下、室温または冷却条件下で還 元することによりアルコール体である化合物 (47)等を得ることができる。
製法 3 :上記化合物 (40)を、メタノール、ジォキサン、テトラハイド口フラン、水等の溶 媒中、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸等の存在下、室温または冷却 件下で処理することにより脱アルキルィ匕体である化合物 (48)等を得ることができる。 さらに上記化合物（48)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイド口フラン 等の溶媒中、ノ《ラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル、酸化白金等の 触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体である化合 物 (49)等を得ることができる。
製法 4 :上記化合物 (48)等を水酸ィ匕ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸カルシウム、炭 酸カリウム等の塩基の存在化、ジメチルホルムアミド (DMF)、テトラハイド口フラン等 の溶媒中、室温または加熱条件下で、アルキルノヽライド、ァリルノヽライド、アルキ-ル ハライド等のアルキル化剤で処理することによりテトラアルキル、テトラアルキ-ル及 びテトラァルケ-ルイ匕体を合成することができる。また本化合物を水酸化ナトリウム、 水酸ィ匕カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム等の塩基の存在化、メタノール、ジォ キサン、テトラハイド口フラン、水等の溶媒中、室温または加熱条件下で処理すること によりアルキル、アルキ-ル及びアルケ-ル化体である化合物を合成することができ る。
製法 5：上記化合物 (40)と各種アミンをジメチルホルムアミド (DMF)、テトラノ、イド口 フラン等の溶媒中で、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン等の塩基の存在 下でジシクロへキシルカルボジイミド (DCC)、水溶性カルボジイミド塩酸塩 (WSC . H Cl)、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル (HOBt)等の縮合剤で処理することにより、室 温または加熱条件下で、対応するトリアミド体である化合物（50)等を得ることができる 製法 6 :上記化合物（40)を、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、テトラハイドロフラ ン等の溶媒中、ノ ラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネー-ッケツル、酸化白金等の 触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりテトラヒドロ体である化 合物（51)等を得ることができる。
製法 7 :上記化合物（40)を、テトラハイド口フラン、 DMF及びジクロロメタンなどの溶 媒中、ジシクロへキシルカルポジィミド (DCC)等の縮合剤により各種のアルコール（ R—OH)と反応させることによって、室温または加熱条件下で、対応するトリエステル (R^R^R R)を得ることができる。あるいは、上記化合物 (40)を、メタノール及 びジクロロメタンなどの混合溶媒中、アミドジヒドロ体トリメチルシリルジァゾメタン (TM SCHN )等で処理し、トリメチルエステル体 (R^R^R^CH )を得ることができる。
2 3
製法 8：製法 7で得たトリメチルエステル体をメタノール、 エタノール及びブタノール等 の溶媒中で 4 トルエンスルフォ-ルヒドラジド等のヒドラジン誘導体で処理することに より、室温または加熱条件下で、対応するヒドラジド体を得、本ヒドラジド体を力テコー ルボラン等の還元剤で処理した後、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化力リウ ム等の塩基の存在化、エタノール、メタノール及び水等の溶媒中、室温または加熱条 件下で、脱ケト体である化合物（52)等を得ることができる。
製法 9：上記化合物 (40)とヒドロキシルァミンまたは各種 O 置換ヒドロキシルァミン をピリジン、トリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン等の存在下で、室温または 加熱条件下で処理することにより対応するォキシムエーテル及びォキシム体である 化合物（53) , (54)等を得ることができる。
製法 10 :上記化合物（40)を、テトラノ、イド口フラン、ジクロロメタン、クロロフオルム等 の溶媒中、ジェチルアミノサルファートリフルオライド（DAST)等で処理し、ハロゲン 化体を得ることができる。 製法 11：上記化合物 (40)と各種アミンをエタノール、メタノール及び、テトラハイド口 フラン等の溶媒中で、中性あるいは弱酸性条件下で、室温または加熱条件下で、水 素化シァノホウ素ナトリウムあるいは水素化トリァセトキシホウ素ナトリウム等還元剤で 処理することによりにより、還元的アミノ化を行い対応するァミン体 (B=—N (R4) (R5) )を得ることができる。
[0122] 本発明の、セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物としては、セリンパ ルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物 を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができる。本発明において、発現を抑制 されるセリンパルミトイル転移酵素の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動 物由来であり、より好ましくはヒト由来である。セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAとしては配列番号: 4または 6 (LCB1または LCB2)に記載の塩基配列力 なる D NA、配列番号： 5または 7に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA 、および配列番号： 5または 7に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸 が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列力 なるタンパク質をコ ードする天然由来の DNA等も含まれる。「1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付カロ 、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列力もなるタンパク質」は、天然型のタンパク 質と同等の機能を有し、かつ高い相同性を持つものである。高い相同性とは、ァミノ 酸配列全体で、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90 %以上（例えば、 95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。
[0123] 上記天然由来の DNAは、配列番号: 4または 6に記載の塩基配列力 なる DNAにハ イブリダィズする DNAである。ハイブリダィゼーシヨンにおける条件は当業者であれば 適宜選択することができる力 ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、例えば 42°C 、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であ る。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば 65°C、 0.1 X SSC及び 0 .1%SDSの条件である。
[0124] セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNAとしては、 より好ましくは配列番号： 1および 2で表す siRNAを挙げることができる。
[0125] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の途中段階である、スフイン ガニン (ジヒロドスフインゴシン)カゝらジヒドロセラミドの生合成過程を遮断する化合物が 挙げられる。該生合成過程を遮断する化合物としては、該生合成に関与するジヒドロ スフインゴシン N ァシル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物、またはジヒドロ スフインゴシン N ァシル転移酵素の発現を抑制する化合物を挙げることができる
[0126] 本発明の、ジヒドロスフインゴシン一 N ァシル転移酵素の酵素活性を阻害するィ匕 合物としては、該酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよいが、好ましく はフモ-シン B1またはその誘導体を挙げることができる。
[0127] 本発明の、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素の発現を抑制する化合物と しては、ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素をコードする DNAの転写産物と 相補的な RNA、または該転写産物を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができ る。
[0128] 本発明の化合物としては、スフインゴ脂質生合成過程の途中段階である、セラミドか らスフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物が挙げられる。該生合成過程を 遮断する化合物としては、該生合成に関与するスフインゴミエリン合成酵素の酵素活 性を阻害する化合物、またはスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物を 挙げることができる。
[0129] 本発明の、スフインゴミエリン合成酵素の酵素活性を阻害する化合物としては、該 酵素活性を阻害するものであれば如何なるものでもよい。
[0130] 本発明の、スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物としては、スフイン ゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA、または該転写産物 を特異的に開裂するリボザィムを挙げることができる。スフインゴミエリン合成酵素をコ ードする DNAとしては配列番号： 8に記載の塩基配列力 なる DNA、配列番号： 9に 記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA、および配列番号： 9に記載 のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または 挿入されたアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする天然由来の DNA等も含まれ る。
[0131] 本発明の「酵素の発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパ ク質への翻訳の抑制が含まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の 減少も含まれる。
[0132] 本発明の「酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の一つの態様は、酵 素をコードする DNAの転写産物と相補的なアンチセンス RNAである。
