ES2633123T3 - Método para la criopreservación de espermatozoides humanos libres de plasma seminal usando un proceso rápido y simple de vitrificación-desvitrificación aséptica - Google Patents

Abstract

Método para la criopreservación de espermatozoides humanos libres de plasma seminal usando un proceso rápido y simple de vitrificación-desvitrificación aséptica, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar espermatozoides libres de líquido seminal; (b) resuspender y mezclar los espermatozoides obtenidos en la etapa (a) en una proporción volumétrica de 1:1 con un medio de vitrificación que comprende: i) medio de tamponamiento para espermatozoides, ii) un crioprotector no permeable con una concentración final de 0,15 a 0,30 M, y iii) un suero suplementado con dextrano (c) mezclar y ajustar la concentración final de los espermatozoides a un intervalo de 0,2 x 106 a 1,8 x 106 espermatozoides por 100 μl de dicho medio de vitrificación; (d) colocar 100 μl de la mezcla de espermatozoides y medio de vitrificación inmediatamente después de la etapa (c) en una pajuela de 0,25 ml, dejando 1 cm libre de líquido en ambos extremos, colocando esta primera pajuela dentro de una segunda pajuela de 0,5 ml para sellar en ambos extremos, colocando la primera y la segunda pajuela de manera horizontal en un receptáculo termoconductor; (e) sumergir la pajuela de 0,5 ml resultante de la etapa d) con el contenido espermático en posición horizontal en N2 líquido; (f) mantener la muestra de esperma dentro de las pajuelas a una temperatura entre -75 ºC y -85 ºC; (g) desvitrificar la muestra mediante introducción de la pajuela que contiene la muestra de esperma en un medio de desvitrificación que comprende; i) medio de tamponamiento para espermatozoides, ii) fluido tubal humano suplementado con albúmina de suero bovino al 1 % de p/v, y iii) un suero suplementado con dextrano; en donde la desvitrificación se lleva a cabo primero colocando las muestras a desvitrificar en un recipiente con N2 líquido y después introduciendo tres pajuelas de 0,25 ml con muestra en un tubo con 5 ml de medio de desvitrificación incubado a una temperatura que oscila de 36,5 a 37,5 ºC en un bloque de calefacción.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la criopreservacion de espermatozoides humanos libres de plasma seminal usando un proceso rapido y simple de vitrificacion-desvitrificacion aseptica.

La invencion desvela un metodo de criopreservacion en etapas que implican la vitrificacion y desvitrificacion de espermatozoides humanos y su uso como una metodologla aseptica, rapida y simple que se puede usar para la conservacion de espermatozoides criopreservados que se implementa facilmente en laboratorios sin requerimiento de un almacenamiento en N2 llquido ya que pueden ser almacenados a -80°C. Estas condiciones son favorables para los laboratorios de reproduccion asistida en general, dado que implica una alta reduccion de los costes en la etapa de conservacion, principalmente debido a los largos perlodos en los que los espermatozoides deben estar criopreservados en bancos de esperma mantenidos en estos laboratorios.

Antecedentes de la invencion

Las tecnicas convencionales para criopreservacion de celulas de mamlfero se asocian generalmente con desventajas que disminuyen el posible uso de estas celulas en el ambito cllnico y de la investigacion.

Concretamente, la congelacion de espermatozoides es la tecnica mas ampliamente utilizada en reproduccion asistida para preservar los gametos masculinos y proporcionar la oportunidad para fecundaciones futuras (Sanger y col., 1992). El principal deterioro comunicado causado por la criopreservacion en los espermatozoides humanos, es una marcada reduccion en la motilidad (Critser y col., 1988). La causa principal de dano celular producido durante la criopreservacion se debe a la formacion de cristales de hielo intracelulares (Muldrew y McGann, 1990). Este dano celular implica la rotura irreversible de las membranas plasmatica y nuclear con una posterior alteracion de los organulos celulares (Brotherton, 1990).

