ES2204804T3 - Composiciones proteinicas matriciales para enfermedades inflamatorias e infeccioas. - Google Patents
Composiciones proteinicas matriciales para enfermedades inflamatorias e infeccioas.Info
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Abstract
El uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una infección.
Description
Composiciones proteínicas matriciales para
enfermedades inflamatorias e infecciosas.
La invención se refiere al uso de matrices de
esmalte, derivados de la matriz de esmalte y/o proteínas de la
matriz de esmalte como agentes terapéuticos o profilácticos. Las
sustancias son activas como agentes antibacterianos y/o
antiinflamatorios.
Las proteínas de la matriz de esmalte tales como
las presentes en las matrices de esmalte son conocidas como
precursoras de esmalte. Las proteínas de esmalte y los derivados de
la matriz de esmalte se han descrito previamente en la literatura de
patentes para inducir la formación de tejido duro (es decir,
formación de esmalte, Patente de Estados Unidos Nº 4.672.032
(Slavkin)) o la unión entre tejidos duros (documentos
EP-B-O 337 967 y
EP-B-0 263 086). De esta forma, la
técnica anterior está centrada exclusivamente en la regeneración de
tejidos duros, mientras que la presente solicitud se refiere a
efectos antibacterianos y antiinflamatorios, que son descubrimientos
inesperados.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la matriz de esmalte, los derivados de la
matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte (en
término "una sustancia de esmalte activa" también se usa en lo
sucesivo para designar una matriz del esmalte, un derivado de la
matriz de esmalte, o una proteína de la matriz de esmalte) son
agentes beneficiosos en tejidos blandos (es decir, tejidos no
mineralizados) tales como tejidos que contienen colágeno o epitelio,
incluyendo piel y mucosa, músculo, vasos sanguíneos y linfáticos,
tejido nervioso, glándulas, tendones, ojos y cartílago.
Además, se ha descubierto que la matriz de
esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de
la matriz de esmalte tienen propiedades antibacterianas y/o
antiinflamatorias que pueden usarse para el tratamiento de
enfermedades en tejido blando y duro (es decir, mineralizado).
Las heridas y/o úlceras se encuentran normalmente
sobresaliendo de la piel o en una superficie de mucosa o como
resultado de un infarto en un órgano ("ataque"). Una herida
puede ser resultado de un defecto o una lesión en un tejido blando
o de una enfermedad subyacente. La regeneración de heridos
periodontales provocadas experimentalmente ha sido descrita por los
inventores y no pretende estar dentro del alcance de la presente
invención. En el presente contexto, el término "piel" se
refiere a la superficie más exterior del cuerpo de un animal,
incluyendo un ser humano, y abarca piel intacta o prácticamente
intacta así como una superficie de piel dañada. El término
"mucosa" se refiere a una mucosa dañada o no dañada de un
animal tal como un ser humano y puede ser la mucosa oral, bucal,
aural, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal, o
rectal.
En el presente contexto, el término "herida"
denota un daño corporal con ruptura de la integridad normal de las
estructuras del tejido. El término también pretende abarcar los
términos "llaga", "necrosis" y "úlcera". Normalmente,
el término "llaga" es un término popular para casi cualquier
lesión de la piel o membranas mucosas y el término "úlcera" es
un defecto o excavación local de la superficie de un órgano o
tejido, que se produce por el cambio de tejido necrótico. Lesión se
refiere generalmente a cualquier defecto en un tejido. Necrosis se
refiere a tejido muerto como resultado de una infección, daño,
inflamación o infarto.
El término "herida" como se usa en el
presente contexto denota cualquier herida (véase a continuación la
clasificación de las heridas) y en cualquier etapa particular del
proceso de cura incluyendo la etapa antes de que se haya iniciado la
cura o incluso antes de realizar una herida específica como una
incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico).
Algunos ejemplos de heridas son, por ejemplo,
heridas asépticas, contusiones, incisiones, laceraciones, heridas no
penetrantes (es decir, heridas en las que no hay ruptura de la piel
pero si hay daño en las estructuras subyacentes), heridas abiertas,
heridas penetrantes, perforaciones, pinchazos, heridas sépticas,
heridas subcutáneas, etc. Algunos ejemplos de llagas son llagas por
decúbito, estomatitis ulcerosa, llagas de cromo, llagas frías,
llagas de presión, etc. Algunos ejemplos de úlceras son, por
ejemplo, úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera
gotosa, úlcera diabética, úlcera hipertensiva isquémica, úlcera de
estasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual,
úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera
tropical, úlcera venérea, por ejemplo la causada por gonorrea
(incluyendo uretritis, endocervicitis y proctitis). Algunas
enfermedades relacionadas con heridas o llagas que pueden tratarse
satisfactoriamente de acuerdo con la invención son quemaduras,
carbunco, tétanos, gangrena, escarlatina, erisipelas, sicosis
barbae, foliculitis, impetigo contaginosa o impetigo bullosa, etc.
A menudo hay una solapamiento entre el uso de los términos
"herida" y "úlcera" y "herida" y "llaga" y,
además, los términos se usan a menudo aleatoriamente. Por lo tanto,
como se ha mencionado anteriormente, en el presente contexto, el
término "herida" abarca los términos "úlcera",
"lesión", "llaga", e "infarto", y los términos se
usan de forma indiscriminada a menos que se indique de otra
forma.
Las heridas de acuerdo con la invención también
incluyen: i) heridas generales tales como, por ejemplo, quirúrgicas,
traumáticas, infecciosas, isquémicas, termales, químicas y bulosas;
ii) heridas específicas de la cavidad oral tales como, por ejemplo,
heridas post-extracción, heridas endodónticas
especialmente en el tratamiento de quistes y flemones, úlceras y
lesiones de origen bacteriano, vírico o autoinmunológico, heridas
mecánicas, químicas, térmicas, infecciosas y liquenoides; úlceras de
herpes, estomatitis aftosa, gingivitis aguda necrosante ulcerativa
y síndrome de quemaduras en la boca son ejemplos específicos; y iii)
heridas en la piel tales como, por ejemplo neoplasma, quemaduras,
(por ejemplo, químicas, térmicas), lesiones (bacterianas, víricas,
autoinmunológicas), mordeduras e incisiones quirúrgicas. Otra forma
de clasificar heridas es como i) pérdida de tejido pequeña debida a
incisiones quirúrgicas, abrasión leve, y mordeduras leves, o como
ii) pérdida de tejido significativa. El último grupo incluye
úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, laceraciones,
mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas de donantes (en
tejidos blandos y duros) e infartos.
Las heridas pueden estar presentes en la cavidad
oral. Tales heridas pueden ser daños corporales o traumas asociados
con la cirugía oral incluyendo cirugía periodontal, extracción de
diente(s), tratamiento endodóntico, inserción de implantes
dentales, aplicaciones y uso de prótesis dentales, y similares. En
la sección experimental de este documento se ha demostrado el efecto
beneficioso de una sustancia de esmalte en tales heridas.
Otras heridas que son importantes en relación con
la presente invención son heridas como úlceras isquémicas, llagas de
presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas, y heridas
de donantes.
El término "piel" se usa en un sentido muy
amplio que abarca la capa de la epidermis y -en aquellos casos en
los que la piel está más o menos dañada- también la capa de dermis
de la piel. Aparte de estrato corneo, la capa epidérmica de la piel
es la capa exterior (epitelial) y la capa más profunda de tejido
conectivo de la piel se denomina dermis.
Como la piel es la parte más expuesta del cuerpo,
es particularmente susceptible a distintos tipos de heridas tales
como, por ejemplo, rupturas, cortes, abrasiones, quemaduras y
congelaciones o daños que surgen de distintas enfermedades. Además,
se destruye mucha piel en accidentes. Sin embargo, dada la
importante función de barrera y fisiológica de la piel, la
integridad de la piel es importante para el bienestar del
individuo, y cualquier corte o ruptura representa una amenaza a la
que se debe enfrentar el cuerpo para proteger su existencia
continuada.
Aparte de las heridas de la piel, las heridas
también pueden estar presentes en todo tipo de tejidos (es decir,
tejidos blandos y duros). Las heridas en tejidos blandos incluyendo
membranas mucosas y/o piel son especialmente relevantes en relación
con la presente invención.
La cura de una herida en la piel o en una
membrana mucosa pasa por una serie de etapas que tienen como
resultado la reparación o regeneración de la piel o de la membrana
mucosa. En los últimos años, se han distinguido regeneración y
reparación como los dos tipos de cura que pueden tener lugar. La
regeneración puede definirse como un proceso biológico en el que la
arquitectura y función del tejido perdido se renuevan
completamente. La reparación, por otro lado, es un proceso biológico
en el que se recupera la continuidad del tejido roto con tejidos
nuevos que no replican la estructura y función del tejido
perdido.
La mayoría de heridas se curan por reparación, lo
que significa que el tejido nuevo formado es estructural y
químicamente distinto del tejido original (cicatriz). Un proceso
que está casi siempre implicado en las primeras etapas de la
reparación del tejido es la formación de un tejido conectivo
transitorio en el área de la herida. El proceso empieza con la
formación de una nueva matriz extracelular de colágeno por los
fibroblastos. Esta nueva matriz extracelular de colágeno es el
soporte para un tejido conectivo durante el proceso final de cura.
La cura final es, en la mayoría de los tejidos, la formación de una
cicatriz que contiene tejido conectivo. En los tejidos que tienen
propiedades regenerativas, tales como, por ejemplo, piel y hueso, la
cura final incluye la regeneración del tejido original. Este tejido
regenerado también tiene normalmente algunas características de
cicatriz, por ejemplo, un aumento en el espesor de la fractura en
el hueso curado.
En circunstancias normales, el cuerpo proporciona
mecanismos para curar piel o mucosa dañada para recuperar la
integridad del la barrera de piel o de la mucosa. El proceso de
reparación, incluso para rupturas o heridas leves, puede llevar un
periodo de tiempo que se extiende de horas y días a semanas. Sin
embargo, en las ulceraciones, la cura puede ser muy lenta y la
herida puede persistir durante un periodo de tiempo prolongado, es
decir, meses o incluso años.
Las etapas de la cura de heridas incluyen
normalmente inflamación (normalmente 1-3 días),
migración (normalmente 1-6 días), proliferación
(normalmente 3-24 días) y maduración (normalmente de
1-12 meses). El proceso de cura es un proceso
fisiológico complejo y bien orquestado que implica migración,
proliferación, y diferenciación de una diversidad de tipos de
células así como la síntesis de los componentes matriciales. El
proceso de cura puede dividirse en las siguientes tres fases:
Cuando las plaquetas están presentes fuera del
sistema circulatorio y se exponen a trombina y colágeno, se activan
y se agregan. De esta forma, las plaquetas inician el proceso de
reparación agregándose y formando una barrera temporal para asegurar
la homeostasis y evitar la invasión de bacterias. Las plaquetas
activas inician el sistema de coagulación y liberan factores de
crecimiento como el facto de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF) y factores de crecimiento epidérmicos (EGF) y factores de
crecimiento de transformación (TGF).
Las primeras células que invaden el área de la
herida son neutrófilos seguidos de monocitos que son activados por
los macrófagos.
El papel principal de los neutrófilos parece ser
limpiar la herida de o defender la herida contra bacterias
contaminantes y mejorar la curación de la herida eliminando células
y plaquetas muertas. La infiltración de neutrófilos se interrumpe en
las primeras 48 horas siempre que no haya una contaminación
bacteriana presente en la herida. El exceso de neutrófilos es
fagocitado por los macrófagos del tejido reclutados de monocitos
sanguíneos circulantes. Se cree que los macrófagos son esenciales
para la curación eficaz de heridas porque son también responsables
de la fagocitosis de organismos patógenos y de la eliminación del
tejido residual. Además, liberan diversos factores implicados en las
etapas posteriores del proceso de curación. Los macrófagos atraen
fibroblastos que inician la producción de colágeno.
A las 48 horas de la formación de la herida, los
fibroblastos empiezan a proliferar y migran al área de la herida
desde el tejido conectivo al borde de la herida. Los fibroblastos
producen colágenos y glucosaminoglicanos y entre otros una baja
tensión de oxígeno en la herida estimula la proliferación de células
endoteliales. Las células endoteliales dan lugar a la formación de
una nueva red capilar.
Los activadores de colagenasas y plasminógenos se
secretan en los queratinocitos. Si la herida se mantiene sin alterar
y bien alimentada con oxígeno y nutrientes, los queratinocitos
migrarán sobre la herida. Se cree que los queratinocitos migran
sobre el tejido viable y, en consecuencia, los queratinocitos
migran al área por debajo del tejido muerto y la costra de la
herida.
El área de la herida se reduce adicionalmente por
contracción.
Tan pronto como se completa la
re-epitelización comienza la remodelación del
tejido. Esta fase, que dura varios años, recupera la fuerza del
tejido dañado.
Todo el proceso de cura mencionado anteriormente
lleva un tiempo considerable. La velocidad de la curación está
influido por el aislamiento de la herida de infecciones, el estado
de salud general del individuo, la presencia de cuerpos extraños,
etc. Algunas enfermedades patológicas tales como infección,
maceración, deshidratación, estado de salud generalmente pobre, y
malnutrición pueden conducir a la formación de una úlcera crónica
tal como, por ejemplo, úlceras isquémicas.
Hasta que tiene lugar al menos una curación
superficial, la herida sigue en riesgo de una infección nueva o
continuada. Por lo tanto, cuanto antes cure la herida, antes se
elimina el riesgo.
De esta forma, cualquier procedimiento que pueda
influir en la velocidad de curación de la herida o influir
favorablemente la curación de heridas es de gran valor.
Además, como casi todos los procesos de
reparación de tejidos incluyen una primera formación de tejido
conectivo, se contempla una estimulación de éste y los procesos
posteriores para mejorar la curación del tejido.
En el presente contexto, el término "curación
clínica" se usa para denotar una situación en la que no puede
observarse visualmente una ruptura del tejido y solo hay presentes
ligeros signos de inflamación tal como un ligero color rojo o un
tejido ligeramente inflamado. Además, no se dan quejas de dolor
cuando el órgano se relaja o se toca.
Tradicionalmente, se han usado más comúnmente
apósitos secos o húmedos-a-secos
para el cuidado de heridas. Éstos se están sustituyendo gradualmente
con entornos húmedos que usan apósitos oclusivos. Para reparar o
sustituir satisfactoriamente una parte del cuerpo dañada, deben
equilibrarse los procesos de curación de heridas, fibrosis e
invasión microbiana. Muchas instrumentos para evitar infecciones
comprometen la curación de la herida. Una curación de herida
retrasada una inflamación puede agravar la fibrosis. Además, se ha
sugerido previamente que los factores de crecimiento tales como el
factor de crecimiento epidérmico (FGF), incluyendo el factor de
crecimiento de fibroblastos ácido (\alpha-FGF) y
el factor de crecimiento de fibroblastos básico
(\beta-FGF), el factor-\beta de
crecimiento de transformación (TGF-\beta) y los
factores de crecimiento similares a al insulina
(IGF-1 e IGF-2) conducen el proceso
de curación de heridas y se citan con frecuencia como promotores de
la curación de heridas; sin embargo, pueden provocar realmente
fibrosis lo que a su vez puede impedir una curación satisfactoria.
Aunque la curación acelerada ofrece la mejor opción para reducir el
riesgo de infección y la inflamación resultante que puede conducir
a la formación de cicatrices, los intentos terapéuticos para
acelerar el proceso normal de curación de herida han tenido
relativamente poco éxito. Esto se debe probablemente a que el
proceso de reparación implica la implicación concertada de diversos
factores, descritos anteriormente.
Hasta este punto, los inventores han descubierto
que en diversos cultivos celulares de fibroblastos (embrional,
dérmico, derivados de ligamento periodontal, en peces o pájaros) se
produce el doble de TGF\beta1 en los cultivos celulares
estimulados con EMDOGAIN® (BIORA AB, S-205 12 Malmö,
Suecia que contiene 40 mg de proteína de la matriz de esmalte
liofilizada (en lo sucesivo abreviada como EMD) y 1 ml de Solución
Vehículo (Alginato de Propilenglicol), que se mezcla antes de la
aplicación, a menos que la proteína y el Vehículo se prueben de
forma separada, siendo la relación en peso de aproximadamente
85/5/10 entre los máximos proteicos a 20, 14 y 5 kDa,
respectivamente) en comparación con cultivos no estimulados cuando
se analizan, por ejemplo, ELISA en una muestra del medio de cultivo
(véase Ejemplo 1 a continuación). El incremento está presente 24
horas después del cultivo, pero es más pronunciado en los siguientes
días (días 2 y 3). Después del segundo día, también aumenta la
proliferación celular en cultivos celulares estimulados con
EMDOGAIN®. Un aumento de la producción de TGF\beta1 similar, pero
menos pronunciado, se observa en células epiteliales humanas. Como
el TGF\beta1 parece tener una importancia central en la
epitelización de heridas superficiales, estos descubrimientos apoyan
el concepto de la presente invención.
Es común el uso de apósitos en la cavidad oral.
Tales apósitos son del tipo tradicional, por ejemplo, Surgipads
para parar las hemorragias y apósitos periodontales
Coe-Pack (Coe Laboratories, GC Group, Chicago, USA)
en heridas abiertas, en los alvéolos de las extracciones dentarias
se inserta Gaze empapados en solución antibiótica y se retira
después de unos pocos días cuando se inicia la curación. Los
aclarados con antisépticos tales como clorhexidina se usan de forma
regular después de la cirugía oral. Algunas veces, también se
prescriben antibióticos generales o tópicos.
En general, se tienen que tomar precauciones
específicas en relación con el tratamiento de heridas, tales como,
por ejemplo, consideraciones de esterilidad, problemas de
contaminación, aplicación correcta de vendajes/apósitos, etc. lo
que requiere normalmente que el tratamiento/aplicación se realice
por enfermeras bien entrenadas o personal similar. De esta forma,
el tratamiento de heridas a menudo se convierte en una operación muy
cara cuando el agente de curación de la herida se tiene que aplicar
varias veces al día. Por lo tanto, se puede obtener una reducción
deseada en los costes implicados en el tratamiento de curación de la
herida cuando se pueda reducir la frecuencia de aplicación o si los
procesos de curación se mejoran llevando a una reducción en el
periodo de tiempo que se necesita para curar la herida.
Los presentes inventores han observado que
después de la aplicación de proteínas de la matriz de esmalte y/o
derivados de la matriz de esmalte, la etapa de inflamación se
acorta y los signos típicos tales como calor, enrojecimiento, edema,
y dolor son menos evidentes.
La actividad terapéutica de la matriz de esmalte,
los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la
matriz de esmalte puede demostrarse por supuesto con pruebas in
vivo usando animales o seres humanos experimentales (véase la
sección experimental en este documento). Sin embargo, puede
obtenerse una indicación de la eficacia de la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte realizando ensayos in vitro relativamente simples
tales como, por ejemplo, ensayos que implican cultivos
celulares.
En relación con el tratamiento de
heridas/úlceras, el desbridamiento y limpieza de la herida son de
particular importancia. Se cree que la limpieza y/o desbridamiento
de heridas/úlceras son un prerrequisito para el proceso de curación,
y, además, cuando se aplican los agentes de curación de la herida,
tales agentes tiene que ejercer su efecto en tejido fresco y vivo,
no en tejido muerto o tejido contaminado. El desbridamiento del
tejido necrótico puede realizarse al menos por cuatro métodos
diferentes: i) desbridamiento con objetos agudos, ii) desbridamiento
mecánico, iii) desbridamiento enzimático, y iv) desbridamiento
autolítico.
Por lo tanto, la presente invención se refiere
también al uso de un método de desbridamiento en combinación con el
uso de matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o
las proteínas de la matriz de esmalte para la cura o prevención de
heridas. Tal terapia de combinación implica las dos siguientes
etapas, a saber i) un método de desbridamiento y ii) aplicación de
una matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o
las proteínas de la matriz de esmalte y las dos etapas pueden
realizarse tantas veces como se desee y en cualquier orden
adecuado.
Cuando la herida se ha sometido a desbridamiento,
la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las
proteínas de la matriz de esmalte puede aplicarse directamente en o
sobre la herida o pueden aplicarse en forma de cualquier composición
farmacéutica adecuada tal como, por ejemplo, un apósito limpio seco
o húmedo en el cual se ha incorporado la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte. Por supuesto, la matriz de esmalte, los derivados de la
matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte también
pueden aplicarse junto con la limpieza de la herida.
Como se discutirá más adelante, la matriz de
esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de
la matriz de esmalte pueden usarse como tales o puede usarse en una
preparación o composición farmacéutica adecuada.
En otro aspecto de la presente invención, la
matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las
proteínas de la matriz de esmalte se usan como agentes terapéuticos
o profilácticos con un efecto antimicrobiano. La matriz de esmalte,
los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz
de esmalte muestran propiedades que reducen la infección.
En el presente contexto el término "efecto que
reduce la infección" se refiere a un efecto de tratamiento o
preventivo de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte en una infección
de un tejido de un individuo cuando el tejido o el individuo se
tratan con la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte.
El término infección se refiere a la invasión y
multiplicación de microorganismos en tejidos corporales o la
acumulación en los tejidos, lo que puede ser clínicamente inaparente
o tener como resultado un daño local celular debido al metabolismo
competitivo, enzimas, toxinas, replicación intracelular o respuesta
de antígenos-anticuerpos.
De acuerdo con la presente invención, la
infección a prevenir y/o tratar puede estar causada por un
microorganismo. Los microorganismos de interés de acuerdo con la
presente invención incluyen bacterias, virus, levaduras, hongos,
protozoos, y rickettsiae.
En el presente contexto el término "efecto
antibacteriano" significa que el crecimiento de las bacterias se
suprime o que se destruyen las bacterias. El término no se limita a
ciertas bacterias sino que abarca cualquier bacteria en general. Sin
embargo, la invención se centra en i) bacterias patógenas que causan
enfermedades en mamíferos incluyendo seres humanos y/o ii) bacterias
que normalmente están presentes en el cuerpo de un mamífero y que
bajo ciertas condiciones pueden causar enfermedades no deseadas en
el cuerpo.
En consecuencia, la invención se refiere al uso
de una sustancia activa de esmalte para la prevención o tratamiento
del crecimiento bacteriano en una superficie corporal tal como la
piel, una superficie de mucosa o una superficie de una uña o un
diente.
La matriz de esmalte, los derivados de la matriz
de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte pueden usarse
para el tratamiento de una infección causada por bacterias con o sin
la presencia de un antimicrobiano. Las bacterias gram negativas a
tratar con la sustancia activa de esmalte pueden ser cocci, tal como
Neisseria (por ejemplo, N. meningitis, N. gonorrhoeae), y
Acinetobacterioides, tales como Bacterioides (por ejemplo, B.
fragilis), Bordetella (por ejemplo, B. pertussis,
B. parapertussis), Brucella y (por ejemplo B.
melitentis, B. abortus Bang, B. suis),
Campylobacter (por ejemplo, C. jejuni, C. coli,
C. fetus), Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia (por ejemplo E. coli),
Haemophilus (por ejemplo H. influenzae, H.
para-influenzae), Klebsiella (por ejemplo
K. pneumoniae), Legionella (por ejemplo L.
pneumophila), Pasteurella (por ejemplo P.
yersinia, P. multocida), Proteus (por ejemplo,
P. mirabilis, P. vulgaris), Pseudomonas (por
ejemplo P. aeruginosa, P. pseudomallei, P.
mallei), Salmonella (por ejemplo S. enteriditis, S.
infantitis, S. Dublin, S. typhi, S.
paratyphi, S. schottmülleri, S. choleraesuis,
S. typhimurium, o cualquiera de los otros 2.500 serotipos),
Serratia, (por ejemplo S. Marscences, S.
liquifaciensv), Shigella (por ejemplo, S. sonnei,
S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii),
Vibrio (por ejemplo B. cholerae, V. eltor),y
Yersinia (por ejemplo Y. enterocolitica, Y.
pseudotuberculosis, Y. pestis). Las bacterias gram
positivas a tratar con la sustancia activa de esmalte pueden ser
cocci, tales como Streptococcus (por ejemplo S.
pneumoniae, S. viridans, S. faecalis, S.
pyogenes), Staphylococcus (por ejemplo S.
aureaus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S.
albus) y rods tales como Actinomyces (por ejemplo
A. israelli), Bacillus (por ejemplo B. cereus,
B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (por
ejemplo C. botulinum, C. tetani, C.
perfringens, C. difficile), Corynebacterium (por
ejemplo C. diphttheriae), Listeria, y
Providencia. Otras bacterias que causan infecciones incluyen
Propionobacterium acne y Piutyosporon ovale.
La matriz de esmalte, los derivados de la matriz
de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte también pueden
usarse para el tratamiento de una infección causada por un
espiroqueto tales como, por ejemplo, Borrelia,
Leptospira, Treponema, o Pseudomonas.
Un antimicrobiano para usar en combinación con la
matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las
proteínas de la matriz de esmalte podría ser una antimicrobiano que
tiene una acción antimicrobiana a través de la inhibición de la
síntesis de pared celular tal como \beta-lactamos
y vactomicina, preferiblemente penicilinas tales como amdinocilina,
ampicilina, amoxicilina, aziocilina, bacampicilina, benzatina
penicilina G, carbenicilina, cloxacilina, ciclacilina,
dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina,
penicilina G, penicilina V, piperacilina, y ticarcilina;
cefalosporinas tales como los fármacos de primera generación
cefadroxil, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, y
cefradina, los fármacos de segunda generación cefaclor, cefamandol,
cefonicida, ceforanida, cefoxitina, y cefuroxima, o las
cefalosporinas de tercera generación cefoperazona, cefotaxima,
cefotetan, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, y moxalactam;
carbapenems tales como imipenem; o monobactams tales como
aztreonam.
Otros fármacos antimicrobianos con acción a
través de la síntesis de proteínas tales como cloramfenicol; otras
tetraciclinas preferiblemente demeclociclina, doxiciclina,
metaciclina, minociclina, y oxitetraciclina; amino glucósidos tales
como amikacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina,
paromomicina, espectinomicina, streptomicina, y tobramicina;
polimixinas tales como colistin, colistimatato y polimixina B, y
eritromicinas y lincomicinas; antimicrobianos con acción a través de
la inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos en particular
sulfonamidas tales como sulfacitina, sulfadiazina, sulfisoxazol,
sulfametoxazol, sulfametizol, y sulfapiridina; trimetoprim,
quinolonas, novobiocin, pirimetamina y rifampina.
En una realización específica de la invención,
la infección está presente en la cavidad oral y la infección puede
ser una enfermedad bacteriana.
Algunos ejemplos (no enfermedades) de bacterias
orales inhibir por contacto o a combatir incluyen
- bacterias que causan caries, por ejemplo
Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.
- bacterias que causan enfermedades
periodontales, por ejemplo, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros,
Gampylobacter (Fusobacteria, Staphylcocci). B.
forsythus
- bacterias que causan alveolitis, etc., por
ejemplo Staphylococcus, Actinomyces y Bacillus
- bacterias que causan lesiones periapicales, por
ejemplo, Espiroquetos y todas las anteriores.
La presente invención también se refiere a los
usaos de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte
y/o las proteínas de la matriz de esmalte como agentes terapéuticos
o profilácticos con efecto antiinflamatorio.
Se emplean varios fármacos para suprimir las
manifestaciones de la inflamación, incluyendo los
adrenocorticoesteroides, el gran grupo que comprende los denominados
fármacos antiinflamatorios no esteroideos o NSAID, y fármacos tales
como agentes inmunosupresores. Los adrenocorticoesteroides, y
especialmente los glucocorticoides, tienen un potente efecto
antiinflamatorio cuando se usan en dosis farmacológicas. Inhiben
específicamente la fase inicial vascular de los procesos
inflamatorios reduciendo la permeabilidad vascular y por lo tanto
la migración de granulocitos. Los glucocorticoides también
interfieren con procesos inflamatorios y reparativos posteriores,
en que inhiben la proliferación de células mesenquimales y la
producción de macromoléculas extracelulares, incluyendo
proteoglicanos y colágeno. Se ha demostrado experimentalmente que
los glucocorticoides inhiben, por ejemplo, la función macrófaga, la
producción de anticuerpos humorales, inmunidad celular y,
posiblemente, la liberación de enzimas lisosomales.
La gravedad del daño en el tejido puede depender
de la reacción antígeno/anticuerpo del organismo así como del grado
de retención de productos inflamatorios en el área afectada. La
acumulación de mediadores de inflamación local acelera el proceso.
En la mayoría de los casos, el proceso es lento, con
inmunoinfiltración del tejido y formación de un tejido de
granulación que contiene células inflamatorias.
En el presente contexto, el término "efecto
antiinflamatorio" denota una contrarrestación o supresión de la
inflamación.
La enfermedad inflamatoria a tratar de acuerdo
con la presente invención puede ser por supuesto cualquier
enfermedad inflamatoria en cualquier parte del cuerpo o cualquier
enfermedad inflamatoria presente en un tejido blando o duro. En una
realización de la invención, la enfermedad inflamatoria está
presente en la cavidad oral. Ejemplos de enfermedades en la cavidad
oral son alveolitis, queilitis, necrosis ósea (después de un
trauma), y fracturas.
En otra realización de la invención, la
enfermedad inflamatoria está presente en un lugar de donante de
hueso. En una tercera realización de la invención, la enfermedad
inflamatoria está presente en una cavidad de una articulación.
Algunos ejemplos de tales enfermedades inflamatorias son artritis
reumatoide y enfermedades relacionadas.
Al contrario que muchos agentes antibióticos
usados actualmente, las proteínas de la matriz de esmalte no
compromete la curación de heridas y a su vez, la rápida curación de
la herida no da lugar a que se desarrollen procesos de inflamación
crónica o de larga duración. Además, la reorganización de los
tejidos apropiados, tales como los descritos después de la
aplicación de los derivados de la matriz de esmalte en los defectos
periodontales, se favorece claramente por una rápida curación de la
herida sin bacterias o reacciones inflamatorias.
La aplicación de la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte conduce a una rápida curación de incisiones quirúrgicas,
creando posiblemente una superficie que al contacto con la bacteria
inhibe su crecimiento pero al mismo tiempo mejora el movimiento de
fibroplastos y la síntesis de colágeno. Si se acorta la etapa
inflamatoria, los signos típicos tales como calor, enrojecimiento,
edema y dolor son menos evidentes.
La matriz de esmalte es un precursor del esmalte
y puede obtenerse de cualquier fuente relevante, por ejemplo, un
mamífero cuyos dientes están en desarrollo. Una fuente adecuada en
los dientes en desarrollo de animales de matadero, tales como
terneras, cerdos o corderos. Otra fuente es, por ejemplo, la piel
del pescado.
La matriz de esmalte puede prepararse con los
dientes en desarrollo como se ha descrito previamente (documentos
EP-B-0 337 967 y
EP-B-0 263 086). La matriz de
esmalte se rasca y se preparan derivados de la matriz de esmalte,
por ejemplo, por extracción con solución acuosa tal como un tampón,
un ácido o base diluida o una mezcla de disolvente/agua, seguida de
exclusión por tamaño, desalación u otras etapas de purificación,
seguidas opcionalmente de liofilización. Las enzimas pueden
desactivarse por tratamiento con calor o disolventes, en cuyo caso
los derivados pueden almacenarse en forma líquida sin
liofilizar.
En el presente contexto, los derivados de la
matriz de esmalte son derivados de la matriz de esmalte que incluyen
una o varias proteínas de la matriz de esmalte o partes de tales
proteínas, producidas naturalmente por cortes o procesamiento
alterno o por escisión enzimática o química de una proteína de
longitud natural, o por síntesis de polipéptidos in vitro o
in vivo (métodos de ADN recombinante o cultivo de células
diploides). Los derivados de la matriz de esmalte también incluyen
polipéptidos o proteínas relacionadas con la matriz de esmalte. Los
polipéptidos o proteínas pueden estar unidos a una molécula vehículo
biodegradable adecuada tal como poliaminoácidos o polisacáridos, o
combinaciones de los mismos. Además, el término derivados de la
matriz de esmalte también abarca sustancias sintéticas análogas.
Las proteínas son macromoléculas biológicas
constituidas por restos aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
Las proteínas, como polímeros lineales de aminoácidos, se denominan
también polipéptidos. Normalmente, las proteínas tienen
50-800 restos aminoácidos y por tanto tienen pesos
moleculares en el intervalo de aproximadamente 6000 a
aproximadamente varios cientos de miles de daltons o más. Las
proteínas pequeñas se denominan péptidos u oligopéptidos.
Las proteínas de la matriz de esmalte son
proteínas que están presentes normalmente en la matriz de esmalte,
es decir, el precursor del esmalte (Ten Cate: Oral Histology, 1994;
Robinsos: Eur. J. Oral. Science, Jan. 1998, 106 Suppl.
1:282-91) o proteínas que pueden obtenerse por
escisión de tales proteínas. En general, tales proteínas tienen un
peso molecular por debajo de 120.000 daltons e incluyen
amelogeninas, no-amelogeninas,
no-amelogeninas ricas en prolina, amelinas
(ameloblastina, sheathilina), y tuftelinas.
Algunos ejemplos de proteínas para usar de
acuerdo con la invención son amelogeninas,
no-amelogeninas ricas en prolina, tuftelina,
proteínas tuft, proteínas del suero, proteínas de la saliva,
amelina, ameloblastina, sheathlina, y derivados de las mismas, y
mezclas de las mismas. Una preparación que contiene una sustancia de
esmalte activa para usar de acuerdo con la invención puede contener
también al menos dos de las sustancias proteicas mencionadas
anteriormente. Un producto comercial que comprende amelogeninas y
posiblemente otras proteínas de la matriz de esmalte se comercializa
como EMDOGAIN® (Biora AB).
En general, las proteínas principales de la
matriz de esmalte se conocen como amelogeninas. Constituyen
aproximadamente el 90% p/p de las proteínas de la matriz. El 10% p/p
restante incluye no-amelogeninas ricas en prolina,
tuftelina, proteínas tuft, proteínas del suero y al menos una
proteína de la saliva; sin embargo, también pueden estar presentes
otras proteínas tales como, por ejemplo, amelina (ameloblastina,
sheathlina) que se ha identificado en relación con la matriz de
esmalte. Además, las diversas proteínas pueden sintetizarse y/o
procesarse en varios tamaños distintos (es decir, pesos moleculares
distintos). De esta forma, se ha descubierto que las proteínas
principales en la matriz de esmalte, amelogeninas, existen en
distintos tamaños que juntos forman agregados supramoleculares. Son
sustancias notablemente hidrófobas que en condiciones fisiológicas
forman agregados. Pueden llevar o ser vehículos para otras proteínas
o péptidos.
También se contemplan otras sustancias proteicas
como adecuadas para usar de acuerdo con la presente invención.
Algunos ejemplos incluyen proteínas tales como proteínas ricas en
prolina y poliprolina. Otros ejemplos de sustancias que se
contemplan como adecuadas para el uso de acuerdo con la presente
invención son agregados de tales proteínas, de derivados de la
matriz de esmalte y/o de proteínas de la matriz de esmalte así como
metabolitos de la matriz de esmalte, derivados de la matriz de
esmalte y proteínas de la matriz de esmalte. Los metabolitos pueden
ser de cualquier tamaño en el intervalo del tamaño de proteínas al
de péptidos cortos.
Como se ha mencionado anteriormente, las
proteínas, polipéptidos, o péptidos para usar de acuerdo con la
invención tienen normalmente un peso molecular de cómo máximo
aproximadamente 120 kDa tal como, por ejemplo, como máximo 100 kDa,
90 kDa, 80 kDa, 70 kDa o 60 kDa calculado por electroforesis
SDS-Page.
Las proteínas para usar de acuerdo con la
invención se presentan normalmente en forma de preparación, en la
que el contenido en proteínas de la sustancia de esmalte activa en
la preparación está en el intervalo de aproximadamente 0,05% p/p a
100% p/p tal como, por ejemplo, aproximadamente
5-99% p/p, aproximadamente 10-95%
p/p, aproximadamente 15-90% p/p, aproximadamente
20-90% p/p, aproximadamente 30-90%
p/p, aproximadamente 40-85% p/p, aproximadamente
50-80% p/p, aproximadamente 60-70%
p/p, aproximadamente 70-90% o aproximadamente
80-90% p/p.
Una preparación de la sustancia de esmalte activa
para el uso de acuerdo con la invención puede contener también una
mezcla de sustancias de esmalte activas con diferentes pesos
moleculares.
Las proteínas de la matriz de esmalte pueden
dividirse en una parte de alto peso molecular y una parte de bajo
peso molecular, y se ha descubierto que una parte bien definida de
las proteínas de la matriz de esmalte tiene unas propiedades
valiosas con respecto al tratamiento de defectos periodontales (es
decir, heridas periodontales). Esta parte contiene proteínas
extraíbles con ácido acético denominadas generalmente amelogeninas
y constituye la parte de bajo peso molecular de la matriz de esmalte
(véanse los documentos EP-B-0 337
967 y EP-B-0 263 086).
Como se ha discutido anteriormente la parte de
bajo peso molecular de la matriz de esmalte tiene una actividad
adecuada para inducir la unión entre tejidos duros en defectos
periodontales. Sin embargo, en el presente contexto las proteínas
activas no se limitan a la parte de bajo peso molecular de la matriz
de esmalte. Actualmente, las proteínas preferidas incluyen
proteínas de la matriz de esmalte tales como amelogenina, amelina,
tuftelina, etc. con pesos moleculares (medidos in vitro con
SPS-PAGE) por debajo de aproximadamente 60.000
daltons aunque las proteínas con peso molecular mayor de 60.000
daltons también tienen propiedades prometedoras como candidatas para
agentes de curación de heridas, antibacterianos y/o
antiinflamatorios.
En consecuencia, se contempla que la sustancia de
esmalte activa para el uso de acuerdo con la invención tiene un peso
molecular de hasta 40.000 tal como, por ejemplo, un peso molecular
entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 25.000.
Los péptidos descritos en el documento WO
97/02730 también están dentro del alcance de la presente invención,
es decir, péptidos que comprenden al menos un elemento de secuencia
seleccionado entre el grupo compuesto por tetrapéptidos DGEA
(Asp-Gly-Glu-Ala);
VTGK
(Val-Thr-Lys-Gly),
EKGE (Glu-Lys-Gly- Glu) y DKGE
(Asp-Lys-Gly-Gluc) y
que comprende además una secuencia de aminoácidos en la que una
cadena consecutiva de 20 aminoácidos es idéntica al menos en un 80%
a una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada entre
el grupo compuesto por la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEC ID NO:1 y una secuencia consistente en los aminoácidos 1 a 103
de la SEC ID NO:1 y los aminoácidos 6 a 324 de la SEC ID NO:2.
El término "identidad de secuencia" se
refiere a la identidad en una secuencia de aminoácidos que concuerda
con respecto a la identidad y posición de los aminoácidos de los
péptidos. Un hueco se cuenta como no-identidad para
uno o más aminoácidos, de forma apropiada.
Tales péptidos pueden comprender de 6 a 300
aminoácidos, por ejemplo al menos 20 aminoácidos, al menos 30
aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, al menos 90
aminoácidos, al menos 120 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos o al
menos 200 aminoácidos.
Un método para el aislamiento de las proteínas de
la matriz de esmalte implica la extracción de las proteínas y la
retirada de iones calcio y fosfato con hidroxiapatita solubilizada
con un método apropiado, por ejemplo filtración en gel, diálisis o
ultrafiltración (véase Janson, J-C & Rydén, L.
(Eds.), Protein purification, VCH Publishers 1989 y Harris, ELV
& Angal, S., Protein purification methods -A practical
approach, IRL Press, Oxford 1990).
Una preparación liofilizada de proteínas puede
contener amelogeninas principalmente o exclusivamente hasta un
70-90% con un peso molecular (PM) entre 40.000 y
50.000 daltons, estando compuesto el 10-30% de
péptidos más pequeños, sales y agua residual. Las bandas proteicas
principales están a 20 kDa, 12-14 kDa y
aproximadamente 5 kDa.
Separando las proteínas, por ejemplo, por
precipitación, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis
preparativa, cromatografía de permeación de gel, cromatografía de
fase inversa o cromatografía por afinidad, pueden purificarse las
amelogeninas de distinto peso molecular.
La combinación de amelogeninas de distinto peso
molecular puede variar, de un compuesto con 20 kDa dominante a un
agregado de amelogeninas con muchos pesos moleculares diferentes
entre 40 y 5 kDa, hasta un compuesto con 5 kDa dominante. Otras
proteínas de la matriz de esmalte tales como amelina, tuftelina, o
enzimas proteolíticas que se encuentran normalmente en la matriz de
esmalte, pueden añadirse al agregado de amelogenina.
Como fuente alternativa de derivados o proteínas
de la matriz de esmalte, se pueden aplicar generalmente rutas
sintéticas conocidas para un especialistas en la técnica o usar
células cultivadas o bacterias modificadas por técnicas de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al.:Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Propiedades fisico-químicas de la
matriz de esmalte, derivados de la matriz de esmalte y proteínas de
la matriz de esmalte.
En general, la matriz de esmalte, los derivados
de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte son
sustancias hidrófobas, es decir, poco solubles en agua especialmente
a altas temperaturas. En general, estas proteínas son solubles para
valores de pH no fisiológicos y a bajas temperaturas tales como
4-20ºC, aunque si se agregan y precipitan a la
temperatura corporal (35-37ºC) y a pH neutral.
La matriz de esmalte, los derivados de la matriz
de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte para el uso de
acuerdo con la invención también incluyen una sustancia de esmalte
activa, en la que al menos una parte de la sustancia de esmalte
activa está en forma de agregados o es capaz de formar agregados
después de la aplicación in vivo. EL tamaño de partícula de
los agregados está en el intervalo de aproximadamente 20 nm a
aproximadamente 1 \mum.
Se contempla que las propiedades de solubilidad
de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o
las proteínas de la matriz de esmalte son importantes en relación
con la actividad profiláctica y terapéutica de las sustancias.
Cuando una composición que contiene la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte (en lo sucesivo denominada "sustancia de esmalte
activa" como término común) se administra, por ejemplo, a un ser
humano, la sustancia proteica precipitará debido al pH predominante
en condiciones fisiológicas. de esta forma se forma una capa de
matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las
proteínas de la matriz de esmalte en el lugar de aplicación y esta
capa (que también puede ser una capa molecular en aquellos casos en
los que se haya formado agregado) es difícil de desprender en
condiciones fisiológicas. Además, dado que las sustancias tienen
propiedades bioadhesivas (ver a continuación) la capa precipitada se
une firmemente al tejido y también en el borde entre la capa
precipitada y el tejido. De esta forma, la capa proteica cubre el
tejido sobre el que se ha aplicado la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte y las sustancias de esmalte activas se mantienen in
situ por un periodo prolongado de tiempo, es decir, no es
necesario administrar la(s) sustancia(s) de esmalte
activa(s) en cortos intervalos. Además, la capa formada in
situ puede compararse prácticamente con un apósito oclusivo, es
decir, la capa formada protege el tejido sobre el que se ha formado
la capa. En el caso del tejido de una herida, un tejido infectado o
un tejido inflamado tal capa protege el tejido de más contaminación
con los microorganismos presentes en/sobre el tejido.
Para que se forme una capa proteica in
situ después de la aplicación, puede ser ventajoso incorporar
una sustancia tampón adecuada en una composición farmacéutica o
cosmética de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte; el propósito de
tal sustancia tampón podría ser evitar la disolución de la sustancia
de esmalte activa en el lugar de aplicación.
También se ha descubierto (por los presentes
inventores) que la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte tienen propiedades
bioadhesivas, es decir, tienen la capacidad de adherirse a la piel o
las superficies de mucosa. Estas propiedades son más valiosas en
relación con un tratamiento terapéutico y/o profiláctico al menos
por las siguientes razones:
- La(s) sustancia(s)
profilácticamente y/o terapéuticamente activas pueden mantenerse en
el lugar de aplicación durante un periodo prolongado de tiempo (es
decir, i) se puede reducir la frecuencia de administración, ii) se
puede obtener un efecto de liberación controlada de la sustancia
activa y/o iii) se mejora un tratamiento local en el lugar de
aplicación).
- Las mismas sustancias pueden ser adecuadas como
vehículos para otras sustancias terapéutica o profilácticamente
activas porque un vehículo que contiene matriz del esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte puede formularse como un vehículo bioadhesivo (es decir, un
nuevo sistema de administración para un fármaco bioadhesivo basado
en las propiedades bioadhesivas de la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte).
La matriz de esmalte es un ejemplo de un matriz
extracelular de proteínas que se adhiere a superficies minerales así
como a superficies proteicas. A pH y temperatura fisiológica las
proteínas forman un agregado insoluble supramolecular (Fincham et
al., in J. Struct. Biol. 1994 Marzo-Abril:
112(2):103-9 y en J. Struct. Biol. 1995
Julio-Agosto; 115(1):50-9),
que se degrada gradualmente con enzimas proteolíticas (esto ocurre
in vivo e in vitro siempre que las proteasas no se
hayan sometido a desactivación).
La observación reciente de que la matriz de
esmalte se forma y está temporalmente presente durante la formación
de la raíz y del cemento de la raíz puede explicar como la
aplicación de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte provoca la
regeneración del tejido periodontal. Sin embargo, la observación que
subyace la presente invención es que la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte también tienen un efecto antiinfeccioso y
antiinflamatorio.
En muchas especies, se encuentran restos de la
matriz de esmalte en la nueva corona mineralizada cuando sale un
diente en la cavidad poral. Puede argumentarse que un diente nuevo
sería muy vulnerable a un ataque bacteriano con bacterias comunes a
menos que tenga una protección natural durante esta fase
inicial.
La aplicación de la matriz de esmalte, los
derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de
esmalte no solubles con propiedades antibacterianas y
antiinflamatorias en la superficie de una herida mejorará la
curación.
Como se demuestra en la sección experimental de
este documento, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de
esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte o agregados de
proteínas impiden el crecimiento bacteriano mediante inhibición por
contacto, mientras que las células expuestas reaccionan
aparentemente con la matriz de esmalte como en un entorno normal, lo
que suprime las respuestas inflamatorias.
De acuerdo con la presente invención, la matriz
de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas
de la matriz de esmalte puede usarse con propósitos curativos así
como con propósitos preventivos. Además, una matriz de esmalte,
derivados de la matriz de esmalte y/o proteína de la matriz de
esmalte puede usarse junto con otras sustancias o fármacos activos
tales como, por ejemplo, sustancias antibacterianas,
antiinflamatorias, antivíricas, antifúngicas, o en combinación con
factores de crecimiento tales como, por ejemplo, TGF\beta, PDGF,
IGF, GFG, factor de crecimiento de queratinocito, o análogos de
péptido D de los mismos (se cree que el EGF promueve la curación
mejorado la migración y la división celular de células epiteliales;
además, el EGF aumenta la cantidad de fibroblastos en las heridas,
lo que tiene como resultado una mayor producción de colágeno). Las
enzimas, presentes de forma inherente en la matriz de esmalte o en
una preparación de las mismas o añadidas - pueden usarse también en
combinación con una matriz del esmalte, un derivado de la matriz de
esmalte y/o una proteína de la matriz de esmalte, especialmente
proteasas.
Una preparación de la sustancia de esmalte activa
se fórmula normalmente como una composición farmacéutica o
cosmética. Por supuesto, tal composición puede consistir en la
preparación proteica o puede comprender adicionalmente un excipiente
farmacéuticamente o cosméticamente aceptable . Los excipientes
especialmente adecuados para el uso en composiciones farmacéuticas o
cosméticas son alginato de propilenglicol, o ácido hialurónico o
sales o derivados de los mismos.
En los siguientes ejemplos se dan composiciones
adecuadas que contienen la(s) sustancia(s) de esmalte
activas. Dependiendo del uso de la(s) sustancia(s) de
esmalte activa(s), una composición puede ser una composición
farmacéutica o cosmética. En lo sucesivo, el término "composición
farmacéutica" pretende abarcar también las composiciones
cosméticas así como las composiciones que pertenecen a la denominada
área gris entre productos farmacéuticos y cosméticos,
cosmecéuticos.
Para la administración a un individuo (un animal
o un ser humano) la matriz de esmalte, los derivados de la matriz
de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte (en los
sucesivo se denota "sustancia de esmalte activa" y/o una
preparación de la misma se fórmula preferiblemente en una
composición farmacéutica que contiene la sustancia de esmalte activa
y, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables.
Las composiciones pueden estar en forma de, por
ejemplo, composiciones sólidas, semi-sólidas, o
líquidas, tales como, por ejemplo, parches bioabsorbibles,
pociones, apósitos, apósitos de hidrogel, apósitos hidrocoloides,
películas, espumas, láminas, vendajes, tiritas, dispositivos de
administración, implantes, polvos, gránulos, granulados, cápsulas,
perlas de agarosa o quitosan, comprimidos, píldoras, bolas,
microcápsulas, microesferas, nanopartículas, nebulizadores,
aerosoles, dispositivos de inhalación, geles, hidrogeles, pastas,
pomadas, cremas, jabones, supositorios, supositorios vaginales,
pasta dentrífica, soluciones, dispersiones, suspensiones,
emulsiones, mezclas, lociones, lavado bucal, champús, enemas, kits
que contienen por ejemplo dos recipientes separados, en el que el
primero de los recipientes contiene la sustancia de esmalte activa
mezclada opcionalmente con unas sustancias o fármacos activos y/o
excipientes farmacéuticamente aceptables y el segundo recipiente
contiene un medio adecuado para añadir al primer recipientes antes
de su uso para obtener una composición lista para usar; y otras
formas adecuadas tales como, por ejemplo, implantes o recubrimiento
de implantes o en una forma adecuada para usar en relación con la
implantación o los transplantes.
Las composiciones para aplicación en la piel o
mucosa se consideran las más importantes en relación con la presente
invención. De esta forma, una composición que comprende la sustancia
de esmalte activa a administrar puede adaptarse para la
administración por cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por
administración tópica (dérmica), oral, bucal, nasal, aural, rectal o
vaginal, o por administración a una cavidad del cuerpo tal como,
por ejemplo, la raíz de un diente o en canal de la raíz de un
diente. Además, una composición puede adaptarse a una administración
en relación con cirugía, por ejemplo, en relación a una incisión
dentro del cuerpo para promover la curación de heridas internas y
daños en tejido blando.
Como se ha mencionado anteriormente, una
composición de la sustancia de esmalte activa puede ser adecuada
para el uso durante la cirugía, por ejemplo, para aplicación local
(por ejemplo, en la cavidad oral) en forma de gel, película o
gránulo seco, o como una solución de aclarado o por tratamiento con
una pasta o crema en el tejido o en la superficie para evitar el
ataque bacteriano. En relación con la cirugía o con la implantación
en el área del canal de la raíz del diente, se puede emplear una
pasta para sellar la cavidad.
Las composiciones pueden formularse de acuerdo
con la práctica farmacéutica convencional, véase, por ejemplo,
“Remington's Pharmaceutical Sciences” y “Encyclopedia of
Pharmaceutical Technology”, editados por Swarbrick, J. & J.C.
Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.
Como se ha mencionado anteriormente, la
aplicación de una composición que comprende una sustancia de esmalte
activa está dirigida a la piel o mucosa. Por supuesto, otras
aplicaciones también pueden ser relevantes tales como, por ejemplo,
la aplicación en dentaduras postizas, prótesis, implantes y la
aplicación en cavidades del cuerpo tales como la cavidad oral,
nasal, y vaginal. La mucosa se selecciona preferiblemente entre la
mucosa oral, bucal, nasal, aural, rectal y vaginal. Además, la
aplicación puede realizarse directamente en o sobre una herida u
otros daños en tejido blando.
Además, la aplicación dentro del área
dental/odontológica es también de gran importancia. Algunos ejemplos
relevantes son la aplicación a bolsas periodontales, encías,
heridas en las encías u otras heridas localizadas en la cavidad
oral, o en relación con la cirugía oral.
Se anticipa además que, debido a las propiedades
antibacterianas de la sustancia de esmalte activa descrita en este
documento, puede aplicarse ventajosamente al diente o a las raíces
de los dientes para prevenir caries y/o la placa. Para apoyar este
uso, se ha demostrado (Weinmann, J.P. et al: Hereditary Disturbances
of enamel formation and calcification. J. Amer. Dent. Ass. 32:39-
418, 1945; Sundell S, Hereditary amelogenesis imperfecta. Una
estudio clínico genético epidemiológico en una población de niños
suecos, Swed Dent J Suppl 1986;31:1-38) que los
dientes que se han desarrollado de manera imperfecta (amelogénesis
imperfecta), y que por tanto contienen grandes cantidades de
amelogeninas, son notablemente resistentes a las caries.
Una composición farmacéutica que comprende una
sustancia de esmalte activa sirve como sistema de administración del
fármaco. En el presente contexto, el término "sistema de
administración del fármaco" denota una composición farmacéutica
(una formulación farmacéutica o forma de dosificación) que después
de la administración entrega la sustancia activo en el cuerpo de un
ser humano o un animal. De esta forma, el término "sistema de
administración del fármaco" abarca composiciones farmacéuticas
simples tales como, por ejemplo, cremas, pomadas, líquidos, polvos,
comprimidos, etc, así como formulaciones más sofisticadas tales como
nebulizadores, tiritas, vendajes, apósitos, dispositivos, etc.
Además de la sustancia de esmalte activa, una
composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la invención
puede comprender excipientes farmacéutica o cosméticamente
aceptables.
Un excipiente farmacéutica o cosméticamente
aceptable es una sustancia que es sustancialmente inocua para el
individuo al que se le administra la composición. Tal excipiente
satisface normalmente los requerimientos dados por las autoridades
nacionales sanitarias. Las farmacopeas tales como por ejemplo, la
Farmacopea Británica, la Farmacopea de Estados Unidos de América, y
la Farmacopea Europea establecen patrones para los excipientes
farmacéuticamente aceptables.
Si un excipiente farmacéuticamente aceptable es
adecuado para el uso en composiciones farmacéuticas depende
generalmente en que tipo de forma de dosificación se seleccione para
el uso en un tipo particular de herida. A continuación se dan
ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para
usar en distintos tipos de composiciones para el uso de acuerdo con
la invención.
A continuación se repasan las composiciones
farmacéuticas relevantes para el uso de acuerdo con la invención. El
repaso se basa en la vía de administración particular. Sin embargo,
debe apreciarse que en aquellos casos en los que un excipiente
farmacéuticamente aceptable puede emplearse en distintas formas de
dosificación o composiciones, la aplicación de un excipiente
farmacéuticamente aceptable no se limita a una forma de dosificación
particular o a una función particular del excipiente.
La elección del excipiente farmacéuticamente
aceptable en una composición para el uso de acuerdo con la invención
y la concentración óptima del mismo no puede predecirse generalmente
y debe calcularse en base a una evaluación experimental de la
composición final. Sin embargo, un especialista en la técnica de la
formulación farmacéutica puede encontrar una guía en por ejemplo
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Edition, Mack
Publishing Company, Easton, 1990.
Para la aplicación en la mucosa o en la piel, las
composiciones para el uso de acuerdo con la invención pueden
contener vehículos y excipientes convencionalmente no tóxicos
farmacéuticamente aceptables, incluyendo microsferas y
liposomas.
Las composiciones para el uso de acuerdo con la
invención incluyen todo tipo de composiciones sólidas,
semi-sólidas y líquidas. Las composiciones de
particular relevancia son, por ejemplo, pastas, pomadas, pomadas
hidrófilas, geles, hidrogeles, soluciones, emulsiones, suspensiones,
lociones, linimentos, champús, gelatinas, jabones, barras,
nebulizadores, polvos, películas, espumas, capas, esponjas (por
ejemplo, esponjas de colágeno), apósitos (tales como, por ejemplo,
apósitos absorbentes de herida), pociones, vendajes, tiritas y
dispositivos de administración transdérmica.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables
pueden incluir disolventes, agentes tampón, conservantes,
humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizadores,
emulsionantes, agentes de suspensión, agentes gelificantes, bases de
pomadas, potenciadores de la penetración, perfumes, y agentes
protectores de la piel.
Algunos ejemplos de disolventes son, por ejemplo,
agua, alcoholes, aceites vegetales o marinos (por ejemplo, aceites
comestibles tales como aceite de almendra, aceite de ricino, manteca
de cacao, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite
de lino, aceite de oliva, aceite de palmera, aceite de cacahuete,
aceite de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de
soja, aceite de girasol y aceite de té), aceites minerales, aceites
grasos (parafina líquida, polietilenglicoles, propilenglicoles,
glicerol, polialquilsiloxanos líquidos, y mezclas de los
mismos.
Algunos ejemplos de agentes tampón son, por
ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido
láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, etc.
Algunos ejemplos adecuados de conservantes para
el uso en composiciones son parabelenos tales como metilo, etilo,
p-hidrobenzoato de propilo, butilparaben,
isobutilparaben, isopropilparaben, sorbato de potasio, ácido
sórbico, ácido benzoico, metilbenzoato, fenoxietanol, bronopol,
bronidox, MDM hidantoína, butilcarbamato de yodopropinilo, EDTA,
cloruro de benzalconio, y alcohol bencílico o mezclas de
conservantes.
Algunos ejemplos de humectantes son glicerina,
propilenglicol, sorbitol, ácido láctico, urea, y mezclas de los
mismos.
Algunos ejemplos de agentes quelantes son EDTA
sódico y ácido cítrico.
Algunos ejemplos de antioxidantes son anisol
butilado hidroxi (BHA), ácido ascórbico y derivados del mismo,
tocoferol y derivados del mismo, cisteína, y mezclas de los
mismos.
Algunos ejemplos de emulsionantes son gomas de
ocurrencia natural, por ejemplo, goma de acacia o goma de
tragacanto; fosfatidas de ocurrencia natural, por ejemplo, lecitina
de soja, derivados del monooleato de sorbitan, grasas de la lana;
alcoholes de la lana; ésteres de sorbitan; monoglicéridos, alcoholes
grasos; ésteres de ácidos grasos (por ejemplo, triglicéridos de
ácidos grasos); y mezclas de los mismos.
Algunos ejemplos de agentes de suspensión son,
por ejemplo, celulosas y derivados de celulosa tales como, por
ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carragenina,
goma de acacia, goma arábica, tragacanto, y mezclas de los
mismos.
Algunos ejemplos de bases de gel, agentes que
aumentan la viscosidad o componentes que son capaces de absorber un
exudado de una herida son: parafina líquida, polietileno, aceites
grasos, sílice o aluminio coloidal, jabones de cinc, glicerol,
propilenglicol, tragacanto, polímeros de carboxivinilo, silicatos
de magnesio-aluminio, Carbopol®, polímeros
hidrófilos tales como, por ejemplo, almidón o derivados de la
celulosa tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa,
hidroxietilcelulosa u otros derivados de la celulosa, hidrocoloides
hinchables en agua, carrageninas, hialuronatos (por ejemplo gel
hialuronato que contiene opcionalmente cloruro sódico), y alginatos
incluyendo alginato de propilenglicol.
Algunos ejemplos de bases para pomadas son, por
ejemplo, cera de abeja, parafina, cetanol, palmitato de cetilo,
aceites vegetales, ésteres de sorbitan de ácidos grasos (Span),
polietilenglicoles y productos de condensación entre ésteres de
sorbitan de ácidos grasos y óxido de etileno, por ejemplo,
monooleato de polioxietilen sorbitan (Tween).
Algunos ejemplos de bases de pomada hidrófobas o
emulsionantes en agua son parafinas, aceites vegetales, grasas
animales, glicéridos sintéticos, ceras, lanolina, y
polialquilsiloxanos líquidos.
Algunos ejemplos de bases de pomadas hidrófilas
son macrogoles sólidos (polietilenglicoles).
Otros ejemplos de bases de pomada son jabones de
trietanolamina, alcohol graso sulfatado y polisorbatos.
Algunos ejemplos de componentes en polvo son:
alginato, colágeno, lactosa, polvo que es capaz de formar un gel al
aplicarlo a una herida (absorbe el líquido/exudado de la herida).
Normalmente, los polvos para la aplicación en grandes heridas deben
ser estériles y las partículas presentes deben estar
micronizadas.
Algunos ejemplos de otros excipientes son
polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica,
hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, pectina, goma xantana, goma de algarrobilla,
goma de acacia, gelatina, carbómero, emulsionantes tales como
vitamina E, estearatos de glicerilo, glucósido de cetanilo,
colágeno, carragenina, hialuronatos y alginatos y quito sanos.
Los apósitos y vendajes también son sistemas de
administración importantes de una sustancia de esmalte activa.
Cuando se usan apósitos como forma de dosificación, la sustancia de
esmalte activa puede mezclarse con otros materiales/ingredientes
antes o durante la fabricación del apósito, o, el apósito puede
recubrirse de alguna forma con la sustancia de esmalte activa, por
ejemplo, sumergiendo el apósito en una solución o dispersión de la
sustancia de esmalte activa o rociando con un nebulizador una
solución o dispersión de la sustancia de esmalte activa en el
apósito. Alternativamente, la sustancia de esmalte activa puede
aplicarse en forma de polvo al apósito. Los apósitos pueden estar en
forma de apósitos absorbentes de heridas para la aplicación a
heridas con exudados. Los apósitos también pueden estar en forma de
apósitos de hidrogel (por ejemplo, polímeros reticulados tales como,
por ejemplo, intrasite® que contiene carboximetilcelulosa,
propilenglicol, o polisacáridos, disacáridos y proteínas) o en
forma de apósitos oclusivos tales como, por ejemplo, alginatos,
quitosan, películas, láminas, colágeno, placas, polvos, espumas o
esponjas hidrófilas de poliuretano, espumas (por ejemplo, de
poliuretano o silicona), hidrocoloides (por ejemplo,
carboximetilcelulosa, CMC), colágeno y apósitos basados en ácido
hialurónico incluyendo combinaciones de los mismos.
Los apósitos de alginato, quitosano e
hidrocoloides absorben el exudado de la herida cuando se colocan en
una herida. Cuando hacen esto, producen un gel acuoso en la
superficie de la herida y se cree que este gel es beneficioso para
la curación de la herida debido a la retención de humedad en la
herida.
También se contempla que la sustancia de esmalte
activa se incorpore en un adhesivo al tejido que comprenda también,
por ejemplo, fibrinógeno y trombina y opcionalmente Factor XIII u
otro factor de coagulación del plasma para proporcionar homeostasis.
El adhesivo al tejido puede prepararse como una premezcla de la
sustancia de esmalte activa, fibrinógeno y opcionalmente Factor
XIII, añadiendo trombina a la premezcla inmediatamente antes de
aplicar el tejido en la herida. Alternativamente, la premezcla de
fibrinógeno y sustancia de esmalte activa y opcionalmente Factor
XIII puede aplicarse en la herida antes de la aplicación de
trombina. In situ, la trombina transforma el fibrinógeno a
fibrina reproduciendo por tanto el proceso de coagulación que ocurre
naturalmente en la curación de heridas. La presencia de la sustancia
de esmalte activa en el tejido adhesivo puede servir para acelerar
el proceso de curación de la herida como se ha descrito
anteriormente. Un producto comercial adecuado para la inclusión de
la sustancia de esmalte activa es Tisseel®, un sellador de fibrina
de dos componentes fabricado por Immuno, AG, Viena, Austria.
En una formulación de pasta dentífrica o de
aclarado bucal u otra formulación para la aplicación en dientes o
raíces de dientes, la sustancia de esmalte activa puede estar
presente en estado disuelto en un vehículo de pH ligeramente ácido o
como dispersión en un vehículo de pH neutral. Se anticipa que en el
uso de la sustancia de esmalte activa puede formar una capa
protectora en la superficie de los dientes, evitando por tanto el
acoplamiento de las bacterias que producen las caries (véase el
Ejemplo 4 a continuación). En tales preparaciones de cuidado dental,
la sustancia de esmalte activa puede formularse junto con uno o más
compuestos que tienen un efecto preventivo de caries, especialmente
flúor u otro elemento de traza tal como vanadio o molibdeno. A pH
neutral, se cree que el elemento de traza se une a (por ejemplo, por
enlaces iónicos) o se empotra en la sustancia de esmalte activa de
la cual se libera para ejercer su efecto preventivo de caries
cuando la sustancia de esmalte activa se disuelve a un pH de
aproximadamente 5,5 o menos, por ejemplo, debido a la producción de
ácido por las bacterias que producen las caries.
Las composiciones mencionadas anteriormente para
la administración tópica son más adecuadas para aplicar directamente
en las heridas o pueden ser adecuadas para la aplicación en o para
la introducción en orificios relevantes del cuerpo, por ejemplo, el
orificio rectal, uretral, vaginal, aural, nasal, u oral. La
composición puede aplicarse directamente en la parte a tratar tal
como, por ejemplo, en la mucosa, o por cualquier otra vía
conveniente de administración.
Las composiciones que han demostrado ser
importantes en relación con la aplicación tópica son aquellas que
tienen propiedades tixotrópicas, es decir, la viscosidad de la
composición se afecta, por ejemplo, por agitación, de forma que se
puede reducir la viscosidad de la composición en el momento de la
administración y cuando la composición se ha aplicado, la viscosidad
aumenta de forma que la composición permanece en el lugar de
aplicación.
Las composiciones adecuadas para el uso de
acuerdo con la invención pueden presentarse también en forma de
suspensiones, emulsiones o dispersiones. Tales composiciones
contienen la sustancia de esmalte activa en mezcla con un agente de
dispersión, un agente de humidificación, un agente de suspensión y/o
uno o más conservantes y otros excipientes farmacéuticamente
aceptables. Tales composiciones son también adecuadas para el uso en
la administración de la sustancia de esmalte activa en, por ejemplo,
una mucosa intacta o dañada, tal como la mucosa oral, bucal, nasal,
rectal o vaginal, o para la administración en la piel intacta o
dañada, o en heridas.
Algunos agentes de dispersión o de humidificación
adecuados son, por ejemplo, fosfatidas de ocurrencia natural, por
ejemplo, lecitina, o lecitina de soja, productos de condensación
del óxido de etileno con, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol
alifático de cadena larga, o un éster parcial derivado de ácidos
grasos y un hexitol o anhídrido de hexitol, por ejemplo, estearato
de polioxietileno, monooleato de polioxietilen sorbitol, monooleato
de polioxietilen sorbitan, etc.
Algunos agentes de suspensión adecuados son , por
ejemplo, gomas de ocurrencia natural tales como, por ejemplo, goma
de acacia, goma xantana, o goma de tragacanto; celulosas tales como,
por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina
(por ejemplo, Avicel® RC 591, metilcelulosa); alginatos y quitosanos
tales como, por ejemplo, alginato sódico, etc.
Algunos ejemplos de conservantes para el uso en
composiciones de acuerdo con la invención son los mismos que los
mencionados anteriormente.
Las composiciones para el uso de acuerdo con la
invención pueden administrarse también por vía oral. Las
composiciones orales adecuadas pueden estar en forma de formulación
particulada o en una forma de dosificación sólida,
semi-sólida, o líquida.
Las composiciones para uso oral incluyen formas
de dosificación sólidas tales como, por ejemplo, polvos, gránulos,
granulados, parches, comprimidos, cápsulas, comprimidos
efervescentes, comprimidos masticables, pastillas, comprimidos de
liberación inmediata, y comprimidos de liberación modificada así
como formulaciones en fluido o líquidas tales como, por ejemplo,
soluciones, suspensiones, emulsiones, dispersiones y mezclas.
Además, la composición puede estar en forma de polvos, polvos
dispersables, o gránulos adecuada para la preparación de una
suspensión acuosa por adición de un medio líquido tal como, por
ejemplo, un medio acuoso.
Con respecto a formas de dosificación sólidas
para uso oral (o tópico), una composición para el uso de acuerdo
con la invención contiene normalmente la sustancia de esmalte activa
y cualquier otra sustancia opcionalmente en mezcla con uno o más
excipientes farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes pueden
ser, por ejemplo,
diluyentes o agentes de relleno inertes, tales
como sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina,
almidones incluyendo almidón de patata, carbonato cálcico, cloruro
sódico, lactosa, fosfato cálcico, sulfato cálcico, o fosfato
sódico;
\newpage
agentes de granulación y disgregación, por
ejemplo, derivados de la celulosa incluyendo celulosa
microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata,
croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico y quitosanos;
agentes aglutinantes, por ejemplo, sacarosa,
glucosa, sorbitol, acacia, ácido algínico, alginato sódico,
gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa
microcristalina, silicato de magnesio aluminio, carboximetilcelulosa
sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa,
polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, o un polietilenglicol;
y quitosanos;
agentes lubricantes incluyendo deslizantes y
antiadhesivos, por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de
cinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o
talco.
Otros excipientes farmacéuticamente aceptables
pueden ser colorantes, aromatizantes, plastificantes, humectantes,
agentes tampón, etc.
En aquellos casos en los que la composición
farmacéutica está en forma de dosificación sólida (por ejemplo, un
comprimido o una cápsula), la forma de dosificación unitaria puede
proporcionarse con un recubrimiento como uno o más de los
recubrimientos mencionados anteriormente.
En aquellos casos en los que la composición está
en forma de comprimido, cápsula o composición de múltiples unidades,
la composición o las unidades individuales o un comprimido o una
cápsula que contiene las unidades individuales puede recubrirse, por
ejemplo, con un recubrimiento de azúcar, un recubrimiento de
película (por ejemplo, basado en hidoxipropilmetilcelulosa,
metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa,
carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato (Eudragit),
polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona) o un recubrimiento
entérico (por ejemplo, basado en un copolímero de ácido metacrílico
(Eudragit), ftalato de acetato de celulosa, ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de
hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo,
shellac y/o etilcelulosa). Además, puede emplearse un material de
retraso tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o
diestearato de glicerilo.
Para la aplicación en la mucosa rectal o vaginal,
las composiciones adecuadas de acuerdo con la invención incluyen
supositorios (de tipo emulsión o suspensión), enemas, y cápsulas
rectales de gelatina (soluciones o suspensiones). Las bases de
supositorio farmacéuticamente aceptables incluyen manteca de cacao,
ácidos grasos esterificados, gelatina glicerinada, y diversas bases
solubles o dispersables en agua como polietilenglicoles y ésteres de
ácidos grasos de polioxietilen sorbitan. Pueden incorporarse
diversos aditivos como, por ejemplo, potenciadores o
tensioactivos.
Para la aplicación en la mucosa nasal (así como
en la mucosa oral), los nebulizadores y aerosoles son composiciones
adecuadas de acuerdo con la invención. En una composición nasal
típica, la sustancia de esmalte activa está presente en forma de
formulación particulada opcionalmente dispersa en un vehículo
adecuado. Los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables y
opcionalmente otros materiales farmacéuticamente aceptables
presentes en la composición tales como diluyentes, potenciadores,
aromatizantes, conservantes, etc. se seleccionan de acuerdo con la
práctica farmacéutica convencional de una manera que comprenden los
especialistas en la técnica de formular productos farmacéuticos.
En una composición farmacéutica para usar de
acuerdo con la invención en la piel o mucosa, una sustancia de
esmalte activa está generalmente presente en una concentración en el
intervalo de 0,01% a aproximadamente 99,9% p/p. La cantidad de
composición aplicada tendrá como resultado una cantidad de proteína
por cm^{2} de herida/piel/área de tejido correspondiente de
aproximadamente 0,01 mg/cm^{2} a aproximadamente 20 mg/cm^{2}
tal como de aproximadamente 0,1 mg/cm^{2} a aproximadamente 15
mg/cm^{2}.
La cantidad aplicada de composición depende de la
concentración de sustancia de esmalte activa en la composición y de
la velocidad de liberación de la sustancia de esmalte activa de la
composición, pero está generalmente en un intervalo que corresponde
de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/ml. En algunos casos
son deseables concentraciones mayores y también se pueden obtener
tal como una concentración de al menos aproximadamente 100
mg/ml.
Cuando se aplica la composición en la cavidad
oral, las siguientes dosis son relevantes:
El área experimental del defecto (en monos) en la
cavidad oral tiene normalmente un tamaño de aproximadamente 4 x 2 x
5-6 mm que corresponden a 50 \mul o de
aproximadamente 0,025 a aproximadamente 0,15 mg de proteína
total/mm^{2} o aproximadamente 2,5-15 mg/cm^{2}.
Normalmente, se aplica hasta 0,5 ml tal como, por ejemplo, 0,4,
0,3, 0,2 o 0,1 ml de una composición con una concentración de
aproximadamente 1-40 mg/ml tal como, por ejemplo,
5-30 mg/ml.
El área del defecto en humanos en la cavidad oral
debida a enfermedades periodontales tiene aproximadamente un tamaño
de aproximadamente 5-10 x 2-4 x
5-10 mm que corresponde a aproximadamente 200 \mul
y normalmente se aplica como máximo aproximadamente
0,5-1 ml tal como aproximadamente
0,2-0,3 ml por diente de una composición que tiene
una concentración de aproximadamente 1-40 mg de
proteína total/ml tal como, por ejemplo, 5-30 mg/ml.
0,2-0,3 mg/ml corresponde a 6 mg de proteína por
25-100 mm^{2} o aproximadamente 0,1 mg/mm^{2} si
se calcula sólo en la superficie de la raíz. Normalmente, se aplica
un volumen excesivo para permitir la cobertura de todas las
superficies. Incluso para varias capas se necesitaría sólo una
pequeña parte de las cantidades mencionadas anteriormente.
Generalmente, se aplica aproximadamente
0,1-0,5 ml tal como, por ejemplo,
0,15-0,3 ml o aproximadamente
0,25-0,35 ml de una composición que comprende la
sustancia de esmalte activa en volúmenes de defectos en la los
alvéolos de extracción (agujeros después de la extracción de
dientes). La concentración de sustancia de esmalte activa en la
composición es normalmente aproximadamente 1-40 mg
de proteína total/ml tal como, por ejemplo, 5-30
mg/ml. Cuando se aplican 0,3-0,4 ml de tal
composición para muelas del juicio, este volumen corresponde a
aproximadamente 0,1 mg/cm^{2} (alveolo calculado como un cilindro
con radio 5 mm y altura 20 mm).
La concentración de sustancia de esmalte activa
en una composición farmacéutica depende de la sustancia de esmalte
específica, su potencia, la gravedad de la enfermedad a prevenir o
tratar, y la edad y estado de salud del paciente. Los métodos
aplicables para seleccionar concentraciones relevantes de sustancia
de esmalte activa en la composición farmacéutica son conocidos por
los especialistas en la técnica y pueden realizarse de acuerdo con
las pautas establecidas para una buena práctica clínica (GCP) o
regulaciones de Exención de Nuevos Fármacos Experimentales
("IND") como las descritas en, por ejemplo, el Patrón
Internacional ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of medical
devices, 1994 y ICH (Comité Internacional para la harmonización):
Harmonised tripartite guideline for good clinical practice,
Brookwood Medical Publications, Ltd, Surrey, UK, 1996. Un
especialista en la técnica, por medio de los métodos descritos en
los libros de texto, pautas y regulaciones descritas anteriormente
así como con el conocimiento general común del campo, sería capaz
de seleccionar el régimen de regulación exacto a implementar para
cualquier sustancia de esmalte activa y/o seleccionar otras
sustancias activas y formas de dosificación usando exclusivamente
procedimientos de experimentación rutinarios.
En otros aspectos la invención se refiere a
métodos para reducir la infección y prevenir y/o tratar la
inflamación, comprendiendo estos métodos la administración a un
mamífero en necesidad de tal tratamiento de una cantidad eficaz de
sustancia de esmalte activa.
Debe apreciarse, que los detalles y particulares
que conciernen al uso de la sustancia de esmalte activa son los
mismos o análogos que los detalles y particulares que conciernen
otros aspectos de uso (aspectos antibacteriano y antiinflamatorio) y
a los aspectos del método discutidos anteriormente, y esto significa
que cuando sea apropiado, las afirmaciones anteriores que conciernen
a la sustancia de esmalte activa, preparación de i) una sustancia de
esmalte activa, una preparación que contiene una sustancia de
esmalte activa, iii) una composición farmacéutica que contiene una
sustancia de esmalte activa, así como a las propiedades mejoradas y
usos de la misma se aplican mutatis mutandis a todos los aspectos de
la invención.
La invención se describe adicionalmente con
referencia a los dibujos adjuntos en los que
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la síntesis
de DNA en células humanas PDL con EMD o células no estimuladas;
La Fig. 2 es un gráfico que muestra la producción
de TGF-\beta1 en células humanas PDL estimuladas
con EMD y células no estimuladas;
La Fig. 3 es un dibujo esquemático de una cámara
de flujo y un ordenador usando en el experimento de flujo descrito
en los Ejemplos 3 y 4 a continuación;
Las Figs. 4, 5, y 6 son gráficos que muestran los
resultados de tres experimentos distintos que muestran el
acoplamiento de Actinomyces viscosus a placas de vidrio
tratadas con EMD y ácido acético, respectivamente;
Las Figs. 7, 8 y 9 son gráficos que muestran los
resultados de tres experimentos distintos que muestran el
acoplamiento de Streptococcus mutans a placas de vidrio
tratadas con EMD y ácido acético, respectivamente.
La Fig. 10A es una fotografía de
rayos-X que muestra el daño postoperativo después de
la extracción de una muela del juicio; y
La Fig. 10B es una fotografía de
rayos-X que muestra la regeneración del ligamento
periodontal después del tratamiento con EMD, como se describe en el
Ejemplo 12 a continuación.
Derivados de la matriz de esmalte, EDMOGAIN® de
BIORA AB, S-205 12 Malmö, Suecia que contiene 30 mg
de proteína de la Matriz Esmalte liofilizada (en lo sucesivo
abreviada como EMD) y 1 ml de Solución Vehículo (Alginato de
Propilenglicol), que se mezclan antes de la aplicación, a menos que
la proteína y el Vehículo se prueben por separado. La relación de
peso es aproximadamente 85/5/10 entre los máximos de proteínas a 20,
14 y 5 kDa, respectivamente.
EMD tratada con calor es EMD que se ha calentado
durante 3 horas a aproximadamente 80ºC para inactivar proteasas
residuales.
La proteína amelogenina 20 kDa y el Péptido
Amelogenina Rico en Tirosina (TRAP) 5 kDa se aislaron de la EMD
usando cromatografía de permeación en gel HPLC (TSK
G-2000 SW equilibrado con acetonitrilo al 30 en NaCl
al 0,9%) y se purificaron por cromatografía de fase inversa
(Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia- Upjohn, Suecia) usando
un gradiente de acetonitrilo. La proteína/polipéptidos separados se
añadieron después a distintas cantidades a la Solución Vehículo de
EMDOGAIN®, a menos que se prueben por separado.
El ácido hialurónico fue HMT-028
(PM 990.000) de Sikagaku Corporation, Tokio, Japón.
Las bacterias y levaduras se aislaron
principalmente de pacientes, se clasificaron por sus propiedades
metabólicas y antígenas de acuerdo con procedimientos
convencionales. Las especies de bacterias y levaduras usadas se
enumeran en la tabla a continuación.
La albúmina de suero (bovino) y el Colágeno de
Tipo I (bovino) se obtuvieron en Sigma, St. Louis, U.S.A.).
Las placas de agar fueron "agar de infusión
Brain Hart" de Difco suplementadas con glóbulos rojos humanos
(100 ml por litro de agar).
Se preparó una solución stock de EMD disolviendo
un vial (que contiene 30 mg de EMD) en 3 ml de HAc al 0,1% filtrado
estéril. Se añadieron 60 \mul de la solución de stock EMD a 6000
\mul de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco que contenía suero
de ternera fetal al 10% y 1% de una solución de penicilina-
streptomicina. Se añadieron 300 \mul de la mezcla a cada pocillo
de placas de microtitulación de 96 pocillos (NUNC A/S, Dinamarca,
Cat. # 167008). Se añadieron 1000 células humanas del ligamento
periodontal (PDL) (obtenidas de tejidos periodontales en humanos
sanos de individuos a los que les extraen los premolares por razones
ortodónticas, y cultivadas sustancialmente como se ha describe en
Somerman et al., J. Dental Res. 67, 1998, pág.
66-70) a cada pocillo y se incubaron a 37ºC,
CO_{2} al 5% durante 5 días.
Las células PDL usadas como control se cultivaron
en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco sustancialmente como se ha
descrito anteriormente, pero en ausencia de EMD.
Después de la incubación, las células se
sometieron a un inmunoensayo de proliferación células midiendo la
incorporación de la
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer
Mannheim, Cat. # 1647 229). En este procedimiento, se incorpora BrdU
en lugar de timidina en el ADN de células en desarrollo. La
incorporación de la BrdU se detecta con un análisis ELISA, y la
cantidad de BrdU medida en el análisis es una indicación de la tasa
de síntesis de AND y por consiguiente de la tasa de proliferación
células de las células PDL.
Los resultados que aparecen en la Fig. 1 muestran
que las células PDL cultivadas en presencia de EMD muestran un tasa
significativamente mayor de proliferación que las células PDL
cultivadas en ausencia de EMD.
A 100 \mul del sobrenadante celular de la placa
de microtitulación se le añaden 20 \mul de HCl 1N seguido de
incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de
incubación se neutralizó con 20 \mul de NaOH 1N/HEPES 0,5M. Se
añadieron 100 \mul de esta mezcla a 400 \mul de un tampón de
dilución. 200 \mul de la dilución se sometieron a ELISA usando el
kit Quantikines™ (Cat. # DB100) disponible en R&D Systems, UK,
de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados de la Fig. 2 muestran un aumento
pronunciado en la producción de TGF-\beta1 en
células PDL incubadas con EMD en relación a células PDL no incubadas
con EMD.
El propósito de esta ejemplo es demostrar la
influencia inhibidora de los derivados de la matriz de esmalte y de
las proteínas de la matriz de esmalte en el crecimiento microbiano
in vitro.
Las proteínas usadas en este ejemplo se
disolvieron en solución salina fosfatada con el pH ajustado a 5,5
con ácido acético. Los microbios empleados se suspendieron en PBS pH
6,8 a una concentración final con un OD_{600} de 0,4.
Se colocaron 50 microlitros de EMDOGAIN® (30 mg
de EMD en 1 ml de PGA) y 50 microlitros de EMD, EMD tratado con
calor, y fracciones de EMD A, B, C, y H (todas 10 mg de proteína por
ml de tampón PBS) en una placa de agar y se dejaron secar al aire
encima de la placa (diámetro 9 cm, agar convencional para
determinación de suplementos de resistencia añadidos requeridos por
cada microbio). Después, se añadió una solución homogénea de
microbios (1 ml, OD_{280}=0,5) extendiendo la suspensión encima de
las placas de agar, y las placas se incubaron a 35ºC durante 3 días
(cultivos aeróbicos) o 14 días (cultivos anaeróbicos) en una
atmósfera enriquecida en CO_{2} o en condiciones anaeróbicas de
acuerdo con los requerimientos individuales de crecimiento. Todos
los cultivos se inspeccionaron a diario. El Colágeno de tipo 1 y la
albúmina de suero (ambos bovinos) se probaron en las mismas
condiciones como controles. También se aplicó alginato de
propilenglicol no diluido (PGA-vehículo EMD), tampón
PBS y ácido hialurónico (HA - vehículo EMD alternativo) como
controles negativos.
Los resultados se muestran en la Tabla 1. Sólo
los derivados de la matriz de esmalte o las proteínas de la matriz
de esmalte o sus derivados inhibieron el crecimiento de algunos
microbios. No hubo signos de zonas de difusión alrededor de la
proteína indicando que las proteínas de EMD aplicadas se agregaron
en la superficie de agar y que sólo se inhibió el crecimiento de los
microbios en contacto directo con las proteínas. Cuando se
recogieron las muestras de la zonas de inhibición y se cultivaron en
medio líquido (caldo LB con suplementos), los monocultivos de
microbios originales podían revivir lo que sugiere que las proteínas
activas no son microbicidas. Todos los controles dieron negativo,
indicando que ningún mecanismo no específico influyó en los
resultados.
\newpage
Todos los resultados en la tabla están
registrados el segundo día (cultivos aeróbicos) o después de cinco
días (cultivos anaeróbicos) de incubación.
Estos resultados muestran que la EMD que contenía
proteínas o péptidos, cuando se le permite agregarse en una
superficie puede inhibir el crecimiento de ciertos rods gram
negativos y algunos cocci gram positivos. En base a las
características básicas de comportamiento de las proteínas EMD (ref.
jpc) y dado que el efecto no es microbicida, una explicación
razonable para el efecto observado es que los agregados de proteína
forman una barrera insoluble que separa los microbios del sustrato
de crecimiento que requieren.
Se investigó el efecto de los EMD en el
acoplamiento inicial de Actinomyces viscosus, un organismo
oral que está ampliamente presente en la placa dental pero que
normalmente no le se considera asociado con la periodontitis
grave. Aunque este microorganismo puede formar agregados con
Porphyromonas gingivales y de esta forma puede influir en la
colonización de la superficie de la raíz con potenciales patógenos
periodontales, los Actinomyuces spp se encuentran en
proporciones relativamente grandes en lugares subgingivales sanos
(estos descubrimientos se corroboran con lo de Lijemark et al.,
Microbiol. Immunol. 8, 1993, pág. 5-15, quien
descubrió que, después del tratamiento periodontal, las
proporciones de Actinomyces spp. se reducían
significativamente. Haffajee et al., J. Clin. Periodont. 24,
1997, pág. 767- 776 concluyó con conteos microbiológicos en la placa
subgingival que en sujetos con una buena respuesta al tratamiento
periodontal inicial, A. viscosus y T. denticola eran
relativamente abundantes.
El Actinomyces viscosus HG85 fue
proporcionado por Dr. A.J. van Winkelhoff (Dept. of Oral
Microbiology, ACTA). EMDOGAIN® fue proporcionado por BIORA (Malmö,
Suecia). El detergente RBS se compró en Fluka (Fluka Chemie AG,
Buchs, Switzerland).
Se inoculó A. viscosus de placas de agar
en cultivo por lotes en medio de Schaedler durante 24 horas a 37ºC.
Este cultivo se usó para inocular un segundo cultivo en caldo de
Schaedler que se dejó crecer durante 16 horas. Las células se
recogieron por centrifugación (5 minutos a 6500 x g) y se lavaron
dos veces con agua desmineralizada. Posteriormente, los
microorganismos se sonicaron durante 20 segundos a 30 W (Vibra Cell
modelo 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) para romper
las cadenas y los agregados bacterianos. La sonicación se realizó de
forma intermitente mientras se refrigeraba en un baño con hielo y
agua. Las células se contaron usando un contador celular
Bürker-Türker. Finalmente, se suspendió A. viscosus
en un tampón de adhesión (fosfato potásico 2mM, cloruro potásico 50
mM, y cloruro cálcico 1 mM, pH 6,8).
Las placas de vidrio se limpiaron meticulosamente
por sonicación en detergente RBS al 5%, aclarado total con agua del
grifo, lavado en metanol y aclarando finalmente con agua destilada.
Este procedimiento produce un ángulo de contacto con el agua de cero
grados. Se disolvió EMD en ácido acético 0,01 M en una concentración
de 7,5 mg/ml. Las placas de vidrio se dividieron en dos mitades
usando un marcador de teflón (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Se
aplicó ácido acético en un lado; 250 \mug EMD al otro. Las placas
de vidrio se secaron al aire en un armario de flujo durante
4-6 horas.
La cámara de flujo y el ordenador usados en este
experimento se muestran esquemáticamente en la Fig. 3. Antes de cada
experimento, todos los tubos y la cámara de flujo se llenaron con el
tampón de adhesión, con precaución de que el sistema no contuviese
burbujas de aire. Las placas de vidrio recubiertas formaban el fondo
de la cámara de flujo. La velocidad de flujo se estableció a 2,5
ml/min (que es comparable a la tasa de flujo media de saliva en
seres humanos). La suspensión bacteriana se hizo circular a través
del sistema durante aproximadamente 3-4 horas, y se
contó el número de bacterias que se adherían al sustrato. Se
realizaron tres experimentos independientes. Todos los experimentos
se realizaron con 3x10^{8} células por 250 ml de tampón de
adhesión. Durante el experimento, se tomaron imágenes cada
10-15 minutos en 6 lugares predeterminados sobre las
placas de control y recubiertas con EMD. La altura del canal de la
cámara de flujo paralela fue 0,6 mm.
Después de contar las células adheridas en todas
las imágenes, los datos se transformaron a bacterias por centímetro
cuadrado. Para cada experimento, se usó el número final de
microorganismos por cm^{2} para los análisis estadísticos (prueba
de la T de Student para observaciones emparejadas usando n como
número de experimentos).
El experimento X (Fig. 4) mostró un aumento
gradual de la cantidad de microorganismos acoplados, especialmente
durante los primeros 150 min. de flujo. Después de este intervalo de
tiempo, el número de microorganismos acoplados a los EMD alcanzó un
máximo de 2,0x10^{6} bacterias por cm^{2} que era
aproximadamente cuatro veces mayor que el aspecto de la placa de
vidrio tratada con ácido acético.
Además, en el Experimento 2 (Fig. 5), los EMD
estimularon espectacularmente el acoplamiento de A. viscosus
al sustrato. Sin embargo, al inicio del experimento el efecto era
menos evidente. Quizás, esto se debe a la menor densidad de los
organismos usados en el sistema de flujo. Después de 90 minutos el
número de bacterias acopladas a los EMD aumentó gradualmente en
relación al control, alcanzando un máximo de 1,4x10^{6} por
cm^{2} después de 3 horas, un aumento triple.
El tercer experimento (Fig. 6) mostró una
estimulación de la adherencia de A. viscosus al recubrimiento
de EMD incluso después de 5 minutos de flujo. Los EMD indujeron un
rápido aumento en el número de organismos acoplados durante los
primeros 45 minutos. Después, el acoplamiento continuó
progresivamente. El acoplamiento al lado tratado con ácido acético
mostró un patrón similar pero con menos microorganismos
adhiriéndose. Después de 200 minutos, el acoplamiento al
recubrimiento de EMD era dos veces mayor que en la superficie
tratada con ácido acético.
En los 3 experimentos, de forma conjunta, la
diferencia demostró ser estadísticamente significativa
(p<0,05).
Con estos resultados, parece que EMD, usada como
recubrimiento en una superficie de vidrio, tiene un efecto
estimulatorio in vitro considerable en el acoplamiento de
A. viscosus. Aunque no se conoce todavía qué factores son
responsables de este mejor acoplamiento inicial, se asume que el
organismo interactúa con los restos prolina que están muy presentes
en el componente amelogenina de la mezcla de proteínas disponible en
el mercado. La adhesión bacteriana se determina a menudo mediante
reconocimiento con proteína-péptido y
lectina-carbohidrato específicos. Se conoce que
A. viscosus, con su fimbriae de tipo 1, se puede unir a
proteínas ricas en prolina como las Proteínas Ricas en Prolina (PRP)
salivares y colágenos de tipo I y III.
Las interacciones específicas entre EMD y ciertos
microorganismos orales puede tener consecuencias importantes para la
composición de la biopelícula en la cavidad oral, ya que puede
cambiar la ecología de la placa. Se pudiesen realizar cambios
ecológicos dirigidos a promover los organismos no asociados con
enfermedades periodontales, la aplicación de la EMD puede tener como
resultado una mejora de la enfermedad periondontal, sólo por esa
acción. Esto es, por supuesto, aparte de otros efectos beneficiosos
de EMD.
Existe una gran evidencia del papel causal de los
organismos de la placa en la patogénesis de enfermedades orales como
periodontitis y caries. De acuerdo con el modelo actual de formación
de la placa subgingival, se cree que los Streptococcus spp.
son los colonizadores principales de la superficie del diente.
Posteriormente, la placa se desarrolla por el crecimiento bacteriano
y por la acumulación posterior de otras especies bacterianas. Esta
acumulación puede ocurrir mediante uniones
bacteria-bacteria o puede estar mediada por
moléculas salivares. La formación de la placa está facilitada
también por la producción de macromoléculas extracelulares. S.
mutans se considera actualmente como una de las especies de la
biopelícula que pueden merecer más atención, dada su relación con la
caries dental. Aunque se ha demostrado que varias bacterias gram
positivas (es decir, S. mutans) causan pérdida alveolar de
hueso en animales gnotobióticos, estos microorganismos no parecen
ser contribuidores principales en la ecología de la bolsa
periodontal en desarrollo. En cualquier caso los microorganismos
potencialmente patógenos deben ser capaces de evitar la protección
del hospedador y los mecanismos inmunes, así como de iniciar la
destrucción del tejido hospedador.
El Streptococcus mutans NS fue
proporcionado amablemente por Dr. H. van der Mei (Materia Tecnica,
University of Groningen). EMDOGAIN® fue proporcionado por BIORA
(Malmö, Suecia). El detergente RBS se compró en Fluka (Fluka Chemie
AG, Buchs, Switzerland).
Se inoculó S. mutans de placas de agar en
cultivo por lotes en medio de caldo de Todd Hewitt durante 24 horas
a 37ºC. Este cultivo se usó para inocular un segundo cultivo en
caldo de Todd Hewitt que se dejó crecer durante 16 horas. Las
células se recogieron por centrifugación (5 minutos a 6500 x g) y
se lavaron dos veces con agua desmineralizada. Posteriormente, los
microorganismos se sonicaron durante 20 segundos a 30 W (Vibra Cell
modelo 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) para romper
las cadenas y los agregados bacterianos. La sonicación se realizó de
forma intermitente mientras se refrigeraba en un baño con hielo y
agua. Las células se contaron usando un contador celular
Bürker-Türker. Finalmente, se suspendió S.
mutans en un tampón de adhesión (fosfato potásico 2mM,
cloruro potásico 50 mM, y cloruro cálcico 1 mM, pH 6,8).
Las placas de vidrio se limpiaron meticulosamente
por sonicación en detergente RBS al 5%, aclarado total con agua del
grifo, lavado en metanol y aclarando finalmente con agua destilada.
Este procedimiento produce un ángulo de contacto con el agua de cero
grados. Se disolvió EMD en ácido acético 0,01 M en una concentración
de 7,5 mg/ml. Las placas de vidrio se dividieron en dos mitades
usando un marcador de teflón (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Se
aplicó ácido acético en un lado; 250 \mug EMD al otro. Las placas
de vidrio se secaron al aire en un armario de flujo durante
4-6 horas.
La cámara de flujo y el ordenador usados en este
experimento se muestran esquemáticamente en la Fig. 3. Antes de cada
experimento, todos los tubos y la cámara de flujo se llenaron con el
tampón de adhesión, con precaución de que el sistema no contuviese
burbujas de aire. Las placas de vidrio recubiertas formaban el fondo
de la cámara de flujo. La velocidad de flujo se estableció a 2,5
ml/min (que es comparable a la tasa de flujo media de saliva en
seres humanos). La suspensión bacteriana se hizo circular a través
del sistema durante aproximadamente 3-4 horas, y se
contó el número de bacterias que se adherían al sustrato. Se
realizaron tres experimentos independientes. Todos los experimentos
se realizaron con 3x10^{8} células por 250 ml de tampón de
adhesión. Durante el experimento, se tomaron imágenes cada
10-15 minutos en 6 lugares predeterminados sobre las
placas de control y recubiertas con EMD. La altura del canal de la
cámara de flujo paralela fue 0,6 mm.
Después de contar las células adheridas en todas
las imágenes, los datos se transformaron a bacterias por centímetro
cuadrado. Para cada experimento, se usó el número final de
microorganismos por cm^{2} para los análisis estadísticos (prueba
de la T de Student para observaciones emparejadas usando n como
número de experimentos).
En cada uno de los tres experimentos la EMD
mostró un efecto inhibidor en la tasa de acoplamiento de S.
mutans (Figs. 7, 8, 9; p<0,05). La inhibición ascendió
aproximadamente a 40-70% en comparación con los
controles tratados con ácido acético.
El primer experimento (Fig. 7) mostró después de
10 minutos de flujo una inhibición de la cantidad de S.
mutans acoplados a la superficie de vidrio recubierta con EMD.
Después de 3 horas, el acoplamiento se inhibió a aproximadamente el
60% del control.
En el segundo experimento (Fig. 8) EMP empezó a
inhibir el acoplamiento de S. mutans después de ½ hora de
flujo. El número de S. mutans adheridos a la EMD alcanzó un
máximo de 0,5 millón por cm^{2} después de aproximadamente 40
minutos de flujo. Después de 3 ½ horas, los recuentos eran de
aproximadamente 25% comparado con los controles.
El tercer experimento (Fig. 9) mostró una
inhibición del acoplamiento de S. mutans con la influencia
de EMD desde el inicio del procedimiento de flujo. Como en el
experimento 1, la inhibición ascendió a un 60% de los valores de
control después de 3 horas de flujo.
El presente estudio muestra que la EMD tiene un
efecto inhibidor significativo en la adherencia de S. mutans
a superficies de vidrio. Una posible explicación para esta
inhibición puede ser las presencia de compuestos hidrófobos en la
mezcla de EMD. Una de las proteínas presentes en abundancia en la
mezcla es amelogenina, una proteína que contiene, además de una
secuencia ácida hidrófila C-terminal, un núcleo
hidrófobo que contiene 100-300 residuos ricos en
prolina, leucina, metionina y glutamina. Saito et al., Arch.
Oral Biol. 42, 1997, pág. 539-545, descubrió que
se inhibía la adherencia de distintas cepas de S. mutans a
una proteína hidrófoba inmovilizada (OAIS). Los autores atribuyeron
el efecto a la carga negativa en la superficie celular de los
microorganismos (que es el caso para S. mutans). Otras
características de la superficie pueden estar también implicadas en
la adherencia afectada al sustrato. S. mutans contiene un
antígeno I/II de superficie que tienen una parte N- terminal
particularmente rica en alanina e incluye repeticiones en tandem. Se
predice que esta región es alfa-helicoidal,
adoptando una conformación en bobina, y puede ser responsable de la
hidrofobia de la superficie celular asociada con la expresión del
antígeno I/II.
Se precultivaron Prevotella intermedia y
Porphyromonas gingivalis durante 10-16 horas
a 37ºC en caldo tioglicolato suplementado con 0,5 mg/l de Vitamina K
y 5 mg/l de hermina en una atmósfera anaeróbica generada con sobres
GasPakPlus en jarras apropiadas. Cuando los cultivos alcanzaron un
OD_{600} de 0,1-0,2 correspondientes a densidades
celulares de 10^{6}- 10^{7} cfu (unidades que forman colonias)
por ml, se retiraron porciones de 100 \mul y las bacterias se
precipitaron por centrifugación. Las bacterias se resuspendieron en
100 \mul de una mezcla preparada recientemente de suero humano y
solución salina estéril, y las suspensiones que contenías
10^{5}-10^{6} células se transfirieron a tubos
Eppendorf estériles de 1,5 ml y se mezclaron con (i) 100 \mul de
preparación de EMD (3 mg de EMD en 0,1 ml de PGA), ii) 100 \mul de
vehículo PGA o iii) 100 \mul de la mezcla de suero/solución NaCl
como control de crecimiento. Se tomaron fracciones de 10 \mul para
los ensayos de crecimiento después de 0, 3, 6 y 24 horas. Las
muestras se diluyeron en serie en solución estéril de NaCl al 0,9% y
se colocaron 10 \mul de las etapas de dilución en placas de agar
Schaedler. Las condiciones de cultivo fueron las mismas que para los
precultivos. Las placas de agar se incubaron durante
3-4 días y se calcularon posteriormente las cfu y
las densidades celulares (cfu/ml). Todos los experimentos se
repitieron seis veces.
0 | 3h | 6h | 24h | |
P. intermedia | 100 | 160 | 25 | 10 |
P. gingivalis | 100 | 100 | 125 | 150 |
0 | 3h | 6h | 24h | |
P. intermedia | 100 | 140 | 25 | 10 |
P. gingivalis | 100 | 75 | 50 | 5 |
0 | 3h | 6h | 24h | |
P. intermedia | 100 | 40 | 0 | 0 |
P. gingivalis | 100 | 30 | 0 | 0 |
Los cultivos se inhibieron de forma destacada en
presencia de EMD en comparación con los controles sólo con vehículo
o sin adición de EMD.
El propósito de este ejemplo es mostrar la
influencia de los derivados de la matriz de esmalte y/o las
proteínas de la matriz de esmalte en la curación mejorada de heridas
en tejidos blandos después de la cirugía oral.
Se crearon defectos experimentales en el
periodontio marginal de los dientes de más de 50 monos macacos
retirando el cemento dental, la membrana periodontal y el hueso
marginal alveolar a una distancia cervico-apical de
aproximadamente 5 mm con un buril dental. Después se aplicó nada
(control) o derivado de la matriz de esmalte (obtenido de EMDOGAIN®
como el polvo liofilizado no reconstituido o como la composición
reconstituida) a los defectos experimentales. La concentración de
las proteínas en la composición reconstituida fue de
aproximadamente 5-30 mg/ml y el volumen aplicado
estaba en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2
ml por defecto.
La curación de la herida se evaluó visualmente
durante las siguientes 8 semanas. En los defectos en los que se
aplico EMDOGAIN® se dio una buena curación (sin enrojecimiento ni
inflamación) e insignificante formación de placa después de 2
semanas, cuando se quitaron las suturas, buena curación y poca
gingivitis después de 5 semanas y curación sin complicaciones
después de 9 semanas, cuando se terminaron los experimentos. En
cambio, los defectos de control mostraron inflamaciones con
retracciones y abundante placa después de 2 semanas, con graves
retracciones y gingivitis después de 5 y 8 semanas.
El propósito de este ejemplo es mostrar la
influencia de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas
de la matriz de esmalte en la rápida curación en pacientes después
de cirugía periodontal.
Se dividieron cincuenta y cinco (55) pacientes en
necesidad de cirugía periodontal en dos grupos, uno con cirugía
convencional con técnica modificada de colgajo de Widman (20
pacientes) y otro con el mismo procedimiento más la aplicación de
EMDOGAIN® (35 pacientes) (se aplicó una concentración de 30 mg
proteína/ml y aproximadamente 0,3 ml por diente). Ningún paciente
recibió antibióticos en el momento de la cirugía pero todos se
instruyeron para usar un lavado bucal aséptico (clorhexidina)
diariamente.
Se realizó una encuesta activa de los pacientes
en el momento de retirar las suturas (1-3 semanas
después de la cirugía). Mientras que 3 (15%) de los pacientes de
control tuvieron episodios post-quirúrgicos que
requirieron antibióticos, sólo uno (3%) de los pacientes tratados
con EMDOGAIN® necesitó tal tratamiento.
El propósito de este ejemplo es mostrar la
influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de
esmalte en la curación de heridas después de extracciones del tercer
molar. Los pacientes, de 30 años o más que requerían la retirada de
los terceros molares simétricos impactados o semiimpactados
mandibulares, se les extrajo un tercer molar por el método clásico
que implica un levantar un colgajo vertical para realizar la
osteoctomía y sección necesarias, mientras que el segundo se extrajo
y el alveolo se rellenó con EMDOGAIN® antes de suturar. Todos los
pacientes recibieron antibióticos (3 g Amoxicilina o 1 g de
Eritromicina) 1-2 horas antes de la cirugía y se les
dio Ibuprofeno (600 mg x 3) después de la cirugía. Después, se les
ordenó aclararse con Clorhexidina (0-1%, 10 ml x 2)
durante 4 semanas.
Las suturas se retiraron después de dos semanas.
El paciente y el dentista evaluaron la curación del sitio de control
y el tratado con EMDOGAIN®. En un centro, 9 pacientes tuvieron
extracciones contralaterales con/sin EMDOGAIN®. Un paciente tuvo una
ligera irritación de las suturas en ambos sitios, mientras que otro
paciente tuvo un dolor severo en el sitio de control, pero ningún
problema en el sitio tratado con EMDOGAIN®. En un segundo centro,
tres pacientes de seis tenían dolores sólo en el sitio de control.
Finalmente, en un tercer centro un paciente tuvo un episodio serio,
alveolitis, que se diagnóstico en el sitio de control de un
paciente. El sitio tratado con EMDOGAIN® curó sin problemas. Otro
paciente tuvo una ligera irritación en las suturas en ambos sitios
de extracción, pero sólo el sitio de control se inflamó y dolía y
requirió repetidas irrigaciones con solución salina y toma de
analgésicos.
Estos resultados clínicos indican que la
aplicación de EMDOGAIN® en los alvéolos de extracción después de la
extracción de muelas del juicio puede mejorar la curación y reducir
las inflamaciones dolorosas, frecuentes de otra manera.
El propósito de este ejemplo es mostrar la
influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de
esmalte en la curación de la alveolitis sicca (alveoalgia).
Después de la retirada de una raíz relicta 35
infectada, un paciente hombre, de 70 años, sufría dolores agudos e
inflamación en relación con el alveolo de la extracción. Cuando le
examinó su dentista era evidente que había desarrollado una
enfermedad de alveolitis sicca, en la cual en coágulo inicial se
había desintegrado y la pared ósea del alveolo estaba necrótica. El
hueso y los tejidos adyacentes estaban inflamados.
El paciente tenía un historial de insuficiencia
cardiaca y se trató con el anticoagulante Marevan. Como resultado de
su enfermedad tenia una circulación periférica reducida. El paciente
también fumaba varios cigarrillos al día.
La alveolitis se trató de la forma tradicional
con la retirada del hueso necrótico y la inducción de una nueva
hemorragia. Además, se movilizó la encía y se aplicó una sutura para
cerrar el alveolo. Después, el paciente se trató con penicilina
(apocilina 660 mg, 2 comprimidos por la mañana y por la tarde
durante 7 días) para combatir la infección y también se le dio
instrucciones de aclararse la boca dos veces al día con una
solución de clorhexidina. Después de cinco días, tras acabar el
régimen antibiótico, el paciente apareció en la clínica dental
quejándose todavía de dolores agudos. La inspección del área de la
operación se realizó visualmente y por palpación y sondeo y mostró
que la alveolitis persistía y que había presente más hueso
necrótico. Los rayos X revelaron una destrucción del hueso y
necrosis hasta la parte apical del alveolo. El área de la operación
se limpió una vez más y la lesión ósea resultante se rellenó con
EMDOGAIN® (30 mg/ml, se aplicó máx. 0,5 ml), y se realizó una nueva
sutura en la encía para cerrar el alveolo. No se aplicó ningún
tratamiento adicional, pero se mandó al paciente continuar con el
aclarado con la solución de clorhexidina. Dos días después, al
paciente informó a la clínica que el dolor y la inflamación habían
desaparecido. El examen clínico y la retirada de la sutura una
semana después del tratamiento con EMDOGAIN® reveló una buena
curación sin signos de tejidos necróticos o inflamación y una encía
intacta sin enrojecimiento o inflamación cubría el área de la
herida. No se produjo hemorragia o dolor al sondear o palpar. No se
observaba mal olor o sabor. El paciente no informó de ningún otro
dolor u otros síntomas.
El propósito de este ejemplo es mostrar el efecto
profiláctico de los derivados de la matriz de esmalte y de las
proteínas del esmalte en la alveolitis sicca.
Una paciente mujer de 82 años de edad sufrió una
fractura longitudinal de la raíz del diente 44. Este diente era un
pilar en un puente del diente 35 al 46, y había sufrido tratamiento
endodóntico varios años antes. Clínicamente, la encía que rodeaba al
diente estaba inflamada y había una bolsa en la encía hasta el ápice
del diente en el lado lingual. Los rayos X mostraron una
periodontitis grave local en el diente 44.
La paciente tenía una buena higiene oral, pero
debido a una enfermedad cardiaca tratada con Marevan
(anticoagulante), se provocaba fácilmente una hemorragia en las
encías cuando se sondeaba. Seis meses antes, a la paciente se la
había retirado quirúrgicamente el diente 35 debido a una
periodontitis grave. Después de esa operación, padeció una
enfermedad de larga duración de alveolitis sicca. La paciente estaba
muy preocupada con que la retirada del diente 44 tuviese las mismas
complicaciones postquirúrgicas que había sufrido entonces. Se le
informó que la combinación de su avanzada edad, el tratamiento con
Marevan, la raíz infectada y la bolsa en las encías aumentaba en
gran medida el riesgo de complicaciones postoperatorias como
alveolitis, pero que no había otra alternativa que retirar
quirúrgicamente los fragmentos de raíz.
La paciente accedió a retirar el diente 44, y,
como experimento, someterse a un tratamiento profiláctico con
EMDOGAIN® para prevenir el desarrollo de alveolitis sicca. La
paciente se anestesió con incisión y retirada del hueso bucal para
permitir retirar los fragmentos de raíz sin aflojar el puente.
Después de la retirada, el alveolo vacío se limpió mecánicamente y
se rellenó con EMDOGAIN® (30 mg/ml, se aplicó max. 0,5 ml) y el
colgajo se reposicionó con una sutura. Esa misma tarde la paciente
informó (por teléfono) de una hemorragia prolongada en el área de la
operación (el tratamiento con Marevan no se interrumpió antes de la
operación) pero ningún otro síntoma. Cuando se retiró la sutura
cinco días después de la cirugía, la herida en el tejido blando de
la operación había curado completamente. El paciente no informó de
ningún otro síntoma como dolor o inflamación después de la cirugía y
en general estaba muy satisfecha con el tratamiento.
El propósito de este ejemplo es mostrar la
influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de
esmalte en la curación de complicaciones post- traumáticas en un
paciente.
Después de un accidente, a un paciente se le
habían ligado los dientes frontales superiores en una clínica de
emergencia. El dentista encontró los dientes 11 y 21 sin vida, los
dientes 12 y 22 tenían fracturas mesio-incisivas de
clase I o II. La encía marginal estaba gravemente inflamada y
pobremente adherida a la superficie de los dientes. El paciente
tenía dolores y se quejaba de entumecimiento, inflamación y mal
sabor y olor. También había muestras de daño en el ligamento
periodontal en las regiones apicales de los dientes 11 y 21. Los dos
incisivos se limpiaron y se rellenó la raíz con
Ca(OH)_{2} mezclada recientemente.
Después de 4 semanas, la curación de la herida
todavía era insatisfactoria. La enfermedad había evolucionado a una
inflamación crónica y los dientes se consideraban perdidos. El
tratamiento convencional de este estado sería la extracción de los
cuatro incisivos y la sustitución con un puente o unos implantes.
Sin embargo, el paciente se oponía fuertemente a este tratamiento y
como último esfuerzo por salvar los dientes, se realizó una cirugía
de colgajo gingival en los cuatro dientes afectados (11, 12, 21,
22). Se usaron dos viales de EMDOGAIN® (60 mg en 3 ml). Como máximo
se aplicaron 0,2 ml de EMDOGAIN ® (30 mg/ml) por diente con una
jeringa antes de volver a suturar los colgajos con 7 puntos. Cuatros
de las suturas se retiraron 5 días después de la cirugía. Había una
mejora notable en el estado clínico y subjetivo. El paciente ya no
se quejaba de dolor, la sensación de entumecimiento había
desaparecido y no había mal olor o sabor en el área afectada.
Después de 2 semanas se retiraron las suturas restantes. La encía no
mostraba signos de inflamación y el paciente no tenía quejas. La
encía estaba firme y no tenía signos de inflamación. Estaba
firmemente acoplada al diente y/o al hueso alveolar, tenía un color
rosa (no el rojo que se observa en las áreas inflamadas) y con una
papila interdental normal (no inflamada). Además, se observó una
mejora notable en la reaparición del ligamento periodontal en las
partes afectadas de los dientes, y en las deposiciones de nuevo
hueso alveolar según se observaba en el examen con rayos X.
Una paciente mujer de 39 años sufría una
pericoronitis grave alrededor de su muela del juicio inferior
izquierda (38). En la clínica dental pública se le retiró
parcialmente la muela, dejando la mitad apical de la muela en la
mandíbula después de una fractura de raíz iatrogénica. Al dolerle,
la paciente se remitió a un especialista en cirugía oral al
siguiente día para la retirada quirúrgica del fragmento de
muela.
Dos días después de la cirugía la paciente acudió
a su dentista habitual para un control. Tenía el lado izquierdo
inflamado y mostraba un bloqueo completo y persistente del nervio
mandibular izquierdo. El examen clínico y las fotografías de rayos X
mostraron que durante la cirugía se había ocasionado un daño grave
por perforación en el hueso del mandíbula, al tercio apical de la
raíz distal del diente 37 y al canal del nervio mandibular (ver
rayos X, Fig. 1A), la profundidad de la bolsa sondeable en el diente
37 era de 25 mm de la parte superior de la corona del diente, lo que
era pasado el ápice de la raíz distal.
En un esfuerzo para inducir la curación del hueso
y del nervio y la regeneración del ligamento periodontal perdido en
el diente 37, la herida de la operación se abrió y se limpió.
Después del desbridamiento con solución salina el hueso expuesto, la
superficie de la raíz distal del 37 y el nervio mandibular se
cubrieron con EMDOGAIN® (30 mg/ml, aplicado en exceso; aprox. 1 ml)
y la herida se cerró con tres suturas. Se le dieron instrucciones
para aclararse la boca con una solución de clorhexidina (Corsodyl®)
dos veces al día durante los cinco días siguientes y se inició un
tratamiento profiláctico de cinco días con penicilina (Ampicilina,
660 mg x 4).
Después de diez días, la paciente volvió para el
control y para retirar las suturas. En este punto, la inflamación
había desaparecido y la curación del tejido blando era muy buena.
Sin embargo, la anestesia completa del nervio mandibular persistía y
se informo a la paciente de que el pronóstico de un nervio roto es,
como mínimo, incierto. En este punto, la anestesia hacía imposible
comprobar la viabilidad del diente 37. Normalmente un daño en la
raíz como el presentado en este caso conduce a una necrosis de la
pulpa y la anquilosis del diente. El tratamiento endodóntico está
indicado para prevenir estas complicaciones. Sin embargo, para ver
si el tratamiento experimental podría promover una curación del
ligamento periodontal, la paciente accedió a dejar el diente sin
tratar por el momento. Se establecieron citas para controles
mensuales.
Dos meses después del control anterior la
paciente tenía hiperestesia local en el labio izquierdo inferior,
un signo de curación del nervio. El tejido blando en la región
37-38 estaba perfectamente curado y sin cicatrices.
Los rayos X mostraron además la formación de hueso nuevo en el
alveolo de extracción. El diente 37 y el tejido circundante todavía
sufrían anestesia.
Cuatro meses después del tratamiento la anestesia
había desaparecido y el diente 37 parecía normal, hipersensible,
según ensayos de sensibilidad a la temperatura y electricidad. Los
rayos X mostraron que el relleno de hueso en el alveolo de
extracción era significativo y que había signos de regeneración
periodontal en la raíz distal del diente 37.
Cinco meses después del tratamiento inicial con
EMDOGAIN® la vitalidad del diente 37 parecía normal. En este
momento, en los rayos X era evidente una regeneración completa del
ligamento funcional periodontal (Fig. 1B) y el hueso alveolar
formado de apariencia normal había rellenado los defectos en el
hueso y en el alveolo de la extracción. No había signos de
anquilosis. La profundidad de sondeo de la bolsa en el diente 37
era sólo de 100 mm lo que era aproximadamente 1 mm por debajo de la
unión cemento-esmalte. Después de este control, la
paciente se despachó como curada completamente y se le dio cita para
controles ordinarios en intervalos de un año.
La curación completa y rápida de heridas
traumáticas en dientes y nervios próximos después de la retirada
quirúrgica de muelas del juicio es poco frecuente. Normalmente,
complicaciones tan graves como las descritas anteriormente acaban
con la retirada completa de la muela dañada, o, como mínimo, en la
retirada endodóntica de la pulpa de la muela y del relleno de la
raíz seguida de la curación del hueso con anquilosis. Un nervio
roto normalmente tarda de 8 a 12 meses en curar, si se cura, y a
menudo algunas regiones con parestesia persisten durante varios
años. La curación rápida y de buena calidad que se ha descrito
anteriormente es muy inusual y debe considerarse como una señal de
la capacidad de curación de heridas de EMDOGAIN®.
Rayos X:
A: Paciente después de dos días de la retirada
del diente 38. Apreciar el gran defecto distal en el diente 37 y la
implicación del canal mandibular. El hueso alveolar distobucal del
diente 37 también se retiró durante la cirugía.
B: Paciente cinco días después de la cirugía.
Apreciar el signo del ligamento completo funcional periodontal
(lamina dura) en el defecto en la parte distal de la raíz en el
diente 37. No hay signos de anquilosis. Ahora se puede observar el
contorno del canal mandibular y el alveolo de extracción está lleno
completamente con hueso. Apreciar también el nuevo hueso alveolar
distobucal en formación alrededor del diente 37.
Paciente
1
El paciente era un hombre, nacido en 1926 y tenía
un historial de repetidas trombosis con un mal síndrome
post-trombótico y úlceras venosas recurrentes. Se
trató sistémicamente con derivados del anticoagulante coumarin, y
las úlceras se trataron localmente con Crupodex (monómero de
dextrano) BIOGAL y una solución al 3% de ácido bórico.
En el momento de la inicialización del
tratamiento con EMDOGAIN® tenía una úlcera venosa con un forma
ovalada y un tamaño de 5 x 4 cm y una profundidad de 0,5 mm que
estaba en etapa de granulación con muy mala epitelización.
La herida se desinfecto con H_{2}O_{2} al 3%,
y se aplicó gota a gota 500 \mul de EMDOGAIN® y se extendió
uniformemente por medio de un palo estéril. El EMDOGAIN® se dejó
durante 10 minutos al aire y después la herida se cubrió con un
apósito Inadine (Johnson & Johnson) Rayon impregnado con una
pomada de povidona yodo al 10%.
Después de 5 días, la epitelización en la parte
proximal de la úlcera había tenido lugar y la úlcera se había
reducido en 1,8 x 2,2 cm y no había reacción secundaria
(inflamación). No se aplicó EMDOGAIN®. Después de 12 días había
tenido lugar más epitelización en la parte proximal y epitelización
nueva en la parte lateral en un área de aproximadamente 2 x 2 cm.
Casi la mitad de la úlcera se había curado. Se aplicaron 400 \mul
de EMDOGAIN®.
Después de 19 días, había tenido lugar más
epitelización en la partes proximal y lateral de la úlcera, pero no
en la parte distal en la que la úlcera era mas bien profunda
(aproximadamente 1 mm). Más de la mitad de la úlcera se había
curado. Se aplicaron 300 \mul de EMDOGAIN® el paciente no sentía
dolor en la úlcera, al contrario que antes del inicio del
tratamiento. Después, se aplicó EMDOGAIN® una vez a la semana hasta
el día 40 (a 200 \mul) y la úlcera se consideró completamente
curada después de 47 días.
Paciente
2
La paciente era mujer, nacida en 1949 y tenía
varices, insuficiencia venosa crónica y úlceras venosas
recurrentes. Tenía alergia polivalente hacia productos farmacéuticos
(fármacos, medicamentos), así como eccema varicosum. Se había
tratado previamente de forma local con gotas de Otosporina (sulfato
de polimixina B + sulfato de neomicina + hidrocortisona) y una
compresa de hidrocortisona.
En el momento del inicio del tratamiento con
EMDOGAIN®, su úlcera venosa tenía un diámetro de 1 cm y una
profundidad de 2mm. Se aplicaron 300 \mul de EMDOGAIN®.
Después de 5 días, la epitelización era de 2 mm
alrededor de la herida (en una circunferencia) y no había reacción
secundaria (inflamación). No se aplicó EMDOGAIN®. Después de 12 días
el tamaño de la úlcera había disminuido a aproximadamente 2 mm en
diámetro, se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.
Después de 19 días, la úlcera todavía era de
aproximadamente 2 mm en diámetro, pero el fondo estaba bien
granulado y la úlcera no era tan profunda (aproximadamente 0,2 mm).
Se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.
La misma paciente tenía otra úlcera en otra
pierna de aproximadamente 0,3 x 1 cm . Se aplicaron 200 \mul de
EMDOGAIN®.
Después de 7 días, había presente nueva
epitelización y una buena granulación en el fondo y el tamaño había
disminuido a aproximadamente 0,2 x 0,5 cm.
Después, se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN® a
cada úlcera una vez a la semana hasta el día 40, y las úlceras se
consideraron completamente curadas después de 47 días. No se
observaron reacciones alérgicas a EMDOGAIN®.
En la misma úlcera se había formado otra úlcera
con un tamaño de aproximadamente 0,5 x 0,3 cm a la cual se le
aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.
Paciente
3
La paciente era mujer, nacida en 1929 y tenía
trombosis venosa profunda después de erisipelas, y en el momento de
inicio del tratamiento con EMDOGAIN® tenía una ulcus cruris
muy grande con un tamaño de aproximadamente 15 x 19 cm en el estado
de progresión en el que la úlcera se consideraba un caso perdido
después de diversos tratamientos,. Se aplicaron 700 \mul de
EMDOGAIN® en un área de aproximadamente 3 cm en el borde
superior.
Después de 7 días, no había epitelización, pero
el área tratada era más transparente (más estructurada) con pequeñas
áreas dispersas de granulación y no había dolor en esta área ni
signos de progresión. Se añadieron 700 \mul de EMDOGAIN® en el
mismo área.
Después de 4 semanas, la paciente desarrolló una
infección, que se cree que fue causada por Pseudomonas, en la parte
distal de la úlcera no tratada con EMDOGAIN®. Se aplicaron 700
\mul de EMDOGAIN®. La infección había desaparecido después de 7
días.
Paciente
4
La paciente era mujer, nacida en 1947 y tenía
varices con tromboflebitis superficial después de erisipelas, y en
el momento del inicio del tratamiento con EMDOGAIN® tenía una
ulcus cruris con un tamaño de aproximadamente 2 x 0,8 cm con
un fondo limpio pero sin granulación. Se aplicaron 300 \mul de
EMDOGAIN®.
Después de 7 días, el tamaño de la úlcera había
disminuido a aproximadamente 0,7 x 0,3 cm y había epitelización
presente alrededor y granulación en el fondo. Se aplicaron 200
\mul de EMDOGAIN®, seguido de 100 \mul de EMDOGAIN® una vez a la
semana durante cinco semanas. La úlcera se consideró completamente
curada después de cinco semanas.
El objetivo de la investigación era evaluar se la
aplicación de EMDOGAIN® podía mejorar el resultado de curación del
tratamiento periodontal no quirúrgico. El objetivo específico de
este estudio fue evaluar el efecto en lugares de superficie
plana.
El estudio se realizó como un ensayo
intra-individual longitudinal de 6 meses de
duración. El estudio tiene un diseño doble ciego, de boca partida,
controlado con placebo y aleatorio.
Sujetos
14 pacientes remitidos a la Clínica de
Periodóntica, Departamento de Periodontología, Universidad de
Göteborg, para el tratamiento de una enfermedad periodontal
moderadamente avanzada.
Criterios de admisión
Al menos 3 superficies planas en dientes en cada
uno de 2 cuadrantes contralaterales con una profundidad de sondeo de
la bolsa = 5 mm, y al menos un par de sitios con una profundidad de
sondeo = 6 mm.
Los dientes seleccionados deben tener una pulpa
vital determinada por estimulación termal o eléctrica o, si se
someten a tratamiento del canal de la raíz, ser asintomático y sin
observaciones técnicas.
Después de un examen basal, a todos los pacientes
se les da una presentación del caso e instrucciones para tomar
medidas de control de la placa supragingival adecuadas. Se realiza
una escala y planificación de la raíz.
Cuando la hemorragia de las bolsas se interrumpe,
se aplica gel de EDTA al 24% (obtenido de Biora AB, Suecia) en las
bolsas durante 2 minutos. Después, las bolsas se irrigan
cuidadosamente con solución salina seguido de la aplicación de la
sustancia del ensayo (EMDOGAIN®) o de control (gel PGA).
El examen inicial, y los exámenes de control en
la semana 1, 2, 3, 8 y 24 incluyó las siguiente variables:
1. Estado de la higiene oral - presencia /
ausencia de placa
2. Estado de las encías (Índice Gingival; Löe
1967)
3. Profundidad de sondeo de la bolsa
4. Nivel de sondeo del acoplamiento
5. Hemorragias en el sondeo - presencia /
ausencia
6. Hipersensibilidad de la dentina después de
estímulo con cañón de aire (si/no)
7. Grado de malestar - registrado en los exámenes
en las semanas 1, 2 y 3 usando una Escala Visual Análoga (VAS) de 10
cm.
Los pacientes tenían menos problemas
postoperativos, menos hemorragias, menos placa y un mejor índice
gingival. Estos resultados apoyan el efecto de curación de heridas
de EMDOGAIN®.
El objetivo de este estudio piloto es evaluar el
proceso de curación de heridas de espesor dividido en cerdos, y
evaluar el efecto de EMD en estas heridas.
Se selecciona el cerdo como modelo para el ensayo
porque esta especie ha demostrado ser un buen modelo para la
evaluación de la curación de heridas en seres humanos.
El experimento se realizará en 4 cerdos hembras
SPF (cruce de Danish country, Yorkshire y Duroc). Al comienzo del
periodo de climatización el peso corporal de los animales será de
aproximadamente 35 kg.
Se permitirá un periodo de climatización de una
semana durante el cual los animales se observarán a diario para
rechazar un animal que presenta un mal estado. Se registrarán todas
las observaciones.
El estudio tendrá lugar en un cuarto para
animales al que se le proporciona aire filtrado a una temperatura
de 21ºC\pm3ºC, una humedad relativa de 55%\pm15% y cambios de
aire 10 veces/hora. El cuarto se iluminará para dar un ciclo de 12
horas de luz y 12 horas de oscuridad. Habrá luz de 06 a 18 h.
Los animales se alojarán individualmente en
corrales.
El lecho será serrín de coníferas "LIGNOCHEL H
¾ " de Hahn & Co, D-24796
Bredenbek-Kronsburg. Se realizan análisis regulares
para detectar posibles contaminantes relevantes.
Se ofrecerá un pienso para cerdos disponible en
el mercado "Altromin 9033" de Chr. Petersen A/S
DK-4100 Ringsted (aproximadamente 800 g dos veces al
día). Se realizan análisis regulares de los principales componentes
nutricionales y de posibles contaminantes relevantes.
Se ofrece agua potable de calidad doméstica a los
animales dos veces al día. Se realizan análisis regulares para
detectar posibles contaminantes relevantes.
Las heridas se realizan el día 1. Los animales se
anestesian con Stresnil® Vet. Janssen, Bélgica (40 mg azaperona/ml,
1 ml/10 kg) y Atropin DAK, Dinamarca (1 mg atropin/ml, 0,5 ml/10
kg), administrados como una única inyección intramuscular seguida de
una inyección i.v. de Hypnodil® Janssen, Bélgica (50 mg
metomidate/ml, aproximadamente 2 ml).
Se afeitará un área dorso-lateral
en uno de los lados de la espalda del animal, se lavar con jabón y
agua, se desinfecta con etanol al 70% que se aclara con solución
salina estéril, y finalmente se seca con una gasa estéril.
Se realizan ocho heridas de espesor dividido (25
x 25 x 0,4 mm) en el área preparada, 4 a cada lado de la columna
vertebral, usando un ACCU-Dermatom (GA 630,
Aesculap®). Las heridas se numera del 1 (más craneal) a 4 (más
caudal) en el lado izquierdo del animal y de 5 (más craneal) a 8
(más caudal) en la lado derecho del animal.
La sangre coagulada se retira con una gasa
estéril.
Justo antes de la cirugía, aproximadamente 8
horas después de la cirugía y cuando sea necesario a partir de
entonces, se administra a los animales una inyección intramuscular
de Anorfin®, A/S GEA, Dinamarca (0,3 mg buprenorfina/ml, 0,04
ml/kg).
Después de la realización de las heridas, las
heridas se tratan como se indica a continuación
Aproximadamente 15 minutos antes de la
dosificación, se prepara la formulación de EMD de acuerdo con las
instrucciones dadas por el fabricante. La formulación de EMD se
usará antes de 2 horas después de la preparación. Para las heridas
de tratamiento B. La EMD se aplica como una fina capa en la
superficie de la herida. Un vial de EMD se usará para 4 heridas.
Las heridas se cubren con Tedagerm®. Los apósitos
estarán cubiertos con un vendaje de gasa fijado con Fixomul®. Los
apósitos, la gasa y el Fixomul® se sujetarán con una redecilla.
Bend-a-rete® (Tesval, Italia). Los
apósitos se observarán a diario.
Los apósitos se cambiarán el día 2 (todos los
animales) y el 3 (animales Nº 3 y 4).
Antes de cada cambio, los animales se anestesian
con una inyección intramuscular en el cuello (1,0 ml /10 kg peso
corporal) de una mezcla de Zoletil 50® Vet., Virbac, Francia (125
mg tiletamina y 125 mg zolazepan en 5 ml de disolvente, 5 ml)
Rompun® Vet. Bayer, Alemania (20 mg zilazina/ml, 6,5 ml) y
Methadon®DAK, Nycomed DAK, Dinamarca 10 mg metadona/ml, 2,5 ml).
Cada herida se observará y fotografiará el día 2
(todos los animales), 3 (todos los animales) y 4 (animales Nº 3 y
4). Se evaluará el grado de exudación e inflamación. Se describirá
en detalle la aparición de epidermis injertada.
Se registran diariamente todos los signos
visibles de mala salud y cualquier cambio en el comportamiento. Se
registrará cualquier desviación de lo normal con respecto al momento
de aparición, duración e intensidad.
Los animales se pesan a la llegada, el día de la
realización de heridas y al final del estudio.
El día 3 (aproximadamente 56 horas después de la
realización de las heridas) los animales Nº 1 y 2 se sacrifican con
un corte en la vena y arteria subclavia después de aturdir con una
pistola eléctrica.
El día 4 (aproximadamente 72 horas después de la
realización de las heridas) los animales Nº 3 y 4 se sacrifican con
un corte en la vena y arteria subclavia después de aturdir con una
pistola eléctrica.
Se corta cada herida como un bloque separado del
tejido muscular esquelético. Si existe adherencia al músculo
esquelético subyacente, se incluye parte del músculo en el material
como fijación. Cada bloque se fija en una solución tampón fosfatada
neutral con formaldehído al 4%.
\newpage
Después de la fijación, cuatro muestras
representativas de todas las heridas se introducen en parafina, se
cortan con un espesor nominal de 5 \mum y se marcan con
haematoxilina y eosina. Después del tinte, los portaobjetos se
observan en un microscopio usando una cuadrícula. Esto permite medir
la longitud total de la herida y la longitud de la superficie
epitelizada. Esta relación se expresará como el porcentaje de la
herida cubierta por células epiteliales por slide. Se tomarán los
valores medios de cada herida, después de lo cual se calculan los
valores medios de grupo.
Se procesarán los datos para dar los valores
medios de grupo y las desviaciones estándar cuando sea apropiado.
También se identifican los posibles valores anormales. Después, se
comprueba la homogeneidad de cada variable continua con la prueba de
Bartlett. Si la varianza es homogénea, se realiza un análisis de
varianza para la variable. Si se detecta cualquier diferencia
significativa, se evalúan las posibles diferencias entre grupos con
la prueba de Dunnett. Si la varianza es heterogénea se comprueba la
normalidad de cada variable con el método de
Shapiro-Wilk. En caso de distribución normal, se
identificarán las posibles diferencias entre grupos con la prueba de
la t de Student. En otro caso, las posibles diferencias entre grupos
se evalúan con la prueba de Kruskal-Wallis. Si se
detecta cualquier diferencia entre grupo significativa, la posterior
identificación de los grupos se realiza con la prueba de Wilcoxin
Suma-Rango.
Los análisis estadísticos se realizarán con
procedimientos SAS® (versión 6.12) descritos en "SAS/STAT® User's
Guide, Version 6, Fourth Edition, Vol. 1+2", 1989, SAS Institute
Inc., Cary, North Carolina 27513, USA.
Claims (11)
1. El uso de una preparación de una sustancia de
esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica
para la prevención y/o tratamiento de una infección.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la infección está causada por un microorganismo.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2
para la prevención de o tratamiento del crecimiento bacteriano en
una superficie de una mucosa.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2
para la prevención de o tratamiento del crecimiento bacteriano en
una uña o en la superficie de un diente.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2
en el que la infección está presente en la cavidad oral.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 para
la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad bacteriana en la
cavidad oral.
7. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 en el que la infección está
causada por una bacteria que causa caries, por ejemplo
Streptococcus mutans; bacterias que causan una enfermedad
periodontal por ejemplo Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivales, Prevotella intermedia,
Peptostreptococccus micros, Campylobacter
(Fusobacteri, Staphylococci), B. forsythus; bacterias
que causan alveolitis etc., por ejemplo Staphylococcus,
Actinomyces y Bacillus; y bacterias que causan
lesiones periapicales, por ejemplo Spirochetes.
8. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que la bacteria está
presente en la piel.
9. El uso de una preparación de una sustancia de
esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica
para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad
inflamatoria.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en
el que la enfermedad inflamatoria está presente en la cavidad
oral.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en
el que la enfermedad inflamatoria está presente en un lugar donante
de hueso.
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