ES2197191T3 - Proteina de fusion hematopoyetica variante de il-3. - Google Patents
Proteina de fusion hematopoyetica variante de il-3.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE FUSION COMPUESTAS DE PROTEINAS (MUTEINAS) VARIANTES O MUTANTES DE INTERLEUCINA-3 (HIL-3) HUMANA FUNCIONALMENTE UNIDAS A UNA SEGUNDA COLONIA DE FACTOR ESTIMULANTE (CSF), CITOQUINA, LINFOQUINA, INTERLEUCINA O LA VARIANTE IL-3. ESTAS VARIANTES HIL-3 CONTIENEN SUSTITUCIONES DE AMINOACIDOS Y PUEDEN TENER TAMBIEN SUPRESIONES DE AMINOACIDOS EN AMBOS TERMINALES, EL N- Y EL C-. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LAS MOLECULAS DE FUSION Y LOS METODOS PARA USARLAS.
Description
Proteína de fusión hematopoyética variante de
IL-3.
La presente invención se refiere a una proteína
de fusión que consta de una variante de
interleuquina-3 humana definida del polipéptido de
la fórmula mostrada en la fig 1; un factor seleccionado entre el
grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una
citoquina, una linfoquina, una interleuquina y un factor de
crecimiento hematopoyético; y opcionalmente un engarce entre las
dos secuencias.
Los factores estimuladores de colonias (CSF), que
estimulan la diferenciación y/o proliferación de células de médula
ósea, han generado mucho interés debido a su potencial terapéutico
para restaurar los niveles reducidos de células derivadas de células
madre hematopoyéticas. Se han identificado CSF tanto en sistemas
humanos como en sistemas murinos y se han distinguido de acuerdo con
sus actividades. Por ejemplo, el CSF de granulocitos
(G-CSF) y el CSF de macrófagos
(M-CSF) estimulan la formación in vitro de
colonias de granulocitos neutrófilos y de macrófagos,
respectivamente, mientras que el GM-CSF y la
interleuquina-3 (IL-3) tienen
actividades más amplias y estimulan la formación de colonias tanto
de macrófagos como de granulocitos neutrófilos y eosinófilos. La
IL-3 también estimula la formación de colonias de
mastocitos, de megacariocitos y de eritroides puras y mixtas (cuando
se añade eritropoyetina en combinación).
Debido a su capacidad de estimular la
proliferación de varios tipos celulares diferentes y de soportar el
crecimiento y la proliferación de células progenitoras, la
IL-3 tiene capacidad de uso terapéutico en la
restauración de cantidades normales de células hematopoyéticas en
los casos en los que el número de células se ha reducido debido a
enfermedades o a tratamientos terapéuticos tales como radiación y
quimioterapia.
La interleuquina-3
(IL-3) es un factor de crecimiento hematopoyético
que tiene la propiedad de poder promover la supervivencia, el
crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas.
Entre las propiedades biológicas de la IL-3 se
encuentra la capacidad (a) de soportar el crecimiento y la
diferenciación de células progenitoras implicadas en todos o en
prácticamente todos los linajes de células sanguíneas; (b)
interaccionar con células madre multipotenciales tempranas; (c)
mantener el crecimiento de células precursoras pluripotentes; (d)
estimular la proliferación de células de leucemia mielógena crónica
(CML); (e) estimular la proliferación de mastocitos, eosinófilos y
basófilos; (f) estimular la síntesis de ADN por células de leucemia
mielógena aguda humana (AML); (g) inducir a las células para la
producción de leucotrienos e histaminas; (h) inducir la quimiotaxis
de leucocitos; e (i) inducir las moléculas de la superficie celular
necesarias para la adhesión de leucocitos.
La interleuquina-3 humana madura
(hIL-3) consta de 133 aminoácidos. Tiene un puente
disulfuro y dos sitios de glicosilación potenciales (Yang, et al.,
CELL 47: 3 (1986)).
La IL-3 murina
(mIL-3) se identificó primero por Ihle, et al., J.
IMMUNOL. 126:2184 (1981) como un factor que inducía la
expresión de una enzima asociada a las células T, la
20-hidroxiesteroide deshidrogenasa. El factor se
purificó hasta la homogeneidad y demostró que regulaba el
crecimiento y la diferenciación de numerosas subclases de células
progenitoras hematopoyéticas y linfoides tempranas.
En 1984, se aislaron clones de ADNc que
codificaban para la IL-3 murina (Fung, et al.,
NATURE 307:233 (1984) y Yokota, et al., PROC. NATL. ACAD.
SCI. ESTADOS UNIDOS 81:1070 (1984)). La secuencia de ADN
murina codificaba para un polipéptido de 166 aminoácidos que
incluía un supuesto péptido señal.
La secuencia de IL-3 de gibón se
obtuvo usando una biblioteca de expresión de ADNc de gibón. La
secuencia de IL-3 de gibón después se usó como una
sonda contra una biblioteca genómica humana para obtener una
secuencia de IL-3 humana.
Yang, et al., CELL 47:3 (1986)
descubrieron homólogos de ADN genómico de gibón y de ser humano de
la secuencia de la IL-3 murina. La secuencia humana
presentada por Yang, et al. incluía un resto de serina en la
posición 8 de la secuencia de la proteína madura. Después de este
hallazgo, otros autores informaron sobre el aislamiento de ADNc
Pro^{8} hIL-3 que tenían prolina en la posición 8
de la secuencia proteica. De esta forma, parece ser que puede haber
dos formas alélicas de hIL-3.
Dorssers, et al., GENE 55:115 (1987),
encontraron un clon procedente de una biblioteca de ADNc humana que
hibridaba con mIL-3. Esta hibridación fue el
resultado del alto grado de homología entre regiones no
codificantes 3' de mIL-3 y hIL-3.
Este ADNc codificaba para una secuencia de hIL-3
(Pro^{8}).
Los documentos U.S. 4.877.729 y U.S. 4.959.455
describen ADNc de IL-3 humana y de
IL-3 de gibón y las secuencias proteicas para las
que codifican. La hIL-3 descrita tiene serina en
lugar de prolina en la posición 8 en la secuencia proteica.
Clark-Lewis, et al., SCIENCE
231:134 (1986) realizaron un análisis funcional de análogos
de IL-3 murina sintetizados con un sintetizador de
péptidos automático. Los autores concluyeron que se requería la
estructura terciaria estable de la molécula completa para conseguir
una actividad completa. Un estudio sobre el papel de los enlaces
disulfuro demostró que el reemplazo de las cuatro cisteínas por
alanina proporcionaba una molécula con 1/500 de actividad con
respecto a la molécula nativa. El reemplazo de dos de los cuatro
restos de Cys por Ala (Cys^{79}, Cys^{140} \rightarrow
Ala^{79}, Ala^{140}) aumentó la actividad. Los autores
concluyeron que en la IL-3 murina se requiere un
solo enlace disulfuro entre las cisteínas 17 y 80 para conseguir
una actividad biológica que se aproxime a los niveles fisiológicos y
que esta estructura probablemente estabiliza la estructura
terciaria de la proteína para proporcionar una conformación que sea
óptima para la función. (Clark-Lewis, et al., PROC.
NATL. ACAD. SCI. ESTADOS UNIDOS 85:7897 (1988)).
La solicitud de patente internacional (PCT) WO
88/00598 describe IL-3 de tipo de gibón y humano.
La hIL-3 contiene un reemplazo de Ser^{8}
\rightarrow Pro^{8}. Se sugiere reemplazar Cys por Ser,
rompiendo de esta manera el puente disulfuro, y reemplazar uno o más
aminoácidos en los sitios de glicosilación.
El documento
EP-A-0275598 (WO 88/04691) ilustra
que puede delecionarse la Ala^{1} mientras que se retiene la
actividad biológica. Se proporcionan algunas secuencias de
hIL-3 mutantes, por ejemplo, dos mutantes dobles,
Ala^{1} \rightarrow Asp^{1}, Trp^{13} \rightarrow
Arg^{13} (pGB/IL-302) y Ala^{1} \rightarrow
Asp^{1}, Met^{3} \rightarrow Thr^{3}
(pGB/IL-304) y un mutante triple Ala^{1}
\rightarrow Asp^{1}, Leu^{9} \rightarrow Pro^{9} ,
Trp^{13} \rightarrow Arg^{13}
(pGB/IL-303).
El documento WO 88/05469 describe cómo pueden
obtenerse mutantes de desglicosilación y sugiere que los mutantes
de Arg^{54}Arg^{55} y Arg^{108}Arg^{109}Lys^{110} podrían
evitar la proteolisis tras la expresión Saccharomyces
cerevisiae por la proteasa KEX2. No se describen proteínas
mutadas. La glicosilación y la actividad de la proteasa KEX2 sólo
son importantes, en este contexto, tras la expresión en
levaduras.
El documento WO 88/06161 menciona diversos
mutantes que teóricamente pueden ser conformacional y
antigénicamente neutros. Las únicas mutaciones realizadas realmente
son Met^{2} \rightarrow Ile^{2} e Ile^{131} \rightarrow
Leu^{131}. No se describe si se obtuvieron las neutralidades
contempladas para estas dos mutaciones.
El documento WO 91/00350 describe proteínas
análogas de hIL-3 no glicosiladas, por ejemplo,
hIL-3
(Pro^{8}Asp^{15}
\breakAsp^{70}), Met^{3} rhul-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}); Thr^{4} rhuL-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}) y Thr^{6} rhuIL-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}). Se dice que estas composiciones de proteína no presentan ciertos efectos secundarios adversos asociados con la hIL-3 nativa tales como la urticaria resultante de la infiltración de mastocitos y linfocitos en la dermis. Las proteínas de hIL-3 análogas descritas pueden tener en el extremo N Met^{3}, Thr^{4} o Thr^{6}.
El documento WO 90/12874 describe variantes con
cisteína añadida (CAV) de IL-3 que tienen al menos
un resto aminoacídico natural substituido por un resto de Cys.
El documento U.S. 4.810.643 describe la secuencia
de ADN que codifica el G-CSF humano.
El documento WO 91/02754 describe una proteína de
fusión compuesta por GM-CSF e IL-3
que tiene mayor actividad biológica que el GM-CSF o
la IL-3 solos. También se describen proteínas
análogas de IL-3 y de GM-CSF no
glicosiladas como componentes de la fusión.
El documento WO 92/04455 describe proteínas de
fusión compuestas de IL-3 fusionadas a una
linfoquina seleccionada entre el grupo compuesto por
IL-3, IL-6, IL-7,
IL-9, IL-11, EPO y
G-CSF.
El documento WO 92/06116 describe proteínas de
fusión tales como IL-3/G-CSF,
IL-3/Epo o Epo/IL-3, con lo que la
proteína de fusión comprende la secuencia entera de
IL-3 humana o con lo que la parte de
IL-3 puede comprender una secuencia de 79
aminoácidos derivada de la IL-3 humana.
La presente invención comprende una proteína de
fusión que consta de
- a)
- una variante interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a. 1-133), donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:
- la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;
- la posición 45 es Val, Met o Asn;
- la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;
- la posición 50 es Asp;
- la posición 51 es Pro o Thr;
- la posición 62 es Pro;
- la posición 76 es Pro;
- la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;
- la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;
- la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;
- la posición 100 es Arg;
- la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;
- la posición 105 es Pro;
- la posición 108 es Ala o Ser;
- la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;
- la posición 121 es Ile;
- la posición 122 es Ile;
- la posición 123 es Met o Glu; y
donde de 1 a 14 aminoácidos pueden delecionarse
opcionalmente del extremo N y/o de 1 a 15 aminoácidos pueden
delecionarse opcionalmente del extremo C de dicho polipéptido
mutante de interleuquina-3 humana.
- b)
- un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético;
opcionalmente un engarce entre las secuencias de
a) y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o
Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína
de fusión.
Estas muteínas de hIL-3 contienen
substituciones de aminoácidos y también pueden tener deleciones de
aminoácidos en uno o en los dos extremos N y C terminales. De esta
manera, esta invención incluye factores estimuladores de colonias
de función mixta formados a partir de polipéptidos unidos
covalentemente, pudiendo actuar cada uno de ellos a través de un
receptor celular diferente y específico para iniciar actividades
biológicas complementarias.
La presente invención comprende una proteína de
fusión que consta de
- a)
- una variante de interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a. 1-133) donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:
- la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;
- la posición 45 es Val, Met o Asn;
- la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;
- la posición 50 es Asp;
- la posición 51 es Pro o Thr;
- la posición 62 es Pro;
- la posición 76 es Pro;
- la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;
- la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;
- la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;
- la posición 100 es Arg;
- la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;
- la posición 105 es Pro;
- la posición 108 es Ala o Ser;
- la posición 116 es Val, Trp, ala, His, Phe o Tyr;
- la posición 121 es Ile;
- la posición 122 es Ile;
- la posición 123 es Met o Glu; y
donde de 1 a 14 aminoácidos pueden delecionarse
opcionalmente del extremo N y/o de 1 a 15 aminoácidos pueden
delecionarse opcionalmente del extremo C de dicho polipéptido
mutante de interleuquina-3 humana.
- b)
- un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético;
opcionalmente un engarce entre las secuencias de
a) y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o
Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína
de fusión.
En otra realización, dicha proteína de fusión de
la invención es una proteína de fusión en la que en dicho
polipéptido variante de interleuquina-3 humana, se
delecionan de 1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14)
y/o se delecionan de 1 a 15 aminoácidos del extremo C (posiciones
119 a 133) de dicho polipéptido variante de
interleuquina-3 humana.
