ES2140870T5 - Deteccion de potenciales transmembrana por metodos opticos. - Google Patents

Deteccion de potenciales transmembrana por metodos opticos.

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ES2140870T5 ES96921410T ES96921410T ES2140870T5 ES 2140870 T5 ES2140870 T5 ES 2140870T5 ES 96921410 T ES96921410 T ES 96921410T ES 96921410 T ES96921410 T ES 96921410T ES 2140870 T5 ES2140870 T5 ES 2140870T5
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Abstract

SE PRESENTAN LOS METODOS Y LAS COMPOSICIONES PARA DETERMINAR EL POTENCIAL DE UNA MEMBRANA. EN UN ASPECTO, EL METODO CONSISTE EN: A) LA INTRODUCCION DE UN PRIMER REACTIVO FORMADO POR UN ION HIDROFOBO FLUORESCENTE CAPAZ DE REDISTRIBUIRSE DESDE UN PRIMER LADO DE LA MEMBRANA A UN SEGUNDO LADO DE LA MEMBRANA COMO RESPUESTA A CAMBIOS EN EL POTENCIAL DE LA MEMBRANA, SEGUN SE DESCRIBE CON LA ECUACION DE NERST; B) LA INTRODUCCION DE UN SEGUNDO REACTIVO QUE MARCA EL PRIMER O EL SEGUNDO LADO DE LA MEMBRANA, ESTANDO FORMADO ESTE SEGUNDO REACTIVO POR UN CROMOFORO CAPAZ DE TRANSFERIR ENERGIA MEDIANTE I) LA DONACION DE LA ENERGIA EN ESTADO EXCITADO AL ION FLUORESCENTE, O II) LA ACEPTACION DE LA ENERGIA DEL ESTADO EXCITADO PROCEDENTE DEL ION FLUORESCENTE; C) LA EXPOSICION DE LA MEMBRANA A LA RADIACION; D) LA DETERMINACION DE LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA ENTRE EL ION FLUORESCENTE Y EL SEGUNDO REACTIVO; Y E) RELACIONAR LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA CON EL POTENCIAL DE MEMBRANA. LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA SE MIDE TIPICAMENTE MEDIANTE LA TRANSFERENCIA DE LA ENERGIA DE RESONANCIA DE FLUORESCENCIA. EN ALGUNAS REALIZACIONES EL PRIMER Y SEGUNDO REACTIVOS ESTAN UNIDOS MEDIANTE UN VINCULO ADECUADO. EN UNA REALIZACION, EL METODO SE UTILIZA PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE MODULEN LOS POTENCIALES DE MEMBRANA EN MEMBRANAS BIOLOGICAS.

Description

Detección de potenciales transmembrana por métodos ópticos.
Fundamentos de la invención
La presente invención se refiere en general a la detección y medida de potenciales transmembrana. En particular, la presente invención está dirigida a composiciones y métodos ópticos para determinación de potenciales transmembrana a través de la membrana plasmática de células biológicas.
Esta invención se realizó con ayuda del Gobierno de acuerdo con el contrato Nº R01 NS27177-07, otorgado por el National Institute of Health. El Gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
La detección y formación de imágenes por florescencia de la actividad eléctrica celular es una técnica de gran importancia y potencial (Grinvald, A., Frostig, R.D., Lieke, E., y Hildesheim, R. 1988. Formación óptica de imágenes de la actividad neuronal. Physiol. Rev. 68: 1285-1366; Salzberg, B.M. 1983. Registro óptico de la actividad eléctrica en las neuronas utilizando sondas moleculares. En "Current Methods in Cellular Neurobiology". J.D. Barker, compilador. Wiley, Nueva York. 139-187; Cohen, L.B. y S. Lesher. 1985. Control óptico del potencial de membrana: Métodos ópticos de medición multisitio. En "Optical Methods in Cell Physiology". P. de Weer y B.M. Salzberg, compiladores. Wiley, Nueva York. 71-99).
Los mecanismos para la detección óptica del potencial transmembrana se han dividido tradicionalmente en dos clases:
(1) redistribución sensible pero lenta de los iones permeantes del medio extracelular a la célula, y
(2) perturbaciones rápidas pero pequeñas de colorantes relativamente impermeantes unidos a una cara de la membrana plasmática. Véase, Loew, L.M., "How to choose a potentiometric membrane probe", en Spectroscopic Membrane Probes. L.M. Loew, compilador, 139-151 (1988) (CRC Press, Boca Raton); Loew, L.M., "Potentiometric Membrane Dyes", en Fluorescent and Luminiscent Probes for Biological Activity, W.T. Mason, compilador, 150-160 (1993) (Academic Press, San Diego).
Los iones permeantes son sensibles debido a que la relación de sus concentraciones entre el interior y el exterior de la célula puede cambiar hasta el límite de Nerst de 10 veces para un cambio de 60 mV en el potencial transmembrana. Sin embargo, sus respuestas son lentas debido a que, para establecer nuevos equilibrios, los iones tienen que difundirse a través de capas no agitadas en cada fase acuosa, y a la baja constante dieléctrica del interior de la membrana plasmática. Además, dichos colorantes se distribuyen indiscriminadamente en todos los sitios de fijación hidrófobos disponibles. Por esta razón, la selectividad entre tipos de células es difícil. Asimismo, cualesquiera adiciones de proteínas o reactivos hidrófobos a la solución externa, o cambios en la exposición a superficies hidrófobas, tienden a producir artefactos. Estos indicadores no logran tampoco producir desplazamiento alguno en las longitudes de onda de fluorescencia o la señal de salida ratiométrica. Tales lecturas de longitud de onda duales son útiles para evitar los artefactos debidos a variaciones en la concentración de colorante, recorrido, número de células, brillo de la fuente y eficiencia de detección.
En contraste, los colorantes no permeantes pueden responder muy rápidamente debido a que precisan poca o ninguna transposición. Sin embargo, dichos colorantes no permeantes son insensibles debido a que detectan el campo eléctrico solamente con una parte de una carga unitaria que se desplaza menos que la longitud de la molécula, lo que a su vez es sólo una pequeña fracción de la distancia a través de la membrana. Adicionalmente, una fracción significativa de la señal total del colorante proviene de moléculas que se encuentran situadas en membranas o células irrelevantes y que diluyen la señal procedente de las pocas moléculas situadas correctamente.
A la vista de los inconvenientes anteriores, se precisan métodos y composiciones que sean sensibles a pequeñas variaciones en los potenciales transmembrana y puedan responder a cambios de potencial de membrana tanto rápidos, preferiblemente en una escala de tiempo de milisegundos, como sostenidos. Se precisan también métodos y composiciones menos susceptibles a los efectos de cambios en la composición de la solución externa, más capaces de controlar selectivamente membranas de tipos de células específicos, y que proporcionen una señal de fluorescencia ratiométrica. Esta invención satisface dicha necesidad y otras análogas.
Adicionalmente, Rink et al. en Biochim. Biophys. Acta, Vol. 595, (1980), páginas 15-30, describen el uso de bis(1,3-dietiltiobarbiturato)-trimetino-oxonol como sonda fluorescente para medir potenciales transmembrana.
El documento US 4.560.665 describe un método de medida de fusiones de membrana entre liposomas constituidos por fosfolípidos, método que se caracteriza por la combinación de ionóforos, colorantes fluorescentes sensibles al potencial de membrana (interior negativo) y porinas, que son las proteínas que forman los poros de las membranas. Por este método, puede determinarse fácil y exactamente la extensión de la fusión de liposomas.
El documento US 4.861.727 da a conocer un sensor de oxígeno para la determinación de la presión parcial de oxígeno. El sensor de oxígeno comprende complejos de lantánidos luminiscentes extinguibles por oxígeno, preferiblemente complejos con terbio de ligandos de bases de Schiff o \beta-dicetonas.
Gutiérrez-Merino et al. en Biochemistry, Vol. 34, (1995), páginas 4846-4855, presentan un estudio de la distribución de los dos análogos fosfolipídicos fluorescentes a través de membranas ricas en el receptor de acetilcolina (AChR) de Torpedo marmorata por una combinación de transferencia de energía de resonancia por fluorescencia no radiactiva utilizando sondas lipídicas y extinción de su fluorescencia con Co^{2+} y ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico. El potencial de membrana se midió, entre otras cosas, utilizando Rho-PE exofacial con extinción de la fluorescencia por Co^{2+}.
El documento EP-A1-0 552 107 presenta un método para la determinación de pH o pCO_{2} utilizando períodos de vida luminiscentes y transferencia de energía, en el cual un par donante-aceptor de transferencia de energía se expone a una muestra a analizar, siendo el donante del par donante-aceptor fotoluminiscente y siendo el aceptor del par donante-aceptor sensible al pH o pCO_{2} de la muestra. Uno o ambos miembros del par donante-aceptor puede(n) estar unido(s) a un soporte. Adicionalmente, el donante y el aceptor pueden estar enlazados por un espaciador y están presentes en una relación conocida.
El documento WO 95/08637 se refiere a un inmunoensayo no competitivo para detectar la presencia de un analito desconocido en solución. El inmunoensayo comprende a) un receptor de canales iónicos inmovilizado en una película lipídica que está en contacto con una solución que contiene iones en ambos lados del mismo; b) un ligando, conjugado al receptor, que tiene afinidad particular para el analito en solución y que, después de fijación al analito en solución, causa una inhibición en el flujo iónico a través del canal; y c) medios para detectar la inhibición del flujo iónico a través del canal en respuesta a la fijación del ligando conjugado y el analito.
El documento EP-A-0 397 641 se refiere a un método para la determinación cuantitativa de uno o más parámetros químicos de un medio de muestra tal como la concentración de iones hidrógeno o concentración de Ba^{2+}, Mg^{2+}, Ca^{2+}, etc. El método emplea un agente fluorescente y un agente cromógeno estrechamente adyacente.
El documento EP-A-0 429 907 se refiere a un sensor con una construcción para un método de detección de moléculas marcadas con un colorante fluorescente para detectar estas sustancias disueltas por transferencia de energía con una técnica de fluorescencia.
Witzak describe "Oxonol - Luminophore mit funktionalisierten" Seinten Ketten Diplomarbeit, University of Düsseldorf 1994.
Bechtel describe ``Synthese von Styrylfarbstoffen mit Reaktivgruppen, Diplomarbeit, University of Düsseldorf 1994.
