ES2205554T3 - Metodo para crioconservacion. - Google Patents

Metodo para crioconservacion.

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ES2205554T3 ES98949129T ES98949129T ES2205554T3 ES 2205554 T3 ES2205554 T3 ES 2205554T3 ES 98949129 T ES98949129 T ES 98949129T ES 98949129 T ES98949129 T ES 98949129T ES 2205554 T3 ES2205554 T3 ES 2205554T3
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Abstract

Un método de crioconservación de material biológico, cuyo método comprende: proporcionar una muestra del material biológico, en la que una fase líquida de la muestra incluye al menos un soluto; hacer descender la temperatura de la muestra hasta un punto de nucleación en el que la nucleación de hielo puede producirse en la muestra; efectuar la nucleación de hielo en la muestra; y hacer descender la temperatura de la muestra no linealmente con respecto al tiempo desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación, caracterizado porque dicho descenso de la temperatura es tal que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 80% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación.

Description

Método para crioconservación.
La presente invención se refiere a un método y un aparato para crioconservar material biológico que incluye, por ejemplo, suspensiones de células tales como embriones, gametos (espermatozoides, oocitos) líneas de células, médula ósea, células germinales de la sangre y similares; soluciones de proteínas y/o otras sustancias biológicamente activas; y tejidos filtrados y órganos, tecnológicos u obtenidos de una fuente natural.
La crioconservación es un procedimiento en el que muestras tales como materiales biológicos son almacenadas a bajas temperaturas. La crioconservación de material biológico como se ha descrito anteriormente es generalmente efectuada congelando en medios de retención apropiados, tales como bolsas flexibles, ampollas de vidrio o plástico, o tubos de plástico (denominados usualmente "pajas" en el campo de la crioconservación) de tipo adecuado para el almacenaje de larga duración a las bajas temperaturas empleadas.
Aunque la crioconservación ha sido extensamente empleada para una diversidad de materiales biológicos, hay ciertos materiales para los cuales no es adecuada. Por ejemplo, con ciertos materiales, pueden producirse daños celulares en la descongelación. Además, la crioconservación no es aplicable a tipos de células en los que la recuperación al descongelarse puede ser baja o muy variable, o incluso no existir. Por ejemplo, la recuperación en la descongelación de espermatozoides humanos de baja fertilidad, espermatozoides testiculares, espermatozoides de cerdo y similares es generalmente baja o variable, y en otros casos tales como oocitos de mamíferos, huevos de peces. embriones de peces, tejidos, órganos o similares la supervivencia es inexistente.
Además, en el material crioconservado descongelado, la supervivencia de las células puede depender de las condiciones y técnicas empleadas, tales como una técnica de nucleación apropiada, la adición de aditivos crioprotectores y también del control del régimen de enfriamiento. La nucleación, por ejemplo, se sabe que es un problema cuando no es controlada exteriormente en las técnicas de crioconservación, y se produce en una amplio intervalo de temperaturas por debajo del punto de fusión de los materiales individuales. Si bien que algunos materiales forman un núcleo a la temperatura del punto de fusión o justamente por debajo, otros pueden no formar un núcleo hasta que la temperatura ha alcanzado hasta 20ºC por debajo del punto de fusión, por ejemplo, con suspensiones de células contenidas en pajas o ampollas el margen de temperaturas es particularmente amplio, porque el volumen de las suspensiones, y por consiguiente el número de heteronúcleos, es pequeño y también porque los recipientes son generalmente obturados antes de ser congelados, eliminando por tanto la posibilidad de siembra mediante núcleos de hielo aéreos en el congelador. La nucleación a temperaturas significativas alejadas de los puntos de fusión de los materiales que requieren crioconservación ha dado como resultado cambios en la temperatura transitoria y muerte de las células incluso cuando los regímenes de enfriamiento han sido aparentemente optimizados para la supervivencia (Whittingham D.G., En el Simposio 52 de la Fundación Ciba, Congelación de Embriones de Mamíferos, págs. 98 a 102, 1977).
