MXPA00003359A - Derivados de indeno [1,2-c]pirazol para inhibir la actividad de cinasa de tirosina - Google Patents

Abstract

Los compuestos químicos que son derivados de indeno (1,2-c)pirazol son inhibidores de la actividad de tirosina cinasa. Algunas de las tirosina cuya actividad es inhibida por estos compuestos químicos están involucradas en procesos angiogénicos. Así, estos compuestos químicos pueden aminorar estados de enfermedad donde la angiogénesis o proliferación de células endoteliales es un factor. Los compuestos de esta invención también incluyen la inducción de la hiperpermeabilidad vascular y la formación asociada de edema, ascitis y exudados.

Description

DERIVADOS INDENO [1 ,2-C]PIRAZOL PARA INHIBIR LA ACTIVIDAD DE TIROSINA CINASA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas tirosina cinasas (PTK) consisten en una clase grande y diversa de proteínas con actividad enzimática. Las PTK desempeñan una función importante en el -control del crecimiento y diferenciación celular (para una revisión véase, Schlessinger & Ülrich, 1992, Neuron 9: 383-391) . Por ejemplo, la transducción de la señal mediada por la tirosina cinasa receptora es inhibida por la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) , por lo común seguido por la dimerización del receptor, la estimulación transitoria de la actividad intrínseca de la proteínas tirosina cinasa y fosforilación. Por este medio se crean los sitios de unión para moléculas de transducción de señales intracelulares y se origina la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmica que facilitan la respuesta celular adecuada. (por ejemplo, la división celular; efectos metabólicos, respuestas al micro ambiente extracelular) , véase Schelessinger y Ulrich, 1992, Neuron 9: 1-20. Con respecto a las tirosina cinasas receptoras, se ha demostrado también gue los sitios de fosforilación de_ tirosina funcionan como sitios de unión de alta afinidad para dominios HS2 (homología src) de moléculas de señalización (Fantl y Col., 1992, Cell 69: 413-423; Songyang y col., 1994, Mol. Cell ,. Biol . 14: 2777-2785; Songyang y col., 1993, 72: 767-778; y Koch y col., 1991, Science 252: 668-678 Mol . Cell . Biol . ) . Se han identificado algunas proteínas sustrato intracelulares que se asocian con las tirosina cinasas receptoras (RTK) . Estas pueden ser divididas en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico y (2) sustratos que carecen de tal dominio pero sirven co o adaptadores y se asocian con moléculas catalíticamente activas (Songyang y col., 1993, Science 72: 767-778) . La especificidad de las interacciones entre receptores o proteínas y los dominios SH2 de sus sustratos es determinada por los residuos aminoácidos que rodean inmediatamente el residuo tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de unión entre los dominios HS2 y las secuencias de aminoácidos que rodean los residuos fosfotirosina sobre receptores particulares son consistentes con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación del sustrato (Songyang y col,, 1993, Science 72: 767-778). Estas observaciones sugieren que la función de cada tirosina cinasa receptora esta determinada no sólo por su patrón de expresión y disponibilidad del ligando sino también por el arreglo de las vías de transducción de la señal corriente abajo que son activadas por un receptor específico. Así, la fosforilación ofrece un paso regulador importante que determina la selectividad de las vías de señalización reclutadas por los receptores del factor de crecimiento específico, así como receptores del factor de diferenciación. ~ Se ha demostrado que la estimulación, expresión o mutaciones aberrantes en los PTK originan proliferación celular incontrolada (por ejemplo, crecimiento de tumor maligno) o defectos en el proceso de desarrollo o reparación clave. En consecuencia, la comunidad bioquímica ha invertido recursos importantes para descubrir la función biológica específica de los miembros de la familia PTK, su función en los procesos de diferenciación, su participación en la tumorigenesis y en otras enfermedades, los mecanismos bioquímicos subyacentes a sus vías de transducción de señales activadas con la estimulación de ligandos y el desarrollo de nuevos medicamentos. Las tirosinas cinasas pueden ser de tipo receptor (teniendo dominios de transmembrana, extracelular e intracelular) y del tipo no receptor) siendo completamente intracelular) . Tirosinas cinasas receptoras (RTK) . Los RTK consisten en una gran familia de receptores de transmembrana con diversas actividades biológicas. La familia de las tirosina cinasa receptoras (RTK) incluye receptores que son importantes para el crecimiento y diferenciación de una variedad de tipos de células (Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433-478. 1988; Ullrichy Scheleessinger, Cell 61: 243-254, 1990) . La función intrínseca de los RTK es activada con la unión del ligando, lo cual da origen a la fosforilación del receptor y de múltiples sustratos celulares, y posteriormente a una variedad de respuesta celulares (Ullrich & Schessinger, 1990, Cell 61: 203-212) . En la actualidad se han identificado cuando menos 19 (diez y nueve) diferentes subfamilias RTK. Se considera que una subfamilia RTK, denominada la subfamilia HER esta compuesta de EGFR, HER2, HER3, y HER4. Los ligandos para la subfamilia de receptores HER incluyen el factor de crecimiento epitelial (EGF) , TGF-a, anfiregulina, HB-EGF, betacelulina y heregulina. Se considera que la regulación aberrante de la actividad de HER2/erbB2 cinasa favorece un fenotipo tumorigénico transformado especialmente en carcinomas de mama. Otras dos familias RTK están designadas la subfamilia del receptor de insulina, la cual esta compuesta de INS-R, IGF-1R y IR-R, y las sub familia "PDGFR" que incluye los receptores PDGFa y ß, CSF-1R, y el c-kit. Se ha sugerido que algunas tirosina cinasas receptoras y factores de crecimiento que se unen a las mismas desempeñan una función en la angiogénesis, aunque algunas pueden favorecer indirectamente la angiogénesis (Mustonen y Alitalo, J. Cell . Biol . , 129: 895-898, 1995). Uno de estos receptores tirosina cinasa, conocido como cinasa 1 de hígado fetal (flk-1) , es un miembro de la subclase tipo III de los RTK. Una denominación alternativa para el flk-1 humano es receptor que contiene el dominio inserto cinasa (KDR) (Terman y col., Oncogene 6 : 1677-83, 1991). Otra denominación alternativa para flk-1/KDR es "receptor 2 del factor de crecimiento celular endotelial vascular" (VEGFR-2) . La versión de murino del flk-l/VEGFR-2 también es conocido como NYK (Oelrichs y col., Oncogene 8 (1): 11-15, 1993). Se han aislado los DNA que codifican para flk-1 de ratón rata y humano, y se han reportado las secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificados (Matthews y col., Proc . Nati . Acad. Sci . EU, 88:" 9026-30, 1991; Terman y col., 1991, supra; Terman y col., Biochem. Biophys . Res . Comm. 187: 1579-86, 1992; Sarzani y col., supra; y Millauer y col., Cell 72: 835-846, 1993). La sub clase de RTK tipo III denominada tirosina cinasa-1 tipo fms (flt-1) esta relacionada con FLK-1/KDR (DeVríes y col., Science 255; 989-991, 1992; Shibuya y col., Oncogene 5 : 519-524, 1990) . Una denominación alternativa para flt-1 es "receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular 1" (VEGFR-1) . A la fecha se ha encontrado que los miembros de las subfamilias flk-l/KDR/VEGFR-2 y flt-l/VEGFR-1 expresan principalmente en células endoteliales. Estos miembros de la subclase son específicamente estimulados por los miembros de la familia de ligandos del factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) (Klagsburn y D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 1 : 259-270, 1996). Se considera que flt-1 es esencial para la organización endotelial durante el desarrollo vascular. La expresión de flt-1 esta asociada con desarrollo vascular temprano en embriones de ratón y con la neovascularización durante la duración de heridas (Mustonen y Alitalo, supra) . La expresión de flt-1 en órganos adultos sugiere una función adicional para este receptor que no esta relacionada al crecimiento celular (Mustonen y Alitalo, supra) . Otro RTK que esta relacionado con flt-1 y flk-1/KDR es flt-4 (Galland y col., Oncogene, 8: 1233-40, 1993; Pajusola y col., Oncogene 8: 2931-37, 1993). Las características cojapartidas por estos tres receptores incluyen los 7 dominios tipo inmunoglobulina en su región extra celular. La secuencia de aminoácidos de flt-4 presenta homología significativa con las secuencias de flt-1 y flk-1, especialmente en el dominio tirosina cinasa (Galland y col., supra) . No obstante, a diferencia de flt-1 y flk-1/KDR, una forma precursora de flt-4 es disociada durante el procesamiento posterior a la traducción para formar dos o polipéptidos con enlace disulfuro (Pajusola y col., supra) . Estudios de expresión de flt-4 durante el desarrollo dan soporte a la teoría del origen venoso de los vasos linfáticos (Kaipainen y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EU 92: 3566-70, abril, 1995).

