JP3979919B2 - 生体高分子解析方法及び装置 - Google Patents
生体高分子解析方法及び装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3979919B2 JP3979919B2 JP2002320204A JP2002320204A JP3979919B2 JP 3979919 B2 JP3979919 B2 JP 3979919B2 JP 2002320204 A JP2002320204 A JP 2002320204A JP 2002320204 A JP2002320204 A JP 2002320204A JP 3979919 B2 JP3979919 B2 JP 3979919B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- biopolymer
- electrophoresis
- migration
- pillar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micromachines (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNA(デオキシリボ核酸)などの生体高分子試料をサイズに応じて分離する生体高分子解析方法とその方法の実施に使用する装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
DNAのサイズ分離は、DNAのシーケンスを決定したり、SNPs(一塩基多型)の検出などによるDNA診断、DNAタイピング、DNA検定による親子の判別や犯罪の捜査まで広く使われている技術であり、今後ますます増える需要に応えるため、その取り扱いの容易化と高速化は、大きな課題である。
【0003】
DNAのサイズ分離には、従来、アガロースやポリアクリルアミドなどのゲルやポリマー中を電気泳動させ、その網目構造に制限を受けながら(ひっかかりながら)移動する速度が、DNAの大きさに依存することを利用したゲル電気泳動が主流であった。
【0004】
しかし、一般的に長時間の泳動が必要とされ、また分離するサイズに応じてゲルやポリマーの組成を変える必要があったり、大きなDNAの分離には途方もない時間が必要だったりするため、使いにくいという問題がある。
【0005】
また、ゲルやポリマーは水分を含むため保存が難しく、その都度作製あるいは充填する必要がある。また体積も大きく、バイオハザード成分を含んだ大量のゲルの廃棄には無毒化の処理も必要であり、この点でも使いにくいものであった。
【0006】
近年、ゲルの網目構造を、リソグラフィーなどを用いて作製したピラー構造の人工的な構造物に置き換え、サイズ分離を試みる手法がいくつか報告されている(非特許文献1参照。)。ピラー構造とは、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されている構造である。
しかし、泳動路に沿ってそのようなピラー構造を配置しただけでは、分離能力や解像度はゲルには及ばない。
【0007】
【非特許文献1】
S. W. Turner, A. M. Perez, A. Lopez and H. G. Graighead, J. Vac. Sci. Technol., B 16(6), Nov/Dec, pp. 3835-3840(1998)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲルやポリマーを用いる方法よりも使いやすく、ピラー構造を用いた従来の方法よりも分離能力や解像度の優れた生体高分子解析方法及び装置を提供することを目的とするものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ピラーのように伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁のない流路を流れているDNAなどの生体高分子が、ピラーのような障壁のある領域に侵入する界面で、侵入速度に大きなサイズ依存性があることを見出した。本発明は、その現象を利用したDNAなど生体高分子のサイズによる分離方法とそれを利用したDNA解析装置である。
【0010】
すなわち、本発明による生体高分子解析方法は、泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面を複数個配置し、その泳動用流路の一端側に生体高分子試料を導入し、その泳動用流路の両端間に泳動用電圧を印加して泳動用流路の一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させることにより、生体高分子試料をサイズに応じて分離することを特徴とする方法である。
【0011】
また、本発明の生体高分子解析装置は、一端側に試料導入部を有し、前記一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が両端間に印加される泳動用流路を備え、前記泳動用流路には、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とが前記泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面が前記泳動用流路に沿って複数個形成されていることを特徴とするものである。
【0012】
そのような障壁領域の一例は、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である。ピラー領域におけるピラーは、直径が1〜1000nm、ピッチが1〜2000nmのものが適当である。
【0013】
【発明の実施の形態】
図1は一実施例における電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示したものである。
この泳動用流路2は、石英ガラス基板に形成された溝と、その上に接合された石英ガラス板により、通路として形成されたものである。泳動用流路2の一端と他端にはそれぞれ上面が開口したリザーバ4,6が設けらけれている。流路2、リザーバ4,6にはバッファ液が充填される。一端側のリザーバ4は試料導入部を兼ねている。リザーバ4,6間には直流電源(図示略)により一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が印加されるようになっている。
【0014】
泳動用流路2には、泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されている障壁領域としてのピラー領域8と、そのような障壁としてのピラーの設けられていない領域10とが泳動用流路2に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、ピラーの設けられていない領域10とピラー領域8との界面が泳動用流路2に沿って複数個(この実施例で6個)形成されている。