Para que materiales biológicos formen un núcleo de una manera reproducible, una práctica común es enfriar en primer lugar los materiales a una temperatura inferior al punto de fusión de los mismos, y entonces, transcurrido un corto periodo de equilibrado térmico, formar un núcleo de hielo en el material sobreenfriado. La nucleación (formación de núcleo) puede lograrse mediante cualquiera de las técnicas siguientes: aplicación de pinzas frías al exterior del material, mediante alambres fríos, mediante dispositivos que emplean "efecto de Peltier inverso" o mediante la aplicación de perturbaciones físicas. Un método alternativo para garantizar la nucleación cerca del punto fusión es incorporar un agente de nucleación de hielo en la suspensión biológica antes de la reducción de temperatura. Ejemplos de agentes de nucleación de hielo incluyen las denominadas bacterias de nucleación de hielo, por ejemplo, Pseudomonas syringae, las proteínas activas de bacterias de nucleación de hielo y compuestos orgánicos tales como colesterol. Seguidamente a la nucleación y al crecimiento del cristal inicial, se reanuda el enfriamiento de los materiales.
No obstante, la vigilancia del éxito del procedimiento de nucleación y también del posterior crecimiento del cristal ha demostrado ser un problema. En un equipo de congelación de régimen controlado convencional, no es posible vigilar el posterior crecimiento del cristal, que sigue a la nucleación, sin retirar las pajas del equipo para la inspección visual. Un elevado riesgo de fusión está asociado con tal retirada. Además, en la actualidad ningún método es capaz en tales equipos de vigilar, de una manera no invasiva, el éxito del procedimiento de nucleación.
Asimismo, han sido encontrados problemas como resultado de las técnicas empleadas para conocer la temperatura después de la nucleación. Una práctica común durante la crioconservación es la de enfriar los materiales biológicos, tanto como es posible, con una reducción lineal en la temperatura con el tiempo. El equipo de crioconservación está diseñado generalmente para controlar el medio del material de una manera lineal, y que depende de las características de transferencia de calor del equipo, los materiales se enfrían de una manera más o menos lineal. Aunque esta solución es conveniente para el diseño simple del equipo y ha producido resultados aceptables con una diversidad de tipos de células, ha demostrado no ser satisfactoria con un cierto número de materiales celulares.
El documento WO 98/23907, publicación de EPC de un Artículo 54(3), describe un aparato para congelar esperma. El aparato comprende un recipiente que tiene medios de enfriamiento con al menos una cara de contacto para contacto con la muestra de células, y medios para controlar el régimen de enfriamiento y la temperatura ambiente del recipiente.
El documento WO 96/02801 examina la importancia de emplear un régimen de enfriamiento lineal a lo largo de toda la fase de enfriamiento en la crioconservación, y se refiere a la provisión de un montaje de enfriamiento capaz de obtener un régimen sustancialmente lineal y reproducible de enfriamiento de las muestras.
El documento 96/24018 se refiere a la crioconservación de tejido de mamífero o cultivos vivos equivalentes hechos mediante tecnología in vitro. El control de temperatura emplea descenso de temperatura lineal, pero diferentes regímenes de descenso de la temperatura lineal son respectivamente empleados en diferentes etapas del procedimiento de crioconservación. Mas particularmente, la temperatura se hace descender inicialmente a un régimen de -10,0ºC/minuto en el intervalo de temperaturas de equilibrio de las fases sólida/líquida para un crioprotector empleado, y a continuación de la propagación de los cristales de semilla de hielo a través de todo el enfriamiento del crioprotector es reanudado con un régimen comprendido entre -0,02 y alrededor de -0,3ºC/minuto.
El documento US 4.799.358 describe la congelación de material biológico, y también emplea un descenso de la temperatura lineal pero con diferentes regímenes de descenso de la temperatura lineal que se emplean respectivamente en diferentes etapas del procedimiento de congelación. Por ejemplo, la temperatura típicamente se hace descender inicialmente a un régimen de -0,5ºC/minuto entre +20ºC y -7ºC y entonces a -0,3ºC/minuto entre -7ºC y -35ºC.
La utilización de regímenes de enfriamiento no lineales ha sido también examinada en la técnica anterior. El documento WO 91/01635 se refiere a un procedimiento de enfriamiento y a un aparato en el que el material que se congela es sometido a un régimen mayor de extracción de calor cuando el calor latente está siendo eliminado durante la nucleación, que cuando el material está más frío. El documento WO 91/01635 indica que los regímenes de extracción de calor pueden no ser lineales, pero no proporciona una guía clara en cuanto a los parámetros empleados en la extracción de calor no lineal.
Los autores de la invención han ideado ahora un método y un aparato para crioconservar material biológico, cuyo método y aparato reducen o alivian los problemas asociados con la técnica anterior. En particular, se han ideado un método y un aparato para reducir o superar los problemas asociados con la herida de congelación celular.
