JP3977314B2 - マイクロチップ - Google Patents

Description

本発明は透明基板内にマイクロチャネルと呼ばれる微細流路やポートなどの極微細構造を有するマイクロチップに関する。更に詳細には、本発明は単一のチャネルでＤＮＡサンプルのゲル電気泳動分析を可能にする構造を有するマイクロチップに関する。

最近、マイクロスケール・トータル・アナリシス・システムズ（μＴＡＳ）又はラブ・オン・チップ(Lab-on-Chip)などの名称で知られるように、基板内に所定の形状の流路を構成するマイクロチャネル及びポートなどの微細構造を設け、該微細構造内で物質の化学反応、合成、精製、抽出、生成及び／又は分析など各種の操作を行うことが提案され、一部実用化されている。このような目的のために製作された、基板内にマイクロチャネル及びポートなどの微細構造を有する構造物は総称して「マイクロチップ」と呼ばれる。

マイクロチップは遺伝子解析、臨床診断、薬物スクリーニング及び環境モニタリングなどの幅広い用途に使用できる。常用サイズの同種の装置に比べて、マイクロチップは(1)サンプル及び試薬の使用量が著しく少ない、(2)分析時間が短い、(3)感度が高い、(4)現場に携帯し、その場で分析できる、及び(5)使い捨てできるなどの利点を有する。マイクロチップの材質や構造及び製造方法は例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１などに提案されている。

極微量のＤＮＡサンプルの塩基配列を決定する方法として、ゲル電気泳動法が広く実施されている。この方法では、ＤＮＡサンプルを電気泳動用ゲルの泳動レーン溝に注入し、電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ鎖状の重合体高分子のため、ゲル中を分子量に反比例した速度で移動する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほど早く、長い（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくりと移動するので、分子量によりＤＮＡを分画できる。最近は、マイクロチップを用いてゲル電気泳動を実施することが行われるようになってきた。このようなマイクロチップにより電気泳動を行う方法は特許文献３及び特許文献４などに記載されている。

従来のＤＮＡ電気泳動用マイクロチップは、図１１に示されるように、ガラス又は合成樹脂（例えば、ポリジメチルシロキサン又はアクリル樹脂）などの透明基板１００に分離用チャネル１０２と、この分離用チャネル１０２と直交する導入用チャネル１０４を有する。このマイクロチップは、分離用チャネル１０２と導入用チャネル１０４が交差していることから、別名、クロスインジェクション方式チップとも呼ばれている。分離用チャネル１０２の両端にはグランド側泳動媒体用ウエル１０６と高電圧側泳動媒体用ウエル１０８が配設されている。また、導入用チャネル１０４の一方の端部にはグランド側のＤＮＡサンプル用ウエル１１０と高電圧側泳動媒体用ウエル１１２が配設されている。

図１２は図１１におけるＸＩＩ−ＸＩＩ線に沿った断面図である。図示されているように、透明基板１００を貫通するように泳動媒体用ウエル１０６及び１０８が設けられ、この基板１００の下面側に、泳動媒体用ウエル１０６及び１０８に連通する分離用チャネル１０２が配設されている。基板１００の下面側に透明又は不透明な素材（例えば、ガラス又は合成樹脂フィルム）からなる対面基板１１４が貼り合わされている。この対面基板１１４の存在により、ウエル及び溝内に泳動媒体及びＤＮＡサンプルなどを注入することができる。

図１３は図１１に示されたマイクロチップの使用方法を示す模式図である。先ず、ステップ（１）で、分離用チャネル１０２の高電圧側泳動媒体用ウエル１０８に電気泳動用の分離用泳動路となるべき泳動媒体（例えば、ゲル電解質）を分注する。次いで、ステップ（２）において、このウエル１０８から静かに圧力をかけて、分離用チャネル１０２及び導入用チャネル１０４に泳動媒体を充填させる。次いで、ステップ（３）において、ウエル１０６とウエル１１２に泳動媒体を分注する。次いで、ステップ（４）において、ウエル１１０にＤＮＡサンプル（遺伝子断片）を分注する。その後、ステップ（５）において、導入用チャネル１０４のウエル１１０をグランド側とし、ウエル１１２を高電圧側とし、導入用チャネル１０４に電圧を印加し、ＤＮＡサンプルをウエル１１０からウエル１１２に向かって泳動させる。次いで、ステップ（６）において、導入用チャネル１０４への電圧印加を止め、分離用チャネル１０２のウエル１０６をグランド側とし、ウエル１０８を高電圧側とし、分離用チャネル１０２に電圧を印加し、チャネルの交差部１１６に存在するＤＮＡサンプル（遺伝子断片）をウエル１０８に向かって泳動させる。分離用チャネル１０２の途中に光学測定位置１１８が存在し、この位置まで泳動された分離断片に光源（図示されていない）から励起光が照射され、断片に標識された蛍光体から発生された蛍光を受光手段（図示されていない）で受光し、分析を行う。

特開２００１−１５７８５５号公報 米国特許第５９６５２３７号明細書 国際公開第９８／５８２４７号パンフレット 特開２０００−２８３９６０号公報 David C. Duffy et al, Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane), Analytical Chemistry, Vol.70, No.23, December 1, 1988, pp.4974-4984

