CN108027203B - 具有利用冰成核剂的冻结-解冻阀的流体装置和相关的操作和分析方法 - Google Patents

具有利用冰成核剂的冻结-解冻阀的流体装置和相关的操作和分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明的实施方案提供流体装置如，但不限于，具有采用一种或多种冰成核剂(INA)的一个或多个冻结解冻阀(FTV)的微流体芯片，其可以可靠地运行以与常规的具有FTV系统的微流体装置相比在相对较高的温度下和/或以更快的速率冻结。

Description

具有利用冰成核剂的冻结-解冻阀的流体装置和相关的操作 和分析方法
相关申请
本申请要求2015年7月22日提交的美国临时申请序列号62/195,652的优先权的权益，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
联邦支持声明
本发明利用在由DOD国防部高级研究计划局(Defense Advanced ResearchProjects Agency，DARPA)授予的批准号HR0011-12-2-0001下的政府支持做出。政府具有在本发明中的某些权利。
著作权保留
本专利文献的公开内容的一部分含有属于著作权保护的素材。著作权所有者北卡罗来纳-查佩尔山大学(The University of North Carolina at Chapel Hill，N.C.)不反对任何人对在美国专利商标局专利文件或记录中存在的专利文献或专利公开内容进行复制，但是除此之外保留任何全部著作权权利。
技术领域
本发明涉及用于处理用于分析的分析物的流体装置。
发明背景
由于其操控和研究微量液体的能力，微流体装置或芯片已经得到了极大关注。参见，例如，Whitesides，G.M.，微流体的起源和未来(The Origins and the Future ofMicrofluidics).Nature 2006，442，368-373。已经利用这些装置证实了多种应用，包括色谱和电泳分离、细胞培养、和现场即时护理(point-of-care)医学诊断。在使用多种液体或试剂的微流体系统中，为了调节流体流动，阀通常是有用的或必需的。冻结-解冻阀(冻融阀，FTV)使用外部冷却源如热电冷却器(TEC)以将通道中的流体的塞子冻结，由此使在流体芯片的所需区域中的流体流动停止。之后可以通过使塞子升温直到其解冻而将通道打开。然而，FTV的实施已经被在微流体尺度上使冰晶体成核所需的低温所阻碍。
液态水既不必然地也不立即地在其熔点以下冻结。当液态水的温度降低至低于0℃时，其进入亚稳热力学状态(过冷)，其中类似固体的相(“胚”)的小聚集体遍及液相存在。这些胚与液相处于平衡地衰减和生长，并且它们的平均尺寸可以与过冷的程度成比例。为了亚稳液相向稳定固相(冰/冻结相)的转变，胚生长应当在能量上比起衰减来说是更有利和可能的。这在被称为“成核”(其存在两种类型)的过程期间发生。在纯液体中，当胚达到临界尺寸并且触发固相的继续生长时，成核均匀地进行。均匀成核的概率随着过冷相的温度的降低而增加。在大约-35℃，概率开始相对于每个连续的1℃下降以50的因数增加，并且在大约-40℃，均匀成核的可能性接近或达到100％。在这个温度范围以上，水可能会与异种物质如矿物质、灰尘、或花粉不均匀地成核。在宏观尺度上通常观察不到深度的过冷，因为这些成核杂质可能是充足的。
微流体装置通常具有光滑的通道壁和非常小的体积，使得成核部位稀少。在大多数微流体装置中，通常需要高的过冷程度(通常至低于-20℃的温度)以将水冻结。这增加了系统对热泵送以及因此的电力的需要。在微流体装置和冷却元件之间的强的热接触也可以是不平凡的设计困难。薄的材料如D263玻璃通常用于使从通道向外的热泵送增加或最大化。这些薄的玻璃材料可能是易碎的。此外，在不存在成核部位的情况下，成功的阀门调节事件的再现性可以具有高百分数的相对标准偏差(％RSD)。这些问题可以通过使用能够在温暖的温度下使冰成核的试剂来克服，但是由于它们的水不溶性和/或可能抑制许多生物过程并且导致许多在生物缓冲液中使用的盐的沉淀的成分，大多数在微流体装置中具有有限的应用。此外，许多成核剂在干燥时最好地发挥作用，并且在水中悬浮时可能会丧失其有效性的大部分。这些因素已经限制了FTV在微流体装置中的实施。
本发明实施方案的概述
本发明的实施方案提供具有采用一种或多种冰成核剂(INA)(例如，一种或多种冰成核蛋白“INP”和/或其功能片段和/或包含其的微生物)的一个或多个FTV的微流体芯片，其可以可靠地运行以与常规的具有FTV系统的微流体装置相比在相对高的温度下和/或以更快的速率冻结。
本发明的实施方案提供可以可靠地在水溶液中发挥作用并且不需要干燥的INA，从而允许在各个微流体装置上的多种阀驱动。
本发明的实施方案可以采用基板，如，例如聚合物、玻璃、硅、金属、或适用于具有FTV的微流体芯片的其他基板。
本发明的实施方案涉及流体分析装置，其包括至少一个流体通道，所述流体通道具有至少一个冻结解冻阀和至少一种冰成核剂(INA)。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物中的一种或多种。
所述至少一种INA可以提取和/或来源自生物。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。任选地，所述INP和/或其功能片段可以提取自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的膜。
所述INP可以由以下基因中的一种或多种编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，所述基因发现于和/或获得自以下生物中的一种或多种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。也可以使用其他基因和/或生物。
所述流体分析装置可以具有第一和第二基板，所述第一和第二基板附连在一起，以限定具有至少一个流体输送通道的微流体芯片并且限定具有多个隔开的冻结解冻阀的流体输送通道。
所述流体分析装置可以与包含所述至少一种INA的液体缓冲液流体连通。可以将所述至少一种INA可流动地引入至在所述流体分析装置上的流体口中。
所述至少一个冻结解冻阀可以是多个隔开的冻结解冻阀，每个冻结解冻阀包括与所述至少一个流体通道的限定区域热连通的热电冷却器。
所述至少一个流体通道可以至少具有尺寸设置为微流体或纳米流体通道的区段。
所述至少一个流体通道可以具有主输送通道和至少一个试剂通道。
所述流体分析装置可以具有全部与所述主输送通道流体连通的样品输入口、缓冲液输入口和珠孔阵列。所述至少一个冻结解冻阀可以是与所述主输送通道和/或至少一个试剂通道流体连通的多个隔开的冻结解冻阀。
所述至少一个流体通道可以包括至少一个具有结合和/或涂布至其表面的所述至少一种INA的流体通道。
所述流体分析装置可以具有珠储存/样品温育室、废料储蓄器和样品计量环路。所述样品计量环路可以位于所述珠储存/温育室和所述样品输入口之间。
所述样品计量环路可以具有约1μL至约1mL之间的体积容量并且与在所述样品计量环路的各个端部上的第一和第二冻结解冻阀流体连通。INA可以用于改善作为样品制备的一部分的所述样品在所述样品计量环路中的冻结，样品制备包括但不限于细胞溶解。
所述至少一种INA可以包含与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构。
其他实施方案涉及分析靶标分析物的方法。所述方法包括：提供具有与至少一个冻结解冻阀流体连通的至少一个流体通道的流体分析装置；将至少一种冰成核剂(INA)引入至所述至少一个流体通道中；以及将所述至少一个冻结解冻阀选择性电子冷却以使用所述至少一种INA将所述至少一个冻结解冻阀冻结。
所述至少一个冻结解冻阀可以是多个隔开的冻结解冻阀。所述方法可以包括将与所述至少一个流体通道热连通的冷却器(电子)设定为通常在-100摄氏度至-1摄氏度的范围内、更通常在-50摄氏度和-2摄氏度之间的温度，以将所述冻结解冻阀冻结。
所述流体装置可以是具有在0.01mm至10mm之间的厚度的流体微芯片。
所述冻结解冻阀中的至少一些具有热电冷却器，将所述热电冷却器设定为所需温度，如，例如在约-50摄氏度和约-2摄氏度之间以用于在三分钟以内进行的冻结操作，并且可以针对各个流体装置、分析物和/或分析多次进行选择性电子冷却。
所述装置可以是流体微芯片。
所述分析物可以是或包括下列各项中的分子：DNA、RNA、肽、蛋白、聚糖、药物、或其他生物或合成大分子或元素或无机化合物。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。
所述至少一种INA可以提取或来源自生物。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。
任选地，所述INP和/或其功能片段提取自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的膜。
所述INP可以由以下基因中的一种或多种编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，所述基因发现于和/或获得自以下生物中的一种或多种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syrmgae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。也可以使用其他基因和/或生物。
在液体中将所述至少一种INA可流动地引入至所述至少一个流体通道中。
所述液体可以是缓冲液。所述至少一种INA可以在所述缓冲液中稀释。
所述至少一种INA可以从包含所述至少一种INA的涂层的表面引入，和/或所述至少一种INA吸附和/或化学结合至所述至少一个流体流动通道的表面。
所述至少一种INA可以具有与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构。
另外的实施方案涉及用于DNA加工的液体缓冲液。
所述液体缓冲液可以包括任选稀释至1个分子/μL至100亿个分子/μL之间的至少一种冰成核剂(INA)。所述INA的浓度也可以超过100亿个分子/μL并且可以横跨纳摩尔、微摩尔、和/或毫摩尔浓度范围。
所述至少一种INA可以提取或来源自生物。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。任选地，所述INP和/或其功能片段可以提取于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的膜中。
所述INP可以由以下基因中的一种或多种编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，所述基因发现于和/或获得自以下生物中的一种或多种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、和野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)。也可以使用其他基因和/或生物。
所述至少一种INA可以包括一种或多种适配体(aptamer)。
所述至少一种INA可以包括冰成核蛋白、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物中的一种或多种。