[0133] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数 の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼに よって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑 制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとェキ ソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成 部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイブリッド形成によ る核力 細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位とのハイブリッド 形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による 翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻 訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド 鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成によ る遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を 阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
[0134] 本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発 現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域 に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。 しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このよう に、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む DN Aも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用されるアンチセンス DN Aは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを 含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の植 物へ形質転換できる。アンチセンス DNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性 遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ま U、が、遺伝子の発現を有 効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的とする 遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性 を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには 、アンチセンス DNAの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上 であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス DNAの 長さは 5kbよりも短く、好ましくは 2.5kbよりも短!、。
[0135] 「酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA」の他の一つの態様は、酵素を コードする DNAの転写産物と相補的な dsRNAである。 RNAiは、標的遺伝子配列と同 一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNA (以下 dsRNA)を細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象で ある。細胞に約 40〜数百塩基対の dsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つ ダイサー (Dicer)と呼ばれる RNaselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、 dsRNAを 3'末 端から約 21〜23塩基対ずつ切り出し、 siRNA (short interference RNA)を生じる。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC : RNA-induced s ilencing complex)が形成される。この複合体は siRNAと同じ配列を認識して結合し、 R Naselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で標的遺伝子の mRNAを切断する。ま た、この経路とは別に siRNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポ リメラーゼ (RsRP)のプライマーとして作用し、 dsRNAが合成される。この dsRNAが再び ダイサ一の基質となって、新たな siRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられて ヽ る。
[0136] 本発明の RNAは、標的遺伝子 mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンス RNA をコードしたアンチセンスコード DNAと、標的遺伝子 mRNAの!、ずれかの領域のセン ス RNAをコードしたセンスコード DNAより発現させることができる。また、これらのアン チセンス RNAおよびセンス RNAより dsRNAを作成することもできる。
[0137] 本発明の dsRNAの発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、 同一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合と、異なるベクタ 一からそれぞれアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる場合がある。例えば、同 一のベクターからアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、アンチセ ンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系のような短い RNA を発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット、センス RNA発 現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに 挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセ ンスコード DNAとセンスコード DNAと逆向きに配置した発現システムを構成することも できる。この構成では、アンチセンス RNAコード鎖とセンス RNAコード鎖とが対となつ た一つの二本鎖 DNA(siRNAコード DNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖から アンチセンス RNA、センス RNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる 。この場合には、センス RNA、アンチセンス RNAの下流に余分な配列が付加されるこ とを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス RNAコード鎖、センス RNAコード鎖）の 3'末端にターミネータ一をそれぞれ備えることが好ましい。このターミネータ一は、 A ( アデニン)塩基を 4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリン ドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類を異ならせることが好 ましい。
[0138] また、異なるベクター力もアンチセンス RNA、センス RNAを発現させる構成としては、 例えば、アンチセンスコード DNAおよびセンスコード DNAの上流にそれぞれ polIII系 のような短い RNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンス RNA発現カセット 、センス RNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持さ せること〖こより構成することができる。
[0139] 本発明の RNAiにおいては、 dsRNAとして siRNAが使用されたものであってもよい。「 siRNAjは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖力 なる二重鎖 RNAを意味し、例え ば、 15〜49塩基対と、好適には 15〜35塩基対と、さらに好適には 21〜30塩基対とす ることができる。あるいは、発現される siRNAが転写され最終的な二重鎖 RNA部分の 長さが、例えば、 15〜49塩基対、好適には 15〜35塩基対、さらに好適には 21〜30塩 基対とすることができる。
[0140] RNAiに用いる DNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも 70 %以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の 配列の相同性を有する。
[0141] dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、完全に対合しているも のに限らず、ミスマッチ (対応する塩基が相補的でない）、バルジ (一方の鎖に対応す る塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、 dsR NAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両 方が含まれていてもよい。
[0142] 本発明の「酵素の発現の抑制」は、また、リボザィムをコードする DNAを利用して行 うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザィ ムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザ ィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設計が可能と なった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのよう に 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼 ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。
[0143] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位 の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている。リボザィムの基質結 合部を標的部位近傍の RNA配列と相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の U C、 UUまたは UAと ヽぅ配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出する ことが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的と なりうる部位が複数存在する。
[0144] また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボ ザィムは、例えばタバコリングスポットゥイノレスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出さ れる (J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断 を起こすように設計できることが示されて 、る。