Dada la función importante de las células endoteliales en la angiogénesis, los factores de crecimiento que actúan en células endoteliales son de interés particular para los estudios de la regulación de la vascularización. Un factor así es el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) , el cual se une a flk-1 y flt-1 con afinidad relativamente alta y es mitogénico hacia las células endoteliales vasculares (Terman y col., 1992, supra; Mustonen y col., supra; DeVries y col., supra) . El VEGF no se une a flt-4 (Pajusola y col., supra) . Los estudios reportados en Millauer y col., supra, sugieren que el VEGF y el flk-l/KDR/VEGFR-2 son un par ligando-receptor que tienen una función importante en la formación y surgimiento de los vasos sanguíneos, conocido como vasculogénesis y angiogénesis, respectivamente. Se han reportado diferentes formas de VEGF que se originan de empalme alternativo del mRNA, incluidas las cuatro especies descritas por Ferrara y col., ( J. Cell . Biochem. 47: 211-218, 1991) . Ambas especies la secretada y la principalmente asociadas a las células de VEGF fueron identificas por Ferrara y col., supra, y la proteína es conocida por existir en la forma de dímeros con enlaces disulfuro. También se sabe que hay una variedad de mecanismos fisiológicos y bioquímicos que subyacen al adema y la formación del estado edematoso en un individuo. Un mediador importante en uno más de estos mecanismos es el "factor de crecimiento de células endoteliales vasculares" (VEGF) . Este mediador también es conocido como "factor de permeabilidad vascular (VPF) . Este factor sobre regula el transporte en células endoteliales vasculares y provoca un aumento en la permeabilidad de numerosos lechos vasculares que incluye la piel, tejidos subcutáneos, la pared peritoneal, el mesenterio, el diafragma, la traquea, bronquios, duodeno y útero. La diapédesis significativa, alteraciones en el intercambio a través del endotelio, la extravasación y depósito de macromoléculas en estos sitios e hipotensión prolongada pueden acompañar estos efectos de incremento en la permeabilidad. Se considera que estos procesos facilitan el preludio a la neovascularización. El VEGF es expresado por células T inflamatorias, macrofagos, neutrofilos y eosinófilos, etcétera, en sitios de inflamación. Este factor es activado por hipoxia, ciertas hormonas vasopresoras, factores de crecimiento, hormonas reproductoras y numerosas citosinas inflamatorias. La permeabilidad vascular mediada por VEGF ha sido implicada en estos padecimientos como ascitis de tumor, endometriosis, respuestas edematosas a quemaduras y trauma, disfunción endotelial en diabetes, complicaciones en el síndrome de hiperestimulación ovárica y edema ocular.

Así, es evidente que sería benéfica la inhibición de la producción o actividad del VEGF, especialmente para bloquear la manifestación de los padecimientos antes mencionados. En particular, para aliviar estos padecimientos serían útiles compuestos que sean capaces de bloquear la hiperpermeabilidad mediada por VEGF y los síndromes de edema y asociados. El factor de crecimiento de placenta (PIGF) tiene una secuencia de aminoácidos que presenta homología significativa a la secuencia de VEGF (Park y col., J. Biol . Chem. 269: 25646-54, 1994; Maglione y col., Oncogene 8: 925-31, 1993). Como con el VEGF, diferentes especies de PIGF surgen de empalme alternativo del mRNA, y la proteína existe en forma dimérica (Park y col, supra) . El PIGF se une a flt-1 con alta afinidad pero no a flk-1/KDR (Park y col., supra) . La PIGF potencia el efecto mitogénico del VEGF en células endoteliales cuando el VEGF esta presente en bajas concentraciones, pero no tiene efecto perceptible cuando el VEGF esta presente en concentraciones mayores (Park y col., supra) . Otras dos subfamilias de RTK han sido designadas como la familia del receptor FGF (FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4) y la subfamilia Met (c-met y Ron) . Debido a las similitudes entre las subfamilias PDGF y FLK, es frecuente que las dos familias sean consideradas juntas. Las subfamilias RTK conocidas están identificadas en Plowman y col., 1994, DN&P 1_ ( 6) : 334-33-9, la cual se incorpora en la presente como referencia. Es deseable la inhibición de la angiogénesis en ciertas situaciones clínicas (por ejemplo, para suprimir el crecimiento y metástasis de tumores sólidos, o en el tratamiento de artritis reumatoide) , mientras que la promoción de la vascularización es benéfica tratar otros padecimientos (por ejemplo, la curación de heridas) . En consecuencia, las moléculas que favorecen la angiogénesis transduciendo señales a través de receptores ya discutidos, y las moléculas capaces de inhibir esta transducción de señales, ambas son de interés. Las tirosinas cinasas no receptoras . Las tirosina cinasas no receptoras representan una colección de enzimas celulares que carecen de secuencias extracelulares y de transmembrana. En la actualidad se han identificado unas 24 tirosinas cinasas no receptoras individuales que comprenden 11 (once) subfamilias (Src, Frk, Csk, Abl, . Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK) . En el presente la subfamilia Src de las tirosinas cinasas no receptoras esta compuesta del número más grande de las PTK e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, y Yrk. La subfamilia Src de enzimas han sido unidas a la oncogénesis. Una descripción más detallada de las tiroginas cinasas no receptoras se proporciona en Bolen, 1993, Oncogene 8_: 2025-2031, la cual se incorpora en la presente como referencia. Muchas de las tirosinas cinasas, ya sea una RTK o tirosina cinasa no receptora, han sido involucradas en las vías de señalización celular involucradas en numerosos padecimientos patogénicos, incluido el cáncer, soriasis y otros padecimientos hiperproliferativos o respuestas hiperinmunes .