所述至少一种INA可以具有与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构。
要指出的是，针对一个实施方案描述的本发明的多个方面可以结合在不同的实施方案中，尽管未针对其具体描述。也就是说，全部实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留改变任何最初提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以独立于和/或结合任何其他一个或多个权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以该方式要求保护。在以下给出的说明书中详细地解释了本发明的这些和其他目的和/或方面。本领域普通技术人员将会根据对以下优选实施方案的附图和详细描述的阅读而理解本发明的另外的特征、优点和详情，这样的描述仅是说明本发明。
附图简述
图1A是根据本发明的实施方案的具有放置在输送通道附近的至少一个热电冷却器的微流体芯片的示意性末端剖视图。
图1B是根据本发明的实施方案的在图1A中示出的装置的示意性顶视图，其示出了在容纳输送通道的至少一部分的基板下方的热电冷却器。
图2A是根据本发明的实施方案的示例性微流体芯片的放大顶视图。
图2B是根据本发明的实施方案的在图2A中示出的示例性微流体芯片的放大顶视图，并且还示出了包括示例性冻结-解冻阀占用空间(foot-print)的额外组件/特征。
图2C是根据本发明的一些实施方案的具有指出阀编号的注释的在图2B中示出的微流体芯片的放大顶视图。
图3A是根据本发明的实施方案的示例性微流体芯片的放大顶视图。
图3B是根据本发明的实施方案的在图3A中示出的示例性微流体芯片的放大顶视图，并且还示出了包括示例性冻结解冻阀占用空间的额外组件/特征。
图3C是根据本发明的一些实施方案的具有指出阀编号的注释的在图3B中示出的微流体芯片的放大顶视图。
图4A是根据本发明的实施方案的双基板微流体芯片的数字照片。
图4B是根据本发明的其他实施方案的双基板微流体芯片的数字照片。
图5A是根据本发明的实施方案的示出将PTFE仅空气(air-only)膜放置在芯片的限定区域之上的双基板微流体芯片的数字照片。
图5B是根据本发明的实施方案的在图5A中示出的微流体芯片的放大区段的数字照片，但是PTFE仅空气膜不在珠储存/样品温育室之上的位置。
图6是可以根据本发明的实施方案进行的用于对分析物进行处理和/或分析的方法的示例性行为的流程图。
图7是根据本发明的实施方案的可以可释放地结合一个或多个用于分析的微流体芯片的自动试验系统的一部分的侧、前透视图。
图8是根据本发明的实施方案的具有用于流体控制的冻结-解冻阀的示例性系统的示意图。
图9是根据本发明的实施方案的用于控制冻结解冻阀开/关和/或温度操作的示例性图形用户界面。
图10是根据本发明的实施方案的具有用于容纳微流体芯片的TEC底座的示例性安装组合件的分解图。
图11是根据本发明的实施方案的冻结时间(秒)相对于温度的图表，关于作为在每个温度下最左侧的柱示出的不具有INP(“无INP”)的缓冲液和关于在Tris缓冲液中的不同INP提取物稀释液。无INP缓冲液在指定的时间内在-20摄氏度下不冻结。误差柱示出了在每个方向上的一个标准偏差。
图12是根据本发明的实施方案的用于冻结样品的解冻时间(秒)相对于温度的图表，关于在Tris缓冲液中的五种不同INP提取物稀释液。对于每组柱来说的最左侧的柱是关于不具有INP(无INP)的缓冲液。解冻时间在关于无INP缓冲液的-20摄氏度冻结温度下不适用，因为其在该温度下不冻结。误差柱示出了在每个方向上的一个标准偏差。
图13是根据本发明的实施方案的用于冻结样品的冻结时间(秒)相对于温度的图表，关于不同芯片厚度和不同INP提取物稀释液。对于标准和薄厚度的微流体芯片来说，解冻时间在关于无INP缓冲液的-20摄氏度冻结温度下不适用，因为样品在该温度下不冻结。误差柱示出了在每个方向上的一个标准偏差。
本发明实施方案的描述
现在将在下文中参照其中示出本发明的实施方案的附图更充分地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施并且不应被解释为限于在本文中给出的实施方案。相似的数字始终是指相似的元件。在附图中，为了清楚，可以将某些层、组件或特征放大，并且虚线示出了任选的特征或操作，除非另外规定。此外，操作(或步骤)的顺序不限于在附图和/或权利要求中给出的顺序，除非具体地另外指出。在附图中，为了清楚，可以将线、层、特征、组件和/或区域的厚度放大，并且虚线示出了任选的特征或操作，除非另外规定。在文字和附图中，针对“图”的缩写“FIG.”和“Fig.”可以可互换地使用。
仅出于描述具体实施方案的目的而在本文中使用的术语并非意在限制本发明。如在本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也意在包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。将会进一步理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和/或“包括(including)”规定所述的特征、区域、步骤、操作、元件、和/或组件的存在，但是不排除添加一个或多个其他特征、区域、步骤、操作、元件、组件、和/或它们的组的存在。如在本文中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列举项的任何一个和全部组合。如在本文中所使用的，短语如“在X至Y之间”和“在约X至Y之间”应当被解释为包括X和Y。如在本文中所使用的，短语如“在约X至Y之间”意指“在约X至约Y之间”。如在本文中所使用的，短语如“约X至Y”意指“约X至约Y”。
应理解的是，当提到特征如层、区域或基板在另一个特征或元件“上”时，其可以直接在另一个特征或元件上，或者也可以存在介于中间的特征和/或元件。相反，当例如提到元件“直接”在另一个特征或元件“上”时，不存在介于中间的元件。还应理解的是，当提到特征或元件与另一个特征或元件“连接”、“附连”或“偶联”时，其可以与另一个元件直接连接、附连或偶联，或者可以存在介于中间的元件。相反，当提到特征或元件与另一个元件“直接连接”、“直接附连”或“直接偶联”时，不存在介于中间的元件。尽管针对一个实施方案描述或示出，如此描述或示出的特征可以适用于其他实施方案。
除非另外定义，在本文中使用的全部术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。将会进一步理解的是，术语，如在常用词典中所定义的那些，应当被解释为具有与它们在本申请的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度正式的意义来解释，除非在本文中明确地那样定义。为了简洁和/或清楚，可以不对公知的功能或结构详细描述。
为了方便描述可以在本文中使用空间相关术语如“在......以下”、“在......下方”、“下部”、“在......之上”、“上部”等以描述如在附图中所示的一个元件或特征与另外一个或多个元件或一个或多个特征的关系。应理解的是，除了在附图中描绘的方向之外，空间相关术语意在包括装置在使用或操作中的不同方向。例如，如果将在附图中的装置倒置，则被描述为在其他元件或特征“以下”或“之下”的元件之后定向在另外的元件或特征“之上”。因此，示例性的术语“在......以下”可以包括在......之上和在......以下的方向二者。可以将装置另外定向(旋转90度或在其他取向上)并且相应地解释空间相关的描述符。类似地，在本文中仅出于解释目的而使用术语“向上”、“向下”、“竖直”、“水平”等，除非具体地另外指出。
应理解的是，尽管可以在本文中使用术语第一、第二等以描述多种元件、组件、区域、层和/或部分，这些元件、组件、区域、层和/或部分不应被这些术语限制。这些术语仅用于将一个元件、组件、区域、层或部分与另一个区域、层或部分进行区分。因此，以下讨论的第一元件、组件、区域、层或部分可以被称为第二元件、组件、区域、层或部分，而不违背本发明的教导。
所有参考文献(专利、专利申请和文章)通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
术语“微芯片”和“微流体芯片”可互换使用并且是指基本上平面的、薄的装置。微流体芯片可以是刚性的、半刚性的或柔性的。术语“薄”是指10mm以下如在10mm至0.01mm之间、并且可以是约3mm、约2.5mm、约2mm、约1.5mm、约1mm、约0.5mm、约0.1mm、和约0.01mm的厚度尺寸。微芯片通常具有小于约6英寸、更通常在约1英寸至6英寸之间的宽度和长度。微芯片可以具有小于长度尺寸的宽度尺寸。在一些实施方案中，微流体芯片可以具有约2.13英寸(54mm)的宽度尺寸和约3.4英寸(85.5mm)的长度尺寸。微芯片可以包括微米尺寸和/或纳米尺寸的流体通道。
术语“主要尺寸”是指流体通道的宽度和/或深度尺寸。
就流体通道而言，术语“微米尺寸”和“微流体”是指具有毫米、亚毫米或更小尺寸的宽度和/或深度的流体流动通道(例如，术语包括毫米、微米和纳米尺寸通道)并且包括具有至少一个宽度和/或深度在数百微米以下、通常小于900微米且大于1nm的尺寸范围内的区段的通道。
在一些实施方案中，主输送通道可以是具有主(major)长度的微流体通道，具有至少一个在1nm至约500μm之间的主要尺寸。例如，主输送通道可以具有约250μm/250μm(宽度/深度，即宽度/高度)尺寸的主要尺寸。术语“主流体输送通道”是指流体通道，通常包括至少一个副长度，其是分析物流经其以用于分析的微米尺寸通道或纳米通道。
术语“纳米通道”是指具有在纳米尺度的临界尺寸的通道或沟槽。纳米通道的主要(也被称为“临界”)尺寸通常低于约100nm，包括在约1-70nm之间。在一些实施方案中，至少一个主要尺寸可以是约5nm以下(平均或最大)。
流体通道具有侧壁和底板。一个或多个流体输送通道可以形成为固体基板以具有开放的上表面和封闭的下表面以及在其之间延伸的侧壁。一个或多个顶部基板、膜或盖可以用于密封、覆盖或封闭一个或多个流体通道的上表面和/或相关端口。
术语“约”是指可以在+/-20％以下如+/-10％之间变化的参数。
术语“横向”通道是指与各流体输送通道交叉的流体通道。流体装置可以包括多个各自并入主输送通道中的横向通道。
在样品中的分析物可以是来自例如包括多种混合物(包括合成的和生物的大分子、纳米粒子、小分子、DNA、核酸/多聚核酸、肽、蛋白、聚糖、药物、元素化合物、无机化合物、有机化合物、和/或类似物质)的样品的任何目标分析物。分析物可以一种或多种单一分析物分子。样品或样品的分析物可以包括一种或多种极性代谢物，如氨基酸或带电分子、分子、肽、和蛋白。样品和/或分析物可以另外或备选地包括从生物流体、血液、血清、尿液，干燥血液、细胞生长培养基、裂解细胞、饮料或食物中提取的分子。样品可以另外或备选地包括环境样品，如水、空气或土壤。
可以使用动电学、浓差极化和/或液压或气动压力(强制压力或压力梯度)、毛细力或重力中的一个或多个进行经由输送通道的输送。
