ES2206997T3 - Derivados de indeno(1,2-c)-,de nafto(1,2-c),y de benzo(6,7)cicloepta(1,2-c)pirazol. - Google Patents

Derivados de indeno(1,2-c)-,de nafto(1,2-c),y de benzo(6,7)cicloepta(1,2-c)pirazol.

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ES2206997T3 ES98951011T ES98951011T ES2206997T3 ES 2206997 T3 ES2206997 T3 ES 2206997T3 ES 98951011 T ES98951011 T ES 98951011T ES 98951011 T ES98951011 T ES 98951011T ES 2206997 T3 ES2206997 T3 ES 2206997T3
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Abstract

Uso de un compuesto representado por la fórmula: en la que el anillo A representa las estructuras tautómeras n es 1, 2 ó 3; Ar es y R1, R2, R4 y R5 representan cada uno de ellos independientemente hidrógeno, halógeno, que tiene un peso atómico de aproximadamente 19 a 36, alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi inferior, trifluorometilo o R1, R2 y R4, R5 representan independientemente metilendioxi unido a los átomos de carbono adyacentes; R3 es hidrógeno, -COR6, o -SO2R6 y R6 es -CH3 o donde Y es hidrógeno, cloro o -CH3 para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la actividad de tirosina cinasa.

Description

Derivados de indeno[1,2-c]-, de nafto[1,2-c]-, y de benzo[6,7]cicloepta[1,2-c]pirazol.
Antecedentes de la invención
Las proteínas tirosina cinasas (PTK) comprenden una amplia y diversa clase de proteínas que poseen actividad enzimática. Las PTK desempeñan una importante función en el control del crecimiento y la diferenciación celular (para revisión, consultar Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391).
Por ejemplo, la transducción de señal mediada por tirosina cinasa receptora se inicia a través de la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), típicamente, seguido de la dimerización de receptor, estimulación transitoria de la actividad de proteína tirosina cinasa intrínseca y fosforilación. De este modo se crean los sitios de unión para las moléculas de transducción de señal intracelular, lo que conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señal citoplásmicas que facilita la respuesta celular apropiada (v.g., división celular, efectos metabólicos, respuestas al entorno extracelular) consultar Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9: 1-20.
En lo que se refiere a las tirosina cinasas receptoras, se ha demostrado que también los sitios de fosforilación de tirosina funcionan como sitios de unión de alta afinidad para dominios SH2 (homología src) de moléculas de señañización (Fantl y cols., 1992, Cell 69:413-423: Songyang y cols., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785; Songyang y cols, 1993, Cell 72: 767-778; y Koch y cols., 1991, Science 252: 668-678). Se han identificado diversas proteínas de sustrato intracelular que se asocian con tirosina cinasas receptoras (RTK). Se pueden dividir en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico y (2) sustratos que carecen de dicho dominio pero que funcionan como adaptadores que se asocian con moléculas catalíticamente activas (Songyang y cols., 1993, Cell 72:767-778). La especificidad de las interacciones entre los receptores o proteínas y dominios SH2 de sus sustratos se determina por los radicales amino ácido que rodean inmediatamente al radical tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácido que rodean los radicales fosfotirosina en receptores concretos se corresponden con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato (Songyang y cols., 1993, Cell 72: 767-778). Estas observaciones sugieren que la función de cada tirosina cinasa receptora se determina no solamente por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando, sino también por la ordenación de las rutas de transducción de señal corriente abajo que se activan a través de un receptor en particular. Por lo tanto, la fosforilación proporciona una importante etapa reguladora que determina la selectividad de las rutas de señalización reclutadas por receptores de factor de crecimiento específicos, así como receptores de factor de diferenciación.
Se ha demostrado que la estimulación aberrante, la expresión o las mutaciones en las PTK conduce o bien a una proliferación celular descrontrolada (v.g., crecimiento de tumores malignos) o bien a defectos en los procesos reparadores o del desarrollo claves. En consecuencia, la comunidad biomédica ha consumido considerables recursos en el descubrimiento del papel biológico específico de miembros de la familia PTK, su función en procesos de diferenciación, su implicación en la génesis de tumor y en otras enfermedades, los mecanismos bioquímicos que subrayan sus rutas de transducción de señal activadas tras la estimulación de ligando y el desarrollo de nuevos fármacos.
Las tirosina cinasas pueden ser de tipo receptor (que tienen dominios intracelulares, de transmembrana y extracelulares) o de tipo no receptor (que son totalmente intracelulares).
Tirosina cinasas receptoras (RTK). Las RTK comprenden una gran familia de receptores de transmembrana con diversas actividades biológicas. La familia de tirosina cinasas receptoras (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una serie de tipos de células (Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433-478, 1988; Ullrich y Schalessinger, Cell 61: 243-254, 1990). La función intrínseca de RTK se activa tras la unión a ligando, lo que tiene como resultado la fosforilación del receptor y sustratos celulares múltiples y, en consecuencia, una serie de respuestas celulares (Ullrich y Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212).
En el momento actual, se han identificado al menos diecinueve (19) subfamilias RTK distintas. Se cree que una de las subfamilias RTK designada subfamilia HER comprende EGRF, HER2, HER3 Y HER4. Los ligandos con la subfamilia HER de receptores incluyen factor de crecimiento epitelial (EGF), TGF-\alpha, anfirregulina, HB-EGF, betacelulina y heregulina. Se cree que la regulación aberrante de la actividad de cinasa HER2/erbB2 promueve un fenotipo tumorigénico transformado, sobre todo en carcinoma de pecho. Otras dos subfamilias de RTK se designan subfamilia de receptor insulina, que comprende INS-R, IGF-1R e IR-R y subfamilia "PDGFR" que incluye los receptores PDGF\alpha y receptores \beta, CSF-1R y c-kit.
Se ha sugerido que diversas tirosina cinasas receptoras, así como factores de crecimiento que se unen a las mismas, desempeñan un papel en la angiogénesis, si bien algunas pueden potenciar la angiogénesis indirectamente (Mustonen y Alitalo, J. Cell. Biol. 129:895-898, 1995). Una de dichas tirosina cinasas receptoras, conocida como cinasa de hígado fetal 1 (flk-1), es un miembro de la subclase de tipo III de RTK. Una designación alternativa para la flk-1 humana es receptor que contiene dominio de inserto de cinasa (KDR) (Terman y cols., Oncogene 6:1677-83, 1991). Otra designación alternativa para flk-1/KDR es "receptor 2 de factor de crecimiento celular endotelial vascular" (VEGFR-2). La versión murínica de flk-1/VEGFR-2 ha sido denominada también NYK (Oelrichs y cols., Oncogene 8 (1): 11-15, 1993). Se han aislado ADN que codifican flk-1 de ratón, rata y ser humano y se han descrito las secuencias de nucleótido y de aminoácido codificadas (Matthews y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026-30, 1991): Terman y cols., 1991, anterior; Terman y cols., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-86, 1992; Sarzani y cols., anterior; y Millauer y cols., Cell 72:835-846, 1993).
La subclase de RTK de tipo III designada tirosina cinasa-1 de tipo fms (flt-1) está relacionada con flk-1/KDR (DeVries y cols., Science 255; 989-991, 1992; Shibuya y cols. Oncogene 5:519-524, 1990). Una designación alternativa para flt-1 es "receptor de factor de crecimiento celular endotelial vascular 1" (VEGFR-1). Hasta la fecha, se han encontrado miembros de las subfamilias flk-1/KDR/VEGFR-2 y flt-1/VEGFR-1 principalmente en células endoteliales. Estos miembros de subclase se estimulan específicamente a través de miembros de la familia de ligandos factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) (Klagsburn y D'Amore, Cytokine & Groth Factor Reviews 7: 259-270, 1996). Se cree que flt-1 es fundamentel para la organización endotelial durante el desarrollo vascular. La expresión de flt-1 está asociada con un desarrollo vascular temprano en embriones de ratón y con la neovascularización durante la cicatrización de heridas (Mustonen y Alitalo, ver anterior). La expresión de flt-1 en órganos adultos sugiere una función adicional para este receptor que no está relacionado con el crecimiento celular (Mustonen y Alitalo, ver anterior).
Otra RTK que está relacionada con flt-1 y flk-1/KDR es flt-4 (Galland y cols. Oncogene 8:1233-40, 1993; Pajusola y cols., Oncogene 8:2931-37, 1993). Los rasgos compartidos por estos tres receptores incluyen los site dominios de tipo inmunoglobulina en su región extracelular. La secuencia de aminoácido de flt-4 presenta una significativa homología con las secuencias de flt-1 y flk-1/KDR, especialmente en el dominio tirosina cinasa (Galland y cols., ver anterior). A diferencia de flt-1 y flk-1, no obstante, una forma precursora de flt-4 se segmenta durante el proceso de post-traducción para formar dos polipéptidos unidos a disulfuro (Pajusola y cols., ver anterior). Los estudios de la expresión de flt-4 durante el desarrollo corroboran la teoría del origen venoso de los vasos linfáticos (Kaipainen y cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3566-70, abril, 1995).