En una realización adicional, dicha proteína de
fusión es una proteína de fusión donde en dicho polipéptido
variante de interleuquina-3 humana se delecionan de
1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se
delecionan de 1 a 8 aminoácidos del extremo C (posiciones 126 a
133) de dicho polipéptido variante de
interleuquina-3 humana.
Preferiblemente, dicho factor de la proteína de
fusión de la invención se selecciona entre el grupo compuesto por:
GM-CSF, CSF-1,
G-CSF, G-CSF (Ser^{17}),
Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina
(EPO), IL-1, IL-4,
IL-2, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-13, LIF, ligando flt3/flk2, hormona de
crecimiento humana, factor de crecimiento de células B, factor de
diferenciación de células B, factor de diferenciación de
eosinófilos y factor de células madre (SCF).
En una realización preferida, dicho factor se
selecciona entre el grupo compuesto por: G-CSF,
GM-CSF y G-CSF (Ser^{17}).
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión detallada
anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además una
molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión
detallada anteriormente.
La presente invención proporciona además un
método para producir una proteína de fusión, que comprende:
cultivar en un medio de crecimiento una célula hospedadora
transformada con un vector de expresión que comprende una molécula
de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión anterior de
una manera que permita la expresión de dicha proteína de fusión, y
recuperar dicha proteína de fusión.
La presente invención también se refiere al uso
de la proteína de fusión detallada anteriormente para uso en el
tratamiento de situaciones en las que se desea un aumento de la
producción de células hematopoyéticas.
Además, la presente invención se refiere al uso
de la proteína de fusión detallada anteriormente para preparar un
medicamento para el tratamiento de situaciones en las que se desea
un aumento de la producción de células hematopoyéticas.
Además, la presente invención se refiere a
vectores de expresión recombinantes que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican las moléculas de fusión de
hIL-3, sistemas de expresión microbianos
relacionados y procesos para fabricar las moléculas de fusión usando
los sistemas de expresión microbianos.
Estas moléculas de fusión pueden caracterizarse
por tener la actividad habitual de los dos péptidos que forman la
molécula de fusión o pueden caracterizarse adicionalmente por tener
una actividad biológica o fisiológica mayor que simplemente la
función aditiva de la presencia de IL-3 o el
segundo factor estimulador de colonias solo. La molécula de fusión
también puede proporcionar de forma inesperada un mayor efecto
sobre la actividad o una actividad diferente de la esperada por la
presencia de IL-3 o el segundo factor estimulador de
colonias o variante de IL-3. La molécula de fusión
también puede tener un mejor perfil de actividad que puede incluir
la reducción de actividades biológicas indeseables asociadas con la
hIL-3 nativa.
La presente invención también se refiere a
mutantes de hIL-3 como se han definido
anteriormente en los que se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos
del extremo N y/o se han delecionado de 1 a 15 aminoácidos del
extremo C, que contienen de 1 a 3 substituciones de aminoácidos, a
los que se ha fusionado un segundo factor estimulador de colonias o
variante de IL-3. Las moléculas de fusión
preferidas de la presente invención se componen de variantes de
hIL-3 en las que se han delecionado los aminoácidos
1 a 14 del extremo N, y se han delecionado los aminoácidos 126 a 133
del extremo C, fusionadas a un segundo factor estimulador de
colonias o variante de IL-3.
La presente invención también proporciona
moléculas de fusión que pueden funcionar como antagonistas de
IL-3 o como fragmentos antigénicos discretos para la
producción de anticuerpos útiles en protocolos de inmunoensayo e
inmunoterapia. Los antagonistas de hIL-3 serían
particularmente útiles en el bloqueo del crecimiento de ciertas
células cancerosas tales como AML, CML y ciertos tipos de cánceres
linfoides B. Otras situaciones en las que los antagonistas serían
útiles incluyen aquellas en las que ciertas células sanguíneas se
producen en números anormalmente altos o se están activando por
ligandos endógenos. Los antagonistas competirían eficazmente por los
ligandos, presumiblemente hemopoyetinas naturales incluyendo, y sin
limitación, IL-3, GM-CSF e
IL-5, que podrían inducir o aumentar el crecimiento
de las células cancerígenas en virtud de su capacidad de unirse al
complejo del receptor de IL-3 mientras se reducen
las propiedades de activación intrínsecas del ligando. La
IL-3, el GM-CSF y/o la
IL-5 también intervienen en ciertas respuestas
asmáticas. Un antagonista del receptor de IL-3 puede
tener la utilidad en esta enfermedad bloqueando la activación
mediada por receptores y el reclutamiento de células
inflamatorias.
Además del uso de las moléculas de fusión de la
presente invención in vivo, se prevé que los usos in
vitro incluirían la capacidad de estimular la médula ósea y la
activación y el crecimiento de células sanguíneas antes de la
infusión en pacientes.
La figura 1 es el gen de la IL-3
humana para la expresión en E. Coli (pMON5873), que codifica
la secuencia polipeptídica de la IL-3 humana natural
(de tipo silvestre) [Sec ID Nº:128], más una metionina iniciadora,
como se expresa en E. Coli, con los aminoácidos numerados
desde el extremo N de la hIL-3 natural.
La presente invención incluye una proteína de
fusión que consta de una variante de
interleuquina-3 humana (hIL-3) del
polipéptido mostrado en la fig. 1 como se ha definido
anteriormente, un factor seleccionado entre el grupo compuesto por
un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina,
una interleuquina y un factor de crecimiento hematopoyético y un
engarce entre las secuencias de a) y b), donde opcionalmente Met-,
Ala- o Met-Ala- precede al primer aminoácido de la
proteína de fusión. De esta manera, esta invención incluye factores
estimuladores de colonias de función mixta formados a partir de
polipéptidos unidos covalentemente, pudiendo actuar cada uno de
ellos a través de un receptor celular diferente y específico para
iniciar actividades biológicas complementarias. La hematopoyesis
requiere una serie compleja de acontecimientos celulares en los que
las células madre generan continuamente grandes poblaciones de
células en proceso de maduración de todos los linajes principales.
Actualmente hay al menos 20 reguladores conocidos con actividad
proliferativa hematopoyética. La mayoría de estos reguladores
proliferativos pueden estimular uno u otro tipo de formación de
colonias in vitro, siendo bastante característico el patrón
preciso de formación de colonias estimulada por cada regulador. Dos
reguladores no estimulan exactamente el mismo patrón de formación de
colonias, según se evalúa por los números de colonias o, lo que es
más importante, por el patrón de linajes y de maduración de las
células que constituyen las colonias en desarrollo. Las respuestas
proliferativas pueden analizarse más fácilmente en sistemas de
cultivo in vitro simplificados. Pueden distinguirse tres
parámetros bastante diferentes: la alteración del tamaño de las
colonias, la alteración del número de colonias y el linaje. Dos o
más factores pueden actuar sobre la célula progenitora, induciendo
la formación de un número mayor de células hijas y aumentando de
esta manera el tamaño de las colonias. Dos o más factores pueden
permitir la proliferación de un mayor número de células
progenitoras, porque existen subseries distintas de células
progenitoras que responden exclusivamente a un factor o porque
algunos progenitores requieren la estimulación por dos o más
factores antes de poder responder. Es probable que la activación de
receptores adicionales en una célula por el uso de dos o más
factores aumente la señal mitótica debido a la coalescencia de rutas
de señales inicialmente diferentes en una ruta final común que
alcanza el núcleo (Metcalf, 1989). Otros mecanismos podrían
explicar la sinergia. Por ejemplo, si una ruta de señalización está
limitada por una activación intermedia de una ruta de señalización
adicional por un segundo factor, se puede obtener una respuesta
superaditiva. En algunos casos, la activación de un tipo de
receptor puede inducir una mayor expresión de otros receptores
(Metcalf, 1993). Entonces, dos o más factores pueden producir un
patrón diferente de linajes celulares a partir de un solo factor.
El uso de moléculas de fusión puede tener la ventaja clínica
potencial resultante de una respuesta proliferativa que no es
posible por ningún factor individual.
Los factores hematopoyéticos y otros factores de
crecimiento pueden agruparse en dos familias distintas de
receptores relacionados: (1) receptores de tirosina quinasa,
incluyendo los del factor de crecimiento epidérmico,
M-CSF (Sherr, 1990) y SCF (Yarden et al., 1987); y
(2) receptores hematopoyéticos, que no contienen un dominio de
tirosina quinasa, pero que presentan una homología evidente en su
dominio extracelular (Bazan, 1990). En este último grupo se incluyen
la eritropoyetina (EPO) (D'Andrea et al., 1989),
GM-CSF (Gearing et al., 1989), IL-3
(Kitamura et al., 1991), G-CSF (Fukunaga et al.,
1990), IL-4 (Harada et al., 1990),
IL-5 (Takaki et al., 1990), IL-6
(Yamasaki et al., 1988), IL-7 (Goodwin et al.,
1990), ILF (Gearing et al., 1991) e IL-2 (Cosman et
al., 1987). La mayoría de este último grupo de receptores existen
en una forma de alta afinidad como heterodímeros. Después de la
unión al ligando, las cadenas \alpha específicas se asocian con
al menos otra cadena de receptor (cadena \beta, cadena \gamma).
Muchos de estos factores comparten una subunidad de receptor común.
Las cadenas \alpha para GM-CSF,
IL-3 e IL-5 comparten la misma
cadena \beta (Miyajima et al., 1992) y los complejos receptores
para IL-6, LIF e IL-11 comparten una
cadena \beta común (gp130) (Taga et al., 1989; Taga et al., 1992;
Gearing et al., 1992). Los complejos receptores de
IL-2, IL-4 e IL-7
comparten una cadena \gamma común (Montonari et al., 1993;
Russell et al., 1993; Masayuki et al., 1993).
El uso de múltiples factores también puede tener
ventajas potenciales al reducir las exigencias sobre las células
productoras de factores y sus sistemas de inducción. Si hay
limitaciones en la capacidad de una célula de producir un factor, al
reducir las concentraciones requeridas de cada uno de los factores
por medio de su uso en combinación se pueden reducir de forma útil
las exigencias sobre las células productoras del factor. El uso de
factores múltiples puede reducir la cantidad de los factores que
serían necesarias, probablemente reduciendo la probabilidad de
respuestas adversas.
La proteína de fusión de la presente invención
consta de una variante de interleuquina-3 humana
del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a.
1-133), donde la variación de dicha
IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido
en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se
selecciona entre el grupo compuesto por:
- la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;
- la posición 45 es Val, Met o Asn;
- la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;
- la posición 50 es Asp;
- la posición 51 es Pro o Thr;
- la posición 62 es Pro;
- la posición 76 es Pro;
- la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;
- la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;
- la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;
- la posición 100 es Arg;
- la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;
- la posición 105 es Pro;
- la posición 108 es Ala o Ser;
- la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;
- la posición 121 es Ile;
- la posición 122 es Ile;
- la posición 123 es Met o Glu; y
donde pueden delecionarse opcionalmente de 1 a 14
aminoácidos del extremo N y/o pueden delecionarse opcionalmente de
1 a 15 aminoácidos del extremo C de dicho polipéptido mutante de
interleuquina-3 humana;
b) un factor seleccionado entre el grupo
compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una
linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento
hematopoyético;
opcionalmente un engarce entre la secuencia de a)
y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o Met-Ala-
precede al primer aminoácido de la proteína de fusión.
El polipéptido variante de la
interleuquina-3 humana y el factor tienen una
actividad diferente pero complementaria.
Por actividad complementaria se entiende una
actividad que aumenta o cambia la respuesta a otro modulador
celular. El polipéptido variante de interleuquina-3
humana se fusiona directamente o a través de un segmento de engarce
al factor. El término ``directamente'' define fusiones en las que
los polipéptidos se unen sin un engarce peptídico. El engarce es un
agente químico unido o un segmento polipeptídico al que se fusionan
en fase tanto el polipéptido variante de
interleuquina-3 humana como el factor, siendo lo
más común que el engarce sea un péptido lineal al que se unen el
polipéptido variante de interleuquina-3 humana y el
factor por medio de enlaces amida que unen el extremo carboxi del
polipéptido variante de la interleuquina-3 humana al
extremo amino del engarce y el extremo carboxi del engarce al
extremo amino del factor. Por ``fusionado en fase'' se entiende que
no hay ninguna terminación de la traducción o alteración entre las
fases de lectura del polipéptido variante de la
interleuquina-3 humana. Una lista no exclusiva de
otros factores de crecimiento, factores estimuladores de colonias
(CSF), citoquinas, linfoquinas, interleuquinas y factores de
crecimiento hematopoyético dentro de la definición del factor que
puede fusionarse a un polipéptido variante de hIL-3
de la presente invención incluye GM-CSF,
CSF-1, G-CSF,
Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina
(EPO), IL-1, IL-4,
IL-2, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-13, LIF, ligando flt3, hormona de crecimiento
humana, factor de crecimiento de células B, factor de
diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos
y factor de células madre (SCF) también conocido como factor de
Steel o ligando c-kit. Además, esta invención
incluye el uso de moléculas de factor modificadas o secuencias de
ADN mutadas o modificadas que codifican estas moléculas de
factor.
El engarce generalmente es un polipéptido con una
longitud comprendida entre 1 y 500 aminoácidos. Los engarces que
unen las dos moléculas preferiblemente están diseñados para (1)
permitir que las dos moléculas se plieguen y actúen
independientemente entre sí, (2) no tener una tendencia a
desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interferir
con los dominios funcionales de las dos proteínas, (3) tener
características hidrófobas o cargadas mínimas que puedan
interaccionar con los dominios de la proteína funcional y (4)
proporcionar una separación estérica del polipéptido variante de
interleuquina-3 humana y el factor de tal forma que
los dos puedan interaccionar simultáneamente con sus receptores
correspondientes en una sola célula. Típicamente, los aminoácidos
superficiales en regiones flexibles de proteínas incluyen Gly, Asn
y Ser. Sería de esperar que prácticamente cualquier permutación de
secuencias de aminoácidos que contuviera Gly, Asn y Ser cumpliera
los criterios anteriores para una secuencia de engarce. En la
secuencia de engarce también pueden usarse otros aminoácidos
neutros, tales como Thr y Ala. En los engarces también pueden
incluirse otros aminoácidos debido a la adición de sitios de
restricción únicos en la secuencia del engarce para facilitar la
construcción de las fusiones.
Los engarces preferidos de la presente invención
incluyen secuencias seleccionadas entre el grupo de fórmulas:
(Gly_{3}Ser)_{n},
(Gly_{4}Ser)_{n}, (Gly_{5}Ser)_{n},
(Gly_{n}Ser)_{n} o (AlaGlySer)_{n}.
Un ejemplo de un engarce muy flexible es la
región espaciadora rica en (GlySer) presente dentro de la proteína
pIII de los bacteriófagos filamentosos, por ejemplo, los
bacteriófagos M13 o fd (Schaller et al., 1975). Esta región
proporciona una región espaciadora larga y flexible entre dos
dominios de la proteína de la superficie pIII. La región espaciadora
consta de la secuencia de aminoácidos:
La presente invención también incluye engarces en
los que se incluye una secuencia de reconocimiento de
endopeptidasas. Tal sitio de escisión puede ser valioso para
separar los componentes individuales de la fusión para determinar si
se pliegan apropiadamente y son activos in vitro. Los
ejemplos de diversas endopeptidasas incluyen, pero sin limitación,
plasmina, enteroquinasa, calicreína, uroquinasa, activador de
plasminógeno tisular, clostripaína, quimosina, colagenasa, proteasa
de veneno de víbora de Russell, enzima de escisión después de
prolina, proteasa de V8, trombina y factor Xa.
Ciertos segmentos de engarce peptídicos de la
región de bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulinas IgG, IgA,
IgM, IgD o IgE proporcionan una relación angular entre los
polipéptidos unidos. Son especialmente útiles las regiones de
bisagra en las que las cisteínas se reemplazan por serinas. Los
engarces preferidos de la presente invención incluyen secuencias
derivadas de la región de bisagra gamma 2b de la IgG murina en la
que las cisteínas se han cambiado por serinas. Estos engarces
también pueden incluir un sitio de escisión por endopeptidasas.
Los ejemplos de tales engarces incluyen las
siguientes secuencias seleccionadas entre el grupo de
secuencias
Sin embargo, la presente invención no se limita
por la forma, el tamaño o el número de secuencias de engarce
empleadas y el único requisito del engarce es que funcionalmente no
interfiera de manera adversa con el plegamiento y la función de las
moléculas individuales de la fusión.
Un método alternativo para conectar dos factores
de crecimiento hematopoyéticos es por medio de una interacción no
covalente. Tales proteínas complejadas pueden describirse por una
de las fórmulas:
R1-C1 + R2-C2; o
C1-R1 + C2-R2; C1-R1
+ R2-C2; o C1-R1 +
R2-C2
donde R1 es una variante de hIL-3
del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 y que puede
tener porciones de la molécula de hIL-3 delecionada,
y R2 es un factor estimulador de colonias como se ha detallado
anteriormente con una actividad diferente pero complementaria. Una
lista no exclusiva de otros factores estimuladores de colonias
(CSF), citoquinas, linfoquinas, interleuquinas y factores de
crecimiento hematopoyéticos dentro de la definición del factor que
puede fusionarse a un polipéptido variante de hIL-3
de la presente invención, incluye GM-CSF,
CSF-1, G-CSF,
Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina
(EPO), IL-1, IL-4,
IL-2, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9;
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-13, LIF, factor de crecimiento de células B,
factor de diferenciación de células B, factor de diferenciación de
eosinófilos y factor de células madre (SCF) también conocido como
factor de Steel o ligando c-kit. Los dominios C1 y
C2 son de estructura química idéntica o no idéntica, típicamente
proteicos, que pueden formar una asociación específica no
covalente. Los complejos entre C1 y C2 dan como resultado una
relación estequiométrica de uno a uno entre R1 y R2 para cada
complejo. Son ejemplos de dominios que se asocian dominios de
``cierre de cremallera de leucina'' de factores de transcripción,
dominios de dimerización de represores de la transcripción
bacteriana y dominios constantes de inmunoglobulina. Los enlaces
covalentes unen la variante de hIL-3 y C1, y el
factor y C2, respectivamente. Como se indica en las fórmulas, los
dominios C1 y C2 pueden estar presentes en el extremo N o en el
extremo C de su factor de crecimiento hematopoyético correspondiente
(R). Estos dominios de multimerización (C1 y C2) incluyen los
derivados de la familia de proteínas bZIP (Abel et al., 1989;
Landshulz et al., 1988; Pu et al., 1993; Korarides et al., 1988) así
como dominios de multimerización de la familia de proteínas de
hélice-bucle-hélice (Abel et al.,
1989; Murre et al., 1989; Tapscott et al., 1988; Fisher et al.,
1991). Las fusiones preferidas de la presente invención incluyen
factores estimuladores de colonias dimerizados en virtud de su
incorporación como fusiones traduccionales de los dominios de
dimerización de cierre de cremallera de leucina de las proteínas de
la familia bZIP Fos y Jun. El dominio de cierre de cremallera de
leucina de Jun puede interaccionar con dominios idénticos. Por otra
parte, el dominio de cierre de cremallera de leucina de Fos
interacciona con el dominio de cierre de cremallera de leucina Jun,
pero no interacciona con otros dominios de cierre de cremallera de
leucina Fos. Las mezclas de Fos y Jun predominantemente dan como
resultado la formación de heterodímeros Fos-Jun. Por
consiguiente, cuando se fusiona a factores estimuladores de
colonias, el dominio Jun puede usarse para dirigir la formación de
homo o heterodímeros. La formación preferente de heterodímeros puede
conseguirse si uno de los patrones del factor estimulador de
colonias se modifica por ingeniería genética para poseer el dominio
de cierre de cremallera de leucina Jun, mientras que el otro se
modifica por ingeniería genética para poseer el dominio de cierre
de cremallera Fos.
También pueden añadirse péptidos para facilitar
la purificación o identificación de proteínas de fusión (por
ejemplo, poli-His). También puede añadirse un
péptido muy antigénico que permita un rápido ensayo y una fácil
purificación de la proteína de fusión por un anticuerpo monoclonal
específico.
Como se usa en este documento, la
interleuquina-3 humana corresponde a la secuencia
de aminoácidos (1-133) representada en la figura 1 y
(15-125) hIL-3 corresponde a la
secuencia de 15 a 125 aminoácidos del polipéptido de
hIL-3 y moléculas variantes de hIL-3
que se modifican después de la traducción (por ejemplo, por
glicosilación).
``La secuencia de aminoácidos mutante'',
``proteína mutante'' o ``polipéptido mutante'' se refiere a un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de una
secuencia nativa o se codifica por una secuencia de nucleótidos que
intencionadamente se ha hecho variante de una secuencia nativa.
``Proteína mutante'', ``proteína variante'' o ``muteína'' significa
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mutante e
incluyen polipéptidos que difieren de la secuencia de aminoácidos
de la hIL-3 nativa debido a deleciones de
aminoácidos, substituciones o ambas. ``Secuencia nativa'' se
refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que es
idéntica a una forma de tipo silvestre o nativa de un gen o
proteína.
La IL-3 humana puede
caracterizarse por su capacidad de estimular la formación de
colonias por células progenitoras hematopoyéticas humanas. Las
colonias formadas incluyen eritroides, granulocitos,
megacariocitos, macrófagos granulocíticos y mezclas de los mismos.
La IL-3 humana ha demostrado una capacidad de
restaurar la función de la médula ósea y de poblaciones de células
sanguíneas periféricas a niveles terapéuticamente beneficiosos en
estudios realizados inicialmente en primates y posteriormente en
seres humanos (Gillio, A. P., et al. (1990); Ganser, A, et al.
(1990); Falk, S., et al. (1991). Otras actividades de la
hIL-3 incluyen la capacidad de estimular la
migración de leucocitos y la quimiotaxis; la capacidad de inducir
leucocitos humanos para producir altos niveles de mediadores
inflamatorios tales como leucotrienos e histamina; la capacidad de
inducir la expresión en la superficie celular de moléculas
necesarias para la adhesión de leucocitos; y la capacidad de inducir
respuestas inflamatorias dérmicas y fiebre. Muchas o todas estas
actividades biológicas de hIL-3 implican la
transducción de señales y la unión de receptores de alta afinidad.
Las moléculas de fusión de la presente invención pueden presentar
propiedades útiles tales como tener una actividad biológica similar
o mayor en comparación con la hIL-3 nativa o tener
una mejor vida media o menos efectos secundarios adversos, o una
combinación de estas propiedades. También pueden ser útiles como
antagonistas. Las moléculas de fusión que tienen una actividad
pequeña o nula en comparación con la hIL-3 nativa
también pueden ser útiles como antagonistas, como antígenos para la
producción de anticuerpos para uso en inmunología o inmunoterapia,
como sondas genéticas o como intermedios usados para construir
otras muteínas de hIL-3 útiles.
Las nuevas moléculas de fusión de la presente
invención preferiblemente tendrá al menos una propiedad biológica
de la IL-3 humana y del otro factor estimulador de
colonias o de la variante de IL-3 a la que se
fusiona y puede tener más de una propiedad biológica de tipo
IL-3, o una propiedad mejorada, o una reducción en
una propiedad biológica indeseable de la IL-3
humana. Algunos polipéptidos mutantes de la presente invención
también pueden presentar un perfil de efectos secundarios mejorado.
Por ejemplo, pueden presentar una reducción en la liberación de
leucotrienos o en la liberación de histamina en comparación con la
hIL-3 nativa o (15-125)
hIL-3. Tales propiedades biológicas de
hIL-3 o de tipo hIL-3 pueden incluir
una o más de las siguientes características biológicas y
actividades in vivo e in vitro.
Una de tales propiedades es el soporte del
crecimiento y la diferenciación de las células progenitoras
destinadas a los linajes eritroide, linfoide y mieloide. Por
ejemplo, en un ensayo de médula ósea humana convencional, una
propiedad biológica de tipo IL-3 es la estimulación
de colonias de tipo granulocítico, colonias de tipo
megacariocítico, colonias de tipo de monocitos/macrófagos y
estallidos eritroides. Otras propiedades de tipo
IL-3 son la interacción con células madre
multipotenciales tempranas, el mantenimiento del crecimiento de
células precursoras pluripotentes, la capacidad de estimular la
proliferación de células de leucemia mielógena crónica (CML), la
estimulación de la proliferación de mastocitos, la capacidad de
soportar el crecimiento de diversas líneas celulares dependientes de
factores, y la capacidad de activar progenitores de células de
médula ósea inmaduras. En la técnica se han descrito otras
propiedades biológicas de la IL-3. La
IL-3 humana también tiene algunas actividades
biológicas que en algunos casos pueden ser indeseables, por
ejemplo, la capacidad de estimular la liberación de leucotrienos y
la capacidad de estimular el aumento de la síntesis de histamina en
cultivos de bazo y de médula ósea e in vivo.
La actividad biológica de la
hIL-3 y de las proteínas de fusión de
hIL-3 de la presente invención se determina por
medio de la síntesis de ADN por células de leucemia mielógena aguda
(AML) humanas. La línea celular dependiente de factores AML 193 se
adaptó para uso en el ensayo de la actividad biológica. La
actividad biológica de la hIL-3 y de las proteínas
de fusión de hIL-3 de la presente invención también
se determina contando las unidades formadoras de colonias en un
ensayo de médula ósea.
Otros ensayos basados en células in vitro
también pueden ser útiles para determinar la actividad de las
moléculas de fusión que dependen de los factores estimuladores de
colonias que comprende la fusión. A continuación se proporcionan
ejemplos de otros ensayos útiles.
Ensayo de proliferación de TF-1:
la línea de células TF-1 se obtuvo a partir de la
médula ósea de un paciente con eritroleucemia (Kitamura et al.,
1989). Las células TF-1 responden a
IL-3, GM-CSF, EPO e
IL-5.
Ensayo de proliferación de 32D: 32D es una línea
celular dependiente de IL-3 murina que no responde
a la IL-3 humana, pero responde al
G-CSF humano que no presenta restricción de
especie.
Ensayo de proliferación de T1165: las células
T1165 son una línea de células murinas dependientes de
IL-6 (Nordan et al., 1986) que responden a la
IL-6 y a la IL-11.
Ensayo de meg-CSF de Coágulos de
Plasma Humano: usado para ensayar la actividad de formación de
colonias de megacariocitos (Mazur et al., 1981).
La proteína de fusión de la presente invención
tiene una actividad biológica similar o mejorada en relación con la
hIL-3 nativa o el factor o variante de
IL-3.
Las proteínas de fusión de la presente invención
pueden tener actividad de hIL-3 o actividad de tipo
hIL-3. Por ejemplo, pueden poseer una o más de las
actividades biológicas de la hIL-3 nativa y pueden
ser útiles en la estimulación de la producción de células
hematopoyéticas por células progenitoras humanas o de primate. La
proteína de fusión de la presente invención y las composiciones
farmacéuticas que la contienen pueden ser útiles en el tratamiento
de situaciones en las que las poblaciones de células
hematopoyéticas se han reducido o destruido debido a una enfermedad
o a tratamientos tales como radiación y/o quimioterapia. Las
composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de fusión de la
presente invención pueden administrarse por vía parenteral,
intravenosa o subcutánea.
La hIL-3 nativa posee una
considerable actividad inflamatoria y se ha demostrado que estimula
la síntesis de los metabolitos del ácido araquidónico LTC_{4},
LTD_{4} y LTE_{4}; la síntesis de histamina y la liberación de
histamina. Ciertos ensayos clínicos humanos realizados con la
hIL-3 nativa han documentado respuestas
inflamatorias (Biesma, et al., BLOOD,
80:1141-1148 (1992) y Postmus, et al., J.
CLIN. ONCOL., 10:1131-1140 (1992)). Un
estudio reciente indica que los leucotrienos están implicados en
las acciones de la IL-3 in vivo y pueden contribuir
significativamente a los efectos biológicos del tratamiento con
IL-3 (Denzlinger, C. et al., BLOOD,
81:2466-2470 (1993)).
Algunas moléculas de fusión de la presente
invención pueden tener un mejor perfil terapéutico que la
hIL-3 nativa. Por ejemplo, algunas moléculas de
fusión de la presente invención pueden tener una actividad de
factor de crecimiento similar o más potente que la
hIL-3 nativa sin tener un aumento similar o
correspondiente en la estimulación del leucotrienos o histamina.
Sería de esperar que estas moléculas de fusión tuvieran un perfil
terapéutico más favorable, ya que la cantidad de polipéptido que
necesita administrarse para conseguir la actividad de factor de
crecimiento deseada (por ejemplo, la proliferación celular) tendría
un menor efecto estimulador de leucotrienos o de histamina. En
estudios realizados con la hIL-3 nativa, la
estimulación de factores inflamatorios ha sido un efecto secundario
indeseable del tratamiento. La reducción o eliminación de la
estimulación de mediadores de la inflamación proporcionaría una
ventaja con respecto al uso de la hIL-3 nativa.
Las nuevas moléculas de fusión de la presente
invención también pueden ser útiles como antagonistas que bloquean
el receptor de hIL-3 por medio de la unión
específica al mismo y la prevención de la unión del agonista.
Una ventaja potencial de las nuevas moléculas de
fusión de la presente invención, particularmente las que retienen
una actividad similar o mejor que la de la hIL-3
nativa, es que puede usarse una cantidad más pequeña de la muteína
biológicamente activa para producir el efecto terapéutico deseado.
Esto hace que sea posible reducir el número de tratamientos
necesarios para producir el efecto terapéutico deseado. El uso de
cantidades más pequeñas también puede reducir la posibilidad de
cualquier efecto antigénico potencial u otros posibles efectos
secundarios indeseables. Por ejemplo, si puede conseguirse un
efecto terapéutico deseado con una menor cantidad de polipéptido, es
posible reducir o eliminar los efectos secundarios asociados con la
administración de la IL-3 nativa, tales como la
estimulación de leucotrienos y/o la liberación de histamina. Las
nuevas moléculas de fusión de la presente invención también pueden
ser útiles en la activación de células madre o progenitores que
tengan un bajo número de receptores.
La presente invención también incluye las
secuencias de ADN que codifican para las proteínas de fusión,
secuencias de ADN que son substancialmente similares y realizan
substancialmente la misma función, y secuencias de ADN que difieren
de los ADN que codifican las moléculas de fusión de la invención
sólo debido a la degeneración del código genético. En la presente
invención también se incluyen; los intermedios oligonucleotídicos
usados para construir los ADN mutantes; y los polipéptidos
codificados por estos oligonucleótidos. Estos polipéptidos pueden
ser útiles como antagonistas o como fragmentos antigénicos para la
producción de anticuerpos útiles en protocolos de inmunoensayo e
inmunoterapia.
Los compuestos de esta invención se realizan
preferiblemente por técnicas de ingeniería genética ahora
convencionales en la técnica, Patente de Estados Unidos 4.935.233 y
Sambrook et al ``Molecular Cloning. A Laboratory Manual'', Cold
Spring Harbor Laboratory (1989)]. Un método para crear los genes
mutantes de hIL-3 (15-125)
preferidos es la mutagénesis de cassette [Wells, et al. (1985)] en
la que una parte de la secuencia codificante de
hIL-3 en un plásmido se reemplaza por
oligonucleótidos sintéticos que codifican las substituciones de
aminoácidos deseadas en una porción del gen entre dos sitios de
restricción. De forma similar, pueden realizarse substituciones de
aminoácidos en el gen hIL-3 de longitud completa, o
en genes que codifican variantes de hIL-3 en las que
se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o se han
delecionado de 1 a 15 aminoácidos del extremo C. Si se ensamblaran
apropiadamente estos oligonucleótidos, podrían codificar variantes
de hIL-3 con las substituciones de aminoácidos
deseados y/o deleciones de los extremos N y/o C. Los especialistas
en la técnica pueden crear estas y otras mutaciones mediante otros
métodos de mutagénesis que incluyen; mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos [Zoller y Smith (1982, 1983, 1984), Smith (1985),
Kunkel (1985), Taylor, et al. (1985), Deng y Nickoloff (1992)] o
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Saiki, (1985)].
Pueden fabricarse pares de oligonucleótidos
sintéticos complementarios que codifiquen el gen deseado y pueden
hibridar entre sí. La secuencia de ADN del oligonucleótido
codificaría la secuencia para los aminoácidos del gen deseado a
excepción de los substituidos y/o delecionados de la secuencia.
El ADN plasmático puede tratarse con las
endonucleasas de restricción elegidas y después unirse a los
oligonucleótidos hibridados. Las mezclas unidas pueden usarse para
transformar células JM101 competentes de manera que sean resistentes
a un antibiótico apropiado. Pueden recogerse colonias individuales
y el ADN plasmídico puede examinarse por análisis de restricción
y/o secuenciación del ADN para identificar los plásmidos con los
genes deseados.
La fusión de las secuencias de ADN de la variante
de hIL-3 con la secuencia de ADN del otro factor
estimulador de colonias o de la variante de IL-3
puede conseguirse por medio del uso de vectores intermedios. Como
alternativa, un gen puede clonarse directamente en un vector que
contiene el otro gen. Pueden usarse engarces y adaptadores pueden
usarse para unir las secuencias de ADN, así como para reemplazar
secuencias perdidas, cuando haya un sitio de restricción interno en
la región de interés. De esta forma, el material genético (ADN) que
codifica un polipéptido, el engarce peptídico, y el otro
polipéptido se inserta en un vector de expresión adecuado que se usa
para transformar bacterias, levaduras, células de insecto o células
de mamífero. El organismo transformado se cultiva y la proteína se
aísla por técnicas convencionales. Por lo tanto, el producto
resultante es una nueva proteína que tiene una variante de
hIL-3 unida mediante una región de engarce a un
segundo factor estimulador de colonias o una variante de
IL-3.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
vectores de ADN plasmídico para uso en la expresión de estas nuevas
moléculas de fusión. Estos vectores contienen las nuevas secuencias
de ADN descritas anteriormente que codifican para los nuevos
polipéptidos de la invención. Los vectores apropiados que pueden
transformar microorganismos capaces de expresar las proteínas de
fusión incluyen vectores de expresión que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican para las moléculas de fusión unidas a
secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción que se
seleccionan de acuerdo con las células hospedadoras usadas.
En la presente invención se incluyen vectores que
incorporan secuencias modificadas como las descritas anteriormente
y son útiles en la producción de los polipéptidos de fusión. El
vector empleado en el método también contiene secuencias reguladoras
seleccionadas en asociación operativa con el ADN que codifica las
secuencias de la invención y capaces de dirigir la replicación la
expresión del mismo en células hospedadoras seleccionadas.
Como aspecto adicional de la presente invención,
se proporciona un método para producir las nuevas proteínas de
fusión. El método de la presente invención implica cultivar en un
medio de crecimiento una célula hospedadora transformada con un
vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico
que codifica la proteína de fusión de la invención de una manera que
permita la expresión de dicha proteína de fusión y la recuperación
de dicha proteína de fusión. Pueden ser células o líneas celulares
adecuadas ciertas células bacterianas. Por ejemplo, las diversas
cepas de E. Coli son bien conocidas como células
hospedadoras en el campo de la biotecnología. Los ejemplos de tales
cepas incluyen cepas JM101 de E. Coli [Obukowicz, et al.
(1992)]. En la presente invención también se incluye la expresión
de la proteína de fusión utilizando un vector de expresión
cromosómico para E. Coli basado en el bacteriófago Mu
(Weinberg et al., 1993). En este método también pueden emplearse
diversas cepas de B. subtilis. También están
disponibles muchas cepas de células de levadura conocidas para los
especialistas en la técnica como células hospedadoras para la
expresión de los polipéptidos de la presente invención. Cuando se
expresan en el citoplasma de E. Coli, las proteínas de fusión
de la variante de hIL-3 mencionadas anteriormente
de la presente invención también pueden construirse con
Met-Ala- en el extremo N, de forma que tras la
expresión, la Met se retire por escisión dejando Ala en el extremo
N. Las moléculas de fusión de la presente invención pueden incluir
polipéptidos de fusión que tienen Met-, Ala- o
Met-Ala- unidos al extremo N. Cuando las moléculas
de fusión se expresan en el citoplasma de E. Coli, se
obtienen polipéptidos con y sin Met unida al extremo N. Los
extremos N de las proteínas obtenidas en el citoplasma de E.
Coli se ven afectados por un procesamiento
post-traduccional por la metionina aminopeptidasa
(Ben-Bassat et al., 1987) y posiblemente por otras
peptidasas. Estas moléculas de fusión mutantes también pueden
expresarse en E. Coli fusionando un péptido señal al extremo
N. Este péptido señal se escinde del polipéptido como parte del
proceso de secreción. La secreción en E. Coli puede usarse
para obtener el aminoácido correcto en el extremo N (por ejemplo,
Asn^{15} en el polipéptido hIL-3
(15-125)) debido a la naturaleza precisa de la
peptidasa señal. Esto está en contraste con la heterogeneidad que
puede observarse en el extremo N de proteínas expresadas en el
citoplasma en E. Coli.
También son adecuadas para uso en la presente
invención células de mamífero, tales como células de ovario de
hámster chino (CHO). En Kaufman, R. J. (1987) High level production
of proteins in mammalian cells, en Genetic Engineering,
Principles and Methods, vol. 9, J. K. Setlow, editor, Plenum
Press, Nueva York, se revisan métodos generales para la expresión de
genes extraños en células de mamífero. Se construye un vector de
expresión en el que un promotor fuerte capaz de funcionar en
células de mamífero dirige la transcripción de una región
codificante del péptido señal de secreción eucariota, que se
fusiona traduccionalmente a la región codificante para la molécula
de fusión. Por ejemplo, pueden usarse plásmidos tales como pcDNA
I/Neo, pRc/RSV, y pRc/CMV (obtenido a partir de Invitrogen Corp.,
San Diego, California). La región codificante del péptido señal de
secreción eucariota puede proceder del propio gen de
hIL-3 o puede proceder de otra proteína de mamífero
secretada (Bayne, M.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
Estados Unidos 84, 2638-2642). Después de
la construcción del vector que contiene el gen de la variante de
hIL-3, el ADN del vector se utiliza para transfectar
células de mamífero. Tales células pueden ser, por ejemplo, las
líneas COS7, HeLa, BHK, CHO, o líneas L de ratón. Las células
pueden cultivarse, por ejemplo, en medio DMEM (JRH Scientific). La
variante de hIL-3 secretada en el medio puede
recuperarse por procedimientos bioquímicos convencionales después de
la expresión transitoria de 24 a 72 horas después de la
transfección de las células o después del establecimiento de líneas
celulares estables tras la selección con respecto a la resistencia
a neomicina. En la técnica se conoce la selección de células
hospedadoras de mamífero adecuadas y de métodos para la
transformación, el cultivo, la amplificación, la selección y la
producción y purificación del producto. Véase, por ejemplo, Gething
y Sambrook, Nature, 293:620-625
(1981) o, como alternativa, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol.,
5 (7):1750-1759 (1985) o Howley et al.,
Patente de Estados Unidos Nº 4.419.446. Otra línea celular de
mamífero adecuada es la línea celular COS-1 de
mono. Una línea celular de mamífero similarmente útil es la línea
celular CV-1.
Cuando se desee, pueden utilizarse células de
insecto como células hospedadoras en el método de la presente
invención. Véase, por ejemplo, Miller et al, Genetic
Engineering, 8:277-298 (Plenum Press
1986) y referencias citadas en este documento. Además, en Summers,
M. D. y Smith, G. E. (1987) - A manual of methods for Baculovirus
vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural
Experiment Station Bulletin No. 1555, se describen métodos generales
para la expresión de genes extraños en células de insecto. Se
construye un vector de expresión que comprende un vector de
transferencia de Baculovirus, en el que un promotor fuerte de
Baculovirus (tal como el promotor de polihedron) dirige la
transcripción de una región codificante del péptido de señal de
secreción eucariota, que está fusionado traduccionalmente a la
región codificante para el polipéptido de fusión. Por ejemplo, puede
usarse el plásmido pVL1392 (obtenido a partir de Invitrogen Corp.,
San Diego, California). Después de la construcción del vector que
lleva el gen que codifica el polipéptido de fusión, se
contransfectan dos microgramos de este ADN con un microgramo de ADN
de Baculovirus (véase Summers & Smith, 1987) en células de
insecto, cepa SF9. El Baculovirus recombinante puro que lleva la
molécula de fusión se usa para infectar células cultivadas, por
ejemplo, en medio sin suero Excell 401 (JRH Biosciences, Lenexa,
Kansas). La molécula de fusión secretada en el medio puede
recuperarse por procedimientos bioquímicos convencionales. Los
sobrenadantes de células de mamífero o de insectos que expresan la
proteína de fusión pueden concentrarse primero usando cualquiera de
varias unidades de concentración comerciales.
Las moléculas de fusión de la presente invención
pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas
por una reducción de los niveles de células mieloides, eritroides,
linfoides o megacariocitos del sistema hematopoyético o
combinaciones de las mismas. Además, pueden ser útiles para activar
células mieloides y/o linfoides maduras. Entre las situaciones
susceptibles al tratamiento con los polipéptidos de la presente
invención se encuentran la leucopenia, una reducción en el número
de leucocitos circulantes (glóbulos blancos) en la sangre
periférica. La leucopenia puede inducirse por exposición a ciertos
virus o a radiación. A menudo, es un efecto secundario de diversas
formas de terapia para el cáncer, por ejemplo exposición a fármacos
quimioterapéuticos o radiación, y de infección o hemorragia. El
tratamiento terapéutico de la leucopenia con estas moléculas de
fusión de la presente invención puede evitar efectos secundarios
indeseables producidos por el tratamiento con fármacos disponibles
en la actualidad.
Las moléculas de fusión de la presente invención
pueden ser útiles en el tratamiento de la neutropenia y, por
ejemplo, en el tratamiento afecciones tales como anemia aplástica,
neutropenia cíclica, neutropenia idiopática, síndrome de
Chediak-Higashi, lupus sistémico eritematoso (SLE),
leucemia, síndrome mielodisplásico y mielofibrosis.
La molécula de fusión de la presente invención
puede ser útil al tratamiento o prevención de la trombocitopenia.
Actualmente, la única terapia para la trombocitopenia es la
transfusión de plaquetas que son caras y que conllevan los riesgos
significativos de infección (VIH, VHB) y aloinmunización. La
molécula de fusión puede aliviar o disminuir la necesidad de
transfusiones de plaquetas. La trombocitopenia grave puede deberse
a defectos genéticos tales como la anemia de Fanconi o los
síndromes de Wiscott-Aldrich o de
May-Hegglin. La trombocitopenia adquirida puede
producirse por auto- o alo-anticuerpos, tal como en
la trombocitopenia púrpura inmune, lupus sistémico eritematoso,
anemia hemolítica o incompatibilidad entre el feto y la madre.
Además, la esplenomegalia, la coagulación intravascular diseminada,
la púrpura trombocitopénica trombótica, la infección o las válvulas
cardíacas protésicas pueden ocasionar trombocitopenia. La
trombocitopenia grave también puede producirse por quimioterapia
y/o terapia de radiación o por un cáncer. La trombocitopenia también
puede deberse a una invasión de la médula por un carcinoma,
linfoma, leucemia o fibrosis.
Las moléculas de fusión de la presente invención
pueden ser útiles en la movilización de progenitores
hematopoyéticos y células madre en la sangre periférica. Se ha
demostrado que ciertos progenitores derivados de sangre periférica
son eficaces en la reconstitución de pacientes en la situación de
trasplante de médula autólogo. Se ha demostrado que los factores de
crecimiento hematopoyéticos, incluyendo G-CSF y
GM-CSF aumentan el número de progenitores
circulantes y las células madre en la sangre periférica. Esto ha
simplificado el procedimiento para la extracción de células madre
periféricas y ha reducido drásticamente el coste del procedimiento
disminuyendo el número de féresis requeridas. La molécula de fusión
puede ser útil en la movilización de células madre y potenciar
adicionalmente la eficacia del trasplante de células madre
periféricas.
Otro uso clínico proyectado de factores de
crecimiento ha sido la activación in vitro de progenitores
hematopoyéticos y células madre para la terapia génica. Para tener
el gen de interés incorporado en el genoma del progenitor
hematopoyético o célula madre, se necesita estimular la división
celular y la replicación del ADN. Las células madre hematopoyéticas
completan el ciclo celular a una frecuencia muy baja, lo que
significa que ciertos factores de crecimiento pueden ser útiles para
promover la transducción génica y, por lo tanto, aumentar las
expectativas clínicas para la terapia génica.
Muchos fármacos pueden producir una represión de
la médula ósea o deficiencias hematopoyéticas. Son ejemplos de
tales fármacos AZT, DDI, agentes alquilantes y
anti-metabolitos usados en quimioterapia,
antibióticos tales como cloranfenicol, penicilina, ganciclovir,
daunomicina y sulfa-fármacos, fenotiazonas,
tranquilizantes tales como meprobamato, analgésicos tales como
aminopirina y dipirona, anticonvulsivantes tales como fenitoína o
carbamazepina, y antitiroideos tales como propiltiouracilo y
metimazol, y diuréticos. Las moléculas de fusión de la presente
invención pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de la
represión de la médula ósea o en deficiencias hematopoyéticas que a
menudo se producen en pacientes tratados con estos fármacos.
También pueden producirse deficiencias
hematopoyéticas como resultado de infecciones virales, microbianas
o parasitarias y como resultado del tratamiento de la enfermedad
renal o insuficiencia renal, por ejemplo, de la diálisis. Las
moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en
el tratamiento de tal deficiencia hematopoyética.
El tratamiento de la deficiencia hematopoyética
puede incluir la administración de una composición farmacéutica que
contiene las moléculas de fusión a un paciente. Las moléculas de
fusión de la presente invención también pueden ser útiles para la
activación y amplificación de células precursoras hematopoyéticas
por medio del tratamiento de estas células in vitro con las
proteínas de fusión de la presente invención antes de inyectar las
células a un paciente.
Diversas inmunodeficiencias, por ejemplo de
linfocitos T y/o B, o trastornos inmunes, por ejemplo la artritis
reumatoide, también pueden verse afectadas beneficiosamente por el
tratamiento con las moléculas de fusión de la presente invención.
Las inmunodeficiencias pueden ser el resultado de infecciones
virales, por ejemplo por HTLVI, HTLVII o HTLVIII, de una exposición
severa a la radiación, de una terapia contra el cáncer o el
resultado de otro tratamiento médico. Las moléculas de fusión de la
presente invención también pueden ser útiles, solas o en combinación
con otras hematopoyetinas, en el tratamiento de otras deficiencias
de células sanguíneas, incluyendo trombocitopenia (deficiencia de
plaquetas) o anemia. Los nuevos polipéptidos también pueden ser
útiles en el tratamiento de pacientes que se recuperan de
transplantes de médula ósea in vivo y ex vivo, y en el desarrollo de
anticuerpos monoclonales y policlonales generados por métodos
convencionales para uso de diagnóstico o terapéutico.
Otros aspectos de la presente invención son
composiciones terapéuticas para tratar las afecciones mencionadas
anteriormente. Tales composiciones comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de una o más de las moléculas de fusión de
la presente invención en una mezcla con un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede ser útil para
administrarse por vía parenteral, intravenosa o subcutánea. La
composición terapéutica de esta invención está preferiblemente en
forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, sin
pirógenos. La preparación de tal solución proteica parenteralmente
aceptable, teniendo en cuenta debidamente el pH, la isotonicidad, la
estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la
técnica.
El régimen de dosificación implicado en un método
para tratar las afecciones descritas anteriormente se determinará
por el médico a cargo del caso considerando diversos factores que
modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, el estado, el peso
corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier
infección, el momento de administración y otros factores clínicos.
Generalmente, un régimen diario puede estar en el intervalo de
0,2-150 \mug/kg de proteína de fusión por
kilogramo de peso corporal. Este régimen de dosificación hace
referencia a un nivel convencional de actividad biológica que
reconoce que la IL-3 nativa generalmente posee una
CE_{50} de o aproximadamente de 10 picomolar a 100 picomolar en
el ensayo de proliferación de AML descrito en este documento. Por lo
tanto, las dosificaciones se ajustarían con respecto a la actividad
de una proteína de fusión dada frente a la actividad de la
IL-3 (de referencia) nativa, y sería razonable
indicar que los regímenes de dosificación pueden incluir dosis tan
bajas como de 0,1 microgramos y tan altas como de 1 miligramo por
kilogramo de peso corporal al día. Además, pueden existir
circunstancias específicas en las que las dosificaciones de la
molécula de fusión se ajusten por encima o por debajo del intervalo
de 10-200 microgramos por kg de peso corporal. Éstas
incluyen la coadministración con otro factor estimulador de
colonias o variante de IL-3 o factores del
crecimiento; la coadministración con fármacos quimioterapéuticos y/o
radiación; el uso de una proteína de fusión glicosilada; y diversas
cuestiones relacionadas con el paciente mencionadas anteriormente en
esta sección. Como se ha indicado anteriormente, el método
terapéutico y las composiciones también pueden incluir la
coadministración con otros factores humanos. Una lista no exclusiva
de otras hematopoyetinas apropiadas, CSF, citoquinas, linfoquinas,
factores de crecimiento hematopoyéticos e interleuquinas para
coadministración simultánea o en serie con las proteínas de fusión
de la presente invención incluye GM-CSF,
CSF-1, G-CSF,
Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina
(EPO), IL-1, IL-4,
IL-2, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13, LIF, factor de
crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B y
factor de diferenciación de eosinófilos, factor de células madre
(SCF) también conocido como factor de Steel o ligando
c-kit, o combinaciones de los mismos. La dosificación
mencionada anteriormente debe ajustarse para compensar tales
componentes adicionales presentes en la composición terapéutica. El
progreso del paciente tratado puede controlarse mediante una
evaluación periódica del perfil hematológico, por ejemplo, el
recuento diferencial de células y similares.
A menos que se indique otra cosa, todos los
agentes químicos de especialidad se obtienen en Sigma Co., (St.
Louis, MO). Las endonucleasas de restricción, la polinucleótido
quinasa de T4, el fragmento grande de la ADN polimerasa I de E.
Coli y la ADN ligasa de T4 se obtienen en New England Biolabs
(Beverly, Massachusetts).
Cepa JM101: delta (pro lac), supE, thi, F'
(traD36, rpoAB, lacI-Q, lacZdeltaM15) (Messing,
1979). Esta cepa puede obtenerse en la American Type Culture
Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
número de acceso 33876. MON 105 (W3110 rpoH358) es un derivado de
W3110 (Bachmann, 1972) y se le ha asignado el número de acceso ATCC
55204. Cepa GM48: dam-3, dcm-6,
gal, ara, lac, thr, leu, tonA, tsx (Marinus, 1973) se usa para
obtener un ADN plasmático que no esté metilado en la secuencia
GATC.
El gen usado para la producción de
hIL-3 en E. Coli se obtiene a partir de
British Biotechnology Incorporated, Cambridge, Inglaterra, con el
número de catálogo BBG14. Este gen se transporta en un plásmido
basado en pUC designado pP0518. Pueden obtenerse muchos otros genes
CSF humanos a partir de R&D Systems, Inc. (Minn, MN) incluyendo
alfa IL-1, beta IL-1,
IL-2, IL-4, Il-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
G-CSF, GM-CSF y LIF.
Los plásmidos usados para la producción de
hIL-3 en E. Coli contienen elementos
genéticos cuyo uso se ha descrito (Olins et al., 1988; Olins y
Rangwala, 1990). El replicón usado es el de pBR327 (Covarrubias, et
al., 1981) que se mantiene en un número de copias de
aproximadamente 100 en la célula (Soberon et al., 1980). En los
plásmidos está presente un gen que codifica la proteína
beta-lactamasa. Esta proteína confiere resistencia a
ampicilina a la célula. Esta resistencia sirve como fenotipo
seleccionable con respecto a la presencia del plásmido en la
célula.
Para los vectores de expresión citoplasmáticos,
el promotor de la transcripción procede del gen recA de E.
Coli (Sancar et al., 1980). Este promotor, designado precA,
incluye el sitio de unión a la ARN polimerasa y el sitio de unión al
represor de lexA (el operador). Este segmento de ADN proporciona
una transcripción de alto nivel que se regula aunque el promotor
recA esté en un plásmido con el origen de replicación de pBR327
(Olins et al., 1988) incorporado en este documento como
referencia.
El sitio de unión a ribosomas usado es el del gen
10 del fago T7 (Olins et al., 1988). Éste se codifica en un
fragmento de 100 pares de bases (pb) localizado de forma adyacente
al precA. En los plásmidos usados en esta invención, la secuencia
de reconocimiento para la enzima NcoI (CCATGG) sigue al
g10-L. Es en este sitio NcoI donde los genes de
hIL-3 se unen al plásmido. Es de esperar que la
secuencia de nucleótidos en esta unión se reconozca en el ARNm como
un sitio de inicio funcional para la traducción (Olins et al.,
1988). Los genes de hIL-3 usados se modificaron por
ingeniería genética para tener un sitio de reconocimiento HindIII
(AAGCTT) cadena debajo de la secuencia codificante del gen. En este
sitio HindIII hay un fragmento RsaI de 514 pares de bases que
contiene el origen de replicación del fago monocatenario f1 (Dente
et al., 1983; Olins, et al., 1990) ambos incorporados en este
documento como referencia. Un plásmido que contiene estos elementos
es pMON2341. Otro plásmido que contiene estos elementos es
pMON5847, que se ha depositado en la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 con el
número de acceso ATCC 68912.
En los plásmidos de expresión de secreción, el
promotor de la transcripción procede de los genes ara B, A, y
D de E. coli (Greenfield et al}., 1978). Este promotor
se denomina pAraBAD y está contenido en un fragmento de
restricción SacII, BglII de 323 pares de bases. La secuencia
directora de secreción LamB(Wong et al., 1988, Clement
et al., 1981) está unida al extremo N del gen de
hIL-3 en la secuencia de reconocimiento para la
enzima NcoI (5'CCATGG3'). Los genes de hIL-3
usados se modificaron por ingeniería genética para tener un sitio
de reconocimiento HindIII (5'AAGCTT3') después de la
secuencia codificante del gen.
Los genes variantes de hIL-3 y
otros genes de CSF pueden construirse por el ensamblaje de
oligonucleótidos sintéticos. Se diseñan oligonucleótidos sintéticos
de forma que hibriden en pares complementarios, con extremos
salientes monocatenarios, y cuando los pares se ensamblen de manera
apropiada darán como resultado una secuencia de ADN que codifica una
porción del gen deseado. Las substituciones de aminoácidos en el
gen de hIL-3 se realizan diseñando los
oligonucleótidos para que codifiquen las substituciones deseadas.
Los oligonucleótidos complementarios se hibridan a una
concentración de 1 picomol por microlitro en tampón de unión más
NaCl 50 mM. Las muestras se calientan en un vaso de precipitados de
100 ml de agua hirviendo y se dejan enfriar lentamente a
temperatura ambiente. Un picomol de cada uno de los pares de
oligonucleótidos hibridados se une con aproximadamente 0,2
picomoles de ADN plasmídico, digerido con las enzimas de restricción
apropiadas, en tampón de unión (Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10
mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM, espermidina 2 mM) con ADN ligasa
de T4 obtenida en New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) en un
volumen total de 20 \mul a temperatura ambiente durante una
noche.
Las técnicas de reacción en cadena de la
polimerasa (denominada en lo sucesivo PCR) (Saiki, 1985) usaron el
kit de reactivos y el aparato de ciclos térmicos de
Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT.). La PCR se basa
en una ADN polimerasa termoestable de Thermus aquaticus. La
técnica de PCR es un método de amplificación de ADN que imita el
proceso de replicación de ADN natural, ya que el número de
moléculas de ADN se duplica después de cada ciclo de una forma
similar a la replicación in vivo. La extensión mediada por
la ADN polimerasa es en la dirección 5' a 3'. El término
``cebador'', como se usa en este documento, se refiere a una
secuencia de oligonucleótidos que proporciona un extremo en el que
la ADN polimerasa puede añadir nucleótidos que son complementarios
a una secuencia de nucleótidos. Esta última secuencia de
nucleótidos se denomina ``plantilla'', con la que hibridan los
cebadores. El producto de PCR amplificado se define como la región
comprendida entre los extremos 5' de los cebadores de extensión.
Como los cebadores tienen secuencias definidas, el producto tendrá
extremos discretos, correspondientes a las secuencias de los
cebadores. La reacción de extensión del cebador se realiza usando 20
picomoles (pmoles) de cada uno de los oligonucleótidos y 1
picogramo de ADN plasmídico de plantilla durante 35 ciclos (1 ciclo
se define como 94 grados C durante un minuto, 50 grados C durante
dos minutos y 72 grados durante tres minutos.). La mezcla de
reacción se extrae con un volumen igual de fenol/cloroformo (50% de
fenol y 50% de cloroformo, volumen/volumen) para retirar las
proteínas. La fase acuosa, que contiene el ADN amplificado, y una
fase de disolvente se separan por centrifugación durante 5 minutos
en una microcentrífuga (Modelo 5414, Eppendorf Inc, Fremont CA.).
Para precipitar el ADN amplificado, la fase acuosa se retira y se
transfiere a un tubo limpio al que se añaden 0,1 volúmenes de NaOAc
3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol (al 100%, almacenado a menos
20 grados C). La solución se mezcla y se pone sobre hielo seco
durante 20 minutos. El ADN se sedimenta por centrifugación durante
10 minutos en una microcentrífuga y la solución se retira del
sedimento. El sedimento de ADN se lava con etanol al 70%, y el
etanol se retira y se seca en un concentrador speedvac (Savant,
Farmingdale, Nueva York). El sedimento se resuspende en 25
microlitros de TE (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, EDTA 1
mM). Como alternativa, el ADN se precipita añadiendo un volumen
igual de NH_{4}OAc 4M y un volumen de isopropanol [Treco et
al., (1988)]. La solución se mezcla y se incuba a temperatura
ambiente durante 10 minutos y se centrifuga. Estas condiciones
precipitan selectivamente fragmentos de ADN mayores que \sim20
bases y se usan para retirar cebadores oligonucleotídicos. Un
cuarto de la reacción se digiere con enzimas de restricción
[Higuchi, (1989)] y, después de finalizar la digestión, se
calienta a 70 grados C para inactivar las enzimas.
Se hacen competentes células JM101 de E.
Coli para captar ADN. Típicamente, se cultivan de 20 a 100 ml
de células en medio LB hasta una densidad de aproximadamente 150
unidades Klett y después se recogen por centrifugación. Las células
se resuspenden en una mitad del volumen de cultivo de CaCl_{2} 50
mM y se mantienen a 4ºC durante una hora. Las células se recogen de
nuevo por centrifugación y se resuspenden en un décimo del volumen
de cultivo de CaCl_{2} 50 mM. Se añade ADN a un volumen de 150
\mul de estas células, y las muestras se mantienen a 4ºC durante
30 minutos. Las muestras se cambian a 42ºC durante un minuto, se
añade 1 ml de LB, y las muestras se agitan a 37ºC durante 1 hora.
Se extienden células de estas muestras sobre placas que contienen
ampicilina para seleccionar los transformantes. Las placas se
incuban durante una noche a 37ºC. Se recogen colonias individuales
y se cultivan en LB suplementado con ampicilina durante una noche a
37ºC con agitación. A partir de estos cultivos, se aísla el ADN
para el análisis de restricción.
Para el cultivo de las células para aislar el ADN
se usa medio LB (Maniatis et al., 1982). Para los cultivos en los
que se produce una molécula de fusión recombinante, se usa medio
mínimo M9 suplementado con casaminoácidos al 1,0%, y caseína
hidrolizada con ácidos, Difco (Detroit, Michigan). Los ingredientes
en el medio M9 son los siguientes: 3 g/litro de KH_{2}PO_{4}, 6
g/l de Na_{2}HPO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl,
MgSO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2} 0,025 mM, glucosa al 0,2% (glicerol
al 0,2% con el promotor AraBAD), casaminoácidos al 1%, 0,1 ml/l de
oligoelementos (por litro, 108 g de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 4,0 g
de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 7,0 de CoCl_{2}\cdot2H_{2}O, 7,0 g
de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 8,0 g de
CuSo_{4}\cdot5H_{2}O, 2,0 g de H_{3}BO_{3}, 5,0 g de
MnSO_{4}\cdotH_{2}O, y 100 ml de HCl concentrado). Se usa bacto
agar para medios sólidos y se añade ampicilina a medios LB tanto
líquidos como sólidos a 200 microgramos por mililitro.
Se cultivan cepas de E. Coli que llevan
los plásmidos de interés a 37ºC en medio M9 más casaminoácidos con
agitación en un baño de agua Gyrotory modelo G76 procedente de
Brunswick Scientific (Edison, New Jersey). El cultivo se controla
con un medidor Klett Summerson (filtro verde 54), Klett Mfg. Co.
(Nueva York, Nueva York). A un valor de Klett de aproximadamente
150, se retira una alícuota del cultivo (normalmente 1 ml) para un
análisis de proteínas. Al cultivo restante se le añade ácido
nalidíxico (10 mg/ml) en NaOH 0,1 N hasta una concentración final
de 50 \mug/ml. Los cultivos se agitan a 37ºC durante 3 a 4 horas
después de la adición de ácido nalidíxico. A lo largo de todo el
cultivo bacteriano se mantiene un alto grado de aireación para
conseguir una producción máxima del producto génico deseado. Las
células se examinan con microscopio óptico para comprobar la
presencia de cuerpos refringentes (RB). Se retiran alícuotas de un
mililitro del cultivo para el análisis del contenido de
proteínas.
La primera etapa en la purificación de las
moléculas de fusión es sonicar las células. Se resuspenden
alícuotas del cultivo procedentes de sedimentos celulares en tampón
de sonicación: Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,1
mM. Estas células resuspendidas se someten a varios estallidos de
sonicación repetidos usando la micropunta de un rompedor de células
Sonicator, modelo W-375 obtenido en Heat
Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, Nueva York).
El grado de sonicación se controla examinando los homogeneizados con
un microscopio óptico. Cuando casi todas las células se han roto,
los homogeneizados se fraccionan por centrifugación. Los
sedimentos, que contienen la mayoría de los cuerpos refractarios,
están muy enriquecidos en proteínas de fusión.
Estas proteínas de fusión pueden purificarse por
una diversidad de métodos convencionales. Algunos de estos métodos
se describen con detalle en Methods in Enzymology, Volumen 182
``Guide to Protein Purification'' editado por Murray Deutscher,
Academic Press, San Diego, CA (1990).
Las proteínas de fusión que se producen como
cuerpos de inclusión insolubles en E. Coli pueden
solubilizarse en altas concentraciones de desnaturalizante, tales
como Guanidina HCl o Urea, incluyendo ditiotreitol o beta
mercaptoetanol como agente de reducción. El plegamiento de la
proteína en una conformación activa puede realizarse mediante
diálisis secuencial a concentraciones inferiores de
desnaturalizante sin agente de reducción.
En algunos casos, las proteínas plegadas pueden
purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como
mAbs o subunidades de receptores unidas a una matriz adecuada. Como
alternativa, (o además) la purificación puede realizarse usando
cualquiera de una diversidad de métodos cromatográficos tales como:
intercambio iónico, exclusión molecular o cromatografía hidrófoba o
HPLC de fase inversa.
Las concentraciones de proteínas de fusión pueden
determinarse usando un ELISA de sándwich basado en un anticuerpo
apropiado purificado por afinidad. Se recubren placas de
microtitulación (Dynatech Immulon II) con 150 \mul de anticuerpo
de cabra anti-rhIL-3 a una
concentración de aproximadamente 1 \mug/ml en NaHCO3 100 mM, pH
8,2. Las placas se incuban durante una noche a temperatura ambiente
en una cámara que mantiene la humedad al 100%. Se vacían los
pocillos y los sitios reactivos restantes en la placa se bloquean
con 200 \mul de solución que contiene PBS 10 mM, BSA al 3% y
Tween 20 al 0,05%, pH 7,4, durante 1 hora a 37ºC y con un 100% de
humedad. Se vacían los pocillos y se lavan 4 veces con NaCl 150 mM
que contiene Tween 20 al 0,05% (tampón de lavado). Después, cada
pocillo recibe 150 \mul de tampón de dilución (PBS 10 mM que
contiene BSA al 0,1%, Tween 20 al 0,01%, pH 7,4), que contiene
patrón de rhIL-3, tampón de control, de muestra o de
dilución solo. Se prepara una curva patrón con concentraciones que
varían de 0,125 ng/ml a 5 ng/ml usando una solución madre de
rhIL-3 (concentración determinada por análisis de
composición de aminoácidos). Las placas se incuban durante 2,5 horas
a 37ºC y con un 100% de humedad. Se vacían los pocillos y cada
placa se lava 4 veces con tampón de lavado. Después, cada pocillo
recibió 150 \mul de una dilución óptima (determinada en un
formato de ensayo de tablero de ajedrez) de anticuerpo de cabra
anti-rhIL-3 conjugado con peroxidasa
de rábano picante. Las placas se incuban durante 1,5 horas a 37ºC y
con un 100% de humedad. Se vacían los pocillos y cada placa se lava
4 veces con tampón de lavado. Después, cada pocillo recibió 150
\mul de solución de substrato ABTS (Kirkegaard y Perry). Las
placas se incuban a temperatura ambiente hasta que aparece un color
en los pocillos patrón que contienen 5 ng/ml de
rhIL-3, en una intensidad suficiente como para
proporcionar una absorbancia entre 0,5 y 1,0 cuando se lee a una
longitud de onda de ensayo de 410 nm y a una longitud de onda de
referencia de 570 nm en un lector de placas de microtitulación
Dynatech. Las concentraciones de rhIL-3
inmunorreactiva en muestras desconocidas se calculan a partir de la
curva patrón usando un software suministrado con el lector de
placas.
La línea celular dependiente de factor AML 193 se
obtuvo a partir de la American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, MD). Esta línea celular, establecida a partir de un
paciente con leucemia mielógena aguda, es una línea celular
dependiente de factor de crecimiento que mostró un mayor crecimiento
en medio suplementado con GM-CSF (Lange, B., et
al., (1987); Valtieri, M., et al., (1987). También se ha
documentado la capacidad de las células AML 193 para proliferar en
presencia de IL-3 humana. (Santoli, D., et al.,
(1987)). Se usó una variante de línea celular, AML 193 1.3, que se
adaptó para el crecimiento a largo plazo en IL-3
lavando los factores de crecimiento y privando a las células AML
193 dependientes de citoquina de los factores de crecimiento durante
24 horas. Después, las células se volvieron a cultivar a 1x10^{5}
células/pocillo en una placa de 24 pocillos en un medio que
contenía 100 U/ml de IL-3. Las células tardaron
aproximadamente dos meses en crecer rápidamente en
IL-3. Estas células se mantienen como AML 193 1.3
posteriormente, suplementando el medio de cultivo de tejidos (véase
más adelante) con IL-3 humana.
Las células AML 193 1.3 se lavan 6 veces en una
solución salina equilibrada de Hanks fría (HBSS, Gibco, Grand
Island, NY) centrifugando las suspensiones celulares a 250 x g
durante 10 minutos seguido de la decantación del sobrenadante. Las
células sedimentadas se resuspenden en HBSS y el procedimiento se
repite hasta que se completan seis ciclos de lavado. Las células
lavadas seis veces mediante este procedimiento se resuspenden en
medio de cultivo de tejidos a una densidad que varía de 2 x
10^{5} a 5 x 10^{5} células viables/ml. Este medio se prepara
suplementando medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM,
Hazleton, Lenexa, KS) con albúmina, transferrina, lípidos y
2-mercaptoetanol. La albúmina bovina
(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a
una concentración de 500 \mug/ml; la transferrina humana
(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a
una concentración de 100 \mug/ml; el lípido de soja
(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a
una concentración de 50 \mug/ml; y el
2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) se añade a
una concentración de 5 x 10^{-5} M.
Se realizan diluciones en serie de
interleuquina-3 humana o de proteína de fusión
(muteína de hIL-3) en series triplicadas en medio de
cultivo de tejidos suplementado como se ha indicado anteriormente,
en placas de cultivo de tejidos Costar 3596 de 96 pocillos. Cada
pocillo contenía 50 \mul de medio que contenía
interleuquina-3 o proteína de fusión una vez
terminadas las diluciones en serie. Los pocillos de control
contenían medio de cultivo de tejidos solo (control negativo). A
cada pocillo se le añaden suspensiones de células AML 193 1.3
preparadas como se ha indicado anteriormente introduciendo en cada
pocillo, con la ayuda de una pipeta, 50 ml (2,5 x 10^{4} células).
Las placas de cultivo de tejidos se incuban a 37ºC con un 5% de
CO_{2} en aire humidificado durante 3 días. En el día 3, se añaden
0,5 \muCi de ^{3}H-timidina (2 Ci/mM, New
England Nuclear, Boston, MA) en 50 \mul de medio de cultivo de
tejidos. Los cultivos se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} en
aire humidificado durante 18-24 horas. El ADN
celular se recoge en mallas de filtro de vidrio (Pharmacia LKB,
Gaithersburg, MD) usando un recolector de células TOMTEC (TOMTEC,
Orange, CT) que utilizaba un ciclo de lavado con agua seguido de un
ciclo de lavado con etanol al 70%. Las mallas de filtro se dejan
secar al aire y después se ponen en bolsas de muestra a las que se
añade fluido de centelleo (Scintiverse II, Fisher Scientific, St.
Louis, MO o BetaPlate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB,
Gaithersburg, MD). Se cuentan las emisiones beta de las muestras de
los pocillos de cultivo de tejidos individuales en un contador de
centelleo LKB Betaplate modelo 1205 (Pharmacia LKB, Gaithersburg,
MD) y los datos se expresan como cuentas por minuto de
^{3}H-timidina incorporada en las células de cada
pocillo de cultivo de tejidos. La actividad de cada preparación de
interleuquina-3 humana o de la preparación de la
proteína de fusión se cuantifica midiendo la proliferación celular
(incorporación de ^{3}H-timidina) inducida por
concentraciones graduadas de interleuquina-3 o de
proteína de fusión. Típicamente, en estos ensayos se cuantifican
intervalos de concentraciones de 0,05 pM - 10^{5} pM. La actividad
se determina midiendo la dosis de interleuquina-3 o
de molécula de fusión que proporciona el 50% de la proliferación
máxima [EC_{50} = 0,5 x (cuentas medias máximas por minuto de
^{3}H-timidina incorporada por pocillo entre
cultivos por triplicado de todas las concentraciones de
interleuquina-3 ensayadas - proliferación de fondo
medida mediante la incorporación de ^{3}H-timidina
observada en cultivos por triplicado que carecen de
interleuquina-3]. Este valor de EC_{50} también
es equivalente a 1 unidad de bioactividad. Cada ensayo se realiza
con interleuquina-3 nativa como patrón de
referencia de forma que puedan asignarse los niveles de actividad
relativa.
Este ensayo proporciona una aproximación
razonable de la actividad de crecimiento de factores estimuladores
de colonias para estimular células de médula ósea normal para que
produzcan diferentes tipos de colonias hematopoyéticas in
vitro (Bradley et al., 1966, Pluznik et al., 1965).
\newpage
Se obtienen aproximadamente 30 ml de aspirado de
médula ósea normal, sana, recién preparada, a partir de individuos.
En condiciones estériles, se diluyen muestras a 1:5 con una
solución 1XPBS (Nº 14040.059 Life Technologies, Gaithersburg, MD.)
en un tubo cónico de 50 ml (Nº 25339-50 Corning,
Corning MD). Se deposita Ficoll (Histopaque-1077
Sigma H-8889) debajo de la muestra diluida y se
centrifuga a 300 x g durante 30 minutos. La banda de células
mononucleares se retira y se lava dos veces en 1XPBS y una vez con
BSA PBS al 1% (CellPro Co., Bothel, WA). Se cuentan las células
mononucleares y se seleccionan las células CD34+ usando la columna
del Kit Ceprate LC (CD34) (CellPro Co., Bothel, WA). Esta
fraccionación se realiza porque todas las células madre y
progenitoras dentro de la médula ósea presentan el antígeno
superficial CD34. Como alternativa, puede usarse médula ósea entera
o sangre periférica.
Se establecen cultivos en pocillos por triplicado
con un volumen final de 0,1 ml en placas de cultivo de tejidos de
48 pocillos (Nº 3548 Costar, Cambridge, MA). El medio de cultivo se
adquiere en Terry Fox Labs. (medio HCC-4330 (Terry
Fox Labs, Vancouver, B.C., Canadá)). Se añaden
600-1000 células CD34+ por pocillo. Se añaden
IL-3 nativa y molécula de fusión para proporcionar
concentraciones finales que varían de 0,001 nM a 10 nM. Se añaden
G-CSF y GM-CSF y ligando
C-Kit a una concentración final de 0,1 nm. La
IL-3 nativa y las moléculas de fusión se suministran
internamente. El ligando C-Kit (Nº
255-CS), el G-CSF (Nº
214-CS) y el GM-CSF (Nº
215-GM) se adquieren en R&D Systems
(Minneapolis, MN). Los cultivos se resuspenden usando un repetidor
Eppendorf y se distribuyen 0,1 ml por pocillo. Los cultivos de
control (respuesta basal) no recibieron factores estimuladores de
colonias. Los cultivos de control positivo recibieron medio
acondicionado (células humanas estimuladas con PHA: Terry Fox Lab.
H2400). Los cultivos se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} en
aire humidificado.
Las colonias hematopoyéticas que se consideran
mayores de 50 células se cuentan en el día de la respuesta máxima
(días 10-11) usando un microcospio de fase inversa
Nikon con una combinación de objetivos de 40 aumentos. Los grupos de
células que contienen menos de 50 células se denominan
agrupamientos. Como alternativa, las colonias pueden identificarse
extendiendo las colonias en un portaobjetos y sometiéndolas a una
tinción o pueden recogerse, resuspenderse y centrifugarse en
portaobjetos Cytospin para la tinción.
Tradicionalmente se usan células de médula ósea
para realizar ensayos in vitro de la actividad del factor
estimulador de colonias (CSF) hematopoyético. Sin embargo, no
siempre se dispone de médula ósea humana, y existe una variabilidad
considerable entre los donadores. La sangre del cordón umbilical es
comparable a la médula ósea como fuente de células madre
hematopoyéticas y progenitores (Broxmeyer et al., 1992; Mayani et
al., 1993). A diferencia de la médula ósea, la sangre de cordón se
puede adquirir más fácilmente de una base regular. También se puede
reducir la variabilidad del ensayo reuniendo células obtenidas
recientemente de varios donadores o crear un banco de células
crioconservadas para este fin. Por medio de la modificación de las
condiciones de cultivo y/o del análisis de los marcadores
específicos de linaje, debe ser posible realizar un ensayo
específicamente con respecto a las colonias de
granulocitos/macrófagos (CFU-GM), con respecto a la
actividad CSF de megacariocitos, o con respecto a la actividad de
células formadoras de colonias con un alto potencial proliferativo
(HPP-CFC).
Se aíslan células mononucleares (MNC) a partir de
sangre de cordón en las 24 horas posteriores a su obtención, usando
un gradiente de densidad convencional (1,077 g/ml de Histopaque).
Se han enriquecido adicionalmente MNC de sangre de cordón con
respecto a células madre y progenitoras mediante varios
procedimientos, incluyendo la selección inmunomagnética de células
CD14-, CD34+; la visualización de la fracción SBA-, CD34+ usando
matraces recubiertos de Applied Immune Science (Santa Clara, CA); y
la selección de CD34+ usando una columna de avidina CellPro
(Bothell, WA). Para el ensayo se usan fracciones enriquecidas en
células CD34+ crioconservadas o aisladas recientemente. Se preparan
cultivos por duplicado para cada dilución en serie de la muestra
(intervalo de concentraciones de 1 pm a 1204 pm) con 1 x 104
células en 1 ml de medio que contiene un 0,9% de metocelulosa sin
factores de crecimiento adicionales (Methocult H4230 de Stem Cell
Technologies, Vancouver, BC). En algunos experimentos, se usó
Methocult H4330 que contenía eritropoyetina (EPO) en lugar de
Methocult H4230 o Factor de Células Madre (SCF), y se añadieron 50
ng/ml (Biosource International, Camarillo, CA). Después del cultivo
durante 7-9 días, se cuentan las colonias que
contienen >30 células. Para descartar la variación subjetiva en
la puntuación, los ensayos se puntúan siguiendo un diseño ciego.
El siguiente ensayo se usa para medir la
liberación de sulfidoleucotrieno mediada por IL-3 a
partir de células mononucleares humanas.
Se recoge sangre humana que contiene heparina y
se deposita sobre un volumen igual de medio de
Ficoll-Paque (Pharmacia Nº
17-0840-02) listo para el uso (con
una densidad de 1,077 g/ml). El Ficoll se calienta a temperatura
ambiente antes del uso y se utilizan tubos de poliestireno
transparentes de 50 ml. El gradiente de Ficoll se centrifuga a 300 x
g durante 30 minutos a temperatura ambiente usando un rotor H1000B
en una centrífuga refrigerada Sorvall RT6000B. La banda que
contiene las células mononucleares se retira cuidadosamente, el
volumen se ajusta a 50 ml con solución salina tamponada con fosfato
de Dulbecco (Gibco Laboratories, Nº de cat. 310-4040
PK), se centrifuga a 400 x g durante 10 minutos a 4ºC y el
sobrenadante se retira cuidadosamente. El sedimento celular se lava
dos veces con tampón HA [Hepes 20 mM (Sigma Nº
H-3375), NaCl 125 mM (Fischer Nº
S271-500), KCl 5 mM (Sigma Nº
P-9541), glucosa 0,5 mM (Sigma Nº
G-5000), albúmina de suero humano al 0,025%
(Calbiochem Nº 126654) y se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos
a 4ºC. Las células se resuspenden en tampón HACM (tampón HA
suplementado con CaCl2 1 mM (Fisher Nº C79-500) y
MgCl2 1 mM (Fisher Nº M-33) a una concentración de 1
x 106 células/ml y se transfieren 180 \mul a cada pocillo de
placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se deja que las células
se aclimaten a 37ºC durante 15 minutos. Las células se ceban
añadiendo 10 \mul de una solución madre 20 X de diversas
concentraciones de citoquina a cada pocillo (típicamente IL3 100000,
20000, 4000, 800, 160, 32, 6,4, 1,28 y 0 fM). Las células se
incuban durante 15 minutos a 37ºC. La liberación de
sulfidoleucotrieno se activa por la adición de 10 \mul de 20 X
(1000 nM) de fmet-leu-phe
(Calbiochem Nº 344252) a una concentración final de FMLP 50 nM e
incubando durante 10 minutos a 37ºC. Las placas se centrifugan a
350 x g a 4ºC durante 20 minutos. Los sobrenadantes se retiran y se
ensayan con respecto a los sulfidoleucotrienos usando el kit de EIA
de Leucotrieno C4 de Cayman (Nº de Cat. 420211) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La hIL-3 nativa se
procesa como un control convencional en cada ensayo.