Desarrollo de compuestos para modular las PTK. En vista de la importancia que presentan las PTK para controlar, regular y modular la proliferación celular, las enfermedades y padecimientos asociados con la proliferación anormal de las células, se han hecho múltiples intentos para identificar los "inhibidores" de tirosina cinasa receptora y no receptora utilizando una serie de enfoques, incluido el uso de ligandos mutantes (Solicitud Estadounidense No. 4,966,849), receptores solubles y anticuerpos (solicitud No. WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Nati . Acad. Sci 90: 10705-09; Ki y col., 1993, Nature 362: 841-844), ligandos RNA (Jallinek y col., B±ochemistry 33: 10450-56; Tacaño y col., 1993, Mol . Bio . Cell 4: 358A; Kinsella, y col., 1992, Exp. Cell Res . 199: 56-62; Wright, y col., 1992, J. Cell ular Phys . 152: 448-57) y los inhibidores de tirosina cinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 94/14808; Patente Estadounidense No. 5,330,992; Mariani y col., 1994, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res . 35: 2268). Actualmente se han hecho intentos por identificar moléculas pequeñas que actúen como inhibidores de tirosina cinasa. Por ejemplo, los compuestos arilo bis monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT WO 92/20642) , y derivados de vinileno-azaindol (PCT WO 94/14808) han sido descrito generalmente como inhibidores de tirosina cinasa. Los compuestos estirilo (Patente Estadounidense No. 5,217,999), los compuestos piridilo sustituidos con estirilo (Patente Estadounidense No. 5,302,606), ciertos derivados de quinazolina (Solicitud EP NO. 0 566 266 Al) , seleindoles y seleniuros (PCT WO 94/03427) , compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos del ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) han sido descritos como-compuestos para uso como inhibidores de tirosina cinasa para uso en el tratamiento de cáncer. La identificación de compuestos pequeños eficaces que inhiban específicamente la transducción de la señal de tirosina modulando la actividad del receptor y no receptor tirosinas cinasas para regular y modular la proliferación celular anormal o inadecuada es, por tanto, deseable.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a los compuestos de la fórmula: en donde: X carbonilo o un grupo metileno o un metileno sustituido; i R es un hidrógeno o grupo metilo; y 2 R es pipdilo, un fenilo o un fenilo sustituido; i siempre y cuando, cuando X es un grupo metileno, R es un grupo metilo. Los enantiómeros, tautómeros, y mezclas de estos compuestos están incluidos en esta invención. Las sales de adición acida farmacéuticamente aceptables de estos compuestos también están incluidas en setas invención. Los compuestos de esta invenciórL son útiles como inhibidores de la actividad de tirosina cinasa. En particular, los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de tirosinas cinasas que son importantes en el proceso de angiogénesis. Estos compuestos también son útiles como inhibidores de las tirosinas cinasas que son importantes en el proceso de la hiperpermeabilidad vascular. Dado que estos compuestos son antiangiogénicos e inhiben la hiperpermeabilidad vascular, estos son sustancias importantes para inhibir el progreso de estados de enfermedad donde la angiogénesis e hiperpermeabilidad vascular son componentes importantes . Los compuestos particularmente preferidos de _la presente invención son compuestos de la fórmula I, donde R , R y X se muestran en la tabla I: TABLA I La presente invención además incluye el uso de estos compuestos en composiciones farmacéuticas en una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos antes _descritos y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas a los individuos para hacer más lento o interrumpir el proceso de angiogénesis en enfermedades auxiliadas por angiogénesis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los compuestos de esta invención tienen propiedades anti angiogénicas . Por esta razón, estos compuestos pueden ser utilizados como agentes activos contra estados de enfermedad como artritis, aterosclerosis, soriasis, hemangiomas, angiogénesis de miocardio, vascularización colateral coronaría y cerebral, angiogénesis de miembro isquémico, _ curación de heridas, enfermedades relacionadas con Helicobacter de ulcera péptica, fracturas, hipertermia por rasguño de gato, rubeosis [sic], enfermedad de la cornea, glaucoma neovascular y retinopatías como las asociadas con,-retinopatía diabética o degeneración macular, o estados de enfermedad similares dependientes de suministro sanguíneo y de nutrientes soportado por angiogénesis o en padecimientos hiperproliferativos de células endoteliales. Además, algunos de estos compuestos pueden ser utilizados como compuestos antifertilidad o como abortivos. Los compuestos de esta invención inhiben la actividad catalítica de las tirosinas cinasas. Es decir, estos compuestos modulan la transducción de señales por las tirosinas cinasas. En particular, estos compuestos inhiben selectivamente la actividad de las KDR/FLK-l/VEGFR-2 tirosinas cinasas. Ciertos compuestos de esta invención también inhiben la actividad de tirosinas cinasas adicionales como flt-l/VEGFR-1, la subfamilia de cinasas Src como Lck, Src, fyn, yes, etcétera. La presencia y potencia de la actividad inhibidora de los compuestos de esta invención contra una tirosina cinasa particular depende de la naturaleza, el número y arreglo de los sustituyentes (es decir, X, R 1 y R2) de estos compuestos. - - Los compuestos de esta invención, cuando se administran a individuos en necesidad de tales compuestos, también inhiben la hiperpermeabilidad vascular y la formación de_ edemas en estos individuos. Se considera que estos compuestos actúan inhibiendo la actividad mediada por los receptores VEGF que están involucrados en el proceso de hiperpermeabilidad vascular y formación decadencia. El VEGF es único en cuanto a que es el único factor de crecimiento angiogénico conocido por contribuir directamente a la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edema. En realidad, la hiperpermeabilidad vascular y edema que están asociados con la expresión o administración de muchos otros factores de crecimiento parecen estar mediadas por la producción de VEGF. Así mismo, la diapédesis con frecuencia acompaña la hiperpermeabilidad vascular. De la misma manera, la hiperpermeabilidad vascular excesiva puede romper el intercambio molecular normal a través del endotelio en tejidos y órganos críticos (por ejemplo, pulmón y riñon), perturbando por este medio la función y causando extravasación y depósito macromolecular. Al inhibir la actividad de la cinasa de los receptores VEGF, la hiperpermeabilidad, así como la extravasación asociada, la formación de edema y ascitis subsecuentes y el depósito de matriz se inhiben y reducen al mínimo. Además, las formas metiladas en la posición N o los análogos N-metilados de los compuestos de esta invención también pueden servir como profármacos que actúan como compuestos antiangiogénicos activados por el metabolismo. Se considera que los padecimientos antes mencionados son mediados en un grado significativo por la actividad de la proteínas tirosina cinasa incluyendo la KDR/VEGFR-2 y/o la flt-l/VEGFR-1 tirosinas cinasas. Al inhibir la actividad de estas tirosinas cinasas se inhibe el progreso de los padecimientos mencionados o los estados fisiológicos debido a que el componente angiogénico de estos estados de enfermedad o condiciones fisiológicas se reducen severamente. La acción de los compuestos de esta invención, por su selectividad para tirosinas cinasas específicas, da lugar a una reducción al mínimo de los efectos adversos que ocurrirían si se utilizarán inhibidores de tirosina cinasa menos selectivos.

La potencia y especificidad de los compuestos genéricos de esta invención pueden con frecuencia ser alteradas y optimizadas por variaciones de los sustituyentes y restricciones conformacionales .

En esta invención, son aplicables las siguientes definiciones : "sales de adición acida farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la efectividad y propiedades biológicas de las bases libres y que se obtienen mediante la reacción con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico o con ácidos orgánicos como ácido sulfónico, ácido carboxílico, ácido fosfórico orgánico, ácido metansulfónico, ácido etan sulfónico, ácido p-toluen sulfónico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido tartárico y similares. En los compuestos de esta invención, los sustituyentes de R 2, cuando R2 es un fenilo, pueden ser un alquilo inferior de 1 o 2 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo alcoxi inferior, un grupo hidroxilo o un grupo amino. En los compuestos de esta invención, X puede ser un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo hidroximetileno, un grupo amino metileno, o un grupo alquilo inferior amino metileno.

Formulaciones farmacéuticas y vias de administración Los compuestos identificados de esta invención pueden ser administrados a un paciente humano como tales o en composiciones farmacéuticas donde estos se mezclan con portadores o excipiente (s) adecuados en dosis para tratar o aminorar una serie de transtornos. Una dosis terapéuticamente eficaz además se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para dar origen a un alivio de los síntomas. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud pueden encontrarse eir "Remington' s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, edición más reciente.

Vías de administración - Las vías de administración adecuadas pueden, por ejemplo, incluir la administración oral, gotas oftálmicas, rectal, transmucosa, tópica, o intestinal; el suministro parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea, intra medular, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intra ocular. De otro modo, es posible administrar el compuesto en una forma local más que sistémica, por ejemplo, por inyección del compuesto intraarticularmente (por ejemplo, para artritis reumatoide) , con frecuencia en un depósito o formulación de liberación sostenida. Además, es posible administrar el medicamento en un sistema de suministro del medicamento dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con anticuerpos específicos del tumor. Los liposomas serán orientados y captados selectivamente por el tumor.

Composición/formulación Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser fabricadas en una forma que es bien conocida, por ejemplo, por medio de los procesos tradicionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, pulverización, emulsificación, encapsulación, entrampado [sic] o liofilización. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención de este modo pueden ser formuladas en una forma convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables conteniendo excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. La formulación adecuada dependerá de la vía de administración elegida. Para inyección, los compuestos de la invención pueden ser formulados en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles como la solución de Hanks, la solución de Ringer o solución amortiguadora salina fisiológica. Para administración transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes adecuados para la barrera que va a ser permeada. Estos penetrantes generalmente son conocidos en la técnica. Para administración oral, los compuestos pueden ser formulados fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos portadores permiten a los compuestos de la invención ser formulados como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral para un paciente que va a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando el compuesto activo con un excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de la adición de los auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas . Los excipientes adecuados son, err particular, materiales de carga como azúcares, incluida lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, es posible adicionar agentes desintegradores como pueden ser polivinilpirrolidona reticulado, agar o ácido_ algínico o una sal de los, mismos como alginato de sodio.