Sumario de la invención
Se proporcionan métodos y composiciones para la determinación del potencial eléctrico transmembrana (potencial de membrana), en particular a través de la membrana externa (plasmática) de las células vivas. En un aspecto, el método comprende:
(a) introducir un primer reactivo que comprende un ion hidrófobo fluorescente, que es capaz de redistribuirse desde una primera cara de la membrana a una segunda cara de la membrana en respuesta a los cambios en el potencial de la membrana, como se describe por la ecuación de Nernst,
(b) introducir un segundo reactivo que marca una cara, usualmente la cara extracelular de la membrana, comprendiendo dicho segundo reactivo un cromóforo, capaz de sufrir transferencia de energía sea por (i) donación de energía de estado excitado al ion fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado del ion fluorescente,
(c) exponer la membrana a luz de excitación de una longitud de onda apropiada, típicamente en la región ultravioleta o visible;
(d) medir la transferencia de energía entre el ion fluorescente y el segundo reactivo, y
(e) relacionar la extensión de la transferencia de energía con el potencial de membrana, en donde el primer reactivo y el segundo reactivo no están unidos covalentemente por un enlazador.
El segundo reactivo es preferiblemente un fluoróforo. En cada caso, la interacción de estado excitado puede proceder por transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET), lo cual se prefiere, o por cualquier otro mecanismo tal como transferencia de electrones, interacción de intercambio (Dexter), extinción paramagnética, o cruzamiento promovido entre sistemas. El método encuentra utilidad particular en la detección de cambios en el potencial de membrana de la membrana plasmática de las células biológicas.
Preferiblemente, el ion hidrófobo es un anión que marca la cara extracelular de la membrana plasmática. Por adición del anión hidrófobo fluorescente a la membrana, células, o preparación de tejido, el anión se reparte en la membrana plasmática, distribuyéndose en ella entre las superficies extracelular e intracelular de acuerdo con un equilibrio de que obece al postulado de Nernst. Los cambios en el potencial de membrana hacen que el anión fluorescente migre a través de la membrana de tal manera que puede continuar fijándose a aquella cara (la cara intracelular o extracelular) que esté cargada ahora positivamente. Dado que la eficiencia de transferencia de energía entre los dos reactivos es función de la distancia entre ellos, y que esta distancia varía a medida que el anión fluorescente se redistribuye hacia atrás y hacia adelante a través de la membrana, la medición de la transferencia de energía proporciona una medida sensible de los cambios en el potencial transmembrana. Por ejemplo, si el potencial de membrana (relación del intracelular al extracelular) cambia de negativo a positivo, el anión hidrófobo fluorescente es atraído desde la superficie extracelular a la superficie intracelular de la membrana plasmática. Si el segundo reactivo es uno que se encuentra en la cara extracelular, esto da como resultado un aumento de la distancia entre el anión y el segundo reactivo y una disminución concomitante en la eficiencia de FRET y la extinción entre las dos especies. Así pues, las mediciones de fluorescencia para longitudes de onda apropiadas de excitación y emisión proporcionan una lectura de fluorescencia que es sensible a los cambios en el potencial transmembrana. Típicamente, la constante de tiempo para la redistribución del anión fluorescente es rápida y está comprendida en la escala de tiempos de los milisegundos, permitiendo así la medición conveniente tanto de fenómenos eléctricos celulares rápidos tales como los potenciales de acción o la apertura de canales provocada por ligandos, como de cambios más lentos y más prolongados provocados por la alteración de la actividad de bombas o cambiadores iónicos.
Las técnicas electrofisiológicas convencionales leen el potencial en la punta de un electrodo y están limitadas por tanto a medidas de una sola célula. En contraste, los indicadores ópticos descritos en esta memoria son particularmente ventajosos para observar el potencial de membrana de muchas neuronas o células musculares simultáneamente. Los indicadores ópticos, al contrario que los microelectrodos convencionales, no requieren punción física de la membrana; en muchas células u orgánulos, dicha punción es altamente lesiva o mecánicamente difícil de realizar. Los indicadores ópticos son por tanto adecuados para células muy pequeñas o frágiles para ser atravesadas por electrodos.
En otro aspecto de la invención, los métodos de detección por voltaje permiten detectar el efecto de las muestras de ensayo, tales como moléculas de fármacos terapéuticos potenciales, sobre la activación/desactivación de transportadores de iones (canales, bombas, o cambiadores) embebidos en la membrana.
Las composiciones de la presente invención comprenden dos reactivos. El primer reactivo comprende un ion hidrófobo fluorescente (preferiblemente un anión) que es capaz de redistribuirse desde una cara de una membrana a la otra en respuesta a cambios en el potencial transmembrana. Se hace referencia a este anión como el anión móvil o hidrófobo. Aniones ilustrativos son polimetino-oxonoles, tetraaril-boratos conjugados a fluoróforos y complejos fluroescentes de tierras raras y metales de transición. El segundo reactivo comprende un cromóforo, preferiblemente un fluoróforo, capaz de sufrir transferencia de energía por (i) donación de energía de estado excitado al anión fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado del anión fluorescente. El segundo reactivo se fija selectivamente a una cara de la membrana y, al contrario que el primer reactivo, no se redistribuye en respuesta a los cambios de potencial transmembrana. Por esta razón, se hace referencia al mismo como el reactivo fijado asimétricamente o inmóvil. Como ejemplos de segundos reactivos se pueden citar lectinas fluorescentes, lípidos fluorescentes, carbohidratos fluorescentes, anticuerpos marcados fluorescentemente contra constituyentes de la superficie de la membrana, y colorantes fluorescentes anfifílicos.
Breve descripción de los dibujos
La invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
las Figs. 1A y 1B ilustran un esquema del mecanismo de FRET sensible al voltaje;
la Fig. 2 ilustra espectros de excitación y emisión normalizados para (A) aglutinina de germen de trigo marcada con fluoresceína (FL-WGA) en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS), (B) (1,3-dihexil-2-tiobarbiturato)trimetino-oxonol [DiSBA-C_{6}-(3)] en octanol, y (C) TR-WGA en HBSS;
la Fig. 3 ilustra corrientes de desplazamiento de DiSBA-C_{6}-(3) 2,3 \muM en células L-M(TK^{-}) a 20ºC;
la Fig. 4 ilustra la dependencia del voltaje de DiSBA-C_{6}-(3) movido durante el desplazamiento y las corrientes de cola para los cambios de voltaje de paso a partir de un potencial de retención de -30 mV;
la Fig. 5 ilustra la dependencia del voltaje de DiSBA-C_{6}-(3) de las constantes de tiempo de las corrientes de desplazamiento en células L-M(TK^{-}) para los mismos datos que se muestran en la Fig. 4;
la Fig. 6 ilustra cambios de fluorescencia simultáneos del par FL-WGA/DiSBA-C_{4}-(3) en respuesta a 4 despolarizaciones desde -70 mV de 40, 80, 120 y 160 mV en una célula L-M(TK^{-}) a 20ºC, representándose las trazas de emisión de fluorescencia de longitud de onda simple de DiSBA-C_{4}-(3) y FL-WGA en los paneles A y B, respectivamente, y representándose en (C) la relación FL-WGA/DiSBA-C_{4}-(3);
la Fig. 7 ilustra la evolución en el tiempo del cambio de fluorescencia del par FL-WGA/DiSBA-C_{10}-(3) en respuesta a una despolarización de 100 mV a partir de -70 mV;
la Fig. 8 ilustra una traza de barrido simple de cambios de relación de fluorescencia del par FL-WGA/DiSBA-C_{4}-(3) en miocitos cardíacos neonatales latientes, representando la traza superior (A) el canal FL-WGA, (B) el canal de oxonol de longitud de onda mayor y (C) la relación FL-WGA/oxonol, en la cual los artefactos de movimiento se reducen significativamente; y
la Fig. 9 ilustra los cambios de fluorescencia del par FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3) en una célula de astrocitoma inmovilizada por voltaje, siendo la traza superior (A) la emisión de DiSBA-C_{6}-(3), (B) la señal de fluorescencia de FL-WGA y (C) la relación FL-WGA/oxonol.
La Fig. 10 muestra la síntesis de un tetraaril-borato fluorescente.
La Fig. 11 muestra una síntesis de un oxonol asimétrico y su enlace a un segundo reactivo.
La Fig. 12 muestra puntos de enlace posibles (X) de oxonoles a un segundo reactivo, no reivindicados.
La Fig. 13 muestra una síntesis de DiSBA-C_{6}-(3).
la Fig. 14 muestra la síntesis de un enlazador bifuncional, no reivindicada.
Las Figs. 15 y 16 muestran la síntesis de un oxonol asimétrico con un enlazador adecuado para fijación a un segundo reactivo, no reivindicada.
La Fig. 17 muestra la FRET entre Cou-PE, un conjugado de una 6-cloro-7-hidroxicumarina con dimiristoilfosfatidiletanolamina, como donante FRET, y un bis-(1,3-dihexil-2-tiobarbiturato)-trimetino-oxonol en una célula de astrocitoma.
La Fig. 18 muestra la FRET entre DMPE-glicina-cumarina (Cou-PE) como donante FRET y un bis-(1,3-diexil-2-tiobarbiturato)-trimetino-oxonol en células L.
La Fig. 19 muestra la FRET entre DMPE-glicina-cumarina (Cou-PE) como donante FRET y un bis-(1,3-dihexil-2-tiobarbiturato-trimetino-oxonol en cardiomiocitos, medida por la señal de salida de relación.
La Fig. 20 muestra conjugados fluorescentes de fosfatidiletanolamina representativos que se comportan como donantes FRET para los oxonoles. Las estructuras de la izquierda muestran fluoróforos representativos y X denota el sitio de fijación de la fosfatidiletanolamina (PE). La estructura (PE-R) a la derecha muestra una fosfatidiletanolamina en la que R denota un fluoróforo unido a la amina de la etanolamina.
La Fig. 21 muestra (A) el espectro de emisión de la Cou-PE; (B) el espectro de excitación de DiSBA-C_{6}-(5); y (C) el espectro de emisión de DiSBA-C_{6}-(5).
La Fig. 22 muestra la tasa de transposición de DiSBA-C_{6}-(5) en respuesta a un paso de despolarización de 100 mV, utilizando FRET procedente de Cou-PE marcada asimétricamente.