マイクロチップを用いてＤＮＡサンプルをゲル電気泳動する場合、ＤＮＡサンプルが十分な濃度を有することが必要である。このため、分析すべきＤＮＡサンプルの濃度が不十分な場合、サンプルを濃縮して濃度を高める前処理を行わなければならない。従来、ＤＮＡサンプルの濃縮は、例えば、エタノール沈殿法やイソプロピルアルコール法などによりＤＮＡを塩析するか、透析膜などを利用して膜内にＤＮＡを貯めるか、又はＤＮＡをガラスビーズに化学的に結合させ、そのビーズを液量の少ない溶液中に移すなどの方法により行われてきた。しかし、このようなＤＮＡ濃縮方法は煩雑であるばかりか、多大な時間と費用を要する。従って、分析すべきＤＮＡサンプルの濃度が不十分な場合、迅速分析の要求を満たすことが困難となる。

また、別の問題点として、高電圧の印加によりＤＮＡサンプルやゲル電解質などが電気分解され、気泡が発生することがある。この発生した気泡がチャネル内に取り込まれると、気泡によりチャネルが閉塞され、ゲル電気泳動の続行が困難又は不可能となることがある。特に、ウエル１１０と交差部１１６までの距離が長い場合、ＤＮＡサンプルを移動させるために印加された高電圧により電気分解が起こりやすい。

更に、他の問題点として、図１１に示されるようなクロスインジェクション方式チップでは、流動性のあるメチルセルロースなどのようなポリマーゲルを使用すると、ポリアクリルアミドなどの硬化型ゲルに比べて電気泳動による分離精度が劣ることが指摘されている。

従って、本発明の目的は、極めて簡単にＤＮＡサンプルを濃縮できるばかりか、電気分解が起こり難く、しかも高い分離精度が得られる、ＤＮＡサンプルのゲル電気泳動用マイクロチップを提供することである。

前記課題を解決するための手段として、請求項１に係る発明の特徴は、第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなるマイクロチップにおいて、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、かつ該チャネルの両端に、該第１の基板を貫通し、そして該チャネルに連通する第１のウエル及び第２のウエルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、サンプル濃縮用電極を前記チャネルと交差するように有することである。

前記のように構成された請求項１に係る発明によれば、第２の基板上のサンプル濃縮用電極を用いることによりＤＮＡサンプルを濃縮することができる。例えば、第１のウエルからサンプル濃縮用電極まで希薄なＤＮＡサンプルを充填し、第１のウエル側をグランドとし、サンプル濃縮用電極に電圧を印加すると、ＤＮＡは負の電荷を持つためＤＮＡ分子だけをサンプル濃縮用電極付近に集中させ、そのサンプル濃度を高めることができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項２に係る発明の特徴は、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極及び第２の端部電極を更に有することである。

前記のように構成された請求項２に係る発明によれば、電気泳動に必要な端部電極が２個とも第２の基板上に形成されているので、サンプル濃縮用電極付近にＤＮＡサンプルが集中されたら、引き続いて電気泳動分析に入ることができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項３に係る発明の特徴は、前記第１の端部電極は前記第１のウエルと交差するように配設され、前記第２の端部電極は前記チャネルと交差するように配設されていることである。

前記のように構成された請求項３に係る発明によれば、従来のように外部電極をウエルの浸漬させる必要性が無くなり、分析作業性を向上させることができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項４に係る発明の特徴は、前記第１の端部電極は前記チャネルと交差するように配設され、前記第２の端部電極は前記第２のウエルと交差するように配設されていることである。

前記のように構成された請求項４に係る発明によれば、第１の端部電極とサンプル濃縮用電極との間隔を小さくすることができ、印加電圧を下げることができるばかりか、ＤＮＡサンプルを迅速にサンプル濃縮用電極に集中させることができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項５に係る発明の特徴は、前記第１の端部電極及び前記第２の端部電極は、前記サンプル濃縮用電極を間に挟んで前記チャネルと交差するように配設されていることである。

前記のように構成された請求項５に係る発明によれば、サンプル濃縮用電極と第２の端部電極とが同じチャネル上に配設されているので、泳動時間を短縮することができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項６に係る発明の特徴は、第１のウエルと、第２のウエルと、これらウエルを接続するチャネルと、該チャネルに交差するサンプル濃縮用電極とからなる組を２個有することである。

前記のように構成された請求項６に係る発明によれば、１枚のマイクロチップで２回分の分析を同時にすることができる。従って、同一検体であれば、ダブルチェックを行うことにより、分析結果の信頼性を向上させることができ、また異なる検体であれば、処理効率が高まり分析作業時間が短縮されるばかりか、分析コストを低減させることができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項７に係る発明の特徴は、第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなるマイクロチップにおいて、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極と、第２の端部電極と、これら第１及び第２の端部電極の中間に配置されたサンプル濃縮用電極とを、前記チャネルと交差するように有することである。