Pueden encontrase otros detalles conocidos para
los especialistas en la técnica en T. Maniatis, et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory (1982) y referencias citadas en dicho documento,
incorporado en este documento como referencia; y en J. Sambrook, et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory (1989), y referencias citadas en dicho
documento, incorporado en este documento como referencia.
En el documento WO 94/12639, publicado el 9 de
junio de 1994, pueden encontrarse detalles adicionales sobre las
variantes de IL-3 de la presente invención.
En los documentos WO 92/04455 y WO 91/02754
pueden encontrarse detalles adicionales sobre cómo fabricar la
proteína de fusión.
En las Patentes de Estados Unidos 4.810.643,
5.218.092 y en la Solicitud de Patente E.P. 02174004 pueden
encontrarse detalles adicionales sobre los CSF y las variantes de
los mismos.
Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención
con más detalle, aunque se entenderá que la invención no se limita
a estos ejemplos específicos.
Construcción de un plásmido que codifica una
proteína de fusión compuesta de la proteína variante de
IL-3 encontrada en el plásmido pMON13252 (documento
WO94/12639 publicado el 9 de junio de 1994), seguida de un sitio de
escisión proteolítica del factor Xa, seguido de la región de
bisagra de la IgG 2b murina, en la que las cisteínas se han
reemplazado por serinas, como secuencia de engarce polipeptídica
entre las dos proteínas de la fusión, y seguida de
G-CSF. El plásmido, pMON13252, se digiere con EcoRI
(que está interno en el gen de la variante de IL-3)
y HindIII (que está después de los codones stop para la variante de
IL-3) y se purifica el fragmento de restricción
EcoRI, HindIII de 3900 pares de bases. Los elementos genéticos
derivados de pMON13252 son el gen de la
beta-lactamasa (AMP), el origen de replicación de
pBR327, el promotor recA, el sitio de unión a ribosomas de g10L, las
bases que codifican los aminoácidos 15-105 del gen
de la variante (15-125)IL-3 y
el origen de replicación del fago f1. Se diseñan pares de
oligonucleótidos sintéticos complementarios para reemplazar la
porción del gen de la variante de IL-3 después del
sitio EcoRI (bases que codifican los aminoácidos
106-125), la secuencia de ADN que codifica el sitio
de escisión del factor Xa, la secuencia de ADN que codifica el
engarce polipeptídico y un sitio de restricción Af1III para
permitir la clonación del segundo gen en la fusión. Cuando se
ensamblan de manera apropiada, los oligonucleótidos producen una
secuencia de ADN que codifica los componentes mencionados
anteriormente en fase, con extremos de restricción EcoRI y HindIII.
Dentro de esta secuencia de ADN, también se crean sitios de
restricción únicos para permitir el reemplazo posterior de regiones
específicas por una secuencia que tenga una función similar (por
ejemplo, una región de engarce polipeptídica alternativa). Se crea
un sitio de restricción SnaBI único en el extremo de gen de 13252
que permite la clonación de otros genes en la posición
C-terminal de la fusión. Se crea un sitio XmaI único
entre la secuencia que codifica el sitio de escisión del factor Xa
y la región que codifica el engarce polipeptídico. Se crea un sitio
Af1III único después de la región de engarce que permite la
clonación de la proteína N-terminal de la fusión.
El fragmento 3900 pares de bases de pMON13252 se une con los
oligonucleótidos ensamblados y se utiliza para transformar una cepa
de E. Coli apropiada. Los clones resultantes se seleccionan
por medio de análisis de restricción y se secuencia el ADN para
confirmar que se crea la secuencia de ADN deseada. El plásmido
resultante se usa como intermedio en el que pueden clonarse otros
genes en forma de un fragmento NcoI,HindIII en los sitios Af1III y
HindIII para crear la fusión deseada. Los salientes creados por
NcoI y Af1III son compatibles, pero las secuencias flanqueantes de
los sitios de reconocimiento de restricción son diferentes. Los
sitios NcoI y Af1III se pierden como resultado de la clonación. Los
sitios de las restricciones mencionados anteriormente se usan como
ejemplos y no se limitan a los descritos. También puede crearse por
ingeniería genética otro sitio de restricción único que tenga la
función de permitir el reemplazo de las regiones. El plásmido que
codifica la fusión resultante es ADN secuenciado para confirmar que
se obtiene la secuencia de ADN deseada. Otros genes de la variante
de IL-3 u otros genes de factores estimuladores de
colonias pueden alterarse de una manera similar por técnicas de
ingeniería genética para crear los sitios de restricción apropiados
que permitan la clonación en la posición C-terminal
o N-terminal de la construcción de fusión descrita
anteriormente. Asimismo, pueden crearse por ingeniería genética
sitios de escisión por peptidasa o engarces polipeptídicos
alternativos en los plásmidos de fusión.
El plásmido, pMON13252, codifica la variante
(15-125)hIL-3 con la
siguiente secuencia de aminoácidos (documento WO 94/12639, páginas
214, 215):
Se cultivan durante una noche cepas de E.
Coli que llevan los plásmidos de interés a 37ºC y se diluyen a
la mañana siguiente, aproximadamente a 1/50, en medio M9 reciente
más casaminoácidos. El cultivo se desarrolla a 37ºC durante tres a
cuatro horas hasta la mitad del crecimiento logarítmico
(OD600=\sim1) con agitación vigorosa. Se añade ácido nalidíxico
(10 mg/ml) en NaOH 0,1 N a una concentración final de 50 \mug/ml.
Los cultivos se desarrollan a 37ºC durante tres a cuatro horas
después de la adición de ácido nalidíxico. A lo largo de todo el
crecimiento bacteriano se mantiene un alto grado de aireación para
conseguir la producción máxima de la proteína de fusión deseada. En
los casos en los que las proteínas de fusión se producen como
cuerpos de inclusión insoluble en E. Coli, las células se
examinan con un microscopio óptico para comprobar la presencia de
cuerpos refractarios (RB).
La primera etapa en la purificación de las
moléculas de fusión es sonicar las células. Se resuspenden
alícuotas del cultivo procedentes de sedimentos celulares en tampón
de sonicación: Tris 10 mM, pH 8,0 EDTA 1 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,1
mM. Estas células resuspendidas se someten a varios estallidos de
sonicación repetidos usando la micropunta de un rompedor de células
Sonicator, modelo W-375 obtenido en Heat
Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, Nueva York).
El grado de sonicación se controla examinando los homogeneizados
con un microscopio óptico. Cuando casi todas las células se han
roto, los homogeneizados se fraccionan por centrifugación. Los
sedimentos, que contienen la mayoría de los cuerpos refractarios,
están muy enriquecidos con proteínas de fusión.
Las proteínas de fusión que se producen como
cuerpos de inclusión insolubles en E. Coli pueden
solubilizarse en altas concentraciones de desnaturalizante, tales
como guanidina HCl o urea que incluyen ditiotreitol o beta
mercaptoetanol como agente reductor. El plegamiento de la proteína
en una conformación activa puede conseguirse por medio de una
diálisis secuencial a concentraciones menores de desnaturalizante
sin agente reductor.
En algunos casos, las proteínas plegadas pueden
purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como
mAbs o subunidades de receptores unidas a una matriz adecuada. Como
alternativa, (o además) la purificación puede realizarse usando una
cualquiera de una diversidad de métodos cromatográficos tales como:
intercambio iónico, exclusión molecular o cromatografía hidrófoba o
HPLC de fase inversa. Estos y otros métodos de purificación de
proteínas se describen con detalle en Methods in Enzymology,
Volumen 182 ``Guide to Protein Purification'' editado por Murray
Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990).
La concentración proteica de la proteína de
fusión puede determinarse usando un ELISA de sándwich basado en un
anticuerpo policlonal purificado por afinidad. Como alternativa, la
concentración proteica puede determinarse por composición de
aminoácidos. La bioactividad de la molécula de fusión puede
determinarse en varios ensayos in vitro en comparación con la
IL-3 nativa, la variante de IL-3 o
el G-CSF solo o conjuntamente. Uno de tales ensayos
es el ensayo de proliferación de células AML-193.
Las células AML-193 responden a IL-3
y a C-GSF, lo cual permite determinar la
bioactividad combinada de la fusión de variante de
IL-3/G-CSF. Además, pueden usarse
otras líneas celulares dependientes de factores, tales como 32D que
es una línea celular dependiente de IL-3 murina. La
actividad de IL-3 es específica de especie,
mientras que G-CSF no lo es, por lo tanto, puede
determinarse independientemente la bioactividad del componente
G-CSF de la fusión variante de
IL-3/G-CSF. El ensayo de
metilcelulosa puede usarse para determinar el efecto de la proteína
de fusión de variante de IL-3/G-CSF
sobre la expansión de las células progenitoras hematopoyéticas y el
patrón de los diferentes tipos de colonias hematopoyéticas in
vitro. El ensayo de metilcelulosa también puede proporcionar
una estimación de la frecuencia de precursores, ya que se mide la
frecuencia de progenitores por 100.000 células de entrada. Se han
usado cultivos dependientes de estroma a largo plazo para definir
progenitores hematopoyéticos y células madre primitivas. Este
ensayo puede usarse para determinar si la proteína de fusión
estimula la expansión de progenitores y/o células madre primitivas.
Además, pueden realizarse cultivos de dilución limitante que
indicarán la frecuencia de los progenitores primitivos estimulados
por las moléculas de fusión.
El sitio de escisión del factor Xa es útil para
escindir la proteína de fusión después de que se haya purificado y
replegado para separar los componentes IL-3 y
G-CSF de la fusión. Después de la escisión con el
factor Xa, los componentes IL-3 y
G-CSF de la fusión pueden purificarse hasta la
homogeneidad y ensayarse por separado para demostrar que ambos
componentes están en una conformación activa después de expresarse,
replegarse y purificarse como una fusión.
En este documento se muestran aminoácidos
mediante las abreviaturas convencionales de una o tres letras, como
se indica a continuación:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Denominación abreviada \+ \+ Aminoácido\cr A \+ Ala \+ Alanina\cr
C \+ Cys \+ Cisteína\cr D \+ Asp \+ Ácido aspártico\cr E \+ Glu \+
Ácido glutámico\cr F \+ Phe \+ Fenilalanina\cr G \+ Gly \+
Glicina\cr H \+ His \+ Histidina\cr I \+ Ile \+ Isoleucina\cr K
\+ Lys \+ Lisina\cr L \+ Leu \+ Leucina\cr M \+ Met \+
Metionina\cr N \+ Asn \+ Asparagina\cr P \+ Pro \+ Prolina\cr Q
\+ Gln \+ Glutamina\cr R \+ Arg \+ Arginina\cr S \+ Ser \+
Serina\cr T \+ Thr \+ Treonina\cr V \+ Val \+ Valina\cr W \+ Trp
\+ Triptófano\cr Y \+ Tyr \+
Tirosina\cr}
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Claims (10)
1. Una proteína de fusión que consta de:
- a)
- una variante interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a.1-133), donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:
- la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;
- la posición 45 es Val, Met o Asn;
- la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;
- la posición 50 es Asp;
- la posición 51 es Pro o Thr;
- la posición 62 es Pro;
- la posición 76 es Pro;
- la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;
- la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;
- la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;
- la posición 100 es Arg;
- la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;
- la posición 105 es Pro;
- la posición 108 es Ala o Ser;
- la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;
- la posición 121 es Ile;
- la posición 122 es Ile;
- la posición 123 es Met o Glu; y
donde de 1 a 14 aminoácidos pueden delecionarse
opcionalmente del extremo N y/o de 1 a 15 aminoácidos pueden
delecionarse opcionalmente del extremo C de dicho polipéptido
mutante de interleuquina-3 humana.
- b)
- un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético; y
opcionalmente un engarce entre las secuencias de
a) y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o
Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína
de fusión.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
donde en dicho polipéptido variante de la
interleuquina-3 humana se han delecionado de 1 a 14
aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se han
delecionado de 1 a 15 aminoácidos del extremo C (posiciones 119 a
133) de dicho polipéptido variante de
interleuquina-3 humana.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o
2, en la que en dicho polipéptido variante de la
interleuquina-3 humana se han delecionado de 1 a 14
aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se han delecionado
de 1 a 8 aminoácidos del extremo C (posiciones 126 a 133) de dicho
polipéptido variante de interleuquina-3 humana.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
2 o 3, donde dicho factor se selecciona entre el grupo compuesto
por: GM-CSF, CSF-1,
G-CSF, G-CSF (Ser^{17}),
Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina
(EPO), IL-1, IL-4,
IL-2, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-13, LIF, ligando flt3/flk2, hormona de
crecimiento humana, factor de crecimiento de células B, factor de
diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos
y factor de células madre (SCF).
5. La proteína de fusión de la reivindicación 4,
en la que dicho factor se selecciona entre el grupo compuesto por:
G-CSF, GM-CSF y
G-CSF (Ser^{17}).
6. Una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de una de
las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica la
proteína de fusión de una de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un método para producir una proteína de
fusión, que comprende: cultivar en un medio de crecimiento una
célula hospedadora transformada con un vector de expresión que
comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 de
una manera que permita la expresión de dicha proteína de fusión, y
recuperar dicha proteína de fusión.
9. La proteína de fusión de una de las
reivindicaciones 1 a 5, para uso para el tratamiento de situaciones
en las que se desea un aumento de la producción de células
hematopoyéticas.
10. Uso de la proteína de fusión de una de las
reivindicaciones 1 a 5 para preparar un medicamento para el
tratamiento de situaciones en las que se desea la producción de
células hematopoyéticas.
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