Los metodos tradicionales de congelacion de espermatozoides utilizan crioprotectores intracelulares porque tienen la capacidad de permeabilizar la membrana plasmatica y son capaces de penetrar en la celula. La eficacia asociada a la funcion espermatica utilizando este tipo de crioprotectores es baja, con un maximo del 45 % de conservacion de al menos una funcion celular relevante que es importante para este tipo de celulas como es su motilidad, ya que los crioprotectores permeables son criotoxicos y provocan dano en los organulos intracelulares y en la membrana plasmatica, disminuyendo notablemente la capacidad de fecundacion del espermatozoide. Ademas, esta tecnica tiene un coste elevado debido al tipo de medios utilizados y a la prolongada conservacion en N2 llquido, y por tanto, su utilizacion se limita a la poblacion de mayores ingresos o a programas con costes que no estan cubiertos por el sistema sanitario, como en los palses desarrollados.

La vitrificacion es un metodo de criopreservacion extremadamente rapido que requiere menos tiempo de ejecucion, es mas seguro y tiene un menor coste efectivo que la congelacion tradicional. La vitrificacion se ha investigado de manera amplia en embriones y oocitos (Chen y col., 2001; Isachenko y col., 2005), pero esta menos desarrollada en espermatozoides, se pueden encontrar pocas publicaciones sobre este tema (Isachenko y col., 2004; Isachenko y col., 2008). En estas ultimas publicaciones, los autores, que tambien son los inventores de la presente invencion, desarrollaron las bases para un metodo de criopreservacion en espermatozoides, libre de criopreservantes toxicos. Sin embargo esta metodologla no es aseptica, y no posee las caracterlsticas de simpleza y eficacia que, de hecho, si se proporcionan mediante la composicion optima de los medios de la presente invencion.

Este metodo es similar a formacion de vidrio, que es una propiedad intrlnseca de todos los llquidos que solo se necesita una velocidad de enfriamiento lo suficientemente rapida como para evitar el paso a traves de la fase cristalina. Por ese motivo, la vitrificacion no provoca un acercamiento de las moleculas de protelnas entre si como en la congelacion tradicional (Levitt, 1966), lo que evita la formacion de puentes disulfuros que producen la desnaturalizacion de las protelnas (Fahy y col., 1984).

La vitrificacion se lleva a cabo en volumenes pequenos, de tal forma que la muestra se sumerge directamente en nitrogeno llquido, para aumentar la velocidad de enfriamiento y disminuir la formacion de cristales de hielo (Nawroth y cols., 2002). Esto contribuye aun mas a facilitar la metodologla y los costes de la vitrificacion de espermatozoides, ya que no requiere equipos criobiologicos especiales. Asimismo permite una conservacion adecuada de la motilidad espermatica, pero la ventaja mas significativa en esta tecnica es que no dana al ADN espermatico.

La solicitud de patente US20080026361, presentada en 2007, desvela una composicion que comprende un crioprotector, una membrana protectora que estabiliza o asiste en la estabilizacion de las membranas de los espermatozoides y un secuestrador de radicales, en donde el crioprotector es un azucar, tal como sacarosa, la membrana protectora puede ser un agente proteico o un agente no proteico o una combinacion de los mismos, siendo la albumina un ejemplo de un posible agente proteico, y el secuestrador de radicales puede ser un agente reductor o un antioxidante. Esta publicacion describe un kit que comprende una composicion de vitrificacion, un recipiente aislante, un envase criogenico, un receptaculo para los espermatozoides, tal como pajuelas, ampollas de

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vidrio, criotubos o crioviales. Sin embargo, la solicitud de patente US20080026361 utiliza una solucion crioprotectora con una composicion distinta a la de la presente invention; usando un medio que principalmente contiene glicerol (TYB) y opcionalmente suplementado con monotioglicerol.

La solicitud de patente US20090305224 (familia de WO2007120829) presentada en 2009, describe un metodo para la criopreservacion de celulas de mamlferos tales como oocitos, hepatocitos, celulas madre, embriones o cigotos, utiles como herramienta cllnica o para la investigation (por ejemplo tecnologla reproductiva, trasplante de celulas, ingenierla de tejidos o medicina regenerativa). La publication se centra en la determination de los parametros de rendimiento termico de distintos materiales y soluciones, tales como la conductividad termica de diversos materiales, principalmente cuarzo. Por otra parte, el documento US20090305224 no ejemplifica el uso del metodo propuesto para la vitrification especlfica de espermatozoides humanos y no ejemplifica los materiales de las pajuelas de la presente invencion, dado que el uso de cuarzo no solo aumenta los costes asociados, sino que tambien restringe la portabilidad y aplicabilidad de receptaculos conductores termicos de este material en un kit comercial.