前記のように構成された請求項７に係る発明によれば、マイクロチップのチャネルをＰＣＲ法によるＤＮＡサンプルの増幅などの目的に使用した後に、その場で同じチャネルを用いて電気泳動を実施することもできる。この際、第１の端部電極とサンプル濃縮用電極との間に電圧を印加することによりサンプル濃縮用電極付近にＤＮＡサンプルを集積させることができ、次いで、第１の端部電極と第２の端部電極との間で電圧を印加することによりサンプル濃縮用電極付近に集積されたＤＮＡサンプルを高い精度で鎖長解析することができる。このような場合、チャネルの両端にオープンウエルが存在する必要性は必ずしも存在しない。従って、チャネルと電極の組合せを有効かつ広範な目的に使用することが可能となる。

前記課題を解決するための手段として、請求項８に係る発明の特徴は、前記チャネルは第１のチャネルと第２のチャネルとに分断されており、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとは、これらのチャネルよりも細いチャネルにより相互に連通されており、前記第１の端部電極、サンプル濃縮用電極及び第２の端部電極は前記第１のチャネル側に存在し、前記第１の端部電極は前記第１のチャネルの分断部分寄りに配設されていることである。

前記のように構成された請求項８に係る発明によれば、第１のチャネルをＰＣＲ法によるＤＮＡサンプルの増幅のための反応区画として使用し、引き続き、その場で電気泳動を実施することもできる。

前記課題を解決するための手段として、請求項９に係る発明の特徴は、前記チャネルは第１のチャネルと第２のチャネルとに分断されており、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとは、これらのチャネルよりも細いチャネルにより相互に連通されており、前記第１の端部電極、サンプル濃縮用電極及び第２の端部電極は前記第１のチャネル側に存在し、前記第１の端部電極は前記第１のチャネルの分断部分寄りに配設されており、前記第１の端部電極と前記サンプル濃縮用電極との間の前記第１のチャネル部分に微量液体秤取構造が接続されており、前記微量液体秤取構造はメインチャネルと、このメインチャネルと直交する微量液体秤取チャネルと、この微量液体秤取チャネルを前記第１のチャネルに連通させるためのこれらのチャネルよりも細い接続用チャネルとからなることである。

前記のように構成された請求項９に係る発明によれば、前記第１の端部電極と前記サンプル濃縮用電極との間の前記第１のチャネル部分に一定量のサンプルを正確に注入することができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項１０に係る発明の特徴は、前記電極は白金又は金からなることである。

前記のように構成された請求項１０に係る発明によれば、導電性の高い白金又は金から電極を構成することにより、電圧印加を確実に行うことができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項１１に係る発明の特徴は、前記電極は前記第２の基板上に印刷又は転写法により形成されていることである。

前記のように構成された請求項１１に係る発明によれば、電極を正確に、かつ容易に第２の基板上に形成することができる。

前記課題を解決するための手段として、請求項１２に係る発明の特徴は、第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなり、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、かつ該チャネルの両端に、該第１の基板を貫通し、そして該チャネルに連通する第１のウエル及び第２のウエルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極及び前記第２の端部電極を有し、該第１の端部電極及び前記第２の端部電極との間に、サンプル濃縮用電極を前記チャネルと交差するように有するマイクロチップを用いることからなる電気泳動方法であって、
(A)少なくともサンプル濃縮用電極が存在するチャネル内に電気泳動用ゲル物質を注入するステップと、
(B)前記第１の端部電極をグランドとし、前記サンプル濃縮用電極に低電圧を印加して、前記ゲル物質内の前記サンプルを前記サンプル濃縮用電極付近に集積させるステップと、
(C)前記サンプル濃縮用電極をオープンにし、前記第１の端部電極をグランドとし、前記第２の端部電極に低電圧を印加して、前記サンプル濃縮用電極付近に集積された前記サンプルを前記第２の端部電極に向かって泳動させるステップとからなることである。

前記のように構成された請求項１２に係る発明によれば、サンプルの濃度が希薄であっても、サンプル濃縮用電極付近にサンプルを集積させることができ、分離されるバンドがシャープになり優れた分析結果が得られる。

本発明のマイクロチップによれば、ＤＮＡサンプルの濃度を高めるための前処理は全く不要となる。また、第１のウエルとサンプル濃縮用電極との間隔を小さくすることによりサンプル濃縮用電極にＤＮＡサンプルを集中させるために印加される電圧を低くすることができ、その結果、電気分解が起こり難くなる。更に、ＤＮＡサンプルを濃縮できるので、第１のウエルに添加するＤＮＡサンプル量が少なくて済み、直線状のチャネルにも注入可能となる。その結果、ポリアクリルアミドのような硬化型ゲルを利用することも可能となり、電気泳動による分離精度を高めることができる。しかも、本発明のマイクロチップによれば、サンプル濃縮用電極部分にＤＮＡサンプルを集中させることができるので、従来のマイクロチップのようなクロスインジェクション用のＤＮＡサンプル導入用チャネル及びその導入用チャネル両端のウエルを配設する必要も無くなる。

また、本発明のマイクロチップによれば、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅をチャネル内で実施した後、その場で電気泳動分析を行うこともでき、分析効率が飛躍的に向上する。

