ES2204804T3

ES2204804T3 - Composiciones proteinicas matriciales para enfermedades inflamatorias e infeccioas.

Info

Publication number: ES2204804T3
Application number: ES01201915T
Authority: ES
Inventors: Stina Gestrelius; Lars Hammarstrim; Staele Peter Lyngstadaas; Christer Andersson; Ivan Slaby; Tomas Hammargren
Original assignee: Biora BioEx AB
Current assignee: Biora BioEx AB
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: JP5024866B2; PL343375A1; JP2011088927A; DE69902234T2; DE69910622T2; HK1030880A1; DE69910622D1; EP1059934B1; EP1059934A2; AU740468B2; CN1248734C; EP1153610B1; BR9908182A; DK1059934T3; EP1153610A1; WO1999043344A3; CA2640994A1; JP5227428B2; IS5591A; DK1153610T3

Abstract

El uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una infección.

Description

Composiciones proteínicas matriciales para enfermedades inflamatorias e infecciosas.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de matrices de esmalte, derivados de la matriz de esmalte y/o proteínas de la matriz de esmalte como agentes terapéuticos o profilácticos. Las sustancias son activas como agentes antibacterianos y/o antiinflamatorios.

Antecedentes de la invención

Las proteínas de la matriz de esmalte tales como las presentes en las matrices de esmalte son conocidas como precursoras de esmalte. Las proteínas de esmalte y los derivados de la matriz de esmalte se han descrito previamente en la literatura de patentes para inducir la formación de tejido duro (es decir, formación de esmalte, Patente de Estados Unidos Nº 4.672.032 (Slavkin)) o la unión entre tejidos duros (documentos EP-B-O 337 967 y EP-B-0 263 086). De esta forma, la técnica anterior está centrada exclusivamente en la regeneración de tejidos duros, mientras que la presente solicitud se refiere a efectos antibacterianos y antiinflamatorios, que son descubrimientos inesperados.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte (en término "una sustancia de esmalte activa" también se usa en lo sucesivo para designar una matriz del esmalte, un derivado de la matriz de esmalte, o una proteína de la matriz de esmalte) son agentes beneficiosos en tejidos blandos (es decir, tejidos no mineralizados) tales como tejidos que contienen colágeno o epitelio, incluyendo piel y mucosa, músculo, vasos sanguíneos y linfáticos, tejido nervioso, glándulas, tendones, ojos y cartílago.

Además, se ha descubierto que la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte tienen propiedades antibacterianas y/o antiinflamatorias que pueden usarse para el tratamiento de enfermedades en tejido blando y duro (es decir, mineralizado).

Herida

Las heridas y/o úlceras se encuentran normalmente sobresaliendo de la piel o en una superficie de mucosa o como resultado de un infarto en un órgano ("ataque"). Una herida puede ser resultado de un defecto o una lesión en un tejido blando o de una enfermedad subyacente. La regeneración de heridos periodontales provocadas experimentalmente ha sido descrita por los inventores y no pretende estar dentro del alcance de la presente invención. En el presente contexto, el término "piel" se refiere a la superficie más exterior del cuerpo de un animal, incluyendo un ser humano, y abarca piel intacta o prácticamente intacta así como una superficie de piel dañada. El término "mucosa" se refiere a una mucosa dañada o no dañada de un animal tal como un ser humano y puede ser la mucosa oral, bucal, aural, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal, o rectal.

En el presente contexto, el término "herida" denota un daño corporal con ruptura de la integridad normal de las estructuras del tejido. El término también pretende abarcar los términos "llaga", "necrosis" y "úlcera". Normalmente, el término "llaga" es un término popular para casi cualquier lesión de la piel o membranas mucosas y el término "úlcera" es un defecto o excavación local de la superficie de un órgano o tejido, que se produce por el cambio de tejido necrótico. Lesión se refiere generalmente a cualquier defecto en un tejido. Necrosis se refiere a tejido muerto como resultado de una infección, daño, inflamación o infarto.

El término "herida" como se usa en el presente contexto denota cualquier herida (véase a continuación la clasificación de las heridas) y en cualquier etapa particular del proceso de cura incluyendo la etapa antes de que se haya iniciado la cura o incluso antes de realizar una herida específica como una incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico).

Algunos ejemplos de heridas son, por ejemplo, heridas asépticas, contusiones, incisiones, laceraciones, heridas no penetrantes (es decir, heridas en las que no hay ruptura de la piel pero si hay daño en las estructuras subyacentes), heridas abiertas, heridas penetrantes, perforaciones, pinchazos, heridas sépticas, heridas subcutáneas, etc. Algunos ejemplos de llagas son llagas por decúbito, estomatitis ulcerosa, llagas de cromo, llagas frías, llagas de presión, etc. Algunos ejemplos de úlceras son, por ejemplo, úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera hipertensiva isquémica, úlcera de estasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical, úlcera venérea, por ejemplo la causada por gonorrea (incluyendo uretritis, endocervicitis y proctitis). Algunas enfermedades relacionadas con heridas o llagas que pueden tratarse satisfactoriamente de acuerdo con la invención son quemaduras, carbunco, tétanos, gangrena, escarlatina, erisipelas, sicosis barbae, foliculitis, impetigo contaginosa o impetigo bullosa, etc. A menudo hay una solapamiento entre el uso de los términos "herida" y "úlcera" y "herida" y "llaga" y, además, los términos se usan a menudo aleatoriamente. Por lo tanto, como se ha mencionado anteriormente, en el presente contexto, el término "herida" abarca los términos "úlcera", "lesión", "llaga", e "infarto", y los términos se usan de forma indiscriminada a menos que se indique de otra forma.

Las heridas de acuerdo con la invención también incluyen: i) heridas generales tales como, por ejemplo, quirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquémicas, termales, químicas y bulosas; ii) heridas específicas de la cavidad oral tales como, por ejemplo, heridas post-extracción, heridas endodónticas especialmente en el tratamiento de quistes y flemones, úlceras y lesiones de origen bacteriano, vírico o autoinmunológico, heridas mecánicas, químicas, térmicas, infecciosas y liquenoides; úlceras de herpes, estomatitis aftosa, gingivitis aguda necrosante ulcerativa y síndrome de quemaduras en la boca son ejemplos específicos; y iii) heridas en la piel tales como, por ejemplo neoplasma, quemaduras, (por ejemplo, químicas, térmicas), lesiones (bacterianas, víricas, autoinmunológicas), mordeduras e incisiones quirúrgicas. Otra forma de clasificar heridas es como i) pérdida de tejido pequeña debida a incisiones quirúrgicas, abrasión leve, y mordeduras leves, o como ii) pérdida de tejido significativa. El último grupo incluye úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, laceraciones, mordeduras graves, quemaduras térmicas y heridas de donantes (en tejidos blandos y duros) e infartos.

Las heridas pueden estar presentes en la cavidad oral. Tales heridas pueden ser daños corporales o traumas asociados con la cirugía oral incluyendo cirugía periodontal, extracción de diente(s), tratamiento endodóntico, inserción de implantes dentales, aplicaciones y uso de prótesis dentales, y similares. En la sección experimental de este documento se ha demostrado el efecto beneficioso de una sustancia de esmalte en tales heridas.

Otras heridas que son importantes en relación con la presente invención son heridas como úlceras isquémicas, llagas de presión, fístulas, mordeduras graves, quemaduras térmicas, y heridas de donantes.

El término "piel" se usa en un sentido muy amplio que abarca la capa de la epidermis y -en aquellos casos en los que la piel está más o menos dañada- también la capa de dermis de la piel. Aparte de estrato corneo, la capa epidérmica de la piel es la capa exterior (epitelial) y la capa más profunda de tejido conectivo de la piel se denomina dermis.

Como la piel es la parte más expuesta del cuerpo, es particularmente susceptible a distintos tipos de heridas tales como, por ejemplo, rupturas, cortes, abrasiones, quemaduras y congelaciones o daños que surgen de distintas enfermedades. Además, se destruye mucha piel en accidentes. Sin embargo, dada la importante función de barrera y fisiológica de la piel, la integridad de la piel es importante para el bienestar del individuo, y cualquier corte o ruptura representa una amenaza a la que se debe enfrentar el cuerpo para proteger su existencia continuada.

Aparte de las heridas de la piel, las heridas también pueden estar presentes en todo tipo de tejidos (es decir, tejidos blandos y duros). Las heridas en tejidos blandos incluyendo membranas mucosas y/o piel son especialmente relevantes en relación con la presente invención.

La cura de una herida en la piel o en una membrana mucosa pasa por una serie de etapas que tienen como resultado la reparación o regeneración de la piel o de la membrana mucosa. En los últimos años, se han distinguido regeneración y reparación como los dos tipos de cura que pueden tener lugar. La regeneración puede definirse como un proceso biológico en el que la arquitectura y función del tejido perdido se renuevan completamente. La reparación, por otro lado, es un proceso biológico en el que se recupera la continuidad del tejido roto con tejidos nuevos que no replican la estructura y función del tejido perdido.

La mayoría de heridas se curan por reparación, lo que significa que el tejido nuevo formado es estructural y químicamente distinto del tejido original (cicatriz). Un proceso que está casi siempre implicado en las primeras etapas de la reparación del tejido es la formación de un tejido conectivo transitorio en el área de la herida. El proceso empieza con la formación de una nueva matriz extracelular de colágeno por los fibroblastos. Esta nueva matriz extracelular de colágeno es el soporte para un tejido conectivo durante el proceso final de cura. La cura final es, en la mayoría de los tejidos, la formación de una cicatriz que contiene tejido conectivo. En los tejidos que tienen propiedades regenerativas, tales como, por ejemplo, piel y hueso, la cura final incluye la regeneración del tejido original. Este tejido regenerado también tiene normalmente algunas características de cicatriz, por ejemplo, un aumento en el espesor de la fractura en el hueso curado.

En circunstancias normales, el cuerpo proporciona mecanismos para curar piel o mucosa dañada para recuperar la integridad del la barrera de piel o de la mucosa. El proceso de reparación, incluso para rupturas o heridas leves, puede llevar un periodo de tiempo que se extiende de horas y días a semanas. Sin embargo, en las ulceraciones, la cura puede ser muy lenta y la herida puede persistir durante un periodo de tiempo prolongado, es decir, meses o incluso años.

Las etapas de la cura de heridas incluyen normalmente inflamación (normalmente 1-3 días), migración (normalmente 1-6 días), proliferación (normalmente 3-24 días) y maduración (normalmente de 1-12 meses). El proceso de cura es un proceso fisiológico complejo y bien orquestado que implica migración, proliferación, y diferenciación de una diversidad de tipos de células así como la síntesis de los componentes matriciales. El proceso de cura puede dividirse en las siguientes tres fases:

i) Hemostasis e inflamación

Cuando las plaquetas están presentes fuera del sistema circulatorio y se exponen a trombina y colágeno, se activan y se agregan. De esta forma, las plaquetas inician el proceso de reparación agregándose y formando una barrera temporal para asegurar la homeostasis y evitar la invasión de bacterias. Las plaquetas activas inician el sistema de coagulación y liberan factores de crecimiento como el facto de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factores de crecimiento epidérmicos (EGF) y factores de crecimiento de transformación (TGF).

Las primeras células que invaden el área de la herida son neutrófilos seguidos de monocitos que son activados por los macrófagos.

El papel principal de los neutrófilos parece ser limpiar la herida de o defender la herida contra bacterias contaminantes y mejorar la curación de la herida eliminando células y plaquetas muertas. La infiltración de neutrófilos se interrumpe en las primeras 48 horas siempre que no haya una contaminación bacteriana presente en la herida. El exceso de neutrófilos es fagocitado por los macrófagos del tejido reclutados de monocitos sanguíneos circulantes. Se cree que los macrófagos son esenciales para la curación eficaz de heridas porque son también responsables de la fagocitosis de organismos patógenos y de la eliminación del tejido residual. Además, liberan diversos factores implicados en las etapas posteriores del proceso de curación. Los macrófagos atraen fibroblastos que inician la producción de colágeno.

ii) Formación del tejido de granulación y re-epitelización

A las 48 horas de la formación de la herida, los fibroblastos empiezan a proliferar y migran al área de la herida desde el tejido conectivo al borde de la herida. Los fibroblastos producen colágenos y glucosaminoglicanos y entre otros una baja tensión de oxígeno en la herida estimula la proliferación de células endoteliales. Las células endoteliales dan lugar a la formación de una nueva red capilar.

Los activadores de colagenasas y plasminógenos se secretan en los queratinocitos. Si la herida se mantiene sin alterar y bien alimentada con oxígeno y nutrientes, los queratinocitos migrarán sobre la herida. Se cree que los queratinocitos migran sobre el tejido viable y, en consecuencia, los queratinocitos migran al área por debajo del tejido muerto y la costra de la herida.

El área de la herida se reduce adicionalmente por contracción.

iii) Remodelación dérmica

Tan pronto como se completa la re-epitelización comienza la remodelación del tejido. Esta fase, que dura varios años, recupera la fuerza del tejido dañado.

Todo el proceso de cura mencionado anteriormente lleva un tiempo considerable. La velocidad de la curación está influido por el aislamiento de la herida de infecciones, el estado de salud general del individuo, la presencia de cuerpos extraños, etc. Algunas enfermedades patológicas tales como infección, maceración, deshidratación, estado de salud generalmente pobre, y malnutrición pueden conducir a la formación de una úlcera crónica tal como, por ejemplo, úlceras isquémicas.

Hasta que tiene lugar al menos una curación superficial, la herida sigue en riesgo de una infección nueva o continuada. Por lo tanto, cuanto antes cure la herida, antes se elimina el riesgo.

De esta forma, cualquier procedimiento que pueda influir en la velocidad de curación de la herida o influir favorablemente la curación de heridas es de gran valor.

Además, como casi todos los procesos de reparación de tejidos incluyen una primera formación de tejido conectivo, se contempla una estimulación de éste y los procesos posteriores para mejorar la curación del tejido.

En el presente contexto, el término "curación clínica" se usa para denotar una situación en la que no puede observarse visualmente una ruptura del tejido y solo hay presentes ligeros signos de inflamación tal como un ligero color rojo o un tejido ligeramente inflamado. Además, no se dan quejas de dolor cuando el órgano se relaja o se toca.

Tradicionalmente, se han usado más comúnmente apósitos secos o húmedos-a-secos para el cuidado de heridas. Éstos se están sustituyendo gradualmente con entornos húmedos que usan apósitos oclusivos. Para reparar o sustituir satisfactoriamente una parte del cuerpo dañada, deben equilibrarse los procesos de curación de heridas, fibrosis e invasión microbiana. Muchas instrumentos para evitar infecciones comprometen la curación de la herida. Una curación de herida retrasada una inflamación puede agravar la fibrosis. Además, se ha sugerido previamente que los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (FGF), incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (\alpha-FGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (\beta-FGF), el factor-\beta de crecimiento de transformación (TGF-\beta) y los factores de crecimiento similares a al insulina (IGF-1 e IGF-2) conducen el proceso de curación de heridas y se citan con frecuencia como promotores de la curación de heridas; sin embargo, pueden provocar realmente fibrosis lo que a su vez puede impedir una curación satisfactoria. Aunque la curación acelerada ofrece la mejor opción para reducir el riesgo de infección y la inflamación resultante que puede conducir a la formación de cicatrices, los intentos terapéuticos para acelerar el proceso normal de curación de herida han tenido relativamente poco éxito. Esto se debe probablemente a que el proceso de reparación implica la implicación concertada de diversos factores, descritos anteriormente.

Hasta este punto, los inventores han descubierto que en diversos cultivos celulares de fibroblastos (embrional, dérmico, derivados de ligamento periodontal, en peces o pájaros) se produce el doble de TGF\beta1 en los cultivos celulares estimulados con EMDOGAIN® (BIORA AB, S-205 12 Malmö, Suecia que contiene 40 mg de proteína de la matriz de esmalte liofilizada (en lo sucesivo abreviada como EMD) y 1 ml de Solución Vehículo (Alginato de Propilenglicol), que se mezcla antes de la aplicación, a menos que la proteína y el Vehículo se prueben de forma separada, siendo la relación en peso de aproximadamente 85/5/10 entre los máximos proteicos a 20, 14 y 5 kDa, respectivamente) en comparación con cultivos no estimulados cuando se analizan, por ejemplo, ELISA en una muestra del medio de cultivo (véase Ejemplo 1 a continuación). El incremento está presente 24 horas después del cultivo, pero es más pronunciado en los siguientes días (días 2 y 3). Después del segundo día, también aumenta la proliferación celular en cultivos celulares estimulados con EMDOGAIN®. Un aumento de la producción de TGF\beta1 similar, pero menos pronunciado, se observa en células epiteliales humanas. Como el TGF\beta1 parece tener una importancia central en la epitelización de heridas superficiales, estos descubrimientos apoyan el concepto de la presente invención.

Es común el uso de apósitos en la cavidad oral. Tales apósitos son del tipo tradicional, por ejemplo, Surgipads para parar las hemorragias y apósitos periodontales Coe-Pack (Coe Laboratories, GC Group, Chicago, USA) en heridas abiertas, en los alvéolos de las extracciones dentarias se inserta Gaze empapados en solución antibiótica y se retira después de unos pocos días cuando se inicia la curación. Los aclarados con antisépticos tales como clorhexidina se usan de forma regular después de la cirugía oral. Algunas veces, también se prescriben antibióticos generales o tópicos.

En general, se tienen que tomar precauciones específicas en relación con el tratamiento de heridas, tales como, por ejemplo, consideraciones de esterilidad, problemas de contaminación, aplicación correcta de vendajes/apósitos, etc. lo que requiere normalmente que el tratamiento/aplicación se realice por enfermeras bien entrenadas o personal similar. De esta forma, el tratamiento de heridas a menudo se convierte en una operación muy cara cuando el agente de curación de la herida se tiene que aplicar varias veces al día. Por lo tanto, se puede obtener una reducción deseada en los costes implicados en el tratamiento de curación de la herida cuando se pueda reducir la frecuencia de aplicación o si los procesos de curación se mejoran llevando a una reducción en el periodo de tiempo que se necesita para curar la herida.

Los presentes inventores han observado que después de la aplicación de proteínas de la matriz de esmalte y/o derivados de la matriz de esmalte, la etapa de inflamación se acorta y los signos típicos tales como calor, enrojecimiento, edema, y dolor son menos evidentes.

La actividad terapéutica de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte puede demostrarse por supuesto con pruebas in vivo usando animales o seres humanos experimentales (véase la sección experimental en este documento). Sin embargo, puede obtenerse una indicación de la eficacia de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte realizando ensayos in vitro relativamente simples tales como, por ejemplo, ensayos que implican cultivos celulares.

En relación con el tratamiento de heridas/úlceras, el desbridamiento y limpieza de la herida son de particular importancia. Se cree que la limpieza y/o desbridamiento de heridas/úlceras son un prerrequisito para el proceso de curación, y, además, cuando se aplican los agentes de curación de la herida, tales agentes tiene que ejercer su efecto en tejido fresco y vivo, no en tejido muerto o tejido contaminado. El desbridamiento del tejido necrótico puede realizarse al menos por cuatro métodos diferentes: i) desbridamiento con objetos agudos, ii) desbridamiento mecánico, iii) desbridamiento enzimático, y iv) desbridamiento autolítico.

Por lo tanto, la presente invención se refiere también al uso de un método de desbridamiento en combinación con el uso de matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte para la cura o prevención de heridas. Tal terapia de combinación implica las dos siguientes etapas, a saber i) un método de desbridamiento y ii) aplicación de una matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte y las dos etapas pueden realizarse tantas veces como se desee y en cualquier orden adecuado.

Cuando la herida se ha sometido a desbridamiento, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte puede aplicarse directamente en o sobre la herida o pueden aplicarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada tal como, por ejemplo, un apósito limpio seco o húmedo en el cual se ha incorporado la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte. Por supuesto, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte también pueden aplicarse junto con la limpieza de la herida.

Como se discutirá más adelante, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte pueden usarse como tales o puede usarse en una preparación o composición farmacéutica adecuada.

Efecto de reducción de la Infección

En otro aspecto de la presente invención, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte se usan como agentes terapéuticos o profilácticos con un efecto antimicrobiano. La matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte muestran propiedades que reducen la infección.

En el presente contexto el término "efecto que reduce la infección" se refiere a un efecto de tratamiento o preventivo de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte en una infección de un tejido de un individuo cuando el tejido o el individuo se tratan con la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte.

El término infección se refiere a la invasión y multiplicación de microorganismos en tejidos corporales o la acumulación en los tejidos, lo que puede ser clínicamente inaparente o tener como resultado un daño local celular debido al metabolismo competitivo, enzimas, toxinas, replicación intracelular o respuesta de antígenos-anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, la infección a prevenir y/o tratar puede estar causada por un microorganismo. Los microorganismos de interés de acuerdo con la presente invención incluyen bacterias, virus, levaduras, hongos, protozoos, y rickettsiae.

En el presente contexto el término "efecto antibacteriano" significa que el crecimiento de las bacterias se suprime o que se destruyen las bacterias. El término no se limita a ciertas bacterias sino que abarca cualquier bacteria en general. Sin embargo, la invención se centra en i) bacterias patógenas que causan enfermedades en mamíferos incluyendo seres humanos y/o ii) bacterias que normalmente están presentes en el cuerpo de un mamífero y que bajo ciertas condiciones pueden causar enfermedades no deseadas en el cuerpo.

En consecuencia, la invención se refiere al uso de una sustancia activa de esmalte para la prevención o tratamiento del crecimiento bacteriano en una superficie corporal tal como la piel, una superficie de mucosa o una superficie de una uña o un diente.

Descripción general y específica de las enfermedades bacterianas a contrarrestar

La matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte pueden usarse para el tratamiento de una infección causada por bacterias con o sin la presencia de un antimicrobiano. Las bacterias gram negativas a tratar con la sustancia activa de esmalte pueden ser cocci, tal como Neisseria (por ejemplo, N. meningitis, N. gonorrhoeae), y Acinetobacterioides, tales como Bacterioides (por ejemplo, B. fragilis), Bordetella (por ejemplo, B. pertussis, B. parapertussis), Brucella y (por ejemplo B. melitentis, B. abortus Bang, B. suis), Campylobacter (por ejemplo, C. jejuni, C. coli, C. fetus), Citrobacter, Enterobacter, Escherichia (por ejemplo E. coli), Haemophilus (por ejemplo H. influenzae, H. para-influenzae), Klebsiella (por ejemplo K. pneumoniae), Legionella (por ejemplo L. pneumophila), Pasteurella (por ejemplo P. yersinia, P. multocida), Proteus (por ejemplo, P. mirabilis, P. vulgaris), Pseudomonas (por ejemplo P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei), Salmonella (por ejemplo S. enteriditis, S. infantitis, S. Dublin, S. typhi, S. paratyphi, S. schottmülleri, S. choleraesuis, S. typhimurium, o cualquiera de los otros 2.500 serotipos), Serratia, (por ejemplo S. Marscences, S. liquifaciensv), Shigella (por ejemplo, S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii), Vibrio (por ejemplo B. cholerae, V. eltor),y Yersinia (por ejemplo Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis). Las bacterias gram positivas a tratar con la sustancia activa de esmalte pueden ser cocci, tales como Streptococcus (por ejemplo S. pneumoniae, S. viridans, S. faecalis, S. pyogenes), Staphylococcus (por ejemplo S. aureaus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. albus) y rods tales como Actinomyces (por ejemplo A. israelli), Bacillus (por ejemplo B. cereus, B. subtilis, B. anthracis), Clostridium (por ejemplo C. botulinum, C. tetani, C. perfringens, C. difficile), Corynebacterium (por ejemplo C. diphttheriae), Listeria, y Providencia. Otras bacterias que causan infecciones incluyen Propionobacterium acne y Piutyosporon ovale.

La matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte también pueden usarse para el tratamiento de una infección causada por un espiroqueto tales como, por ejemplo, Borrelia, Leptospira, Treponema, o Pseudomonas.

Un antimicrobiano para usar en combinación con la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte podría ser una antimicrobiano que tiene una acción antimicrobiana a través de la inhibición de la síntesis de pared celular tal como \beta-lactamos y vactomicina, preferiblemente penicilinas tales como amdinocilina, ampicilina, amoxicilina, aziocilina, bacampicilina, benzatina penicilina G, carbenicilina, cloxacilina, ciclacilina, dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, y ticarcilina; cefalosporinas tales como los fármacos de primera generación cefadroxil, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, y cefradina, los fármacos de segunda generación cefaclor, cefamandol, cefonicida, ceforanida, cefoxitina, y cefuroxima, o las cefalosporinas de tercera generación cefoperazona, cefotaxima, cefotetan, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, y moxalactam; carbapenems tales como imipenem; o monobactams tales como aztreonam.

Otros fármacos antimicrobianos con acción a través de la síntesis de proteínas tales como cloramfenicol; otras tetraciclinas preferiblemente demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, minociclina, y oxitetraciclina; amino glucósidos tales como amikacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, espectinomicina, streptomicina, y tobramicina; polimixinas tales como colistin, colistimatato y polimixina B, y eritromicinas y lincomicinas; antimicrobianos con acción a través de la inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos en particular sulfonamidas tales como sulfacitina, sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfametizol, y sulfapiridina; trimetoprim, quinolonas, novobiocin, pirimetamina y rifampina.

En una realización específica de la invención, la infección está presente en la cavidad oral y la infección puede ser una enfermedad bacteriana.

Algunos ejemplos (no enfermedades) de bacterias orales inhibir por contacto o a combatir incluyen

- bacterias que causan caries, por ejemplo Streptococcus mutans, Lactobacillus spp.

- bacterias que causan enfermedades periodontales, por ejemplo, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros, Gampylobacter (Fusobacteria, Staphylcocci). B. forsythus

- bacterias que causan alveolitis, etc., por ejemplo Staphylococcus, Actinomyces y Bacillus

- bacterias que causan lesiones periapicales, por ejemplo, Espiroquetos y todas las anteriores.

Efecto antiinflamatorio

La presente invención también se refiere a los usaos de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte como agentes terapéuticos o profilácticos con efecto antiinflamatorio.

Se emplean varios fármacos para suprimir las manifestaciones de la inflamación, incluyendo los adrenocorticoesteroides, el gran grupo que comprende los denominados fármacos antiinflamatorios no esteroideos o NSAID, y fármacos tales como agentes inmunosupresores. Los adrenocorticoesteroides, y especialmente los glucocorticoides, tienen un potente efecto antiinflamatorio cuando se usan en dosis farmacológicas. Inhiben específicamente la fase inicial vascular de los procesos inflamatorios reduciendo la permeabilidad vascular y por lo tanto la migración de granulocitos. Los glucocorticoides también interfieren con procesos inflamatorios y reparativos posteriores, en que inhiben la proliferación de células mesenquimales y la producción de macromoléculas extracelulares, incluyendo proteoglicanos y colágeno. Se ha demostrado experimentalmente que los glucocorticoides inhiben, por ejemplo, la función macrófaga, la producción de anticuerpos humorales, inmunidad celular y, posiblemente, la liberación de enzimas lisosomales.

La gravedad del daño en el tejido puede depender de la reacción antígeno/anticuerpo del organismo así como del grado de retención de productos inflamatorios en el área afectada. La acumulación de mediadores de inflamación local acelera el proceso. En la mayoría de los casos, el proceso es lento, con inmunoinfiltración del tejido y formación de un tejido de granulación que contiene células inflamatorias.

En el presente contexto, el término "efecto antiinflamatorio" denota una contrarrestación o supresión de la inflamación.

Descripción general y específica del tipo de enfermedades inflamatorias a tratar

La enfermedad inflamatoria a tratar de acuerdo con la presente invención puede ser por supuesto cualquier enfermedad inflamatoria en cualquier parte del cuerpo o cualquier enfermedad inflamatoria presente en un tejido blando o duro. En una realización de la invención, la enfermedad inflamatoria está presente en la cavidad oral. Ejemplos de enfermedades en la cavidad oral son alveolitis, queilitis, necrosis ósea (después de un trauma), y fracturas.

En otra realización de la invención, la enfermedad inflamatoria está presente en un lugar de donante de hueso. En una tercera realización de la invención, la enfermedad inflamatoria está presente en una cavidad de una articulación. Algunos ejemplos de tales enfermedades inflamatorias son artritis reumatoide y enfermedades relacionadas.

Antibacteriano frente a antiinflamatorio

Al contrario que muchos agentes antibióticos usados actualmente, las proteínas de la matriz de esmalte no compromete la curación de heridas y a su vez, la rápida curación de la herida no da lugar a que se desarrollen procesos de inflamación crónica o de larga duración. Además, la reorganización de los tejidos apropiados, tales como los descritos después de la aplicación de los derivados de la matriz de esmalte en los defectos periodontales, se favorece claramente por una rápida curación de la herida sin bacterias o reacciones inflamatorias.

La aplicación de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte conduce a una rápida curación de incisiones quirúrgicas, creando posiblemente una superficie que al contacto con la bacteria inhibe su crecimiento pero al mismo tiempo mejora el movimiento de fibroplastos y la síntesis de colágeno. Si se acorta la etapa inflamatoria, los signos típicos tales como calor, enrojecimiento, edema y dolor son menos evidentes.

Matriz del esmalte, derivados de la matriz de esmalte y proteínas de la matriz de esmalte

La matriz de esmalte es un precursor del esmalte y puede obtenerse de cualquier fuente relevante, por ejemplo, un mamífero cuyos dientes están en desarrollo. Una fuente adecuada en los dientes en desarrollo de animales de matadero, tales como terneras, cerdos o corderos. Otra fuente es, por ejemplo, la piel del pescado.

La matriz de esmalte puede prepararse con los dientes en desarrollo como se ha descrito previamente (documentos EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086). La matriz de esmalte se rasca y se preparan derivados de la matriz de esmalte, por ejemplo, por extracción con solución acuosa tal como un tampón, un ácido o base diluida o una mezcla de disolvente/agua, seguida de exclusión por tamaño, desalación u otras etapas de purificación, seguidas opcionalmente de liofilización. Las enzimas pueden desactivarse por tratamiento con calor o disolventes, en cuyo caso los derivados pueden almacenarse en forma líquida sin liofilizar.

En el presente contexto, los derivados de la matriz de esmalte son derivados de la matriz de esmalte que incluyen una o varias proteínas de la matriz de esmalte o partes de tales proteínas, producidas naturalmente por cortes o procesamiento alterno o por escisión enzimática o química de una proteína de longitud natural, o por síntesis de polipéptidos in vitro o in vivo (métodos de ADN recombinante o cultivo de células diploides). Los derivados de la matriz de esmalte también incluyen polipéptidos o proteínas relacionadas con la matriz de esmalte. Los polipéptidos o proteínas pueden estar unidos a una molécula vehículo biodegradable adecuada tal como poliaminoácidos o polisacáridos, o combinaciones de los mismos. Además, el término derivados de la matriz de esmalte también abarca sustancias sintéticas análogas.

Las proteínas son macromoléculas biológicas constituidas por restos aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. Las proteínas, como polímeros lineales de aminoácidos, se denominan también polipéptidos. Normalmente, las proteínas tienen 50-800 restos aminoácidos y por tanto tienen pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 6000 a aproximadamente varios cientos de miles de daltons o más. Las proteínas pequeñas se denominan péptidos u oligopéptidos.

Las proteínas de la matriz de esmalte son proteínas que están presentes normalmente en la matriz de esmalte, es decir, el precursor del esmalte (Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinsos: Eur. J. Oral. Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1:282-91) o proteínas que pueden obtenerse por escisión de tales proteínas. En general, tales proteínas tienen un peso molecular por debajo de 120.000 daltons e incluyen amelogeninas, no-amelogeninas, no-amelogeninas ricas en prolina, amelinas (ameloblastina, sheathilina), y tuftelinas.

Algunos ejemplos de proteínas para usar de acuerdo con la invención son amelogeninas, no-amelogeninas ricas en prolina, tuftelina, proteínas tuft, proteínas del suero, proteínas de la saliva, amelina, ameloblastina, sheathlina, y derivados de las mismas, y mezclas de las mismas. Una preparación que contiene una sustancia de esmalte activa para usar de acuerdo con la invención puede contener también al menos dos de las sustancias proteicas mencionadas anteriormente. Un producto comercial que comprende amelogeninas y posiblemente otras proteínas de la matriz de esmalte se comercializa como EMDOGAIN® (Biora AB).

En general, las proteínas principales de la matriz de esmalte se conocen como amelogeninas. Constituyen aproximadamente el 90% p/p de las proteínas de la matriz. El 10% p/p restante incluye no-amelogeninas ricas en prolina, tuftelina, proteínas tuft, proteínas del suero y al menos una proteína de la saliva; sin embargo, también pueden estar presentes otras proteínas tales como, por ejemplo, amelina (ameloblastina, sheathlina) que se ha identificado en relación con la matriz de esmalte. Además, las diversas proteínas pueden sintetizarse y/o procesarse en varios tamaños distintos (es decir, pesos moleculares distintos). De esta forma, se ha descubierto que las proteínas principales en la matriz de esmalte, amelogeninas, existen en distintos tamaños que juntos forman agregados supramoleculares. Son sustancias notablemente hidrófobas que en condiciones fisiológicas forman agregados. Pueden llevar o ser vehículos para otras proteínas o péptidos.

También se contemplan otras sustancias proteicas como adecuadas para usar de acuerdo con la presente invención. Algunos ejemplos incluyen proteínas tales como proteínas ricas en prolina y poliprolina. Otros ejemplos de sustancias que se contemplan como adecuadas para el uso de acuerdo con la presente invención son agregados de tales proteínas, de derivados de la matriz de esmalte y/o de proteínas de la matriz de esmalte así como metabolitos de la matriz de esmalte, derivados de la matriz de esmalte y proteínas de la matriz de esmalte. Los metabolitos pueden ser de cualquier tamaño en el intervalo del tamaño de proteínas al de péptidos cortos.

Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas, polipéptidos, o péptidos para usar de acuerdo con la invención tienen normalmente un peso molecular de cómo máximo aproximadamente 120 kDa tal como, por ejemplo, como máximo 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa o 60 kDa calculado por electroforesis SDS-Page.

Las proteínas para usar de acuerdo con la invención se presentan normalmente en forma de preparación, en la que el contenido en proteínas de la sustancia de esmalte activa en la preparación está en el intervalo de aproximadamente 0,05% p/p a 100% p/p tal como, por ejemplo, aproximadamente 5-99% p/p, aproximadamente 10-95% p/p, aproximadamente 15-90% p/p, aproximadamente 20-90% p/p, aproximadamente 30-90% p/p, aproximadamente 40-85% p/p, aproximadamente 50-80% p/p, aproximadamente 60-70% p/p, aproximadamente 70-90% o aproximadamente 80-90% p/p.

Una preparación de la sustancia de esmalte activa para el uso de acuerdo con la invención puede contener también una mezcla de sustancias de esmalte activas con diferentes pesos moleculares.

Las proteínas de la matriz de esmalte pueden dividirse en una parte de alto peso molecular y una parte de bajo peso molecular, y se ha descubierto que una parte bien definida de las proteínas de la matriz de esmalte tiene unas propiedades valiosas con respecto al tratamiento de defectos periodontales (es decir, heridas periodontales). Esta parte contiene proteínas extraíbles con ácido acético denominadas generalmente amelogeninas y constituye la parte de bajo peso molecular de la matriz de esmalte (véanse los documentos EP-B-0 337 967 y EP-B-0 263 086).

Como se ha discutido anteriormente la parte de bajo peso molecular de la matriz de esmalte tiene una actividad adecuada para inducir la unión entre tejidos duros en defectos periodontales. Sin embargo, en el presente contexto las proteínas activas no se limitan a la parte de bajo peso molecular de la matriz de esmalte. Actualmente, las proteínas preferidas incluyen proteínas de la matriz de esmalte tales como amelogenina, amelina, tuftelina, etc. con pesos moleculares (medidos in vitro con SPS-PAGE) por debajo de aproximadamente 60.000 daltons aunque las proteínas con peso molecular mayor de 60.000 daltons también tienen propiedades prometedoras como candidatas para agentes de curación de heridas, antibacterianos y/o antiinflamatorios.

En consecuencia, se contempla que la sustancia de esmalte activa para el uso de acuerdo con la invención tiene un peso molecular de hasta 40.000 tal como, por ejemplo, un peso molecular entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 25.000.

Los péptidos descritos en el documento WO 97/02730 también están dentro del alcance de la presente invención, es decir, péptidos que comprenden al menos un elemento de secuencia seleccionado entre el grupo compuesto por tetrapéptidos DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala); VTGK (Val-Thr-Lys-Gly), EKGE (Glu-Lys-Gly- Glu) y DKGE (Asp-Lys-Gly-Gluc) y que comprende además una secuencia de aminoácidos en la que una cadena consecutiva de 20 aminoácidos es idéntica al menos en un 80% a una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada entre el grupo compuesto por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:1 y una secuencia consistente en los aminoácidos 1 a 103 de la SEC ID NO:1 y los aminoácidos 6 a 324 de la SEC ID NO:2.

El término "identidad de secuencia" se refiere a la identidad en una secuencia de aminoácidos que concuerda con respecto a la identidad y posición de los aminoácidos de los péptidos. Un hueco se cuenta como no-identidad para uno o más aminoácidos, de forma apropiada.

Tales péptidos pueden comprender de 6 a 300 aminoácidos, por ejemplo al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos, al menos 120 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos.

Un método para el aislamiento de las proteínas de la matriz de esmalte implica la extracción de las proteínas y la retirada de iones calcio y fosfato con hidroxiapatita solubilizada con un método apropiado, por ejemplo filtración en gel, diálisis o ultrafiltración (véase Janson, J-C & Rydén, L. (Eds.), Protein purification, VCH Publishers 1989 y Harris, ELV & Angal, S., Protein purification methods -A practical approach, IRL Press, Oxford 1990).

Una preparación liofilizada de proteínas puede contener amelogeninas principalmente o exclusivamente hasta un 70-90% con un peso molecular (PM) entre 40.000 y 50.000 daltons, estando compuesto el 10-30% de péptidos más pequeños, sales y agua residual. Las bandas proteicas principales están a 20 kDa, 12-14 kDa y aproximadamente 5 kDa.

Separando las proteínas, por ejemplo, por precipitación, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis preparativa, cromatografía de permeación de gel, cromatografía de fase inversa o cromatografía por afinidad, pueden purificarse las amelogeninas de distinto peso molecular.

La combinación de amelogeninas de distinto peso molecular puede variar, de un compuesto con 20 kDa dominante a un agregado de amelogeninas con muchos pesos moleculares diferentes entre 40 y 5 kDa, hasta un compuesto con 5 kDa dominante. Otras proteínas de la matriz de esmalte tales como amelina, tuftelina, o enzimas proteolíticas que se encuentran normalmente en la matriz de esmalte, pueden añadirse al agregado de amelogenina.

Como fuente alternativa de derivados o proteínas de la matriz de esmalte, se pueden aplicar generalmente rutas sintéticas conocidas para un especialistas en la técnica o usar células cultivadas o bacterias modificadas por técnicas de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al.:Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Propiedades fisico-químicas de la matriz de esmalte, derivados de la matriz de esmalte y proteínas de la matriz de esmalte.

En general, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte son sustancias hidrófobas, es decir, poco solubles en agua especialmente a altas temperaturas. En general, estas proteínas son solubles para valores de pH no fisiológicos y a bajas temperaturas tales como 4-20ºC, aunque si se agregan y precipitan a la temperatura corporal (35-37ºC) y a pH neutral.

La matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte para el uso de acuerdo con la invención también incluyen una sustancia de esmalte activa, en la que al menos una parte de la sustancia de esmalte activa está en forma de agregados o es capaz de formar agregados después de la aplicación in vivo. EL tamaño de partícula de los agregados está en el intervalo de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 1 \mum.

Se contempla que las propiedades de solubilidad de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte son importantes en relación con la actividad profiláctica y terapéutica de las sustancias. Cuando una composición que contiene la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte (en lo sucesivo denominada "sustancia de esmalte activa" como término común) se administra, por ejemplo, a un ser humano, la sustancia proteica precipitará debido al pH predominante en condiciones fisiológicas. de esta forma se forma una capa de matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte en el lugar de aplicación y esta capa (que también puede ser una capa molecular en aquellos casos en los que se haya formado agregado) es difícil de desprender en condiciones fisiológicas. Además, dado que las sustancias tienen propiedades bioadhesivas (ver a continuación) la capa precipitada se une firmemente al tejido y también en el borde entre la capa precipitada y el tejido. De esta forma, la capa proteica cubre el tejido sobre el que se ha aplicado la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte y las sustancias de esmalte activas se mantienen in situ por un periodo prolongado de tiempo, es decir, no es necesario administrar la(s) sustancia(s) de esmalte activa(s) en cortos intervalos. Además, la capa formada in situ puede compararse prácticamente con un apósito oclusivo, es decir, la capa formada protege el tejido sobre el que se ha formado la capa. En el caso del tejido de una herida, un tejido infectado o un tejido inflamado tal capa protege el tejido de más contaminación con los microorganismos presentes en/sobre el tejido.

Para que se forme una capa proteica in situ después de la aplicación, puede ser ventajoso incorporar una sustancia tampón adecuada en una composición farmacéutica o cosmética de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte; el propósito de tal sustancia tampón podría ser evitar la disolución de la sustancia de esmalte activa en el lugar de aplicación.

También se ha descubierto (por los presentes inventores) que la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte tienen propiedades bioadhesivas, es decir, tienen la capacidad de adherirse a la piel o las superficies de mucosa. Estas propiedades son más valiosas en relación con un tratamiento terapéutico y/o profiláctico al menos por las siguientes razones:

- La(s) sustancia(s) profilácticamente y/o terapéuticamente activas pueden mantenerse en el lugar de aplicación durante un periodo prolongado de tiempo (es decir, i) se puede reducir la frecuencia de administración, ii) se puede obtener un efecto de liberación controlada de la sustancia activa y/o iii) se mejora un tratamiento local en el lugar de aplicación).

- Las mismas sustancias pueden ser adecuadas como vehículos para otras sustancias terapéutica o profilácticamente activas porque un vehículo que contiene matriz del esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte puede formularse como un vehículo bioadhesivo (es decir, un nuevo sistema de administración para un fármaco bioadhesivo basado en las propiedades bioadhesivas de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte).

Teorías con respecto al mecanismo de acción

La matriz de esmalte es un ejemplo de un matriz extracelular de proteínas que se adhiere a superficies minerales así como a superficies proteicas. A pH y temperatura fisiológica las proteínas forman un agregado insoluble supramolecular (Fincham et al., in J. Struct. Biol. 1994 Marzo-Abril: 112(2):103-9 y en J. Struct. Biol. 1995 Julio-Agosto; 115(1):50-9), que se degrada gradualmente con enzimas proteolíticas (esto ocurre in vivo e in vitro siempre que las proteasas no se hayan sometido a desactivación).

La observación reciente de que la matriz de esmalte se forma y está temporalmente presente durante la formación de la raíz y del cemento de la raíz puede explicar como la aplicación de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte provoca la regeneración del tejido periodontal. Sin embargo, la observación que subyace la presente invención es que la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte también tienen un efecto antiinfeccioso y antiinflamatorio.

En muchas especies, se encuentran restos de la matriz de esmalte en la nueva corona mineralizada cuando sale un diente en la cavidad poral. Puede argumentarse que un diente nuevo sería muy vulnerable a un ataque bacteriano con bacterias comunes a menos que tenga una protección natural durante esta fase inicial.

La aplicación de la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte no solubles con propiedades antibacterianas y antiinflamatorias en la superficie de una herida mejorará la curación.

Como se demuestra en la sección experimental de este documento, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte o agregados de proteínas impiden el crecimiento bacteriano mediante inhibición por contacto, mientras que las células expuestas reaccionan aparentemente con la matriz de esmalte como en un entorno normal, lo que suprime las respuestas inflamatorias.

De acuerdo con la presente invención, la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte puede usarse con propósitos curativos así como con propósitos preventivos. Además, una matriz de esmalte, derivados de la matriz de esmalte y/o proteína de la matriz de esmalte puede usarse junto con otras sustancias o fármacos activos tales como, por ejemplo, sustancias antibacterianas, antiinflamatorias, antivíricas, antifúngicas, o en combinación con factores de crecimiento tales como, por ejemplo, TGF\beta, PDGF, IGF, GFG, factor de crecimiento de queratinocito, o análogos de péptido D de los mismos (se cree que el EGF promueve la curación mejorado la migración y la división celular de células epiteliales; además, el EGF aumenta la cantidad de fibroblastos en las heridas, lo que tiene como resultado una mayor producción de colágeno). Las enzimas, presentes de forma inherente en la matriz de esmalte o en una preparación de las mismas o añadidas - pueden usarse también en combinación con una matriz del esmalte, un derivado de la matriz de esmalte y/o una proteína de la matriz de esmalte, especialmente proteasas.

Una preparación de la sustancia de esmalte activa se fórmula normalmente como una composición farmacéutica o cosmética. Por supuesto, tal composición puede consistir en la preparación proteica o puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente o cosméticamente aceptable . Los excipientes especialmente adecuados para el uso en composiciones farmacéuticas o cosméticas son alginato de propilenglicol, o ácido hialurónico o sales o derivados de los mismos.

Composiciones farmacéuticas y/o cosméticas

En los siguientes ejemplos se dan composiciones adecuadas que contienen la(s) sustancia(s) de esmalte activas. Dependiendo del uso de la(s) sustancia(s) de esmalte activa(s), una composición puede ser una composición farmacéutica o cosmética. En lo sucesivo, el término "composición farmacéutica" pretende abarcar también las composiciones cosméticas así como las composiciones que pertenecen a la denominada área gris entre productos farmacéuticos y cosméticos, cosmecéuticos.

Para la administración a un individuo (un animal o un ser humano) la matriz de esmalte, los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte (en los sucesivo se denota "sustancia de esmalte activa" y/o una preparación de la misma se fórmula preferiblemente en una composición farmacéutica que contiene la sustancia de esmalte activa y, opcionalmente, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones pueden estar en forma de, por ejemplo, composiciones sólidas, semi-sólidas, o líquidas, tales como, por ejemplo, parches bioabsorbibles, pociones, apósitos, apósitos de hidrogel, apósitos hidrocoloides, películas, espumas, láminas, vendajes, tiritas, dispositivos de administración, implantes, polvos, gránulos, granulados, cápsulas, perlas de agarosa o quitosan, comprimidos, píldoras, bolas, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, nebulizadores, aerosoles, dispositivos de inhalación, geles, hidrogeles, pastas, pomadas, cremas, jabones, supositorios, supositorios vaginales, pasta dentrífica, soluciones, dispersiones, suspensiones, emulsiones, mezclas, lociones, lavado bucal, champús, enemas, kits que contienen por ejemplo dos recipientes separados, en el que el primero de los recipientes contiene la sustancia de esmalte activa mezclada opcionalmente con unas sustancias o fármacos activos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables y el segundo recipiente contiene un medio adecuado para añadir al primer recipientes antes de su uso para obtener una composición lista para usar; y otras formas adecuadas tales como, por ejemplo, implantes o recubrimiento de implantes o en una forma adecuada para usar en relación con la implantación o los transplantes.

Las composiciones para aplicación en la piel o mucosa se consideran las más importantes en relación con la presente invención. De esta forma, una composición que comprende la sustancia de esmalte activa a administrar puede adaptarse para la administración por cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por administración tópica (dérmica), oral, bucal, nasal, aural, rectal o vaginal, o por administración a una cavidad del cuerpo tal como, por ejemplo, la raíz de un diente o en canal de la raíz de un diente. Además, una composición puede adaptarse a una administración en relación con cirugía, por ejemplo, en relación a una incisión dentro del cuerpo para promover la curación de heridas internas y daños en tejido blando.

Como se ha mencionado anteriormente, una composición de la sustancia de esmalte activa puede ser adecuada para el uso durante la cirugía, por ejemplo, para aplicación local (por ejemplo, en la cavidad oral) en forma de gel, película o gránulo seco, o como una solución de aclarado o por tratamiento con una pasta o crema en el tejido o en la superficie para evitar el ataque bacteriano. En relación con la cirugía o con la implantación en el área del canal de la raíz del diente, se puede emplear una pasta para sellar la cavidad.

Las composiciones pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, véase, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences” y “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”, editados por Swarbrick, J. & J.C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988.

Como se ha mencionado anteriormente, la aplicación de una composición que comprende una sustancia de esmalte activa está dirigida a la piel o mucosa. Por supuesto, otras aplicaciones también pueden ser relevantes tales como, por ejemplo, la aplicación en dentaduras postizas, prótesis, implantes y la aplicación en cavidades del cuerpo tales como la cavidad oral, nasal, y vaginal. La mucosa se selecciona preferiblemente entre la mucosa oral, bucal, nasal, aural, rectal y vaginal. Además, la aplicación puede realizarse directamente en o sobre una herida u otros daños en tejido blando.

Además, la aplicación dentro del área dental/odontológica es también de gran importancia. Algunos ejemplos relevantes son la aplicación a bolsas periodontales, encías, heridas en las encías u otras heridas localizadas en la cavidad oral, o en relación con la cirugía oral.

Se anticipa además que, debido a las propiedades antibacterianas de la sustancia de esmalte activa descrita en este documento, puede aplicarse ventajosamente al diente o a las raíces de los dientes para prevenir caries y/o la placa. Para apoyar este uso, se ha demostrado (Weinmann, J.P. et al: Hereditary Disturbances of enamel formation and calcification. J. Amer. Dent. Ass. 32:39- 418, 1945; Sundell S, Hereditary amelogenesis imperfecta. Una estudio clínico genético epidemiológico en una población de niños suecos, Swed Dent J Suppl 1986;31:1-38) que los dientes que se han desarrollado de manera imperfecta (amelogénesis imperfecta), y que por tanto contienen grandes cantidades de amelogeninas, son notablemente resistentes a las caries.

Una composición farmacéutica que comprende una sustancia de esmalte activa sirve como sistema de administración del fármaco. En el presente contexto, el término "sistema de administración del fármaco" denota una composición farmacéutica (una formulación farmacéutica o forma de dosificación) que después de la administración entrega la sustancia activo en el cuerpo de un ser humano o un animal. De esta forma, el término "sistema de administración del fármaco" abarca composiciones farmacéuticas simples tales como, por ejemplo, cremas, pomadas, líquidos, polvos, comprimidos, etc, así como formulaciones más sofisticadas tales como nebulizadores, tiritas, vendajes, apósitos, dispositivos, etc.

Además de la sustancia de esmalte activa, una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la invención puede comprender excipientes farmacéutica o cosméticamente aceptables.

Un excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable es una sustancia que es sustancialmente inocua para el individuo al que se le administra la composición. Tal excipiente satisface normalmente los requerimientos dados por las autoridades nacionales sanitarias. Las farmacopeas tales como por ejemplo, la Farmacopea Británica, la Farmacopea de Estados Unidos de América, y la Farmacopea Europea establecen patrones para los excipientes farmacéuticamente aceptables.

Si un excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para el uso en composiciones farmacéuticas depende generalmente en que tipo de forma de dosificación se seleccione para el uso en un tipo particular de herida. A continuación se dan ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para usar en distintos tipos de composiciones para el uso de acuerdo con la invención.

A continuación se repasan las composiciones farmacéuticas relevantes para el uso de acuerdo con la invención. El repaso se basa en la vía de administración particular. Sin embargo, debe apreciarse que en aquellos casos en los que un excipiente farmacéuticamente aceptable puede emplearse en distintas formas de dosificación o composiciones, la aplicación de un excipiente farmacéuticamente aceptable no se limita a una forma de dosificación particular o a una función particular del excipiente.

La elección del excipiente farmacéuticamente aceptable en una composición para el uso de acuerdo con la invención y la concentración óptima del mismo no puede predecirse generalmente y debe calcularse en base a una evaluación experimental de la composición final. Sin embargo, un especialista en la técnica de la formulación farmacéutica puede encontrar una guía en por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Composiciones tópicas

Para la aplicación en la mucosa o en la piel, las composiciones para el uso de acuerdo con la invención pueden contener vehículos y excipientes convencionalmente no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo microsferas y liposomas.

Las composiciones para el uso de acuerdo con la invención incluyen todo tipo de composiciones sólidas, semi-sólidas y líquidas. Las composiciones de particular relevancia son, por ejemplo, pastas, pomadas, pomadas hidrófilas, geles, hidrogeles, soluciones, emulsiones, suspensiones, lociones, linimentos, champús, gelatinas, jabones, barras, nebulizadores, polvos, películas, espumas, capas, esponjas (por ejemplo, esponjas de colágeno), apósitos (tales como, por ejemplo, apósitos absorbentes de herida), pociones, vendajes, tiritas y dispositivos de administración transdérmica.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir disolventes, agentes tampón, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizadores, emulsionantes, agentes de suspensión, agentes gelificantes, bases de pomadas, potenciadores de la penetración, perfumes, y agentes protectores de la piel.

Algunos ejemplos de disolventes son, por ejemplo, agua, alcoholes, aceites vegetales o marinos (por ejemplo, aceites comestibles tales como aceite de almendra, aceite de ricino, manteca de cacao, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de lino, aceite de oliva, aceite de palmera, aceite de cacahuete, aceite de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite de té), aceites minerales, aceites grasos (parafina líquida, polietilenglicoles, propilenglicoles, glicerol, polialquilsiloxanos líquidos, y mezclas de los mismos.

Algunos ejemplos de agentes tampón son, por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, etc.

Algunos ejemplos adecuados de conservantes para el uso en composiciones son parabelenos tales como metilo, etilo, p-hidrobenzoato de propilo, butilparaben, isobutilparaben, isopropilparaben, sorbato de potasio, ácido sórbico, ácido benzoico, metilbenzoato, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, butilcarbamato de yodopropinilo, EDTA, cloruro de benzalconio, y alcohol bencílico o mezclas de conservantes.

Algunos ejemplos de humectantes son glicerina, propilenglicol, sorbitol, ácido láctico, urea, y mezclas de los mismos.

Algunos ejemplos de agentes quelantes son EDTA sódico y ácido cítrico.

Algunos ejemplos de antioxidantes son anisol butilado hidroxi (BHA), ácido ascórbico y derivados del mismo, tocoferol y derivados del mismo, cisteína, y mezclas de los mismos.

Algunos ejemplos de emulsionantes son gomas de ocurrencia natural, por ejemplo, goma de acacia o goma de tragacanto; fosfatidas de ocurrencia natural, por ejemplo, lecitina de soja, derivados del monooleato de sorbitan, grasas de la lana; alcoholes de la lana; ésteres de sorbitan; monoglicéridos, alcoholes grasos; ésteres de ácidos grasos (por ejemplo, triglicéridos de ácidos grasos); y mezclas de los mismos.

Algunos ejemplos de agentes de suspensión son, por ejemplo, celulosas y derivados de celulosa tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carragenina, goma de acacia, goma arábica, tragacanto, y mezclas de los mismos.

Algunos ejemplos de bases de gel, agentes que aumentan la viscosidad o componentes que son capaces de absorber un exudado de una herida son: parafina líquida, polietileno, aceites grasos, sílice o aluminio coloidal, jabones de cinc, glicerol, propilenglicol, tragacanto, polímeros de carboxivinilo, silicatos de magnesio-aluminio, Carbopol®, polímeros hidrófilos tales como, por ejemplo, almidón o derivados de la celulosa tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa u otros derivados de la celulosa, hidrocoloides hinchables en agua, carrageninas, hialuronatos (por ejemplo gel hialuronato que contiene opcionalmente cloruro sódico), y alginatos incluyendo alginato de propilenglicol.

Algunos ejemplos de bases para pomadas son, por ejemplo, cera de abeja, parafina, cetanol, palmitato de cetilo, aceites vegetales, ésteres de sorbitan de ácidos grasos (Span), polietilenglicoles y productos de condensación entre ésteres de sorbitan de ácidos grasos y óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitan (Tween).

Algunos ejemplos de bases de pomada hidrófobas o emulsionantes en agua son parafinas, aceites vegetales, grasas animales, glicéridos sintéticos, ceras, lanolina, y polialquilsiloxanos líquidos.

Algunos ejemplos de bases de pomadas hidrófilas son macrogoles sólidos (polietilenglicoles).

Otros ejemplos de bases de pomada son jabones de trietanolamina, alcohol graso sulfatado y polisorbatos.

Algunos ejemplos de componentes en polvo son: alginato, colágeno, lactosa, polvo que es capaz de formar un gel al aplicarlo a una herida (absorbe el líquido/exudado de la herida). Normalmente, los polvos para la aplicación en grandes heridas deben ser estériles y las partículas presentes deben estar micronizadas.

Algunos ejemplos de otros excipientes son polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, pectina, goma xantana, goma de algarrobilla, goma de acacia, gelatina, carbómero, emulsionantes tales como vitamina E, estearatos de glicerilo, glucósido de cetanilo, colágeno, carragenina, hialuronatos y alginatos y quito sanos.

Los apósitos y vendajes también son sistemas de administración importantes de una sustancia de esmalte activa. Cuando se usan apósitos como forma de dosificación, la sustancia de esmalte activa puede mezclarse con otros materiales/ingredientes antes o durante la fabricación del apósito, o, el apósito puede recubrirse de alguna forma con la sustancia de esmalte activa, por ejemplo, sumergiendo el apósito en una solución o dispersión de la sustancia de esmalte activa o rociando con un nebulizador una solución o dispersión de la sustancia de esmalte activa en el apósito. Alternativamente, la sustancia de esmalte activa puede aplicarse en forma de polvo al apósito. Los apósitos pueden estar en forma de apósitos absorbentes de heridas para la aplicación a heridas con exudados. Los apósitos también pueden estar en forma de apósitos de hidrogel (por ejemplo, polímeros reticulados tales como, por ejemplo, intrasite® que contiene carboximetilcelulosa, propilenglicol, o polisacáridos, disacáridos y proteínas) o en forma de apósitos oclusivos tales como, por ejemplo, alginatos, quitosan, películas, láminas, colágeno, placas, polvos, espumas o esponjas hidrófilas de poliuretano, espumas (por ejemplo, de poliuretano o silicona), hidrocoloides (por ejemplo, carboximetilcelulosa, CMC), colágeno y apósitos basados en ácido hialurónico incluyendo combinaciones de los mismos.

Los apósitos de alginato, quitosano e hidrocoloides absorben el exudado de la herida cuando se colocan en una herida. Cuando hacen esto, producen un gel acuoso en la superficie de la herida y se cree que este gel es beneficioso para la curación de la herida debido a la retención de humedad en la herida.

También se contempla que la sustancia de esmalte activa se incorpore en un adhesivo al tejido que comprenda también, por ejemplo, fibrinógeno y trombina y opcionalmente Factor XIII u otro factor de coagulación del plasma para proporcionar homeostasis. El adhesivo al tejido puede prepararse como una premezcla de la sustancia de esmalte activa, fibrinógeno y opcionalmente Factor XIII, añadiendo trombina a la premezcla inmediatamente antes de aplicar el tejido en la herida. Alternativamente, la premezcla de fibrinógeno y sustancia de esmalte activa y opcionalmente Factor XIII puede aplicarse en la herida antes de la aplicación de trombina. In situ, la trombina transforma el fibrinógeno a fibrina reproduciendo por tanto el proceso de coagulación que ocurre naturalmente en la curación de heridas. La presencia de la sustancia de esmalte activa en el tejido adhesivo puede servir para acelerar el proceso de curación de la herida como se ha descrito anteriormente. Un producto comercial adecuado para la inclusión de la sustancia de esmalte activa es Tisseel®, un sellador de fibrina de dos componentes fabricado por Immuno, AG, Viena, Austria.

En una formulación de pasta dentífrica o de aclarado bucal u otra formulación para la aplicación en dientes o raíces de dientes, la sustancia de esmalte activa puede estar presente en estado disuelto en un vehículo de pH ligeramente ácido o como dispersión en un vehículo de pH neutral. Se anticipa que en el uso de la sustancia de esmalte activa puede formar una capa protectora en la superficie de los dientes, evitando por tanto el acoplamiento de las bacterias que producen las caries (véase el Ejemplo 4 a continuación). En tales preparaciones de cuidado dental, la sustancia de esmalte activa puede formularse junto con uno o más compuestos que tienen un efecto preventivo de caries, especialmente flúor u otro elemento de traza tal como vanadio o molibdeno. A pH neutral, se cree que el elemento de traza se une a (por ejemplo, por enlaces iónicos) o se empotra en la sustancia de esmalte activa de la cual se libera para ejercer su efecto preventivo de caries cuando la sustancia de esmalte activa se disuelve a un pH de aproximadamente 5,5 o menos, por ejemplo, debido a la producción de ácido por las bacterias que producen las caries.

Las composiciones mencionadas anteriormente para la administración tópica son más adecuadas para aplicar directamente en las heridas o pueden ser adecuadas para la aplicación en o para la introducción en orificios relevantes del cuerpo, por ejemplo, el orificio rectal, uretral, vaginal, aural, nasal, u oral. La composición puede aplicarse directamente en la parte a tratar tal como, por ejemplo, en la mucosa, o por cualquier otra vía conveniente de administración.

Las composiciones que han demostrado ser importantes en relación con la aplicación tópica son aquellas que tienen propiedades tixotrópicas, es decir, la viscosidad de la composición se afecta, por ejemplo, por agitación, de forma que se puede reducir la viscosidad de la composición en el momento de la administración y cuando la composición se ha aplicado, la viscosidad aumenta de forma que la composición permanece en el lugar de aplicación.

Composiciones para uso oral para aplicación en la mucosa o en la piel

Las composiciones adecuadas para el uso de acuerdo con la invención pueden presentarse también en forma de suspensiones, emulsiones o dispersiones. Tales composiciones contienen la sustancia de esmalte activa en mezcla con un agente de dispersión, un agente de humidificación, un agente de suspensión y/o uno o más conservantes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones son también adecuadas para el uso en la administración de la sustancia de esmalte activa en, por ejemplo, una mucosa intacta o dañada, tal como la mucosa oral, bucal, nasal, rectal o vaginal, o para la administración en la piel intacta o dañada, o en heridas.

Algunos agentes de dispersión o de humidificación adecuados son, por ejemplo, fosfatidas de ocurrencia natural, por ejemplo, lecitina, o lecitina de soja, productos de condensación del óxido de etileno con, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol alifático de cadena larga, o un éster parcial derivado de ácidos grasos y un hexitol o anhídrido de hexitol, por ejemplo, estearato de polioxietileno, monooleato de polioxietilen sorbitol, monooleato de polioxietilen sorbitan, etc.

Algunos agentes de suspensión adecuados son , por ejemplo, gomas de ocurrencia natural tales como, por ejemplo, goma de acacia, goma xantana, o goma de tragacanto; celulosas tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel® RC 591, metilcelulosa); alginatos y quitosanos tales como, por ejemplo, alginato sódico, etc.

Algunos ejemplos de conservantes para el uso en composiciones de acuerdo con la invención son los mismos que los mencionados anteriormente.

Las composiciones para el uso de acuerdo con la invención pueden administrarse también por vía oral. Las composiciones orales adecuadas pueden estar en forma de formulación particulada o en una forma de dosificación sólida, semi-sólida, o líquida.

Las composiciones para uso oral incluyen formas de dosificación sólidas tales como, por ejemplo, polvos, gránulos, granulados, parches, comprimidos, cápsulas, comprimidos efervescentes, comprimidos masticables, pastillas, comprimidos de liberación inmediata, y comprimidos de liberación modificada así como formulaciones en fluido o líquidas tales como, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones, dispersiones y mezclas. Además, la composición puede estar en forma de polvos, polvos dispersables, o gránulos adecuada para la preparación de una suspensión acuosa por adición de un medio líquido tal como, por ejemplo, un medio acuoso.

Con respecto a formas de dosificación sólidas para uso oral (o tópico), una composición para el uso de acuerdo con la invención contiene normalmente la sustancia de esmalte activa y cualquier otra sustancia opcionalmente en mezcla con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo,

diluyentes o agentes de relleno inertes, tales como sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata, carbonato cálcico, cloruro sódico, lactosa, fosfato cálcico, sulfato cálcico, o fosfato sódico;

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agentes de granulación y disgregación, por ejemplo, derivados de la celulosa incluyendo celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos o ácido algínico y quitosanos;

agentes aglutinantes, por ejemplo, sacarosa, glucosa, sorbitol, acacia, ácido algínico, alginato sódico, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, silicato de magnesio aluminio, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, o un polietilenglicol; y quitosanos;

agentes lubricantes incluyendo deslizantes y antiadhesivos, por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de cinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o talco.

Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes tampón, etc.

En aquellos casos en los que la composición farmacéutica está en forma de dosificación sólida (por ejemplo, un comprimido o una cápsula), la forma de dosificación unitaria puede proporcionarse con un recubrimiento como uno o más de los recubrimientos mencionados anteriormente.

En aquellos casos en los que la composición está en forma de comprimido, cápsula o composición de múltiples unidades, la composición o las unidades individuales o un comprimido o una cápsula que contiene las unidades individuales puede recubrirse, por ejemplo, con un recubrimiento de azúcar, un recubrimiento de película (por ejemplo, basado en hidoxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato (Eudragit), polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona) o un recubrimiento entérico (por ejemplo, basado en un copolímero de ácido metacrílico (Eudragit), ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, shellac y/o etilcelulosa). Además, puede emplearse un material de retraso tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Composiciones rectales y/o vaginales

Para la aplicación en la mucosa rectal o vaginal, las composiciones adecuadas de acuerdo con la invención incluyen supositorios (de tipo emulsión o suspensión), enemas, y cápsulas rectales de gelatina (soluciones o suspensiones). Las bases de supositorio farmacéuticamente aceptables incluyen manteca de cacao, ácidos grasos esterificados, gelatina glicerinada, y diversas bases solubles o dispersables en agua como polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitan. Pueden incorporarse diversos aditivos como, por ejemplo, potenciadores o tensioactivos.

Composiciones nasales

Para la aplicación en la mucosa nasal (así como en la mucosa oral), los nebulizadores y aerosoles son composiciones adecuadas de acuerdo con la invención. En una composición nasal típica, la sustancia de esmalte activa está presente en forma de formulación particulada opcionalmente dispersa en un vehículo adecuado. Los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros materiales farmacéuticamente aceptables presentes en la composición tales como diluyentes, potenciadores, aromatizantes, conservantes, etc. se seleccionan de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional de una manera que comprenden los especialistas en la técnica de formular productos farmacéuticos.

Dosificaciones de matriz del esmalte, derivados de la matriz de esmalte y/o proteínas de la matriz de esmalte

En una composición farmacéutica para usar de acuerdo con la invención en la piel o mucosa, una sustancia de esmalte activa está generalmente presente en una concentración en el intervalo de 0,01% a aproximadamente 99,9% p/p. La cantidad de composición aplicada tendrá como resultado una cantidad de proteína por cm^{2} de herida/piel/área de tejido correspondiente de aproximadamente 0,01 mg/cm^{2} a aproximadamente 20 mg/cm^{2} tal como de aproximadamente 0,1 mg/cm^{2} a aproximadamente 15 mg/cm^{2}.

La cantidad aplicada de composición depende de la concentración de sustancia de esmalte activa en la composición y de la velocidad de liberación de la sustancia de esmalte activa de la composición, pero está generalmente en un intervalo que corresponde de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/ml. En algunos casos son deseables concentraciones mayores y también se pueden obtener tal como una concentración de al menos aproximadamente 100 mg/ml.

Cuando se aplica la composición en la cavidad oral, las siguientes dosis son relevantes:

El área experimental del defecto (en monos) en la cavidad oral tiene normalmente un tamaño de aproximadamente 4 x 2 x 5-6 mm que corresponden a 50 \mul o de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 0,15 mg de proteína total/mm^{2} o aproximadamente 2,5-15 mg/cm^{2}. Normalmente, se aplica hasta 0,5 ml tal como, por ejemplo, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 ml de una composición con una concentración de aproximadamente 1-40 mg/ml tal como, por ejemplo, 5-30 mg/ml.

El área del defecto en humanos en la cavidad oral debida a enfermedades periodontales tiene aproximadamente un tamaño de aproximadamente 5-10 x 2-4 x 5-10 mm que corresponde a aproximadamente 200 \mul y normalmente se aplica como máximo aproximadamente 0,5-1 ml tal como aproximadamente 0,2-0,3 ml por diente de una composición que tiene una concentración de aproximadamente 1-40 mg de proteína total/ml tal como, por ejemplo, 5-30 mg/ml. 0,2-0,3 mg/ml corresponde a 6 mg de proteína por 25-100 mm^{2} o aproximadamente 0,1 mg/mm^{2} si se calcula sólo en la superficie de la raíz. Normalmente, se aplica un volumen excesivo para permitir la cobertura de todas las superficies. Incluso para varias capas se necesitaría sólo una pequeña parte de las cantidades mencionadas anteriormente.

Generalmente, se aplica aproximadamente 0,1-0,5 ml tal como, por ejemplo, 0,15-0,3 ml o aproximadamente 0,25-0,35 ml de una composición que comprende la sustancia de esmalte activa en volúmenes de defectos en la los alvéolos de extracción (agujeros después de la extracción de dientes). La concentración de sustancia de esmalte activa en la composición es normalmente aproximadamente 1-40 mg de proteína total/ml tal como, por ejemplo, 5-30 mg/ml. Cuando se aplican 0,3-0,4 ml de tal composición para muelas del juicio, este volumen corresponde a aproximadamente 0,1 mg/cm^{2} (alveolo calculado como un cilindro con radio 5 mm y altura 20 mm).

La concentración de sustancia de esmalte activa en una composición farmacéutica depende de la sustancia de esmalte específica, su potencia, la gravedad de la enfermedad a prevenir o tratar, y la edad y estado de salud del paciente. Los métodos aplicables para seleccionar concentraciones relevantes de sustancia de esmalte activa en la composición farmacéutica son conocidos por los especialistas en la técnica y pueden realizarse de acuerdo con las pautas establecidas para una buena práctica clínica (GCP) o regulaciones de Exención de Nuevos Fármacos Experimentales ("IND") como las descritas en, por ejemplo, el Patrón Internacional ISO/DIS 14155 Clinical Investigation of medical devices, 1994 y ICH (Comité Internacional para la harmonización): Harmonised tripartite guideline for good clinical practice, Brookwood Medical Publications, Ltd, Surrey, UK, 1996. Un especialista en la técnica, por medio de los métodos descritos en los libros de texto, pautas y regulaciones descritas anteriormente así como con el conocimiento general común del campo, sería capaz de seleccionar el régimen de regulación exacto a implementar para cualquier sustancia de esmalte activa y/o seleccionar otras sustancias activas y formas de dosificación usando exclusivamente procedimientos de experimentación rutinarios.

En otros aspectos la invención se refiere a métodos para reducir la infección y prevenir y/o tratar la inflamación, comprendiendo estos métodos la administración a un mamífero en necesidad de tal tratamiento de una cantidad eficaz de sustancia de esmalte activa.

Debe apreciarse, que los detalles y particulares que conciernen al uso de la sustancia de esmalte activa son los mismos o análogos que los detalles y particulares que conciernen otros aspectos de uso (aspectos antibacteriano y antiinflamatorio) y a los aspectos del método discutidos anteriormente, y esto significa que cuando sea apropiado, las afirmaciones anteriores que conciernen a la sustancia de esmalte activa, preparación de i) una sustancia de esmalte activa, una preparación que contiene una sustancia de esmalte activa, iii) una composición farmacéutica que contiene una sustancia de esmalte activa, así como a las propiedades mejoradas y usos de la misma se aplican mutatis mutandis a todos los aspectos de la invención.

Breve descripción de las figuras

La invención se describe adicionalmente con referencia a los dibujos adjuntos en los que

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la síntesis de DNA en células humanas PDL con EMD o células no estimuladas;

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la producción de TGF-\beta1 en células humanas PDL estimuladas con EMD y células no estimuladas;

La Fig. 3 es un dibujo esquemático de una cámara de flujo y un ordenador usando en el experimento de flujo descrito en los Ejemplos 3 y 4 a continuación;

Las Figs. 4, 5, y 6 son gráficos que muestran los resultados de tres experimentos distintos que muestran el acoplamiento de Actinomyces viscosus a placas de vidrio tratadas con EMD y ácido acético, respectivamente;

Las Figs. 7, 8 y 9 son gráficos que muestran los resultados de tres experimentos distintos que muestran el acoplamiento de Streptococcus mutans a placas de vidrio tratadas con EMD y ácido acético, respectivamente.

La Fig. 10A es una fotografía de rayos-X que muestra el daño postoperativo después de la extracción de una muela del juicio; y

La Fig. 10B es una fotografía de rayos-X que muestra la regeneración del ligamento periodontal después del tratamiento con EMD, como se describe en el Ejemplo 12 a continuación.

Sección experimental Materiales y métodos

Derivados de la matriz de esmalte, EDMOGAIN® de BIORA AB, S-205 12 Malmö, Suecia que contiene 30 mg de proteína de la Matriz Esmalte liofilizada (en lo sucesivo abreviada como EMD) y 1 ml de Solución Vehículo (Alginato de Propilenglicol), que se mezclan antes de la aplicación, a menos que la proteína y el Vehículo se prueben por separado. La relación de peso es aproximadamente 85/5/10 entre los máximos de proteínas a 20, 14 y 5 kDa, respectivamente.

EMD tratada con calor es EMD que se ha calentado durante 3 horas a aproximadamente 80ºC para inactivar proteasas residuales.

La proteína amelogenina 20 kDa y el Péptido Amelogenina Rico en Tirosina (TRAP) 5 kDa se aislaron de la EMD usando cromatografía de permeación en gel HPLC (TSK G-2000 SW equilibrado con acetonitrilo al 30 en NaCl al 0,9%) y se purificaron por cromatografía de fase inversa (Pro-RPC, HR 5/10, Pharmacia- Upjohn, Suecia) usando un gradiente de acetonitrilo. La proteína/polipéptidos separados se añadieron después a distintas cantidades a la Solución Vehículo de EMDOGAIN®, a menos que se prueben por separado.

El ácido hialurónico fue HMT-028 (PM 990.000) de Sikagaku Corporation, Tokio, Japón.

Las bacterias y levaduras se aislaron principalmente de pacientes, se clasificaron por sus propiedades metabólicas y antígenas de acuerdo con procedimientos convencionales. Las especies de bacterias y levaduras usadas se enumeran en la tabla a continuación.

La albúmina de suero (bovino) y el Colágeno de Tipo I (bovino) se obtuvieron en Sigma, St. Louis, U.S.A.).

Las placas de agar fueron "agar de infusión Brain Hart" de Difco suplementadas con glóbulos rojos humanos (100 ml por litro de agar).

Ejemplos Ejemplo 1 Proliferación celular y producción de TGF-\beta1 en células PDL tratadas con EMDOGAIN®

Se preparó una solución stock de EMD disolviendo un vial (que contiene 30 mg de EMD) en 3 ml de HAc al 0,1% filtrado estéril. Se añadieron 60 \mul de la solución de stock EMD a 6000 \mul de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco que contenía suero de ternera fetal al 10% y 1% de una solución de penicilina- streptomicina. Se añadieron 300 \mul de la mezcla a cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos (NUNC A/S, Dinamarca, Cat. # 167008). Se añadieron 1000 células humanas del ligamento periodontal (PDL) (obtenidas de tejidos periodontales en humanos sanos de individuos a los que les extraen los premolares por razones ortodónticas, y cultivadas sustancialmente como se ha describe en Somerman et al., J. Dental Res. 67, 1998, pág. 66-70) a cada pocillo y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 5 días.

Las células PDL usadas como control se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco sustancialmente como se ha descrito anteriormente, pero en ausencia de EMD.

Después de la incubación, las células se sometieron a un inmunoensayo de proliferación células midiendo la incorporación de la 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim, Cat. # 1647 229). En este procedimiento, se incorpora BrdU en lugar de timidina en el ADN de células en desarrollo. La incorporación de la BrdU se detecta con un análisis ELISA, y la cantidad de BrdU medida en el análisis es una indicación de la tasa de síntesis de AND y por consiguiente de la tasa de proliferación células de las células PDL.

Los resultados que aparecen en la Fig. 1 muestran que las células PDL cultivadas en presencia de EMD muestran un tasa significativamente mayor de proliferación que las células PDL cultivadas en ausencia de EMD.

A 100 \mul del sobrenadante celular de la placa de microtitulación se le añaden 20 \mul de HCl 1N seguido de incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de incubación se neutralizó con 20 \mul de NaOH 1N/HEPES 0,5M. Se añadieron 100 \mul de esta mezcla a 400 \mul de un tampón de dilución. 200 \mul de la dilución se sometieron a ELISA usando el kit Quantikines™ (Cat. # DB100) disponible en R&D Systems, UK, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de la Fig. 2 muestran un aumento pronunciado en la producción de TGF-\beta1 en células PDL incubadas con EMD en relación a células PDL no incubadas con EMD.

Ejemplo 2 Investigación del crecimiento de microorganismos en presencia de derivados de la matriz de esmalte y proteínas de la matriz de esmalte

El propósito de esta ejemplo es demostrar la influencia inhibidora de los derivados de la matriz de esmalte y de las proteínas de la matriz de esmalte en el crecimiento microbiano in vitro.

Las proteínas usadas en este ejemplo se disolvieron en solución salina fosfatada con el pH ajustado a 5,5 con ácido acético. Los microbios empleados se suspendieron en PBS pH 6,8 a una concentración final con un OD_{600} de 0,4.

Se colocaron 50 microlitros de EMDOGAIN® (30 mg de EMD en 1 ml de PGA) y 50 microlitros de EMD, EMD tratado con calor, y fracciones de EMD A, B, C, y H (todas 10 mg de proteína por ml de tampón PBS) en una placa de agar y se dejaron secar al aire encima de la placa (diámetro 9 cm, agar convencional para determinación de suplementos de resistencia añadidos requeridos por cada microbio). Después, se añadió una solución homogénea de microbios (1 ml, OD_{280}=0,5) extendiendo la suspensión encima de las placas de agar, y las placas se incubaron a 35ºC durante 3 días (cultivos aeróbicos) o 14 días (cultivos anaeróbicos) en una atmósfera enriquecida en CO_{2} o en condiciones anaeróbicas de acuerdo con los requerimientos individuales de crecimiento. Todos los cultivos se inspeccionaron a diario. El Colágeno de tipo 1 y la albúmina de suero (ambos bovinos) se probaron en las mismas condiciones como controles. También se aplicó alginato de propilenglicol no diluido (PGA-vehículo EMD), tampón PBS y ácido hialurónico (HA - vehículo EMD alternativo) como controles negativos.

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Sólo los derivados de la matriz de esmalte o las proteínas de la matriz de esmalte o sus derivados inhibieron el crecimiento de algunos microbios. No hubo signos de zonas de difusión alrededor de la proteína indicando que las proteínas de EMD aplicadas se agregaron en la superficie de agar y que sólo se inhibió el crecimiento de los microbios en contacto directo con las proteínas. Cuando se recogieron las muestras de la zonas de inhibición y se cultivaron en medio líquido (caldo LB con suplementos), los monocultivos de microbios originales podían revivir lo que sugiere que las proteínas activas no son microbicidas. Todos los controles dieron negativo, indicando que ningún mecanismo no específico influyó en los resultados.

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Todos los resultados en la tabla están registrados el segundo día (cultivos aeróbicos) o después de cinco días (cultivos anaeróbicos) de incubación.

Estos resultados muestran que la EMD que contenía proteínas o péptidos, cuando se le permite agregarse en una superficie puede inhibir el crecimiento de ciertos rods gram negativos y algunos cocci gram positivos. En base a las características básicas de comportamiento de las proteínas EMD (ref. jpc) y dado que el efecto no es microbicida, una explicación razonable para el efecto observado es que los agregados de proteína forman una barrera insoluble que separa los microbios del sustrato de crecimiento que requieren.

Ejemplo 3 Efecto de EMD en la tasa de acoplamiento de Actinomyces viscosus in vitro Introducción

Se investigó el efecto de los EMD en el acoplamiento inicial de Actinomyces viscosus, un organismo oral que está ampliamente presente en la placa dental pero que normalmente no le se considera asociado con la periodontitis grave. Aunque este microorganismo puede formar agregados con Porphyromonas gingivales y de esta forma puede influir en la colonización de la superficie de la raíz con potenciales patógenos periodontales, los Actinomyuces spp se encuentran en proporciones relativamente grandes en lugares subgingivales sanos (estos descubrimientos se corroboran con lo de Lijemark et al., Microbiol. Immunol. 8, 1993, pág. 5-15, quien descubrió que, después del tratamiento periodontal, las proporciones de Actinomyces spp. se reducían significativamente. Haffajee et al., J. Clin. Periodont. 24, 1997, pág. 767- 776 concluyó con conteos microbiológicos en la placa subgingival que en sujetos con una buena respuesta al tratamiento periodontal inicial, A. viscosus y T. denticola eran relativamente abundantes.

Materiales

El Actinomyces viscosus HG85 fue proporcionado por Dr. A.J. van Winkelhoff (Dept. of Oral Microbiology, ACTA). EMDOGAIN® fue proporcionado por BIORA (Malmö, Suecia). El detergente RBS se compró en Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland).

Crecimiento bacteriano y recogida

Se inoculó A. viscosus de placas de agar en cultivo por lotes en medio de Schaedler durante 24 horas a 37ºC. Este cultivo se usó para inocular un segundo cultivo en caldo de Schaedler que se dejó crecer durante 16 horas. Las células se recogieron por centrifugación (5 minutos a 6500 x g) y se lavaron dos veces con agua desmineralizada. Posteriormente, los microorganismos se sonicaron durante 20 segundos a 30 W (Vibra Cell modelo 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) para romper las cadenas y los agregados bacterianos. La sonicación se realizó de forma intermitente mientras se refrigeraba en un baño con hielo y agua. Las células se contaron usando un contador celular Bürker-Türker. Finalmente, se suspendió A. viscosus en un tampón de adhesión (fosfato potásico 2mM, cloruro potásico 50 mM, y cloruro cálcico 1 mM, pH 6,8).

Recubrimiento de las placas de vidrio

Las placas de vidrio se limpiaron meticulosamente por sonicación en detergente RBS al 5%, aclarado total con agua del grifo, lavado en metanol y aclarando finalmente con agua destilada. Este procedimiento produce un ángulo de contacto con el agua de cero grados. Se disolvió EMD en ácido acético 0,01 M en una concentración de 7,5 mg/ml. Las placas de vidrio se dividieron en dos mitades usando un marcador de teflón (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca). Se aplicó ácido acético en un lado; 250 \mug EMD al otro. Las placas de vidrio se secaron al aire en un armario de flujo durante 4-6 horas.

Experimento de flujo

La cámara de flujo y el ordenador usados en este experimento se muestran esquemáticamente en la Fig. 3. Antes de cada experimento, todos los tubos y la cámara de flujo se llenaron con el tampón de adhesión, con precaución de que el sistema no contuviese burbujas de aire. Las placas de vidrio recubiertas formaban el fondo de la cámara de flujo. La velocidad de flujo se estableció a 2,5 ml/min (que es comparable a la tasa de flujo media de saliva en seres humanos). La suspensión bacteriana se hizo circular a través del sistema durante aproximadamente 3-4 horas, y se contó el número de bacterias que se adherían al sustrato. Se realizaron tres experimentos independientes. Todos los experimentos se realizaron con 3x10^{8} células por 250 ml de tampón de adhesión. Durante el experimento, se tomaron imágenes cada 10-15 minutos en 6 lugares predeterminados sobre las placas de control y recubiertas con EMD. La altura del canal de la cámara de flujo paralela fue 0,6 mm.

Análisis de los datos

Después de contar las células adheridas en todas las imágenes, los datos se transformaron a bacterias por centímetro cuadrado. Para cada experimento, se usó el número final de microorganismos por cm^{2} para los análisis estadísticos (prueba de la T de Student para observaciones emparejadas usando n como número de experimentos).

Resultados

El experimento X (Fig. 4) mostró un aumento gradual de la cantidad de microorganismos acoplados, especialmente durante los primeros 150 min. de flujo. Después de este intervalo de tiempo, el número de microorganismos acoplados a los EMD alcanzó un máximo de 2,0x10^{6} bacterias por cm^{2} que era aproximadamente cuatro veces mayor que el aspecto de la placa de vidrio tratada con ácido acético.

Además, en el Experimento 2 (Fig. 5), los EMD estimularon espectacularmente el acoplamiento de A. viscosus al sustrato. Sin embargo, al inicio del experimento el efecto era menos evidente. Quizás, esto se debe a la menor densidad de los organismos usados en el sistema de flujo. Después de 90 minutos el número de bacterias acopladas a los EMD aumentó gradualmente en relación al control, alcanzando un máximo de 1,4x10^{6} por cm^{2} después de 3 horas, un aumento triple.

El tercer experimento (Fig. 6) mostró una estimulación de la adherencia de A. viscosus al recubrimiento de EMD incluso después de 5 minutos de flujo. Los EMD indujeron un rápido aumento en el número de organismos acoplados durante los primeros 45 minutos. Después, el acoplamiento continuó progresivamente. El acoplamiento al lado tratado con ácido acético mostró un patrón similar pero con menos microorganismos adhiriéndose. Después de 200 minutos, el acoplamiento al recubrimiento de EMD era dos veces mayor que en la superficie tratada con ácido acético.

En los 3 experimentos, de forma conjunta, la diferencia demostró ser estadísticamente significativa (p<0,05).

Con estos resultados, parece que EMD, usada como recubrimiento en una superficie de vidrio, tiene un efecto estimulatorio in vitro considerable en el acoplamiento de A. viscosus. Aunque no se conoce todavía qué factores son responsables de este mejor acoplamiento inicial, se asume que el organismo interactúa con los restos prolina que están muy presentes en el componente amelogenina de la mezcla de proteínas disponible en el mercado. La adhesión bacteriana se determina a menudo mediante reconocimiento con proteína-péptido y lectina-carbohidrato específicos. Se conoce que A. viscosus, con su fimbriae de tipo 1, se puede unir a proteínas ricas en prolina como las Proteínas Ricas en Prolina (PRP) salivares y colágenos de tipo I y III.

Las interacciones específicas entre EMD y ciertos microorganismos orales puede tener consecuencias importantes para la composición de la biopelícula en la cavidad oral, ya que puede cambiar la ecología de la placa. Se pudiesen realizar cambios ecológicos dirigidos a promover los organismos no asociados con enfermedades periodontales, la aplicación de la EMD puede tener como resultado una mejora de la enfermedad periondontal, sólo por esa acción. Esto es, por supuesto, aparte de otros efectos beneficiosos de EMD.

Ejemplo 4 Efecto de la EMD en la tasa de acoplamiento de Streptococcum mutans in vitro

Existe una gran evidencia del papel causal de los organismos de la placa en la patogénesis de enfermedades orales como periodontitis y caries. De acuerdo con el modelo actual de formación de la placa subgingival, se cree que los Streptococcus spp. son los colonizadores principales de la superficie del diente. Posteriormente, la placa se desarrolla por el crecimiento bacteriano y por la acumulación posterior de otras especies bacterianas. Esta acumulación puede ocurrir mediante uniones bacteria-bacteria o puede estar mediada por moléculas salivares. La formación de la placa está facilitada también por la producción de macromoléculas extracelulares. S. mutans se considera actualmente como una de las especies de la biopelícula que pueden merecer más atención, dada su relación con la caries dental. Aunque se ha demostrado que varias bacterias gram positivas (es decir, S. mutans) causan pérdida alveolar de hueso en animales gnotobióticos, estos microorganismos no parecen ser contribuidores principales en la ecología de la bolsa periodontal en desarrollo. En cualquier caso los microorganismos potencialmente patógenos deben ser capaces de evitar la protección del hospedador y los mecanismos inmunes, así como de iniciar la destrucción del tejido hospedador.

Materiales

El Streptococcus mutans NS fue proporcionado amablemente por Dr. H. van der Mei (Materia Tecnica, University of Groningen). EMDOGAIN® fue proporcionado por BIORA (Malmö, Suecia). El detergente RBS se compró en Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland).

Crecimiento bacteriano y recogida

Se inoculó S. mutans de placas de agar en cultivo por lotes en medio de caldo de Todd Hewitt durante 24 horas a 37ºC. Este cultivo se usó para inocular un segundo cultivo en caldo de Todd Hewitt que se dejó crecer durante 16 horas. Las células se recogieron por centrifugación (5 minutos a 6500 x g) y se lavaron dos veces con agua desmineralizada. Posteriormente, los microorganismos se sonicaron durante 20 segundos a 30 W (Vibra Cell modelo 375, Sonics and Materials Inc., Danbury, CT, USA) para romper las cadenas y los agregados bacterianos. La sonicación se realizó de forma intermitente mientras se refrigeraba en un baño con hielo y agua. Las células se contaron usando un contador celular Bürker-Türker. Finalmente, se suspendió S. mutans en un tampón de adhesión (fosfato potásico 2mM, cloruro potásico 50 mM, y cloruro cálcico 1 mM, pH 6,8).

Recubrimiento de las placas de vidrio

Experimento de flujo

Análisis de los datos

Resultados

En cada uno de los tres experimentos la EMD mostró un efecto inhibidor en la tasa de acoplamiento de S. mutans (Figs. 7, 8, 9; p<0,05). La inhibición ascendió aproximadamente a 40-70% en comparación con los controles tratados con ácido acético.

El primer experimento (Fig. 7) mostró después de 10 minutos de flujo una inhibición de la cantidad de S. mutans acoplados a la superficie de vidrio recubierta con EMD. Después de 3 horas, el acoplamiento se inhibió a aproximadamente el 60% del control.

En el segundo experimento (Fig. 8) EMP empezó a inhibir el acoplamiento de S. mutans después de ½ hora de flujo. El número de S. mutans adheridos a la EMD alcanzó un máximo de 0,5 millón por cm^{2} después de aproximadamente 40 minutos de flujo. Después de 3 ½ horas, los recuentos eran de aproximadamente 25% comparado con los controles.

El tercer experimento (Fig. 9) mostró una inhibición del acoplamiento de S. mutans con la influencia de EMD desde el inicio del procedimiento de flujo. Como en el experimento 1, la inhibición ascendió a un 60% de los valores de control después de 3 horas de flujo.

El presente estudio muestra que la EMD tiene un efecto inhibidor significativo en la adherencia de S. mutans a superficies de vidrio. Una posible explicación para esta inhibición puede ser las presencia de compuestos hidrófobos en la mezcla de EMD. Una de las proteínas presentes en abundancia en la mezcla es amelogenina, una proteína que contiene, además de una secuencia ácida hidrófila C-terminal, un núcleo hidrófobo que contiene 100-300 residuos ricos en prolina, leucina, metionina y glutamina. Saito et al., Arch. Oral Biol. 42, 1997, pág. 539-545, descubrió que se inhibía la adherencia de distintas cepas de S. mutans a una proteína hidrófoba inmovilizada (OAIS). Los autores atribuyeron el efecto a la carga negativa en la superficie celular de los microorganismos (que es el caso para S. mutans). Otras características de la superficie pueden estar también implicadas en la adherencia afectada al sustrato. S. mutans contiene un antígeno I/II de superficie que tienen una parte N- terminal particularmente rica en alanina e incluye repeticiones en tandem. Se predice que esta región es alfa-helicoidal, adoptando una conformación en bobina, y puede ser responsable de la hidrofobia de la superficie celular asociada con la expresión del antígeno I/II.

Ejemplo 5 Efecto de la EMD en el crecimiento de ciertos periopatógenos

Se precultivaron Prevotella intermedia y Porphyromonas gingivalis durante 10-16 horas a 37ºC en caldo tioglicolato suplementado con 0,5 mg/l de Vitamina K y 5 mg/l de hermina en una atmósfera anaeróbica generada con sobres GasPakPlus en jarras apropiadas. Cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de 0,1-0,2 correspondientes a densidades celulares de 10^{6}- 10^{7} cfu (unidades que forman colonias) por ml, se retiraron porciones de 100 \mul y las bacterias se precipitaron por centrifugación. Las bacterias se resuspendieron en 100 \mul de una mezcla preparada recientemente de suero humano y solución salina estéril, y las suspensiones que contenías 10^{5}-10^{6} células se transfirieron a tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se mezclaron con (i) 100 \mul de preparación de EMD (3 mg de EMD en 0,1 ml de PGA), ii) 100 \mul de vehículo PGA o iii) 100 \mul de la mezcla de suero/solución NaCl como control de crecimiento. Se tomaron fracciones de 10 \mul para los ensayos de crecimiento después de 0, 3, 6 y 24 horas. Las muestras se diluyeron en serie en solución estéril de NaCl al 0,9% y se colocaron 10 \mul de las etapas de dilución en placas de agar Schaedler. Las condiciones de cultivo fueron las mismas que para los precultivos. Las placas de agar se incubaron durante 3-4 días y se calcularon posteriormente las cfu y las densidades celulares (cfu/ml). Todos los experimentos se repitieron seis veces.

Resultados (dados como cfu/ml en porcentaje de la concentración en el instante 0) 1) Cultivos de control en diferentes instantes de tiempo

	0	3h	6h	24h
P. intermedia	100	160	25	10
P. gingivalis	100	100	125	150

2) Cultivos en presencia del vehículo PGA en diferentes instantes de tiempo

	0	3h	6h	24h
P. intermedia	100	140	25	10
P. gingivalis	100	75	50	5

3) Cultivos en presencia de EMD en diferentes instantes de tiempo

	0	3h	6h	24h
P. intermedia	100	40	0	0
P. gingivalis	100	30	0	0

Los cultivos se inhibieron de forma destacada en presencia de EMD en comparación con los controles sólo con vehículo o sin adición de EMD.

Ejemplo 6 Investigación del efecto mejorado de curación de heridas en tejidos blandos de EMDOGAIN® después de la cirugía oral

El propósito de este ejemplo es mostrar la influencia de los derivados de la matriz de esmalte y/o las proteínas de la matriz de esmalte en la curación mejorada de heridas en tejidos blandos después de la cirugía oral.

Se crearon defectos experimentales en el periodontio marginal de los dientes de más de 50 monos macacos retirando el cemento dental, la membrana periodontal y el hueso marginal alveolar a una distancia cervico-apical de aproximadamente 5 mm con un buril dental. Después se aplicó nada (control) o derivado de la matriz de esmalte (obtenido de EMDOGAIN® como el polvo liofilizado no reconstituido o como la composición reconstituida) a los defectos experimentales. La concentración de las proteínas en la composición reconstituida fue de aproximadamente 5-30 mg/ml y el volumen aplicado estaba en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 ml por defecto.

La curación de la herida se evaluó visualmente durante las siguientes 8 semanas. En los defectos en los que se aplico EMDOGAIN® se dio una buena curación (sin enrojecimiento ni inflamación) e insignificante formación de placa después de 2 semanas, cuando se quitaron las suturas, buena curación y poca gingivitis después de 5 semanas y curación sin complicaciones después de 9 semanas, cuando se terminaron los experimentos. En cambio, los defectos de control mostraron inflamaciones con retracciones y abundante placa después de 2 semanas, con graves retracciones y gingivitis después de 5 y 8 semanas.

Ejemplo 7 Investigación en el efecto de curación de heridas de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte después de la cirugía periodontal

El propósito de este ejemplo es mostrar la influencia de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte en la rápida curación en pacientes después de cirugía periodontal.

Se dividieron cincuenta y cinco (55) pacientes en necesidad de cirugía periodontal en dos grupos, uno con cirugía convencional con técnica modificada de colgajo de Widman (20 pacientes) y otro con el mismo procedimiento más la aplicación de EMDOGAIN® (35 pacientes) (se aplicó una concentración de 30 mg proteína/ml y aproximadamente 0,3 ml por diente). Ningún paciente recibió antibióticos en el momento de la cirugía pero todos se instruyeron para usar un lavado bucal aséptico (clorhexidina) diariamente.

Se realizó una encuesta activa de los pacientes en el momento de retirar las suturas (1-3 semanas después de la cirugía). Mientras que 3 (15%) de los pacientes de control tuvieron episodios post-quirúrgicos que requirieron antibióticos, sólo uno (3%) de los pacientes tratados con EMDOGAIN® necesitó tal tratamiento.

Ejemplo 8 Investigación en el efecto de curación de heridas de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte después de la extracción dental

El propósito de este ejemplo es mostrar la influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de esmalte en la curación de heridas después de extracciones del tercer molar. Los pacientes, de 30 años o más que requerían la retirada de los terceros molares simétricos impactados o semiimpactados mandibulares, se les extrajo un tercer molar por el método clásico que implica un levantar un colgajo vertical para realizar la osteoctomía y sección necesarias, mientras que el segundo se extrajo y el alveolo se rellenó con EMDOGAIN® antes de suturar. Todos los pacientes recibieron antibióticos (3 g Amoxicilina o 1 g de Eritromicina) 1-2 horas antes de la cirugía y se les dio Ibuprofeno (600 mg x 3) después de la cirugía. Después, se les ordenó aclararse con Clorhexidina (0-1%, 10 ml x 2) durante 4 semanas.

Las suturas se retiraron después de dos semanas. El paciente y el dentista evaluaron la curación del sitio de control y el tratado con EMDOGAIN®. En un centro, 9 pacientes tuvieron extracciones contralaterales con/sin EMDOGAIN®. Un paciente tuvo una ligera irritación de las suturas en ambos sitios, mientras que otro paciente tuvo un dolor severo en el sitio de control, pero ningún problema en el sitio tratado con EMDOGAIN®. En un segundo centro, tres pacientes de seis tenían dolores sólo en el sitio de control. Finalmente, en un tercer centro un paciente tuvo un episodio serio, alveolitis, que se diagnóstico en el sitio de control de un paciente. El sitio tratado con EMDOGAIN® curó sin problemas. Otro paciente tuvo una ligera irritación en las suturas en ambos sitios de extracción, pero sólo el sitio de control se inflamó y dolía y requirió repetidas irrigaciones con solución salina y toma de analgésicos.

Estos resultados clínicos indican que la aplicación de EMDOGAIN® en los alvéolos de extracción después de la extracción de muelas del juicio puede mejorar la curación y reducir las inflamaciones dolorosas, frecuentes de otra manera.

Ejemplo 9 Investigación del efecto de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte en la curación de alveolitis sicca

El propósito de este ejemplo es mostrar la influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de esmalte en la curación de la alveolitis sicca (alveoalgia).

Después de la retirada de una raíz relicta 35 infectada, un paciente hombre, de 70 años, sufría dolores agudos e inflamación en relación con el alveolo de la extracción. Cuando le examinó su dentista era evidente que había desarrollado una enfermedad de alveolitis sicca, en la cual en coágulo inicial se había desintegrado y la pared ósea del alveolo estaba necrótica. El hueso y los tejidos adyacentes estaban inflamados.

El paciente tenía un historial de insuficiencia cardiaca y se trató con el anticoagulante Marevan. Como resultado de su enfermedad tenia una circulación periférica reducida. El paciente también fumaba varios cigarrillos al día.

La alveolitis se trató de la forma tradicional con la retirada del hueso necrótico y la inducción de una nueva hemorragia. Además, se movilizó la encía y se aplicó una sutura para cerrar el alveolo. Después, el paciente se trató con penicilina (apocilina 660 mg, 2 comprimidos por la mañana y por la tarde durante 7 días) para combatir la infección y también se le dio instrucciones de aclararse la boca dos veces al día con una solución de clorhexidina. Después de cinco días, tras acabar el régimen antibiótico, el paciente apareció en la clínica dental quejándose todavía de dolores agudos. La inspección del área de la operación se realizó visualmente y por palpación y sondeo y mostró que la alveolitis persistía y que había presente más hueso necrótico. Los rayos X revelaron una destrucción del hueso y necrosis hasta la parte apical del alveolo. El área de la operación se limpió una vez más y la lesión ósea resultante se rellenó con EMDOGAIN® (30 mg/ml, se aplicó máx. 0,5 ml), y se realizó una nueva sutura en la encía para cerrar el alveolo. No se aplicó ningún tratamiento adicional, pero se mandó al paciente continuar con el aclarado con la solución de clorhexidina. Dos días después, al paciente informó a la clínica que el dolor y la inflamación habían desaparecido. El examen clínico y la retirada de la sutura una semana después del tratamiento con EMDOGAIN® reveló una buena curación sin signos de tejidos necróticos o inflamación y una encía intacta sin enrojecimiento o inflamación cubría el área de la herida. No se produjo hemorragia o dolor al sondear o palpar. No se observaba mal olor o sabor. El paciente no informó de ningún otro dolor u otros síntomas.

Ejemplo 10 Investigación del efecto profiláctico de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte en la curación de alveolitis sicca

El propósito de este ejemplo es mostrar el efecto profiláctico de los derivados de la matriz de esmalte y de las proteínas del esmalte en la alveolitis sicca.

Una paciente mujer de 82 años de edad sufrió una fractura longitudinal de la raíz del diente 44. Este diente era un pilar en un puente del diente 35 al 46, y había sufrido tratamiento endodóntico varios años antes. Clínicamente, la encía que rodeaba al diente estaba inflamada y había una bolsa en la encía hasta el ápice del diente en el lado lingual. Los rayos X mostraron una periodontitis grave local en el diente 44.

La paciente tenía una buena higiene oral, pero debido a una enfermedad cardiaca tratada con Marevan (anticoagulante), se provocaba fácilmente una hemorragia en las encías cuando se sondeaba. Seis meses antes, a la paciente se la había retirado quirúrgicamente el diente 35 debido a una periodontitis grave. Después de esa operación, padeció una enfermedad de larga duración de alveolitis sicca. La paciente estaba muy preocupada con que la retirada del diente 44 tuviese las mismas complicaciones postquirúrgicas que había sufrido entonces. Se le informó que la combinación de su avanzada edad, el tratamiento con Marevan, la raíz infectada y la bolsa en las encías aumentaba en gran medida el riesgo de complicaciones postoperatorias como alveolitis, pero que no había otra alternativa que retirar quirúrgicamente los fragmentos de raíz.

La paciente accedió a retirar el diente 44, y, como experimento, someterse a un tratamiento profiláctico con EMDOGAIN® para prevenir el desarrollo de alveolitis sicca. La paciente se anestesió con incisión y retirada del hueso bucal para permitir retirar los fragmentos de raíz sin aflojar el puente. Después de la retirada, el alveolo vacío se limpió mecánicamente y se rellenó con EMDOGAIN® (30 mg/ml, se aplicó max. 0,5 ml) y el colgajo se reposicionó con una sutura. Esa misma tarde la paciente informó (por teléfono) de una hemorragia prolongada en el área de la operación (el tratamiento con Marevan no se interrumpió antes de la operación) pero ningún otro síntoma. Cuando se retiró la sutura cinco días después de la cirugía, la herida en el tejido blando de la operación había curado completamente. El paciente no informó de ningún otro síntoma como dolor o inflamación después de la cirugía y en general estaba muy satisfecha con el tratamiento.

Ejemplo 11 Investigación del efecto de los derivados de la matriz de esmalte y las proteínas de la matriz de esmalte en la curación de complicaciones post-traumáticas

El propósito de este ejemplo es mostrar la influencia de las proteínas del esmalte/derivados de la matriz de esmalte en la curación de complicaciones post- traumáticas en un paciente.

Después de un accidente, a un paciente se le habían ligado los dientes frontales superiores en una clínica de emergencia. El dentista encontró los dientes 11 y 21 sin vida, los dientes 12 y 22 tenían fracturas mesio-incisivas de clase I o II. La encía marginal estaba gravemente inflamada y pobremente adherida a la superficie de los dientes. El paciente tenía dolores y se quejaba de entumecimiento, inflamación y mal sabor y olor. También había muestras de daño en el ligamento periodontal en las regiones apicales de los dientes 11 y 21. Los dos incisivos se limpiaron y se rellenó la raíz con Ca(OH)_{2} mezclada recientemente.

Después de 4 semanas, la curación de la herida todavía era insatisfactoria. La enfermedad había evolucionado a una inflamación crónica y los dientes se consideraban perdidos. El tratamiento convencional de este estado sería la extracción de los cuatro incisivos y la sustitución con un puente o unos implantes. Sin embargo, el paciente se oponía fuertemente a este tratamiento y como último esfuerzo por salvar los dientes, se realizó una cirugía de colgajo gingival en los cuatro dientes afectados (11, 12, 21, 22). Se usaron dos viales de EMDOGAIN® (60 mg en 3 ml). Como máximo se aplicaron 0,2 ml de EMDOGAIN ® (30 mg/ml) por diente con una jeringa antes de volver a suturar los colgajos con 7 puntos. Cuatros de las suturas se retiraron 5 días después de la cirugía. Había una mejora notable en el estado clínico y subjetivo. El paciente ya no se quejaba de dolor, la sensación de entumecimiento había desaparecido y no había mal olor o sabor en el área afectada. Después de 2 semanas se retiraron las suturas restantes. La encía no mostraba signos de inflamación y el paciente no tenía quejas. La encía estaba firme y no tenía signos de inflamación. Estaba firmemente acoplada al diente y/o al hueso alveolar, tenía un color rosa (no el rojo que se observa en las áreas inflamadas) y con una papila interdental normal (no inflamada). Además, se observó una mejora notable en la reaparición del ligamento periodontal en las partes afectadas de los dientes, y en las deposiciones de nuevo hueso alveolar según se observaba en el examen con rayos X.

Ejemplo 12 Curación de heridas traumáticas en dientes y nervios próximos Informe de caso

Una paciente mujer de 39 años sufría una pericoronitis grave alrededor de su muela del juicio inferior izquierda (38). En la clínica dental pública se le retiró parcialmente la muela, dejando la mitad apical de la muela en la mandíbula después de una fractura de raíz iatrogénica. Al dolerle, la paciente se remitió a un especialista en cirugía oral al siguiente día para la retirada quirúrgica del fragmento de muela.

Dos días después de la cirugía la paciente acudió a su dentista habitual para un control. Tenía el lado izquierdo inflamado y mostraba un bloqueo completo y persistente del nervio mandibular izquierdo. El examen clínico y las fotografías de rayos X mostraron que durante la cirugía se había ocasionado un daño grave por perforación en el hueso del mandíbula, al tercio apical de la raíz distal del diente 37 y al canal del nervio mandibular (ver rayos X, Fig. 1A), la profundidad de la bolsa sondeable en el diente 37 era de 25 mm de la parte superior de la corona del diente, lo que era pasado el ápice de la raíz distal.

En un esfuerzo para inducir la curación del hueso y del nervio y la regeneración del ligamento periodontal perdido en el diente 37, la herida de la operación se abrió y se limpió. Después del desbridamiento con solución salina el hueso expuesto, la superficie de la raíz distal del 37 y el nervio mandibular se cubrieron con EMDOGAIN® (30 mg/ml, aplicado en exceso; aprox. 1 ml) y la herida se cerró con tres suturas. Se le dieron instrucciones para aclararse la boca con una solución de clorhexidina (Corsodyl®) dos veces al día durante los cinco días siguientes y se inició un tratamiento profiláctico de cinco días con penicilina (Ampicilina, 660 mg x 4).

Después de diez días, la paciente volvió para el control y para retirar las suturas. En este punto, la inflamación había desaparecido y la curación del tejido blando era muy buena. Sin embargo, la anestesia completa del nervio mandibular persistía y se informo a la paciente de que el pronóstico de un nervio roto es, como mínimo, incierto. En este punto, la anestesia hacía imposible comprobar la viabilidad del diente 37. Normalmente un daño en la raíz como el presentado en este caso conduce a una necrosis de la pulpa y la anquilosis del diente. El tratamiento endodóntico está indicado para prevenir estas complicaciones. Sin embargo, para ver si el tratamiento experimental podría promover una curación del ligamento periodontal, la paciente accedió a dejar el diente sin tratar por el momento. Se establecieron citas para controles mensuales.

Dos meses después del control anterior la paciente tenía hiperestesia local en el labio izquierdo inferior, un signo de curación del nervio. El tejido blando en la región 37-38 estaba perfectamente curado y sin cicatrices. Los rayos X mostraron además la formación de hueso nuevo en el alveolo de extracción. El diente 37 y el tejido circundante todavía sufrían anestesia.

Cuatro meses después del tratamiento la anestesia había desaparecido y el diente 37 parecía normal, hipersensible, según ensayos de sensibilidad a la temperatura y electricidad. Los rayos X mostraron que el relleno de hueso en el alveolo de extracción era significativo y que había signos de regeneración periodontal en la raíz distal del diente 37.

Cinco meses después del tratamiento inicial con EMDOGAIN® la vitalidad del diente 37 parecía normal. En este momento, en los rayos X era evidente una regeneración completa del ligamento funcional periodontal (Fig. 1B) y el hueso alveolar formado de apariencia normal había rellenado los defectos en el hueso y en el alveolo de la extracción. No había signos de anquilosis. La profundidad de sondeo de la bolsa en el diente 37 era sólo de 100 mm lo que era aproximadamente 1 mm por debajo de la unión cemento-esmalte. Después de este control, la paciente se despachó como curada completamente y se le dio cita para controles ordinarios en intervalos de un año.

Comentarios

La curación completa y rápida de heridas traumáticas en dientes y nervios próximos después de la retirada quirúrgica de muelas del juicio es poco frecuente. Normalmente, complicaciones tan graves como las descritas anteriormente acaban con la retirada completa de la muela dañada, o, como mínimo, en la retirada endodóntica de la pulpa de la muela y del relleno de la raíz seguida de la curación del hueso con anquilosis. Un nervio roto normalmente tarda de 8 a 12 meses en curar, si se cura, y a menudo algunas regiones con parestesia persisten durante varios años. La curación rápida y de buena calidad que se ha descrito anteriormente es muy inusual y debe considerarse como una señal de la capacidad de curación de heridas de EMDOGAIN®.

Rayos X:

A: Paciente después de dos días de la retirada del diente 38. Apreciar el gran defecto distal en el diente 37 y la implicación del canal mandibular. El hueso alveolar distobucal del diente 37 también se retiró durante la cirugía.

B: Paciente cinco días después de la cirugía. Apreciar el signo del ligamento completo funcional periodontal (lamina dura) en el defecto en la parte distal de la raíz en el diente 37. No hay signos de anquilosis. Ahora se puede observar el contorno del canal mandibular y el alveolo de extracción está lleno completamente con hueso. Apreciar también el nuevo hueso alveolar distobucal en formación alrededor del diente 37.

Ejemplo 13 Investigación del efecto de los derivados de la matriz de esmalte en la curación de ulcus cruris (úlcera venosa)

Paciente 1

El paciente era un hombre, nacido en 1926 y tenía un historial de repetidas trombosis con un mal síndrome post-trombótico y úlceras venosas recurrentes. Se trató sistémicamente con derivados del anticoagulante coumarin, y las úlceras se trataron localmente con Crupodex (monómero de dextrano) BIOGAL y una solución al 3% de ácido bórico.

En el momento de la inicialización del tratamiento con EMDOGAIN® tenía una úlcera venosa con un forma ovalada y un tamaño de 5 x 4 cm y una profundidad de 0,5 mm que estaba en etapa de granulación con muy mala epitelización.

La herida se desinfecto con H_{2}O_{2} al 3%, y se aplicó gota a gota 500 \mul de EMDOGAIN® y se extendió uniformemente por medio de un palo estéril. El EMDOGAIN® se dejó durante 10 minutos al aire y después la herida se cubrió con un apósito Inadine (Johnson & Johnson) Rayon impregnado con una pomada de povidona yodo al 10%.

Después de 5 días, la epitelización en la parte proximal de la úlcera había tenido lugar y la úlcera se había reducido en 1,8 x 2,2 cm y no había reacción secundaria (inflamación). No se aplicó EMDOGAIN®. Después de 12 días había tenido lugar más epitelización en la parte proximal y epitelización nueva en la parte lateral en un área de aproximadamente 2 x 2 cm. Casi la mitad de la úlcera se había curado. Se aplicaron 400 \mul de EMDOGAIN®.

Después de 19 días, había tenido lugar más epitelización en la partes proximal y lateral de la úlcera, pero no en la parte distal en la que la úlcera era mas bien profunda (aproximadamente 1 mm). Más de la mitad de la úlcera se había curado. Se aplicaron 300 \mul de EMDOGAIN® el paciente no sentía dolor en la úlcera, al contrario que antes del inicio del tratamiento. Después, se aplicó EMDOGAIN® una vez a la semana hasta el día 40 (a 200 \mul) y la úlcera se consideró completamente curada después de 47 días.

Paciente 2

La paciente era mujer, nacida en 1949 y tenía varices, insuficiencia venosa crónica y úlceras venosas recurrentes. Tenía alergia polivalente hacia productos farmacéuticos (fármacos, medicamentos), así como eccema varicosum. Se había tratado previamente de forma local con gotas de Otosporina (sulfato de polimixina B + sulfato de neomicina + hidrocortisona) y una compresa de hidrocortisona.

En el momento del inicio del tratamiento con EMDOGAIN®, su úlcera venosa tenía un diámetro de 1 cm y una profundidad de 2mm. Se aplicaron 300 \mul de EMDOGAIN®.

Después de 5 días, la epitelización era de 2 mm alrededor de la herida (en una circunferencia) y no había reacción secundaria (inflamación). No se aplicó EMDOGAIN®. Después de 12 días el tamaño de la úlcera había disminuido a aproximadamente 2 mm en diámetro, se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.

Después de 19 días, la úlcera todavía era de aproximadamente 2 mm en diámetro, pero el fondo estaba bien granulado y la úlcera no era tan profunda (aproximadamente 0,2 mm). Se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.

La misma paciente tenía otra úlcera en otra pierna de aproximadamente 0,3 x 1 cm . Se aplicaron 200 \mul de EMDOGAIN®.

Después de 7 días, había presente nueva epitelización y una buena granulación en el fondo y el tamaño había disminuido a aproximadamente 0,2 x 0,5 cm.

Después, se aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN® a cada úlcera una vez a la semana hasta el día 40, y las úlceras se consideraron completamente curadas después de 47 días. No se observaron reacciones alérgicas a EMDOGAIN®.

En la misma úlcera se había formado otra úlcera con un tamaño de aproximadamente 0,5 x 0,3 cm a la cual se le aplicaron 100 \mul de EMDOGAIN®.

Paciente 3

La paciente era mujer, nacida en 1929 y tenía trombosis venosa profunda después de erisipelas, y en el momento de inicio del tratamiento con EMDOGAIN® tenía una ulcus cruris muy grande con un tamaño de aproximadamente 15 x 19 cm en el estado de progresión en el que la úlcera se consideraba un caso perdido después de diversos tratamientos,. Se aplicaron 700 \mul de EMDOGAIN® en un área de aproximadamente 3 cm en el borde superior.

Después de 7 días, no había epitelización, pero el área tratada era más transparente (más estructurada) con pequeñas áreas dispersas de granulación y no había dolor en esta área ni signos de progresión. Se añadieron 700 \mul de EMDOGAIN® en el mismo área.

Después de 4 semanas, la paciente desarrolló una infección, que se cree que fue causada por Pseudomonas, en la parte distal de la úlcera no tratada con EMDOGAIN®. Se aplicaron 700 \mul de EMDOGAIN®. La infección había desaparecido después de 7 días.

Paciente 4

La paciente era mujer, nacida en 1947 y tenía varices con tromboflebitis superficial después de erisipelas, y en el momento del inicio del tratamiento con EMDOGAIN® tenía una ulcus cruris con un tamaño de aproximadamente 2 x 0,8 cm con un fondo limpio pero sin granulación. Se aplicaron 300 \mul de EMDOGAIN®.

Después de 7 días, el tamaño de la úlcera había disminuido a aproximadamente 0,7 x 0,3 cm y había epitelización presente alrededor y granulación en el fondo. Se aplicaron 200 \mul de EMDOGAIN®, seguido de 100 \mul de EMDOGAIN® una vez a la semana durante cinco semanas. La úlcera se consideró completamente curada después de cinco semanas.

Ejemplo 14 EMDOGAIN® como un adjunto a tratamiento periodontal no quirúrgico en lugares de superficie plana Objetivo

El objetivo de la investigación era evaluar se la aplicación de EMDOGAIN® podía mejorar el resultado de curación del tratamiento periodontal no quirúrgico. El objetivo específico de este estudio fue evaluar el efecto en lugares de superficie plana.

Diseño del estudio

El estudio se realizó como un ensayo intra-individual longitudinal de 6 meses de duración. El estudio tiene un diseño doble ciego, de boca partida, controlado con placebo y aleatorio.

Sujetos

14 pacientes remitidos a la Clínica de Periodóntica, Departamento de Periodontología, Universidad de Göteborg, para el tratamiento de una enfermedad periodontal moderadamente avanzada.

Criterios de admisión

Al menos 3 superficies planas en dientes en cada uno de 2 cuadrantes contralaterales con una profundidad de sondeo de la bolsa = 5 mm, y al menos un par de sitios con una profundidad de sondeo = 6 mm.

Los dientes seleccionados deben tener una pulpa vital determinada por estimulación termal o eléctrica o, si se someten a tratamiento del canal de la raíz, ser asintomático y sin observaciones técnicas.

Tratamiento

Después de un examen basal, a todos los pacientes se les da una presentación del caso e instrucciones para tomar medidas de control de la placa supragingival adecuadas. Se realiza una escala y planificación de la raíz.

Cuando la hemorragia de las bolsas se interrumpe, se aplica gel de EDTA al 24% (obtenido de Biora AB, Suecia) en las bolsas durante 2 minutos. Después, las bolsas se irrigan cuidadosamente con solución salina seguido de la aplicación de la sustancia del ensayo (EMDOGAIN®) o de control (gel PGA).

Evaluaciones

El examen inicial, y los exámenes de control en la semana 1, 2, 3, 8 y 24 incluyó las siguiente variables:

1. Estado de la higiene oral - presencia / ausencia de placa

2. Estado de las encías (Índice Gingival; Löe 1967)

3. Profundidad de sondeo de la bolsa

4. Nivel de sondeo del acoplamiento

5. Hemorragias en el sondeo - presencia / ausencia

6. Hipersensibilidad de la dentina después de estímulo con cañón de aire (si/no)

7. Grado de malestar - registrado en los exámenes en las semanas 1, 2 y 3 usando una Escala Visual Análoga (VAS) de 10 cm.

2

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Conclusión

Los pacientes tenían menos problemas postoperativos, menos hemorragias, menos placa y un mejor índice gingival. Estos resultados apoyan el efecto de curación de heridas de EMDOGAIN®.

Ejemplo 15 Estudio piloto de curación de heridas en cerdos Introducción Objetivo

El objetivo de este estudio piloto es evaluar el proceso de curación de heridas de espesor dividido en cerdos, y evaluar el efecto de EMD en estas heridas.

Razón para la elección de la especie animal

Se selecciona el cerdo como modelo para el ensayo porque esta especie ha demostrado ser un buen modelo para la evaluación de la curación de heridas en seres humanos.

Materiales y métodos Animales

El experimento se realizará en 4 cerdos hembras SPF (cruce de Danish country, Yorkshire y Duroc). Al comienzo del periodo de climatización el peso corporal de los animales será de aproximadamente 35 kg.

Se permitirá un periodo de climatización de una semana durante el cual los animales se observarán a diario para rechazar un animal que presenta un mal estado. Se registrarán todas las observaciones.

Alojamiento

El estudio tendrá lugar en un cuarto para animales al que se le proporciona aire filtrado a una temperatura de 21ºC\pm3ºC, una humedad relativa de 55%\pm15% y cambios de aire 10 veces/hora. El cuarto se iluminará para dar un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Habrá luz de 06 a 18 h.

Los animales se alojarán individualmente en corrales.

Lecho

El lecho será serrín de coníferas "LIGNOCHEL H ¾ " de Hahn & Co, D-24796 Bredenbek-Kronsburg. Se realizan análisis regulares para detectar posibles contaminantes relevantes.

Alimentación

Se ofrecerá un pienso para cerdos disponible en el mercado "Altromin 9033" de Chr. Petersen A/S DK-4100 Ringsted (aproximadamente 800 g dos veces al día). Se realizan análisis regulares de los principales componentes nutricionales y de posibles contaminantes relevantes.

Agua Potable

Se ofrece agua potable de calidad doméstica a los animales dos veces al día. Se realizan análisis regulares para detectar posibles contaminantes relevantes.

Heridas

Las heridas se realizan el día 1. Los animales se anestesian con Stresnil® Vet. Janssen, Bélgica (40 mg azaperona/ml, 1 ml/10 kg) y Atropin DAK, Dinamarca (1 mg atropin/ml, 0,5 ml/10 kg), administrados como una única inyección intramuscular seguida de una inyección i.v. de Hypnodil® Janssen, Bélgica (50 mg metomidate/ml, aproximadamente 2 ml).

Se afeitará un área dorso-lateral en uno de los lados de la espalda del animal, se lavar con jabón y agua, se desinfecta con etanol al 70% que se aclara con solución salina estéril, y finalmente se seca con una gasa estéril.

Se realizan ocho heridas de espesor dividido (25 x 25 x 0,4 mm) en el área preparada, 4 a cada lado de la columna vertebral, usando un ACCU-Dermatom (GA 630, Aesculap®). Las heridas se numera del 1 (más craneal) a 4 (más caudal) en el lado izquierdo del animal y de 5 (más craneal) a 8 (más caudal) en la lado derecho del animal.

La sangre coagulada se retira con una gasa estéril.

Justo antes de la cirugía, aproximadamente 8 horas después de la cirugía y cuando sea necesario a partir de entonces, se administra a los animales una inyección intramuscular de Anorfin®, A/S GEA, Dinamarca (0,3 mg buprenorfina/ml, 0,04 ml/kg).

Dosificación

Después de la realización de las heridas, las heridas se tratan como se indica a continuación

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Aproximadamente 15 minutos antes de la dosificación, se prepara la formulación de EMD de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante. La formulación de EMD se usará antes de 2 horas después de la preparación. Para las heridas de tratamiento B. La EMD se aplica como una fina capa en la superficie de la herida. Un vial de EMD se usará para 4 heridas.

Apósitos en las heridas

Las heridas se cubren con Tedagerm®. Los apósitos estarán cubiertos con un vendaje de gasa fijado con Fixomul®. Los apósitos, la gasa y el Fixomul® se sujetarán con una redecilla. Bend-a-rete® (Tesval, Italia). Los apósitos se observarán a diario.

Los apósitos se cambiarán el día 2 (todos los animales) y el 3 (animales Nº 3 y 4).

Antes de cada cambio, los animales se anestesian con una inyección intramuscular en el cuello (1,0 ml /10 kg peso corporal) de una mezcla de Zoletil 50® Vet., Virbac, Francia (125 mg tiletamina y 125 mg zolazepan en 5 ml de disolvente, 5 ml) Rompun® Vet. Bayer, Alemania (20 mg zilazina/ml, 6,5 ml) y Methadon®DAK, Nycomed DAK, Dinamarca 10 mg metadona/ml, 2,5 ml).

Observación de heridas

Cada herida se observará y fotografiará el día 2 (todos los animales), 3 (todos los animales) y 4 (animales Nº 3 y 4). Se evaluará el grado de exudación e inflamación. Se describirá en detalle la aparición de epidermis injertada.

Signos clínicos

Se registran diariamente todos los signos visibles de mala salud y cualquier cambio en el comportamiento. Se registrará cualquier desviación de lo normal con respecto al momento de aparición, duración e intensidad.

Peso corporal

Los animales se pesan a la llegada, el día de la realización de heridas y al final del estudio.

Observaciones terminales

El día 3 (aproximadamente 56 horas después de la realización de las heridas) los animales Nº 1 y 2 se sacrifican con un corte en la vena y arteria subclavia después de aturdir con una pistola eléctrica.

El día 4 (aproximadamente 72 horas después de la realización de las heridas) los animales Nº 3 y 4 se sacrifican con un corte en la vena y arteria subclavia después de aturdir con una pistola eléctrica.

Muestras de tejidos

Se corta cada herida como un bloque separado del tejido muscular esquelético. Si existe adherencia al músculo esquelético subyacente, se incluye parte del músculo en el material como fijación. Cada bloque se fija en una solución tampón fosfatada neutral con formaldehído al 4%.

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Preparación histológica

Después de la fijación, cuatro muestras representativas de todas las heridas se introducen en parafina, se cortan con un espesor nominal de 5 \mum y se marcan con haematoxilina y eosina. Después del tinte, los portaobjetos se observan en un microscopio usando una cuadrícula. Esto permite medir la longitud total de la herida y la longitud de la superficie epitelizada. Esta relación se expresará como el porcentaje de la herida cubierta por células epiteliales por slide. Se tomarán los valores medios de cada herida, después de lo cual se calculan los valores medios de grupo.

Estadísticas

Se procesarán los datos para dar los valores medios de grupo y las desviaciones estándar cuando sea apropiado. También se identifican los posibles valores anormales. Después, se comprueba la homogeneidad de cada variable continua con la prueba de Bartlett. Si la varianza es homogénea, se realiza un análisis de varianza para la variable. Si se detecta cualquier diferencia significativa, se evalúan las posibles diferencias entre grupos con la prueba de Dunnett. Si la varianza es heterogénea se comprueba la normalidad de cada variable con el método de Shapiro-Wilk. En caso de distribución normal, se identificarán las posibles diferencias entre grupos con la prueba de la t de Student. En otro caso, las posibles diferencias entre grupos se evalúan con la prueba de Kruskal-Wallis. Si se detecta cualquier diferencia entre grupo significativa, la posterior identificación de los grupos se realiza con la prueba de Wilcoxin Suma-Rango.

Los análisis estadísticos se realizarán con procedimientos SAS® (versión 6.12) descritos en "SAS/STAT® User's Guide, Version 6, Fourth Edition, Vol. 1+2", 1989, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina 27513, USA.

Claims

1. El uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una infección.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la infección está causada por un microorganismo.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la prevención de o tratamiento del crecimiento bacteriano en una superficie de una mucosa.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la prevención de o tratamiento del crecimiento bacteriano en una uña o en la superficie de un diente.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que la infección está presente en la cavidad oral.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad bacteriana en la cavidad oral.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el que la infección está causada por una bacteria que causa caries, por ejemplo Streptococcus mutans; bacterias que causan una enfermedad periodontal por ejemplo Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivales, Prevotella intermedia, Peptostreptococccus micros, Campylobacter (Fusobacteri, Staphylococci), B. forsythus; bacterias que causan alveolitis etc., por ejemplo Staphylococcus, Actinomyces y Bacillus; y bacterias que causan lesiones periapicales, por ejemplo Spirochetes.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la bacteria está presente en la piel.

9. El uso de una preparación de una sustancia de esmalte activa para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad inflamatoria está presente en la cavidad oral.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad inflamatoria está presente en un lugar donante de hueso.