La Fig. 23 muestra los espectros de [Tb(Salen)_{2}]^{-1} (arriba) y [Eu(Salen)_{2}]^{-1} (abajo), ambos como sales de piperidinio disueltas en acetonitrilo.
Descripción de la realización preferida
Las definiciones siguientes se presentan para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos utilizados para describir la invención de esta memoria.
El término "hidrocarbilo" hace referencia a un radical orgánico constituido por cadenas de carbonos a las cuales están unidos hidrógeno y otros elementos. El término incluye grupos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo, grupos que tienen una mezcla de enlaces saturados e insaturados y anillos carbocíclicos, e incluye combinaciones de tales grupos. Aquél puede referirse a estructuras de cadena lineal, de cadena ramificada, estructuras cíclicas o sus combinaciones.
El término "alquilo" hace referencia a un radical hidrocarbonado saturado, monovalente y acíclico, de cadena ramificada o lineal, con uno a veinte átomos de carbono.
El término "alquenilo" hace referencia a un radical hidrocarbonado insaturado que contiene al menos un enlace doble carbono-carbono e incluye radicales de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos.
El término "alquinilo" hace referencia a un radical hidrocarbonado insaturado que contiene al menos un enlace triple carbono-carbono e incluye radicales de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos.
El término "inferior", al que se hace referencia en esta memoria en conexión con radicales o compuestos orgánicos define respectivamente aquéllos que tienen hasta seis átomos de carbono inclusive, preferiblemente hasta cuatro átomos de carbono inclusive. Tales grupos pueden ser de cadena lineal o ramificados.
El término "heteroalquilo" hace referencia a un radical saturado monovalente acíclico, de cadena ramificada o lineal, con dos a cuarenta átomos en la cadena, en el cual al menos uno de los átomos de la cadena es un heteroátomo, tal como, por ejemplo, oxígeno o azufre.
La expresión "alquilo inferior" hace referencia a un radical alquilo con uno a seis átomos de carbono. Este término se ilustra adicionalmente por radicales tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, n-butilo y terc-butilo, n-hexilo y 3-metilpentilo.
El término "cicloalquilo" hace referencia a un radical carbocíclico saturado monovalente con tres a doce átomos de carbono en el carbociclo.
El término "heterocicloalquilo" hace referencia a un radical cíclico saturado monovalente con uno a doce átomos en el anillo, que tiene al menos un heteroátomo, tal como oxígeno o azufre, en el anillo.
El término "alquileno" hace referencia a un radical hidrocarbonado de cadena ramificada o lineal, bivalente, cíclico o acíclico y totalmente saturado con uno a cuarenta átomos de carbono. Este término se ilustra ulteriormente por radicales tales como metileno, etileno, n-propileno, 1-etiletileno, y n-heptileno.
El término "heteroalquileno" hace referencia a un radical alquileno en el cual al menos uno de los átomos de la cadena es un heteroátomo.
La expresión "heterociclo-diílo" hace referencia a un radical bivalente que contiene un anillo heterocíclico. Las valencias libres pueden encontrarse ambas en el anillo heterocíclico, o una o las dos pueden encontrarse en sustituyentes alquileno unidos como apéndice en el anillo.
La expresión "alquileno inferior" hace referencia a un radical hidrocarbonado de cadena ramificada o lineal, bivalente, acíclico y totalmente saturado, con uno a seis átomos de carbono. Esta expresión se ilustra adicionalmente por radicales tales como metileno, etileno, n-propileno, isopropileno, n-butileno, isobutileno (o 2-metilpropileno), isoamileno (o 3,3-dimetilpropileno), pentileno, y n-hexileno.
La expresión "cicloalquil-alquilo inferior" hace referencia a un grupo cicloalquilo unido como apéndice a un radical alquilo inferior. Este término se ilustra, pero sin carácter limitante, por grupos tales como ciclopropilmetilo, ciclopentilmetilo, ciclopentiletilo, y ciclopentilpropilo.
La expresión "fenilo sustituido" hace referencia a un grupo fenilo que está mono-, di-, tri- o tetra-sustituido, independientemente, con hidrocarbilo, alquilo, alquilo inferior, cicloalquilo o cicloalquil-alquilo inferior.
El término "arilo" hace referencia a un radical carbocíclico aromático monovalente que tiene un solo anillo (v.g., fenilo) o anillos múltiples condensados (v.g., naftilo, antracenilo), que pueden estar opcionalmente mono-, di-, o tri-sustituidos, independientemente, con hidrocarbilo, alquilo, alquilo inferior, cicloalquilo o cicloalquil-alquilo inferior. El término "arileno" hace referencia a un radical carbocíclico aromático bivalente. Las posiciones de valencia libres pueden encontrarse en cualquier posición en el o los anillos. En el caso de un radical fenilo bivalente, aquéllas pueden ser orto, meta o para una respecto a otra.
El término "aralquilo" hace referencia a un grupo arilo unido como apéndice a un radical alquilo inferior. Este término se ilustra, pero sin carácter limitante, por grupos tales como bencilo, 2-feniletilo y 2-(2-naftiletilo).
El término "aralquenilo" hace referencia a un grupo arilo unido como apéndice a un radical alquenilo totalmente conjugado. Este término se ilustra por estirenilo (cis y trans), 1-fenil-butadienilo y 1-naftil-butadienilo (con inclusión de todas las posibles combinaciones de los isómeros Z y E alrededor de los enlaces dobles).
El término "halo" hace referencia a fluoro, bromo, cloro y yodo.
La expresión "alquiltio inferior" hace referencia al grupo R-S-, donde R es alquilo inferior.
La expresión "grupo lábil" significa un grupo capaz de ser desplazado por un nucleófilo en una reacción química, por ejemplo halo, alquil-sulfonatos (v.g., metanosulfonato), aril-sulfonatos, fosfatos, ácido sulfónico, sales de ácido sulfónico, imidazólidos, N-hidroxi-succinimidas y análogos.
El término "enlazador" hace referencia a cualquier agrupación de átomos covalente, química y biológicamente compatible, que puede servir para enlazar entre sí los reactivos primero y segundo de esta invención
El término "anfifílico" hace referencia a una molécula que tiene una porción hidrófila y una porción hidrófoba.
Se proporcionan métodos y composiciones para detectar cambios en el potencial de membrana de los sistemas biológicos. Un aspecto del método de detección comprende:
(a) introducir un primer reactivo que comprende un anión hidrófobo fluorescente capaz de redistribuirse desde una primera cara de la membrana a una segunda cara de la membrana en respuesta a los cambios en el potencial de la membrana,
(b) introducir un segundo reactivo que marca la primera cara o la segunda cara de la membrana, comprendiendo dicho segundo reactivo un fluoróforo capaz de sufrir transferencia de energía sea por (i) donación de energía de estado excitado al anión fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado del anión fluorescente,
(c) exponer la membrana a luz de excitación de longitudes de onda apropiadas;
(d) medir la transferencia de energía entre el anión fluorescente y el segundo reactivo, y
(e) relacionar la transferencia de energía con el cambio en el potencial de la membrana plasmática. Witzak describe "Oxonol - Luminophore mit funktionalisierten" Seinten Ketten Diplomarbeit, University of Düsseldorf 1994.
Bechtel describe ``Synthese von Styrylfarbstoffen mit Reaktivgruppen, Diplomarbeit, University of Düsseldorf 1994.
El modo preferido de transferencia de energía es la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET). El método encuentra utilidad particular en la detección de cambios en el potencial de membrana de la membrana plasmática en las células biológicas.
Las composiciones utilizadas en los métodos de la invención comprenden dos reactivos. El primer reactivo comprende un anión hidrófobo fluorescente que se redistribuye rápidamente desde una cara de la membrana plasmática a la otra en respuesta a los cambios en el potencial transmembrana. Se hace referencia a esta especie como el anión móvil o hidrófobo. El segundo reactivo comprende un fluoróforo capaz de sufrir transferencia de energía sea por (i) donación de energía de estado excitado al anión fluorescente, o (ii) aceptación de energía del estado excitado del anión fluorescente, típicamente por FRET.
Los reactivos primero y segundo son espectroscópicamente complementarios uno con respecto al otro, por lo cual se entiende que sus características espectrales son tales que puede producirse entre ellos transferencia de energía de estado excitado. Cualquiera de los reactivos puede funcionar como el donante o el aceptor, en cuyo caso el otro reactivo es el complemento correspondiente, es decir, el aceptor o donante respectivamente. Tanto la FRET como la extinción son muy sensibles a la distancia entre las dos especies. Por ejemplo, la extinción de tipo Forster no radiactiva observada en la FRET varía inversamente con la sexta potencia de la distancia entre las especies donante y aceptora. Por esta razón, cuando el potencial de membrana cambia y el anión hidrófobo fluorescente se mueve alejándose de o acercándose al segundo reactivo, la FRET entre los dos reactivos se reduce o aumenta significativamente. Otros mecanismos tales como transferencia de electrones, interacción de intercambio Dexter, extinción paramagnética, y cruzamiento promovido intersistema son incluso de intervalo más corto y requieren que los dos reactivos colisionen o al menos se aproximen dentro de 1 nm uno al otro.
Los indicadores fluorescentes sensibles al voltaje publicados previamente que operaban por redistribución del fluoróforo impulsada por el potencial a través de la membrana tenían tiempos de respuesta mayores que 100 ms, a menudo tan largos como minutos. Un aspecto de la presente invención proporciona colorantes aniónicos altamente fluorescentes que sufren transposición a través de la membrana a velocidades mucho más rápidas, con constantes exponenciales de tiempo típicamente menores que aproximadamente 10 ms, frecuentemente menores que 5 ms, comprendidas con gran frecuencia entre aproximadamente 1 y 3 ms, y muy preferiblemente menores que 1 ms en la escala de tiempos (v.g., 0,1 a 1 ms). Estas tasas de transposición son independientes de la presencia del segundo reactivo en la superficie extracelular de la membrana. Son necesarios tiempos de respuesta menores que 1 ms para la medición exacta de los potenciales de acción simples en las neuronas individuales, y dichos tiempos se obtienen con algunos de los colorantes descritos en esta memoria (v.g., pentametino-oxonol sustituido con hexilo, diSBA-C_{6}-(5)). Otros colorantes descritos en esta memoria tienen tiempos de respuesta comprendidos en el intervalo de 2 a 5 ms, que son bastante rápidos para observar los cambios de voltaje en el corazón y la musculatura lisa, muchos potenciales sinápticos en neuronas simples, y la actividad de disparo media en las poblaciones de neuronas (por ejemplo, el mapeado de las respuestas eléctricas, de regiones diferentes del sistema nervioso central a las informaciones sensoriales). Los indicadores de la presente invención son capaces también de seguir cambios de voltaje más lentos a lo largo de una escala de tiempos de segundos a minutos.