以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施態様について説明する。図１は本発明のマイクロチップの一例の平面図である。図２は図１におけるＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図である。本発明のマイクロチップ１は基本的に第１の基板３と第２の基板５とからなる。第１の基板３の一方の面にはチャネル７が形成されており、このチャネル７の両端には第１の基板３を貫通する第１のウエル９と第２のウエル１１が穿設されている。第２の基板５は第１の基板３のチャネル７が形成されている方の面に貼り合わされている。これにより、第１の基板３のチャネル７と第１のウエル９及び第２のウエル１１の下端が封止され、第１のウエル９からチャネル７内にゲル電解質溶液及びＤＮＡサンプルを注入することができる。第２の基板５の第１の基板３との貼り合わせ面にはサンプル濃縮用電極１３が配設されている。サンプル濃縮用電極１３はチャネル７と交差するように配設する事が好ましい。

図１のマイクロチップ１を用いて電気泳動を行う場合、従来のマイクロチップと同様に第１のウエル９及び第２のウエル１１に電極を浸漬させることができる。しかし、外部からウエル内に電極を浸漬したり抜き出したりするのは不便であり、分析の作業性も低下する。そのため、図３に示されるように、サンプル濃縮用電極１３と同様に、第２の基板５の貼り合わせ面上に、電気泳動用の第１の端部電極１５を第１のウエル９と交差するように配設し、電気泳動用の第２の端部電極１７を第２のウエル１１と交差するように配設することもできる。これにより、電気泳動のためにウエル９及び１１内にいちいち電極を浸漬したり抜き出したりする手間が不要になり、分析の作業性が向上する。

電気泳動用の第１の端部電極１５及び第２の端部電極１７は必ずしもウエル９，１１と交差させる必要は無い。従って、図４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、必要に応じて端部電極１５，１７をウエル９，１１及び／又はチャネル７の適宜の位置に配設することができる。端部電極の配設位置は、印加電圧、ＤＮＡサンプルの泳動距離、蛍光検出位置及び／又は分離精度などを総合的に考慮して適宜決定することができる。

第１の基板３の形成材料としては、例えば、エラストマータイプのシリコン樹脂であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を使用することが好ましい。ＰＤＭＳは良好なモールド転写性や透明性、耐薬品性、生体適合性などマイクロチップの部材として優れた特徴を有する。従って、ＰＤＭＳにより形成されたマイクロチップは、微細なチャネル（流路）を形成する際に、作業が繁雑なエッチングや、切削などの機械加工などの処理プロセスが不要であり、単純かつ安価な型取りと封止だけで極めて簡単に微細流路を形成することができる。ＰＤＭＳ以外の基板材料（例えば、ガラス又はポリメチルメタクリレート(PMMA)など）も同様に使用できる。第１の基板３は透明であっても、不透明であってもよい。一方、第２の基板５の形成材料としては、例えば、ＰＤＭＳ、ガラス、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などを適宜する使用することができる。第２の基板５も透明であっても、不透明であってもよい。しかし、本発明のマイクロチップ１が光学的検出手段と併用される場合には、第１の基板３及び／又は第２の基板５は透明であることが好ましい。第１の基板３がＰＤＭＳである場合、第２の基板５はガラスから形成すると、両者を貼り合わせるだけで、強固に接着させることができる。

第１の基板３に配設されるチャネル７の幅は数十μｍ〜数百μｍの範囲内であり、深さ（又は高さ）は数十μｍ〜数百μｍの範囲内であり、長さは数十ｍｍの範囲内であることができる。また、第１のウエル９及び第２のウエル１１の開口径は数ｍｍ程度である。一般的に、第１のウエル９はゲル電解質及び被分析ＤＮＡサンプルの注入用として使用され、第２のウエル１１はこれらの排出用として使用される。

第２の基板５に配設される電極１３，１５及び１７は例えば、金（Ａｕ）又は白金（Ｐｔ）から形成することができる。その他、炭素（ダイヤモンドを含む）、パラジウム、水銀、半導体なども電極形成材料として使用できるが、電気分解の起こり難さの点から金又は白金が好ましく、特に白金が好ましい。電極の幅は数十μｍ〜数百μｍの範囲内であり、厚さは数μｍ程度であることが好ましい。電極の厚さが厚すぎると、電極がチャネル７内で堰のようになり、ゲル電解質及び／又は被分析ＤＮＡサンプル溶液の注入を阻害するので好ましくない。電極１３，１５及び１７の幅はチャネル７の幅と大体同一であることが好ましい。これにより、電極とチャネルの交差部は正方形になるので電圧の印加を一定にすることができる。電源（図示されていない）との接続を可能にするため、チャネルと交差しない方の電極１３，１５及び１７の端部は第２の基板５の側面に露出させることが好ましい。別法として、第１の基板３の幅よりも若干大きな幅を有する第２の基板５を使用することにより、チャネルと交差しない方の電極１３，１５及び１７の端部を第２の基板５の上面に露出させることができる。電極１３，１５及び１７は例えば、蒸着、印刷、転写などの公知慣用の技法を用いて第２の基板５の貼り合わせ面上に容易に配設することができる。

図５は図１及び図２に示されたマイクロチップ１の製造方法を示す工程図である。先ず、ステップ（ａ）において、最終製品のマイクロチップ１のサイズ（例えば、２０ｍｍｘ２０ｍｍ又は２０ｍｍｘ３０ｍｍ）と概ね同じサイズのシリコンウエハ２０を準備する。シリコンウエハ２０は予め乾燥させたり、表面処理などの所望の前処理を施すこともできる。その後、ステップ（ｂ）において、適当なレジスト材料（例えば、ネガティブフォトレジストＳＵ−８など）を２０００ｒｐｍ〜５０００ｒｐｍの回転速度で数秒間〜数十秒間にわたってスピン塗布し、オーブン中で乾燥させ、所望の厚さのレジスト膜２２を形成する。次いで、ステップ（ｃ）において、このレジスト膜２２上にマスク２４を通して、適当な露光装置（図示されていない）で露光する。マスク２４は本発明のマイクロチップ１におけるチャネル７に対応するレイアウトパターンを有する。その後、ステップ（ｄ）において、適当な現像液（例えば、１−メトキシ−２−プロピル酢酸）中で現像し、上面にチャネル７に対応する微細構造２６を有するマスター２８を生成する。所望により、このマスター２８を有機溶媒（例えば、イソプロピルアルコール）及び蒸留水で洗浄することができる。更に、マスター２８の表面をフルオロカーボンの存在下で反応性イオンエッチングシステムにより処理することができる。このフルオロカーボン存在下の反応性イオンエッチング処理は、後のステップにおいて、ＰＤＭＳのマスター２８からの離型性を改善する。次いで、ステップ（ｅ）において、前記のマスター２８の上面に、ＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤を適度な割合で混合し、脱気したＰＤＭＳプレポリマー混合液を流し込む。この際、型枠を使用し、鋳込み型とし、その中にＰＤＭＳプレポリマー混合液を流し込んで型取りすることが好ましい。ＰＤＭＳプレポリマー混合液としては、例えば、米国のダウ・コーニング社製のSYLGARD 184 SILICONE ELASTOMERが好適に使用できる。これは液状のＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤を１０対１の割合で混合するものである。塗布後、常温で十分な時間放置するか、又は、例えばオーブン中で６５℃で１時間加熱するか若しくは１３５℃で１５分間加熱して硬化させ、ＰＤＭＳ中間基板３０を生成させる。ＰＤＭＳ中間基板３０は透明性の高いゴム状の樹脂であり、マスター２８の微細構造２６が転写されている。その後、ステップ（ｆ）において、ＰＤＭＳ中間基板３０をマスター２８から剥離し、ＰＤＭＳ中間基板３０の上面から下部のチャネル７に連通するウエル９（１１）をパンチ３２で穿設することによりにＰＤＭＳ基板（第１の基板）３を得る。次いで、ステップ（ｇ）において、サンプル濃縮用電極１３が上面に配設された第２の基板５に、ＰＤＭＳ基板（第１の基板）３をチャネル７形成面を下側にして貼り合わせる。最後に、ステップ（ｈ）において、完成された本発明のマイクロチップ１を回収する。

図６は本発明の更に別の実施態様に係るマイクロチップ１Ｅの概要平面図である。図６に示されたマイクロチップ１Ｅは図３に示されたマイクロチップ１Ａと異なり、第１の基板３及び第２の基板５に、チャネル７、ウエル９，１１、サンプル濃縮用電極１３、第１の端部電極１５及び第２の端部電極１７が２セット形成されている。図６のマイクロチップ１Ｅによれば、１台のマイクロチップで２個の検体を同時に又は時間を変えて分析することができ、同一検体のダブルチェックに利用すれば分析結果の信頼度が高まり、一方、別々の検体の分析に利用すれば作業時間の短縮や分析コストの低減に役立つ。電気泳動方向を目視可能に示すために第１の基板３及び第２の基板５の角端部の１箇所に切欠部３４を設けることもできる。

図７は本発明の更に他の実施態様に係るマイクロチップ１Ｆの部分概要平面図である。図７のマイクロチップ１Ｆでは、第１の端部電極１５と第２の端部電極１７及びこれら両端部電極間のサンプル濃縮用電極１３とのセットが第１のチャネル３６と交差するように配設されている。この第１のチャネル３６は必ずしも端部にウエルを有する必要が無い。例えば、第１のチャネル３６はこのチャネルよりも細い接続用チャネル３８により第２のチャネル４０に連通させることができる。第２のチャネル４０の他端にはポンプ又はバルブ（図示されていない）などを接続することもできる。すなわち、換言すれば、本発明のマイクロチップ１Ｆではウエルが存在しなくても、チャネルにサンプルの供給とゲルの充填が可能であれば、電気泳動を行うことが可能である。従って、例えば、第１のチャネル３６（又は別の図示されていない反応用チャネル）でＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅反応を実施した後、その増幅に使用した部位を利用して、引き続き電気泳動を実施することも可能である。

図８（Ａ）は、図７のマイクロチップ１Ｆの第１のチャネル３６において、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅反応の終了時点の状態を示す模式図である。言うまでもなく、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅反応は第１のチャネル３６以外の別の反応用チャネル（図示されていない）において実施することもでき、その反応用チャネルから第１のチャネル３６に増幅産物を移動させてもよい。ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅反応が終了したら、増幅されたＤＮＡサンプルをビーズ４２に吸着させる。電気泳動に過剰な（すなわち、ビーズ４２に吸着しきれない）増幅産物は細管３８を介して第２のチャネルに排液させることもできる。斯くして、充填されるビーズ４２の量を調整することにより、最終的な電気泳動のためのＤＮＡサンプル量を規定することができる。図８（Ａ）において、増幅されたＤＮＡ断片はビーズ４２に吸着された状態で第１のチャネル３６内に保存されている。ビーズ４２は例えば、シリカビーズ又は磁性体ビーズなどである。磁性体ビーズを使用すると、チップ外から磁石を当てることによりビーズを任意の箇所に移動させることができるという利点がある。第１のチャネル３６と第２のチャネル４０との間はこれらのチャネルよりも細い接続用チャネル３８が存在するので、ビーズ４０は第１のチャネル３６の端部で堰き止められる。