Los núcleos para grageas se proporcionan como recubrimientos adecuados. Para este propósito, es posible utilizar soluciones de azúcar concentradas que pueden opcionalmente contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilen glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Los colorantes o pigmentos pueden ser adicionados a las tabletas o recubrimientos para grageas o identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de las dosis de los compuestos activos. Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas por vía oral incluyen cápsulas hechas de gelatina, así como cápsulas selladas, blandas hechas de una gelantina y un plastificador, como puede ser glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste sin huelgo pueden contener los ingredientes activos en mezcla con el material de carga como lactosa, aglomerantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados como aceites grasos, parafina líquida o polietilen glicoles líquidos. Además, es posible _ adicionar estabilizadores . Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificación adecuada para tal administración.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en un modo tradicional. Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de recipientes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para el suministro de una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden ser formulados conteniendo una mezcla de polvos del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón. Los compuestos pueden estar formulados para administración parenteral por inyección, por ejemplo, inyección en bolo o por vía intravenosa continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes para dosis múltiples, con un preservador adicionado, las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden ser preparadas como suspensiones oleosas para inyección adecuadas. Los solventes lipofílicos o vehículos adecuados incluyen aceites grasos como aceite de sésamo, o esteres de ácidos grasos sintéticos como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o compuestos adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. De otro modo, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, de agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Los compuestos también pueden estar formulados en composiciones rectales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases para supositorios tradicionales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones anteriormente descritas, los compuestos también pueden estar formulados como una preparación de depósito. estas formulaciones de acción prolongadas pueden ser administradas por implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscular o por inyección intra muscular) . Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Un portador farmacéutico para - los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema cosolvente consistiendo en alcohol bencílico, un surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema cosolvente puede ser el sistema co-solvente VPD. El VPD es una solución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del surfactante no polar polisorbato 80 y 65% p/v de_ polietilen glicol 300, llevado a volumen en alcohol absoluto. El sistema cosolvente VPD (VPD: 5 W) consiste en VPE diluido 1:1 con una solución de 5% de dextrosa en agua. Este sistema co-solvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos y produce baja toxicidad en la administración sistémica. Como es natural, las proporciones de un sistema co-solvente pueden yariar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del co-solvente pueden variar: por ejemplo, es posible utilizar otros surfactantes no polares, de baja toxicidad en lugar de polisorbato 80; puede variar el tamaño de la fracción de polietilen glicol; otros polímeros biocompatibles pueden sustituir el polietilen glicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir dextrosa. De otro modo, es posible emplear otros sistemas de suministro para los compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o portadores de suministro para medicamentos hidrofóbicos . Ciertos solventes orgánicos como dimetilsulfóxido también pueden emplearse, aunque por lo común a costa de mayor toxicidad. Además, los compuestos pueden ser suministrados utilizando un sistema de liberación sostenida, como puede ser matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el compuesto terapéutico. Diferentes materiales de liberación sostenida han sido establecidos y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación prolongada pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante algunas semanas hasta durante 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, es posible emplear estrategias adicionales para la estabilización de la proteína. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener portadores o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de estos portadores o excipientes incluyen, pero na_ están limitados a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, azúcares diversos, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros como polietilen glicoles. Muchos de los compuestos moduladores de PTK de la invención pueden proporcionarse como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden formarse con muchos ácidos incluido, pero no limitado a ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etcétera. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros solventes próticos de lo que son las formas base libres correspondientes .

Dosificación eficaz _ _ ^ Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para su fin propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad efectiva para prevenir el desarrollo de o aliviar los síntomas existentes de la persona que esta siendo tratada. La determinación de la cantidad efectiva esta dentro de la capacidad de los expertos en -la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en la presente. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis efectiva, terapéutica puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos celulares. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en modelos animales para obtener un intervalo de concentración circulante que incluye la IC50 como se determina en los ensayos celulares (es decir, la concentración del compuesto de prueba que obtiene una inhibición media-máxima de la actividad de la- PTK. Esta información puede ser utilizada para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto que da origen a mejoría de los síntomas o una prolongación de la sobre vivencia en un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de estos compuestos pueden ser determinadas por los procedimientos farmacéuticos normales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal de 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . El índice de dosis entre efectos tóxicos terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación entre LD50 y ED50. Los compuestos que presentan índices terapéuticos altos son los preferidos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y estudios animales pueden ser utilizados en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de estos compuestos de preferencia se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación que se emplee y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico en vista del estado del paciente. (véase por ejemplo, Fingí y col., 1975 en "The_ Pharmacological Basis of Therapeutics", capítulo 1, pl) . La cantidad e intervalo de la dosificación pueden ser ajustados individualmente para proporcionar niveles en plasma de la porción activa que sean suficientes para mantener los efectos moduladores de la cinasa, o la concentración mínima eficaz (MEC) . La MEC variará para cada compuesto pero puede ser estimada a partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para obtener 50-9-0% de inhibición de la cinasa utilizando los ensayos que se describen en la presente. Las dosis necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. No obstante, es posible utilizar ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma. Los intervalos de la dosificación también pueden ser determinados utilizando el valor MEC. Los compuestos deben ser administrados utilizando un régimen que mantenga las concentraciones en plasma por enzima de la MEC durante 10-90% del tiempo, de preferencia entre 30-90% de mayor preferencia entre 50-90%. En casos de administración local o captación_ selectiva, la concentración local eficaz del medicamento puede ser no liberada para la concentración en plasma. La cantidad de la composición administrada, desde luego, dependerá del individuo que se trate, del peso del individuo, la gravedad del padecimiento, la forma de administración y el juicio del medico que prescribe.

Envasado Las composiciones pueden, si se desea, ser presentadas en un envase o dispositivo dosificador que pueda contener una o más formas de dosificación unitaria conteniendo el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, consistir en una hoja metálica o de plástico, como puede ser un "blister pack". El envase o dispositivo dosificador pueden estar acompañados por instrucciones para la administración. Las composiciones conteniendo un compuesto de la invención formulado en un portador farmacéuticamente compatible también pueden ser preparadas, colocadas en un recipiente adecuado y etiquetadas para tratamiento de un padecimiento indicado . Los padecimientos adecuados indicados en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un trastorno Jaiperproliferativo-celular, la inhibición de angiogénesis, el tratamiento de fibrosis, diabetes, edema, ascitis y similares.

EJEMPLIFICACIONES " ~ I. Síntesis de los compuestos Los compuestos de esta invención, fórmula I, pueden ser sintetizados utilizando el siguiente esquema.

La síntesis del sistema de anillos indeno[1, 2-c]pirazol : El sistema de anillos indeno[l, 2-c]pirazol puede ser sintetizado por los métodos de Braun y Mosher (Braun, R.A.; Mosher, W. A. J. Org. Chem. 1959, 24, 648) mediante la reacción del 1, 3-indandiona adecuadamente asilado con hidrazina o metilhidrazina.

II IV Funcionalización del puente carbono: El puente carbonilo puede ser transformado en un grupo metileno por la reducción de Wolf-Kishner de la hidrazona correspondiente (Mosher, W.A., Tawfik, E.-Z., Lipp, D.W. J. Org. Chem. 1971, 36, 3890) . Los métodos adicionales para la funcionalización del puente carbonilo y los ejemplos específicos pueden encontrarse en la solicitud de la Patente Japonesa JP 60 130521 A2, y B. Loev, Patente Estadounidense 3,004,938 (1960) .

Ejemplos La invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos que se proporcionan a manera de ejemplo solamente.

El producto final de cada uno de estos ejemplos fue caracterizado por uno o más de los siguientes procedimientos: cromatografía líquida de alta resolución; análisis elemental, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectroscopia de infrarrojo y espectroscopia de masas de alta resolución. Se utilizan las siguientes abreviaturas: DMF = dimetilformamida; IMS = alcoholes industriales metilados; y LCMS = cromatografía líquida/espectroscopia de masa. Los ejemplos 1 y 2 fueron preparados por los métodos que se mencionan en JP60-13.521.

Ejemplo 1 3- (3, 4-dimetoxifenil) indeno[l, 2-c]pirazol-4 (1H) -ona, (disponible en el comercio de Menai Organics Ltd., Unit 5, Menai Technology Centre Deiniol Road, Bangor Gwynedd, N. Wales LL57 2UP UK) .

Ejemplo 2 3- ( 3 , 4-dimetoxifenil ) indeno [1 , 2-c]pirazol-4 ( 1H) -ona, p . f . 268-272 °C .