I. Primer reactivo - Aniones hidrofobos fluorescentes
En las composiciones y los métodos de la presente invención, el primer reactivo comprende un ion hidrófobo (donante, aceptor o extintor de la fluorescencia) que sirve como sensor de voltaje y se mueve en el interior de la membrana desde una cara de la membrana a la otra en respuesta a los cambios en el potencial transmembrana. La distribución de los iones hidrófobos entre las dos interfases membrana-agua (la interfase extracelular y la interfase intracelular) está determinada por el potencial de membrana. Los cationes tenderán a congregarse en la interfase de la membrana cargada negativamente, y en correspondencia, los aniones se moverán hacia la interfase cargada positivamente. La sensibilidad inherente de la invención está basada en los grandes cambios de concentración interfacial del ion móvil para cambios fisiológicamente relevantes en los potenciales de membrana. Potencialmente, un cambio de 60 mV produce un cambio 10 veces mayor en la relación de las concentraciones del anión en las interfases respectivas. Los métodos de esta invención acoplan este cambio en la concentración interfacial a una lectura eficiente de fluorescencia, proporcionando así un método sensible de detección de los cambios en el potencial transmembrana. La velocidad del cambio de fluorescencia depende de la tasa de transposición del ion hidrófobo a través de la membrana.
Preferiblemente, los iones fluorescentes que se transponen a través de la membrana plasmática son hidrófobos a fin de fijarse fuertemente a la membrana plasmática y transponerse rápidamente a través de la misma en respuesta a los cambios en el potencial transmembrana. Preferiblemente, el ion tendrá una carga simple que estará deslocalizada a través de una porción significativa del colorante, preferiblemente todo el colorante. La deslocalización de la carga reduce la energía de carga de Born (inversamente proporcional al radio del anión) requerida para mover una molécula cargada desde un entorno hidrófilo a un entorno hidrófobo, y facilita la transposición rápida de los iones (Benz, R. 1988. "Structural requirement for the rapid movement of charged molecules across membranes", Biophys. J., 54: 25-33). El carácter hidrófobo creciente minimiza la liberación del colorante fijado de la membrana plasmática y entierra el ion más profundamente en la membrana, lo que reduce la energía de activación electrostática para la transposición. Los grupos polares en el ion deben mantenerse en un mímino y protegidos en la mayor medida posible para dificultar la solvatación en la región de grupo de cabeza de la bicapa. Sin embargo, el carácter hidrófobo no puede incrementarse indefinidamente, dado que se requiere cierta solubilidad en agua para permitir la carga celular. Si es necesario, los colorantes pueden cargarse con ayuda de reactivos solubilizantes anfifílicos tales como \beta-ciclodextrina, Pluronics tales como Pluronic F-127, o polietilen-glicoles tales como PEG400, que favorecen la solubilización de los iones hidrófobos en solución acuosa.
El término "hidrófobo", cuando se utiliza en el contexto del ion hidrófobo, hace referencia a una especie cuyo coeficiente de reparto entre una solución salina fisiológica (v.g. HBSS) y octanol es de modo preferible al menos aproximadamente 50, y de modo más preferible al menos aproximadamente 1000. Su coeficiente de adsorción a una bicapa fosfolipídica (tal como por ejemplo una membrana derivada de un glóbulo rojo humano) es al menos aproximadamente 100 nm, de modo preferible al menos aproximadamente 300 nm (donde la membrana es 3 nm). Métodos de determinación de los coeficientes de reparto y los coeficientes de adsorción son conocidos por los expertos en la técnica.
Generalmente se prefiere que el colorante hidrófobo sea una especie aniónica. Los grupos éster de las membranas biológicas generan un potencial de dipolo apreciable dentro del núcleo hidrocarbonado de la membrana. Este potencial favorece la transposición de los aniones a través de la capa hidrófoba, pero dificulta la de los cationes. Por esta razón, en lo que hace referencia a la transposición de la membrana, los aniones tienen una ventaja de velocidad inherente muy grande sobre los cationes. Por ejemplo, es sabido que para los iones isoestructurales catión tetrafenilfosfonio y anion tetrafenilborato, el anion es mucho más permeante que el catión (Flewelling, R.F. y Hubbell, W.L. 1986. "The membrane dipole potential in a total membrane potential model", Biophys J. 49: 541-552).
De manera preferible, los aniones deben ser fuertemente fluorescentes cuando están adsorbidos en la membrana, mientras que aquéllos deben tener una fluorescencia mínima cuando se encuentran libres en solución acuosa. Preferiblemente, los fluoróforos aniónicos deben ser al menos cuatro veces, y de modo más preferible al menos aproximadamente ocho veces, más brillantes cuando están adsorbidos en la membrana. En el caso de los tiobarbiturato-oxonoles descritos en esta memoria, su fluorescencia es aproximadamente veinte veces mayor en la membrana que en agua. En principio, si el colorante se fijara de modo extremadamente fuerte a la membrana, no habría necesidad de una alta relación de fluorescencia cuando se encuentra fijado a la membrana con respecto a su estado libre en solución acuosa; sin embargo, dado que en realidad el volumen de la membrana es diminuto con relación a la solución acuosa y es necesaria cierta solubilidad en agua para la carga del colorante en las células y los tejidos, es deseable que la fluorescencia del primer reactivo sea al menos aproximadamente cuatro veces más intensa en una membrana que en solución acuosa.
Los aniones no deberían actuar tampoco como ionóforos, especialmente protonóforos, dado que dicho comportamiento puede generar corrientes de fuga sostenidas. Por esta razón, el pKa de protonación del anión es típicamente muy inferior a 7, preferiblemente inferior a 5, y más preferiblemente inferior a 3. Se prefieren las longitudes de onda de excitación y emisión rojas a infrarrojas, a fin de evitar la dispersión en los tejidos y la absorbancia del grupo hemo. El deterioro fotodinámico debería mantenerse lo más bajo posible, siendo probablemente óptima la minimización de la formación del estado de triplete con generación resultante de oxígeno singulete.
Los iones hidrófobos fluorescentes incluyen polimetino-oxonoles, tetraaril-boratos conjugados con fluoróforos y complejos fluorescentes de tierras raras y metales de transición.
A. Polimetino-oxonoles
La expresión "polimetino-oxonol" hace referencia a moléculas que comprenden dos grupos potencialmente ácidos enlazados por una cadena de polimetino y que poseen una carga negativa simple deslocalizada entre los dos grupos ácidos. Los grupos ácidos preferidos son barbituratos o tiobarbituratos. Dichos grupos pueden ser simétricos o asimétricos, es decir, ambos (tio)barbituratos pueden ser iguales o diferentes. Los (tio)barbiturato-oxonoles simétricos se designan por la notación abreviada convencional DiBA-C_{n}-(x) y DiSBA-C_{n}-(x), en la que DiBA hace referencia a la presencia de dos barbituratos, DiSBA hace referencia a la presencia de dos tiobarbituratos, C_{n} representa sustituyentes alquilo que tienen n átomos de carbono en los átomos de nitrógeno de los (tio)barbituratos y x denota el número de átomos de carbono en la cadena de polimetino que enlaza los (tio)barbituratos. Inesperadamente, se ha encontrado que los oxonoles con sustituyentes alquilo de cadena larga (v.g. C_{n} mayor que hexilo, especialmente decilo en los pentametino-oxonoles) se transponen de modo sorprendentemente rápido a través de las membranas plasmáticas.
Una propiedad extremadamente útil de estos oxonoles es que su máximo de emisión de fluorescencia a 560 nm es veinte veces más brillante cuando están fijados a las membranas que en solución acuosa [Rink, T.J., Montecucco, C., Hesketh, T.R., y Tsien, R.Y. 1980. Potencial de membrana de los linfocitos evaluado con sondas fluorescentes. Biochim. Biophys. Acta 595: 15-30]. Adicionalmente, la carga negativa está deslocalizada en la totalidad del cromóforo, conteniendo los cuatro oxígenos equivalentes la mayor parte de la carga. La alta afinidad electrónica de los restos tiobarbiturato se opone a la protonación, pKa < 1, y resiste el blanqueo por fotooxidación. Los cuatro grupos N-alquilo y el tiocarbonilo dan a la molécula la cantidad necesaria de carácter hidrófobo precisa para la fijación fuerte a la membrana y la transposición rápida.
Los compuestos de oxonol utilizados en esta invención tienen una estructura general de Fórmula I.
Fórmula I
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1 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual:
R se selecciona independientemente del grupo constituido por H, hidrocarbilo y heteroalquilo;
X es independientemente oxígeno o azufre; y
n es un número entero de 1 a 3;
y sus sales.
Los aniones oxonol se cargan usualmente como sales, siendo el catión típicamente H^{+}, metal alcalino, amonio sustituido, o piridinio.
Preferiblemente, X es azufre, es decir, el anión hidrófobo es un bis-(1,3-dialquil-2-tiobarbiturato)-polimetino-oxonol o un derivado del mismo.
Cuando R es un grupo hidrocarbilo, puede seleccionarse independientemente del grupo constituido por alquilo, arilo, aralquilo, cicloalquilo y cicloalquil-alquilo inferior. Por lo general, estos grupos tienen desde aproximadamente 4 a aproximadamente 40 átomos de carbono, de modo más preferible aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Los grupos arilo pueden estar sustituidos con hidrocarbilo, alquilo, alquilo inferior, heteroalquilo y grupos halógenos. Oxonoles en los cuales los grupos R en un resto (tio)barbiturato particular son diferentes uno de otro se contemplan específicamente por esta invención y pueden prepararse a partir de derivados de urea
asimétricos.
En algunas realizaciones, R es un grupo hidrocarbilo de la fórmula:
-(CH_{2})_{p}(CH=CH-CH_{2})_{q}(CH_{2})_{r}CH_{3}
en la cual:
p es un número entero de 1 a aproximadamente 20 (de modo preferible aproximadamente 1 a 2);
q es un número entero de 1 a aproximadamente 6, preferiblemente 1 a 2;
la estereoquímica del o de los dobles enlaces puede ser cis o trans, prefiriéndose cis;
r es un número entero de 1 a aproximadamente 20 (de modo preferible aproximadamente 1 a 3), y p + 3q + r = 1 a 40, de modo preferible aproximadamente 4 a 20, y de modo más preferible aproximadamente 6 a 10.