El artlculo “Impact of three different cryoprotectant on the motility of post-thaw human sperm” (Hu y cols, 2007) se centra en la comparacion de los niveles de efecto de un crioprotector de glucosa o crioprotectores con diferentes concentraciones de sacarosa en la motilidad de espermatozoides humanos tras la descongelacion. En el estudio no se observaron grandes diferencias con otros crioprotectores cuando se uso glucosa como un crioprotector, en una concentration de 0,1 M. Sin embargo cuando se uso sacarosa en una concentration de 0,2 M, se observo una significativa disminucion en los danos de los espermatozoides en comparacion con otros crioprotectores. Sorprendentemente, el uso de una concentracion de sacarosa en un intervalo mayor que 0,2 M constituye una concentracion optima para el medio de vitrificacion para espermatozoides del metodo de la presente invencion.

El documento EP 2156735 A1 ensena sobre un instrumento descrito como una pajuela de tres miembros para el almacenamiento de muestras biologicas vitrificadas, y el metodo relacionado. El metodo comprende dos crioprotectores diferentes llamados solucion no vitrificante (VS1) y solucion vitrificante (VS2). VS1 y VS2 es una nomenclatura usada tlpicamente en los kits comerciales de vitrificacion de oocitos y embriones, VS1 se corresponde con una solucion deshidratante y VS2 con una solucion de vitrificacion que contiene los crioprotectores.

El artlculo “Acrosomal status and mitochondrial activity of human spermatozoa vitrified with sucrose” (Isachencko y cols., Reproduction, 2008, Vol. 136, n.° 2, p. 167-173, XP055265907) investiga la capacidad de la sacarosa como crioprotector de espermatozoides frente al dano mitocondrial, y su efecto en la reaction de criocapacitacion y acrosomal, durante la vitrificacion. Fue la primera tecnica en lograr niveles adecuados de la funcion espermatica en seres humanos, pero por vitrificacion no aseptica.

El documento 2009/081782 ensena un metodo de vitrificacion de oocitos humanos.

El documento US 2006/046243 A1 ensena sobre un metodo de criopreservacion que pretende vitrificar celulas de mamlfero. El procedimiento incluye la selection de espermatozoides usando distintos medios de cultivo, donde un medio particular comprende HTF (Fluido Tubal Humano) suplementado con sacarosa 0,25 M y HSA (albumina de suero humano) al 1 %. Tras la vitrificacion se evaluaron distintas propiedades funcionales de los espermatozoides, y el artlculo concluye que el medio con sacarosa fue significativamente mejor para conservar la motilidad progresiva de los espermatozoides tras la desvitrificacion. La metodologla que se ha usado para vitrificar la suspension celular consistio en esferas vitrificantes de 30 gl que se echaron directamente al nitrogeno llquido, siendo esta una metodologla eficaz pero no aseptica, ya que las gotas entraban directamente en contacto con el nitrogeno llquido. Sorprendentemente, el uso del metodo de la presente invencion, ademas de ser aseptico, permite la preservation de un volumen de hasta 100 gl, y por tanto, es un metodo mas eficaz cuando estan disponibles mayores volumenes de muestra.

Las tecnicas utilizadas para la congelation de espermatozoides requieren de un equipamiento especlfico y de nitrogeno llquido para la mantener las muestras durante algun tiempo, lo que implica un alto coste. Por lo tanto, el acceso a esta alternativa de conservation se limita a un pequeno grupo de pacientes que se pueden permitir el procedimiento. La tecnica convencional de congelacion tiene una baja tasa de recuperation de espermatozoides moviles y funcionales, dado a que se congela toda la muestra de llquido seminal (espermatozoides + plasma seminal) junto con todos los contaminantes biologicos (bacterias, hongos y virus) que pudieran estar presentes.

La presente invencion resuelve el problema de la tecnica optimizando el uso de materiales y tiempo implicados en la criopreservacion mediante vitrificacion, permitiendo obtener mejores resultados usando una suspension de espermatozoides vitrificados en sacarosa 0,25 M, con un alto porcentaje de espermatozoides moviles, viables que tienen una integridad del acrosoma mayor del 80 % tras la desvitrificacion. El uso de sacarosa en lugar de otros criopreservantes evita el dano osmotico y la cristalizacion. Mas importante aun, los espermatozoides vitrificados en sacarosa conservaron una mejor funcion espermatica, ya que mas del 60 % presentaba un potencial de membrana mitocondrial (A^MMit) sin alteration. El parametro de medicion A^MMit es la forma mas sensible para evaluar la funcion de los espermatozoides (Marchetti y cols., 2002).