如在本文中所使用的“冰成核剂”、“INA”或其语法变体是指可以具有和/或具有催化和/或引发冰晶体形成的能力的试剂。因此，INA可以具有和/或具有使冰成核的能力。INA可以降低在给定温度下的FTV动作时间。在一些实施方案中，INA是含碳INA(即含有至少一个碳原子)。在一些实施方案中，INA包括和/或是冰成核蛋白(单数为“INP”，复数为“INPs”)和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。在一些实施方案中，INA不是含银试剂，如，例如碘化银和/或包含银的纳米粒子。在一些实施方案中，INA不导致和/或准备使盐在其所存在的流体中的沉淀。在一些实施方案中，INA不干扰生物过程和/或使用微流体装置研究和/或进行的测定中的过程。在一些实施方案中，INA不干扰在其存在的流体中的组分。
因此，在一些实施方案中，INA可以是生物，如，例如无脊椎动物(例如，多细胞无脊椎动物)、细菌、真菌、和/或地衣，其包括和/或表达INP和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。在一些实施方案中，INA可以得自生物(如细菌和/或酵母)，其包括和/或表达(例如，通过蛋白工程)INP和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。在一些实施方案中，INA可以是生物(例如，脊椎动物和/或微生物)的组分和/或衍生物，如，例如其中存在INP和/或其片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物的生物的细胞和/或细胞组分(例如，细胞膜)。在一些实施方案中，当INP和/或其功能片段保留在细胞膜中和/或能够与其他膜组分(例如，其他细胞膜蛋白或脂质)相互作用时，可以使成核有效性最大化。在一些实施方案中，冰成核脂质可以包括细胞膜的全部或一部分，或者可以包括合成的脂质膜的全部或一部分。冰成核脂质可以增强其他冰成核剂的作用。在一些实施方案中，INA可以是INP和/或其功能片段。在一些实施方案中，INA可以是冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物，如，例如可以使冰成核的合成核酸、合成脂质、和/或合成碳水化合物。在一些实施方案中，INA可以是天然存在的、合成的、或选择性进化的核酸序列。
可以在本发明的装置、流体通道、和/或FTV中存在两种以上(例如，3、4、5、6、或更多种)不同的INA。例如，本发明的装置可以包括多个FTV，并且多个FTV中的一个FTV可以包括与多个FTV中的另一个FTV相同的INA、相同的INA组合、不同的INA、和/或不同的INA组合。INA可以以任何适合的浓度存在于本发明的装置、流体通道、和/或FTV中。在一些实施方案中，INA可以以在约1分子或生物/μL至约100亿分子或生物/μL的范围内的浓度存在于装置、流体通道、和/或FTV中，或在其中的任何范围和/或单独的值，如，例如约1,000分子或生物/μL至约300万分子或生物/μL。在一些实施方案中，INA的浓度可以在纳摩尔至毫摩尔浓度的范围内，如，例如约1nM至约1mM。在一些实施方案中，INA可以以大于100亿个分子/μL的浓度存在于装置、流体通道、和/或FTV中。在一些实施方案中，INA可以以在横跨纳摩尔、微摩尔、和/或毫摩尔浓度范围的范围内的浓度存在于装置、流体通道、和/或FTV中。
在一些实施方案中，INA(例如，INP、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物)包含可以为冰形成供核的结构(例如，二级、三级、或四级结构或其部分)。在一些实施方案中，INA(例如，适配体，如DNA、RNA、和/或肽适配体)可以包含与冰相似的结构并且可以将水分子排列为冰状晶格。在一些实施方案中，INA可以高效率地使冰成核(即INA可以不像花粉和/或灰尘粒子一样随机地使冰成核)。在一些实施方案中，在给定温度下，INA可以通过使水和/或溶液在平均比水和/或溶液在不存在INA的情况下冻结的平均时间少的时间内冻结而高效率地使冰成核。在一些实施方案中，在给定温度下在微流体装置的各个冻结-解冻阀中，与水和/或溶液在冻结解冻阀中在不存在INA的情况下冻结的时间相比，INA可以通过使水和/或溶液通过连续的冻结动作在具有能够使用十次试验评估的少于50秒(例如，少于45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1秒)的标准偏差的较少时间内冻结而高效率地使冰成核。
INA的实例包括但不限于在美国专利号4,200,228；4,706,463；4,978,540；5,233,412；5,489,521；5,532,160；5,554,368；5,620,729；5,843,506；5,972,686；6,361,934；和7,624,698以及欧洲专利申请号88114120.4中描述的那些，对于与该段相关的教导，其每一个的各部分通过整体引用结合在本文中。
如在本文中所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。术语包括其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可以可互换地使用并且包括RNA和DNA两种，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成的(例如，化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体。术语多核苷酸、核苷酸序列、或核酸是指核苷酸的链，而不考虑链的长度。核酸可以包含一个或多个非天然存在的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸的人工化学类似物)，其可以或可以不以与天然存在的核苷酸相似的方式进行碱基配对。在一些实施方案中，核酸可以包含一个或多个通常不天然存在、并且可以不必须以与天然存在的核苷酸相似的方式进行碱基配对的碱基。核酸可以是双股或单股的。除非另外限制，术语“核酸”包括具有天然核苷酸序列的基本性质的类似物，原因在于它们以与天然存在的核苷酸相似的方式与单股核酸(例如，肽核酸)杂交。
在一些实施方案中，INP和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物可以为其在其中存在和/或表达的生物和/或细胞赋予冰成核活性的(冰+)表型。如在本文中所使用的冰+表型是指生物和/或细胞在较高温度下(如在低于0℃且高于-20℃的温度下，和/或在其中的任何范围和/或单独的值)催化和/或引发冰晶体形成的能力。因此，冰+表型提供具有在-20℃至0℃范围内的温度下产生冰核的能力的生物和/或细胞。如本领域技术人员将会意识到的，INP和/或其功能片段(例如，从其中表达它的生物中收获和/或提取的INP和/或其功能片段)、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物本身可以具有催化和/或引发冰晶体形成的能力。
在一些实施方案中，INP可以是细胞膜蛋白，如，例如外部细胞膜蛋白。INP可以由生物自然表达和/或存在于生物中，如，例如脊椎动物；无脊椎动物(例如，多细胞无脊椎动物)；细菌；真菌；和/或地衣。在一些实施方案中，可以在生物中重组地表达INP。
自然表达INP的实例细菌包括但不限于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、南极假单胞菌(P.antarctica)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。在一些实施方案中，INP可以存在于表达INP的生物(例如，细菌)的外部膜中。在一些实施方案中，INP可以从表达INP的细菌的膜中收获和/或提取，如，例如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
如在本文中所使用的，对于多肽来说，术语“片段”是指这样的多肽：其长度相对于参考多肽(例如，全长INP，如天然存在的INP)减小，并且包含与参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成和/或由所述氨基酸序列组成。在适当时，这样的多肽片段可以包含在它作为其成分的较大多肽中。在一些实施方案中，多肽片段包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、或更多个连续氨基酸，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，多肽片段包含小于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450或500个连续氨基酸，基本上由其组成或者由其组成。
如在本文中所使用的，对于多肽来说，术语“功能片段”是指保留全长多肽的至少一种生物活性(例如，催化冰形成和/或赋予冰成核活性(冰+)的表型的能力)的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％以上的多肽片段。在一些实施方案中，功能片段可以具有全长多肽的至少一种生物活性的更高水平。在一些实施方案中，含有INP的功能片段的生物(例如，含有INP功能片段的细菌)可以具有全长多肽的至少一种生物活性的更高水平。
在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以包含至少1个两个以上连续氨基酸的重复序列(repeat)，如，例如8、16、和/或48个氨基酸序列的重复序列。在一些实施方案中，两个以上连续氨基酸(例如，8、16、和/或48个氨基酸序列)可以在INP和/或功能片段中重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多次。两个以上连续氨基酸(例如，8、16、和/或48个氨基酸序列)可以在INP和/或功能片段中连续重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多次。在一些实施方案中，重复序列可以是不完全的(imperfect)和/或展现出天然差异。实例氨基酸序列包括但不限于在Green&Warren，Nature 1985，vol.317，pp 645-648中描述的那些，对于与该段相关的部分，其内容通过引用结合在本文中。在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以包含串联重复的8、16、和/或48个氨基酸序列，其可以存在于INP的内部区域中。
在一些实施方案中，INP可以由一个或多个基因编码，如，例如，但不限于iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和/或inaZ。INP可以存在或发现于和/或获得自生物，如，例如，但不限于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、南极假单胞菌(Ps.antarctica)、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Ps.putida)、绿黄假单胞菌(Ps.viridiflava)、成团泛菌(Pa.agglomerans)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、和/或北方假单胞菌(Ps，borealis)。在一些实施方案中，INP可以由如在表1中所示的存在或发现于和/或获得自生物的基因编码。例如，INP可以是由发现或存在于和/或获得自草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)的iceE基因编码的多肽。