Según la presente invención, se proporciona un método para crioconservar material biológico, cuyo método comprende: proporcionar una muestra de material biológico, en el que una fase líquida de la muestra incluye al menos un soluto; reducir la temperatura de la muestra hasta un punto de nucleación en el que puede ocurrir la nucleación de hielo en la muestra; efectuar la nucleación de hielo en la muestra; y reducir la temperatura de la muestra a partir del punto de nucleación hasta el punto de solidificación de la misma, caracterizado porque la reducción de temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación no es lineal, por lo que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 80% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación.
Preferiblemente, en el método de la invención la fase líquida es acuosa y, preferiblemente, la muestra biológica está suspendida o disuelta en la misma.
El término "punto de solidificación", como se usa en esta memoria, designa la temperatura a la cual sustancialmente toda la fase líquida de la muestra se solidifica, o vitrifica. Esta temperatura puede ser determinada a partir de un diagrama de fases o puede ser medida mediante un calorímetro de exploración diferencial. Para soluciones simples, el punto de solidificación es la temperatura eutéctica.
Preferiblemente, el método de la presente invención comprende determinar el punto de fusión de la muestra. Adecuadamente, el punto de fusión puede ser determinado basándose en la osmolalidad de la fase líquida, y un método según la presente invención comprende además adecuadamente determinar la osmolalidad de la fase líquida. La osmolalidad puede ser determinada mediante cualquier procedimiento adecuado conocida en la técnica, tal como el de osmometría del punto de solidificación, o puede ser calculada a partir de la composición de la fase líquida. El diagrama de fases de equilibrio durante la solidificación o congelación puede ser construido mediante un método apropiado, que incluye la medición experimental, mediante referencia a un texto estándar (por ejemplo Rasmussen & Mckenzie, Nature 220, 1315 a 1317, 1968, Shephard y otros, Criobiología 13, 9 a 23, 1976, Lane, Ind. Engr. Chem. 17,924, 1925). Para soluciones con diagramas de fase incompletos o no publicados, y para soluciones mezcladas complejas, el diagrama de fase puede obtenerse aproximadamente mediante cualquier sistema bien definido, por ejemplo glicerol y agua (Lane, Ind. Engr. Chem. 17,924, 1925).
El método según la presente invención incluye preferiblemente determinar el punto de nucleación de la muestra. Preferiblemente el punto de nucleación deberá ser sustancialmente próximo al punto de fusión. En una realización particular preferida, el punto de nucleación no deberá estar a menos de alrededor de 4ºC por debajo del punto de fusión. Incluso más preferiblemente, el punto de nucleación no deberá estar a menos de alrededor de 2ºC por debajo del punto de fusión. La nucleación de hielo puede lograrse empleando cualquiera de las técnicas de la técnica anterior sustancialmente con se ha descrito en esta memoria anteriormente.
En una primera realización de la presente invención, el método puede comprender además una operación de reequilibrado térmico a continuación de la nucleación. En una segunda realización de la presente invención, por ejemplo, en la que grandes volúmenes de muestras (tales como suspensiones de células, o tejidos u órganos filtrados) se están crioconservando en bolsas flexibles, no se efectúa reequilibrado alguno.
Sustancialmente como se ha descrito anteriormente en esta memoria, el descenso de temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación no es lineal, de modo que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 80% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación. Se apreciará, sin embargo, que cualquier perfil térmico particular, tal como uno no lineal, dependerá sustancialmente del material biológico que se crioconserva, la concentración del mismo, la concentración de soluto o concentraciones y también la presencia de cualquier otro aditivo en la muestra.
Se prefiere particularmente además que el descenso de temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación sea no lineal de modo que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuya durante más del 90% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación al punto de solidificación. Ventajosamente, el cambio en la concentración de soluto durante el tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación es muy aproximado a:
A = 26,9 \ + \ 30,6 \ tg^{-1} \ \{(t \ + \ t_{0} \ - \ 0,385)/1,17 \}
donde t es el tiempo en el que la temperatura empieza a descender desde el punto de nucleación, y t_{0} se determina a partir de la concentración A_{0} según la ecuación
t_{0} = 0,385 \ + \ 1,17 \ tg \ \{0,0327(A_{0} \ - \ 26,9) \}
Típicamente, la muestra empleada en un método según la presente invención contiene uno o más crioprotectores. Un crioprotector adecuado puede incluir una solución de glicerol, fructosa y citrato de sodio.