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La tecnica de criopreservacion de la presente invencion implica la vitrificacion solo de espermatozoides moviles seleccionados usando tecnicas de seleccion espermatica, de tal manera que se eliminan espermatozoides anormales o danados y las celulas infiltradas, as! como todo el plasma seminal.

Por otra parte, hace posible la criopreservacion de la funcion espermatica de manera altamente eficaz, usando un kit de vitrificacion para espermatozoides humanos cuya formulacion sin crioprotectores permeables que es capaz de proteger la integridad y la funcion reproductiva sin requerir equipamiento especial para el almacenamiento. Tambien sera posible implementar una tecnica de vitrificacion facilmente aplicable para los espermatozoides usando un kit de vitrificacion con un coste de al menos el 50 % menor que el coste de un kit de congelacion tradicional para un mercado demandante en palses desarrollados que actualmente usa el metodo convencional de congelacion. Asimismo, este bajo coste permitira su uso y distribution a palses en vlas de desarrollo.

Description detallada de la invencion

La presente invencion desvela un metodo para la criopreservacion de espermatozoides libres de plasma seminal usando vitrificacion y desvitrificacion de espermatozoides humanos que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar espermatozoides libres de llquido seminal,

(b) resuspender y mezclar los espermatozoides en una proportion volumetrica de 1:1 con un medio de vitrificacion que comprende:

i) medio de tamponamiento para espermatozoides

ii) un crioprotector no permeable con una concentration final de 0,15 a 0,30 M y

iii) un suero suplementado con dextrano;

(c) mezclar y ajustar la concentracion final de espermatozoides a un intervalo de 0,2 x 106 a 1,8 x 106 de espermatozoides por 100 pl de dicho medio de vitrificacion.

(d) colocar 100 pl de la suspension de espermatozoides y medio de vitrificacion inmediatamente despues de la etapa (c) en una pajuela de 0,25 ml, dejando 1 cm libre de llquido en ambos extremos, colocando esta primera pajuela dentro de una segunda pajuela de 0,5 ml que se sella en ambos extremos, colocando la primera y segunda pajuelas de manera horizontal en un receptaculo termoconductor.

(e) sumergir dicha pajuela sellada de 0,5 ml con el contenido espermatico en position horizontal en N2 llquido;

(f) mantener la muestra de esperma dentro de las pajuelas a una temperatura entre -75 °C y -85 °C;

(g) desvitrificar la muestra introduciendo la pajuela de 0,25 ml que contiene la muestra vitrificada en un medio de desvitrificacion que comprende:

i) medio de tamponamiento para espermatozoides,

ii) fluido tubal humano suplementado con el 1 % en peso/volumen de albumina de suero bovino y

iii) un suero suplementado con dextrano.

donde la desvitrificacion se lleva a cabo, primero colocando las muestras que se desean desvitrificar en un recipiente con N2 llquido, y despues, introduciendo tres (3) pajuelas de 0,25 ml con muestra en un tubo con 5 ml de medio de desvitrificacion incubado a una temperatura que oscila de 36,5 a 37,5 °C en un bloque de calefaccion.

Como alternativa, se puede llevar a cabo una etapa adicional que comprende: centrifugar a la muestra a 1.800 rpm durante 5 minutos, para eliminar el medio de desvitrificacion; posteriormente, resuspender la muestra libre de sobrenadante en medio para espermatozoides y evaluar la motilidad de los espermatozoides; y utilizar para la tecnica de reproduction deseada.

El uso del metodo de la presente invencion se destaca para el tratamiento de trastornos relacionados con fracasos reproductivos o en pacientes que se esten sometiendo a un tratamiento de reproduccion asistida, y tambien en pacientes que requieren la conservation de su capacidad de fecundation en determinadas patologias tales como cancer o infecciones viricas tales como VIH que amenacen su capacidad reproductiva.