Ejemplo 3 a) Ftalato de dimetilo (15.0 g) en tetrahidrofurano (100 ml) fue adicionado a una suspensión en agitación de metóxido de sodio (8.31 g) en tetrahidrofurano (60 ml) seguido por 4'-cloroacetofenona (11.8 g) en tetrahidrofurano (100 ml) a 20°C bajo nitrógeno, la mezcla fue luego hervida a reflujo durante 18 horas después enfriada a 20°C y vaciada en éter (250 ml) y agua (250 ml) . La capa acuoso fue separada y la capa orgánica fue lavada con agua (3 x 75 ml) . El extracto acuoso combinado y los lavados fueron acidificados con ácido clorhídrico concentrado y el sólido que precipito fue recolectado por filtración. El filtrado fue extraído con diclorometano, secado y evaporado. El residuo fue recristalizado a partir de etanol para obtener 2- (4-clorobenzoil) -indan-1, 3-diona. b) El producto de a) (1.23 g) fue suspendido en etanol (40 ml) e hidrato de hidrazina (0.216 g) fue adicionada bajo nitrógeno. La mezcla fue hervida a reflujo bajo nitrógeno durante 4 horas, después se dejo enfriar a temperatura ambiente y en reposo durante 16 horas, después se filtro para obtener 3- (4-clorofenil) indeno[l, 2-c]pirazol-4 (ÍH) -ona, p.f. > 330°C.

Ejemplo 4 3- (4-clorofenil) indeno[l, 2-c]pirazol-4 (1H) -ona, (0.68 g) fue disuelta en N, N-dimetilformamida (30 ml) bajo nitrógeno a 20°C. Se adicionó hidruro de sodio (106 mg, una dispersión al-60% en aceite mineral) y la mezcla fue agitada durante 30 minutos, después se adicionó yodo metano (0.38 g) . La mezcla fue agitadas a 20°C durante 2 horas y luego vaciada en agua (50 ml) . Se recolecto un sólido amarillo por filtración y se lavo con éter de petróleo (25 ml) . El sólido fue disuelto en acetato de etilo caliente y preabsorbido sobre sílice la cual fue aplicada a la parte superior de la columna de sílice. La mezcla fue separada por cromatografía en columna instantánea utilizando diclorometano/éter de petróleo/metanol (50:50:1). Las fracciones fuero recolectadas, combinadas como fuer adecuado y evaporadas para obtener un sólido que cristalizó a partir de acetato - de etilo para _obtener 3- (4-clorofenil)metilindeno[l, 2-c]pirazol-4 (1H) -ona, p.f. 219-221°C. dH [2H6]DMSO (250 MHz) 4.07 (3H,s,NMe), 7.41 (lH,t,Ar), 7.55 (4H,m,Ar) , 7.65 ( ÍH, d,Ar-8-H) , 8.13 (2H,d,Ar). La estructura fue identificada por presencia del efecto Nuclear Overhauser.

Ejemplo 5 a) En una semejante al Ejemplo 4, 3-fenilindeno[l, 2-c]pirazol-4 (ÍH) -ona, (1.0 g) se hizo reaccionar con yodometano (0.64 g) a 20°C para obtener, después de la separación por cromatografía en columna instantánea, 1-metil-3-fenilindeno[l, 2-c]pirazol-4 (2H) -ona, p.f. 187-188°C.

Ejemplo 6 Una mezcla de 3- (4-dimetoxifenil) indenofl, 2-c]pirazol-4(lH)-ona, (0.6 g) y borohidruro de sodio (0.16 g) en etanol absoluto (100 ml) ser hirvió bajo reflujo durante 5 horas. La mezcla de reacción fue enfriada y el etanol se eliminó a presión reducida. Se adicionó agua (20 ml) y la mezcla fue extraída con acetato de etilo (3 x 50 ml) . Los extractos combinados de acetato de etilo fueron lavados con agua, secados, filtrados y evaporados para obtener un sólido que fue purificado por cromatografía líquida de alta resolución, preparativa en una columna de fase inversa (41.4 x 250 mm) Dynamax C18 utilizando solución amortiguadora de acetonitrilo/formato de trietilamonio como eluyente para obtener 3- (4-dimetoxifenil) -1, 4-dihidroindeno[l, 2-c]pirazol-4-ol, p.f. 197-198°C Ejemplo 7 Una mezcla 3-fenilindeno [1, 2-c]pirazol-4- (1H) -ona (0.86 g) , borohidrururo de sodio (0.26 g) y etanol absoluto (20Q ml) fue agitada a temperatura ambiente durante 72 horas. La mezcla fue filtrada para eliminar una pequeña cantidad de sólido la cual fue descartada y el filtrado fue concentrado a presión reducida a bajo volumen con lo cual se formaron cristales. Esta suspensión fue diluida con agua a aproximadamente 250 ml y el sólido fue recolectado por filtración y recristalizado a partir de metanol para obtener 3-fenil-l, 4-dihidroindeno[l, 2-c]pirazol-4-ol, p.f. 269-272°C.

Ejemplo 8 a) Una mezcla de indan-1,3 diona (5.85 g) , piperidina (0.46 ml) y piridin-4-carboxaldehído (4.31 g) fue agitada en IMS (40 ml) a temperatura ambiente durante 50 minutos, la mezcla fue enfriada en un baño de hielo pero no ocurrió-cristalización. La solución se dejo calentar a temperatura ambiente y luego el solvente fue eliminado a presión reducida para obtener un residuo que fue parcialmente purificado por cromatografía instantánea en columnas sobre gel de sílice utilizando 10% de alcohol industrial metilado en diclorometano seguido por 20% de alcohol industrial metilado en diclorometano como las fases móviles. Se recolectaron las primeras fracciones, se combinaron y evaporaron para obtener un sólido que fue triturado con dietiléter enfriado con hielo y se filtraron para obtener 2- (4-piridilmetilen) indan-1, 3-diona, p.f. 152-157°C. b) el producto de a) (0.64 g) fue disuelto en una mezcla de diclorometano (5.5 ml) y metanol (5.5 ml) y la mezcla fue agitada a temperatura ambiente a medida que se adicionaba una solución acuosa 2M de hidróxido de sodio (1.36 ml) , seguida por peróxido de hidrógeno acuoso 100 volúmenes (0.55 ml) . La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 45 minutos, fueron adicionadas agua (25 ml) y diclorometano 25 ml) y la fase acuosa fue separada y extraída con diclorometano. Los extractos combinados de diclorometano fueron evaporados a presión reducida para obtener 1, 3-dioxo-3r - (4-piridil) -espiro [indan-2, 2 ' -oxirano] en forma cruda que fue luego utilizada directamente en la siguiente parte de este ejemplo. c) una mezcla del epóxido del b) (0.51 g) , metanol (20 ml) , ácido acético glacial (20 gotas) e hidrato de hidrazina (1 ml de una solución preparada diluyendo hidrato de hidrazina 1 ml a 10 ml del volumen total con metanol) fue hervida bajo reflujo durante 18 horas. La mezcla se dejo enfriar y luego el solvente fue eliminado a presión reducida. El residuo fue purificado por cromatografía instantánea en columna sobre sílice utilizando 5% y luego 10% de IMS en diclorometano como la fase móvil. Las fracciones adecuadas fueron combinadas y evaporadas para obtener un sólido que fue triturado con dietiléter y filtrado para obtener 3- (4-piridil) indeno[l, 2-c] pirazol-4- (1H) -ona p.f. > 300°C.

Ejemplo 9 a) Una mezcla 1:1 (en volumen) de diclorometano: etanol (1 ml) fue adicionada a 2- (4-fluorobenciliden) -1, 3-indandiona (50.7 mg) en un tubo sellado con un septo adicionada por un manej ador de líquidos Wilson 215, seguido por solución acuosa 2M de hidróxido de sodio (100.5 µl) seguida por peróxido de hidrógeno acuoso 100 volúmenes (41.1 µl) . La mezcla de reacción resultante fue luego agitada a temperatura ambiente durante 20 horas. Después del análisis LCMS, fue adicionado más peróxido de hidrógeno acuoso 100 volúmenes (41.1 µl) , esta vez manualmente a través de una pipeta con punta de plástico. Se continuo entonces la agitación durante otras 24 horas . La mezcla de reacción fue equilibrada entre diclorometano (aproximadamente 5 ml) y agua (aproximadamente 2 ml) , filtrando la fase orgánica a través de un cartucho de filtro Empore® y lavando a través con diclorometano (aproximadamente 2 ml) . La fase de cLclarornetaño fue evaporada y el residuo además secado al vacío para obtener 46. mg del material. El producto fue tomado para el siguiente paso con base en la 2, 3-epoxicetona correspondiente. b) se adicionó n-butanol (2 ml) a través de un manej ador de líquidos Wilson 215 al producto de a) en u tubo tapado con un septo más seguido por hidrato de hidrazina como una solución al 10% en volumen en n-butanol (100 µl, 1.2 equivalentes molares) . Por último, se adicionó ácido acético glacial (2 gotas) mediante una jeringa. La mezcla de reacción fue calentada a 100°C durante 6 horas. La mezcla de reacción fue evaporada a sequedad y el residuo fue purificado por cromatografía sobre sílice eluyendo con acetato de etilo, fue diluida según fue necesario con éter de petróleo p.f. 40- 60°C. Las fracciones adecuadas fueron evaporadas y secadas al vacío. El producto fue además purificado por HPLC preparativa para obtener 3- (4-fluorofenil) indeno [1, 2-c]pirazol-4 (ÍH) -ona (1.3 mg, tiempo de retención 4.42 minutos y con MH+ correspondientes a Ci6H9FN20=264 por LCMS) . La identidad de los productos fue confirmada por LCMS utilizando las condiciones que se dan a continuación.