【0015】
ピラー領域8には、図2に示されているようなピラーを高密度に配置した。図2の例では、ピラーは直径が200nm、ピッチが400nm、高さが5μmの円柱状で、アスペクト比は25である。しかし、本発明におけるピラーの形状は円柱状に限らず、角柱状であってもよく、サイズもこれに限らない。ピッチはDNAなどの測定対象となる生体高分子が伸びた状態で通過できるように適当に設定することができる。
【0016】
図1の実施例の装置の寸法を概略的に示す、泳動用流路2は幅が1〜100μm、例えば25μm、長さが0.1〜500mm、例えば10mm、高さが0.1〜50μm、例えば5μmであり、ピラー領域8の長さは0.1〜10mm、例えば1mm、ピラー領域8間に挟まれた領域10の長さは0.1〜10mm、例えば1mmである。もちろん、寸法はこれに限られるものではない。
【0017】
このように、ピラーのある領域8とない領域10を交互に配置し、ピラーのある領域8で引き伸ばされたDNAなどの生体高分子が、ピラーのない領域10でもう一度熱的にまるまることにより、次のピラーのあるなし界面でも、再度泳動速度に大きなサイズ依存性が起きることが期待できる。これを繰り返すことにより、総合して泳動時間に大きなサイズ依存性を持たせることができる。
【0018】
高密度ピラーの形成方法について、以下に記述する。
まず石英ガラス基板に電子ビーム用レジスト層を形成し、電子ビーム露光装置により、所定のパターンに直接描画して露光し、現像してレジストパターンを得る。そのレジストパターンを鋳型にしてニッケル層を電着しニッケルパターンを形成する。次に、そのニッケルパターンをマスクにしてNLD法により石英ガラス基板をドライエッチングしてピラーを形成する。NLDエッチングとはプラズマエッチングの一種で、コイルによってチャンバ内に磁気中性線を含む領域を生じさせ、この領域でプラズマを発生させることによって得た、低圧・高密度・低温のプラズマを用いてエッチングを行うものである。微細加工に適し、かつエッチング速度も速いという特長を持つ。
【0019】
その後、ピラーが形成された石英ガラス板の加工面にリザーバ用貫通穴を形成した石英ガラス板カバーを接合する。接合には、純水によるプリボンド及び熱処理による直接接合を用いた。即ち、親水化処理した石英ガラス基板同士を純水を介して重ね合わせ、荷重(約1.3MPa)を加えながら乾燥させ、その後1100℃、酸素雰囲気中での熱処理を行うことにより接合した。
【0020】
本発明の意義を明確にするために、図3のような1つのピラー領域18をもつ流路12を備えた電気泳動チップを作成した。流路12の幅は25μm、ピラー領域18の長さは24mm、深さは5μmで、ピラーのサイズとピッチの異なる2種類のチップを製作した。ピラーのそのサイズとピッチは、(サイズ,ピッチ)=(300nm,600nm)及び(500nm、1000nm)である。これらの電気泳動チップをそれぞれマイクロチップ電気泳動装置に装着し、オートサンプラを用いて試料を導入して測定を行なった。
【0021】
電気泳動速度を測定するために、試料として165.6kbpの塩基長をもつT4DNA溶液と、48.5kbpの塩基長をもつλDNA溶液を用意し、それぞれをYOYO1で着色し、0.5トリス硼酸EDTA緩衝液により試料溶液とした。それらの試料を図3の電気泳動チップに注入し、電気泳動を行なって蛍光顕微鏡を用いてそれぞれのDNAの泳動を観察した。
【0022】
その結果を図4と図5に示す。図4は直径300nm、ピッチ600nmのピラーをもつピラー領域でT4DNAとλDNAの泳動速度を測定した結果である。泳動電圧が50〜200V/cmの領域において殆ど同一である。
【0023】
図5は直径500nm、ピッチ1000nmのピラーをもつピラー領域で分離した結果である。図4の結果よりも、両DNAが分離されていることがわかる。このことからDNAフラグメントの分離にはピラー構造の直径及び/又はパターンの最適化が重要であることが推定される。
しかしながら、このようなピラー領域内での泳動速度に対するDNAのサイズ依存性はさほど大きいとはいえない。
【0024】
そこで、図6に示されるように、ピラーのない領域20からピラーのある領域18に入る界面をまたいだDNAの平均速度を測定した。その結果を図7に示す。図7はピラーのない領域20からピラーのある領域18に入る界面を通過する時のDNAの平均速度を示したものである。この場合は、70V/cmという低い泳動電圧でもλDNAの電気泳動速度はT4DNAのほぼ2倍の大きさであり、T4DNAとλDNAの泳動速度に大きなサイズ依存がみられる。
【0025】
すなわち、ピラーのないところでは熱運動で丸まった形で泳動しているDNAが、ピラー領域に入るときに、引き伸ばされ、ピラー領域内部では直線状に伸びた形で泳動している。この界面で、丸まった形から、直線状に伸びるのに必要な時間に関して大きなサイズ依存性があるものと考えられる。ピラー領域に入ったあとは、図4や図5に示したように、大きなサイズ依存性なく泳動するものと考えられる。
【0026】
実施例では、試料としてDNAを例に説明を行ってきたが、同様に電気泳動による分離を行っているたんぱく質やRNA(リボ核酸)のような生体高分子にも適用できる。
また、実施例では、障壁としてリソグラフィーとエッチングにより作製したピラーを用いたが、同様にDNAの動きを制限し直線状に引き伸ばす物体を障壁として繰り返し配置することにより同様の効果が期待できる。そのような障壁となる物体として、光硬化多孔質樹脂、光硬化ゲル、ビーズなどが挙げられる。
【0027】
【発明の効果】
本発明では、泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもつ障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁のない領域と障壁領域との界面を複数個配置して生体高分子試料を電気泳動分離させるようにしたので、生体高分子試料のサイズによって分離できるようになる。このサイズ依存性は、単位分離媒体長さ当りで比較すると、けた違いに大きく、トータルとしてより短い分離チャネルで、従来のゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動と同等の分離性能を得ることができる。これは、装置の小型化、高集積化だけではなく、短い泳動距離でよいことを意味しており、ひいては短い泳動時間でよく、けた違いの高速化につながる。これは、増大するDNA解析需要にとって計り知れない利点である。
また、本発明の装置は、チップ化した際には、他の微小流体デバイスと同時に、1プロセスで作製することができ、ゲルを埋め込んだり、後で注入したりするものに比べて、容易に作製、利用できる。