Dado el crucial papel de las células endoteliales en la angiogénesis, los factores de crecimiento que actúan sobre las células endoteliales son de particular interés para estudios de la regulación de la vascularización. Uno de dichos factores es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se une tanto a flk-1/KDR como flt-1 con una afinidad relativamente alta y es mitógeno para las células endoteliales vasculares (Terman y cols., 1992, ver anterior; Mustonen y cols. ver anterior; DeVries y cols., ver anterior). VEGF no se une a flt-4 (Pajusola y cols., ver anterior). Estos estudios registrados en Millauer y cols., ver anterior, sugieren que VEGF y flk11/KDR/VEGFR-2 son un par ligando-receptor que desempeña un importante papel en la formación y brote de vasos sanguíneos, denominados vasculogénesis y angiogénesis, respectivamente.
Se han descrito las diferentes formas de VEGF que surgen como división alternativa de ARNm incluyendo las cuatro especies descritas por Ferrara y cols., (J. Cell. Biochem. 47:211-218, 1991). Tanto las especies secretadas como las asociadas a célula predominantemente de VEGF han sido identificadas por Ferrara y cols., ver anterior, y se sabe que la proteína existe en forma de dímeros unidos a disulfuro.
Asimismo, se sabe que existen diversos mecanismos fisiológicos y bioquímicos que subyacen al edema y la formación del estado edematosos en un individuo. Un importante mediador en uno o más de estos mecanismos es el "factor de crecimiento celular endotelial vascular" (VEGF). Este mediador también es conocido como "factor de permeabilidad vascular" (VPF). Este factor regula el transporte en las células endoteliales vasculares, y causa un aumento de la permeabilidad de numerosos lechos vasculares, incluyendo los tejidos de la piel, subcutáneos, la pared peritoneal, mesenterio, diafragma, tráquea, bronquios, duodeno y útero. Estos efectos de mayor permeabilidad pueden ir acompañados de una diapedesis significativa, alteraciones en el intercambio a través del endotelio, extravasación y depósito de macromoléculas en estos sitios e hipotensión prolongada. Se cree que estos procesos constituyen un preludio que facilita la neovascularización. VEGF se expresa mediante células T inflamatorias, macrófagos, neutrófilos y eosinófilos, etc. en los sitios de inflamación. El factor se regula por hipoxi, determinadas hormonas vasopresoras, factores de crecimiento, hormonas reproductivas y numerosas citoquinas inflamatorias. Se ha relacionado la permeabilidad vascular mediada por VEGF con trastornos como ascitis tumoral, endometriosis, respuestas edematosas a quemaduras y traumatismos, disfunción endotelial en diabetes, complicaciones de síndrome de hiperestimulación ovárica y edema ocular.
Por lo tanto, es evidente que la inhibición de la producción o actividad de VEGF podría ser beneficiosa, sobre todo para bloquear la manifestación de los trastornos antes mencionados. En particular, serían útiles para aliviar dichos trastornos agentes capaces de bloquear la hiperpermeabilidad y edema mediados por VEGF y los síndromes relacionados.
El factor de crecimiento de placenta (PIGF) tiene una secuencia de aminoácido que presenta una significativa homología con la secuencia VEGF (Park y cols., J. Biol. Chem. 269-25646-54, 1994; Maglione y cols., Oncogene 8:925-31, 1993). Al igual que con VEGF, surgen diferentes especies de PIGF a partir de la división alternativa de ARNm, y la proteína existe en forma dimérica (Park y cols., ver anterior). PIGF se une a flt-1 con alta afinidad, pero no a flk-1/KDR (Park y cols., ver anterior). PIGF potencia el efecto mitógeno de VEGF sobre las células endoteliales cuando VEGF está presente en bajas concentraciones, pero no tiene ningún efecto detectable cuando VEGF está presente a una concentración más alta (Park y cols., ver anterior).
Se han designado otras dos subfamilias de RTK como familia redeptora FGF (FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4) y la subfamilia Met (c-met y Ron).
Dadas las similitudes entre las subfamilias PDGF y FLK, frecuentemente se consideran juntas las dos subfamilias. Las subfamilias RTK conocidas han sido identificadas en Plowman y cols., 1994, DN&P 7(6):334-339.
Es deseable inhibir la angiogénesis en determinadas situaciones clínicas (v.g., para suprimir el crecimiento y metástasis de tumores sólidos, o en el tratamiento de artritis reumatoide), al mismo tiempo que la promoción de la vascularización es beneficiosa para el tratamiento de otros estados patológicos (v.g., cicatrización de heridas). En consecuencia, son interesantes tanto las moléculas que potencian la angiogénesis transduciendo señales a través de los receptores antes mencionados, como las moléculas que son capaces de inhibir la transducción de señal.
Tirosina cinasas no receptoras. Las tirosina cinasas no receptoras representan una colección de enzimas celulares que carecen de secuencias extracelulares y de transmembrana. En el momento actual, se han identificado más de veinticuatro tirosina cinasas no receptoras, que comprenden (11) subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK). En el momento actual, la subfamilia Src de tirosina cinasas no receptoras comprende el mayor número de PTKs e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr y Yrk. Se ha relacionado la subfamilia de enzimas Src con la oncogénesis. En Bolen, 1993, Oncogene 8:2025-2031 se puede encontrar una explicación más detallada de tirosina cinasas no receptoras.
Se ha observado que muchas tirosina cinasas, ya sean RTK o tirosina cinasas no receptoras, están relacionadas con rutas de señalización celular implicadas en numerosos estados patológicos, incluyendo cáncer, psoriasis y otros trastornos hiperproliferativos de respuestas hiper-inmunes.
Desarrollo de compuestos para modular las PTK. Teniendo en cuenta la supuesta importancia de las PTK para el control, regulación y modulación de la proliferación celular, las enfermedades y los trastornos asociados con una proliferación celular anormal, se han realizado numerosas tentativas para identificar "inhibidores" de tirosina cinasas receptoras y no receptoras a través de la aplicación de diferentes métodos, incluyendo el uso de ligandos mutantes (solicitud EE.UU. Nº 4.966.849), receptores y anticuerpos solubles (solicitud Nº WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci 90: 10705-09; Kim y cols., 1993; Nature 362: 841-844), ligandos RNA (Jellinek y cols., Biochemistry 33: 10450-56; Takano y cols., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella y cols., 1992, Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright y cols. 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) e inhibidores de tirosina cinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; patente EE.UU. Nº 5.330.992; Mariani y cols., 1994 Proc. Am. Associ. Cancer Res. 35:2268).
Más recientemente, se han realizado tentativas para identificar moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de tirosina cinasa. Por ejemplo, se han descrito compuestos arilo monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT WO 92/20642), compuestos de pirazoloquinazolina (Palmer, y cols., J. Med. Chem. (1997), 40: 1519), 4-amino-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidinas (PCT WO 96/31510), pirazoles sustituidos (PCT WO 96/14843) y derivados de vinileno-azaíndol (PCT WO 94/14808), de forma general como inhibidores de tirosina cinasa. Se han descrito compuestos de estirilo (patente EE.UU. Nº 5.217.999), compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (patente EE.UU. Nº 5.302.606), determinados derivados de quinazolina (solicitud EP Nº 0.566.266 A1), seleoindoles y selenidas (PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO92/21660), 4-amino-1H-pirazol[3,4-d]pirimidinas (PCT WO 96/31510) y compuesto de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) como compuestos para su uso como inhibidores de tirosina cinasa para su uso en el tratamiento del cáncer.
Se han descrito indeno-, nafto- y cicloheptapirazoles como agentes abortivos y antifertilidad (Coombs y Houlihan, patente EE.UU. Nº 3.843.665 y Habeck y Houlihan, patente EE.UU. Nº 3.932.430).
Así pues, es deseable la identificación de compuestos pequeños efectivos que inhiban específicamente la transducción de señal de tirosina mediante la modulación de la actividad de las tirosina cinasas receptoras y no receptoras para regular la proliferación celular anormal o inapropiada.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de tirosina cinasa a través de la administración de compuestos de fórmula:
1
en la que A representa las estructuras:
2
n es 1, 2 ó 3;
Ar es
3
y
R^{1}, R^{2} y R^{4} y R^{5} representan cada uno de ellos independientemente hidrógeno, halógeno con un peso molecular de aproximadamente 19 a 36, alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi inferior, trifluorofenilo o
R^{1}, R^{2} y R^{4}, R^{5} representan independientemente metilendioxi unido a los átomos de carbono adyacentes;
R^{3} es hidrógeno, COR^{6}, o SO_{2}R^{6}
R^{6} es -CH_{3} o
4
donde Y es hidrógeno, cloro o -CH_{3}.
Dentro de la invención se incluyen los enantiómeros, tautómeros y mezclas de estos compuestos. Asimismo, se incluyen dentro de la invención las sales de adición de ácido de estos compuestos farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos representados por la fórmula estructural I son útiles como inhibidores de la actividad de tirosina cinasa. En particular, estos compuestos son útiles como inhibidores de tirosina cinasas que son importantes en el proceso de angiogénesis. Por otra parte, estos compuestos también son útiles como inhibidores de tirosina cinasas que son importantes en el proceso de hiperpermeabilidad vascular. Dado que estos compuestos son anti-angiogénicos e inhiben la hiperpermeabilidad vascular, son sustancias importantes para inhibir la progresión de estados patológicos en los que son importantes componentes la angiogénesis y la hiperpermeabilidad vascular.