[0145] 標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、植物細胞中で転写されるようにカリ フラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配 列に連結される。しかし、その際、転写された RNAの 5'末端や 3'末端に余分な配列が 付加されていると、リボザィムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写 されたリボザィムを含む RNA力 リボザィム部分だけを正確に切り出すために、リボザ ィム部分の 5'側や 3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを 配置させることも可能である (K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianotta nd J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.C ech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19 :5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を 切断できるようにして、より効果を高めることもできる (N.Yuyama et al. Biochem.Biophy s.Res.Commun. l86:1271,1992)0このようなリボザィムを用いて本発明で標的となる遺 伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
[0146] 本明細書における「治療」という記載は、本発明の薬物を被験者に投与することによ つて、 HCVを消滅あるいは軽減させること、さらなる HCVの広がりを抑制すること、 H CVの感染による症状を軽減することを意味する。 HCVの感染による症状としては、 好ましくは C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。
[0147] 本発明の化合物は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使 用することができる。上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定さ れず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩;酢酸、酒石 酸、乳酸、クェン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスル ホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウ スルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属 又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。
[0148] 上記医薬製剤に含まれる有効成分ィ匕合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜 選択される力 例えば、 0. 1-99. 5重量％、好ましくは 0. 5〜90重量％である。
[0149] 本発明の化合物を、常法に従って主薬として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、 矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野にお いて通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。錠剤の形態に 成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば 乳糖、白糖、塩ィ匕ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結 晶セルロース、ケィ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グル コース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセル ロース、リン酸カリウム、ポリビュルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナト リウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシェチレ ンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱 粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑 制剤;第 4級アンモ-ゥム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤;グリセリン、 澱粉などの保湿剤;澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸などの吸着 剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが 例示できる。
[0150] さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン 被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができ る。丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く 使用でき、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タ ルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤； ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、 担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール 、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成 グリセリドなどを挙げることができる。注射剤として調製される場合には、液剤および 懸濁剤は殺菌され、かっ血液と等張であるのが好ましぐこれら液剤、乳剤および懸 濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをす ベて使用でき、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリ ルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン 脂肪酸エステル類などを挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製 するのに充分な量の食塩、グルコース、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せし めてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤などを添加してもよい。さらに 必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品を含有する ことちでさる。
[0151] 上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましぐ経口投与、組織内 投与 (皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など)、局所投与 (経皮投与など)又は経 直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤 型で投与されることは当然である。
[0152] 本発明の化合物など又はそれの製薬上許容され得る塩を医薬として投与する場合 、抗ウィルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性 質と程度などを考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成 人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、 0.1〜2000mgの範囲である。上 記範囲未満の用量で足りる場合もある力 逆に上記範囲を超える用量を必要とする 場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。
[0153] 上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤 、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、その他の剤型などにより行 うことができる。
[0154] 上記組織内投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射 用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発 明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体 などの注射目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁 液又は溶液を滅菌することにより製造される。
[0155] 上記局所投与 (経皮投与など）は、例えば、液剤、クリーム剤、粉末剤、ペースト剤、 ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これら のものは、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、外用製剤の 目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化 剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより製造され る。
[0156] 上記経直腸的投与は、本発明の化合物又はその製薬上許容される塩の一定量を 、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、ポリエチレングリコ ール、カカオ脂、これらの混合物など力もなる低融点固体に混入した座剤などを用い て行うことができる。
[0157] 上記投与は、例えば、溶液や懸濁剤などの皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液 状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の化 合物又はその製薬上許容される塩の一定量を、例えば、水性や油性の媒体などの 注射の目的に適合する非毒性の液状担体に懸濁又は溶解し、ついで上記懸濁液又 は溶液を滅菌することにより製造される。
[0158] 本発明は、式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイ ル転移酵素阻害剤に関する。また、式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体 を含む、セリンノ ルミトイル転移酵素阻害剤に関する。
[0159] 該阻害剤は HCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだけではなぐ スフインゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質 (スフインゴミエリ ン)が異常蓄積する疾患であるスフインゴリビドーシス、スフインゴリピドバインディング モチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルッノヽイマ一病、脊髄運動 ニューロン内のセラミドが増加 L#経細胞死を引き起こす筋萎縮性側索硬化症 (Cutl er, R. G.， et al.， Ann. Neurol, 52, 448-457, 2002)、 gpl20タンパク質が関与する HI V感染症、および PrPタンパク質が関与するプリオン病、ラフトに結合して宿主細胞に 感染するウィルス感染症 (例えばインフルエンザ、 HIV)等の有用な予防または治療 する薬剤として利用できる。