表1：实例冰成核基因/蛋白和它们可以发现或存在于和/或获得自的物种。
Figure BDA0001605065090000161
Figure BDA0001605065090000171
在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以是由inaZ基因编码的多肽，如，例如如以登录号P06620给出的多肽(ICEN_PSESY)。INP的中央结构域(domain)(例如，inaZ)可以包含122个八肽的不完全重复序列，并且其可以具有与冰相似的结构。在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以将水分子排列为冰状晶格。在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以具有包含至少一个β发夹(例如，1、2、3、4、5、或更多个)的结构，并且任选地，至少一个β发夹可以包含1、2、或更多个八肽重复序列。在一些实施方案中，冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物可以具有与INP的结构的至少一部分相似的结构。
在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以是天然、合成、和/或重组地获得和/或制备的。在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以从可以天然和/或重组地表达其的生物中分离、获得、收获、和/或提取。在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以从生物或微生物(例如，细菌、真菌等)中分离、获得、收获、和/或提取并且用作INA。
在一些实施方案中，INP和/或其功能片段可以通过重组技术获得并且可以基于来自天然和/或合成DNA的质粒。重组INP和/或其功能片段可以在生物如细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))和/或酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表达。类似地，INP试剂可以在其他适合的生物如植物或动物中表达。重组INP和/或其功能片段可以被修饰以辅助INP和/或功能片段的表达、纯化、改性、和/或稳定性。例如，重组INP和/或其功能片段可以被修饰以包含聚组氨酸标签，以促进多肽从其中表达它的生物中的纯化，和/或可以被修饰以具有更优选的特征，如，例如在不同条件如温度范围、pH水平、离子强度、和溶剂强度下对变性提高的抗性。重组INP和/或其功能片段可以被修饰以包含与表面或另一个分子附连的官能团。在一些实施方案中，重组INP和/或其功能片段可以被修饰以改善冰成核。例如，重组INP和/或其功能片段可以被修饰以包括将序列重复，以将两个以上INP/功能结构域连接在一起，以在PTM期间连接磷脂，或包含间隔体以优化INP结构域之间的距离。在一些实施方案中，重组INP和/或其功能片段可以被修饰以将两个以上INP和/或其功能片段组合在一起。
在一些实施方案中，可以将INP和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物分离。如在本文中所使用的，对于多肽、核酸、脂质、和/或碳水化合物来说，术语“分离”是指脱离其天然环境存在并且因此不是天然产物的人工的多肽、核酸、脂质、和/或碳水化合物。在一些实施方案中，冰成核多肽、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物以基本不含细胞物质、病毒物质、培养基(当通过重组DNA技术制备时)、或化学前体或其他化学物质(当化学合成时)的纯化形式存在。“分离片段”是作为片段不以实质浓度天然存在并且将不会在痕量水平以上以天然状态发现的多肽、核酸、脂质、和/或碳水化合物。“分离”并非意指技术上纯净(均匀)的制备，而是意指足够纯净以提供其可以用于预期目的的形式的冰成核多肽、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。在某些实施方案中，包含冰成核多肽、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物的组合物纯度至少约为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上。
在一些实施方案中，INA可以在微流体尺度上使冰晶体成核。因此，如在本文中所描述的INA可以在微流体尺度上，如，例如在微流体芯片中在水和/或溶液(例如，水溶液)中催化和/或引发冰晶体形成，从而使水和/或溶液冻结。可以在微流体芯片中(例如，在流体通道和/或FTV中)冻结的流体(例如，水)的体积可以是在约1飞升至约100毫升的范围内，和/或在其中的任何范围和/或单独的值。在一些实施方案中，可以使用可以在一个或多个冻结-解冻阀中冻结的较大的流体体积，如约1毫升或数毫升。如在本文中所使用的“冻结”是指足以阻止和/或停止存在于与外部冷却源如热电冷却器相连的微流体装置上的FTV中的流体的流动的量的固相的形成。因此，在冻结之后，在微流体芯片中(例如，在流体通道和/或FTV中)的固相可以具有大于流体在冻结之前的体积的体积。
在一些实施方案中，与水和/或溶液在不存在INA的情况下冻结的温度和/或时间相比，在微流体芯片中使用INA可以平均在较高的温度下和/或在较少的时间内使水和/或溶液冻结。在一些实施方案中，INA可以在比水和/或溶液在给定时间量内在不存在INA的情况下冻结的温度高至少5℃(例如，6、7、8、9、10℃、或更多)的温度下使水和/或溶液冻结。在一些实施方案中，INA可以减少在结晶进行之前将水和/或溶液固定在其熔点以下(例如，对于水来说是0℃)的平均时间。在一些实施方案中，INA可以将在结晶进行之前将水和/或溶液固定在其熔点以下(例如，对于水来说是0℃)的平均时间减少至少约5％以上，如，例如减少至少10％、15％、20％、25％、50％、或更多。
INA可以在低于0℃和高于-50℃(和/或在其中的任何范围和/或单独的值，如，例如约-1℃至约-20℃、约-6℃至约-14℃、约-2℃至约-12℃、约-1℃至约-30℃、约-2℃至约-8℃、约-2℃至约-50℃、或约-5℃至约-25℃)的温度下催化和/或引发在水和/或溶液(例如，水溶液)中的冰晶体形成。在某些实施方案中，INA可以在约0、-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30、-31、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47、-48、-49或-50℃(和/或在其中的任何范围和/或单独的值)的温度下催化和/或引发在水和/或溶液中的冰晶体形成。冻结/解冻温度可以在所需冻结解冻区域的容纳具有INA的溶液的微流体输送通道中测量。提供冻结和/或解冻输入的热电源的实际温度(设定)通常将会不同于在冻结/解冻区域的输送通道中的温度，例如冻结温度设定如-45℃至-20℃将会得到在输送通道中含有INA的物质的高于设定的冻结温度，通常高于设定约5至25℃。
一个以及通常全部各FTV 22可以以少于三分钟、通常在约45秒以下、更通常在2秒至33秒之间的冻结时间运行。一个或多个FTV 22的解冻时间可以少于相应的冻结时间，通常在1-30秒之间，如1-15秒之间。
可以将INA设计为在水和/或溶液如水溶液中发挥作用，并且可以不需要干燥。INA可以以多种方式提供。在一些实施方案中，可以将INA稀释至缓冲液中以用于向微流体芯片中和/或上输入。在一些实施方案中，INA可以在缓冲液或适用于与免疫测定一起使用的其他液体(例如，基于Tris的或基于磷酸盐的缓冲液)中提供。下面描述INP的其他配方/递送机制。
术语“回路”是指完全地硬件实施方案或将软件和硬件组合的实施方案。
术语“均匀成核”是指当类似固体的相(胚)的小聚集体存在于整个液相中时，胚达到临界尺寸，并且胚触发固相的继续生长。对于水来说，均匀成核通常发生在约-37℃以下。
术语“不均匀成核”是指由于液相中杂质(例如，INA)的存在而从亚稳过冷状态向稳定固态的相变。不均匀成核通常发生在液体表面上的成核部位，并且对于水来说，通常发生在约0℃至高于-40℃的范围内的温度下。在一些实施方案中，INA可以使其所存在的溶液和/或液体不均匀地成核。
术语“寡核苷酸”是指约五个核苷酸至约500个核苷酸(例如，5、6、7、8、9，10、12、15、18、20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)的核酸序列。在一些实施方案中，例如，寡核苷酸可以是约15个核苷酸至约40个核苷酸，或约20个核苷酸至约25或至约30个核苷酸，其例如可以用作聚合酶链式反应(PCR)扩增测定中的引物和/或用作杂交测定中或微阵列中的探针。用于加工的寡核苷酸可以是天然的或合成的，例如，如在本领域内公知的DNA、RNA、PNA、LNA、修饰的主链等，或它们的任何组合。
探针和引物，包括用于扩增和/或检测的那些探针和引物，是任何适合长度的寡核苷酸(包括天然存在的寡核苷酸如DNA和合成和/或修饰的寡核苷酸)，但是通常长度为5、6、或8个核苷酸，多至长度为40、50或60个核苷酸，或更多。可以将这样的探针和或引物固定在固体载体上或与固体载体偶联(固体载体比如是珠、芯片、针、或微量滴定板孔)，和/或与可检测基团偶联或用可检测基团标记，可检测基团比如是荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素、或酶。
在一些实施方案中，INA可以固定在固体载体上，附连至固体载体，或偶联至固体载体，固体载体如例如粒子或珠。INA可以在引入至流体分析装置中之前固定在固体载体上，附连至固体载体，或偶联至固体载体。可以将固定在固体载体上、附连至固体载体、或偶联至固体载体的INA引入至流体分析装置的至少一个流体通道中和/或可以用于冻结和解冻流体分析装置的至少一个冻结解冻阀。
在一些具体的实施方案中，具有冻结解冻阀并且包含INA(例如，INP和/或其功能片段和/或包含其的微生物)的流体装置可以根据已知技术进行PCR。参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；和4,965,188。通常，PCR包括，首先，将核酸样品(例如，在热稳定DNA聚合酶的存在下)与针对待检测的特定序列的每条链的一个寡核苷酸引物在杂交条件下进行处理，从而合成与每个核酸链互补的每个引物的延伸产物，并且引物与特定序列的每条链充分互补以与其杂交，从而由每个引物合成的延伸产物当与其互补序列分离时可以充当用于另一个引物的延伸产物的合成的模板，并且之后这些变性条件下处理样品以在存在待检测的一个或多个序列的情况下将引物延伸产物与其模板分离。可以循环重复这些步骤直到得到所需的扩增程度。通过向反应产物中加入能够与反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，所述探针携带可检测标记物，并且之后根据已知技术检测，或者通过在凝胶上的直接可视化，可以进行扩增的序列的检测。也可以通过在反应混合物中的嵌入染料以及监测将会与双链DNA的总质量成比例的荧光信号强度来检测扩增的序列。尽管针对PCR反应描述了根据本发明的实施方案，但应理解的是，可以使用其他核酸扩增方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，包括等温扩增技术如滚环扩增或环介导的等温扩增(LAMP)。