Entre los compuestos preferibles para su uso en el método de la presente invención se incluyen aquellos que presentan las siguientes fórmulas:
5
La presente invención incluye además el uso de estos compuestos en composiciones farmacéuticas con una cantidad farmacéuticamente efectiva de los compuestos antes descritos, así como un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar a individuos para reducir o detener el proceso de angiogénesis en enfermedades favorecidas por la angiogénesis o de hiperpermeabilidad vascular en enfermedades asociadas con este proceso.
Descripción detallada de la invención
Los compuestos representados por la fórmula estructural I poseen propiedades antiangiogénicas. Por esta razón, estos compuestos se pueden utilizar como agentes activos contra estados patológicos como artritis, aterosclerosis, psoriasis, hemangiomas, angiogénesis micárdica, efectos colaterales coronarios y cerebrales, angiogénesis de extremedidad esquémica, cicatrización de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, fiebre por arañazo de gato, rubeosis, glaucoma neovascular y retinopatías, como por ejemplo las asociadas con retinopatía diabética o la degeneración macular relacionada con la edad. Por otra parte, se pueden utilizar algunos de estos compuestos como agentes activos contra tumores sólidos y trastornos hiperproliferativos ya que dichas enfermedades requieren una proliferación de las células de los vasos sanguíneos para el crecimiento y la metástasis.
Los compuestos representados por la Fórmula Estructural I presentan actividad inhibidora contra tirosina cinasas. Es decir, estos compuestos modulan la transducción de señal a través de tirosina cinasas. En particular, estos compuestos inhiben de forma selectiva la actividad de KDR/FLK-1/VEGFR-2 tirosina cinasas. Determinados compuestos de la presente invención inhiben también la actividad de tirosina cinasas adicionales como Flt-1/VEGFR-1, cinasas de subfamilia Src, tales como Lck, Src, fyn, yes, etc. La existencia y potencia de la actividad inhibidora de los compuestos de la presente invención contra una tirosina cinasa determinada depende de la naturaleza, el número y el ordenamiento de los sustituyentes (v.g., R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}) de estos compuestos.
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Estos compuestos representados por la fórmula estructural I, cuando se administran a individuos que necesitan dichos compuestos, también inhiben la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edema en estos individuos. Estos compuestos actúan, se cree, inhibiendo la actividad mediada por receptores VEGF que están implicados en el proceso de hiperpermeabilidad vascular y formación de edema. VEGF es único ya que es el único factor de crecimiento angiogénico que, según se sabe, contribuye directamente a la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edema. De hecho, la hiperpermeabilidad vascular y el edema asociado con la expresión o administración de muchos otros factores de crecimiento parece estar medida por la producción de VEGF. Frecuentemente la hiperpermeabilidad vascular va acompañada también de diapedesis. De manera similar, la hiperpermeabilidad vascular excesiva puede interrumpir el intercambio molecular normal a través del endotelio en tejidos y órganos críticos (v.g. pulmones y riñones), perturbando así su función y causando una extravasación macromolecular y depósito. Al inhibir la actividad de cinasa de receptores VEGF, la hiperpermeabilidad, así como la extravasación asociada, se inhibe y se reduce al mínimo la consiguiente formación de edema o ascitis y el depósito de matriz.
Por otra parte, las formas N-aciladas (R^{3}= -COR^{6}) o los análogos N-sulfonilados (R^{3}= -SO_{2}R^{6}) de los compuestos de la presente invención también pueden servir como profármacos que actúan como agentes antiangiogénicos activados metabólicamente.
Se prevé que los trastornos antes enumerados están mediados en un grado significativo por la actividad de proteína tirosina cinasa que implica KDR/VEGFR-2 y/o Flt-1/VEGFR-1 tirosina cinasas. Al inhibir la actividad de estas tirosina cinasas, se inhibe la progresión de los trastornos enumerados ya que se reduce severamente el componente angiogénico del estado patológico. La acción de los compuestos de la invención, a través de su selectividad para tirosina cinasas específicas, tiene como resultado una reducción al mínimo de los efectos secundarios que podrían producirse si se utilizaran inhibidores de tirosina cinasa menos selectivos.
La potencia y especificidad de los compuestos genéricos de la presente invención se pueden alterar frecuentemente y optimizar a través de variaciones sustituyentes y restricciones conformacionales.
En la presente invención, son apreciables las siguientes definiciones:
"Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales que retienen la eficacia biológica y las propiedades de bases libres y que se obtienen por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico o ácidos orgánicos como ácido sulfónico, ácido carboxílico, ácido fosfórico orgánico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido tartárico y similares.
"Alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo grupos de cadena lineal o ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono.
"Alcoxi" se refiere a un grupo "O-alquilo" en el que "alquilo" se define como se ha definido antes.
Formulaciones farmacéuticas y rutas de administración
Los compuestos identificados en la presente invención se pueden administrar a un paciente humano como tales o como composiciones farmacéuticas, mezclándolos con vehículos o excipientes adecuados, en dosis suficientes para tratar o mejorar una serie de enfermedades. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a una cantidad del compuesto suficiente como para tener como resultado una mejora de los síntomas. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente invención se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Rutas de administración
Las rutas de administración adecuadas pueden incluir por ejemplo administración oral, gotas oculares, administración rectal, transmucosal, tópica o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Alternativamente, se puede administrar el compuesto de forma local en lugar de una manera sistémica, por ejemplo, por inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, a menudo en una formulación de liberación sostenida o de depósito.
Por otra parte, se puede administrar el fármaco en un sistema de administración de fármaco dirigida, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tumor. Los liposomas irán dirigidos y serán absorbidos selectivamente por el tumor.
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Composición /formulación
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar según el modo conocido, v.g., a través de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulando, formación de grageas, levigación, emulsión, ensapsulado, atrapamiento o liofilizado.
Las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención se pueden formular por lo tanto según el modo convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que incluyen excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración seleccionada.
Para inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles como, por ejemplo, solución de Hanks, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosal, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera que deben traspasar. Dichos agentes de penetración son conocidos generalmente dentro de la técnica.
Para administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptable muy conocidos dentro de la técnica. Dichos vehículos permiten la formulación de los compuestos de la invención como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión oral por parte del paciente en tratamiento. Las preparaciones farmacéuticas para su uso oral se pueden obtener combinando los compuestos activos con un excipiente sólido, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla del granulado, tras la adición de auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Entre los excipientes adecuados se incluyen en particular cargas como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetilcelulosa sólida, y/o polivinil pirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir los agentes disgregantes, como por ejemplo polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de ellos, como alginato sódico.
Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden utilizar soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilen glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes y pigmentos a los recubrimientos de tabletas o grageas para la identificación o la caracterización de diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar por vía oral incluyen cápsulas encajadas a presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante como glicerol o sorbitol. Las cápsulas a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga como lactosa, aglutinantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafinas líquidas o polietilen glicoles líquidos. Por otra parte, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deberán presentarse en dosis adecuadas para dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden presentar la forma de tabletas o pastillas formuladas según el modo convencional.
Para administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente invención se administran convencionalmente en forma de pulverizador de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, v.g., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono y otro gas adecuado. En el caso de aerosol presurizado, se puede determinar la unidad de dosis proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, v.g., de gelatina para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular con un contenido de una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, v.g., inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosis unitaria, v.g., en ampollas o en contenedores de multi-dosis, con la adición de un conservante. Las composiciones pueden adoptar la forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación como por ejemplo agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en una forma hidrosoluble. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar en suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Entre los disolventes o vehículos lipófilos adecuados se incluyen aceites grasos como, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos, como oleato de etilo o triglicéricos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetil celulosa sólida, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, v.g., agua sin pirógenos esterilizada, antes de su uso.
Los compuestos pueden formularse también en forma de composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, v.g., con contenido en bases para supositorio convencionales como mantequilla de cacao y otros gliceridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de larga actuación se pueden administrar por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular o por inyección intramuscular). Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o derivados poco solubles, por ejemplo, una sal poco soluble.
Un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de la invención es un sistema de co-disolvente que comprende alcohol bencílico, un agente tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema de co-disolvente puede consistir en el sistema de co-disolvente VPD. VPD es una solución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del polisorbato de agente tensioactivo no polar 80, y 65% p/v de polietilen glicol 300, completado al volumen en etanol absoluto. El sistema de codisolvente VPD (VPD:5W) consiste en VPD diluido 1:1 con 5% de dextrosa en solución acuosa. Dicho sistema de co-disolvente disuelve los compuestos hidrófobos y produce por sí mismo una baja toxicidad tras la administración sistémica. Naturalmente, pueden variar las proporciones del sistema de co-disolvente de forma considerable sin destruir su solubilidad y características de toxicidad. Por otra parte, la identidad de los componentes de co-disolvente puede variar: por ejemplo, se pueden utilizar otros agentes tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar de polisorbato 80; se puede variar el tamaño de fracción de polietilen glicol; se pueden reemplazar los polietilen glicoles por otros polímeros biocompatibles, v.g., polivinil pirrolidona; y la dextrosa se puede sustituir por otros azúcares o polisacáridos.
Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración para compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos o soportes de administración para fármacos hidrófobos. Se pueden emplear determinados disolventes orgánicos como por ejemplo sulfóxido de dimetilo, si bien normalmente al coste de una mayor toxicidad. Adicionalmente, se pueden administrar los compuestos empleando un sistema de liberación sostenida, como por ejemplo matrices semipermeables de polímeros hidróbofos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida que son conocidos entre los especialistas en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los compuestos en un tiempo comprendido entre unas semanas y más de 100 días, dependiendo de su naturaleza química. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de proteína.
Las composiciones farmacéuticas también incluyen vehículos o excipientes en fase sólida o de gel adecuados. Entre los ejemplos de dichos vehículos o excipientes se incluyen sin limitarse sólo a ellos carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros como polietilen glicoles.
Muchos de los compuestos de modulación de PTK de la invención se pueden proporcionar como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles se pueden formar con muchos ácidos incluyendo, sin limitarse sólo a ellos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos o en otros disolventes próticos que en las formas de base libre correspondientes.
Dosis efectiva
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad efectiva para evitar el desarrollo o para aliviar los síntomas existentes que presenta el sujeto en tratamiento. La determinación de cantidades efectivas entra dentro de la capacidad de las personas especializadas en esta campo, sobre todo a la luz de la descripción detallada aquí expuesta.
Para cualquiera de los compuestos utilizados en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluye la IC_{50}, tal como se determina en los ensayos celulares (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición media máxima de la actividad de PTK). Dicha información se puede utilizar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos.
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del compuesto que tiene como resultado una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se puede determinar a través de los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, v.g., para determinar la LD_{50} (la dosis letal para un 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en un 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre LD_{50} y ED_{50}. Son preferibles los compuestos que presentan índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden utilizar para formular un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. Las dosis de dichos compuestos se encuentran preferiblemente dentro del intervalo de las concentraciones en circulación que incluyen la ED_{50} con una baja toxicidad o sin toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. El médico especialista podrá seleccionar la formulación, ruta de administración y dosis exactas teniendo en cuenta el estado del paciente (véase v.g., Fingl y cols., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1).
La cantidad de dosis y el intervalo se pueden ajustar de forma individual para proporcionar niveles en plasma de la fracción activa que sean suficientes para mantener los efectos de modulación de cinasa, o una concentración efectiva mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro: v.g., la concentración necesaria para conseguir un 50-90% de inhibición de la cinasa aplicando los ensayos que se describen en el presente documento. Las dosis necesarias para conseguir la MEC dependerán de las características individuales y de la ruta de administración. No obstante, se pueden aplicar ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosis se pueden determinar utilizando el valor MEC. Los compuestos deberán administrarse utilizando un régimen que mantenga los niveles en plasma por encima de MEC durante un 10-90% del tiempo, preferiblemente entre 30 y 90%, siendo sobre todo preferible entre un 50 y un 90%. En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma.
La cantidad de composición administrada dependerá naturalmente del sujeto que se esté tratando, del peso del sujeto, de la gravedad de la afección, de la manera de administración y el del criterio del médico encargado.
Envase
Las composiciones se pueden presentar, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosis unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede incluir por ejemplo una hoja metálica o plástica, como por ejemplo un paquete de ampolla. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. Asimismo, se pueden preparar composiciones que comprenden el compuesto de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible, colocarlas en un contenedor apropiado y etiquetarlas para el tratamiento de un estado patológico indicado. Entre los estados patológicos pertinentes indicados en la etiqueta se pueden incluir tratamiento de un trastorno hiperproliferativo celular, inhibición de angiogénesis, tratamiento de fibrosis, diabetes, edema, ascitis y similares.
Ejemplos I. Síntesis
Existen dos métodos generales para la síntesis de sistemas de anillo de indeno-, nafto- y ciclohepta[1,2-c] pirazol que han sido expuestos en la patente EE.UU. 3.843.665 y la patente EE.UU. 3.843.666 que están representados por la fórmula I.
En la patente EE.UU. 3.843.665, la ciclación del anillo de pirazol está afectada por el calentamiento de compuestos de estructura II con una sulfonilhidrazida aromática en un disolvente inerte y una cantidad catalítica de un ácido. La reacción se lleva a cabo durante un período de 5 a 30 horas, a una temperatura comprendida entre 75 y 100ºC. El esquema que se muestra a continuación es representativo de esta transformación.
6
en el que:
p es 0, 1, 2 y
W es un alquilo inferior.
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Los compuestos de fórmula II se preparan tratando una 1-indanona, alfa-tetralona o 1-benzosuberona funcionalizada apropiadamente con un arilaldehído en presencia de un catalizador ácido o básico (Braun, R.A.; Mosher, W.A. J. Amer. Chem. Soc. 1958, 80, 2749).
7
En la patente EE.UU. 3.843.666 se expone un segundo método para preparar indeno-, nafto y benzo[6,7]ciclohepta[1,2-c]pirazol, en el que se calientan los compuestos de la fórmula general VI a 75ºC - 175ºC con una cantidad catalítica de un ácido carboxílico orgánico o un ácido sulfónico orgánico en un disolvente inerte como por ejemplo un hidrocarburo aromático durante un período de 6 a 24 horas.
8
donde:
Ar, R^{1} y R^{2} son como se han definido antes.
Los compuestos que presentan la fórmula general VI se preparan tratando los compuestos de fórmula general VII con hidrazina en un disolvente inerte. La reacción se lleva a cabo a 15ºC - 20ºC durante un período de hasta 24 horas.
9
Los compuestos que tienen la fórmula general VII se preparan tratando II con peróxido de hidrógeno alcalino a temperatura ambiente en una mezcla de co-disolvente orgánico como por ejemplo CH_{2}Cl_{2}/MeOH. Alternativamente, VII se produce a partir de la reacción de VIII con un aril aldehído en condiciones básicas. La reacción se lleva a cabo en un disolvente inerte a una temperatura comprendida entre 5ºC y 10ºC durante un período de 3 a 6 horas.
10
donde:
Y es cualquier grupo saliente convencional como por ejemplo cloro, bromo, yodo, tolisilato o mesilato.
La ciclación de VI se puede llevar a efecto por tratamiento con un ácido mineral como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. La reacción se lleva a cabo en un alcanol inferior, a una temperatura comprendida entre 15ºC y 20ºC durante un período de 12 a 48 horas. El producto de la reacción, IX, se puede aromatizar después en I por calentamiento a una temperatura comprendida entre 50ºC y 150ºC con un ácido carboxílico orgánico o un ácido orgánico sulfónico en un éter de cadena lineal o un éter cíclico durante un período de 8 a 30 horas.
11
El compuesto IX se puede diacetilar por tratamiento con un anhídrido acético en un disolvente inerte como, por ejemplo, un hidrocarburo aromático a una temperatura comprendida entre 35ºC y 200ºC durante un período de 5 a 8 horas.
12
A continuación, se puede aromatizar el compuesto XI en el compuesto XII por calentamiento a una temperatura comprendida entre 35ºC y 200ºC con un ácido mineral o con un ácido orgánico en un disolvente inerte durante un período de 4 a 8 horas. Finalmente, se puede convertir el compuesto XII en I por calentamiento a una temperatura comprendida entre 50ºC y 150ºC, en un disolvente inerte como por ejemplo agua o un alcohol inferior en presencia de un metal alcalino o un hidróxido de metal alcalino durante un período de 8 a 30 horas.
13
Los compuestos de fórmula general XIII se pueden obtener por tratamiento de VII con un compuesto de fórmula XIV en presencia de un disolvente inerte como, por ejemplo, un alcanol inferior, un éter de cadena lineal o un éter cíclico a una temperatura comprendida entre 15ºC y 20ºC durante un período de 24 horas.
14
donde:
R^{3} es hidrógeno, -COR^{6}, o -SOR^{6} y
R^{6} es -CH_{3} o
15
Y es hidrógeno, cloro o -CH_{3}.
Los compuestos de fórmula general XIII se pueden ciclar en XV por calentamiento a 75ºC a 175ºC con una cantidad catalítica de un ácido carboxílico orgánico o un ácido sulfónico orgánico en un disolvente inerte como por ejemplo un hidrocarburo aromático durante un período comprendido entre 6 y 24 horas. Los compuestos con la fórmula general XV (R^{3} \neq H) se pueden convertir a I por calentamiento, a una temperatura comprendida entre 50ºC y 150ºC en un disolvente inerte como por ejemplo agua o un alcohol inferior, en presencia de metal alcalino o un hidróxido de metal alcalino durante un período comprendido entre 8 y 30 horas.