El método según la presente invención implica además preferiblemente determinar el tiempo que requerirá hacer descender la temperatura de modo no lineal desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación. El tiempo transcurrido desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación puede depender de un cierto número de factores, tales como el material biológico que se crioconserva, y adecuadamente también del crioprotector empleado, puede ser determinado de diversas maneras.
Por ejemplo, el tiempo transcurrido puede adecuadamente corresponder de modo sustancial al tiempo que requeriría descender del punto de nucleación al punto de solidificación empleando el régimen lineal óptimo de enfriamiento para un material biológico seleccionado. El régimen lineal óptimo de enfriamiento para espermatozoides de mamíferos es de -10ºC y
-0,3ºC para embriones de mamíferos. Este régimen lineal óptimo de enfriamiento puede ser estimado basándose en el conocimiento de los parámetros biofísicos que determinan el comportamiento osmótico durante la solidificación.
Particularmente para las suspensiones de células, tejidos filtrados u órganos, no obstante, el tiempo transcurrido durante el empleo del enfriamiento no lineal en la presente invención pude ser determinado modelando el comportamiento osmótico durante la solidificación. Consecuentemente, el tiempo transcurrido puede ser determinado seleccionando el tiempo más corto que logra suficiente pérdida de agua para evitar sustancialmente cualquier formación de hielo intracelular en las células del material biológico, durante cualquiera de las operaciones de reducción de la temperatura empleadas en la presente invención.
El material biológico empleado en un método según la presente invención comprende adecuadamente suspensiones de células, tales como embriones, gametos (espermatozoides, oocitos), líneas de células, médula ósea, células germinales sanguíneas, o similares; soluciones de proteínas y/o otras sustancias biológicamente activas; y tejidos filtrados y órganos, tecnológicos u obtenidos de una fuente natural.
El material biológico sustancialmente como se ha descrito anteriormente en esta memoria puede ser proporcionado crioconservado mediante un método sustancialmente como el descrito anteriormente en esta memoria.
Un aparato adecuado para crioconservar un material biológico de acuerdo con el método de la invención comprende medios para recibir una o más muestras del material biológico, en las que una fase líquida de la muestra o muestras incluye al menos un soluto, medios para hacer descender la temperatura de la muestra o muestras hasta un punto de nucleación de la misma en el puede producirse la nucleación de hielo en la muestra o muestras, medios para efectuar la nucleación de hielo en la muestra o muestras; y medios para hacer descender la temperatura de la muestra o muestras desde el punto de nucleación hasta un punto de solidificación de las mismas, caracterizado porque los medios para hacer descender la temperatura la hacen descender de un modo no lineal desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación, por lo que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 80% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación.
Adecuadamente los medios de recepción del aparato están dimensionados de modo que son adecuados ara recibir los medios de retención de muestras generalmente empleados en la crioconservación tales como tubos de plástico (comúnmente conocidos en el campo de la crioconservación como "pajas") para la muestra o muestras biológicas. Apropiadamente, los medios de recepción pueden comprender un soporte ranurado (mecanizado típicamente) para los medios de retención tales como pajas, y pueden generalmente comprender un material térmicamente conductor adecuado. Generalmente, el soporte ranurado está dispuesto de modo sustancialmente horizontal para recibir las pajas. Alternativamente, donde los medios de retención comprenden ampollas de plástico o viales de vidrio, el soporte puede comprender aberturas dispuestas de modo sustancialmente vertical para recibir estos medios de retención. Donde se emplean ampollas de plástico como medios de retención, es generalmente preferible emplear tapas transparentes para las ampollas para facilitar la detección de la nucleación sustancialmente como se describe en esta memoria más adelante.
El aparato comprende apropiadamente además medios para iluminar una o más muestras biológicas dispuestas en el mismo. Los medios de iluminación pueden comprender simplemente una fuente luminosa disponible remotamente con relación a los medios de recepción para iluminar las pajas o similares. Alternativamente, los medios de iluminación pueden comprender medios de enchufe transparentes para iluminar axialmente las muestras que están crioconservadas según la presente invención. En el último caso, la presencia de hielo puede ser indicada por la forma de la dispersión lateral de un haz luminoso axial resultante.
