ES2181554B1

ES2181554B1 - Nuevas sales de iminio derivadas de 1,3-dimetilpropilenureas (dmpu).

Info

Publication number: ES2181554B1
Application number: ES200002651A
Authority: ES
Inventors: Miguel Angel Bailen Latorre; Rafael Chinchilla Cruz; David John Dodsworth; Carmen Najera Domingo; Miguel Yus Astiz
Original assignee: ASAC Cia Biotecnologia e Investigacion SA; Universidad de Alicante
Current assignee: ASAC Cia Biotecnologia e Investigacion SA; Universidad de Alicante
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2000-11-03
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2020-11-03
Also published as: ES2181554A1

Abstract

Nuevas sales de iminio, su síntesis y su utilización como reactivo para la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos para formar péptidos. En particular, la invención describe nuevos reactivos de acoplamiento obtenidos a partir de 1,3-dimetilpropilenureas.

Description

Nuevas sales de iminio derivadas de 1,3-dimetilpropilenureas (DMPU).

Campo de la invención

La invención describe nuevas sales de iminio, su síntesis y su utilización como reactivo para la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos para formar péptidos. En particular, la invención describe nuevos reactivos de acoplamiento obtenidos a partir de 1,3-dimetilpropilenureas.

Antecedentes de la invención

Se conocen multitud de péptidos útiles como medicamentos, por lo que la mejora en sus procedimientos de síntesis implica importantes incentivos económicos. En su preparación, el paso crucial es la formación del enlace peptídico, es decir el enlace amida entre aminoácidos protegidos u otros fragmentos peptídicos. La formación de este enlace amida requiere previamente la activación del grupo carboxílico antes de la reacción con la amina. Para conseguir esta activación y, por tanto, la formación de este enlace se han desarrollado multitud de reactivos de acoplamiento peptídico, tanto en solución, mediante métodos clásicos de síntesis, o bien usando soportes sólidos.

Uno de los principales problemas que se encuentran al utilizar un reactivo de acoplamiento peptídico es la racemización total o parcial de los residuos de aminoácido, una reacción indeseable producida generalmente mediante formación de la oxazolona correspondiente. Asimismo, son problemas añadidos la formación de productos secundarios, tales como dicetopiperazinas, o bien la formación de guanidinas o N-carboxianhídridos (Humphrey, J. M.; Chamberlain, A. R. Chem. Rev. 1997, 97, 2243. Albericio, F.; Bofill, J. M.; El-Faham, A.; Kates, S. A. J. Org. Chem. 1998, 63, 9678).

Otros reactivos utilizados para la formación del acoplamiento peptídico han sido las carbodiimidas bien solas o en combinación con otros aditivos tales como 1-hidroxi-7-benzotriazol (HOBt: König, W.; Geiger, R. Chem. Ber. 1970, 103, 788) o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt: ver por ejemplo: Carpino, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397).

También se han empleado reactivos del tipo del ácido hidroxámico, en combinación con una carbodiimida, tales como N-hidroxisuccinimida (HONSu: Anderson, G. W.; Zimmerman, J. E.; Callahan, F. H. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 3039), 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HODhbt: König, W.; Geiger, R. Chem. Ver. 1970, 103, 2024), N-hidroxiftalimida (HOPht: Nefkens, G. H. L.; Tesser, G. F. J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 1263), endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida (HONB: Fujino, M.; Kobayashi, S.; Obayashi, M.; Fukuda, T.; Shinagawa, S.; Nishimura, O. Chem. Pharm. Bull. 1974, 22, 1867) o N-hidroxi-1,2-dihidro-2-oxopiridina (HOPyr: König, W.; Geiger, R. Chem. Ver. 1973, 106, 3626).

El uso de carbodiimidas se está viendo superado por el de sales de aminio y fosfonio. Así, son reactivos muy utilizados las sales de aminio derivadas de HOBt, por ejemplo, hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-bis(tetrametilen)uronio (HBTU: Dourtoglou, V.; Gross, B.; Lambropoulou, V.; Zioudrou, C. Synthesis 1984, 572) o tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-bis(tetrametilen)uronio (TBTU: Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927), o bien de HOAt, por ejemplo hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU: Carpino, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397). También las sales de fosfonio derivadas de HOBt, por ejemplo hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio (BOP: Castro, B.; Dormoy, J.-R. Tetrahedron Lett.1973, 3243) o HOAt, por ejemplo hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-il)oxitris(dimetilamino)fosfonio (AOP: Carpino, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 4397). Asimismo, se han empleado sales de halouronio o halofosfonio, por ejemplo hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrop: Coste, J.; Frerot, E.; Jouin, P.; Castro, B. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967), o el hexafluorofosfato de 2-cloro-1,3-dimetilimidazolidinio (CIP: Akaji, K.; Kuriyama, N.; Kiso, Y. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 3315).

Para la preparación de estas sales de aminio o fosfonio se utilizan como productos de partida ureas o fosforoamidas, respectivamente. Al finalizar la reacción de acoplamiento estos compuestos son liberados, lo que hace que el utilizar especies de baja toxicidad evite problemas de contaminación ambiental, puesto que muchas de estos productos son parcialmente solubles en agua y, por tanto, difíciles de separar de las aguas utilizadas en los procesos extractivos. Esto ha hecho que sales de fosfonio derivadas de la triamida del ácido hexametilfosfórico (HMPA), como los señalados BOP y AOP se encuentren en desuso dado que la HMPA esta clasificada como un potencial cancerígeno (ver R. R. Dykstra, en ``Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis'', L. A. Paquette, ed., vol. 4, p. 2668. Wiley, Chichester, UK, 1995; ver además RTECS nº TDO875000). Por otra parte, las sales de iminio mas utilizadas como reactivos de acoplamiento son derivadas de la 1,1,3,3-tetrametilurea (TMU), como es el caso de HBTU, TBTU o HATU. La TMU está registrada como reactivo al que se le han descubierto propiedades como mutágeno que provoca trastornos reproductivos (ver RTECS nº YU2625000).

Por tanto, resulta de alto interés el desarrollo de nuevos reactivos de acoplamiento peptídico que, no sólo fueran económicos y sencillos de preparar, sino que además diesen lugar a los residuos menos contaminantes posibles.

Los documentos más cercanos a la invención (HAMTU: Albericio, F.; Bofill, J. M.; El-Faham, A.; Kates, S. A. J. Org. Chem. 1998, 63, 9678 y Carpino, L. A.; El-Faham, A.; Minor, C. A.; Albericio, F. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994, 201) describen el uso del HAMTU [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,3 -dimetil-1,3-trimetiluronio], obtenido por reacción del HOAt con 1,3-dimetilpropilenurea, como reactivos de acoplamiento en la síntesis de péptidos. Sin embargo, el uso del HAMTU plantea unos problemas tales como el elevado precio del HOAt y principalmente la escasa estabilidad hidrolítica del HAMTU en disolución como se describe en Albericio, F.; Bofill, J. M.; El-Faham, A.; Kates, S. A. J. Org. Chem. 1998, 63, 9678.

El problema técnico objeto de la presente invención consiste en proporcionar nuevos reactivos utilizables para el acoplamiento peptídico que tengan una elevada estabilidad en disolución, produzcan elevados rendimientos, reduzcan el grado de epimerización en la síntesis de péptidos, sean económicamente adsequibles y carezcan de toxicidad.

Sorprendentemente, otros derivados de la 1,3-dimetilpropilenurea diferentes del HAMTU son idóneos para el acoplamiento peptídico por su estabilidad hidrolítica, elevados rendimientos y disminución del grado de epimerización.

Siendo objetivo prioritario de esta invención, las sales de iminio son derivadas de la 1,3-dimetilpropilenurea que se obtienen por reacción de las mismas con cloruro de oxalilo o con trifosgeno y posterior reacción con diferentes nucleófilos. Los nucleófilos pueden ser de diferente naturaleza, por ejemplo del tipo:

- ROH, donde R representa un resto heterociclo monocíclico o bicíclico, por ejemplo N-hidroxisuccininimida o endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida (HONSu o HONB)

- RS, donde R representa un heterociclo, por ejemplo N-hidroxi-2-piridinotiona,

o

- Haluro, por ejemplo fluoruro.

Tras el intercambio del anión cloruro en las sales anteriores por los aniones hexafluorofosfato o tetrafluoroborato se obtienen sales de iminio que pueden ser utilizadas como nuevos reactivos para conseguir el acoplamiento peptídico.

Las sales de iminio obtenidas poseen una estabilidad hidrólitica elevada, pudiéndose almacenar los reactivos durante tiempo indefinido y ser empleadas en reacciones de formación de enlaces peptídicos. La adición de una pequeña proporción de HOAt en la mezcla de reacción produce un aumento del rendimiento y una disminución en la epimerización.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona unos nuevos reactivos para acoplamiento peptídico de fórmula general (I)

1

diferente al HAMTU

donde

X^{-} es BF_{4}^{-} o bien PF_{6}^{-} y

Z es un nucleófilo desprotonado, siendo preferentemente del tipo RO, RS o un haluro.

Donde R es un resto heterocíclico monocíclico o bicíclico.

Los derivados de la 1,3-dimetilpropilenurea son asequibles por un procedimiento que comprende:

a) Hacer reaccionar la 1,3-dimetilalquilenurea (DMPU, II) con cloruro de oxalilo o con trifosgeno en un disolvente orgánico. Tras evaporación del mismo se obtiene el derivado de fórmula (III)

2

b) Disolver el derivado (III) en un disolvente orgánico y realizar el intercambio del anión cloruro añadiendo a la mezcla anterior tetrafluoroborato de sodio o bien hexafluorofosfato de potasio.

c) Reacción de la mezcla obtenida con un nucleófilo, utilizándose de un modo preferente los nucleófilos del tipo ROH, RS o haluro, siendo R un resto heterocíclico monocíclico o bicíclico, por ejemplo:

3

en presencia de una base soluble en disolventes orgánicos como por ejemplo trietilamina, colidina, ó diisopropiletilamina para neutralizar el cloruro de hidrógeno formado durante la reacción.

d) Purificación del producto de reacción por cualquier método conocido por un experto en la materia, como la cristalización.

Como los nucleófilos empleados en la formación de nuevas sales de iminio se utilizaran preferiblemente aquellos que son disponibles comercialmente. Entre los compuestos de fórmulas IV-VII se encuentra la N-hidroxisuccinimida (IV) y la endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida (V). Dichos compuestos pueden adquirirse o pueden prepararse por métodos sintéticos bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Anderson, G. W.; Zimmerman, J. A.; Callahan, F. M. J. Am. Chem. Soc. 1964, 86, 1839 y Nefkens, G. H. L.; Resser, G. I. J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 1263). El compuesto de fórmula VI es comercialmente asequible o bien puede extraerse de una disolución comercial de 1-óxido de 2-piridinotiolato de sodio de acuerdo a un procedimiento conocido (Barton, D. H. R.; MacKinnon, J.; Perchet, R. N.; Tse, C.-L. Org. Synth. 1997, 75, 124).

Los derivados descritos en la invención son utilizados para realizar el acoplamiento peptídico por reacción del aminoácido o el péptido N-protegido con el clorhidrato del aminoéster) en DMF o acetonitrilo y derivados de fórmula I así obtenidos son útiles como agentes para realizar el acoplamiento peptídico.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención, consistente en la obtención de nuevos reactivos derivados de DMPU, sin que deban considerarse como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de O(succinimidil)-1,3-dimetilpropilenuronio

A una disolución de 1,3-dimetilpropilenurea (1,21 ml, 10 mmol) y N,N-dimetilformamida (4 gotas) en diclorometano (10 ml) se le añade cloruro de oxalilo (1,04 ml, 12 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 20ºC o bien trifosgeno (1,19 g, 12 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h y luego se calienta a reflujo durante 24 h. Se destila el diclorometano a presión reducida obteniéndose un residuo sólido. A este residuo se le añade diclorometano (2 x 5 ml) y se destila cada vez. De esta forma se preparara el derivado clorado de fórmula III en forma de un sólido amarillento. Este sólido se disuelve en acetonitrilo (10 ml), se añade hexafluorofosfato de potasio (2,2 g, 12 mmol) o bien tetrafluoroborato de sodio (1,3 g, 12 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante

\hbox{24 h}

. A la suspensión resultante se le añade la N-hidroxisuccinimida (1,15 g, 10 mmol) y trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 25ºC. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 h y luego se calienta a 50ºC durante 1 h. La suspensión resultante se filtra a través de una capa de celite y se lava el sólido con acetonitrilo. El disolvente se destila a presión reducida. En el caso del derivado con hexafluorofosfato, se añade etanol caliente (5 ml) y se agita durante 1 h a unos 40ºC. En el caso del derivado con tetrafluoroborato, al residuo resultante anterior se le añade una mezcla de metanol/isopropanol (50 ml, 1:5 v/v). Las suspensiones obtenidas en ambos casos se enfrían a unos 4ºC durante 2 h. El sólido se filtra, obteniéndose el hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de O-(succinimidil)-1,3-dimetilpropilenuronio (2 g, 54% y 2 g, 64%, respectivamente) como sólidos blancos de p.f.: 170-172ºC y 104-106ºC, respectivamente. Ejemplo 2 Hexafluorofosfato de O(5-norborneno-2,3-carboximidil)-1,3- dimetilpropilenuronio

El derivado clorado de fórmula III, preparado como se describe en el ejemplo 1, se disuelve en acetonitrilo (20 ml), se añade hexafluorofosfato de potasio (2,2 g, 12 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 h. A La suspensión resultante se le añade endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida (1,81 g, 11 mmol) y trietilamina (1,66 ml, 12 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 25ºC. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 h y luego se calienta a 50ºC durante 1 h. La suspensión que se obtiene se filtra a través de una capa de celite y se lava el sólido con acetonitrilo. El disolvente se destila a presión reducida. Al sólido resultante se le añade metanol (30 ml), se agita y se filtra, lavándose con metanol (2 x 10 ml). Se recristaliza en una mezcla de acetonitrilo/metanol obteniéndose el hexafluorofosfato de O-(5-norborneno-2,3-carboximidil)-1,3-dimetilpropilenuronio (2,44 g, 58%) como un sólido blanco, p.f.: 180ºC).

Ejemplo 3 Hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de S(1-óxido-2-tiopiridinil)-1,3-dimetilpropilenuronio

El derivado clorado de fórmula III, preparado como se describe en el ejemplo 1, se disuelve en acetonitrilo (20 ml), se añade hexafluorofosfato de potasio (2,2 g, 12 mmol) o tetrafluoroborato de sodio (1,3 g, 12 mmol), y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 24 h. A La suspensión resultante se le añade N-hidroxi-2-piridinotiona (1,27 g, 10 mmol) y trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 25ºC. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 4 h y luego se calienta a 50ºC durante 1 h. La suspensión que resulta se filtra a través de una capa de celite y se lava el sólido con acetonitrilo. El disolvente se destila a presión reducida. En el caso del derivado con hexafluorofosfato, al residuo resultante anterior se le añade una mezcla de metanol/isopropanol (50 ml, 1:5 v/v). En el caso del derivado con tetrafluoroborato, se añade etanol caliente (5 ml) y se agita durante 1 h a unos 40ºC. La suspensión. obtenida en ambos casos se enfría a unos 4ºC durante 2 h. El sólido resultante se filtra, obteniéndose el hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de S-(1-óxido-2-piridinil)-1,3-dimetilpropilenuronio (3,1 g, 81% y 1,95, 60%, respectivamente) como sólidos blancos de p.f.: 110-112ºC y 120-122ºC, respectivamente.

Ejemplo 4 Hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de 1,3-dimetiltrimetilenfluoroformamidinio

El derivado clorado de fórmula III, preparado como se describe en el ejemplo 1, se disuelve en acetonitrilo (20 ml), se añade hexafluorofosfato de potasio (2,4 g, 13 mmol) o tetrafluoroborato de sodio (1,4 g, 13 mmol) y fluoruro de potasio (0,75 g, 13 mmol). La suspensión resultante se calienta a 60ºC durante 3 h, se filtra a través de celite y se destila el disolvente a presión reducida. El residuo resultante, en el caso del derivado con hexafluorofosfato, se tritura con metanol caliente, mientras que en el caso del derivado con tetrafluoroborato se agita con una mezcla de metanol/isopropanol (50 ml, 1:5 v/v). La suspensión resultante en ambos casos se enfría y se filtra obteniéndose el hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de 1,3-dimetiltrimetilenfluoroformamidinio (2,1 g, 76% y 1,3 g, 60%, respectivamente) como sólidos blancos de p.f.: 195-197ºC y 205-207ºC, respectivamente.

Ejemplo 5 Procedimiento para el acoplamiento peptídico

Se disuelve el aminoácido o péptido N-protegido (0.5 mmol) y el clorhidrato del aminoéster (0.5 mmol) en DMF o acetonitrilo (5 ml) y se adiciona trietilamina o diisopropiletilamina (1 mmol) a temperatura ambiente. A la mezcla resultante se le añade el reactivo de acoplamiento (0.5 mmol) y la suspensión resultante se agita a temperatura ambiente entre 2-6 horas. Se añade una disolución saturada de NaCl (50 ml) y se extrae con acetato de etilo. Las fases orgánicas se lavan sucesivamente con ácido clorhídrico diluido, agua, bicarbonato sódico y agua. La fase orgánica se seca y se evapora, obteniéndose el péptido.

Ejemplo 6 Rendimientos y grado de epimerización

Sobre el péptido Cbz-Gly-Phe-Val-OMe obtenido por acoplamiento de Cbz-Gly, PheOH y ClH_{3}NValOMe se mide la relación de epímeros por RMN.

Los rendimientos y las relaciones de epímeros se detallan a continuación:

Hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de 1,3-dimetiltrimetilenfluoroformamidinio

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll} 
Rendimiento   \+  82% \\  Grado epimerización  \+  10:4
\\\end{tabular}\par

Hexafluorofosfato de O-(5-norborneno-2,3-carboximidil)-1,3 dimetilpropilenuronio

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll} 
Rendimiento    \+  74% \\  Grado epimerización   \+   10:1
\\\end{tabular}\par

Hexafluorofosfato o tetrafluoroborato de S-(1-óxido-2-tiopiridinil)-1,3-dimetilpropilenuronio

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll} 
Rendimiento   \+  70% \\  Grado de epimerización    \+ 10:0.8
\\\end{tabular}\par

\catcode`\#=12\nobreak\hskip-\tabcolsep\begin{tabular}{ll} 
Rendimiento     \+ 55% \\  Grado de epimerización    \+ 1:1
\\\end{tabular}\par

Sin embargo, mediante la adición de un 5% de HOAt como aditivo en la reacción se produce una disminución en la epimerización (1:0) y un aumento en el rendimiento.

Claims

1. Sales de iminio (I) caracterizadas por la fórmula

4

diferentes al hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,3 dimetil-1,3- trimetiluronio.

donde:

X^{-} es BF_{4}^{-} o PF_{6}^{-}

Z es RO, RS, o flúor, donde R es un radical heterocíclico monocíclico o bicíclico.

2. Sales de iminio según la reivindicación 1 caracterizadas porque el radical R es succinimidilo.

3. Sales de iminio según la reivindicación 1 caracterizadas porque el radical R es 5-norborneno-2,3-dicarboximidilo.

4. Sales de iminio según la reivindicación 1 caracterizadas porque el radical R es 1-óxido-2-tiopiridinilo.

5. Procedimiento de obtención de sales de iminio según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque comprende los pasos de:

a): Reacción de la 1,3-dimetilpropilenurea con cloruro de oxalilo o trifosgeno en un disolvente orgánico para formar el derivado clorado de 1,3-dimetilpropilenurea (III).

b): Disolución del producto de reacción anterior (III) en un disolvente orgánico y reacción con tetrafluoroborato de sodio o hexafluorofosfato de potasio.

c): Reacción de la mezcla anterior con un nucleófilo en presencia de una amina terciaria.

d): Purificación de la mezcla de reacción.

6. Procedimiento de obtención de sales de iminio según la reivindicación 5 caracterizado porque el nucleófilo es N-hidroxisuccinimida.

7. Procedimiento de obtención de sales de iminio según la reivindicación 5 caracterizado porque el nucleófilo es endo-N-hidroxi-5-norborneno-2-3-dicarboximida.

8. Procedimiento de obtención de sales de iminio según la reivindicación 5 caracterizado porque el nucleófilo es N-hidroxi-2-piridinotiona.

9. Procedimiento de obtención de sales de iminio según la reivindicacion 5 caracterizado porque el nucleófilo es fluoruro potásico.

10. Uso de las sales de iminio según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 como reactivo de acoplamiento peptípico caracterizado porque reaccionan las sales de iminio con un péptido N-protegido, el clorhidrato del aminoéster y una amina terciaria en un disolvente orgánico.

11. Uso de las sales de iminio como reactivo acoplamiento peptídico según la reivindicación 12, caracterizado porque a la mezcla de polimerización se le añade 1-hidroxi-7-azabenzotriazol.