LC Columna: 5µ HYPERSIL BDS C18 (100 X 2.1 mm) Fase móvil: ácido fórmico al 0.1%: MeCN (gradiente véase más adelante) Condiciones : 10-100% MeCN en 8 min (gradiente) 100% MeCN en 1 minuto 100-10% MeCN en 2 minutos (tiempo de corrimiento del análisis total 11 minutos) velocidad de flujo: 1 ml/min rango de la longitud de 206-320 nm onda: volumen de inyección: 10 µl MS Ionización ApcI+ve/ve Rango de masa: 150-500 m/z Voltaje del cono: 20 Las estructuras químicas de los compuestos producidos en estos ejemplos se muestran en la tabla II: II . Ensayos de PTK in vi tro Es posible realizar los siguientes ensayos in vi tro para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención sobre uno o más de los PTK. Es posible diseñar ensayos similares junto con las mismas líneas para otras tirosina cinasas utilizando las técnicas bien conocidas. A. Producción de proteína KDR utilizando el sistema de-Baculovirus : La secuencia codificante para el dominio intra celular de LKDR (aa 789-1354) fue generada a través de PCR utilizando los cDNA aislados de células HUVEC. Se introdujo una secuencia poli-Hise en el N-terminal de esta proteína también. Este fragmento fue clonado en el vector de transfección pVL1393 en el sitio Xba 1 y Not I. El baculovirus recombinante (BV) fue generado por cotransfección utilizando el reactivo BaculoGold Transfection (PharMingen) . El BV recombinante fue purificado por placa y verificado a través del análisisi Western. Para la producción de proteínas, las células SF-9 fueron crecidas en medio SF-900-11 a 2 x 10 /ml, y fueron infectadas en 0.5 unidades formadoras de placa por célula (MOI) [sic]. Las células fueron cosechadas 48 horas después de la infección.

B. purificación de KDR Células SF-9 expresando (His) 6KDR (aa789-1354) fueron Usadas adicionando 50 ml de solución amortiguadora para lisis con Tritón X-100 (tris 20 M, pH 8.0, NaCl 137 mM, 20% glicerol, 1% Tritón X-100, PMSF 1 mM, aprotinina 10 µg/ml, leupeptina 1 µg/ml) al paquete de células de 1L de cultivo celular. El lisado fue centrifugado a 19,000 rpm en un rotor Sorval SS-34 durante 30 minutos a 4°C. El lisado de células fue aplicado a una columna de Sepharose quelante 5 ml NiCl , equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 7.3 M. El KDR fue eluído utilizando la misma solución amortiguadora conteniendo imidazol 0.25 M. Las fracciones de la columna fueron analizadas utilizando SDS-PAGE y un ensayo ELISA (más adelante) que mide la actividad de la cinasa. El KDR purificado fue intercambiado en HEPES 25 mM, pH 7.5, NaCl 25 mM, solución amortiguadora DTT 5 mM y almacenado a -80°C. producción y purificación de Tie-2 cinasa humana.

La secuencia codificante para el dominio intracelular de Tie-2 humana (aa 775-1124) fue generada a través de PCR utilizando los cDNA aislados de placenta humana como una plantilla. Fue introducida una secuencia poli-HiS6 en el N-ter inal y esta construcción fue clonada- en el- vector de transfección pVL 1939 en el sitio Xba 1 y Not 1. El BV recombinante fue generado por cotransfeación utilizando el reactivo de transfección BaculoGold (PharMIngen) . El BV recombinante fue purificado en placa y verificado a través del análisis Western. Para la producción de proteína, células de insecto SF-9 fueron crecidas en medio SF-900-II a 2 x 106/ml, y fueron infectadas en MOI de 0.5. La purificación de la cinasa etiquetada con His utilizada en la detección fue análoga a la descrita para KDR.

D. Producción y purificación de Flt-1 tirosina cinasa humana Se utilizó el vector de expresión baculoviral pVL 1393^ (Phar Mingen, Los Angeles, CA) . La secuencia de nucleótidos codificante para el dominio de cinasa fue generada a través de PCR utilizando las bibliotecas de cDNA aisladas de células HUVEC. Una secuencia de nucleótidos codificante para poli-Hisß fue colocada 5' para la región del nucleótido que codifica para todo el dominio cinasa intracelular de Flt-1 humana (aminoácidos 786-1338) . Los residuos de histidina permitieron purificación por afinidad de la proteína como una forma análoga a la de KDR (parte B.) y ZAP70 (parte F.) las células de insecto SF-9 fueron infectadas en una multiplicidad 0.5 y cosechadas 48 horas después de la infección.

E, Fuentes de tirosina cinasa Lck y EGFR.

La Lck o las formas truncadas de Lck fueron obtenidas del comercio (por ejemplo, Upstate Biotechnology Inc., Saranac Lake, NY o Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) o fueron purificadas a partir de fuentes naturales o recombinantes conocidas utilizando los métodos tradicionales. La EHGFR fue adquirida de Sigma (Cat # E-3641; 500 unidades/50 µl) y el ligando EGF fue adquirido de Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat # PF011-100) .

F. Producción de ZAP70 tirosina cinasa Se utilizó el vector de expresión baculoviral pVL 1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA) . Una secuencia de nucleótido codificante para poli-Hisß fue colocada 5' para la región del nucleótido que codifica para toda la ZAP70 (aminoácidos 1- 619) . La secuencia de nucleótidos codificante para la regió codificante de ZAP70 fue generada a través de PCR utilizando las bibliotecas cDNA aisladas de las células T inmortalizadas Jurkat . Los residuos de histidina permitieron purificación_ por afinidad de la proteína. El puente LVPRGS constituyó una secuencia de reconocimiento para el desdoblamiento proteolítico por trombina, permitiendo por este medio la separación de la etiqueta de afinidad de la enzima. Las células de insecto SF-9 fueron infectadas en una multiplicidad 0.5 y cosechadas 48 horas después de la infección.

G. Purificación de ZAP70 Las células SF-9 fueron Usadas en una solución amortiguadora conteniendo Tris 20 mM, pH 8.0, NaCl 137 mM, 10% de glicerol, 1% Tritón X-100, PMSF 1 M, 1 µg/ml leupeptina, 10 µg/ml aprotinina y ortovanadato de sodio 1 mM. El lisado soluble fue aplicado a una columna quelante Sephafose Hi Trap (Pharmacia) equilibrada en HEPS 50 mM, pH 7.5, NaCl 0.3 m. La proteína de fusión fue eluída con imidazol 250 mM. La enzima recuperada fue almacenada en solución amortiguadora conteniendo HEPES 50 mM, pLH 7.5, NaCl 50 M y DTT 5 mM.

H. Ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) .

Los ensayos de inmunoabsorción en enzimas ligadas (ELISA) pueden ser utilizados para detectar y medir la presencia de la actividad de tirosina cinasa. El ELISA puede ser realizado de acuerdo con los protocolos conocidos que están descritos, por ejemplo, en Voller y col., 1980, "Enzyme-Linked I munosorbent Assay", In Manual of Clinical Immunology, 2a edición, por Rose y Friedaman, pp 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

El protocolo descrito puede ser adaptado para determinar la actividad con respecto a un RTK específico. Por ejemplo, los protocolos preferidos para realizar los experimentos ELISA para KDR se proporcionan a continuación. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia RTK, así como las tirosina cinasas no receptoras, están dentro de las habilidades de los expertos en la técnica. Para propósitos de determinar la selectividad del inhibidor, un sustrato universal de PDK (por ejemplo, el copolímero aleatorio de poli (Glu4Tyr) 20,000-50,000 PM) fue empleado junto con ATP (por lo común 5 µM) en concentraciones aproximadamente el doble de la Km aparente en el ensayo.