16
En las patentes EE.UU. 3.843.665 y 3.843.666 se pueden encontrar ejemplos específicos de estas transformaciones.
Ejemplos
La invención quedará ilustrada con mayor detalle con los siguientes ejemplos que se exponen únicamente con fines ilustrativos. El producto final de cada uno de estos ejemplos se caracterizó a través de uno o más de los siguientes procedimientos: cromatografía de líquidos de alto rendimiento; análisis elemental, espectroscopía de resonancia magnética nuclear, espectroscopía de infrarrojo y espectroscopía de masas de alta resolución:
THF = tetrahidrofurano;
DMF = dimetilformamida;
IMS = licor metilado industrial; y
LCMS = cromatografía de líquidos/espectroscopía de masa
Los ejemplos 1-3 fueron preparados a través de los métodos expuestos en US 3.932.430 (Sandoz, 1976):
Ejemplo 1
3-(3-piridil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 223-224ºC;
Ejemplo 2
3-(4-piridil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 264-266ºC (desc);
Ejemplo 3
3-(2-tienil)-4,5-dihidro-1H-benz[g]indazol, p.f. 206-208ºC.
Ejemplo 4
Se sometió a ebullición una mezcla de 2-benciliden-indan-1-ona (3,99 g), p-toluensulfonil hidrazina (4,0 g), hidrato de ácido p-toluensulfónico (0,7 g) y etanol (60 ml), a reflujo durante 1,5 horas y después se dejó en reposo durante 18 horas a temperatura ambiente. Se sometió a ebullición la mezcla a reflujo durante otras 74 horas y después se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 74 horas. Se separó el disolvente a presión reducida y se repartió el residuo entre diclorometano (100 ml) y solución 2M de hidróxido sódico (50 ml). Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato de magnesio y se filtró. Se lavó el sulfato de magnesio con acetato de etilo y se filtró. Se evaporó el filtrado de acetato de etilo a sequedad para dar un sólido que fue recristalizado en etanol para dar 3-fenil-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 234-236ºC.
Ejemplo 5
a) Se sometió a ebullición una mezcla de indan-1-ona (10,0 g), etanol (35 ml) e hidrato de hidrazina (10,0 ml) y ácido acético glaciar (2,0 ml), a reflujo, bajo nitrógeno durante 1 hora. Se enfrió la mezcla a 20ºC y se concentró la mezcla a presión reducida para dar un sólido que fue recogido por filtración para dar indan-1-ona hidrazona, p.f.
84-86ºC.
b) Se disolvió la forma hidrazona a) (3,55 g) en tetrahidrofurano (80 ml) y se enfrió a 0ºC bajo nitrógeno, al mismo tiempo que se añadía una solución de n-butil-litio (28,8 ml de una solución 2,5 M en hexano). Se agitó la mezcla a 0ºC durante 30 minutos y después se añadió 3-metoxibenzoato de etilo (2,16 g) y se agitó la mezcla a 0ºC durante 20 minutos. Se añadió ácido clorhídrico 3M (80 ml) y se sometió a ebullición la mezcla a reflujo durante 1 hora. Se separó la capa orgánica y se neutralizó la capa acuosa con bicarbonato sódico y se extrajo con éter para dar un aceite que fue purificado por cromatografía de columna instantánea utilizando 30-40% de acetato de etilo en éter de petróleo, p.e. 60-80ºC como la fase móvil para dar 3-(3-metoxifenil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 172-174ºC.
Ejemplo 6
Se sometió a ebullición, a reflujo, una mezcla de 2-(4-metoxibenzoíl)indan-1,3-diona (1,4 g, preparada por modificación del método descrito en J. Het. Chem. 8, 855-859 (1971) e hidrato de hidrazina (15 ml) durante 24 horas. Se enfrió la mezcla, se vertió en agua con hielo y se recogió el sólido precipitado por filtración, se lavó con etanol absoluto y se secó para dar 3-(4-metoxifenil)-1,4-dihidroindenol[1.2-c]pirazol, p.f. 247ºC.
Ejemplo 7
Se sometió a ebullición una mezcla de 2-(4-metilbenzoíl)indan-1,3-diona (1,32 g, preparada de manera similar a la del material de partida del ejemplo 6) e hidrato de hidrazina (15 ml), a reflujo, durante 24 horas. Se enfrió la mezcla, se vertió en agua con hielo y se recogió el sólido por filtración, se lavó con etanol absoluto y se secó para dar 3-(p-tolil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 267-269ºC.
Ejemplo 8
a) Se agitó una solución de 5-metoxiindan-1-ona (5,46 g) y carbazato de terc-butilo (4,45 g) en etanol (100 ml) y ácido acético glaciar (1 gota) y se sometió a ebullición a reflujo durante 2 horas. Se redujo el volumen a la mitad, a presión reducida y se recogió el sólido que cristalizó por filtración para dar 5-metoxiindan-1-ona-terc-butiloxicarbonilhidrazona.
b) Se añadió una solución de diisopropilamida de litio (11,3 ml de una solución 2,0 M en heptano/THF/etilbenceno), gota a gota, a una solución en agitación de 5-metoxiindan-1-ona-terc-butiloxicarbonilhidrazona (2,5 g) en tetrahidrofurano (100 ml) a -78ºC bajo nitrógeno. Se agitó la mezcla a esta temperatura durante 1,5 horas y a continuación, se añadió gota a gota una solución de tiofen-2-carboxilato de etilo (1,69 g) en tetrahidrofurano (10 ml). Tras la adición, se agitó la mezcla durante 30 minutos a -78ºC y después se dejó templar a temperatura ambiente. Después de agitar durante 20 minutos más a temperatura ambiente, se añadió solución de cloruro amónico saturada (100 ml) y se agitó la mezcla vigorosamente durante diez minutos. Se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa con éter (3 x 75 ml). Se lavaron las sustancias orgánicas combinadas con ácido clorhídrico 1M, a continuación, salmuera, y después se secó, se filtró y se evaporó para dar una goma amarilla que fue suspendida en diclorometano (25 ml) y se añadió pentametilbenceno (1,34 g). Se enfrió la mezcla a 0ºC y se añadió ácido trifluoroacético (0,2 ml). Se agitó la mezcla durante 64 horas y después se concentró a presión reducida para dar un aceite que fue disuelto en éter (200 ml), se lavó con solución saturada de bicarbonato sódico (100 ml), después con salmuera, después se secó, se filtró y se evaporó para dar una goma que fue purificada por cromatografía de columna instantánea utilizando éter de petróleo, p.e. 60-80ºC/acetato de etilo (4:1) como fase móvil para dar 6-metoxi-2-terc-butoxicarbonil-3-(2-tienil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 163-165ºC.
c) Se añadió ácido clorhídrico 3M (10 ml) a una solución en agitación del producto de b) (100 mg) en acetato de etilo (10 ml) a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora y después se calentó a reflujo. Se sometió la mezcla a ebullición, a reflujo, durante 30 minutos y después se enfrió. Se vertió la mezcla en agua (50 ml) y se separó la capa orgánica y se lavó con agua. Se alcalinizaron la capa acuosa combinada y los lavados con solución saturada de bicarbonato sódico y se extrajo con diclorometano. Se lavaron los extractos y los lavados de diclorometano combinados con salmuera, se secaron, se filtraron y se evaporaron para dar 6-metoxi-3-(2-ytienil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 212-214ºC.
Ejemplo 9
a) Se sometió a ebullición una solución de indan-1-ona (5,0 g) y carbazato de terc-butilo (5,0 g) en metanol (20 ml) que contenía ácido acético glaciar (1 gota) y se agitó a reflujo durante 1,5 horas. Se enfrió la mezcla y se evaporó a presión reducida. Se recristalizó el residuo en etanol para dar indan-1-ona-terc-butiloxicarbonil hidrazona.
b) De manera similar al ejemplo anterior, se hicieron reaccionar el producto de a) (500 mg) con diisopropilamida de litio (2,23 ml de una solución 2,0M en heptano/THF/etilbenceno) y después con 2-furoato de etilo (299 mg) y después se trató el compuesto obtenido con ácido trifluoroacético (5 ml) para dar 3-(2-furil)-1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol, p.f. 195-197ºC.
Ejemplo 10
De manera similar a la de los dos ejemplos anteriores, se preparó 6-fluoro-3-(2-tienil)-1,4-dihidroindeno[1.2-c]pirazol, p.f. 222-224ºC partiendo de 5-fluoroindan-1-ona y utilizando tiofen-2-carboxilato de etilo.
Ejemplos 11-28 (Método general)
a) Se añadió una mezcla 1:1 (en volumen) de diclorometano:metanol (1 ml) a través de un manipulador de líquidos Gilson 215, a la enona de partida (aproximadamente 50 mg, tabla I) en un tubo sellado con tapón, seguido de solución acuosa 2M de hidróxido sódico (1 equivalente molar, véase tabla 1) seguido de 100 volúmenes de peróxido de hidrogeno acuoso (1,8 equivalentes molares). A continuación, se agitaron las soluciones/suspensiones resultantes a temperatura ambiente durante 20 horas. Tras el análisis de LCMS, se añadieron 100 volúmenes más de peróxido de hidrógeno acuoso (1,8 equivalentes molares) a cada tubo de reacción, esta vez manualmente mediante una pipeta con punta de plástico. Por otra parte, se añadió una mezcla 1:1 (en volumen) de diclorometano:metanol (1 ml) a los tubos que contenían una cantidad significativa de material insoluble. A continuación, se siguió agitando durante 24 horas más.