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Ejemplos de aplicacion

Vitrificacion aseptica de espermatozoides

Las muestras de Kquido seminal se obtuvieron de pacientes en un periodo de abstinencia sexual de al menos 48 horas antes de la recogida de la muestra, con la previa firma del consentimiento informado. Todas las muestras contenian al menos 20.000.000 de espermatozoides por ml; el 50 % de los mismos teniendo una motilidad progresiva y una morfologia normal < al 15 %. Las muestras de liquido seminal normozooespermico se seleccionaron usando la tecnica de “swim up”. Esta tecnica permite la obtencion de fracciones de espermatozoides con los niveles mas altos de actividad y viabilidad.

Se resuspendieron los espermatozoides en Medio de Vitrisperm; preparado a partir de 0,495 ml de medio de tampon para gametos (COOK®); 0,495 ml de solucion de sacarosa 0,5 M (MP Biomedicals, Cat. 152584); y 0,010 ml de un suero suplementado con dextrano (IrvineScientific, Cat. 9301).

Los espermatozoides seleccionados se mezclaron con el medio de vitrificacion (en una proporcion columetrica de 1:1) solo antes del proceso de vitrificacion, dado que no es aconsejable someter a las celulas al medio de vitrificacion durante mucho tiempo, y se ajusto la concentration final a 0,5 x 106 - 1,8 x 106 espermatozoides por 100 pl de medio de vitrificacion. Posteriormente, con ayuda de un dispositivo de pipeteo, se colocaron 100 pl de la suspension en cada pajuela de 0,25 ml dejando un espacio de 1 cm en cada extremo.

Posteriormente se introdujo horizontalmente la pajuela de 0,25 ml dentro de la pajuela de 0,5 ml y los extremos abiertos de la pajuela de 0,5 ml se sellaron. Es importante mantener siempre la position horizontal de la pajuela desde la etapa de llenado hasta su sumersion en N2 liquido.

Desvitrificacion aseptica de espermatozoides

Se relleno un recipiente con N2 Kquido y las pajuelas a desvitrificar se pusieron dentro. De manera simultanea, 5 ml de medio de desvitrificacion que contiene 4,95 ml de tampon de gametos (COOK®) y 0,05 ml del suero suplementado con dextrano (IrvineScientific, Cat.9301) se equilibraron a 37 °C.

Se coloco cerca del recipiente un bloque de calefaccion (bano de agua) a 37 °C con los tubos con 5 ml de medio de desvitrificacion. Se utilizo 1 tubo con 5 ml de medio por cada 3 pajuelas.

Utilizando pinzas se sacaron una a una las pajuelas del N2 liquido, la pajuela de 0,5 ml se corto por el lugar con un extremo marcado, y la pajuela de 0,25 ml se dejo caer en el medio de desvitrificacion, invirtiendo la pajuela de 0,5 ml previamente cortada, ayudando en el proceso con el movimiento de la pajuela con la ayuda de unas pinzas esteriles. La pajuela de 0,25 ml se estabilizo en el medio durante al menos 5 minutos con incubation a 37 °C. El medio se centrifugo a 1.800 rpm durante 5 minutos para concentrar y eliminar el sobrenadante. El sedimento se lavo una vez con medio para espermatozoides (tampon de gametos) y luego se aplico una tecnica de selection, o inmediatamente se realizaron los ensayos para evaluar el estado de los espermatozoides tras la vitrificacion.

Evaluation de la calidad espermatica

Se contrastaron diversos parametros de calidad espermatica, principalmente la motilidad espermatica y la viabilidad, para las condiciones de: una muestra control sin criopreservar, la muestra sometida al proceso de vitrificacion/desvitrificacion tal como se ensena en los primeros ejemplos; y una muestra congelada/descongelada en N2 Kquido con un crioprotector comercial (metodo de congelation tradicional). Todos los ensayos descritos en la siguiente section se realizaron en un citometro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson).

La motilidad se midio utilizando una camara Makler. La movilidad se estimo usando microscopio de luz con 400X de aumento. Se midio este parametro solo para los espermatozoides que tienen motilidad progresiva de categorias a y b (a, progresion rapida y lineal; b, progresion lenta y lineal).

La integridad de la membrana acrosomal se determino utilizando el kit comercial PSA-FITC Sigma L-2857. Mientras que la criocapacitacion espermatica se determino midiendo la translocation de fosfatidil-serina, usando el kit comercial ANEXINA V-FITC APOPTEST™- FITC (Nexins Research).