図８（Ｂ）は、マイクロチップ１Ｆの第１のチャネル３６に電気泳動用のゲル４４（例えば、ハイドロキシメチルセルロース溶液）を充填した状態を示す模式図である。矢線方向からビーズ４２を接続用チャネル３８方向へ押しやるようにゲル４４を充填する。このとき、接続用チャネル３８から第２のチャネル４０に向かって空気が逃げるために、ゲル４４の充填が可能になる。ゲル充填時の圧力によりゲルの一部が接続用チャネル３８を介して第２のチャネル４０に流入するが、特に問題は無い。

図８（Ｃ）は電気泳動を実施している状態を示す模式図である。ゲル４４を充填すると、コロイド塩析によりビーズ４２に吸着していたＤＮＡがゲル中に溶出される。第１の端部電極１５をグランドとし、サンプル濃縮用電極１３に数Ｖ（例えば、ＤＣ５Ｖ）の電圧を印加すると、サンプル濃縮用電極１３上にＤＮＡを集積させることができる（図８（Ｃ）（１）参照）。その後、サンプル濃縮用電極１３をオープンとし、第２の端部電極１７に数Ｖ（例えば、ＤＣ５Ｖ）を印加すると、サンプル濃縮用電極１３上のＤＮＡサンプルが逐次、電気泳動され、その鎖長解析が可能となる（図８（Ｃ）（２）参照）。

図９は本発明の更に他の実施態様に係るマイクロチップ１Ｇの部分概要平面図である。マイクロチップ１Ｇはマイクロチップ１Ｆと同様に、第１の端部電極１５と第２の端部電極１７及びこれら両端部電極間のサンプル濃縮用電極１３とのセットが第１のチャネル３６と交差するように配設されている。マイクロチップ１Ｆと異なり、マイクロチップ１Ｇでは、第１のチャネル３６に対して、第１の端部電極１５とサンプル濃縮用電極１３との間に微量液体秤取構造４６が接続されている。このような微量液体秤取構造４６は特願２００２−３０２６９２号明細書に記載されている。微量液体秤取構造４６はメインチャネル４８と、このメインチャネル４８と直交する微量液体秤取チャネル５０と、この微量液体秤取チャネル５０を第１のチャネル３６に連通させるためのこれらのチャネルよりも細い接続用チャネル５２とからなる。

図１０（Ａ）は、図９に示されたマイクロチップ１Ｇにおいて、微量液体秤取構造４６のメインチャネル４８内にＤＮＡ吸着ビーズ４２が充填されている状態を示す。

図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）において、微量液体秤取構造４６のメインチャネル４８内にＤＮＡ溶出用の低塩濃度のバッファ液（例えば、ＴＥバッファ液又はＴＢＥバッファ液など）を注入すると、ビーズ４２に吸着されていたＤＮＡがバッファ液に溶け出し、溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４が得られる。溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４は微量液体秤取チャネル５０にも満たされる。

図１０（Ｃ）は、図１０（Ｂ）において、微量液体秤取構造４６のメインチャネル４８の一方の端部から空気圧などの圧力を加えることにより、メインチャネル４８の他方の端部から溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４を排出させると、細管５２の存在により、前記排出圧力だけでは、微量液体秤取チャネル５０内の溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４は排出されず、そのまま残るので、微量液体秤取チャネル５０の容積に対応する量の溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４を秤取することができる。

図１０（Ｄ）に示されるように、微量液体秤取構造４６のメインチャネル４８内の溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４が全て排出されたら、第１のチャネル３６に電気泳動用のゲル４４（例えば、ハイドロキシメチルセルロース溶液）を充填する。矢線方向からゲル４４を充填する。このとき、接続用チャネル３８から第２のチャネル４０に向かって空気が逃げるために、ゲル４４の充填が可能になる。ゲル充填時の圧力によりゲルの一部が接続用チャネル３８を介して第２のチャネル４０に流入するが、特に問題は無い。

次いで、図１０（Ｅ）に示されるように、微量液体秤取構造４６のメインチャネル４８の他方の端部を閉じ、一方の端部から空気圧などの圧力を加えることにより、微量液体秤取チャネル５０内の溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４を細管５２を介して、第１のチャネル３６の電気泳動用ゲル４４内に注入する。この場合、ゲル内に注入された溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４はゲル内で拡散してしまう。

そこで、図１０（Ｆ）に示されるように、第１の端部電極１５をグランドとし、サンプル濃縮用電極１３にＤＣ５Ｖの電圧を印加すると、ゲル内に拡散していた溶出ＤＮＡ含有バッファ液５４をサンプル濃縮用電極１３上に集積させることができる。