Todas las reacciones fueron analizadas por TLC y a las que se consideró que habían dado una reacción incompleta se les añadió 100 volúmenes de peróxido de hidrógeno acuoso (1,8 equivalentes molares) de nuevo mediante una pipeta de punta de plástico (véase las reacciones indicadas con x3 en la tabla I). Se agitaron estas mezclas de reacción a temperatura ambiente durante 3 días.
TABLA I
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Se equilibraron las soluciones/suspensiones de reacción entre diclorometano (aproximadamente 5 ml) y agua (aproximadamente 2 ml), se eliminaron por filtración la fase orgánica a través de un cartucho de filtro Empore y lavando con diclorometano (aproximadamente 2 ml). Se evaporaron las fases de diclorometano y se secaron los residuos al vacío.
Se tomaron los productos de a) por b) basándose en que eran las 2,3-epoxicetonas correspondientes.
b) Se añadió a los productos de la etapa 1 en un tubo sellado con tapón, a través de un manipulador de líquidos Gilson 215, n-butanol (2 ml) seguido de hidrato de hidrazina (2 equivalentes molar en función de la cantidad de enona de partida utilizada en la etapa 1) como una solución al 10% en volumen en n-butanol (véase tabla II). Se añadió a cada tubo finalmente ácido acético glaciar (2 gotas) manualmente con una jeringuilla. Se calentaron las reacciones a 100ºC con agitación durante las veces indicadas en la tapa II, en función del control del análisis de TLC. Se evaporaron las mezclas de reacción a sequedad y se purificaron los residuos por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con acetato de etilo, diluido cuando fue necesario con éter de petróleo, p.e. 40-60ºC. Se evaporaron fracciones apropiadas y se secaron al vacío para dar los pirazoles finales. Se confirmó la identidad de los productos por LCMS aplicando las condiciones que se indican a continuación.
LC
Columna: 5 \mu HYPERSIL BDS C18 (100 X 2,1 mm)
Fase móvil: ácido fórmico al 0,1%: MeCN (gradiente - véase abajo)
Condiciones: 10-100% MeCN en 8 minutos
(gradiente) 100% MeCN durante 1 minuto
100-10% MeCN en 2 minutos
(tiempo de ciclo del análisis total 11 minutos)
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Intervalo longitud de onda: 206-320 nm
Volumen de inyección: 10 \mul
EM
Ionización: APcI + ve/-ve
Intervalo de masa: 150-500 m/z
Voltaje de cono: 20
En la tabla II se exponen los detalles de reacción y los rendimientos de los compuestos de los ejemplos 11-28:
TABLA II Detalles de reacción
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TABLA II (continuación) Rendimientos/LCMS
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Los compuestos producidos en los ejemplos 11-28 son los siguientes:
Ejemplo 11 3-(2-piridil)-4,5-dihidro-2H-benz-[g]indazol Ejemplo 12 3-(3-piridil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 13 3-(4-fluorofenil)-1,4-dihidroinden[1,2-c]pirazol Ejemplo 14 3-fenil-2,4,5,6-tetrahidrobenzo[6,7]ciclohepta[1,2-c]pirazol Ejemplo 15 3-(2-tienil)-2,4,5,6-tetrahidrobenzo[6,7]ciclohepta[1,2-c]pirazol 
\newpage
Ejemplo 16 3-(4-metoxifenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 17 3-(2-clorofenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 18 3-(3-clorofenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 19 3-(4-clorofenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 20 3-(4-indopropilfenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 21 3-piperonil-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 22 7-metoxi-3-(4-tolil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 23 3-(4-trifluorometilfenil)-1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol Ejemplo 24 3-(2,4-diclorofenil)-1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol Ejemplo 25 3-(2,3-dimetoxifenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 26 7-metoxi-3-(4-metoxifenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 27 3-(3,5-dimetoxifenil)-4,5-dihidro-2H-benz[g]indazol Ejemplo 28 6,7-dimetoxi-3-(4-metoxifenil)-1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol Ejemplo 29
a) Se calentaron indan-1-ona (3,30 g), tiofen-3-carboxaldehído (2,60 ml), ácido acético (0,47 ml) y piperidina (0,57 ml) en combinación en un baño de vapor durante 16 horas. Se enfrió la mezcla para dar una masa sólida que se sometió a ebullición con IMS (120 ml) y se filtró en caliente para eliminar la materia insoluble. Se enfrió el filtrado en hielo para hacer precipitar un sólido marrón que fue recogido por filtración y secado para dar 2-(3-tienil)metilenindan-1-ona, p.f. 137-138ºC.
b) Se sometió a ebullición una mezcla del producto de a) (2,03 g), p-toluensulfonil hidrazina (2,00 g), ácido p-toluensulfónico (0,35 g) y etanol (30 ml) a reflujo durante 44 horas. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se disolvió el residuo en diclorometano (100 ml). Se lavó la solución con solución acuosa 2M de hidróxido sódico (25 ml). Se secó la fase orgánica, se filtró a través de una almohadilla de sílice, lavándolo con acetato de etilo, y se evaporó para dar un aceite que se purificó por cromatografía de columna instantánea sobre gel de sílice utilizando éter de petróleo, p.e 60-68ºC/acetato de etilo (2:1) seguido de los mismo disolventes en la proporción de 1:1 como fase móvil. Se combinaron las fracciones apropiadas y se evaporaron para dar un sólido que fue triturado con éter dietílico y se filtró para dar 3-(3-tienil)-1,4-dihidroindeno[1,2-c]pirazol, p.f. 219-220ºC.
En la tabla III se exponen las estructuras químicas de los compuestos producidos en estos ejemplos:
TABLA III
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II. Ensayos de PTK in vitro
Se pueden aplicar los siguientes ensayos in vitro para determinar el nivel de actividad y el efecto de los diferentes compuesto de la presente invención sobre una o más PTK. Se pueden diseñar ensayos similares siguiendo la misma línea para otras tirosina cinasas empleando las técnicas conocidas dentro de la técnica.
A. Producción de proteína KDR utilizando sistema de baculovirus
Se generó la secuencia de codificación para el dominio intracelular de KDR (aa 789-1354) por PCR utilizando ADNc aislado de células HUVEC. Se introdujo una secuencia poly-His_{6} en el término N de esta proteína también. Se clonó este fragmento en el vector de transfección pVL1393 en el sitio Xba 1 y Not 1. Se generó el baculovirus recombinante (BV) por co-transfección utilizando el reactivo de transfección BaculoGold (PharMingen). Se purificó por placa BV recombinante y se verificó por análisis de Western. Para la producción de proteína, se cultivaron células SF-9 en medio SF-900-II a 2 x 10^{6}/ml, y se infectaron a 0,5 unidades de formación de placa por célula (MOI). Se recogieron las células a las 48 horas tras la infección.
B. Purificación de KDR
Se sometieron a lisis células SF-9 que expresaban (His)_{6}KDR(aa789-1354) por adición de 50 ml de tampón de lisis Triton X-100 (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, 10 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina) al aglomerado de células de 1L de cultivo celular. Se centrifugó el lisato a 19.000 rpm en un rotor Sorval SS-34 durante 30 minutos a 4ºC. Se aplicó el lisato celular a una columna de sepharose quelante NiCl_{2} de 5 ml, se equilibró con HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M. Se eluyó KDR utilizando el mismo tampón que contenía 0,25 M de imidazol. Se analizaron las fracciones de columna utilizando SDS-PAGE y un ensayo ELISA (abajo) que mide la actividad de cinasa. Se intercambió el KDR purificado en HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 25 mM, tampón DTT 5 mM y se almacenó a -80ºC.
C. Producción y purificación de cianasa Tie-2- humana
Se generó la secuencia de codificación para el dominio intra-celular tie-2- humano (aa775-1124) por PCR utilizando ADNc aislado de placenta humana como plantilla. Se introdujo una secuencia poli-His_{6} en el término N y se clonó este constructo en el vector de transfección pVL 1939 en el sitio Xba 1 y Not 1. Se generó BV recombinante por co-transfección utilizando el reactivo de transfección BaculoGold (PharMingen). Se purificó por placa BV recombinante y se verificó por análisis de Western. Para la producción de proteína, se cultivaron células de insecto SF-9 en medio SF-900-II a 2 x 10^{6}/ml, y se infectaron en MOI de 0,5. La purificación de la cinasa etiquetada con HIs utilizada en la detección selectiva fue análoga a la descrita para KDR.