また、本質的に形状加工だけなので、マイクロ精密プリンティングや、一回のドライエッチングなどにより、大量生産可能である。
さらに、乾燥状態で保存できるため、取り扱いが楽であり、また試料や廃棄物も少量である。
したがって、専門的オペレータや廃棄施設を持った研究所や大病院のみならず、診療所、専門外の研究機関でも容易に利用でき、DNA解析の応用範囲を大きく広げると期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】一実施例の電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示す平面図である。
【図2】一実施例におけるピラー構造を示す画像である。
【図3】比較のために製作した電気泳動チップの泳動用流路を概略的に示す平面図である。
【図4】図3の電気泳動チップの一例を用いたDNAの泳動速度測定結果を示すグラフである。
【図5】図3の電気泳動チップの他の例を用いたDNAの泳動速度の測定結果を示すグラフである。
【図6】ピラーのない領域からピラーのある領域に入る界面をまたいだDNAの移動を模式的に示す平面図である。
【図7】ピラーのない領域からピラーのある領域に入る界面をまたいだDNAの平均速度の測定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
2 泳動用流路
4,6 リザーバ
8 ピラー領域
10 ピラーのない領域
Claims (6)
- 泳動用流路に、伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもち泳動用流路を遮る障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とを泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置することにより、障壁のない領域と障壁領域との界面のうち障壁のない領域が泳動方向の上流側に配置されたものとなる界面を泳動用流路に沿って複数個配置し、
前記泳動用流路の一端側に生体高分子試料を導入し、
前記泳動用流路の両端間に泳動用電圧を印加して前記泳動用流路の一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させることにより、前記生体高分子試料をサイズに応じて分離することを特徴とする生体高分子解析方法。 - 前記障壁領域は泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である請求項1に記載の生体高分子解析方法。
- 前記ピラー領域におけるピラーは、直径が1〜1000nm、ピッチが1〜2000nmである請求項2に記載の生体高分子解析方法。
- 一端側に試料導入部を有し、前記一端側から他端側に向かって試料を電気泳動させるための泳動用電圧が両端間に印加される泳動用流路を備え、
前記泳動用流路には伸びた状態の測定対象生体高分子のみを通過させる隙間をもち泳動用流路を遮る障壁領域と、そのような障壁の設けられていない領域とが前記泳動用流路に沿って交互に繰り返し配置されていることによって、障壁の設けられていない領域と障壁領域との界面のうち障壁のない領域が泳動方向の上流側に配置されたものとなる界面が前記泳動用流路に沿って複数個形成されていることを特徴とする生体高分子解析装置。 - 前記障壁領域は泳動方向に直交する方向に延びた微細な棒状のピラーが高密度に形成されているピラー領域である請求項4に記載の生体高分子解析装置。
- 前記ピラー領域におけるピラーは、直径が1〜1000nm、ピッチが1〜2000nmである請求項5に記載の生体高分子解析装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002320204A JP3979919B2 (ja) | 2002-11-01 | 2002-11-01 | 生体高分子解析方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002320204A JP3979919B2 (ja) | 2002-11-01 | 2002-11-01 | 生体高分子解析方法及び装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004156926A JP2004156926A (ja) | 2004-06-03 |
JP3979919B2 true JP3979919B2 (ja) | 2007-09-19 |
Family
ID=32801191
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002320204A Expired - Fee Related JP3979919B2 (ja) | 2002-11-01 | 2002-11-01 | 生体高分子解析方法及び装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3979919B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005124332A1 (ja) * | 2004-06-15 | 2005-12-29 | Nec Corporation | 電気泳動チップおよび電気泳動装置、ならびに電気泳動方法 |
JP4661125B2 (ja) * | 2004-08-04 | 2011-03-30 | 日立電線株式会社 | 成分分離素子およびその製造方法 |
JP6063693B2 (ja) * | 2012-10-03 | 2017-01-18 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 分析装置及び分析方法 |
JP2014240065A (ja) * | 2013-05-15 | 2014-12-25 | 公立大学法人大阪府立大学 | 流路構造体および流路構造体の製造方法 |
JP6213987B2 (ja) * | 2013-09-19 | 2017-10-18 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | マイクログルコースセンサ |
CN104677972B (zh) * | 2015-02-10 | 2017-02-22 | 四川大学 | 毛细管等速微通道电泳芯片 |
-
2002
- 2002-11-01 JP JP2002320204A patent/JP3979919B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004156926A (ja) | 2004-06-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU698921B2 (en) | Nanofabricated separation matrix for analysis of biopolymers and methods of making and using same | |