En otra realización de los polimetino-oxonoles, R es un grupo heteroalquilo de la fórmula:
-(CH_{2})_{x}A_{y}(CH_{2})_{z}CH_{3},
en la cual:
A es oxígeno o azufre;
x es independientemente un número entero de 1 a aproximadamente 20 (de modo preferible aproximadamente 10 a 15);
y es independientemente 0 ó 1;
z es independientemente un número entero de 1 a aproximadamente 20 (de modo preferible aproximadamente 10 a 15); y
x + y + z = 40, de modo preferible x + y + z = un número entero de aproximadamente 5 a 25, y de modo más preferible aproximadamente 5 a 10.
En otras realizaciones, R es un grupo fenilo sustituido independientemente con hasta cuatro sustituyentes seleccionados del grupo constituido por hidrocarbilo, heteroalquilo, halógeno y H.
Una carga negativa de oxonol se distribuye por la totalidad del cromóforo. Los bis(tiobarbiturato)trimetino-oxonoles absorben a 542 nm (coeficiente de extinción = 200.000 M^{-1} cm^{-1}), emiten a 560 nm y tienen un rendimiento cuántico de 0,4 en octanol. Un oxonol en el cual R = n-hexilo, DiSBA-C_{6}-(3), se transpone con una constante de tiempo (\tau) < 3 ms en células de mamífero inmovilizadas por voltaje. El compuesto decílico correspondiente DiSBA-C_{10}-(3), se transpone con una constante de tiempo < 2 ms. El requerimiento molecular para la transposición rápida se cumple perfectamente con los oxonoles simétricos. Los bis(tiobarbiturato)pentametino-oxonoles absorben a \sim 630 nm y emiten a \sim 660 nm. La carga negativa está deslocalizada ulteriormente en tales oxonoles desplazados hacia el rojo. Como sería de esperar, las tasas de transposición para los pentametino-oxonoles son más rápidas que para los trimetino-oxonoles. DisBA-C_{4}-(5) atraviesa la membrana con \tau < 3 ms, seis veces más deprisa que el trimetino-oxonol correspondiente. DiSBA-C_{6}-(5) se transpone con \tau \sim 0,4 ms a 20ºC.
B. Conjugados tetraaril-borato - fluoróforo
Otra clase útil de aniones hidrófobos fluorescentes son los tetraaril-boratos que tienen una estructura general de Fórmula II.
Fórmula II
[(Ar^{1})_{3}B-Ar^{2}-Y-FLU]^{-}
en la cual:
Ar^{1} es un grupo arilo;
Ar^{2} es un grupo bifuncional arileno;
B es boro;
Y es oxígeno o azufre; y
FLU es un fluoróforo neutro.
Frecuentemente, Ar^{1} está sustituido con uno o dos grupos que sustraen electrones, tales como, pero sin carácter limitante, CF_{3}. En realizaciones seleccionadas, Ar^{1} y Ar^{2} son grupos fenilo opcionalmente sustituidos, como se muestra a continuación para la estructura de Fórmula III.
\newpage
Fórmula III
2
en la cual:
cada R' es independientemente H, hidrocarbilo, halógeno o CF_{3};
n es un número entero de 0 a 5;
cada X es independientemente H, halógeno o CF_{3};
m es un número entero de 0 a 4;
Y es oxígeno o azufre; y
FLU es un fluoróforo neutro.
Cuando R' es hidrocarbilo, el mismo tiene típicamente de 1 a aproximadamente 40 átomos de carbono, de modo preferible 3 a aproximadamente 20 átomos de carbono, y de modo más preferible aproximadamente 5 a 15 átomos de carbono. Preferiblemente, R' es un grupo alquilo inferior, más preferiblemente (por facilidad de síntesis) todos los grupos R' son H. Cuando R' no es hidrocarbilo, el mismo es frecuentemente CF_{3} y n = 1. En realizaciones seleccionadas, X = F y m = 4. X es típicamente sustractor de electrones a fin de impedir la transferencia de electrones fotoinducida del tetraaril-borato al fluoróforo, que extingue el último. X = F es muy preferido.
1. Síntesis de conjugados tetraaril-borato - fluoróforo
Una síntesis general de aniones tetraaril-borato fluorescentes ha sido desarrollada y se muestra en la Figura 10 para un conjugado tetraaril-borato bimano fluorescente ilustrativo (identificado como Bormano, compuesto IV en la Figura 10).
En términos generales, se hace reaccionar un triaril-borano con un reactivo organometálico fenoxi o tiofenoxi protegido, tal como, por ejemplo, un derivado orgánico de litio. El grupo protector se elimina subsiguientemente y el fenol (o tiofenol) no enmascarado se hace reaccionar con un fluoróforo que lleva un grupo lábil. El desplazamiento nucleófilo del grupo lábil seguido por purificación convencional del producto de reacción bruto suministra el anión tetraaril-borato conjugado al fluoróforo. Los sustituyentes R' y X pueden variar por elección apropiada del triaril-borano de partida y el compuesto organometálico fenoxi (o tiofenoxi). Materiales de partida adecuados pueden obtenerse de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) y otros suministradores comerciales conocidos por los expertos en la técnica. Así, en estas especies, un fluoróforo se conjuga a un núcleo de borato funcionalizado. Este método de síntesis general permite fijar cualquier fluoróforo al anión borato.
2. Fluoróforos neutros
Dado que los cromóforos polares retardan la tasa de transposición de la membrana, se prefiere que el fluoróforo conjugado al tetraaril-borato sea una especie neutra. Para los propósitos de la presente invención, un fluoróforo neutro puede definirse como una molécula fluorescente que no contiene grupos funcionales cargados. Moléculas fluorescentes representativas que contienen grupos lábiles y adecuadas para conjugación están disponibles de Molecular Probes (Portland, OR), Eastman Kodak (Huntington, TN), Pierce Chemical Co. (Rockville, MD) y otros suministradores comerciales conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, pueden introducirse grupos lábiles en moléculas fluorescentes utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Clases particularmente adecuadas de fluoróforos neutros que pueden conjugarse a los tetraaril-boratos para uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, los siguientes: bimanos, bodipis y cumarinas.
Los bodipis (es decir, difluoroboradiazaindacenos) pueden representarse por una estructura general de Fórmula IV.
Fórmula IV
3
en la cual:
cada R^{1}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo inferior, arilo, heteroaromático, aralquenilo y un punto de fijación alquileno;
cada R^{2}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo inferior, fenilo y un grupo de fijación alquileno.
Para los propósitos de esta descripción, la expresión "punto de fijación alquileno" hace referencia al grupo
-(CH_{2})_{t}- o -(CH_{2})_{t}-C(O)-, en el cual t es un número entero de 1 a 10, un enlace de valencia está unido al fluoróforo y el otro enlace de valencia está unido al tetraaril-borato. Preferiblemente, t = 1, es decir el punto de fijación alquileno es un grupo metileno. Como será evidente para un experto en la técnica, todos los fluoróforos poseerán un punto de fijación por el cual aquéllos estarán conjugados al tetraaril-borato. Generalmente, la molécula precursora utilizada para conjugar el fluoróforo al tetraaril-borato llevará un grupo lábil en el punto de fijación. La reacción de este precursor con un nucleófilo apropiado en el tetraaril-borato (v.g., un grupo amino, hidroxi o tiol), proporcionará un conjugado fluoróforo-tetraaril-borato enlazado juntamente en el punto de fijación. La expresión "punto de fijación" hace referencia en términos más generales a una agrupación química que es apropiada para reaccionar con un fluoróforo para formar los conjugados fluorescentes como se describe en esta memoria. Frecuentemente, estos puntos de fijación llevarán grupos lábiles, v.g., alquil-tosilatos, ésteres activados (anhídridos, ésteres de N-hidroxisuccinimidilo y análogos) que pueden reaccionar con un nucleófilo en la especie a conjugar. Un experto reconocerá que puede invertirse el posicionamiento relativo del grupo lábil y el nucleófilo en las moléculas que se enlazan mutua-
mente.
Las cumarinas y fluoróforos afines pueden representarse por estructuras de las Fórmulas generales V y VI
Fórmula V 
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Fórmula VI
4
en las cuales:
cada R^{3}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, halógeno, alquilo inferior, CN, CF_{3}, COOR^{5}, CON(R^{5})_{2}, OR^{5}, y un punto de fijación;
R^{4} se selecciona del grupo constituido por OR^{5} y N(R^{5})_{2};
Z es O, S o NR^{5}; y
cada R^{5}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo inferior y un punto de fijación alquileno.
Los bimanos se pueden representar por una estructura de Fórmula general VII:
Fórmula VII
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5 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual:
cada R^{5}, que puede ser igual o diferente, es independientemente H, alquilo inferior o un punto de fijación alquileno.
Se han preparado tetraaril-boratos fluorescentes con cumarinas y bimanos fijados. Estos boratos fluorescentes se transponen con \tau < 3 ms en fibroblastos inmovilizados por voltaje. La síntesis de un tetraaril-borato fluorescente ilustrativo se describe en el Ejemplo V.
C. Complejos de fluoróforos con metales de transición
Los iones lantánidos, tales como, por ejemplo, Tb^{3+} y Eu^{3+}, emiten luminiscencia en las regiones verde y roja del espectro visible con períodos de vida de milisegundos. La emisión se compone de varias bandas netas que son indicativas del origen atómico de los estados excitados. La excitación directa de los iones puede realizarse utilizando luz UV intensa. La excitación de los iones lantánidos a longitudes de onda mayores es posible cuando los iones son transformados en quelatos por ligandos absorbentes que pueden transferir energía de excitación a los iones, los cuales pueden emitir luego luminiscencia con su emisión característica como si se hubieran excitado directamente. Los complejos lantánidos de Tb^{3+} y Eu^{3+} con ligandos absorbentes que aportan 4 cargas negativas, dando como resultado una carga neta de -1, pueden funcionar como iones móviles para el mecanismo FRET sensible al voltaje. Los períodos de vida de Tb^{3+} y Eu^{3+} son todavía suficientemente rápidos para medir cambios de voltaje de milisegundos.
Esta invención proporciona también complejos de este tipo que pueden funcionalizar el anión hidrófobo fluorescente (como donante FRET) en el primer reactivo. Utilizando el ligando bis-(salicilaldehido)etilenodiamina (Salen)^{2-}, se han obtenido [Tb(Salen)_{2}]^{-1} y [Eu(Salen)_{2}]^{-1}. Estos complejos absorben máximamente a 350 nm con absorbancia significativa hasta 380 nm y emiten luminiscencia con la emisión atómica característica, Fig. 10. El uso de complejos lantánidos como donantes ofrece varias ventajas singulares. La difusión, autofluorescencia celular, y emisión de aceptores excitados directamente tienen períodos de vida de nanosegundos o más cortos y pueden ser rechazadas por discriminación de tiempos de la producción de emisión (véase, por ejemplo, Marriott, G., Heidecker, M., Diamandis, E.P., Yan-Marriott, Y. 1994. Microscopía de imágenes de fluorescencia retardada, resuelta por tiempos utilizando un complejo quelato de ion europio. Biophys. J. 67:957-965). La eliminación de la emisión rápida reduce el ruido de fondo y proporciona relaciones excelentes de señal a ruido. Otra ventaja importante de la utilización de quelatos lantánidos como donantes es que el intervalo de FRET se amplifica por difusión lateral en la membrana durante el período de vida del estado excitado (Thomas, D.D., Carlsen, W.F., Stryer, L. 1978. Transferencia de energía por fluorescencia en el límite de la difusión rápida. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5746-5750). Esta característica reduce notablemente la necesidad de concentraciones elevadas de aceptores para asegurar una FRET eficiente. Además de reducir la perturbación y la tensión para el sistema celular por las concentraciones de colorante altas, la FRET mejorada por difusión conducirá a una mayor sensibilidad al voltaje que la que es posible en un caso estático. Los quelatos lantánidos pueden utilizarse también como donantes marcados asimétricamente para aceptores móviles tales como los tri- y pentametino-oxonoles, con las mismas ventajas que se han expuesto
anteriormente.
Complejos lantánidos representativos que pueden utilizarse como anión hidrófobo fluorescente se muestran en las Fórmulas XI y XII.
\newpage
Fórmula XI
6
en la cual:
n = Tb, Eu, o Sm;
R es independientemente H, alquilo C1-C8, cicloalquilo C1-C8 o perfluoroalquilo C1-C4;
X e Y son independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, CF_{3}, alquilo inferior (C1-C4), CN, Ph, O-(alquilo inferior), u OPh; o X e Y juntos son -CH=CH-; y
Z = 1,2-etanodiílo, 1,3-propanodiílo, 2,3-butanodiílo, 1,2-ciclohexanodiílo, 1,2-ciclopentanodiílo, 1,2-cicloheptanodiílo, 1,2-fenilenodiílo, 3-oxa-1,5-pentanodiílo, 3-aza-3-(alquilo inferior)-1,5-pentanodiílo, piridina-2,6-bis(metileno) o tetrahidrofurano-2,5-bis(metileno).
Fórmula XII
7
en la cual:
Ln = Tb, Eu, o Sm;
R es independientemente H, alquilo C1-C8, cicloalquilo C1-C8 o perfluoroalquilo C1-C4;
X' e Y' son independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, CF_{3}, alquilo inferior (C1-C4), CN, Ph, O-(alquilo inferior), u OPh; o X' e Y' juntos son -CH=CH-; y
Z' es independientemente un enlace de valencia, CR_{2}, piridina-2,6-diílo o tetrahidrofuran-2,5-diílo.
II. Segundos reactivos inmóviles, unidos asimétricamente
El segundo reactivo es un donante, aceptor, o extintor fluorescente, complementario al primer reactivo, el anión hidrófobo, y se fija a la cara extracelular o intracelular de la membrana plasmática. Así, la presencia del segundo reactivo en una o la otra cara de la membrana hace asimétrica la membrana. Como se ha descrito anteriormente, la irradiación con luz de una longitud de onda apropiada genera una lectura fluorescente que cambia en respuesta al movimiento del ion hidrófobo hacia atrás y adelante a través de la membrana plasmática. Como resultaría inmediatamente evidente para los expertos en este campo, existen numerosas especies moleculares que podían funcionar como el agente de asimetría fluorescentemente activo. Las características primarias para este componente son que el mismo está localizado en una cara de la membrana plasmática y funciona de manera complementaria (es decir, como donante, aceptor, o extintor de fluorescencia) al ion hidrófobo, que se desplaza alternativamente hacia atrás y adelante a través de la membrana a medida que cambia el potencial transmembrana.
Segundos reactivos ilustrativos incluyen lectinas fluorescentes, lípidos fluorescentes, carbohidratos fluorescentes con sustituyentes hidrófobos, péptidos fluorescentes, anticuerpos marcados fluorescentemente contra constituyentes de la superficie de la membrana, o xantenos, cianinas y cumarinas con sustituyentes hidrófobos e hidrófilos que promueven la fijación a las membranas e impiden la permeación a través de las membranas.
A. Lectinas fluorescentes
Una clase de segundo reactivo son lectinas que llevan un marcador fluorescente. Para los propósitos de la presente invención, una lectina puede definirse como una proteína fijadora de azúcar que se fija a glicoproteínas y glicolípidos en la cara extracelular de la membrana plasmática. Véase, Roth, J., "The Lectins: Molecular Probes in Cell Biology and Membrane Research", Exp. Patholo. (Supp. 3), (Gustav Fischer Verlag, Jena, 1978). Las lectinas incluyen Concanavalina A; diversas aglutininas (aglutinina de gisante, aglutinina de cacahuete, aglutinina de germen de trigo, y análogas); cadena A de la ricina, y análogas. Una diversidad de lectinas están disponibles de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Marcadores fluorescentes adecuados para uso en lectinas fluorescentes incluyen, pero sin carácter limitante, los siguientes: xantenos (con inclusión de fluoresceínas, rodaminas y rodoles); bodipis, cianinas, y complejos luminiscentes de metales de transición. Se reconocerá que los marcadores fluorescentes descritos a continuación pueden utilizarse no simplemente con lectinas sino con los otros segundos reactivos descritos en esta memoria. Hasta la fecha, los mejores resultados con lectinas se han obtenido con aglutinina de germen de trigo marcada con fluoresceína (FL-WGA).
1. Xantenos
Una clase preferida de marcadores fluorescentes comprenden cromóforos de xanteno que tienen una estructura de Fórmula general VIII o IX.
Fórmula VIII
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Fórmula IX
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en las cuales:
R^{6} se selecciona independientemente del grupo constituido por H, halógeno, alquilo inferior, SO_{3}H y un punto de fijación alquileno;
R^{7} se selecciona del grupo constituido por H, alquilo inferior, un punto de fijación alquileno, y R^{8}, en el cual R^{8} se selecciona del grupo constituido por
10
en los cuales:
cada uno de a y a' se selecciona independientemente del grupo constituido por H y un punto de fijación alquileno;
G se selecciona del grupo constituido por H, OH, OR^{9}, NR^{9}R^{9} y un punto de fijación alquileno;
T se selecciona del grupo constituido por O, S, C(CH_{3})_{2} y NR^{9}; y
M se selecciona del grupo constituido por O y NR^{9}R^{9};
donde cada R^{9}, que puede ser igual o diferente, es independientemente H o hidrocarbilo.
2. Cianinas
Otra clase preferida de marcadores fluorescentes son los colorantes de cianina, que tiene una estructura de Fórmula general X.
Fórmula X
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en la cual:
R^{15} se selecciona independientemente del grupo constituido por H, halógeno, alquilo inferior, SO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, COOH, y un punto de fijación alquileno;
R^{16} se selecciona del grupo constituido por H, alquilo inferior, (CH_{2})_{j}COOH, (CH_{2})_{j}SO_{3}H, y un punto de fijación alquileno; donde j es un número entero de 1 a 10;
T' se selecciona del grupo constituido por O, S, C(CH_{3})_{2}, -CH=CH-, y NR^{17}, donde R^{17} es H o hidrocarbilo; y
n es un número entero de 1 a 6.
B. Lípidos fluorescentes
Lípidos anfipáticos marcados fluorescentemente, en particular fosfolípidos, se han empleado también con éxito. Para los propósitos de la presente invención, un lípido anfipático puede definirse como una molécula con grupos tanto hidrófobos como hidrófilos que se fijan a la membrana celular pero que no atraviesan fácilmente la misma. Los fosfolípidos marcados fluorescentemente son particularmente valiosos como segundo reactivo.
Tal como se define en esta memoria, "fosfolípidos" incluye ácido fosfatídico (PA), y fosfatidil-gliceroles (PG), fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE), fosfatidilinositoles (PI), fosfatidilserinas (PS), y derivados lipídicos de fosfatidil-colina, serina, inositol y etanolamina tales como fosfatidilcolina de huevo (EPC), dilauroil-fosfatidiletanolamina, dimiristoilfosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidil-etanolamina, diestearoilfosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidilserina, dilinoleoil-fosfatidilinositol, y sus mezclas. Dichos compuestos pueden ser lípidos insaturados, y pueden ser existentes naturalmente o sintéticos. Los componentes individuales de los ácidos fosfatídicos pueden ser simétricos, es decir que ambos restos acilo sean iguales, o pueden ser asimétricos, es decir, que los restos acilo pueden ser diferentes.
Realizaciones particularmente preferidas incluyen fosfatidiletanolamina marcada con 6-cloro-7-hidroxicumarina (Cou-PE), fosfatidiletanolamina marcada con fluoresceína (FL-PE), N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)fosfatidiletanolamina (NBD-PE), y fosfatidiletanolamina marcada con 5,5'-disulfoindodicarbocianina (Cy5-PE). El grupo fluorescente se selecciona convenientemente entre los descritos previamente como útiles en la preparación de lectinas fluorescentes. Fosfolípidos fluorescentes preferidos incluyen Cou-PE, FL-PE, NBD-PE o Cy5-PE. La utilización de Cou-PE como donante con DiSBA-C_{6}-(3) como aceptor ha dado un cambio de relación de 80% para un cambio de 100 mV en el potencial de la membrana plasmática, y típicamente proporciona señales de relación dos veces mayores que la FL-WGA con el mismo oxonol.
