JP2009192348A - 生体サンプル分析用プレートの液体定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】定量されたサンプル液が電気泳動する前の検出流路中に流れ込むことなくサンプル液の各成分を電気泳動分離できる生体サンプル分析用プレートの液体定量方法を提供する。
【解決手段】サンプル液を定量するための定量部と、定量部に接続されたサンプル液を電気泳動させるための検出流路とからなる生体サンプル分析用プレートの液体定量方法において、検出流路に緩衝液を充填する際の緩衝液の粘度が１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満であることにより、サンプル液が検出流路中に流れ込むことを防ぎ、サンプル液の各成分を電気泳動分離することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡやタンパク質などの生体サンプルを分析する生体サンプル分析用プレートの液体の定量方法に関するものである。

近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、セ
ンサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈiｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野などでその応用が期待されている（例えば、特許文献１参照。）。

従来のバイオチップの中には、プレートを回転させることで生じる遠心力を用いてサンプル液を移送し、生体サンプルの分析を行うものもある。図５は従来の生体サンプル分析用プレート１０１であり、この生体サンプル分析用プレートには、図６の流路パターン１０２が８つ形成されている。この流路パターン１０２を利用し、遠心力を用いて液体を定量する方法について説明する。

流路パターン１０２には、プレートの回転中心に対して内周側に設けたサンプル液を注入するサンプル注入部１０９と外周側に設けたバッファ部１１７が流路１１６により連結されており、プレートを回転させることによりサンプル注入口１０８からサンプル注入部１０９へ注入されたサンプル液は流路１１６を通りバッファ部１１７に移動する。さらに、バッファ１１７部よりも外周側に設けられたサンプル保持部１２１とバッファ部１１７が流路１１８、流路１１９により連結されており、バッファ部１１７に移動したサンプル液はサンプル保持部１２１に達する。ここで、サンプル保持部１２１の流路１１９と連結される開口部１２３はサンプル保持部１２１の外周方向の壁面に形成されているため、サンプル保持部１２１内に予め保有している空気は遠心力により移動してきたサンプル液によって圧縮保持された状態になる。また、サンプル液がサンプル保持部１２１に保持されるのと同時に、緩衝液注入口１０６に注入されている緩衝液は、プレートの回転により緩衝液注入部１０７の外周側に接続された正電極部１１２、負電極部１１３へと移動し、さらに外周側に接続された流路１１４、検出流路１１５へ移動し、サンプル定量部１２２にまで達する。ここで、緩衝液はサンプル定量部１２２の底部まで移動するように、緩衝液の注入量は予め設定されている。

次に、プレートの回転を急停止することでサンプル保持部１２１内の圧縮された空気は一気に開放され、サンプル保持部１２１内のサンプル液は流路１１９を内周側に逆流していく。ここで、流路１１９には流路１２０が連結されており、サンプル保持部１２１は流路１１９、流路１２０を介してバッファ部１１７よりも内周側に設けられたチャンバー部１２４に連結されており、連結部とチャンバー部１２４の間にはサンプル定量部１２２が設けられている。このため、プレートの回転を急停止することで、内周方向へ逆流したサンプル液は流路１１９を通りチャンバー部１２４まで達し、流路１２５とサンプル定量部１２２にサンプル液が充填された状態になる。次に、再度プレートを回転させることにより流路１２５に充填されたサンプル液はサンプル定量部１２２内に充填されたサンプル液を残し外周側へ移動し、バッファ部１１７及びサンプル保持部１２１へ移動する。これにより一定量のサンプル液をサンプル定量部１２２に定量することが出来る（例えば、特許文献２参照。）。
特開２００４−２８５８９号公報 国際公開第２００６／０６２１４９号パンフレット

しかしながら、前記従来の構成では、サンプル液をサンプル定量部１２２に送る際のサンプル液の移動速度が大きいため、図７に示すように黒色部分で示すサンプル液が、予め充填された検出流路１１４中の斜線部分で示す緩衝液へと押し込まれる。その結果、サンプル液が検出流路１１４中に流れ込むため、サンプル定量以上のサンプルを電気泳動させることになる。そのため、サンプル液の各成分を電気泳動分離できないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、定量されたサンプル液が電気泳動する前の検出流路中に流れ込むことなくサンプル液の各成分を電気泳動分離できる生体サンプル分析用プレートの液体定量方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法は、
サンプル液を定量するための定量部と、
前記定量部に接続されたサンプル液を電気泳動させるための検出流路とからなる生体サンプル分析用プレートの液体定量方法において、
前記検出流路に緩衝液を充填する際に前記緩衝液の粘度が１９０ｃＰ以上４００ｃＰ以下であることを特徴としたものである。

本発明の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法によれば、サンプル液が検出流路中に流れ込むことを防ぎ、サンプル液の各成分を電気泳動分離することができる。

以下に、本発明の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１から図７を用いて、本実施の形態１における生体サンプル分析用プレート及びそれを用いた生体サンプル分析方法について説明する。本発明は、生体サンプルを緩衝液中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。

なお、本実施の形態１では、説明を具体的にするために、サンプル液がホルムアミド９０％／Ｈ₂Ｏ１０％を溶媒とする２本鎖ＤＮＡで、緩衝液が分離用ＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル分析用プレートが、流路中に充填させた緩衝液である分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量された前記ＤＮＡサンプルを添加して電気泳動を行い、該流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出して、該ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。

本発明で使用する生体サンプル分析用プレートは、背景技術で説明した生体サンプル分析用プレートを使用する。図５を用いて、生体サンプル分析用プレートを詳述する。本プレート１０１は回転するための軸心１０５を中心にプレートを回転系に固定するための中心孔１０３が設けられている。チャンバーと流路で形成された流路パターン１０２が中心孔１０３の周囲に８個放射状に形成されている。本実施例では、流路の幅は５０から３００μｍ、深さ５０〜１００μｍで形成されている。本プレートの厚みは２ｍｍで、外形は８センチ四方の正方形であり、４角のうち３角はＲが設けられ、残りの１角は面取りされている。更に、位置決め孔１０４が設けられており、外形を非対称にして流路パターンの位置を特定できるようにしている。また、本プレートの材料はポリオレフィン系の樹脂を使用しており、流路形成面にプレートと同材料のフィルムを接着することで密閉流路を形成している。

次に、ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を説明する。

まず、サンプル液となるＤＮＡサンプルを準備する。本来ＤＮＡは２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。抽出方法や１本鎖化については公知の技術を用いるので、詳細は割愛する。

次に、緩衝液として増粘剤を含むＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５'末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５'末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。

増粘剤とは、緩衝液の粘度を調節可能であり、ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートとの相互作用を阻害しないものであればいずれでも良く、具体的には水溶性高分子のリニアポリマーであるポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。本実施の形態における増粘剤はポリエチレングリコールとする。緩衝液の粘度は、増粘剤を用いて１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満に調製する。以降に記述する「緩衝液」とは、ＤＮＡコンジュゲートと、高分子ポリマーと、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤およびＭｇＣｌ₂などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。

試料の準備が終わったところで、緩衝液であるＤＮＡコンジュゲートおよびサンプル液であるＤＮＡサンプルをプレート１０１内へ注入する。以下、流路パターン１０２の拡大図である図６を用いて説明する。緩衝液はピペッター等により定量を行い緩衝液注入口１０６から緩衝液注入部１０７へ分注する。サンプル液も同様に定量を行いサンプル注入口１０８よりサンプル注入部１０９へ分注する。分注量としては、流路パターンのスケールにより異なるが本実施の形態１においては、緩衝液は１８μＬ、サンプル液は２μＬとする。

次に、プレート１０１をモータ等に固定して、軸心１０５を軸に回転を行う。この時分注された緩衝液とサンプル液は、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝液注入部１０７内の緩衝液は流路１１０と流路１１１を通り正電極部１１２と負電極部１１３へ等分され、正電極部１１２へ移動した緩衝液はさらに流路１１５を通りサンプル定量部１２２まで移動する。負電極部１１３へ移動した緩衝液も同様に検出流路１１４を通りサンプル定量部１２２まで移動する。

図１は回転開始から２分後、緩衝液の移動が停止した状態を示す図である。斜線で示す部分が緩衝液あり、緩衝液は、正電極部１１２および負電極部１１３の６割程度まで充填されており、流路１１４、検出流路１１５を満たしており、正電極部１１２と負電極部１１３内に存在する緩衝液の液面高さとサンプル定量部１２２の液面高さは、プレートの軸心を中心とする同一円周上となる。

また、図２はサンプル定量部１２２周辺を拡大した図である。緩衝液は流路１１４、検出流路１１５に充填され、サンプル定量部１２２において合流し、サンプル定量部１２２は緩衝液と空気の２層に分かれた状態になっている。

次に、サンプル液の移動について説明する。サンプル注入部１０９内のサンプル液はプレートを回転させることで発生した遠心力により流路１１６を通りバッファ部１１７へ流入する。さらに、バッファ部１１７は流路１１８、流路１１９によりサンプル保持部１２１と接続されており、サンプル保持部１２１よりも内周方向に設けられているため、バッファ部１１７へ流れ込んだサンプル液は流路１１８と流路１１９を通りサンプル保持部まで移動する。

しかしながら、図６に示すように、流路１１９のサンプル保持部１２１と連結される開口部１２３はサンプル保持部１２１の外周方向の壁面に接続されており、かつ、サンプル保持部には空気抜けが可能となる空気孔も空気抜け流路も存在しない。そのため、サンプル保持部１２１内に予め保有している空気は遠心力により移動してきたサンプル液により圧縮された状態になる。ここで、サンプル液は流路１１８と流路１１９の連結部に連結された流路１２０にも流入することになるが、流路１２０はバッファ部１１７よりも内周方向までのびているため、プレート回転中バッファ部１１７内のサンプル液の液面と流路１２０内の液面は軸心１０５を中心とする同一円周上となるため、回転中にサンプルがサンプル定量部１２２に注入されることはない。

図３（Ａ）はプレート回転後サンプル液の移動が停止した状態を示す図である。サンプル液はバッファ部の５割程度まで充填されており、流路１１８と流路１１９を満たし、サンプル保持部１２１の２割程度まで充填されている。また、流路１２０にも充填されており、流路１２０内のサンプル液の液面高さとバッファ部１１７内のサンプル液の液面高さはプレートの軸心１０５を中心とする同一円周上となっている。サンプル保持部１２１内の空気は圧縮された状態になっており、プレート回転中のみ図３（Ａ）に示すように遠心力と加圧力とが平衡となった状態を維持する。

次に、プレートを一定時間回転させサンプル液と緩衝液の移動が停止した状態で、プレートの回転を急停止させる。例えば、４０００ｒｐｍより２秒で停止まで至らしめる。プレートの回転を急停止することにより、サンプル液にかかっていた遠心力がなくなるため、サンプル保持部１２１内で圧縮されていた空気は一気に開放され、サンプル液はサンプル保持部１２１から流路１１９へ逆流しようとする。さらに、サンプル液はサンプル保持部１２１内の空気が大気圧となるまで流路１１９を移動しようとし、流路１１９、流路１２０を通りサンプル定量部１２２まで達する。

図３（Ｂ）はプレートの回転を急停止させた直後の状態を示す図である。サンプル液は流路１１９、流路１２０を満たし、サンプル定量部１２２、流路１２５、チャンバー部１２４に注入された状態になっている。

次に、プレートをもう１度数秒間回転させた後、緩やかに減速し停止させる（例えば３６００ｒｐｍで３秒間回転後、６０秒で停止まで至らしめる。）。流路１２５に満たされたサンプル液はプレートを回転することによって生じる遠心力により外周方向へ移動し、サンプル液は定量部１２２を流れ、サンプル保持部１２１へと流れていく。

図３（Ｃ）はプレートの回転を停止した後の状態を示す図である。サンプル液は、定量部１２２、流路１１９に満たされており、定量部１２２においてサンプル液の定量ができた。また、定量したサンプル液はサンプル定量部１２２において流路１１４、検出流路１１５から充填された緩衝液と接している。

このとき、サンプル定量部では緩衝液の粘度によってサンプル液が緩衝液中に押し込まれる現象が生じる。すなわち、図３（Ａ）のプレート回転中の状態からプレートの回転を急停止させて、サンプル定量部へ移動させるサンプル液の移動速度は大きい。そのため、予め充填された緩衝液の粘度が低いと、サンプル液が検出流路１１４の斜線部分で示す緩衝液へと押し込まれる場合がある。緩衝液の粘度とサンプル液が緩衝液中に押し込まれるサンプル押し込み量との関係を測定したものが図４に示すグラフである。緩衝液の粘度が１９０ｃＰ未満であると、サンプル液がサンプル定量部１２２に流れ込む際、サンプル液の移動速度が大きいために、図７に示すようにサンプル液が予め充填された検出流路１１４中の緩衝液へと押し込まれる。その結果、サンプル液が流路１１４中に流れ込むため、サンプル定量以上のサンプルを電気泳動させることになり、サンプル液の各成分を電気泳動分離できなくなる。

緩衝液の粘度が４００ｃＰ以上であると、粘度が高いためにピペットで緩衝液を定量的に採取したり、注入したりするのが困難であるため、緩衝液の分注量がばらつく。そのため、サンプル定量部における緩衝液の液面高さがばらつくので、サンプル定量部１２２におけるサンプル液の定量にばらつきが生じてしまう。以上から、緩衝液の粘度は１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満が好ましい。

また、流路１２０内に充填されたＤＮＡサンプルは外周方向へ移動している。ここで、流路１２０内に残っているＤＮＡサンプルは遠心力によりサンプル保持部１２１に戻されるため、再びサンプル保持部１２１内の空気が圧縮されることになるが、プレートの回転の減速を緩やかにすることによりサンプル保持部１２１内のＤＮＡサンプルが再度流路１２０を逆流することはない。

以上により、サンプル定量部１２２に一定量のサンプル液を残留させることができ、サンプル定量部１２２のサンプル液が最終的な分析対象試料となる。

次に、電気泳動を行う。電気泳動は正電極部１１２に正電極、負電極部１１３に負電極を、プレート１０１の外部からフィルムを突き破って挿入して、緩衝液と接触させる。そして数百Ｖの電圧を印加する。すると、サンプル定量部１２２から検出流路１１５への方向にＤＮＡが移動する電界が発生し、サンプル定量部１２２に一定量残存したサンプル液中のＤＮＡサンプルは検出流路１１５中を正電極側（図３（Ｃ）中Ａ方向）へ移動する。

検出流路１１５中には緩衝液である分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプルは分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにＤＮＡサンプル中の正常型ＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと変異型のＤＮＡが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別が行える。

ＤＮＡの検出は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を修飾したＤＮＡを４７０ｎｍの光で励起し、５２０ｎｍ付近の光検出によって行った。ＤＮＡの検出は、２６０ｎｍの吸光度によって行ってもよい。また、検出流路１１５を電気泳動するＤＮＡを、プレート１０１を回転させながら走査して光検出することもできる。

以上のように、本実施の形態１においては、検出流路に緩衝液を充填する際に前記緩衝液の粘度を１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満にすることにより、サンプル液が検出流路中に流れ込むことを防ぎ、サンプル液の各成分を電気泳動分離することができる。

また、本実施の形態１では、生体サンプル分析用プレートを疎水性の材料としたことにより、毛細管現象によるサンプル液の好ましくない移動現象を防ぎ、本実施の形態に記載した遠心力によるサンプル液、緩衝液の移動を達成することができる。

さらに、本実施の形態１では、検出流路を幅５０〜２００μｍ、深さ５０〜１００μｍとしたことにより、上述した緩衝液の粘度範囲においてサンプル液の緩衝液への流れ込みを防ぎ、サンプル液の各成分を電気泳動分離することができる。

さらに、本実施の形態１では、増粘剤としてポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコールを用いることにより、緩衝液に含まれる増粘剤の濃度を調整することで、１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満の粘度の緩衝液を容易に作製することが出来る。

本発明の生体サンプル分析用プレートは、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの電気泳動分析を、正確、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。

本発明の実施の形態１における試料充填処理を施した時の緩衝液の状態を示す図 本発明の実施の形態１における試料充填処理を施した時のサンプル定量部付近の状態を示す図 （Ａ）本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートに緩衝液とサンプル液を充填し、４０００ｒｐｍにて回転中の各試料の状態を示す図（Ｂ）本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートに緩衝液とサンプル液を充填し、４０００ｒｐｍにて回転停止後、２秒で停止まで至らしめた時の各試料の状態を示す図（Ｃ）本発明の実施の形態１における生体サンプル分析用プレートに緩衝液とサンプル液を充填し、３６００ｒｐｍにて３秒間再回転して減速し停止させた時の各試料の状態を示す図 本発明の実施の形態１における試料充填処理を施した時の、緩衝液粘度とサンプル押し込み量との関係を示す図 従来の発明における生体サンプル分析用プレートの流路形成面を示す図 従来の発明における生体サンプル分析用プレートに形成される流路パターンを示す図 従来の発明における生体サンプル分析用プレートを用いて試料充填処理を施した時のサンプル定量部付近の状態を示す図

符号の説明

１０１ 生体サンプル分析用プレート
１０２ 流路パターン
１０３ 中心孔
１０４ 位置決め孔
１０５ 軸心
１０６ 緩衝剤注入口
１０７ 緩衝剤注入部
１０８ サンプル注入口
１０９ サンプル注入部
１１０ 流路
１１１ 流路
１１２ 正電極部
１１３ 負電極部
１１４ 流路
１１５ 検出流路
１１６ 流路
１１７ バッファ部
１１８ 流路
１１９ 流路
１２０ 流路
１２１ サンプル保持部
１２２ サンプル定量部
１２３ 開口部
１２４ チャンバー部
１２５ 流路
１２６ 流路
１２７ 流路

Claims (5)

1. サンプル液を定量するための定量部と、
   前記定量部に接続されたサンプル液を電気泳動させるための検出流路とからなる生体サンプル分析用プレートの液体定量方法において、
   前記検出流路に緩衝液を充填する際に前記緩衝液の粘度が１９０ｃＰ以上４００ｃＰ未満である生体サンプル分析用プレートの液体定量方法。
2. 前記生体サンプル分析用プレートは疎水性の材料である、請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法。
3. 前記検出流路は、幅５０〜２００μｍ、深さ５０〜１００μｍである、請求項１又は請求項２に記載の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法。
4. 前記緩衝液の粘度は、増粘剤により調製する請求項１に記載の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法。
5. 前記増粘剤は、ポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコールである請求項４に記載の生体サンプル分析用プレートの液体定量方法。

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