US20200150085A1 (en) | Nanofluidic devices for the rapid mapping of whole genomes and related systems and methods of analysis | |
US10471428B2 (en) | Fluidic devices with nanoscale manifolds for molecular transport, related systems and methods of analysis | |
JP6510984B2 (ja) | 巨大分子の制御される捕捉、捕獲、及び輸送の為の統合された構成要素を有するナノ流体の装置、及び関連する分析方法 | |
Levy et al. | DNA manipulation, sorting, and mapping in nanofluidic systems | |
Tegenfeldt et al. | Micro-and nanofluidics for DNA analysis | |
JP4075765B2 (ja) | 分離装置およびその製造方法、ならびに分析システム | |
Sassi et al. | Rapid, parallel separations of D1S80 alleles in a plastic microchannel chip | |
JP2002532715A (ja) | 空間的且つ時間的に変動する電場による荷電粒子の分離 | |
US20110120867A1 (en) | Micro-channel chip for electrophoresis and method for electrophoresis | |
Marie et al. | Nanofluidic devices towards single DNA molecule sequence mapping | |
CN115007231B (zh) | 一种用于细胞-微珠捕获配对的微流控芯片 | |
US6110339A (en) | Nanofabricated separation matrix for analysis of biopolymers and methods of making and using same | |
JP3979919B2 (ja) | 生体高分子解析方法及び装置 | |
JP3977314B2 (ja) | マイクロチップ | |
WO2009005476A1 (en) | Capillary sample separation apparatus | |
JPWO2004008132A1 (ja) | 生体分子分離セル及びその製造方法並びにdna分取装置 | |
Yasui et al. | Nanopillar, nanowall, and nanowire devices for fast separation of biomolecules | |
Roelen | Transducing Signals and Pre-Concentrating Molecules for Enhanced Solid-State Nanopore Biosensing | |
Wang et al. | Biased reptation model with electroosmosis for DNA electrophoresis in microchannels with a sub-micron pillar array | |
Liu et al. | Characterization of molecular transport in poly (dimethylsiloxane) microchannels for electrophoresis fabricated with synchrotron radiation-lithography and UV-photolithography | |
Ye | DNA electrophoresis in colloidal self-assembled arrays | |
Cross et al. | Micro-and Nanofluidics for Biological separations | |
Araki | Electrophoresis of large DNA with a sparse zinc oxide nanowire array. | |
Sanger | microfabricated bioprocessor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040709 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050304 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070206 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070409 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070409 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070626 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070626 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3979919 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100706 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100706 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110706 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110706 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120706 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120706 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130706 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |