JP2009121860A - 生体試料判別用プレート及びそれを用いた生体試料移送方法 - Google Patents

Abstract

【課題】分析装置内部の温度が上昇しても、サンプル定量後のサンプル定量部に不要なサンプルが逆流しない生体試料判別用プレートを提供する。
【解決手段】生体サンプルが注入される注入部と、前記注入部に接続された注入流路と、
前記注入流路に接続された前記生体サンプルを保持するためのサンプル保持部と、前記サンプル保持部に接続された移送流路と、前記移送流路に接続された前記生体サンプルを定量するための定量部とからなり、前記サンプル保持部の前記移送流路側の壁面に互いに隣接した第１の凹部と第２の凹部とを設ける。
【選択図】図４

Description

本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させて得られる輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体試料判別用プレートに関する。

一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。

ＤＮＡの分析方法の一つに電気泳動を用いる電気泳動方法がある。これは、キャピラリー管中にＤＮＡサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を充填し、これらを電気泳動させた際に得られる輸送反応を検出して、ＤＮＡの分析や判定を行う。最近では、取り扱いに技術を有するキャピラリー管から、プレート上に微細な溝を彫ってキャピラリーを形成させ、扱いを容易にした生体試料判別用プレートが開発されている。

このような生体試料判別用プレートには、プレートを回転させることで生じる遠心力を用いて生体サンプルの移送を行うものもある。図８に、この生体サンプル分析用プレートの流路パターンを示す。図示していないが、チャンバー２０９およびチャンバー２０７の上側に生体サンプル分析用プレートの回転中心がある。この回転中心に対して生体サンプルを注入するサンプル注入部２０９の外周側にバッファ部２１６が設けられており、２０９と２１６とは流路２１５で連結されている。このため、サンプル注入口２０８からサンプル注入部２０９へ注入された生体サンプルは、プレートを回転させることにより流路２１５を通りバッファ部２１６に移動する。サンプル保持部２２０とバッファ部２１６は、バッファ２１６部よりも外周側に設けられており、各々流路２１７と流路２１８とで連結されているので、バッファ部２１６に移動した生体サンプルは、プレートを回転させることによりサンプル保持部２２０に達する。ここで、サンプル保持部２２０には空気抜けの通路が無い構成なので、サンプル保持部２２０内の空気は、遠心力により移動してきた生体サンプルによって圧縮される。そのため、プレートの回転を急停止することでサンプル保持部２２０内の圧縮された空気は一気に開放され、その圧力でサンプル保持部２２０内の生体サンプルは流路２１８を内周側に逆流していく。

ここで、流路２１８には流路２１９が連結されており、サンプル保持部２２０は流路２１９によりバッファ部２１６よりも内周側に設けられたチャンバー部２２１に連結されており、連結部とチャンバー部２２１の間にはサンプル定量部２２３が設けられている。このため、プレートの回転を急停止することで、内周方向へ逆流した生体サンプルは流路２１９を通りチャンバー部２２１まで達し、流路２１９とサンプル定量部２２３に生体サンプルが充填された状態になる。次に、再度プレートを回転させることにより流路２１９に充填された生体サンプルはサンプル定量部２２３内に充填された生体サンプルを残し外周側へ移動し、バッファ部２１６及びサンプル保持部２２０へ移動する。これにより一定量の生体サンプルをサンプル定量部２２３に定量することが出来る（例えば、特許文献１参照。）。
国際公開第２００６／０６２１４９号パンフレット

しかしながら、前記従来の構成では、サンプル保持部２２０内部の空気の圧縮膨張を利用してサンプル定量部にサンプルを移送させている。そのため、分析装置内部の温度ムラにより、サンプル定量終了後にサンプル保持部２２０の温度が上昇すると、サンプル保持部２２０内の空気が膨張して、流路２１８や流路２１９に残留している生体サンプルをサンプル定量部２２３の方向へ移送させしまう。その結果、再度、サンプル定量部２２３にサンプルが過剰に供給されるという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、分析装置内部の温度が上昇しても、サンプル定量後のサンプル定量部に不要なサンプルが逆流しない生体試料判別用プレートを提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、生体試料判別用プレート及びそれを用いた生体試料移送方法は、生体サンプルが注入される注入部と、前記注入部に接続された注入流路と、前記注入流路に接続された前記生体サンプルを保持するためのサンプル保持部と、前記サンプル保持部に接続された移送流路と、前記移送流路に接続された前記生体サンプルを定量するための定量部とからなり、前記サンプル保持部の前記移送流路側の壁面に互いに隣接した第１の凹部と第２の凹部とを設けたことを特徴とする。