DNA扩增技术，如前述的，可以包括使用探针、一对探针、或两对探针，所述探针与含有目标多态性或突变的DNA特异性结合，但是在相同杂交条件下不与不含有目标多态性的DNA结合，并且所述探针充当用于在扩增反应中的DNA或其一部分的扩增的一个或多个引物。这样的探针在本文中有时被称为扩增探针或引物。
术语“试剂”是指加入至系统中从而产生化学反应或者加入以查看是否发生反应的任何物质或化合物，包括引物、核酸模板和/或一种或多种扩增酶。扩增试剂是指除了引物、核酸模板和扩增酶之外的通常用于扩增的那些试剂(脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液等)。通常，扩增试剂连同其他反应组分一起放置并且容纳在反应容器(试管、微孔等)中。
如在本文中所使用的术语“磁性”包括铁磁性、顺磁性和超级顺磁性性质。
在一些实施方案中，本发明的实施方案所预期的流体装置可以采用寡核苷酸探针，其用于检测含有目标多态性或突变，并且是与编码所述突变或多态性的DNA结合、但是在相同杂交条件下不与不含有突变或多态性的DNA结合的寡核苷酸探针。寡核苷酸探针可以用适合的可检测基团如以下给出的那些标记。这样的探针在本文中有时被称为检测探针或引物。
尽管针对PCR反应在本文中描述了根据本发明的实施方案，应理解的是，在本文中所描述的微流体装置和方法可以用于多个其他过程，例如反应。例如，任何核酸转录和/或扩增相关的反应均在本发明的范围内，包括但不限于PCR反应、实时PCR(rt-PCR)、数字PCR(dPCR)、RNA向cDNA的逆转录(RT)、来自之前RT步骤的cDNA的PCR(RT-PCR)、使用实时或数字量化的RT-PCR、免疫PCR(iPCR)及其变体、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环复制、和/或非酶核酸扩增方法(例如，“DNA回路”)。在本发明的范围内还包括对核酸进行测序的方法，包括下一代测序方法，包括借助基于合成或杂交的方法的测序。在本发明的范围内包括的其他反应包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(SiMoA)或数字ELISA、其中使用多个珠递送不同试剂以用于组合化学的反应、其中珠递送催化剂试剂的反应、和/或其中以通过随机珠加载确定的化学计量递送“点击”化学试剂的反应。对于使用裂解的试剂的过程的实例来说，参见，例如，U.S.14/402,565，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
现在转向附图，作为简单说明，本发明的实施方案所预期的流体装置的一个实例可以包括如在图1A和1B中所示的微流体芯片10。微流体芯片10具有至少一个流体输送通道20。一些实施方案可以包括多个输送通道。各个输送通道20具有至少一个限定的具有冻结解冻“阀”22的流动区域20r。冻结解冻阀22与至少一个冷却器25热连通；通常，流体装置包含多个冻结解冻阀22，每个具有各自的冷却器25，任选一个或多个热电冷却器(TEC)25t，其可以用于将输送通道20的各个限定区域中的液体冻结和解冻。至少一个热电冷却器25t可以是，例如珀耳贴(Peltier)冷却器。
在一些实施方案中，FTV 22中的一个或多个可以包括多个冷却器25，如在与各个FTV 22相连的相应通道区段20r之上的冷却器和之下的冷却器，其可以增加冻结作用，即缩短冻结的时间。
在一些具体的实施方案中，可以将热电冷却器25t配置为由夹在电绝缘但导热的材料的薄片之间的n-型和p-型半导体构成的固态装置。当向n-型和p-型元件的阵列施加直流电时，装置的一侧由于珀耳贴效应而冷却并且从周围环境中吸收热量。热量通过装置输送至对侧并且释放，在TEC的两侧之间之间形成温度梯度。参见，例如，Sgro等人，水性液滴在微流体装置中的热电操作(Thermoelectric Manipulation of Aqueous Droplets inMicrofluidic Devices)，Anal Chem.2007，79(13)：4845-4851，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。可以将小规模和较大的TEC嵌入、一体地附连至和/或可释放地直接或间接附连至微流体芯片10，以用于纳升和/或微升尺寸体积的局部冷却。对于热电冷却器的其他实例来说，参见，例如，Maltezos等人，使用微珀耳贴结对微流体的热管理(Thermal management in microfluidics using micro-Peltier junctions)，AppliedPhys.Lett.87，154105(2005)，其内容通过引用结合于此，如同在本文中完整叙述一样。
冷却器25可以具有可以具有在朝向和/或沿着输送通道20的流动方向上测量的长度L的与微流体芯片10热连通的热占用空间(footprint)“F”，FTV区域22的一些占用空间F可以比另一些(例如，图2B、2C、3B、3C)大(宽度和/或长度)。在一些具体的实施方案中，占用空间F可以由各个TEC 25t的尺寸限定。例如，对于FTV区域22中的至少一些来说，TEC 25t可以具有约16mm2的表面积，例如具有约4mm乘4mm的宽度和长度尺寸。
图2A-2C和3A-3C示出了微流体芯片10的实例，每个都具有多个与各自冷却器25热接触的冻结解冻阀22、珠孔阵列40、样品输入口45、珠储存/样品温育室50和废料储蓄器55。样品计量环路47可以位于珠储存/温育室50和样品输入口45之间。样品计量环路47可以任选具有如示出的蛇形形状。在一些实施方案中，样品计量环路47可以具有在约1μL至约1mL之间、更通常在1至500μL之间如约10.75μL至29μL之间的体积容量。环路47可以具有并入主流体输送通道20中的相对的开口端。
如示出的，例如，在图2A和3A中，与冻结解冻阀22相连的流体通道区段中的一些可以具有可以调整尺寸并且配置成增加被冷却器冷却的体积以促进冻结作用的曲线弯管22b。
珠孔阵列40可以具有温度控制部件125，其位于孔阵列40的全部长度或基本上全部长度之下或之上，可能在其入口/出口颈部附近、之前或之后终止。
微流体芯片10和/或芯片10的一个层可以具有经由芯片10的一侧或两侧在针对流体吸入/离开区域的限定位置处延伸的通孔(即，进入孔和/或端口)和/或流路。
如在图2A和3A中所示，样品输入口45可以包括经由进入孔或路45a的样品输入口。珠储存/样品温育室50可以包括进入路或孔50a。珠洗涤和二级试剂温育室52可以包括进入孔或路52a。缓冲液输入口60可以包括进入路或孔60a(图3A)。密封剂输入口66可以包括进入孔或路66a。检测底物(substrate)(和/或PCR预混液(master mix))70可以包括进入孔或路70a。废料储蓄器55可以包括通过一侧的通孔(through-hole)或路55a。二级试剂输入口63可以包括进入孔或路63a。
图3A示出了，微流体芯片10可以包括具有通孔或路68a的阵列预处理试剂室68和具有通孔或路69a的阵列洗涤和油吹洗废料室69。
图2A-2C示出了十五个具有冷却器25的冻结解冻阀22，并且图3A-3C示出了十四个具有冷却器25(例如，TEC部件/元件25t)的冻结解冻阀22，一些在微流体芯片10的顶表面10t上(图4)并且多个在微流体芯片10的底部10b之下。
如在图2C中所示，用于冻结解冻阀22的冷却器25(例如，TEC部件25t)可以位于通向珠孔阵列40的通道区段20s的每一侧，例如，阀7和8(阀7在珠储存/温育室50上游并且与其相邻)可以位于流体芯片10的上侧上并且其余部分可以位于微流体芯片10之下。如在图3C中所示，用于冻结解冻阀8和9的冷却器25可以位于微流体芯片10的顶部上，一个在珠储存/温育室50上游并且与其相邻，并且一个在通向珠孔阵列40的通道区段20s的内部。
用于冻结解冻阀22(即，图2C的阀7/8，图3C的阀8/9)的顶侧冷却器25可以位于薄区域中，例如约为顶部基板10t和/或芯片本身的主体的厚度的30-95％的区域，例如在基板的顶部上的约900μm厚的区域，所述基板在该区域/体积外具有1-2mm之间的标称或平均厚度。也就是说，微流体芯片10可以具有模制的并且容纳例如流体通道20、63i、20s的顶部基板10t(图4A、4B)。可以将较薄区域22t调整尺寸并且配置成容纳顶置冷却器25t和/或与其热连通。
微流体芯片10可以包括缓冲液输入口60和多个试剂输入口63(例如，流体储蓄器63f，图7)。图2A-2C示出了三个二级试剂输入口63，而图3A-3C示出了两个二级试剂输入口63。试剂输入口63可以各自与具有带有冷却器25的相应冻结解冻阀22的输入口通道63i相连。
微流体芯片10可以包括与二级试剂输入口63中的一个或全部流体连通的珠洗涤/二级温育室52。
微流体芯片10还可以包括检测底物区域和/或PCR预混液区域70。例如，在使用时，PCR预混液可以包含以最佳浓度含有热稳定DNA聚合酶、dNTP、MgCl2和反应缓冲液的预混合的、随时可用的溶液，以用于通过PCR进行DNA模板的高效扩增。
微流体芯片10可以包括密封剂输入口66。密封剂可以包括矿物质、有机硅、烃、碳氟化合物类、这样的油的混合物、或多官能化的合成油和/或蜡。
图2B、2C、3B和3C示出了与冷却器25相连的冻结解冻阀22的示例性占用空间F，其以在流体通道的各个限定局部区域周围绘制的封闭周长示出。这些附图还示出了透气性膜35、135。图2B和2C示出了在试剂输入口63、珠洗涤和二级试剂温育室52之上的一个膜35和在珠储存和样品温育室50之上的另一个膜135。图3B和3C示出了分别覆盖废料储蓄器55和试剂输入口63的两个分离的隔开的膜35。另一个透气性膜135位于珠储存/温育室50之上并且与检测底物和/或PCR预混液70以及阵列预处理试剂68相邻。
参照图4A和4B，微流体芯片10可以包括多个堆叠的层，通常为附连在一起的第一和第二基板层。图4A示出了顶部和底部基板10t、10b二者可以是视觉透过的，通常是透明的或半透明的。图4B示出了，底部基板10b可以是不透明的(例如，不透明的黑色)，而顶部10t可以是视觉透过的。
顶部基板层10t可以容纳至少一个流体输送通道20的至少一部分。输送通道20和其他流体通道可以是内部通道(被顶部基板10t包围)或者可以作为在基板10t中的开放上表面形成。在后者的情况中，覆盖物或盖可以附连至顶层10t的上表面以将输送通道20密封，或者输送通道20可以在其长度或其一部分上对大气开放。底部基板层10b可以容纳珠孔阵列40。如以上所讨论的，路和/或流体吸入/离开通道可以用于将储蓄器或室与一个或多个外部流体供给处和排出处连接。
如在图4A和4B中所示，一些室或储蓄器可以对大气/环境条件开放，包括样品吸入口45、珠储存器50、二级试剂温育室52、废料储蓄器55、二级试剂输入口63和检测底物和/或PCR预混液70。一个或多个透气性膜35、135可以位于这些特征/组件之上。