KDR IN VITRO ELISA Se µtilizó el siguiente procedimiento para ensayar el efecto inhibidor de los compuestos de esta invención sobre la actividad de KDR tirosina cinasa: Soluciones amortiguadoras y soluciones: 1. PGT: poli (Glu, Tyr) 4:1 almacenar el polvo a -20°C. Disolver el polvo en salina amortiguada con fosfatos (PBS) para solución 50 mg/ml) .

Almacenar alícuotas de 1 ml a -20°C. Cuando se preparen las placas diluir a 250 µg/ml en PBS Gibco. 2. solución amortiguadora de la reacción: 1Q0 mM Hepes, 20 mM MgCl2, 4 mM MnCl2, 5 mM DTT, 0.02% BSA 200 µM NaVo4, pH 7.10 3. ATP: Almacenar alícuotas de 100 mM a -20°C. Diluir a 20 µM en agua. 4. solución amortiguadora de lavado : PBS con 0.1% de Tween 20. . solución amortiguadora para diluir el anticuerpo: 0.1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. 6. Sustrato TMB: mezclar el sustrato TMB y soluciones de peróxido 9:1 justo antes del uso o utilizar el sustrato K-blue de Neogen. 7. Solución Stop: ácido fosfórico 1M.

Procedí miento 1. Preparación de la placa: Diluir la solución patrón de PGT (50 mg/ml, congelado) en PBS a 250 µg/ml) . Adicionar 124 µl de PBS a los pozos blanco . Cubrir con cinta obturante e incubar durante la noche a 37°C. Lavar 1 X con 200 µl de solución amortiguadora de lavado y secar durante aproximadamente 2 horas en incubador seco a 37°C.

Almacenar las placas cubiertas en bolsas selladas a 4°C hasta su uso. 2. Reacción de tirosina cinasa: - preparar soluciones inhibidoras en una concentración 4x en DMSO al 20% en agua. - preparar solución amortiguadora de reacción. - preparar solución de enzima de modo que las unidades deseadas están en 50 µl, por ejemplo, para KDR hacer 1 ng/µl para un total de 50 ng por pozo en las reacciones. Almacenar en hielo. - hacer una solución 4x de ATP a 20 µM a partir de una solución patrón de 10-Q-mM en agua. Almacenar en hielo. - adicionar 50 µl de solución de enzima por pozo. - adicionar 25 µl del inhibidor 4x. - adicionar 25 µl de ATP 4x para ensayar el inhibidor. - incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. - interrumpir la reacción adicionando 50 µl de HCL 0.05 N por pozo. - lavar la placa. ** concentraciones finales para la reacción: ATP: 5 µM 5% DMSO 3. Unión a anticuerpos . - diluir alícuota de 1 mg/ml del anticuerpo PY20-HRP- (Pierce) a 50 ng/ml en 0.1% de BSA en PBS mediante 2 pasos de dilución (lOOx, después 200x) - adicionar 100 µl de Ab por pozo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. Incubar 1 hora a 4°C. - lavar 4x la placa 4. Reacción de color. - preparar sustratos TMB y adicionar 100 µl por pozo. - revisar la DO a 650 nm hasta llegar a 0.6. - interrumpir con ácido fosfórico 1 M. agitar en el vector de placas . -leer la DO inmediatamente a 450 nm.

Los tiempos óptimos de incubación y las condiciones de la reacción de las enzimas varía ligeramente con las preparaciones de las enzimas y se determinara empíricamente para cada lote. Se utilizaron condiciones de ensayo análogas para Ftl-1, Tie-2, EGFR y ZAP70. Para Lck, la solución amortiguadora de reacción fue utilizada fue MOPSO 100 mM, pH 6.5, MnCl2, 4 mM, MgCl2 20 mM, DTT 5 M, BSA al 0.2%, NáV04 200 mM bajo las condiciones de ensayo análogas.

Fuente de PKC cinasa La subunidad catalítica de TKC puede obtenerse en el comercio (Calbiochem) .

Ensayo de PKC cinasa Se empleó el ensayo de cinasa radioactiva siguiendo un procedimiento publicado (Yasuda, I. Kirshi oto, A., Tanaka, S., Tominaga, M. Sakurai, A., Nashizuka, Y. Biochemical and Biophysical Research Communication 3: 166, 1220-1227 (1990)). En breve, todas las reacciones fueron realizadas en una solución amortiguadora de cinasa consistiendo en Tris-HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, ATP 100 µM, péptido 8 M, DMSO 5% y ATP con 33P (8 Ci/ M) . El compuesto y la enzima fueron mezclados en el recipiente de reacción y se inicio la reacción duran e la adición del ATP y la mezcla de sustrato. Después de la terminación de la reacción mediante la adición de la solución amortiguadora Stop 10 µl (ATP 5 M en ácido fosfórico 75 mM) , una porción de la mezcla fue colocada sobre filtros de fosfocelulosa. Las muestras fueron lavadas tres veces en ácido fosfórico 75 mM a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. se cuantifico la incorporación de la radio marca por cuenta de centelleo . líquido.

Resultados Se obtuvieron las siguientes concentraciones inhibidoras para los compuestos representativos.

Compuesto de fórmula I, KDR ELISA IC50 donde : X es carbonilo, R es 0.15 µM 2 hidrógeno y R es fenilo X es carbonilo, R es 2.6 µM 2 hidrógeno y R es 4-metilfenilo X es carbonilo, R es 1.5 µM 2 hidrógeno y R es 4-metoxifenilo Estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención tienen actividad inhibidora notable para KDR tirosina cinasa, particularmente cuando se comparan con la falta de actividad inhibidora para KDR tirosina cinasa por los compuestos fuera del alcance de la presente invención.

III. Ensayos de RTK en células Es posible utilizar los siguientes ensayos celulares para determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en uno o más_ de los RTK. Ensayos semejantes pueden ser diseñados junto co . las mismas líneas de otras tirosina cinasas utilizando técnicas bien conocidas.

A. Fosforilación de KDR inducida por VEGF en células de vena umbilical humana (HUVEC) medido por Western blots. 1. Células HUVEC (de diversos donadores) fueron adquiridas de Clonetics (San Diego, CA) y cultivadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sólo se utilizaron pasajes tempranos (3-8) para este ensayo. Las células fueron cultivadas en platos de 100 mm (Falcon for Tissue culture; Becton Dickinson; Plymouth, England) utilizando el medio EMB completo (Clonetics) . 2. Para evaluar la actividad inhibidora del compuesto, las células fueron tripsinizadas y sembradas a 0.5-1.0 x 10 células/pozo en cada pozo de placas de 6 pozos (Costar; Cambridge, MA) . 3. 3-4 días después del sembrado, las placas fueron confluentes 90-100%. El medio fue eliminado de todos los pozos, las células fueron enjuagadas con 5-1Q ml de PBS e incubadas 18-24 horas con 5 ml de medio base EBM sin suplemento adicionado (es decir, sin suero) . 4. Diluciones en serie de los inhibidores fueron adicionadas en 1 ml de medio EMB (25 uM, 5 uM, ó 1 uM como concentración final) a las células e incubadas durante 1 hora a 37 °C. El UVGF (165) ( R & D Systems) recombinante humano fue_ luego adicionado a todos los pozos en 2 ml de medio EBM a una concentración final de 50 mg/ml e incubado a 37 °C durante 10 minutos, las células control no tratadas o tratadas con VEGF solo fueron utilizadas para valorar la fosforilación de fondo e inducción por VEGF.