さらに本発明の生体試料判別用プレート及びそれを用いた生体試料移送方法は、請求項１に記載の生体試料判別用プレートの前記注入部に生体サンプルを注入する生体サンプル注入ステップと、前記注入部の前記生体サンプルを前記サンプル保持部の前記第１の凹部に移送するように前記生体試料判別用プレートを第１の回転で回転させる第１の回転ステップと、前記回転を停止させ前記生体試料判別用プレートを停止させる停止ステップと、前記第１の凹部の前記生体サンプルを前記第２の凹部へ移送させる方向に第２の回転で回転させる第２の回転ステップとからなることを特徴とする。

本発明の生体試料判別用プレート及びそれを用いた生体試料移送方法によれば、サンプル定量後に不要な生体サンプルが送液流路内に残ることがない。そのため、サンプル定量部に供給することができる生体サンプルが存在しないことになる。これにより、分析装置内部の温度上昇により生じるプレート内の空気膨張により生体サンプルがサンプル定量部へ移送されることがないようにすることができる。

以下に、本発明の生体試料判別用プレート、生体試料移送方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
まず、本生体試料判別用プレートの構成について説明する。図１は、本生体試料判別用プレートのパターン形成面を示す図である。本プレート１０１は回転するための軸心１０５を中心にプレートを回転系に固定するための中心孔１０３が設けられており、流路となる幅１００から３００μｍ、深さ５０μｍの溝やチャンバーとなる孔で形成された流路パターン１０２が中心孔１０３の周囲に８個放射状に形成されており、同時に８検体の分析が可能となっている。本プレートの厚みは２ｍｍで、外形は８センチ四方の正方形であり、４角のうち３角はＲが設けられ、残りの１角は面取りされている。更に、位置決め孔１０４が設けられており、外形を非対称にして流路パターンの位置を特定できるようにしている。また、本プレートの材料はポリオレフィン系の樹脂を使用しており、流路形成面にプレートと同材料のフィルムを接着することで密閉流路を形成している。

図２に、生体試料判別用プレート１０１に形成された流路パターン１０２の構成を示す。ＤＮＡサンプルは、サンプル注入口１０８から注入されサンプル注入部１０９に充填される。サンプル注入部１０９は、流路１１５を介してサンプル保持部１１６に接続されており、ＤＮＡサンプルを一時保持する。サンプル保持部１１６からＤＮＡサンプルを定量するためのサンプル定量部１１８には、流路を介して接続されている。サンプル定量部１１８内のＤＮＡサンプルは、後述する緩衝剤を介して電気泳動流路１１４と接続されている。電気泳動時の緩衝剤である分離用ＤＮＡコンジュゲートは、緩衝剤注入口１０６を介して緩衝剤注入部１０７に充填される。緩衝剤は、生体試料判別用プレート１０１の回転に伴い、流路１１０を経由して電気泳動流路１１４に充填される。正電極部１１２と負電極部１１３とは、電気泳動のための電極であり、それぞれ正負の電圧が印加される。

次に、図１および図２を利用して前述した該ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を説明する。

まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。本来ＤＮＡは２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。抽出方法や１本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細説明は省略する。

次に、緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５'末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５'末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。以降に記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤およびＭｇＣｌ₂などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性を持つものとする。

試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲートおよびＤＮＡサンプルをプレート１０１内へ注入する。ＤＮＡコンジュゲートはピペッター等により定量を緩衝剤注入口１０６から緩衝剤注入部１０７へ分注する。ＤＮＡサンプルも同様に定量をサンプル注入口１０８よりサンプル注入部１０９へ分注する。分注量としては、流路パターンのスケールにより異なるが本実施の形態１においては、ＤＮＡコンジュゲートは１８マイクロリットル、ＤＮＡサンプルは２マイクロリットルとする。

次に、プレート１０１をモータ等に固定して、軸心１０５を軸に回転を行う（本実施の形態１では、回転数を２０００ｒｐｍとした。）。この時分注されたＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝剤注入部１０７内のＤＮＡコンジュゲートは流路１１０と流路１１１を通り正電極部１１２と負電極部１１３へ等分され正電極部１１２へ移動したＤＮＡコンジュゲートはさらに電気泳動流路１１４を通りサンプル定量部１１８まで移動する。負電極部１１３へ移動したＤＮＡコンジュゲートも同様に電気泳動流路１１４を通りサンプル定量部１１８まで移動する。