顶部和/或底部基板10t、10b可以包含任何适合的材料，并且可以是刚性的、半柔性的或柔性的。底部和顶部层10t、10b的基板可以是相同的或不同的材料。顶部层和/或底部层10t、10b可以包含硅、玻璃、硬质塑料、硬质聚合物材料、柔性聚合物材料、或这样的材料的任何混合物或复合材料。冻结可以用于通过冻结-解冻阀22调节在微流体芯片上的流体流动。微流体芯片10可以容纳在弹性/柔性基板(例如，聚二甲基硅氧烷)中和/或在非弹性/非柔性基板(例如，玻璃和硬质塑料)中的一个或多个主要输送通道和二级流体缓冲液和/或试剂通道。
图5示出了具有透气性膜35、135的微流体芯片10。在一些实施方案中，膜35可以位于废料储蓄器55、二级试剂输入口63、和检测底物和/或PCR预混液70之上。膜35、135可以包含PTFE或其他适合的材料并且可以是“仅空气”膜。术语“仅空气”意指在零至至少1psi(或更大，如至2、3、4或5psi)的施加的压力差下允许气体脱离或横跨膜而不允许液体或颗粒物质通过。
图5B示出了在珠储存/样品温育室50中干燥的珠，在室50之上的位置没有透气性膜135。
在一些具体的实施方案中，顶部基板10t可以注塑成型有流体通道20和其他流体通道。例如，输送通道20可以包括250μm宽、250μm深的通道。与在样品计量通道47的每个末端的流动通道20相比，样品计量通道47可以通常宽20-60％之间，如宽约50％。在一些实施方案中，计量通道47可以约500μm宽并且在重新并入通道20的直线区段中之前上下转换多次。与在计量通道47和阵列40之间的输送通道20(如约200μm深)相比，阵列室40可以较浅，例如浅10-50％。阵列40可以包括在阵列室40c中的物理结构如横向和纵向隔开的分隔器40d，以防止室在顶部基板10t与底部基板10b结合期间损坏。分隔器40d可以有助于通过宽阵列室40的流体流动的控制。
底部基板10b可以是视觉透过的，例如透明的或清澈的，或不透明的，通常不透明的黑色，并且还通常是塑料。底部基板10b可以含有约1-200万个之间的“狭缝”或“彗星”形状的珠和反应孔的阵列40。阵列40可以容纳约200万个圆柱形孔。在顶部基板10t中的孔可以用作储蓄器。它们可以含有干燥的珠和/或干燥的试剂。
一旦用一个或多个可透过空气的(过滤器)膜35、135覆盖，孔(例如，进入孔或路)即在读取器将缓冲液推入芯片10中时允许空气排出。废料储蓄器55上的真空可以与冻结-解冻阀22一起使用，以将再水化的试剂抽取至一个或多个温育室和/或一个或多个反应腔50、52中。通过输入口66(图2A-2C、3A-3C)的油或其他适合的密封剂可以用于在将珠阵列40成像以读取荧光信号之前将单独的反应彼此密封。如对本领域技术人员来说公知的，可以使用具有与其附连的磁铁的致动器臂将珠加载并且移动通过芯片10。
通常在将微流体芯片10与至少一个冷却器25热接触放置之后，包含INA(例如，INP和/或其功能片段和/或包含其的微生物)的缓冲液60f(图2A、3A)可以可流动地从缓冲液输入口60(图2A、3A)引入至输送通道20中。更通常地，将微流体芯片10放置在试验固定装置/安装组合件中的位置与放置在限定位置的多个隔开的热电冷却器25t热接触，然后具有溶剂化的INA的缓冲液60f可流动地引入至微流体芯片10中以占据/填充流体通道，包括通道20和试剂输入口63i。
可以通过将冷却器25如TEC 25t设定为通常在-100摄氏度至-1摄氏度之间的用于“冻结”操作/模式的限定温度来操作冻结-解冻阀25。在一些实施方案中，冻结温度可以在约-45℃(估算的稳态内部温度为-32℃)至约-20℃(估算的稳态内部温度为-11℃)之间。也可以使用低于-45摄氏度的温度，在一些实施方案中，温度可以是约-50摄氏度以上至-1摄氏度。可以使用高于-20摄氏度的温度。一个或多个FTV 22的不同冻结动作可以具有不同的温度和/或时间设定。在-45℃下，发现与无INA对照相比，含INA的缓冲液冻结快两倍，并且是更加可重复的。在向芯片的外表面施加的-20℃下，含INA的缓冲液在冻结时间方面展现出浓度依赖性效果，而无INA缓冲液在观察到的时间范围内根本不冻结。预期的是，本发明的实施方案可以用于促进能够降低系统对常规FTV系统的冻结时间和温度要求的微流体冻结-解冻阀门调节。冻结-解冻系统可以与不同的微流体基板相容，包括非柔性/非弹性材料如玻璃和硅，并且并且可以扩大使用者可用的装置设计的数量。
尽管在本文中所述的某些实施方案提出了在主(工作)缓冲液中溶剂化的INA(如经由缓冲液输入口60)(例如，图2A、3A)，也预期了其他将INA提供和/或引入至流体微芯片10的方式。例如，可以将微流体芯片10的一个或多个流体通道用含INA的缓冲液填充(部分或完全)，并且之后干燥，由此被动地使通道或通道区段涂布有INA。这些蛋白然后可以用于在使装置再水化之后为冻结供核。尽管如果蛋白随时间被洗去，对于这种方法来说无限数量的阀门调节步骤可能是不可行的，但如果将一些动作用于装置的运行，它工作良好。其实例包括其中仅在装置使用的早期阶段期间需要冻结的装置、或其中另外仅存在少许具有将会将INA洗掉的缓冲液的最小交换的冻结步骤的装置。
也可以将INA共价附连至通道壁，例如利用PEG-磺基-NHS链接化学(linkingchemistry)，并且利用固定的成核位置具有对仅通过洗涤移除的耐性的优点来实现相似的效果。
通过非共价附连，INA的定向展开(deployment)也可以是可能的。这样的一种情况将会是将链霉抗生物素蛋白与INA偶联(例如，在它们的重组表达期间直接偶联，或之后共价偶联)并且将生物素与其中需要INA的装置的区域偶联。链霉抗生物素蛋白修饰的INA将会之后与需要它们的区域牢固偶联。另一种非共价定向展开的情况可以包括用靶标分子修饰装置的区域，然后将INA与结合至靶标分子上的部位的抗体或适配体偶联。大粒子如聚苯乙烯微球也可以在INA与粒子附连(共价或被动)之后用作用于INA的载体。此外，INA可以通过疏水或亲水表面相互作用或其他非共价或静电力吸附至微流体通道壁。最后，如果系统不需要将蛋白提取和溶剂化，可以完全放弃提取过程以代替使用整个生物(例如，完整的丁香假单胞菌(P.syringae))或它们的含INA的膜。对于其中需要最暖的可能的冰成核温度(大约-2℃至-6℃)的系统来说，使用完整的生物或膜可能是必需的，因为可能会在将INP从细胞膜中移除之后损失这些成核部位中的>99.9％。
相对于不具有这样的INA的已知的常规微流体芯片，使用具有INA的冻结-解冻阀的溶液(例如，水溶液)的冻结可以在较高的温度下引发。INA可以任选收获自细菌，作为流体添加剂。冻结过程可以在与在不存在INA的情况下所需的那些相比相对温暖的温度下进行。INA可以在约-2℃的温度下引发冰结晶过程，而水可以被过冷至大约-40℃并且在不存在成核部位(例如，在纯水中或在具有光滑通道的微流体装置中)的情况下不结晶。对于在较温暖的温度下触发冻结来说，此外和/或备选地，INA可以明显减少在结晶进行之前必须将水维持在凝固点以下的平均时间。INA冻结-解冻处理技术的实施可以用于允许利用简单且容易制造的芯片结构进行精确的流体控制，而不需要移动阀部件，大幅降低了制造和运行成本。
在一些实施方案中，可以在制备样品的方法中使用INA。例如，INA可以用于改善作为样品制备的一部分的样品在流体分析装置中的样品计量环路中的冻结，样品制备包括但不限于细胞溶解。在一些实施方案中，样品可以包含多个细胞，并且多个细胞中的至少一部分可以通过以下方式裂解：使用至少一个冻结解冻阀将样品计量环路选择性地电子冷却以将至少一个冻结解冻阀和/或在样品计量环路中的样品的至少一部分冻结。在一些实施方案中，可以将样品计量环路和/或至少一个冻结解冻阀加热以使样品计量环路、至少一个冻结解冻阀、和/或样品的至少一部分解冻。将样品计量环路和/或至少一个冻结解冻阀加热可以是主动加热或被动加热。主动加热可以是将样品计量环路和/或至少一个冻结解冻阀选择性地电子加热。主动加热可以使用热源(例如，热电源)以增加冻结解冻阀和/或样品计量环路的温度。被动加热是基于周围环境在不主动应用来自热源的热量的情况下使冻结解冻阀和/或样品计量环路升温(例如，解冻)至室温。
图6示出了可以针对用于对分析物进行处理和/或分析的方法进行的示例性行为。如示出的，提供具有多个隔开的冻结-解冻阀和包含INA的流体通道的流体装置(方格160)。将冻结解冻阀冷却至冻结温度以使液体停止流经冻结解冻阀(方格170)。将冻结解冻阀加热至解冻温度以允许液体流经冻结解冻阀(方格180)。冻结解冻阀的加热可以是主动的或者可以是被动的。
INA可以收获和/或来源于生物如细菌(方格162)。
可以将INA在液体中可流动地引入至与冻结解冻阀相连的至少一个流体通道中(方格165)。可流动的引入可以是单次或相继的限定的量或推注(即，批次)，或者以连续方式进行。在单个微流体装置中的相继的处理操作期间，INA的量可以是恒定的、增加或减少。
装置可以是具有底部基板和顶部基板(直接或间接附连在一起)的微流体芯片。底部基板可以具有在0.01mm至10mm之间的厚度(方格164)。
可以使用与流体微芯片热连通的热电冷却器(TEC)进行冷却和加热(方格175)。TEC中的一些可以位于底部基板附近并且一些可以位于顶部基板附近。可以将TEC设定为在-100摄氏度至-1摄氏度之间的温度以用于冷却至冻结温度(方格177)。
可以将提取的INA溶液加入至相对于缓冲液以任何适合的量稀释(仅通过举例的方式，例如1∶10至1∶10,000)的缓冲溶液中(方格166)。在一些实施方案中，INA可以以约1分子或生物/μL至100亿分子或生物/μL的量(和/或在其中的任何范围和/或单独的值)存在于缓冲溶液中。在一些实施方案中，在一些具体的实施方案中，INA可以以约1纳摩尔至100毫摩尔(包括10-50nM)的量存在于缓冲溶液中。
INA可以作为涂层提供和/或结合至与结合冻结解冻阀的流体流动通道相连的至少一个表面(方格172)。一个或多个结合/涂布的表面可以在装置上或者在结合与流体装置流体连通的行进路径的导管或其他装置中。
冷却可以可控地进行以使冻结解冻阀中的一些或全部连续或同时(即选择性地)冻结(方格173)。类似地，加热可以可控地进行以使冻结解冻阀中的一些或全部连续或同时(即选择性地)加热。可以将冻结解冻阀中的一些或全部主动加热或被动加热。
INA可以包括或者是一种或多种INP、一种或多种冰成核(IN)核酸、一种或多种IN脂质、和/或一种或多种IN碳水化合物(方格174)。
INA可以包括或者是一种或多种合成的适配体(方格176)。
图7示出了具有集成的读取器300和用于微流体芯片10的容纳组合件250的示例性自动试验系统200。系统200可以具有带有用于冷却器25的控制输入(如，例如电压和流体输入)的支持模块200h。配线和管道W、T可以将容纳组合件250连接至模块200h的控制/流体输入。例如，电压和/或流体输入可以集成至容纳微流体芯片10的相同模块中，或者可以是单独的协同运行的子组合件或模块200h。系统200可以包括支持安装组合件250和读取器300的基部202。基部202也可以支持通常包含INA的二级试剂流体63f和/或缓冲液，以用于向流体流动通道中的流体引入，以利用冻结解冻阀22运行。
系统200可以包括控制器200c或者与控制器连通(图8)，所述控制器具有显示器210和图形用户界面(GUI)260(图9)以用于允许用户选择时间/温度输入，以控制和/或冻结解冻阀22运行或者为其编写脚本。为了使用容易，可以针对具体样品或类型或芯片尺寸和/或构造预设冻结解冻阀集合的默认操作和/或操作的可电子选择的限定菜单。显示器210可以在系统200、模块200h上，或者远离系统200和/或模块200h。