C. Anticuerpos marcados fluorescentemente
Anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie tales como glicolípidos o proteínas de la membrana pueden marcarse también fluorescentemente y utilizarse como segundo reactivo. Por ejemplo, anticuerpos marcados con FITC contra el glicolípido GD3 tiñen la superficie externa de la línea de células de melanoma M21 y dan cambios de relación de hasta 10%/100 mV utilizando DiSBA-C_{6}-(3) como el anión fluorescente móvil. La especificidad para tipos de células particulares es probablemente más fácil de alcanzar con anticuerpos que con lectinas, dado que pueden generarse anticuerpos prácticamente contra cualquier marcador de superficie. Asimismo, anticuerpos microinyectados podrían marcar sitios en la cara citoplásmica de la membrana plasmática, en la que están ausentes sitios de fijación de carbohidratos para lectinas.
D. Citocromos
Se ha encontrado que el citocromo c utilizado como segundo reactivo funciona también como extintor que se fija a la superficie externa de la membrana plasmática. De acuerdo con ello, otra clase adecuada de segundo reactivo comprende citocromo c o apocitocromo c, con o sin un grupo fluorescente como se ha descrito previamente en conexión con otras clases de segundo reactivo.
E. Carbohidratos fluorescentes
Otra clase preferida adicional de realizaciones del segundo reactivo incluye carbohidratos anfipáticos marcados fluorescentemente, v.g., ciclodextrinas que se fijan selectiva y fuertemente a la superficie extracelular de la membrana plasmática. Típicamente, los carbohidratos se funcionalizan con una cola hidrófoba para facilitar su intercalación en la membrana y su fijación fuerte a la misma. El azúcar cíclico imparte solubilidad satisfactoria en agua para la carga celular e impide la transposición en la membrana. Otra ventaja añadida es que las ciclodextrinas favorecen la carga del oxonol.
F. Péptidos y proteínas fluorescentes
Otra clase preferida adicional de realizaciones del segundo reactivo incluye péptidos anfipáticos marcados fluorescentemente. Típicamente, dichos péptidos contienen varios restos básicos tales como lisinas y argininas que se fijan electrostáticamente a los grupos de cabeza fosfolipídicos cargados negativamente, más varios restos hidrófobos que anclan el péptido a la membrana. Opcionalmente, sustituyentes alquilo de cadena larga tales como N-miristoílo, N-palmitoílo, S-palmitoílo, o grupos prenilo C-terminales pueden proporcionar carácter hidrófobo. El marcador fluorescente se une típicamente por la vía de los grupos amino épsilon de la lisina o los grupos sulfhidrilo de la cisteína.
Otra clase preferida adicional de realizaciones del segundo reactivo incluye proteínas naturalmente fluorescentes tales como la Proteína Fluorescente Verde (GFP) de Aequorea victoria (Cubitt, A.B. et al., 1995. Comprensión, mejora y utilización de las proteínas verdes fluorescentes. Trends Biochem. Sci. 20: 448-455; Chalfie, M., y Prasher, D.C. US 5.491.084). Tales proteínas podrían fusionarse a las proteínas nativas de la membrana plasmática por expresión de constructos de DNA en tándem en los cuales las secuencias de DNA que codifican la GFP y la proteína nativa están concatenadas en marco. Alternativamente, la GFP podría fusionarse a un grupo que causa la fijación de anclas de glicosilfosfatidilinositol y el direccionamiento de la proteína a la membrana plasmática.
Como indica la exposición que antecede y como podría ser apreciado fácilmente por los expertos en la técnica, puede utilizarse una gran diversidad de pares donante/aceptor conocidos como reactivos primero y segundo. Combinaciones particularmente preferidas incluyen, pero sin carácter limitante, las siguientes, en las cuales el primer fluoróforo citado es el donante y el segundo es el aceptor: fluoresceína/bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol; Proteína Fluorescente Verde/bis-tiobarbi-turato-trimetino-oxonol; Proteína Fluorescente Verde/bis-tiobarbiturato-pentametino-oxonol; cumarina/bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol; cumarina/bis-tiobarbiturato-pentametino-oxonol; bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol/Rojo Texas; bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol/resorrufina; bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol/Cy5; bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol/bis-tiobarbiturato-pentametino-oxonol; Rojo Texas/bis-tiobarbiturato-pentametino-oxonol; NBD/bis-tiobarbiturato-trimetino-oxonol, y NBD/bis-tiobarbiturato-pentametino-oxonol.
III. Métodos de medición
En una clase de realizaciones de la presente invención, la fluorescencia del ion hidrófobo en una cara de la membrana se extingue por un mecanismo distinto de FRET. FRET tiene las ventajas de actuar sobre largas distancias, lo que minimiza la concentración necesaria de aceptores, y de proporcionar una señal de salida ratiométrica para dos longitudes de onda de emisión. Sin embargo, aun cuando FRET es muy eficiente en distancias muy largas, mayores que el espesor de la membrana, puede fallar en lo referente a discriminación entre aceptores del mismo lado y aceptores de lados opuestos de la membrana. Los otros mecanismos de extinción son de alcance mucho más corto y no serían nunca eficaces a través del espesor de la membrana.
El segundo fluoróforo/extintor puede estar localizado en la cara intracelular o la extracelular, con tal que sea específico para una u otra. En los ejemplos específicos que se consignan en esta memoria, se consideró como diana por conveniencia la superficie extracelular.
La FRET o extinción por fluorescencia se detecta óptimamente por determinación de la relación de emisión, método que puede diferenciar las dos poblaciones del fluoróforo móvil, es decir, las fijadas a la cara extracelular frente a las fijadas a la cara intracelular de la membrana. En particular, la FRET con utilización de un aceptor fluorescente proporciona un cambio de relación de emisión que es muy adecuado para microscopía confocal con barrido por láser y corrige internamente las variaciones en carga de donante, espesor celular y posición (con inclusión de los artefactos por movimiento), e intensidad de excitación. Las relaciones de emisión cambian usualmente en mayores porcentajes que cualquier señal de longitud de onda de emisión aisladamente considerada, dado que las emisiones de donante y aceptor deberían cambiar en direcciones opuestas, que se refuerzan una a otra cuando se calcula su relación. Si no es deseable o posible la determinación de la relación de emisión, puede utilizarse todavía la longitud de onda por sí sola, o puede controlarse el cambio en el período de vida en estado excitado del donante.
Las relaciones de emisión se miden, o bien por cambio de la banda de paso de un filtro selectivo para longitudes de onda frente a un solo detector, o preferiblemente por descomposición de la luz emitida con un espejo dicroico y medición simultánea de dos bandas de longitud de onda con dos detectores, que pueden estar precedidos cada uno por filtros de selección de longitud de onda adicionales. En el primer método, los filtros selectivos de longitud de onda pueden ser dos o más filtros de interferencia con bandas de paso diferentes dispuestas alternativamente frente al detector, o puede tratarse de un monocromador sintonizable continuamente que se somete repetidamente a barrido en un intervalo de longitudes de onda. La ventaja del primer método es que se utiliza un solo detector, lo cual redunda en economía de detectores y evita el problema de hacer coincidir exactamente dos detectores. Las ventajas del segundo método, que utiliza un espejo dicroico y dos detectores separados, son que las dos emisiones pueden medirse realmente de manera simultánea en lugar de sucesivamente, y que hace un uso más eficiente de los fotones emitidos por la muestra.
La especificidad molecular para tipos de células particulares en una población mixta puede introducirse por utilización de anticuerpos específicos de las células o lectinas como vehículos del marcador fluorescente extracelular, o por utilización de la Proteína Fluorescente Verde expresada específicamente en un tipo de célula dado como marcador intra- o extracelular. Las células marcadas específicamente reducen también la tinción de fondo y proporcionan cambios de fluorescencia grandes en tejidos complejos.
Se alcanza una sensibilidad alta cuando el sensor de voltaje (es decir, el anión hidrófobo del primer reactivo) transpone al menos una carga unitaria completa a través de prácticamente toda la membrana. Incluso sin canales o transportadores iónicos específicos, dicha transposición puede ser muy rápida si el ion está cargado negativamente, está deslocalizado, y es hidrófobo. Por ejemplo, el anión no fluorescente liposoluble de la dipicrilamina (2,2',4,4',6,6'-hexanitrodifenilamina) produce corrientes de desplazamiento en tejidos excitables con cinética inferior al milisegundo, comparables en velocidad a las corrientes de discriminación de los canales de sodio [Benz, R. y Conti, F. 1981. Estructura de la membrana del axón de calamar, deducida de estudios de relajación carga-pulso, en presencia de iones lipófilos absorbidos. J. Membrane Biol. 59: 91-104; Benz, R. y Nonner, W. 1981. Estructura del axolema de los nervios mielinados de la rana: experimentos de relajación conb un ion de sonda lipófilo. J. Membrane Biol. 59: 127-134; Fernández, J.M., Taylor, R.E., y Bezanilla, F. 1983. Capacitancia inducida en el axón gigante del calamar. J. Gen. Physiol. 82: 331-346]. Sin embargo, la detección de voltaje no debería requerir difusión ulterior del ion a través de las capas acuosas sin agitar, dado que hace más lenta la respuesta y genera una corriente de fuga sostenida.
Para crear una lectura óptica a partir de la transposición del ion hidrófobo fluorescente (es decir, el primer reactivo) desde un lado de la membrana plasmática al otro lado, se emplea FRET o extinción de fluorescencia entre el ion que se transpone y un fluoróforo o extintor (es decir, el segundo reactivo) fijado justamente a una cara de la membrana plasmática. De manera muy conveniente, se emplea la cara extracelular.
A manera de ejemplo, y no de limitación, se representa esquemáticamente en la Fig. 1 el caso en que los iones que se transponen son aceptores fluorescentes aniónicos que absorben a longitudes de onda que se superponen con el espectro de emisión de los fluoróforos donantes fijados extracelularmente. Para un potencial de membrana residual negativo (A) los oxonoles permeantes tienen una concentración elevada en la superficie extracelular de la membrana plasmática y se ve favorecida la transferencia de energía desde la FL-WGA (aglutinina de germen de trigo-fluoresceína) fijada extracelularmente). La FRET se simboliza por la flecha recta desde la lectina al oxonol. Para un potencial de membrana positivo (B) los aniones están localizados fundamentalmente en la superficie intracelular de la membrana, y la transferencia de energía se ve reducida notablemente debido a su distancia media incrementada desde los donantes en la superficie extracelular.