図３は回転開始から２分後における流路パターン１０２のＤＮＡコンジュゲートの状態を示す。斜線部はＤＮＡコンジュゲートを示す。ＤＮＡコンジュゲートは、正電極部１１２および負電極部１１３から電気泳動流路１１４にかけて充填されており、サンプル定量部１１８でＤＮＡサンプルと合流している。このとき、正電極部１１２と負電極部１１３内に存在するＤＮＡコンジュゲートの液面高さとサンプル定量部１１８の液面高さは、プレートの軸心１０５を中心とする同一円周上となる。

ここで、本発明の特徴であるサンプル保持部１１６について図４を用いて詳細に説明する。図４は、サンプル保持部１１６の拡大図である。サンプル保持部１１６は、サンプル注入部１０９よりも外周方向に設けられており、サンプル注入部１０９とは流路１１５により接続されている。サンプル保持部１１６の外周部の内壁には、互いに隣接する受け部１２１と移送部１２２が設けられている。サンプル注入部１０９からの流路１１５は、受け部１２１に対向する内壁に設けられており、移送部には流路１１７が設けられている。更に、受け部１２１と移送部１２２を隔てる壁の受け部１２１側の壁面は傾斜している（本実施の形態１では４０度の傾斜を設けた。）。また、サンプル定量部１１８は、サンプル保持部１１６よりも外周側に設けられおり、流路１１７により接続されている。

次に、ＤＮＡサンプルの移送について説明する。サンプル注入部１０９内のＤＮＡサンプルはプレートを回転させることで発生した遠心力により流路１１５を通り、サンプル保持部１１６へ移送される。注入するＤＮＡサンプル量は、受け部１２１の容積とほぼ同じ量とする。サンプル保持部に接続する流路１１５は、サンプル保持部１１６の受け部１２１に対向する内壁に設けられているため、サンプル保持部１１６に流入したＤＮＡサンプルは受け部１２１へ注入され、受け部１２１内に保持される。

図５はプレート回転後ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態を示す図である。ＤＮＡサンプルはサンプル保持部１１６の受け部１２１に注入されている。本実施の形態１では回転数を２０００ｒｐｍとしたが、回転数は１０００ｒｐｍ以上であればよい。１０００ｒｐｍ未満では、サンプル注入部１０９へ注入されたＤＮＡサンプルにかかる遠心力不足のため、流路１１５へ送り出せずサンプル注入部１０９内に留まっていた。

ＤＮＡサンプルとＤＮＡコンジュゲートの移動が終われば、プレートの回転を停止させる。その後、本実施例では時計回りに回転させるが、このとき、回転方向と回転時の加速度が重要である。まず、回転方向は、受け部１２１が移送部１２２の左側に位置しているので、時計方向の回転が必要である。また、この回転を急加速させて加速度を大きくすることが必要である（本実施例では、この回転を１秒で４０００ｒｐｍになるように急加速した。）。時計方向に急加速することにより、受け部１２１に充填されたＤＮＡサンプルに慣性力が働き、受け部１２１内のＤＮＡサンプルは受け部１２１の斜面となっている壁を乗り越え移送部１２２へ移動する。

この結果を、図６に示す。図６は、プレートの回転を一旦停止した後急加速した直後のＤＮＡサンプルの状態を示す。ＤＮＡサンプルの一部が受け部１２１から移送部１２２へ移送されている。そのため、流路１１７を通ってサンプル定量部１１８へ移送可能な状態となっている。

ここで、本実施の形態１では回転数を４０００ｒｐｍとしているが、３０００ｒｐｍ以上であればよい。これは、３０００ｒｐｍ未満とした場合、受け部１２１内のＤＮＡサンプルにかかる慣性力が不足して移送部１２２へ移送されるＤＮＡサンプルの量がサンプル定量部１１８の容積よりも小さくなってしまうためである。

次に、更に回転を行う。回転をすることにより移送部１２２へ移送されたＤＮＡサンプルはプレートを回転することで生じる遠心力により流路１１７を通り、チャンバー部１１９まで移送される。このとき、サンプル保持部１１６とチャンバー部１１９の間にあるサンプル定量部１１８にＤＮＡサンプルが充填されることになる。プレートを数秒回転させることにより、ＤＮＡサンプルはサンプル定量部１１８を残して全てチャンバー部１１９に移送される。

図７はプレートの回転を停止した後の状態を示す図である。ＤＮＡサンプルはサンプル定量部１１８において電気泳動流路１１４から充填されたＤＮＡコンジュゲートと接している。また、移送部１２２に注入されたＤＮＡサンプルはサンプル定量部１１８を残してすべてチャンバー部１１９へ移送されている。