. Todos los pozos fueron luego enjuagados con 5-10 ml de PBS frío conteniendo ortovanadato de sodio 1 mM (Sigma) y las células fueron usadas y raspadas en 200 µl de solución amortiguadora RIPA (Tris-HCl pH 7, NaCl 150 mM, NP-40 1%, de oxicolato de sodio 0.25%, EDTA 1 mM) conteniendo inhibidores de proteasa (PMSF 1 mM, aprotinina 1 µg/ml, pepstatina 1 µg/ml, leupeptina 1 µg/ml, vanadato de Na 1 mM, fluoruro de Na 1 mM) y 1 µg/ml de DNasa (todas las sustancias químicas de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) . El lisado fue centrifugado a 14, 000 rpm durante 30 minutos para eliminar los núcleos . 6. Después cantidades iguales de proteínas fueron precipitadas mediante la adición de etanol frío (~ 20°C) (2 volúmenes) durante un mínimo de 1 hora o un máximo de toda la noche. Los paquetes fueron reconstruidos en solución amortiguadora de muestra Laemi conteniendo 5% de ß-mercapts etanol (BioRad; Hercules, CA) y hervidos durante 5 minutos. las proteínas fueron resueltas por electroforesis en gel de poliacrilamida (6%, 1.5 mm de Novex, San Diego CA) y transferidas sobre una membrana de nitro celulosa utilizando el sistema Novex. Después de bloquear con albúmina de suera bovino (3%), las proteínas fueron sondeadas durante la noche con anticuerpo psliclonal anti-KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) o con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 4°C. Después de lavar e incubar durante 1 hora con F(ab)2 conjugado con HRP de IgG anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra las bandas fueron visualizadas utilizando el sistema de quimioluminiscencia de emisión (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL) . Por ejemplo, cuando X es carbonilo, R es hidrógeno y R es fenilo en un compuesto de la fórmula I, la IC50 celular de acuerdo con este método es 3 µM.

B. Ensayo de mitogénesis para HUVEC Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) fueron cultivadas en medio completo EGM (medio de__ crecimiento endotelial complementado con FBS al 10%, hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico y extracto de cerebro bovino como para las instrucciones del proveedor) . Las células, el medio y los complementos fueron adquiridos de Clonetics (San Diego, CA) . El ensayo de mitogénesis de HUVEC fue utilizado para medir la inhibición de la mitogénesis inducida por VEGF, FGF o medio completo. Las células fueron cosechadas por tripsinización, lavadas una vez y suspendidas en medio completo (CM) en una concentración de 5,000 células/0.15 ml . Las células fueron sembradas en placas de 96 pozos a 5,000 células/pozo e incubadas a 37°C durante 24 horas. Las células fueron lavadas una vez con medio libre de suero (sfm) e incubadas bajo condiciones sin suero durante 24 horas. Los pozos control sin suero fueron cultivados con CM durante este periodo. Los compuestos de prueba fueron preparados como soluciones patrón 10 mM en DMSO, diluidos en SFM y adicionados a los pozos durante un rango de concentración (concentración final 0.005-50 µM) . las células fueron incubadas durante 1 hora antes de la adición de 50 mg/ml VEGF o FGF (R & D Systems, Minneapolis, MN) . Los pozos estimulados con medio completo recibieron el compuesto de prueba y el estímulo simultáneamente. Después de 5 horas de incubación, 0.5 ci y/o pozo de timidina tritiada (Amersham) fue adicionado y las células fueron incubadas durante la noche. El ensayo fue interrumpido por -congelación de las placas a -20 °C durante 24 horas. Las placas fueron cosechadas en esterillas de filtro con un Tomtec Harvester y contadas con un contador de centelleo líquido Betaplate (Wallac) . Por ejemplo, cuando X es carbonilo, R 1 es hidrógeno y R2 es fenilo en un compuesto de la fórmula I, la IC50 de la mitogénesis de HUVEC de acuerdo con este método es < 0.10 µM.

Aunque esta invención ha sido particularmente mostrada y descrita con referencias a las modalidades preferidas de la misma, los expertos en la técnica entenderán que diversos cambios en la forma y detalles pueden hacerse en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Los expertos en la técnica reconocerán o podrán averiguar utilizando no más que la experimentación habitual, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención descritas específicamente en la presente. Estos equivalentes están propuestos para estar comprendidos en el alcance de las reivindicaciones .

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método de inhibición de la actividad de tirosina- cinasa, consistiendo en poner en contacto la tirosina cinasa con cuando menos un compuesto en concentración suficiente para inhibir la actividad de tirosina cinasa, en donde eL compuesto esta representado por la fórmula estructural I:

En donde: X es un carbonilo un metileno o un grupo metileno sustituido; R es un hidrógeno o grupo metilo; y R es piridilo, un fenilo o un fenilo sustituido; A condición de que, cuando, cuando X es un grupo etileno, R es un grupo metilo. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto esta en una forma enantiomérica, esta en una forma tautomérica, forma parte de una mezcla que incluye uno o más compuestos adicionales representados por la fórmula estructural I o esta en forma enantiomérica y forma parte de una mezcla que incluye uno o más compuestos adicionales representados por la fórmula estructural I.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la tirosina cinasa es una tirosina cinasa receptora o una tirqsina cinasa no receptora.

4. El uso de un compuesto representado por la fórmula: en donde : X es un grupo carbonilo, un grupo metileno o un metileno sustituido; R es un hidrógeno o grupo metilo; y R es piridilo, un fenilo o un fenilo sustituido para tirosina cinasa en concentración suficiente para inhibir la actividad enzimática de la tirosina cinasa; a condición de que, cuando X es un grupo metilo, R es un grupo metilo para fabricar un medicamento para inhibir la actividad de tirosina cinasa.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el compuesto esta en una forma enantiomérica, una forma tautomérica, esta en una mezcla con uno más de otros compuestos o esta en forma enantiomérica y en una mezcla con uno o más de otros compuestos .

6. El uso de la reivindicación 4, en -donde la tirosina cinasa es una tirosina cinasa receptora o una tirosina cinasa no receptora.

7. El uso de la -reivindicación 6, en donde la tirosinacinasa se selecciona del grupo que consiste en .LKDS, flt-1, TIE-2, Lck, Src, fyn. Y yes.

8. El uso de la reivindicación 4, en donde- la actividad de la tirosina cinasa afecta la angiogénesis.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde la inhibición de tirosina cinasa es anti-angiogénica.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde la inhibición de la tirosina cinasa inhibe el progreso del estado de la enfermedad seleccionado del grupo que consiste en artritis, aterosclerosis, soriasis, henangioma, angiogénesis de miocardio, vascularización colateral coronaria y cerebral, angiogénesis de miembro isquémico, enfermedad cornea, rubeosis, glaucoma neovascular, degeneración macular, curación de heridas, úlcera péptica, enfermedad relacionada con helicobacter, fracturas, retinopatía diabética y fiebre por rasguño de gato .

11. El uso de la reivindicación 4, en donde la actividad de tirosina cinasa afecta la hiperpermeabilidad vascular.

12. El uso de la reivindicación 4, en donde .el compuesto esta representado por la fórmula: en donde R se selecciona del grupo que consiste en fenilo, 4-metilfenilo, 4-fluorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 4-bromo fenilo, 4-hidroxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-metoxifenilo, 3-metoxi-4-hidroxi-fenilo, 3-piridilo, 4-piridilo, y 3, 4-dimetoxifenilo.

13. El uso de la -reivindicación 12, en donde R 2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo, 4-fluorofenilo y 4-hidroxifenilo .

14. El uso de la reivindicación 4, en donde el compuesto esta representado por la fórmula: en donde R y X juntos son respectivamente seleccionados del grupo que consiste en fenilo, CO; 4-metilfenilo, CO; 3-clorofenilo, CO; 4-clorofenilo, CO; 4-bromofenilo, CO; 4-hidroxifenilo, CO; 3-metoxifenilo, CO; 4-metoxifenilo, CO; 4-a ino pentilo, CO; 3-piridilo, CO; 4-clorofenilo, CH2; 4-metoxifenilo, CH2; fenilo CH (OH) ; 4-clorofenilo, CH (OH) ; 3-piridilo, CH (OH) ; 4-metoxiohenilo [sic), CH (NH2) ; fenilo, (CH(NHC3H7); y fenilo, CH (NHC2H4N (CH3) 2) .

15. El uso de la reivindicación 14, en donde R es un grupo 2 , carbonilo y R se selecciona del grupo que consiste en 4-clorofenilo 4-bromofenilo, 4-hidroxifenilo, 3-metoxifenilo y 4-metoxifenilo .

16. El uso de la reivindicación 4, en donde R es un grupo metilo, en donde la inhibición de la actividad de tirosina esta asociada con efectos de antifertilidad o abortivo.

17. El uso de la reivindicación 1, en donde X es un grupo i carbonilo o un grupo metileno sustituido, y R es un hidrógeno, en donde la inhibición de la actividad de tirosina esta asociada con efectos antifertilidad o abortivos.