Puede ser conveniente que los medios de recepción estén adaptados (por ejemplo por el color de la superficie y/o la modificación del acabado) para mejorar la detección del contraste óptico que se produce después de la nucleación. Adecuadamente, un indicador puede ser incluido en una muestra que está crioconservada según la presente invención de modo que los cambios en propiedades físicas seleccionadas de la muestra pueden ser detectados a continuación de la formación de hielo. Por ejemplo, puede emplearse un indicador de pH capaz de proporcionar una indicación colorimétrica del cambio de pH.
Se prefiere además que el aparato comprenda medios adicionales para ver una muestra o muestras dispuestas en el mismo. Por ejemplo, los medios de recepción pueden estar dispuestos adecuadamente dentro de una cámara de la que al menos una porción de pared comprende un material transparente que permite la visión de una muestra o muestras dispuestas en la cámara. La porción de pared puede comprender un material aislante, tal como Perspex, y puede además estar provista de una cubierta aislante que puede ser retirada para permitir la inspección de una muestra o muestras que estén crioconservadas según la presente invención. De esta manera, si la nucleación no ha sido satisfactoria esta puede ser detectada y sustancialmente rectificada. Por ejemplo, la nucleación puede ser repetida para una muestra o muestras que ha sido detectado que no han experimentado previamente la nucleación, y esto no será perjudicial para las muestras en el aparato según la presente invención que han experimentado previamente una nucleación satisfactoria.
Este aspecto de la presente invención es particularmente ventajoso, pues una detección satisfactoria de nucleación de hielo puede ser un parámetro importante en la consecución de una crioconservación satisfactoria.
Los medios para hacer descender la temperatura empleados en el aparato destinado a ser usado en la presente invención pueden comprender un bucle de realimentación que incorpore medios de medición de la temperatura, un controlador y un calentador de película fina.
La presente invención se ilustrará además mediante las figuras y el ejemplo siguientes, que no limitan el alcance de la invención en modo alguno.
La figura 1 es una vista lateral de un soporte (1) para recibir horizontalmente pajas (2) que contienen suspensiones que han de ser crioconservadas, en el que las suspensiones están iluminadas por una fuente luminosa (3) remota;
la figura 2 es una vista en planta del soporte (1) mostrado en la figura 1;
la figura 3 es una vista lateral de un soporte (1) para recibir pajas (2) dispuestas horizontalmente que contienen suspensiones que han de ser crioconservadas, en el que las suspensiones están iluminadas por medio de guías (8) de luz;
la figura 4 es una vista en planta del soporte (1) mostrado en la figura 3;
la figura 5 es una vista lateral de un refrigerador pasivo para ser usado en el método según la presente invención.
Las figuras 1 y 2 muestran un soporte (1) de suspensiones en el que las suspensiones están iluminadas mediante una fuente luminosa (3). La fuente luminosa (3) está posicionada de modo que permite que el hielo dentro de las pajas (2) sea visualizado a través de una ventana (4) de observación. El calor se extrae continuamente del soporte por medio de una placa (5) aislante a un absorbedor (6) de calor. La temperatura del soporte (1) es medida mediante cualquier técnica adecuada, tal como mediante un termopar (no mostrado) y un calentador (7) de película fina se usa entonces para controlar la temperatura del soporte (1) como se requiera. El control de la temperatura durante la solidificación se logra usando cualquier controlador adecuado que pueda ser programado para lograr regímenes no lineales del cambio de temperatura.
Las figuras 3 y 4 muestran un soporte (1) en el que las pajas (2) están iluminadas axialmente por medio de guías (8) de luz en el extremo de las pajas (2). La fuente luminosa (3) proporciona luz a la guía (8).
La figura 5 muestra un refrigerador pasivo adecuado para ser usado en el método según la presente
invención. La temperatura del soporte (1) hasta la nucleación de hielo de las suspensiones es controlada por el calentador (7) de película fina rebajando la refrigeración en el absorbedor (6) de calor. Dos placas (5) y (9) aislantes se usan con un calentador (10) de película delgada entre ellas. El calentador (10) se usa para mantener la temperatura en la superficie inferior de la placa (5) aislante superior a una temperatura (T_{1}) predeterminada. Después de la nucleación, el calentador (7) superior es desconectado y el soporte (1) enfría pasivamente a la temperatura T_{1}. Después de un periodo de tiempo predeterminado el segundo calentador (10) es desconectado y el soporte (1) enfría a la temperatura del absorbedor (6) de calor.