[0160] 本発明は、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤のスクリーニング方法に 関する。
[0161] 本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、まず、パルミトイル CoAからス フインゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。
[0162] 本発明のスクリーニング方法における「パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生 合成に関与する酵素 (以下「該生合成酵素」として約して使用される場合もある)」とし ては、セリンパルミトイル転移酵素、 3—ケトジヒドロスフインゴシン還元酵素、ジヒドロ スフインゴシン一 N—ァシル転移酵素、ジヒドロセラミド不飽和化酵素、スフインゴミエリ ン合成酵素等を挙げることができる。これら酵素の由来は、特に制限はなぐ例えばこ れらの酵素は酵母またはヒトを含む哺乳動物等の由来のものであってもよい。
[0163] 第一の態様に用いられる生合成酵素の状態としては、特に制限はなぐ例えば、精 製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであって もよい。該生合成酵素が発現している細胞としては、内在性の生合成酵素を発現し ている細胞、または外来性の生合成酵素を発現している細胞が挙げられる。上記内 在性の生合成酵素を発現して!/、る細胞としては、培養細胞などを挙げることができる 力 これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなぐ例え ば、市販のものを用いることが可能である。また、上記外来性の生合成酵素を発現し ている細胞は、例えば、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを細胞に導入 することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸力 ルシゥム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフエタミン法、マイクロインジェクション法等 によって実施することができる。このような外来性の生合成酵素が導入される細胞が 由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現さ せる技術が確立されて 、る生物種であればょ 、。
[0164] 生合成酵素が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含ま れる細胞抽出液に、生合成酵素をコードする DNAを含むベクターを添加したものを 挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなぐ市販の試験 管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
[0165] 本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然ィ匕 合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化 合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発 酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽 出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応 じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等 を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば 、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれ る。
[0166] 本発明において「接触」は、生合成酵素の状態に応じて行う。例えば、生合成酵素 が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことが できる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば 、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより 行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、酵母またはヒ トを含む哺乳動物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例 えば、該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、生合成酵素が発現している 細胞へ導入する、または該ベクターを生合成酵素が発現して！/ヽる細胞抽出液に添加 することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ノ、 イブリツド法を利用することも可能である。
[0167] 第一の態様では、次いで、上記生合成酵素と被検化合物の結合を検出する。タン ノ^質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利 用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が 挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、 BIACOREを用いた測定方法等、公知 の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素 と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、 HCV感染症を 治療または予防するための薬剤が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下 のスクリーニングの被検化合物として用いてもょ 、。
[0168] 本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、パルミトイル CoAからス フインゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる
。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りで ある。
[0169] 第二の態様では、次 、で、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程で 合成される化合物の量を測定する。合成される化合物としては、 3—ケトジヒドロスフィ ンゴシン、ジヒドロスフインゴシン、ジヒドロセラミド、セラミド等の中間生成物等も含まれ る力 より好ましくは最終生成物であるスフインゴミエリンを挙げることができる。合成さ れた化合物の定量は、 GC- MS法、 MS-MS法、 LC- MS法等公知の方法によって測定 することができる。また、合成されたィ匕合物力 Sスフインゴミエリンの様にリン脂質である 場合には、リン酸脂質中のリン酸の定量を行うことによつても定量を行うことができる。 本方法においては、ついで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、合成 された化合物の量を減少させた場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予 防するための薬剤として選択する。
[0170] 本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、パルミトイル CoAからス フインゴミエリンの生合成に関与する酵素を保持する細胞に被検化合物を接触させる 。該生合成酵素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りで ある。
[0171] 第三の態様では、次いで、パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に 関与する酵素の発現レベルを測定する。該生合成酵素の発現レベルの測定は、当 業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該生合成酵素の mRNAを定法 に従って抽出し、この mRNAを铸型としたノーザンハイブリダィゼーシヨン法、または R T-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。 さらに、 DNAアレイ技術を用いて、該生合成酵素の発現レベルを測定することも可能 である。
[0172] また、該生合成酵素を含む画分を定法に従って回収し、該生合成酵素の発現を SD S-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこ ともできる。また、該生合成酵素に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッテイング法を 実施し、該生合成酵素の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を 行うことも可能である。
[0173] 該生合成酵素の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限 はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用する ことができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリ クローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。該生合成酵 素、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリ コンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清 を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交 換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティー カラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例え ば、該生合成酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マ ウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ 細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細 胞 (ハイブリドーマ）の中から、該生合成酵素に結合する抗体を産生するクローンを選 択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水 を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロティ ン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、該生合成酵素や合成ペプチドをカツ プリングしたァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能である
[0174] 第三の態様においては、ついで、該生合成酵素の発現レベルが、被検化合物を接 触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または予 防するための薬剤として選択する。
[0175] 本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず該生合成酵素のプロモー ター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または 細胞抽出液を提供する
[0176] 第四の態様において、「機能的に結合した」とは、生合成酵素のプロモーター領域 に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、生 合成酵素のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合して 、ることを 、う。従つ て、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパ ク質を形成する場合であっても、生合成酵素のプロモーター領域に転写因子が結合 すること〖こよって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的 に結合した」の意に含まれる。
[0177] 上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限さ れず、例えば、当業者において一般的に使用される CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシ フェラーゼ遺伝子、 /3 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)および GFP遺伝子等を挙げる ことができる。第四の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化 合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺 伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記 の説明の通りである。
[0178] レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、 当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT 遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を 検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポ 一ター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による 色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合に は、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、 また、 j8 -ダルク口-ダーゼ遺伝子 (GUS)である場合には、該遺伝子発現産物の触 媒作用による Glucuron (ICN社）の発光や 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- 13 -ダルク 口-ド (X- Glue) の発色を検出することにより、さらに、 GFP遺伝子である場合には、 G FPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測 定することができる。
[0179] 第四の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベル力 被検化 合物を接触させないときに比べ減少する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療 または予防するための薬剤として選択する。
[0180] 本発明のスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、パルミトイル CoAからス フインゴミエリンの生合成に関与する酵素に被検化合物を接触させる。該生合成酵 素および「被検化合物」「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
[0181] 第五の態様では、次 、で、上記生合成酵素の活性を測定する。生合成酵素の活性 測定は、それぞれの酵素につき公知の方法で行うことができる。一般的には、基質と 生成物との間の分光学的性質の差を利用して、その時間的変化を測定する活性測 定法が使用されるが、酵素上の情報基 (例えばトリブトファンゃチロシンのようなァミノ 酸残基、および補酵素等)力もの情報をストップフロー法や種々の緩和法を用いて、 酵素反応をより直接的に測定する方法が選択されてもよい。活性測定法に用いられ る分光学的方法としては、吸光、蛍光、 CD、 NMR、 ESR、 IR、ラマン等を挙げることが できる。第五の態様においては、ついで、上記生合成酵素の活性が、被検化合物を 接触させないときに比べ低下する場合に、被検化合物を、 HCV感染症を治療または 予防するための薬剤として選択する。
[0182] 本発明は、上記に記載の 5つのスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。
このようなキットには、上記に記載の 5つのスクリーニング方法の検出工程や測定ェ 程に使用されるものを含みうる。例えば、パルミトイル CoA力 スフインゴミエリンの生 合成に関与する酵素の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗 体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤 、保存剤等が含まれていてもよい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0183] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0184] 〔実施例 1〕ノザンブロット解析によるミリオシンまたはオーレォバシディウム (Aureobasi dium)属などの微生物に由来する式 (II)で表される化合物の HCV RNA複製阻害活 性の測定
ミリオシン又は以下の式（II)で表される化合物を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン 細胞 Huh-3-lに与え、 5%CO存在下、 37度にて培養した。
2
[0185] 式（Π) :
Figure imgf000059_0001
[0186] 72時間後に細胞を回収し、全 RNAを抽出した後で、 Ambion社のノザンマックスキッ トの方法に従いネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った。
[0187] ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、 NorthernMax transfer buffer (Ambion
#8672),転写膜 BrightStar- Plus (Ambion #10100),ろ紙（Sigma P-6664) , ULTRAhy b (Ambion #8670)。プローブの標識は BiotinStar Psoralen- Biotin kit (Ambion #9860 G3)でビォチン化標識した。 High Stringency buffer (Amibion #8674); BrightStar BioD etect kit (Wash buffer, Ambion #8650G; Blocking buffer, Ambion #8651G; Streptavi din-Alkaline Phosphatase, Ambion #2374G; Assay buffer, Ambion #8652G;CDP— Sta r, Ambion #8653G) [0188] 1%ァガロースゲルで lugのトータル RNAを泳動し、泳動後ェチジゥムブ口ミドで RNA を染色して写真をとり、脱色後 NorthernMax transfer bufferを用いて転写膜に 2時間 転写した。湿ったままの状態で UVクロスリンカ一にて RNAを転写膜に固定ィ匕した。ハ イブリローターを用いて、 ULTRAhybにて 42度、 30分間の回転前処理の後、前処理 液を捨て、ピオチン化したネオマイシン耐性遺伝子と 10mlの ULTRAhyb液を加えて 42 度一夜振とう処理した。
[0189] ULTRAhyb液を捨て、 42度に保温した High Stringency bufferを 15ml加え 42度で 30 分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。浸る程度の Wash bufferで転写膜 を洗浄した。転写膜を Blocking bufferで 30分間振とうした。液を捨て、 10mlの Blocking bufferに 2ulの Streptavidin- Alkaline Phosphataseをカ卩えたもので室温 30分間振とうし た。転写膜を浸る程度の Blocking bufferで 10分間振とうした。 Wash bufferで 5分間洗 浄し、 Wash bufferで転写膜を洗浄した後、 CDP-Starで転写膜を覆い、 5分後に余分 な液を除き、 1時間後に X線フィルムに感光させ、バンドの濃さから RNA量を比較した 。その結果、ミリオシン及び式 (II)で表される化合物に 1-lOnMの濃度でレプリコン RN Aを 50%減少させる効果が認められた（図 2、 3)。
[0190] 〔実施例 2〕ウェスタンプロット解析によるミリオシンまたは式 (II)で表される化合物の H CVタンパク合成阻害の測定
ウェスタン解析は以下の方法でおこなった。ミリオシン又は式 (II)で表される化合物 を ΙρΜから lOOuMの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5%CO存在下、 37度に
2
て培養した。 72時間後に培地を捨て、 PBS(Phosphate buffered saline)を加え、ピぺッ ティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。 Phosphate用溶解液 (50 m M Tris— HCl(pH7.5),0.5% Triton, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12mM glycerophospha te, 50 mM NaF, 1 mM Na VO , 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin)をカロえてピぺッテ
3 4
イングにより細胞を破壊し、高速遠心により上清を回収した。 Dye Reagent (Nacalai te sque #074-27)にてタンパク定量をおこなった（ゥシ γグロブリン標準液、 BIO- RAD#5 00-0005)。得られたタンパク質 5ugを 9 11%グラジェントゲル（第一化学薬品、 # 317 552)でトリス-グリシン- SDS緩衝液（BIO-RAD # 161-0772)で電気泳動した。分子量 サイズマ1 ~~力' ~~は Rainbow molecular weight markers、 mershamBioscience#RPN75。 )を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスブロットセル（BIO-RAD#l 70-3930) にてメンブレン（PROTRAN BA85, Nitrocellulose transfer membrane(Shleicher&Schue 11 #10401196)に転写した。 HCVタンパク由来の抗 NS3ゥサギ抗体を用いてウェスタン 解析を行った。内部標準として抗ァクチンゥサギ抗体を用いた。その結果、 ミリォシン 及び式 (II)で表される化合物に 1-lOnMの濃度で HCVタンパク質の発現を 50%減少さ せる効果が認められた（図 4, 5)。
[0191] 〔実施例 3〕フモ-シン B1の HCVレプリコン阻害活性の測定
スフインゴ脂質生合成の途中段階において、ジヒドロスフインゴシン力 ジヒドロセラ ミドを生成するジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素を特異的に阻害するフモ 二シン B1の HCVレプリコン阻害活性を測定した。
[0192] ホタル.ルシフェラーゼ HCVレプリコン細胞 (Huh- 3-1)を 5%ゥシ胎児血清（Hyclone c at. no. SH30071.03)を含むダルベッコ MEM (G¾co cat. no. 10569)に懸濁し 96穴プ レートに 5000細胞 ZWellで蒔き、 5%CO、 37度で一夜培養した。約 20時間後、フモ-
2
シン B1を順次 3倍希釈し、終濃度 1.37uMから lOOOuMになるようにカ卩え、さらに 3日間 培養した。アツセィプレートは 2系統用意し、 1つは白色プレート、他はクリアプレート でアツセィを行った。培養終了後、白色プレートは Steady- Glo Luciferase Assay Syst em (Promega cat. no. E2520)に用いた。すなわち、 Wellあたり 100 μ 1の試薬を入れ、 3 〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WALLAC)にてルミ ネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し引き 、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算出した。一方、細 胞毒性試験はセル'カウントキット 8 (DOJIN Laboratories, cat. No.341- 07761)を W ellあたり 10 μ 1入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、約 30分間放置後に OD450nm力 1.0程度 になった時点で測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し 引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算出した。
[0193] その結果、フモ-シン B1は 10-lOOOuMの濃度で、 HCVレプリコン阻害活性を示すこ とがわかった（図 6)。
[0194] 〔実施例 4〕セリンパルミトイル転移酵素の siRNA合成
SPTの阻害が HCVレプリコン活性を阻害しているかを確認する目的で、 LCB1 (SPT のへテロダイマーのうち 1サブユニット）を標的とした siRNAを合成した。 2種の特異的 な siRNA (si246、 si633)は、 LCBlcDNAの配列（GenBank Accession No. Y08685)をも とにデザインし、 Qiagen社により合成された。コントロール siRNA (配列番号： 3)は、 LC B1の発現に影響しない配列を使用した。合成した siRNA配列を配列番号： 1 (si246) および配列番号： 2に示した。
[0195] 〔実施例 5〕ウェスタンブロット解析を用いた siRNAによる LCB1のタンパク質発現阻害
6穴プレートに 1.2 X 105個の Huh-3-l細胞をまき、 37°C、 5%でー晚培養した。 2.3 μ Lの 20 μ M siRNAを 100 μ Lの ECR buffer(RNAiFect Kit中に含まれる Buffer)に加 え、激しく攪拌し、さらに 4 /z Lの RNAiFectトランスフエクシヨン試薬（Qiagen cat. No. 3 01605)を加え、緩やかに攪拌して室温にて 10分間放置した。 siRNAは、最終濃度が 35 nMになるようにカロえ、 4日間培養した。
[0196] 細胞を細胞溶解用緩衝液（50 mM Tris- HC1 (pH 7.5), 0.5% Triton, 3 mM EDTA, 1 50 mM NaCl, 12 mM glycerophosphate, 50 mM NaF, 1 mM Na^O^, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM aporotinin)に懸濁し、氷上で 10分間放置した。 15,000 X gで 10分間遠心し、 上清を回収した。タンパク質の定量後、各サンプルの蛋白量を 10 gに調製し、 1/4 量の 5 X SDSサンプル緩衝液（125 mM Tris- HC1 (pH 6.5), 25 % Glycerol, 5% SDS, 0. 25 % BPB, 5% 2-Mercaptoethanol)〖こカロえ、 98°C5分処理する。ポリアクリルアミドゲル PAGミニ 9/11 (第一化学、 cat. No. 317552)で電気泳動後、ゲルを-トロセルロースメ ンブレン PROTRAN BA85 (Schleicher&Schuell cat. No. 10404496)にブロッテイング（ 70V、 3時間）する。メンブレンを Blocking Buffer(10% skim milk, 0.1% Tween 20/PBS) で Blockingを行う。 1000倍希釈した抗 LCB1抗体（Transduction cat. No. L89820)及 び 250倍希釈した抗ァクチン (20-33)抗体（Sigma cat. No. A5060)で 2時間室温にて 反応させる。メンブレンを 0.1%Tween 20/PBSにて洗浄後、二次抗体として、 1000倍希 釈した抗マウス IgG- HRP (Cell Signaling cat. No. A7076)及び抗ゥサギ IgG- HRP (Cel 1 Signaling cat. No. A7074)を 1時間室温にてそれぞれ反応させる。メンブレンを 0.1%T ween 20/PBSにて洗浄後、 ECLで 1分間反応させ、オートラジオグラフィ一にてシグナ ルを検出した。
[0197] その結果、図 7に示すように、コントロール siRNAと比較して、 si246、 si633はともに L CB1のタンパク質発現量の減少が認められた。特に、 si246では強く発現阻害が認め られた。
[0198] 〔実施例 6〕 LCB1のノックダウンによる HCVレブリコン阻害活性効果
実施例 5の結果にもとづいて、 Huh-3-l細胞が LCB1発現を低下する条件下での細 胞毒性及び HCVレブリコン活性の影響を以下の方法にて測定した。すなわち、 96穴 プレートに 1ゥエルあたり 3500個の細胞をまき、 37°C、 5%でー晚培養した。 1.75 L の 2 M 3«^ を23.3 μ Lの ECR緩衝液 (RNAiFect Kit中に含まれる緩衝液）に加 え、激しく攪拌し、さらに 0.31 μ Lの RNAiFectトランスフエクシヨン試薬をカ卩え、緩やか に攪拌して室温にて 10分間放置した。 siRNAは、最終濃度が 35 nMになるように加え 、 4日間培養した。細胞毒性による影響は、培地に 10 μ Lの Cell counting kit-8 (DOJI N Laboratories cat. No. 341-07761)をカ卩えて 3— 4回ピペットで混和し、 37°C、 1時 間放置後、マイクロプレートリーダー Emax (Molecular devices)を用いて 450 nmの吸 光度で測定した。 HCVレブリコン活性は、培養終了後、新しい培地に交換し、 Steady -Glo Luciferase Assay System (Promega cat. no. E2520)を用い、 Wellあたり 100 μ 1の 試薬を入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WAL LAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添カロの値をバックグランドとして全ての 値力も差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC50 (50%阻害濃度)を算 出した。
[0199] その結果、図 8に示すように、 LCB1の発現を抑制した si246、 si633処理した細胞で は、コントロール siRNA処理した細胞に対し、有意に HCVレプリコン活性を阻害した。 この阻害効果は、 LCB1の発現を強く抑制した si246で強く認められた。また、同条件 下にお 、て siRNA処理による細胞毒性を調べたところ、ほとんど影響が認められなか つた o
[0200] 〔実施例 7〕 HCVレブリコンアツセィおよび細胞毒性試験
式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体につ!、て、 HCVレプリコンアツセィぉ よび細胞毒性試験を行った。
[0201] まず、 HCV—RNAのコピー数を定量するために HCV—RNAの中にレポーター遺伝 子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。 Kriegerら（J. Virol.75:4614)の方法に従い、 HCV遺伝子の IRES (Internal Ribosome Entry Site)の 直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。ィ ンビトロで当該 RNAを合成後、エレクト口ポレーシヨン法で Huh7細胞に導入し、 G418 而性クローンとして単離した。ホタル 'ルシフェラーゼ HCVレプリコン細胞（Huh-3-l) を 5%ゥシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03)を含むダルベッコ MEM (Gibco c at. no. 10569-010)に懸濁し、 96穴プレートに 5000細胞 Zゥエルで播種し、 5%CO
2
37°Cで一夜培養した。約 20時間後、希釈した試験化合物をゥエルあたり 10 1加え、 さらに 3日間培養した。アツセィプレートを 2系統用意し、 1つは白色プレート、他はタリ ァープレートでアツセィを行った。培養終了後、白色プレートは Steady- Glo Luciferas e Assay System (Promega cat. no. E2520)に用いた。すなわち、ゥエルあたり 100 μ 1の 試薬を入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450 MicroBeta TRILUX (WAL LAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添カロの値をバックグランドとして全ての 値力も差し引き、試験化合物未添加の値を阻害 0%として薬剤の IC (50%阻害濃度
50
)を算出した。
[0202] また、細胞毒性の測定には Cell counting kit- 8 (同人堂カタログ No. CK04)を用い た。すなわち、 10 1の Cell counting kit- 8をクリア一プレートに添カ卩し、 37度で 30〜60 分間保温した。 96穴プレートリーダーにて波長 450應、対照波長 630nmで吸光度を測 定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値力も差し引き、薬剤未添加の 値を阻害 0%として薬剤の CC (50%細胞阻害濃度)を算出した。
50
[0203] 上記の HCVレプリコンアツセィおよび細胞毒性試験の結果を表 1および 2に示す。
[0204] [表 1] レブリコンアツセィ 細胞毒性 化合物番号 I C50 [ M] CC50 Ifl M]
(1 ) 0. 002 >5
(2) 0. 01 0 >5
(3) < 0. 001 >5
(4) 0. 001 >5
(5) 0. 002 >5
(6) 0. 007 >5
(7) 0. 004 > 1
(8) 0. 01 4 > 1
(9) 0. 01 7 > 1
( 1 0) 0. 01 1 > 1
( 1 1 ) 0. 009 > 1
( 1 2) 0. 01 7 > 1
(1 3) 0. 01 0 > 1
( 1 4) 0. 009 > 1
( 1 5) 0. 006 > 1
( 1 6) 0. 008 > 1
(1 7) 0. 01 2 > 1
( 1 8) 0. 068 > 1
( 1 9) 0. 01 2 > 1
(20) 0. 055 > 1
(21 ) 0. 080 > 1
(22) 0. 500 > 1
(23) 0. 21 0 > 1
(24) 0. 024 > 1
(25) 0. 020 > 1
(26) 0. 001 > 1
(27) 0. 002 > 1
レブリコンアツセィ 細胞毒性
化合物番号 CC50 [jU M]
(28) 0. 001 > 1
(29) 0. 003 > 1
(30) 0. 001 > 1
(31 ) 0. 005 > 1
(32) 0. 800 >5
(33) 0. 250 > 1
(34) 0. 003 > 1
(35) 0. 004 > 1
o
(36) 0. 004 > 1
(37) 0. 01 7 > 1
(38) 0. 024 > 1
(39) 0. 002 > 1
(40) 0. 002 >5
(41 ) 0. 1 28 > 1
(42) 0. 076 > 1
(43) 0. 1 03 > 1
(44) 0. 082 > 1
(45) 0. 007 > 1
(46) 0. 002 >5
(47) 0. 005 >5
(48) 0. 020 >5
(49) 0. 245 >50
(50) 0. 262 >5
(51 ) 0. 072 >5
(52) 0. 1 > 50
(53) 0. 020 22
(54) 0. 020 > 50
[0206] 〔実施例 8〕式 (II)で表される化合物による HCVレブリコンの阻害及び宿主細胞への 毒性
HCVレプリコン細胞に、図 9に示された濃度の式 (II)で表される化合物で処理を行 レ、、レブリコン複製阻害活性及び細胞生存阻害活性を測定した。 レブリコンによるル 、ノフエフ' ι^ί¾" '性 ίま Steady— GLO luciferase assay system (Promega, cat. no. E2510) 、糸田胞生存阻害活 '性は、 Cell counting counting kit一 8 (Dojin Laboratories, cat. no.3 41-07761)を用いて測定したその結果図 9に示すように、式 (II)で表される化合物によ る処理により濃度依存的に HCVレブリコン阻害活性を認めた (IC50 = 2 nM)。また、式 (II)で表される化合物の細胞毒性は、認められな力つた（IC50 > 50nM)。
[0207] 〔実施例 9〕免疫染色法による式 (Π)で表される化合物の HCV-NS3タンパク質発現阻 害の確認
HCVレプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で 96時間処理した後、細 胞を 3.7%ホルムアルデヒドで固定した。 3% BSAでブロッキング後、 NS3抗体（Fホフ マン ·ラロシュより供与）でインキュベートした後、洗浄した細胞を Texas- Redラベルし たゥサギ IgG (Molecular probe )でインキュベートし、蛍光顕微鏡で解析した (図 10)。 その結果、図 10に示すように、 HCV-NS3タンパク質は核周辺に存在した力 式 (II) で表される化合物の添カ卩によりそれが消失した (白色で示された部分は NS3タンパク 質、灰色で示された部分はへキスト 33342 (Sigma, cat. no. B2261)で染色された核を 示す。）。
[0208] 〔実施例 10〕ウェスタンブロット解析による式 (II)で表される化合物の NS3、 NS5A及び NS5Bタンパク質の発現阻害
レプリコン細胞を 100 nMの式（II)で表される化合物で図 11に示された時間（48時 間および 96時間）処理した。ウェスタンプロット解析は、実施例 5と同様の方法にてお こなった。その結果、時間依存的に HCVの非構造タンパク質 NS3、 NS5A及び NS5Bを 各抗体で検出した結果、ウィルスタンパク質の発現レベルの低下が認められた（図 1
D o
[0209] 〔実施例 11〕式 (II)で表される化合物による SPT阻害活性
in vitr。における SPT阻害活性を測定するために、ヒト組み換え型 SPT (ヘテロダイマ 一 LCB1及び LCB2)タンパク質を調製した。ヒト肝臓の cDNAライブラリー（Clontech, c at. no. 639307)から、 LCBl及び LCB2の cDNAを RT- PCRによって取得し、 Hisタグ付 きの pBudCE4.1ベクター (Invitogen, cat. no. V532- 20)に組み込んだ。 HEK293細胞（ ATCC, cat. no. CRL- 1573)に遺伝子導入し、 72時間後、細胞を溶解し、 N卜 NTAァ ガロース（Qiagen, cat. no. 1018244)にてタンパク質を精製した。 SPT活性は反応緩衝 液 [200 mM HEPES buffer (pH 8.0), 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.05 mM pyridoxal 5 -phosphate, 0.2 mM palmitoyト CoA, 0.1 mM L- serine, and 1 mCi [3 H] serine (Amer sham, cat. no. TRK308)]に精製した SPTを加え、 15分 37°Cにて反応した。クロ口ホル ム:メタノール（1 : 2, v/v)で抽出後有機層を水で 2回再抽出した後、有機層の放射活 性を液体シンチレーシヨンカウンタ一にて測定した。その結果、図 12に示すように、 式 (II)で表される化合物は IC50約 10nMで SPT阻害活性を有していることが明らかと なった。
[0210] 〔実施例 12〕式 (II)で表される化合物によるセラミド、スフインゴミエリンの de novo合成 阻害
HCVレプリコン細胞を、図 13に示された濃度の式 (II)で表される化合物で 48時間処 理した後、 [14C]セリンで 3時間標識した。クロ口ホルム:メタノール（1 : 2, v/v)で抽出 後、 de novo合成されたセラミド（図 13A)、スフインゴミエリン（図 13B)を薄層クロマトグ ラフィ一により分離した。その結果、図 13に示すように、式 (II)で表される化合物は濃 度依存的に細胞内のセラミド及びスフインゴミエリンの de novo合成を阻害した。
[0211] 〔実施例 13〕C2—セラミドによる式 (II)で表される化合物の複製阻害の回復
式 (II)で表される化合物による HCVレブリコン阻害活性が、スフインゴ脂質生合成 経路に依存する力否かを明らかにするために、細胞性浸透性セラミド: C2—セラミド (S igma, cat. no. A7191)を式（II)で表される化合物と同時に HCVレプリコン細胞に添カロ し、 96時間培養した。細胞抽出物を用いて、実施例 5と同様の方法にてウェスタンブ ロット解析を行った。その結果 (図 14)、式 (II)で表される化合物による HCV複製阻害 は C2セラミドの濃度に依存して抑制されることが明らかとなった。
[0212] 〔実施例 14〕ラフト生合成関連低分子化合物による HCV複製阻害
HCVレプリコン細胞を、既知の SPT阻害剤ミリオシン（Sigma, cat. no. M1177)、セラ ミド合成阻害剤フモ-シン Bl(Sigma, cat. no. F1147)、およびセラミド輸送阻害剤 H PA-12 [Kobayashiら Org.lett.(2002)の合成方法に準じて合成）で処理した後、 72時間 後レブリコン活性及び生細胞数を測定した。その結果、いずれの化合物も細胞毒性 を認めな 、濃度で HCVの複製を抑制する効果が認められた (図 15)。
[0213] 〔実施例 15〕式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質の影響（1)
HCVレプリコン細胞に ImMの式 (II)で表される化合物を 72時間添加した後、細胞抽 出液を可溶化剤 1% Nonidet P- 40 (Nacalai tesque, cat. no. 252- 23)にて 1時間処理し た。ショ糖密度勾配分画法により、フラクション 1—9まで分離し、ウェスタンプロット解 析は、実施例 5と同様な方法にて行った。その結果、図 16に示すように式 (II)で表さ れる化合物は可溶化剤耐性画分の NS5Bの発現レベルを低下させた。し力しながら、 NS5Aや宿主のラフト結合タンパク質力べオリン -2にお 、て式 (II)で表される化合物に よる影響は認められなかった。力べォリン- 2の発現は力べォリン- 2抗体（BD Transduc tion, cat. no. 610684)により確認した。
[0214] 〔実施例 16〕式 (II)で表される化合物によるラフトタンパク質の影響 (2)
HCVレプリコン細胞に ImMの式 (II)で表される化合物を 72時間添加した後、細胞抽 出液を 1% NP-40で 1時間処理した。ショ糖密度勾配分画法により、ラフトタンパク質（ 可溶化剤耐性)、非ラフトタンパク質を分離し、 PBSで希釈し濃縮後 ELISA解析により 定量した。その結果、式 (II)で表される化合物は、 NS5Bにおいて有意にラフト上から 解離が認められた (図 17)。
産業上の利用可能性
[0215] 本発明により、スフインゴ脂質生合成が HCV感染に関与することがわかり、スフイン ゴ脂質生合成に関わる酵素の活性や発現を阻害する化合物が、 HCV感染症の極め て有用な治療剤または予防剤となりうることがわ力つた。また、スフインゴ脂質であるス フインゴミエリンは細胞膜上のラフトの構成成分であり、インフルエンザ、 HIV等のウイ ルスがラフトを介して複製されることから（Takeda M. et al. (2003) PNAS, 100, 25、 Lu cero H. A., et al. (2004) Archives of Biochemistry and Biophysics, 426, 208、 Simons
K. (1997) Nature, 387, 569、 G.— Z. Leu et al. (2004))、 HCVはラフトを介して複製 されていることが強く示唆された。よって、ラフトを標的とした本発明の化合物を有効 成分とする薬剤は、 HCV感染症を予防または治療する薬剤として利用できる可能性 がある。
[0216] これまでの HCV感染症を予防または治療する薬剤は、生体内のどのカスケードに 作用するかが知られておらず、副作用が心配されていたが、本発明の薬剤は標的が 明確であるため、副作用の排除、薬剤の効果の調節等が容易に行えるものと考えら れる。
[0217] また、本発明の薬剤は HCV感染症を予防または治療する薬剤として使用できるだ けではなぐスフインゴ脂質合成の異常によって引き起こされる疾患、例えば脂質 (ス フインゴミエリン)が異常蓄積する疾患であるスフインゴリビドーシス、スフインゴリピドバ インデイングモチーフを持つベータアミロイドタンパク質が関与するアルツハイマー病 、 gpl20タンパク質が関与する HIV感染症、および PrPタンパク質が関与するプリオン 病、さらには、脊髄運動-ユーロン内のセラミドが増加し神経細胞死を引き起こす筋 萎縮性側索硬化症（Cutler, R. G., et al., Ann. Neurol., 52, 448-457, 2002)、ラフト に結合して宿主細胞に感染するウィルス感染症（例えばインフルエンザ、 HIV)等の 有用な予防または治療する薬剤として利用できると考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] スフインゴミエリンの生合成過程を遮断する化合物を有効成分として含有する、 HC
V感染症を治療または予防するための薬剤。
[2] スフインゴミエリンの生合成過程力 パルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成 過程である請求項 1に記載の薬剤。
[3] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。
(a)パルミトイル CoAから 3-ケトジヒドロスフインゴシンの生合成に関与する、セリンパ ルミトイル転移酵素 (SPT)の酵素活性を阻害する化合物
(b)セリンパルミトイル転移酵素（SPT)の発現を抑制する化合物
[4] セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物力 スフインゴファンギン 、ミリオシン、以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体である、請求項 3 に記載の薬剤。
式 (I) :
Figure imgf000071_0001
〔式中、 Aは、 - (CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；
2 n
Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N
2 2
OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァ ルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換さ れて 、てもよ 、ァミノ基で置換されて 、てもよ 、）を表し；
Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子
2 m
、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、シクロアルケ-ル基、置換され ていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよい ヘテロァリール基、—OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状の アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ -ル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、または ハロゲン原子を表し；
Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH
2 p
基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖も しくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置 換されて 、てもよ 、複素環式基、または置換されて 、てもよ 、ヘテロァリール基を表 し；
結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして
及び R3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は 分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分 岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分 岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を 示す。〕
セリンパルミトイル転移酵素の酵素活性を阻害する化合物が、以下の式 (II)で表さ れる化合物またはそれらの誘導体である、請求項 3に記載の薬剤。
式 (Π) :
Figure imgf000072_0001
[6] セリンパルミトイル転移酵素の発現を抑制する化合物力 以下の（a)または (b)であ る、請求項 3に記載の薬剤。
(a)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA
(b)セリンパルミトイル転移酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリ ボザィム活性を有する RNA
[7] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。
(a)スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、 ジヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物
(b) (a)に記載のジヒドロスフインゴシン—N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合 物
[8] スフインガニン (ジヒドロスフインゴシン)力もジヒドロセラミドの生合成に関与する、ジ ヒドロスフインゴシン N ァシル転移酵素活性を阻害する化合物力 フモ-シン B1 またはその誘導体である請求項 7に記載の薬剤。
[9] ジヒドロスフインゴシン N ァシルイ匕酵素の発現を抑制する化合物力 以下の（a) または (b)である、請求項 7に記載の薬剤。
(a)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物と相補的 な RNA
(b)ジヒドロスフインゴシン N ァシル化酵素をコードする DNAの転写産物を特異 的に開裂するリボザィム活性を有する RNA
[10] 以下の (a)または (b)を有効成分として含有する、請求項 2に記載の薬剤。
(a)セラミドからスフインゴミエリンの生合成に関与する、スフインゴミエリン合成酵素の 酵素活性を阻害する化合物
(b) (a)に記載のスフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物
[11] スフインゴミエリン合成酵素の発現を抑制する化合物が、以下の（a)または (b)であ る、請求項 10に記載の薬剤。
(a)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物と相補的な RNA
(b)スフインゴミエリン合成酵素をコードする DNAの転写産物を特異的に開裂するリボ ザィム活性を有する RNA [12] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 1〜11の いずれかに記載の薬剤。
[13] 以下の式 (I)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転 移酵素阻害剤。
式 (I) :
Figure imgf000074_0001
〔式中、 Aは、 - (CH ) —を表し、ここで nは、 0〜10の整数を表し；
2 n
Bは、 CH —、 - (C = 0) 一、 -CH (OH) 一、 CH (NH ) 一、または一 C ( = N
2 2
OR) を表し、ここで Rは、水素原子、炭素数 1〜8の直鎖状もしくは分岐鎖状のァ ルキル基 (炭素数 1〜4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換さ れて 、てもよ 、ァミノ基で置換されて 、てもよ 、）を表し；
Dは、—（CH ) を表し、ここで mは、 0〜 10の整数を表し、 R' は、水素原子
2 m
、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖 もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、シクロアルキル基、シクロアルケ-ル基、置換され ていてもよい複素環式基、置換されていてもよいァリール基、置換されていてもよい ヘテロァリール基、—OX基 (ここで、 Xは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状の アルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ -ル基、シクロアルキル基、または置換されていてもよいァリール基を表す）、または ハロゲン原子を表し；
Eは、水素原子または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し；
Gは、一（CH ) —Jを表し、ここで pは、 0〜4の整数を表し、 Jは、水素、 OH基、 SH
2 p
基、メチルチオ基、カルボキシル基、力ルバモイル基、アミノ基、グァ -ジノ基、直鎖も しくは分岐鎖状のアルキル基、シクロアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ- ル基、直鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、置換されていてもよいァリール基、置 換されて 、てもよ 、複素環式基、または置換されて 、てもよ 、ヘテロァリール基を表 し；
結合 Qは、単結合または二重結合を表し;そして
及び R3は、同一又は異なって、水酸基、アミノ基 (炭素数 1〜4の直鎖又は 分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、 OL、直鎖又は分 岐鎖状のアルキル基、直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または直鎖もしくは分 岐鎖状のアルキニル基を表し、ここで Lは、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、直 鎖もしくは分岐鎖状のァルケ-ル基、または直鎖もしくは分岐鎖状のアルキ-ル基を 示す。〕
以下の式 (II)で表される化合物またはそれらの誘導体を含む、セリンパルミトイル転 移酵素阻害剤。
式 (Π) :
Figure imgf000075_0001
[15] ヒト由来のセリンパルミトイル転移酵素を阻害する、請求項 13または 14に記載の阻 害剤。
[16] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤の スクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
(b) (a)に記載の酵素と被検化合物の結合を検出する工程
(c) (a)に記載の酵素と結合する被検化合物を選択する工程
[17] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤の スクリーニング方法。
(a)被検化合物を細胞に接触させる工程
(b)スフインゴミエリンの生合成過程で合成される化合物の量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させて ヽな 、場合と比較して、上記化合物の量を減少させた 被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
[18] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤の スクリーニング方法。
(a)被検化合物を細胞に接触させる工程
(b)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物を接触させて!ヽな!ヽ場合と比較して、上記酵素の発現レベルを減少 させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。
[19] 以下の（a)〜（d)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤の スクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素をコードする DNAのプロモーター 領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した DNAを有する細胞または細胞 抽出液を提供する工程
(b)該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
(c)該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定 する工程
(d)被検化合物を接触させて!/、な!、場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レ ベルを減少させた被検化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択 する工程。
[20] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、 HCV感染症を治療または予防するための薬剤の スクリーニング方法。
(a)スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素に被検化合物を接触させる工程
(b)該スフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素の活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、上記酵素の活性を低下させた被検 化合物を、 HCV感染症を治療または予防する薬物として選択する工程。 [21] スフインゴミエリンの生合成過程力 パルミトイル CoA力もスフインゴミエリンの生合成 過程である請求項 16〜20のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[22] ノ ルミトイル CoAからスフインゴミエリンの生合成過程に関与する酵素力 セリンノ ル ミトィル転移酵素、 N—ァシル転移酵素およびスフインゴミエリン合成酵素である、請 求項 21に記載のスクリーニング方法。
[23] HCV感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化、または肝癌である、請求項 16〜22 のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[24] 請求項 16〜23のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
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