Ademas el potencial de membrana mitocondrial (A^MMit), se midio utilizando un unico colorante cationico conocido como JC-1 (Smiley y cols, 1991). El ensayo se llevo a cabo de acuerdo con las condiciones de un kit comercial para la detection de la permeabilidad de membrana mitocondrial (Kit AK-116, Mit-E-^, BIOMOL International LP).

Los resultados obtenidos de estos cuatro ensayos se presentan en porcentajes en la siguiente tabla resumen.

Ensayo

Resultado % Condicion de la muestra

Control Vitrificacion Congelacion

Translocacion de fosfatidil-serina

promedio 1,555 1,59 20,05

desviacion estandar

1,027 0,9317 1,06

Perdida de la integridad de la membrana

promedio 3,43 28,03 41,43

desviacion estandar

3,459 6,919 1,688

Potencial de membrana mitocondrial

promedio 89,3 71,65 29,45

desviacion estandar

10,49 1,708 4,342

Motilidad

promedio 95,78 77,72 28,32

desviacion estandar

1,704 2,26 3,408

A partir de la tabla anterior, los resultados sorprendentes del metodo utilizado en la presente invencion destacan con respecto a la tecnica de congelacion que se usa comunmente en los laboratorios. En estos resultados, la translocacion de fosfatidil-serina indica un comportamiento que es muy similar al de una muestra reciente que no se 5 ha vitrificado. La perdida de integridad de membrana acrosomal es menor a la obtenida con la metodologla de congelacion, en donde el valor de A^MMit de la muestra vitrificada/desvitrificada es muy similar con el valor correspondiente de la muestra control. Tambien se puede observar que la perdida de motilidad de la muestra vitrificada es mucho menor que la de la muestra congelada.

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para la criopreservacion de espermatozoides humanos libres de plasma seminal usando un proceso rapido y simple de vitrificacion-desvitrificacion aseptica, comprendiendo dicho metodo:

(a) proporcionar espermatozoides libres de llquido seminal;

(b) resuspender y mezclar los espermatozoides obtenidos en la etapa (a) en una proporcion volumetrica de 1:1 con un medio de vitrificacion que comprende:

i) medio de tamponamiento para espermatozoides,

ii) un crioprotector no permeable con una concentracion final de 0,15 a 0,30 M, y

iii) un suero suplementado con dextrano

(c) mezclar y ajustar la concentracion final de los espermatozoides a un intervalo de 0,2 x 106 a 1,8 x 106 espermatozoides por 100 pl de dicho medio de vitrificacion;

(d) colocar 100 pl de la mezcla de espermatozoides y medio de vitrificacion inmediatamente despues de la etapa (c) en una pajuela de 0,25 ml, dejando 1 cm libre de llquido en ambos extremos, colocando esta primera pajuela dentro de una segunda pajuela de 0,5 ml para sellar en ambos extremos, colocando la primera y la segunda pajuela de manera horizontal en un receptaculo termoconductor;

(e) sumergir la pajuela de 0,5 ml resultante de la etapa d) con el contenido espermatico en posicion horizontal en N2 llquido;

(f) mantener la muestra de esperma dentro de las pajuelas a una temperatura entre -75 °C y -85 °C;

(g) desvitrificar la muestra mediante introduccion de la pajuela que contiene la muestra de esperma en un medio de desvitrificacion que comprende;

i) medio de tamponamiento para espermatozoides,

ii) fluido tubal humano suplementado con albumina de suero bovino al 1 % de p/v, y

iii) un suero suplementado con dextrano;

en donde la desvitrificacion se lleva a cabo primero colocando las muestras a desvitrificar en un recipiente con N2 llquido y despues introduciendo tres pajuelas de 0,25 ml con muestra en un tubo con 5 ml de medio de desvitrificacion incubado a una temperatura que oscila de 36,5 a 37,5 °C en un bloque de calefaccion.

2. Metodo para la criopreservacion de espermatozoides de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el crioprotector no permeable de la etapa (b) es sacarosa.

3. Metodo para la criopreservacion de espermatozoides de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la cantidad final de espermatozoides en la etapa (c) se ajusta en un intervalo de 0,5 x 106 a 1,8 x 106.

4. Metodo para la criopreservacion de espermatozoides de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde durante la etapa de vitrificacion de la etapa (d) el material termoconductor del receptaculo es plastico.

5. Metodo para la criopreservacion de espermatozoides de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha sumersion en N2 llquido de la etapa (e) se hace durante 5 segundos.