参照图8，系统控制器200c可以在系统200上或者远离系统，并且被配置成提供GUI260以用于允许用户对于设定如温度参数进行调节或者为不同FTV 22的一个或多个和/或集合编写脚本。系统控制器200c可以完全容纳在本地计算机中，部分容纳在本地计算机中和/或分布在多个数据库/服务器上(例如，基于云端的)。术语“计算机”广义地使用以包括任何电子装置，其通常包括至少一个数字信号处理器，以允许对FTV 22的控制和通讯，从而控制运行。计算机可以是本地的，或者远离具有模块200h的部位。
显示器210可以在系统200上或者远离该系统。显示器210可以包括与普适计算装置如智能电话、电子笔记本等相连的显示器。GUI 260可以通过APP(APP通常具有通过一个或多个图标访问的限定功能)提供。系统控制器200c可以控制用于一个或多个冷却器25例如TEC元件25t的一个或多个温度控制器205。温度控制器205可以是任何适合的温度控制器，如Wavelength Electronics(Bozeman，MT)PTC5K-CH 5A温度控制器，其可以由NationalInstruments数据获取/电压输出卡控制，所述卡进而可以由运行LabVIEW或其他适合的操作程序的计算机控制。每个TEC元件25t可以具有自己的PTC5K-CH控制器或集合，或者所有TEC元件可以共享一个温度控制器。在一些实施方案中，可以使用定制温度控制回路控制TEC元件25t的运行。电路128可以将一个或多个温度控制器205与一个或多个TEC元件25t连接。
图9示出了具有步骤和时间调节以及用于冻结解冻阀22(如示出的阀10-15)的用户可选择的温度调节(Ti)GUI 260的直观操作屏幕。可以在显示器210上提供芯片10的布局的图形图示。用户可以使用GUI 260调节与冻结解冻阀22相连的各个冷却器25的设定和持续时间。
图10示出了用于容纳微流体芯片10从而TEC部件/元件25t具有与导热块的适当热接触或与TEC部件25t的直接接触的安装组合件250。安装组合件250可以包括顶部或底部基板10t、10b，分别邻接在一侧上的芯片10和在另一侧上的TEC 25t的多个导热部件26，如金属(例如，铜或其他适合的导热材料)垫片。在一些实施方案中，可以将导热材料和/或块26附连至基板10t和/或10b，然后放置到与TEC部件25t热连通的安装组合件250中。如在图10中所示，可以将TEC部件25t放置在与微流体芯片10上的阀位置对齐的容纳基板(例如，平板)251b上。
可以至少在冻结解冻阀22(未示出)的区域中，将箔或导热涂层涂覆的基板10b、10t上。
TEC部件25t和安装装置可以被配置成允许容易更换并且模块化设计可以促进将来设计的变化。
如在图10中所示，安装组合件250可以包括可以具有在窗口251w周围延伸的周长的刚性顶板251t。图8还示出了，系统200可以包括具有回路和/或可以获得针对在输送通道20中的分析物的分析数据的至少一个处理器200p的计算机200c。术语“计算机”广义地使用以包括任何电子装置，其通常包括至少一个数字信号处理器，从而控制运行。计算机可以是本地的，或者远离具有装置10的部位。
读取器300可以包括能够获取在输送通道20和/或阵列40中的分析物分子的一系列图像的检测器和激发源。用于系统200的读取器300可以包括激发光源(通常用于生成激发荧光标记分子的光)(其可以任选包括镜子和透镜或其他物镜)和图像生成装置或检测器，如相机、光电倍增管或光电二极管中的一种或多种。在使用时，物镜/透镜可以位于装置10的主表面以下或以上。电输入口/输出口和流动操作可以位于装置10的对侧上。也可以将装置10翻转以在其侧面上运行(平坦的主表面竖直或成一定角度)而不是如示出的基本水平的。
在以下非限制性实施例中更详细地解释了本发明。
使用冰成核蛋白减少阀动作时间和在低温下的可变性
使用适用于免疫测定的封闭缓冲液(50mM Tris+10％新生小牛血清+0.1％Tween-20+0.05％叠氮化钠，pH＝7.4)供应2mm厚的塑料微流体芯片，其含有由两个各自具有大约1mm的厚度的基板组成的具有250μm宽度和250μm深度的通道。将芯片放置在TEC顶部，从而将其通道放置TEC元件之上(图1A/1B)的需要阀门调节的位置。通过将TEC分别设定为-45℃和+25℃，在芯片上进行通道内含物的冻结和解冻。应该指出的是，在通道的FTV区域看到的实际温度明显高于-45℃，因为可以对经由塑料的热损失建模以显示出大约-32℃的所得稳态温度。根据通道的明视场显微监测对每个冻结和解冻事件计时，并且时间在TEC从25℃冷却或芯片从-45℃升温启动时开始(即时间包括TEC将其本身和芯片冷却或加热所需的时间)。将冰的快速出现作为每个冻结事件的终点，而将其消失作为每个解冻事件的终点。之后在Tris缓冲液中制备INP提取物的十倍稀释液(1∶10、1∶100、1∶1,000、1∶10,000)，并且利用这些样品中的每一个进行相同的时间实验。无INP Tris缓冲液需要37s的平均时间，并且标准偏差为2.0s(估算的通道温度≈-32℃)。INP提取物的加入明显影响冻结时间和再现性，并且在所测试的全部四个INP浓度中未观察到浓度依赖性作用，同时在所有情况中在大约18-20s内发生冻结，并且标准偏差为大约1s。
使用来自在TEC顶部具有单个1mm厚的塑料基板的IR相机的温度测量，在冻结时，估算内部温度≈-22℃。为每个样品进行十个冻结/解冻试验，并且这些数据在图11中示出。
解冻时间完全不受INP浓度影响，在所有情况中均为大约20-22s，包括针对无INP缓冲液的情况(如在图12中所示)。
图11示出了在Tris封闭缓冲液中INP提取物稀释对冻结时间的影响。与无INP对照相比，所有四个INP提取物稀释液在-45℃在不具有浓度依赖性作用的情况下大约快两倍。在-20℃下，无INP缓冲液在五个30min试验期间不冻结。所需的冻结时间和标准偏差(绝对值和百分数相对值二者)在该温度下作为INP浓度的函数而减少。在-20℃(*)下的1∶10,000INP缓冲液在十五个3min试验中仅冻结十次。对于-45℃试验来说N＝10，并且对于-20℃试验来说N＝15。误差柱表示在每个方向上的一个标准偏差。
图12示出了在Tris缓冲液中五种不同INP浓度的解冻时间。初始温度是指用于将通道冻结的温度，同时将通道设定为直接从该温度解冻。对于在任何一个温度下解冻来说，浓度依赖性作用均不明显。在-20℃下解冻时间不适用于无INP缓冲液，因为其在该温度下不冻结。对于-45℃试验来说N＝10，并且对于-20℃试验来说N＝15。误差柱表示在每个方向上的一个标准偏差。
使用冰成核蛋白降低对较温暖的阀门调节温度的温度要求
以针对低温试验描述的相同的方式再次测试用于低温自由解冻阀门调节的系统和INP提取物稀释液，不同之处在于所使用的冻结温度是-20℃(在通道内部估算的稳态温度为-11℃)。进行十五个试验，并且数据在图11中示出。在五个具有设定在-20℃的TEC的30min试验期间未观察到无INP封闭缓冲液冻结。所有含INP样品在该温度下冻结，伴有浓度依赖性作用。与在-45℃下相比，1∶10和1∶100INP提取物稀释液花费更长时间冻结，并且平均冻结时间分别为33s±2.0s和36s±2.0s(在两种情况中估算的通道温度为-11℃)。1∶1,000INP提取物稀释液在-45℃下展现出与Tris缓冲液的行为类似的行为，以及类似的冻结时间(平均44s)和大的标准偏差(6.5s)。经过十五个3min试验，1∶10,000INP提取物稀释液冻结十次，具有91s的平均值，具有45s的极大的标准偏差；其最短的冻结时间是41s并且最长是174s。对于在-45℃下的试验来说，解冻时间不受INP浓度影响。所有试验在-20℃下在大约15s内解冻，具有少于1s的标准偏差。这些数据在图12中示出。
使用冰成核蛋白减少在薄芯片中的动作时间
使用与在以上试验中使用的芯片(标准芯片)相同的较薄的芯片进行最后一组实验，不同之处在于底部基板厚度是0.5mm而不是1mm。在-45℃和-20℃TEC温度下使用具有和不具有INP的Tris缓冲液再次测试冻结时间。在这些实验中仅测试INP提取物的1∶100稀释液。将基板厚度等分的效果明显。在-45℃下，在具有和不具有INP的情况下，冻结时间分别为13s±0.48s和22s±0.92s，而对于标准芯片来说在那些条件下为19s±1.1s和37s±2.0s。在-20℃下，在具有INP的情况下，冻结需要18s±0.74s，这大约与在标准芯片中在-45℃下在具有INP的情况下相同。对于标准芯片来说，在-20℃下，在指定时间内，在不具有INP的情况下未观察到冻结。这些数据和与相关标准芯片数据的比较在图13中示出。
图13示出了在具有和不具有INP的情况下在标准(1mm基板)和较薄芯片(0.5mm基板)之间的冻结时间的比较。对于每个冻结温度和缓冲条件来说，与标准芯片相比，冻结基本上在薄芯片中更快地进行，例外是在-20℃下不具有INP的情况下，其中没有芯片内含物在指定时间内冻结。最快的观察到的冻结时间在具有INP的在-45℃下的较薄芯片中出现(～13s，相对于标准芯片的～19s)。最大的性能差异在-20℃下出现，此时薄芯片冻结得大约快至标准芯片的两倍(～18s相对于～36s)。对于具有INP的薄芯片来说，从-45℃到-20℃的温度增加仅使所需的冻结时间增加～5s，而对于标准芯片来说，其使所需的冻结时间增加～18s，有效地使其加倍。对于所有薄芯片试验来说，N＝10。误差柱表示在每个方向上的一个标准偏差。
前述是说明本发明而不应被解释为对其进行限制。尽管已经描述了本发明的一些示例性实施方案，本领域技术人员将会容易理解的是，这些本质上不背离本发明的新的教导和优点的情况下，在示例性的实施方案中许多修改是可行的。因此，所有这样的修改均意图包括在如在权利要求中所限定的本发明的范围内。本发明由以下权利要求以及包括在其中的权利要求的等同物限定。

Claims (48)

1.一种流体分析装置，所述流体分析装置包括：
至少一个流体通道，所述流体通道包括至少一个冻结解冻阀和至少一种冰成核剂(INA)，其中所述至少一种INA是含碳INA并且包含具有为冰形成供核的能力的结构，其中所述结构是与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构。
2.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。
3.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一种INA提取或来源自生物。
4.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。
5.权利要求4所述的流体分析装置，其中所述INP和/或所述其功能片段通过选自由下列各项组成的组的基因编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，并且其中所述基因发现于或获得自选自由下列各项组成的组的生物中：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、南极假单胞菌(Ps.antarctica)、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Ps.putida)、绿黄假单胞菌(Ps.viridiflava)、成团泛菌(Pa.agglomerans)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、和/或北方假单胞菌(Ps.borealis)。