D. Producción y purificación de tirosina kinasa Ftl-1 humana
Se utilizó el vector de expresión baculoviral pVL1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA). Se generó la secuencia de nucleótido que codifica el dominio cinasa por PCR utilizando bibliotecas de ADNc aisladas de células HUVEC. Se colocó una secuencia de nucleótido que codificaba poli-His_{6} 5' para la región de nucleótido que codifica el dominio intracelular de cinasa entero de Flt-1 humano (aminoácidos 786-1338). Los radicales de histidina permitieron la purificación de afinidad de la proteína de manera análoga a la de KDR (parte B) y ZAP70 (parte F). Se infectaron células de insecto SF-9 a una multiplicidad 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.
E. Fuentes de tirosina cinasa Lck y EGFR
Se obtuvieron en el comercio Lck o formas truncadas de Lck (v.g. Upstate Biotechnology Inc., Saranac Lake, NY o Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o se purificaron a partir de fuentes naturales o recombinantes
\newpage
conocidas aplicando los métodos convencionales. Se adquirió EGFR de Sigma (Cat# E-3641; 500 unidades/50 \mul) y se adquirió el ligando EGF de Oncogene Research Products /Calbiochem (Cat # PF011-100).
F. Producción de tirosina cinasa ZAP70
Se utilizó el vector de expresión baculoviral pVL 1393 (Phar Mingen, Los Angeles CA). Se colocó una secuencia de nucleótido que codificaba poly-His_{6} a 5' de la región de nucleótido que codificaba el ZAP70 entero (aminoácidos 1-619). Se generó la secuencia de nucleótido que codificaba la región de codificación de ZAP70 por PCR utilizando bibliotecas de ADNc aisladas de células T Jurkat inmortalizadas. Los radicales de histidina permitieron la purificación de afinidad de la proteína. El puente LVPRGS constituyó una secuencia de reconocimiento para la segmentación proteolítica mediante trombina, permitiendo así la eliminación de la etiqueta de afinidad de la enzima. Se infectaron células de insecto SF-9 a una multiplicidad 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.
G. Purificación de ZAP70
Se sometieron a lisis células SF-9 en un tampón que contenía Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina y ortovanadato sódico 1 mM. Se aplicó el lisato soluble a una columna Hi Trap de Sepharose quelante (Pharmacia) equilibrada en HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M. Se eluyó la proteína de fusión con 250 mM de imidazol. Se almacenó la enzima recuperada en un tampón que contenía HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM y DTT 5 mM.
H. Ensayo inmunoabsorbente unido a enzima
Se pueden aplicar ensayos inmunoabsorbentes de unión a enzima (ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad tirosina cinasa. El ensayo ELISA se puede realizar con arreglo a protocolos conocidos que se describen por ejemplo en Voller, y cols., 1980, "Enzyme-Linked Inmmunosorbent Assay," en Manual of Clinical Immunology 2ª ed. editado por Rose and Friedman, pp. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington D.C.
Se puede adaptar el protocolo descrito para determinar la actividad en relación con una RTK específica. Por ejemplo, los protocolos preferibles para llevar a cabo los experimentos del ensayo ELISA para KDR son los que se exponen a continuación. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia RTK, así como tirosina cinasas no receptoras, se encuadran perfectamente dentro de la capacidad de los especialistas en este campo. Para determinar la selectividad inhibidora, se empleó un sustrato PTK universal (v.g., copolímero al azar de poli (Glu_{4}, Tyr) 20.000-50.000 PM) junto con ATP (típicamente 5 \muM) a concentraciones aproximadamente el doble de K_{m} aparente en el ensayo.
Ensayo ELISA KDR in vitro
Se aplicó el siguiente procedimiento para someter a ensayo el efecto inhibidor de los compuestos de la presente invención sobre la actividad tirosina cinasa KDR:
Tampones y soluciones:
1. PGT: Poly(Glu, Tyr) 4:1
Se almacena el polvo a -20ºC. Se disuelve el polvo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para una solución 50 mg/ml. Se almacenan partes alícuotas de 1 ml a -20ºC. Al preparar las placas se diluye a 250 \mug/ml en PBS de Gibco.
2. Tampón de reacción
Hepes 100 mM; MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 4 mM, DTT 5 mM, BSA 0,02%, NaVO_{4} 200 \muM, pH 7,10
3. ATP
Se almacenan partes alícuotas de 100 mM a -20ºC. Se diluye en 20 \muM en agua
4. Tampón de lavado
PBS con 0,1% de Tween 20
5. Tampón de dilución de anticuerpo
0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS
\newpage
6. Sustrato de TMB
Se mezcla el sustrato TMB y soluciones de peróxido 9:1 inmediatamente antes de su uso o se usa un sustrato 
\hbox{K-Blue}
de Neogen 7. Solución de parada
Ácido fosfórico 1M
Procedimiento
1. Preparación de placa
Se diluye reserva de PGT (50 mg/ml, congelada) En PBS a 250\mug/ml. Se añaden 125 \mul por pocillo de placas de ELISA de alta afinidad de fondo plano modificadas Corning (Corning #25805-96). Se añaden 125 \mul de PBS en pocillos en blanco. Se cubren con cinta de sellado y se incuban durante toda la noche a 37ºC. Se lavan 1 vez con 250 \mul de tampón de lavado y se secan durante aproximadamente 2 horas en un incubador seco a 37ºC.
Se almacenan las placas recubiertas en una bolsa sellada a 4ºC hasta su uso.
2. Reacción de tirosina cinasa
- Se preparan soluciones de inhibidor a una concentración 4x en DMSO al 20% en agua.
- Se prepara el tampón de reacción
- Se prepara la solución de enzima para que las unidades deseadas estén en 50 \mul, v.g., para KDR se prepara en 1 ng/\mul para un total de 50 ng por pocillo en las reacciones. Se almacena sobre hielo.
- Se prepara una solución de ATP 4x para 20 \muM a partir de reserva 100 mM en agua. Se almacena sobre hielo.
- Se añaden 50 \mul de la solución de enzima por pocillo.
- Se añaden 25 \mul de inhibidor 4 x.
- Se añaden 25 \mul de ATP 4x para ensayo inhibidor
- Se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Se detiene la reacción añadiendo 50 \mul de HCl 0,05 N por pocillo.
- Se lava la placa
** Concentraciones finales para la reacción:
ATP: 5 \muM
5% de DMSO
3. Unión de anticuerpo
- Se diluye una parte alícuota de 1 mg/ml de anticuerpo PY20-HRP (Pierce) para 50 ng/ml en BSA al 0,1% en PBS a través de una dilución en 2 etapas (100 x, después 200 x).
- Se añaden 100 \mul de Ab por pocillo. Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incuba durante 1 hora a 4ºC.
- Se lava la placa 4x
4. Reacción de color
- Se prepara un sustrato TMB y se añaden 100 \mul por pocillo.
- Se lleva un seguimiento del OD a 650 nm hasta que se alcanza 0,6.
- Se detiene con ácido fosfórico 1M. Se agita sobre un lector de placa.
\newpage
Los tiempos de incubación y las condiciones de reacción de enzima óptimos varían ligeramente según las preparaciones de enzima y se determinan de forma empírica para cada lote.
Se aplicaron condiciones de ensayo análogas para Flt-1, Tie-2, EGFR y ZAP70. Para Lck, el tampón de reacción utilizado fue 100 mM MOPSO, pH 6,5, MnCl_{2} 4 mM, MgCl_{2} 20 mM, DTT 5 mM, BSA al 0,2%, NaVO_{4} 200 mM, en condiciones de ensayo análogas.
Fuente de PKC cinasa
La subunidad catalítica de PKC se puede obtener en el comercio (Calbiochem).
Ensayo de PKC cinasa
Se empleó un ensayo de cinasa radiactiva siguiendo el procedimiento publicado (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S. Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and Biophysical Research Communication 3: 166, 1220-1227 (1990)). Brevemente, se realizaron todas las reacciones en un tampón de cinasa que consistió en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, ATP 100 \muM, péptido 8 \muM, DMSO al 5% y ATP ^{33}P (8Ci/mM). Se mezclaron el compuesto y la enzima en el recipiente de reacción y se inició la reacción añadiendo ATP y mezcla de sustrato. Una vez terminada la reacción por adición de 10 \muL de tampón de detención (ATP 5 mM en ácido fosfórico 75 mM), se detectó una porción de la mezcla en los filtros de fosfocelulosa. Se lavaron las muestras detectadas 3 veces en ácido fosfórico 75 mM a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. Se determinó cuantitativamente la incorporación de radioetiqueta por recuento de centelleo de líquidos.
Ensayo de unión a receptor de estrógenos
Se determinó la unión de 17\beta-estradiol radioetiquetado 1 nM para el receptor de estrógenos humano en el citosol de células de carcinoma mamario MCF-7 seguido de la incubación durante 20 horas a 4ºC aplicando las condiciones de reacción de Shein y cols., Cancer Res.45: 4192 (1985). Después de la incubación, se mezclaron las fracciones de citosol con una suspensión de carbono recubierto con dextrano durante 10 minutos a 4ºC, se centrifugó y se recogieron los sobrenadantes. Se midió la radioactividad unida que permanecía en el sobrenadante de carbón con un aparato de recuento de centelleo ((LS 6000, Beckman) utilizando un cocktail de centelleo de líquidos (Fórmula 989 Packard). Se sometieron a ensayo los compuestos de manera simultánea a ocho concentraciones por duplicado para obtener una curva de competencia con el fin de determinar cuantitativamente la actividad inhibidora. Se definió la unión de radioligando específica para el receptor de estrógeno como la diferencia entre la unión total y la unión no específica determinada en presencia de un exceso de 17-estradiol sin etiquetar (6 mM).