以上により、サンプル定量部１１８に一定量のＤＮＡサンプルを残留させることができ、サンプル定量部１１８のＤＮＡサンプルが分析をする最終試料となる。

次に、電気泳動を行う。電気泳動は正電極部１１２に正電極、負電極部１１３に負電極を、プレート１０１の外部からフィルムを突き破って挿入して、分離用ＤＮＡコンジュゲートと接触させる。そして数百Ｖの電圧を印加する。すると、電気泳動流路１１４およびサンプル定量部１１８において電界が発生し、サンプル定量部１１８に一定量残存したＤＮＡサンプルは電気泳動流路１１４中を正電極側（図７中Ａ方向）へ移動する。

流路１１４中には分離用ＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプルは分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにＤＮＡサンプル中の正常型ＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと変異型のＤＮＡが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別が行える。

ＤＮＡの検出は、蛍光標識（ＦＩＴＣ）を修飾したＤＮＡを４７０ｎｍの光で励起し、５２０ｎｍ付近の光検出によって行った。ＤＮＡの検出は、２６０ｎｍの吸光度によって行ってもよい。また、電気泳動流路１１４を電気泳動するＤＮＡを、プレート１０１を回転させながら走査して光検出することもできる。

以上のように、実施の形態１においては、サンプル保持部１１６の流路１１７側の壁面に互いに隣接した受け部１２１と移送部１２２を設けた構成とする。更に、プレートの回転を急加速で回転させることで生じる慣性力を利用して生体サンプルを受け部１２１から移送部１２１へ移送することにより、サンプル定量後に流路１１７内に生体サンプルが残ることのないようにすることが出来る。これにより、サンプル定量後に装置内部が温度上昇した際に、プレート内の空気膨張が生じても不要な生体サンプルがサンプル定量部１１８に供給されることがない。

（実施の形態２）
以下、本実施の形態２における生体試料移送方法について、図５から図６を用いて説明する。なお、本実施の形態２で使用する生体試料判別用プレートは実施の形態１で説明したものと同様であるため、生体試料判別用プレートの説明は省略する。実施の形態１と異なる点は、サンプル保持部１１６の受け部１２１内のＤＮＡサンプルを移送部１２２へ移動する方法にある。

図５はプレート回転後ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態を示す図である。ＤＮＡサンプルは、サンプル保持部１１６の受け部１２１に注入されている。

次に、プレートの回転を停止させる。このとき停止を急激にすることが重要である（例えば、本実施の形態２では４０００ｒｐｍから１秒で停止させる。）。プレートの回転を急停止することで、受け部１２１に充填されたＤＮＡサンプルに慣性力が働き、受け部１２１に充填されたＤＮＡサンプルに慣性力が働き、受け部１２１内のＤＮＡサンプルは受け部１２１の斜面となっている壁を乗り越え移送部１２２へ移動する。

図６はプレートの回転を急停止した直後のＤＮＡサンプルの状態を示す図である。ＤＮＡサンプルの一部が受け部１２１から移送部１２２へ移送されている。そのため、流路１１７を通ってサンプル定量部へ移送可能な状態となっている。

ここで、本実施の形態２では回転数を４０００ｒｐｍとしているが、３０００ｒｐｍ以上であればよい。これは、３０００ｒｐｍ未満とした場合、プレートの回転を停止する際に受け部のＤＮＡサンプルにかかる慣性力が不足して移送部１２２へ移送されるサンプル量がサンプル定量部１１８の容積よりも小さくなってしまうためである。

次に、再び回転を行う（例えば、本実施の形態２では回転数３０００ｒｐｍ。）。移送部１２２へ移送されたＤＮＡサンプルはプレートを回転することで生じる遠心力により流路１１７を通り、チャンバー部１１９まで移送される。このとき、サンプル保持部１１６とチャンバー部１１９の間にあるサンプル定量部１１８にＤＮＡサンプルが充填されることになる。プレートを数秒回転させることにより、ＤＮＡサンプルはサンプル定量部１１８を残して全てチャンバー部１１９に移送される。

以上のように、サンプル保持部１１６の流路１１７側の壁面に互いに隣接した受け部１２１と移送部１２２を設けた構成とする。更に、プレートの回転を急停止することで生じる慣性力を利用して生体サンプルを受け部１２１から移送部１２１へ移送することにより、サンプル定量後に流路１１７内に生体サンプルが残ることのないようにすることが出来る。これにより、サンプル定量後に装置内部が温度上昇した際に、プレート内の空気膨張が生じても不要な生体サンプルがサンプル定量部１１８に供給されることがない。