6.权利要求1所述的流体分析装置，所述流体分析装置还包括第一和第二基板，所述第一和第二基板附连在一起以将微流体芯片限定为具有所述至少一个流体通道的所述流体分析装置，并且将沿着所述至少一个流体通道的多个隔开的冻结解冻阀限定为所述至少一个冻结解冻阀。
7.权利要求1所述的流体分析装置，所述流体分析装置与包含所述至少一种INA的液体缓冲液流体连通，其中将所述至少一种INA可流动地引入至在所述流体分析装置上的流体口中。
8.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一个冻结解冻阀是多个隔开的冻结解冻阀，每个冻结解冻阀包括与所述至少一个流体通道的限定区域热连通的热电冷却器，并且其中所述至少一个流体通道至少具有尺寸设置为微流体或纳米流体通道的区段。
9.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一个流体通道包括主输送通道和至少一个试剂通道，并且其中所述流体分析装置包括全部与所述主输送通道流体连通的样品输入口、缓冲液输入口和珠孔阵列，并且所述至少一个冻结解冻阀包括与所述主输送通道和/或至少一个试剂通道流体连通的多个隔开的冻结解冻阀。
10.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一个流体通道包括至少一个具有结合和/或涂布至其表面的所述至少一种INA的流体通道。
11.权利要求9所述的流体分析装置，所述流体分析装置还包括珠储存/样品温育室、废料储蓄器和样品计量环路，所述样品计量环路位于所述珠储存/样品温育室和所述样品输入口之间，其中所述样品计量环路具有约1μL至约1mL之间的体积容量并且与在所述样品计量环路的各个端部上的第一和第二冻结解冻阀流体连通。
12.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述结构具有在水和/或溶液中在比不存在所述至少一种INA的情况下水和/或所述溶液冻结温度和/或时间平均更高的温度下和/或更少的时间内为冰形成供核的能力。
13.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述结构具有在低于0℃和高于-20℃的温度为冰形成供核的能力。
14.权利要求1所述的流体分析装置，其中所述至少一种INA在液体缓冲液中以1个分子/μL至100亿个分子/μL的量和/或约1nM至约1mM的浓度存在。
15.一种分析靶标分析物的方法，所述方法包括：
提供具有与至少一个冻结解冻阀流体连通的至少一个流体通道的流体分析装置；
将至少一种冰成核剂(INA)引入至所述至少一个流体通道中，其中所述至少一种INA含有碳原子并且包含具有为冰形成供核的能力的结构，其中所述结构是与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构；以及
将所述至少一个冻结解冻阀选择性电子冷却以使用所述至少一种INA将所述至少一个冻结解冻阀冻结。
16.权利要求15所述的方法，其中所述至少一个冻结解冻阀是多个隔开的冻结解冻阀，并且其中所述方法包括将与所述至少一个流体通道热连通的冷却器设定为在-100摄氏度和-1摄氏度之间的温度以将所述冻结解冻阀冻结。
17.权利要求15所述的方法，其中所述流体装置是具有在0.1mm至10mm之间的厚度的流体微芯片，其中所述至少一个冻结解冻阀是多个隔开的冻结解冻阀，并且其中所述冻结解冻阀中的至少一些具有热电冷却器，将所述热电冷却器设定为在约-100摄氏度和约-1摄氏度之间以用于在三分钟以内进行的冻结操作，并且其中针对各个样品多次进行选择性电子冷却。
18.权利要求15所述的方法，其中所述装置是流体微芯片，并且其中所述分析物是有机分子或无机化合物。
19.权利要求15所述的方法，其中所述装置是流体微芯片，并且其中所述分析物是药物。
20.权利要求15所述的方法，其中所述装置是流体微芯片，并且其中所述分析物是DNA、RNA、肽、蛋白或聚糖。
21.权利要求15所述的方法，其中所述装置是流体微芯片，并且其中所述分析物是生物或合成大分子。
22.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。
23.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA提取或来源自生物。
24.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。
25.权利要求24所述的方法，其中所述INP和/或所述其功能片段通过选自由下列各项组成的组的基因编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，并且其中所述基因发现于或获得自选自由下列各项组成的组的生物中：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、南极假单胞菌(Ps.antarctica)、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Ps.putida)、绿黄假单胞菌(Ps.viridiflava)、成团泛菌(Pa.agglomerans)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、和/或北方假单胞菌(Ps.borealis)。
26.权利要求15所述的方法，其中在液体中将所述至少一种INA可流动地引入至所述至少一个流体通道中。
27.权利要求26所述的方法，其中所述液体是缓冲液，并且其中所述至少一种INA在所述缓冲液中稀释。
28.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA从包含所述至少一种INA的涂层的表面引入，和/或所述至少一种INA吸附和/或化学结合至所述至少一个流体流动通道的表面。
29.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA固定在固体载体上或偶联至固体载体。
30.权利要求15所述的方法，其中所述结构具有在水和/或溶液中在比不存在所述至少一种INA的情况下水和/或所述溶液冻结温度和/或时间平均更高的温度下和/或更少的时间内为冰形成供核的能力。
31.权利要求15所述的方法，其中所述结构具有在低于0℃和高于-20℃的温度为冰形成供核的能力。
32.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种INA在液体缓冲液中以1个分子/μL至100亿个分子/μL的量和/或约1nM至约1mM的浓度存在。
33.一种包含至少一种冰成核剂(INA)的用于DNA加工的液体缓冲液，其中所述至少一种INA含有碳原子，并且其中所述至少一种INA以在1个分子/μL至100亿个分子/μL之间的量和/或以约1nM至约1mM的浓度存在于所述液体缓冲液中。
34.权利要求33所述的液体缓冲液，其中所述至少一种INA提取或来源自生物。
35.权利要求33所述的液体缓冲液，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。
36.权利要求35所述的液体缓冲液，其中所述INP和/或所述其功能片段通过选自由下列各项组成的组的基因编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，并且其中所述基因发现于或获得自选自由下列各项组成的组的生物中：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
37.权利要求33所述的液体缓冲液，其中所述至少一种INA包括一种或多种适配体。
38.权利要求33所述的液体缓冲液，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。
39.权利要求33-38中任一项所述的液体缓冲液，其中所述至少一种INA包含与冰相似的结构和/或将水分子排列为冰状晶格的结构。
40.一种制备样品的方法，所述方法包括：
提供包括样品计量环路和至少一个流体通道的流体分析装置，其中所述样品计量环路和所述至少一个流体通道与至少一个冻结解冻阀流体连通；
将样品引入至所述样品计量环路中，其中所述样品包含至少一种含有碳原子的冰成核剂(INA)；和
使用所述至少一个冻结解冻阀将所述样品计量环路选择性电子冷却以将所述至少一个冻结解冻阀和在所述样品计量环路中的所述样品的至少一部分冻结。
41.权利要求40所述的方法，其中所述至少一个流体通道包括主输送通道和至少一个试剂通道，并且其中所述流体分析装置包括全部与所述主输送通道流体连通的样品输入口、缓冲液输入口和珠孔阵列，并且其中所述至少一个冻结解冻阀是与所述主输送通道和/或至少一个试剂通道流体连通的多个隔开的冻结解冻阀。
42.权利要求40所述的方法，其中所述流体分析装置还包括珠储存/样品温育室和废料储蓄器，其中所述样品计量环路位于所述珠储存/样品温育室和所述样品输入口之间。
43.权利要求40所述的方法，其中所述样品计量环路具有约1μL至约1mL之间的体积容量并且与在所述样品计量环路的各个端部上的第一和第二冻结解冻阀流体连通。
44.权利要求40所述的方法，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白和/或其功能片段、冰成核核酸、冰成核脂质、和/或冰成核碳水化合物。
45.权利要求40所述的方法，其中所述至少一种INA提取或来源自生物。
46.权利要求40所述的方法，其中所述至少一种INA包括冰成核蛋白(INP)和/或其功能片段。
47.权利要求46所述的方法，其中所述INP和/或所述其功能片段通过选自由下列各项组成的组的基因编码：iceE、iceH、inaA、inaE、inaF、inaK、inaPb、inaQ、inaU、inaV、inaW、inaX、和inaZ，并且其中所述基因发现于或获得自选自由下列各项组成的组的生物中：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)KUIN-1、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、南极假单胞菌(Ps.antarctica)、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Ps.putida)、绿黄假单胞菌(Ps.viridiflava)、成团泛菌(Pa.agglomerans)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、和/或北方假单胞菌(Ps.borealis)。
48.权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述样品包含多个细胞，并且其中使用所述至少一个冻结解冻阀将所述样品计量环路选择性电子冷却以将所述至少一个冻结解冻阀和在所述样品计量环路中的所述样品的至少一部分冻结将所述多个细胞中的至少一部分溶解。
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