次いで、図１０（Ｇ）に示されるように、サンプル濃縮用電極１３をオープンとし、第１の電極１５をグランドとして、第２の端部電極１７にＤＣ５Ｖを印加すると、サンプル濃縮用電極１３上の集積ＤＮＡサンプルが逐次、電気泳動され、その鎖長解析が可能となる。通常、電気泳動では、ゲルとＤＮＡ溶液との境界面が、分離されて行くバンドの形状となる。歪んでいれば、分離されるバンドもその歪みを引きずって行く。これに対して、本発明のように、サンプル濃縮用電極１３上にＤＮＡサンプルを集積させてから電気泳動すると、分離されるバンドがシャープとなり、鎖長解析が正確に行える。つまり、本発明のマイクロチップ１Ｇを使用すると、ＤＮＡサンプル注入で歪んだゲルとの境界面を修正させ、バンドの修正に効果があるばかりか、バンド精度を上げる効果も得られる。

第１の基板３の素材としてＰＤＭＳを使用し、第２の基板５の素材としてガラスを使用し、図５に示される製造プロセスに従って図４（Ｂ）に示されるマイクロチップ１Ｃを製造した。ＰＤＭＳ製の第１の基板３の幅は２０ｍｍ、長さは５０ｍｍ、厚さは２ｍｍであり、ガラス製の第２の基板５の幅及び長さは第１の基板３と同一であるが、厚さは１ｍｍであった。第１の基板３の片側に、幅１００μｍ、深さ１００μｍ、長さ３０ｍｍのチャネル７を形成させ、チャネル７の両端に内径１ｍｍの第１のウエル９と第２のウエル１１を穿設した。第２の基板の片側には、蒸着法により最細幅１００μｍ、厚さ１μｍ、長さ３ｍｍのサンプル濃縮用電極１３，第１の端部電極１５及び第２の端部電極１７がそれぞれ、チャネル７の各位置に対応するように形成されていた。第１の基板３のチャネル形成面と第２の基板の電極形成面をそれぞれ対向させ、両者を貼り合わせて一体化させた。第１の端部電極１５とサンプル濃縮用電極１３との間隔は１ｍｍであり、サンプル濃縮用電極１３と第２の端部電極１７との間隔は１２ｍｍであった。
前記のようにして作製されたマイクロチップ１Ｃの第１のウエル９から、最終濃度０．６％−０．５Ｘ：ＴＢＥ（電気泳動用緩衝液）のハイドロキシメチルセルロース（ＨＰＭＣ）ゲル溶液を充填し、チャネル７及び第２のウエル１１を満たした。同様のゲル溶液に蛍光標識したＤＮＡサンプルを溶解させ、第１のウエル９からサンプル濃縮用電極１３上にまで充填した。
第１の端部電極１５をグランド（Ｇ）とし、サンプル濃縮用電極１３に５Ｖを印加すると、蛍光ラベルされたＤＮＡサンプルがサンプル濃縮用電極１３の近傍に集積された。更に、第１の端部電極をグランド（Ｇ）とし、サンプル濃縮用電極１３をオープン（Ｏ）にし、第２の端部電極１７に５Ｖを印加するとサンプル濃縮用電極１３の近傍に集積された蛍光ラベルＤＮＡサンプルを第２の端部電極１７にまで移送させることができた。

本発明のマイクロチップの特徴は、第１のウエル９と第２のウエル１１とを結ぶチャネル７の間の任意の箇所に２つの電極と該電極間にサンプル濃縮用電極を設けることにより、そのサンプル濃縮用電極近傍へＤＮＡサンプルを運搬することが可能であるということである。この原理を利用すると、前記のような電気泳動のサンプルインジェクション技術として応用又は利用することが可能となる。これは、通常、ＤＮＡ量が多くなり電気泳動による分離が困難となるため、従来のマイクロチャネル式電気泳動では、チャネル構造を十字状に交差させた“クロスインジェクション”方式を採用している。この“クロスインジェクション”方式を採用した場合、メチルセロースなどのような流動性のあるポリマーゲルを使用しなければならない。これに対して、本発明のマイクロチップによる方式を採用すると、第１のウエル９に充填されるＤＮＡサンプル量が少なくて済み、直線状のチャネル７に直接インジェクションすることも可能となる。この直線状のチャネル７に直接インジェクションできるということは、ポリアクリルアミドのような硬化型ゲルを利用する事も可能となり、電気泳動による分離精度を向上させることが可能となる。

前記のように本発明のマイクロチップによれば、被分析ＤＮＡサンプルを濃縮するための前処理が不要なため、例えば、犯罪現場などにおいて採取された血液や体液などのようなＤＮＡを含有する証拠などをその場で直接分析することも可能となる。また、食品製造現場や医療現場などで緊急に分析しなければならないときにも有用性を発揮する。

本発明のマイクロチップの一例の概要平面図である。 図１におけるII-II線に沿った断面図である。 本発明のマイクロチップの別の例の概要平面図である。 本発明のマイクロチップの更に別の例の概要平面図である。 本発明のマイクロチップの製造方法の一例を示す製造工程図である。 本発明のマイクロチップの他の例の概要平面図である。 本発明のマイクロチップの他の例の部分概要平面図である。 図７に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図７に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図７に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 本発明のマイクロチップの他の例の部分概要平面図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 図９に示されたマイクロチップを用いて電気泳動する方法を説明する模式図である。 従来のマイクロチップの一例の概要平面図である。 図１１におけるＸＩＩ−ＸＩＩ線に沿った断面図である。 図１１に示されたマイクロチップによるＤＮＡサンプルインジェクションと電気泳動の原理を説明する概要図である。

符号の説明

１，１Ａ−１Ｇ 本発明のマイクロチップ
３ 第１の基板
５ 第２の基板
７ チャネル
９ 第１のウエル
１１ 第２のウエル
１３ サンプル濃縮用電極
１５ 第１の端部電極
１７ 第２の端部電極
３６ 第１のチャネル
３８ 接続細管
４０ 第２のチャネル
４２ 吸着ビーズ
４４ 電気泳動用ゲル
４６ 微量液体秤取構造
４８ メインチャネル
５０ 微量液体秤取チャネル
５２ 接続細管

Claims (11)

1. 第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなるマイクロチップにおいて、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、かつ該チャネルの両端に、該第１の基板を貫通し、そして該チャネルに連通する第１のウエル及び第２のウエルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、サンプル濃縮用電極を前記チャネルと交差するように有し、かつ、
   前記第１のウエル及び第２のウエルは、電気泳動のために、外部から当該ウエル内に電極が浸漬されたり、抜き出したりされるウエルであることを特徴とするマイクロチップ。
2. 第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなるマイクロチップにおいて、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、かつ該チャネルの両端に、該第１の基板を貫通し、そして該チャネルに連通する第１のウエル及び第２のウエルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、サンプル濃縮用電極を前記チャネルと交差するように有し、かつ、
   前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極及び第２の端部電極を有することを特徴とするマイクロチップ。
3. 前記第１の端部電極は前記第１のウエルと交差するように配設され、前記第２の端部電極は前記チャネルと交差するように配設されていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ。
4. 前記第１の端部電極は前記チャネルと交差するように配設され、前記第２の端部電極は前記第２のウエルと交差するように配設されていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ。
5. 前記第１の端部電極及び前記第２の端部電極は、前記サンプル濃縮用電極を間に挟んで前記チャネルと交差するように配設されていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ。
6. 第１のウエルと、第２のウエルと、これらウエルを接続するチャネルと、該チャネルに交差するサンプル濃縮用電極とからなる組を２個有することを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップ。
7. 第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなるマイクロチップにおいて、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極と、第２の端部電極と、これら第１及び第２の端部電極の中間に配置されたサンプル濃縮用電極とを、前記チャネルと交差するように有することを特徴とするマイクロチップ。
8. 前記チャネルは第１のチャネルと第２のチャネルとに分断されており、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとは、これらのチャネルよりも細いチャネルにより相互に連通されており、前記第１の端部電極、サンプル濃縮用電極及び第２の端部電極は前記第１のチャネル側に存在し、前記第１の端部電極は前記第１のチャネルの分断部分寄りに配設されていることを特徴とする請求項７に記載のマイクロチップ。
9. 前記チャネルは第１のチャネルと第２のチャネルとに分断されており、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルとは、これらのチャネルよりも細いチャネルにより相互に連通されており、前記第１の端部電極、サンプル濃縮用電極及び第２の端部電極は前記第１のチャネル側に存在し、前記第１の端部電極は前記第１のチャネルの分断部分寄りに配設されており、前記第１の端部電極と前記サンプル濃縮用電極との間の前記第１のチャネル部分に微量液体秤取構造が接続されており、前記微量液体秤取構造はメインチャネルと、このメインチャネルと直交する微量液体秤取チャネルと、この微量液体秤取チャネルを前記第１のチャネルに連通させるためのこれらのチャネルよりも細い接続用チャネルとからなることを特徴とする請求項７又は８に記載のマイクロチップ。
10. 第１の基板と、該第１の基板と貼り合わされる第２の基板とからなり、前記第１の基板の一方の面に所定の幅と深さのチャネルを有し、かつ該チャネルの両端に、該第１の基板を貫通し、そして該チャネルに連通する第１のウエル及び第２のウエルを有し、前記第２の基板の、前記第１の基板の前記チャネル形成面と貼り合わされる面上に、第１の端部電極及び前記第２の端部電極を有し、該第１の端部電極及び前記第２の端部電極との間に、サンプル濃縮用電極を前記チャネルと交差するように有するマイクロチップを用いることからなる電気泳動方法であって、
    (A)少なくともサンプル濃縮用電極が存在するチャネル内に電気泳動用ゲル物質を注入するステップと、
    (B)前記第１の端部電極をグランドとし、前記サンプル濃縮用電極に低電圧を印加して、前記ゲル物質内の前記サンプルを前記サンプル濃縮用電極付近に集積させるステップと、
    (C)前記サンプル濃縮用電極をオープンにし、前記第１の端部電極をグランドとし、前記第２の端部電極に低電圧を印加して、前記サンプル濃縮用電極付近に集積された前記サンプルを前記第２の端部電極に向かって泳動させるステップとからなることを特徴とする電気泳動方法。
11. 前記被電気泳動分析用サンプルはＤＮＡサンプルであることを特徴とする請求項１０に記載の電気泳動方法。

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