本発明の生体試料判別用プレートは、分析装置内部の温度変化を必要とするＤＮＡサンプル等の生体試料判別装置に有用である。

本発明の実施の形態１における生体試料判別用プレートの流路形成面を示した図 本発明の実施の形態１における生体試料判別用プレートに形成される流路パターンを示した図 本発明の実施の形態１における試料充填処理を施した時のＤＮＡコンジュゲートの状態を示した図 本発明の実施の形態１におけるサンプル保持部の形状を示した図 本発明の実施の形態１における生体試料判別用プレートにおいてサンプル保持部の受け部にＤＮＡサンプルが保持された状態を示した図 本発明の実施の形態１における生体試料判別用プレートにおいてサンプル保持部の移送部にＤＮＡサンプルが移送された状態を示した図 本発明の実施の形態１における生体試料判別用プレートにおいてＤＮＡサンプルがサンプル定量部に定量された状態を示した図 従来の生体試料判別用プレートに形成される流路パターンを示す図

符号の説明

１０１ プレート
１０２ 流路パターン
１０３ 中心孔
１０４ 位置決め孔
１０５ 軸心
１０６ 緩衝剤注入口
１０７ 緩衝剤注入部
１０８ サンプル注入口
１０９ サンプル注入部
１１０ 流路
１１１ 流路
１１２ 正電極部
１１３ 負電極部
１１４ 電気泳動流路
１１５ 流路
１１６ サンプル保持部
１１７ 流路
１１８ サンプル定量部
１１９ チャンバー部
１２０ 流路
１２１ 受け部
１２２ 移送部
２０６ 緩衝剤注入口
２０７ 緩衝剤注入部
２０８ サンプル注入口
２０９ サンプル注入部
２１０ 流路
２１１ 流路
２１２ 正電極部
２１３ 負電極部
２１４ 流路
２１５ 流路
２１６ バッファ部
２１７ 流路
２１８ 流路
２１９ 流路
２２０ サンプル保持部
２２１ チャンバー部
２２２ 流路
２２３ 定量部
２２４ 流路

Claims (10)

1. 生体サンプルが注入される注入部と、
   前記注入部に接続された注入流路と、
   前記注入流路に接続された前記生体サンプルを保持するためのサンプル保持部と、
   前記サンプル保持部に接続された移送流路と、
   前記移送流路に接続された前記生体サンプルを定量するための定量部とからなり、
   前記サンプル保持部の前記移送流路側の壁面に互いに隣接した第１の凹部と第２の凹部とを設けた生体試料判別用プレート。
2. 前記生体試料判別用プレートは、回転可能に構成されており、前記注入部は前記サンプル保持部より内側に配置され、前記定量部は前記サンプル保持部より外側に配置されている請求項１に記載の生体試料判別用プレート。
3. 前記サンプル保持部の前記第１の凹部に対向する内壁には前記注入流路が設けられており、前記第２の凹部の底面に前記移送流路が設けられている請求項１に記載の生体試料判別用プレート。
4. 前記第１の凹部と前記第２の凹部を隔てる壁の前記第１の凹部側の壁面が、傾斜している請求項１に記載の生体試料判別用プレート。
5. 請求項１に記載の生体試料判別用プレートの前記注入部に生体サンプルを注入する生体サンプル注入ステップと、
   前記注入部の前記生体サンプルを前記サンプル保持部の前記第１の凹部に移送するように前記生体試料判別用プレートを第１の回転で回転させる第１の回転ステップと、
   前記回転を停止させ前記生体試料判別用プレートを停止させる停止ステップと、
   前記第１の凹部の前記生体サンプルを前記第２の凹部へ移送させる方向に第２の回転で回転させる第２の回転ステップとからなる生体サンプル移送方法。
6. 前記第１の回転は、回転数１０００ｒｐｍ以上である請求項５に記載の生体試料移送方法。
7. 前記第２の回転ステップにおいて、前記第２の回転は停止状態から１秒で３０００ｒｐｍ以上の加速度で回転させる請求項５に記載の生体試料移送方法。
8. 請求項１に記載の生体試料判別用プレートの前記注入部に生体サンプルを注入する生体サンプル注入ステップと、
   前記注入部の前記生体サンプルを前記サンプル保持部の前記第１の凹部のみに移送するように前記生体試料判別用プレートを回転させる回転ステップと、
   前記第１の凹部の前記生体サンプルを前記凹部へ移送させるように前記回転を停止させる停止とからなる生体試料移送方法。
9. 前記回転は、回転数３０００ｒｐｍ以上である請求項８に記載の生体試料移送方法。
10. 前記停止ステップにおいて、前記停止は回転状態から１秒で停止させる請求項８に記載の生体試料移送方法。

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