Resultados
Se obtuvieron las siguientes concentraciones de inhibición de un compuesto representativo (ejemplo 4) con la siguiente fórmula estructural:
(Fórmula pasa a página siguiente)
\newpage
23
24
Por otra parte, se pudo obtener la siguiente concentración de inhibición de otro compuesto representativo:
25
Estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención e ilustrados en el presente documento poseen una considerable actividad de inhibición para tirosina cinasa KDR y son particularmente selectivos como inhibidores de tirosina cinasa KDR.
III. Ensayos de RTK celular
Se pueden aplicar los siguientes ensayos celulares para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en una o más RTK. Se pueden diseñar ensayos similares siguiendo las mismas líneas para otras tirosina cinasas aplicando técnicas conocidas en la especialidad.
A. Fosforilación de KDR inducida por VEGF en células de vena umbilical humanas (HUVEC) según se mide a través de manchas de Western.
1. Se adquirieron células HUVEC (de donantes agrupados) de Clonetics (San Diego, CA) y se cultivaron con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se utilizaron únicamente los primeros pasos (3-8) para este ensayo. Se cultivaron células en platos de 100 mm (Falcon para cultivo de tejido; Becton Dickinson; Plymouth, Inglaterra) utilizando medio EMB completo (Clonetics).
2. Para evaluar la actividad inhibidora del compuesto, se tripsinizaron las células y se sembraron a 0,5-1,0 x 10^{5} células/pocillo en cada pocillo de placas de 6 pocillos agrupados (Costar; Cambridge, Ma).
3. De 3 a 4 días después de la siembra, las placas fueron confluentes en un 90-100%. Se separó el medio de todos los pocillos, se enjuagaron las células con 5-10 ml de PBS y se incubaron durante 18-24 horas con 5 ml de media de base de EBM sin añadir ningún suplemento (es decir, agotamiento de suero).
4. Se añadieron diluciones en serie de inhibidores en 1 ml de medio EBM (concentración final de 25 uM, 5 uM o 1 uM) a células y se incubó durante una hora a 37ºC. A continuación se añadió VEGF_{(165)} recombinante humano (R&D Systems) a todos los pocillos en 2 ml de medio EBM a una concentración final de 50 ng/ml y se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Se utilizaron células de control sin tratar o tratadas con VEGF solamente para valorar el fondo de la fosforilación y la inducción a través de VEGF.
5. A continuación, se enjuagaron todos los pocillos con 5-10 ml de PBS frío que contenía Ortovanadato sódico 1 mM (Sigma) y se sometieron a lisis las células y se rasparon en 200 \mul de tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato sódico 0,25%, EDTA 1 mM) que contenía inhibidores de proteasa (PMSF 1mM, aprotinina 1 \mug/ml, pepstatina 1 \mug/ml, Leupeptina 1 \mug/ml, Vanadato Na 1 mM, fluoruro Na 1 mM) y 1 \mug/ml de DNasa (todos los productos químicos son de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Se hizo girar el lisato a 14.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los núcleos.
6. Se hicieron precipitar cantidades equivalentes de proteínas por adición de etanol frío (-20ºC) (2 volúmenes) durante un mínimo de 1 hora o un máximo de toda la noche. Se reconstituyeron los aglomerados en tampón de muestra Laemli que contenían 5% de \beta-mercaptoetanol (BioRad; Hercules CA) y se sometió a ebullición durante 5 minutos. Se resolvieron las proteínas por electroforesis de gel de poliacrilamida (6%, 1,5 mm Novec, San Diego, CA) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema Novex. Después del bloqueo con albúmina de suero bovino (3%), se sondearon las proteínas durante toda la noche con anticuerpo policlonal anti-KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) y con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 4ºC. Después del lavado y la incubación durante 1 hora con HRP-Fa(ab)_{2} conjugado de IgG cabra ante-conejo o ratón anticabra, se visualizaron las bandas utilizando sistema quimioluminiscencia de emisión (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).
Resultados
Se obtuvo la siguiente concentración inhibidora de un compuesto representativo:
26
Por otra parte, las concentraciónes de inhibición de otro compuesto representativo con la fórmula estructural:
27
fueron las siguientes:
28
Se demostró también que este compuesto tenía selectividad de tirosina cinasa.
Estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención tienen una considerable actividad inhibidora para la fosforilación de tirosina inducida por VEGF de tirosina cinasa KDR en células endoteliales.
B. Ensayo de mitogénesis de HUVEC
Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) en medio completo EGM (medio de crecimiento endotelial suplementado con FBS al 10%, hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico y extracto de cerebro bovino según las instrucciones del provedor). Se adquirieron las células, los medios y los suplementos de Clonetics (San Diego, CA). Se utilizó el ensayo de mitogénesis de HUVEC para medir la inhibición de mitogénesis inducida por VEGF, FGF o Medio completo. Se recogieron las células por tripsinación, se lavaron una vez y se suspendieron en medio completo (CM) a una concentración de 5.000 células/0,15 ml. Se sembraron células en placas de 96 pocillos a 5.000 células/pocillo y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Se lavaron las células una vez con medio sin suero (SFM) y se incubaron sin suero durante 24 horas. Se cultivaron los pocillos de control desprovistos sin suero con CM durante este período. Se prepararon los compuestos de ensayo como soluciones de reserva 10 mM en DMSO, se diluyeron en SFM y se añadieron a los pocillos en un intervalo de concentración (0,005 a 50 \muM de concentración final). Se incubaron las células durante 1 hora antes de la adición de 50 ng/ml de VEGF o FGF (R & D Systems, Minneapolis, MN). Los pocillos estimulados con medios completos recibieron el compuesto de ensayo y el estímulo simultáneamente. Al cabo de 5 horas de incubación, se añadieron 0,5 Ci/pocillo de timidina tritiada (Amersham) y se cultivaron las células durante toda la noche. Se detuvo el ensayo congelando las placas a -20ºC durante 24 horas. Se recogieron las placas sobre esterillas de filtro con un Recogedor Tomtec y se hizo el recuento con un contador de centelleo de líquidos Betaplate (Wallac).
Resultados
Se obtuvo la siguiente concentración de inhibición de un compuesto representativo.
29
Estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención poseen una considerable actividad inhibidora para la mitogénesis estimulada por VEGF.

Claims (10)

1. Uso de un compuesto representado por la fórmula:
30
en la que el anillo A representa las estructuras tautómeras
31
n es 1, 2 ó 3;
Ar es
32
y
R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} representan cada uno de ellos independientemente hidrógeno, halógeno, que tiene un peso atómico de aproximadamente 19 a 36, alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi inferior, trifluorometilo o
R^{1}, R^{2} y R^{4}, R^{5} representan independientemente metilendioxi unido a los átomos de carbono adyacentes;
R^{3} es hidrógeno, -COR^{6}, o -SO_{2}R^{6} y
R^{6} es -CH_{3} o
33
donde Y es hidrógeno, cloro o -CH_{3}
para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la actividad de tirosina cinasa.
2. Uso según la reivindicación 1, encontrándose dicho compuesto en una forma enantiómero, mezclado con uno o más de los compuestos mencionados, o tanto en una forma enantiómera como mezclado con uno o más de los compuestos mencionados.
3. Uso según la reivindicación 1, siendo dicha tirosina cinasa una tirosina cinasa receptora o una tirosina receptora no receptora.
4. Uso según la reivindicación 3, seleccionándose dicha tirosina cinasa del grupo que consiste en KDR, ftl-1, 
\hbox{TIE-2,}
LcK, Src, fyn y yes.
5. Uso según la reivindicación 1, afectando la actividad de dicha tirosina cinasa en la antiogénesis.
6. Uso según la reivindicación 5 siendo la inhibición de dicha tirosina cinasa antiangiogénica.
7. Uso según la reivindicación 6, consistiendo la inhibición de dicha tirosina cinasa en la inhibición de la progresión de un estado patológico seleccionado del grupo que consiste en trastornos hiperproliferativos, artritis, aterosclerosis, psoriasis, hemangioma, angiogénesis micárdica, efectos colaterales coronarios y cerebrales, angiogénesis de extremidades isquémica, enfermedades córneas, rubeosis, glaucoma neovascular, degeneración macular, cicatrización de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, retinopatía diabética y fiebre de arañazo de gato.
8. Uso según la reivindicación 1, afectando la actividad de dicha tirosina cinasa a la hiperpermeabilidad vascular.
9. Uso según la reivindicación 1 en la que n es 1; R^{3} es hidrógeno; R^{1} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, metoxi y flúor; y Ar se selecciona del grupo que consiste en 2-tienilo, 3-tienilo y 2-furanilo.
10. Uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto es:
34
y
35
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