Ejemplo 1 Crioconservación de espermatozoides humanos
Los espermatozoides humanos normales fueron diluidos en una solución crioprotectora que contenía glicerol, fructosa y citrato de sodio antes de la congelación. La osmolalidad de la suspensión de células fue medida y era de 1430 mOsm/Kg mediante osmometría de punto de congelación, equivalente a una solución de glicerol acuosa de 13,5 w/v. La curva de temperatura en función del tiempo para lograr un cambio en la concentración de soluto de la fracción descongelada que estuvo disminuyendo durante >90% del tiempo transcurrido fue determinada entonces y se muestra en la figura 6 junto con la curva calculada de concentración en función del tiempo mostrada en la figura 7. El tiempo transcurrido desde -5ºC (la temperatura de nucleación) hasta -45ºC (la temperatura eutéctica para glicerol/agua) fue de 4 minutos.
Pajas (0,25 ml IMV, L'Aigle France) fueron llenadas con la suspensión de células y obturadas con polvo de PVA. Las pajas fueron colocadas en el aparato del tipo mostrado en la figura 1 y enfriadas desde 20ºC a -5ºC a un régimen de 2ºC/min. A -5ºC las pajas fueron nucleadas dentro del equipo tocando la paja en la superficie libre de la columna líquida con una herramienta de nucleación que había sido enfriada mediante inmersión en nitrógeno líquido. La confirmación de que se había formado hielo en todas las pajas fue obtenida por observación directa de las pajas iluminadas sobre la placa de refrigeración. La temperatura de las pajas se redujo entonces a -45ºC siguiendo la curva de temperatura tiempo mostrada en la figura 6. Las pajas fueron entonces enfriadas a -100ºC a un régimen de 10ºC/min y transferidas entonces a nitrógeno líquido para almacenamiento. Cuando se necesitaron las pajas fueron descongeladas a la temperatura ambiente y evaluada la movilidad.
Con todas las muestras de espermatozoides examinadas de espermatozoides congelados mediante un método según la presente invención la recuperación era significativamente más alta que con los espermatozoides congelados mediante un protocolo de refrigeración de fase de vapor pasiva o mediante congelación lineal a un régimen de -10ºC/min dentro de un congelador de régimen controlado convencional. Por ejemplo, con espermatozoides de una eyaculación, el enfriamiento de fase de vapor produjo el 60% de espermatozoides móviles al ser descongelados mientras que, el enfriamiento lineal dentro de un congelador de régimen controlado produjo el 66%, las muestras congeladas mediante un método según la presente invención tuvieron una recuperación en la descongelación del 88%.

Claims (11)

1. Un método de crioconservación de material biológico, cuyo método comprende: proporcionar una muestra del material biológico, en la que una fase líquida de la muestra incluye al menos un soluto; hacer descender la temperatura de la muestra hasta un punto de nucleación en el que la nucleación de hielo puede producirse en la muestra; efectuar la nucleación de hielo en la muestra; y hacer descender la temperatura de la muestra no linealmente con respecto al tiempo desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación, caracterizado porque dicho descenso de la temperatura es tal que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 80% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación.
2. Un método según la reivindicación 1, que comprende además determinar el punto de fusión de la muestra.
3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además determinar la osmolalidad de la fase líquida.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además determinar el punto de nucleación de la muestra.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el punto de nucleación no debe ser menor de alrededor de 4ºC por debajo del punto de fusión.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que el punto de nucleación no debe ser menor de
alrededor de 2ºC por debajo del punto de fusión.
7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método comprende además la operación de reequilibrado térmico que sigue a la nucleación.
8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el descenso de la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación es no lineal de modo que el régimen de cambio de la concentración de soluto en la fase líquida disminuye durante más del 90% del tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación.
9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el cambio en la concentración de soluto durante el tiempo requerido para hacer descender la temperatura desde el punto de nucleación hasta el punto de solidificación es muy aproximado a
A = 26,9 \ + \ 30,6 \ tg^{-1} \ \{(t \ + \ t_{0} \ - \ 0,385)/1,17 \}
donde t es el tiempo en el que la temperatura empieza a descender desde el punto de nucleación, y t_{0} se determina a partir de la concentración A_{0} según la ecuación
t_{0} = 0,385 \ + \ 1,17 \ tg \ \{0,0327(A_{0} \ - \ 26,9) \}
10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra contiene un crioprotector.
11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la muestra contiene un agente de nucleación de hielo.
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