La velocidad de la respuesta de fluorescencia sensible al voltaje depende de la tasa de transposición del fluoróforo de un sitio al otro. La velocidad de respuesta para DiSBA-C_{6}-(3) se muestra en la Fig. 5 y sigue las ecuaciones generales (1) y (2). Como indican estas ecuaciones, los iones fluorescentes que saltan a través de la membrana en una escala de tiempos de milisegundos en respuesta a cambios biológicamente significativos del potencial transmembrana tienen que seguir una cinética rápida de polarización/despolarización. Los iones que saltan con mayor lentitud no serán útiles por ejemplo en el seguimiento de señales eléctricas rápidas en el tejido neuronal (una aplicación fundamental de las composiciones y métodos de la presente invención). El desarrollo y descubrimiento de tales moléculas con la limitación añadida de ser fluorescentes es muy importante.
Los aniones hidrófobos móviles pueden ser donantes en lugar de aceptores. Ambas alternativas tienen sus ventajas. Un ejemplo en el que el ion hidrófobo es el donante FRET es la combinación DiSBA-C_{6}-(3)/Rojo Texas WGA. Una ventaja fundamental de esta disposición es que minimiza la concentración de la molécula del colorante hidrófobo en la membrana; esto reduce la toxicidad y las perturbaciones celulares resultantes de la corriente de desplazamiento y de cualesquiera efectos fotodinámicos. Otra ventaja estriba en los rendimientos cuánticos generalmente más altos de los fluoróforos fijados en las membranas con relación a los que se fijan en proteínas o en agua; esto proporciona una FRET mejor para una distancia dada.
Se ha demostrado en esta memoria que los bis-(1,3-dialquil-2-tiobarbiturato)-trimetino-oxonoles, en los que alquil es n-hexil y n-decil (DiSBA-C_{6}-(3) y DiSBA-C_{10}-(3) respectivamente) se comportan como donantes para aglutinina de germen de trigo marcada con Rojo Texas (TR-WGA) y como aceptores en el caso de la lectina marcada con fluoresceína (FL-WGA). En fibroblastos inmovilizados por voltaje, se midió la transposición de estos oxonoles como una corriente de desplazamiento con una constante de tiempo de aproximadamente 2 ms para despolarización de 100 mV a 20ºC, que es igual a la velocidad de los cambios de fluorescencia. Se observaron cambios de relación de fluorescencia comprendidos entre 4 y 34% para una despolarización de 100 mV en fibroblastos, células de astrocitoma, miocitos cardíacos latientes, y células de neuroblastoma B104. Los grandes cambios de fluorescencia permitían una formación de imágenes confocal de alta velocidad.
Se utilizaron en los ejemplos células aisladas a fin de que las señales ópticas pudieran compararse con cambios de voltaje conocidos exactamente por técnicas tradicionales de microelectrodos, tales como inmovilización por parche, que son aplicables únicamente a células aisladas. Sin embargo, debería resultar evidente que los colorantes pueden utilizarse para muchas aplicaciones en las que no son aplicables los microelectrodos. La comparación con los microelectrodos es necesaria únicamente para calibración exacta y demostración de que el mecanismo de la generación de la señal de fluorescencia es como se describe en esta memoria. Las composiciones de dos reactivos y los métodos descritos en esta memoria pueden, o bien resolver los potenciales eléctricos diferentes de muchas células vecinas o partes vecinas de una misma célula, o dar una lectura media para todas las localizaciones de membrana, dependiendo de si la señal óptica se transforma en imagen o se agrupa espacialmente.
Los métodos descritos en esta memoria son aplicables para una gran diversidad de membranas. En particular, pueden detectarse y controlarse potenciales de membrana en membranas de células biológicas. El método encuentra su utilidad máxima con las membranas plasmáticas, especialmente la membrana plasmática más externa de las células de mamífero. Membranas representativas incluyen, pero sin carácter limitante, orgánulos subcelulares, membranas del retículo endoplasmático, gránulos secretorios, mitocondrias, microsomas y vesículas secretoras. Tipos de células que pueden utilizarse incluyen, pero sin carácter limitante, neuronas, células cardíacas, linfocitos (linfocitos T y B), células nerviosas, células musculares y análogas.
IV. Escrutinio de fármacos
La invención proporciona también métodos para escrutar muestras de ensayo tales como posibles fármacos terapéuticos que afectan a los potenciales de membrana en las células biológicas. Estos métodos implican la medición de los potenciales de membrana como se ha descrito anteriormente en presencia y ausencia (medida de control) de la muestra de ensayo. Las medidas de control se realizan usualmente con una muestra que contiene todos los componentes de la muestra de ensayo excepto el fármaco supuesto. La detección de un cambio en el potencial de membrana en presencia del agente de ensayo con relación al control indica que el agente de ensayo es activo. Los potenciales de membrana pueden determinarse también en presencia o ausencia de un agente farmacológico de actividad conocida (es decir, un agente estándar) o actividad supuesta (es decir, un agente de ensayo). Una diferencia en los potenciales de membrana tal como se detectan por los métodos expuestos en esta memoria permite comparar la actividad del agente de ensayo con la del agente estándar. Se reconocerá que muchas combinaciones y permutaciones de protocolos de escrutinio de fármacos son conocidas por los expertos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente para su utilización con el método de medida del potencial de membrana expuesto en esta memoria para identificar compuestos que afectan a los potenciales de membrana. El uso de la técnica de determinación del potencial de membrana expuesta en esta memoria en combinación con la totalidad de dichos métodos se contempla en esta invención. En una aplicación particular, la invención ofrece un método de identificación de un compuesto que modula la actividad de un canal, bomba o cambiador iónico en una membrana, que comprende:
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(a) cargar las células con los reactivos primero y segundo, que miden juntos el potencial de membrana como se ha descrito anteriormente;
(b) determinar el potencial de membrana como se describe anteriormente;
(c) exponer las células a la muestra de ensayo;
(d) determinar nuevamente el potencial de membrana y comparar con el resultado obtenido en (b) para determinar el efecto de la muestra de ensayo;
(e) opcionalmente, exponer la membrana a un estímulo que modula un canal, bomba o cambiador de iones, determinar nuevamente el potencial de membrana, y compararlo con el resultado obtenido en (d) para determinar el efecto de la muestra de ensayo sobre la respuesta al estímulo.
En otra aplicación, la invención ofrece un método de escrutinio de muestras de ensayo para identificar un compuesto que modula la actividad de un canal, bomba o cambiador de iones en una membrana, que comprende:
(a) cargar un primer grupo y un segundo grupo de células con reactivos primero y segundo que miden juntos el potencial de membrana como se ha descrito anteriormente;
(b) opcionalmente, exponer ambos grupos de células primero y segundo a un estímulo que modula el canal, la bomba o el cambiador de iones;
(c) exponer el primer grupo de células a una muestra de ensayo;
(d) medir el potencial de membrana en el primer y el segundo grupo de células; y
(e) relacionar la diferencia en los potenciales de membrana entre el primer y el segundo grupo de células con la capacidad de un compuesto contenido en la muestra de ensayo para modular la actividad de un canal, bomba o cambiador de iones en una membrana.
Canales iónicos de interés incluyen, pero sin carácter limitante, canales iónicos de sodio, calcio, potasio, un catión no específico, e ion cloruro, cada uno de los cuales puede estar constitutivamente abierto, discriminado por voltaje, discriminado por ligandos, o controlado por caminos de señalización intracelulares.
Células biológicas que pueden escrutarse incluyen, pero sin carácter limitante, cultivos primarios de células de mamífero, células disociadas de tejidos de mamífero, inmediatamente o después de cultivo primario. Tipos de células incluyen, pero sin carácter limitante, glóbulos blancos de la sangre, v.g. leucocitos, hepatocitos, células \beta pancreáticas, neuronas, células de la musculatura lisa, células del epitelio intestinal, miocitos cardíacos, células de glía, y análogas. La invención incluye también el uso de células recombinantes en las cuales se han insertado y expresado por ingeniería genética transportadores iónicos, canales, bombas y cambiadores iónicos. Muchas secuencias de cDNA para transportadores de este tipo han sido clonadas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.380.836 para un canal de sodio clonado) y métodos para su expresión en líneas de células de interés están dentro del conocimiento de un experto en la técnica (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.436.128). Líneas de células cultivadas representativas derivadas de seres humanos y otros mamíferos incluyen células LM (TK^{-}), HEK293 (células de riñón de embrión humano), fibroblastos 3T3, células COS, células CHO, células RAT1 y células HLHepG2.
Los métodos de escrutinio descritos en esta memoria pueden aplicarse a células desarrolladas en superficies sólidas o depositadas sobre las mismas. Una técnica común consiste en utilizar un pocillo de placa de microtitulación en el cual las medidas de fluorescencia se realizan por medio de lectores de placas fluorescentes disponibles comercialmente. La invención incluye escrutinio de alta capacidad en sistemas tanto automáticos como semiautomáticos. Un método de este tipo consiste en utilizar células en placas Costar de microtitulación de 96 pocillos (aplastadas con fondo claro) y medir la señal fluorescente con un lector de placas de pocillos múltiples CytoFluor (Perseptive Biosystems, Inc., MA) utilizando dos longitudes de onda de emisión para registrar las relaciones de emisión fluorescente.
La invención puede comprenderse mejor con referencia a los ejemplos que se acompañan, los cuales tienen por objeto únicamente propósitos de ilustración y no deben interpretarse como limitantes en ningún sentido del alcance de la invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas a esta memoria. Todos los ejemplos que no son abarcados por las reivindicaciones están por razones de comparación.
Ejemplos Ejemplo I Síntesis de colorantes oxonol
Todos los materiales de partida y los reactivos eran de la máxima pureza disponible (Aldrich; Milwaukee, WI) y se utilizaron sin purificación ulterior, excepto en los casos en que se indica. Los disolventes eran de calidad HPLC (Fisher) y se secaron sobre tamices moleculares 3\ring{A} activados. Los espectros NMR se obtuvieron en un espectrómetro Variant Gemini de 200 MHz (Palo Alto, CA). Los espectros se referenciaron con relación al pico de disolvente residual (CHCl_{3}, \delta = 7,24 ppm). Los espectros de fluorescencia se tomaron en un equipo SPEX Fluorolog-2 (Edison, NJ) y se corrigieron por las variaciones de longitud de onda de lámpara y detector utilizando los archivos de corrección suministrados por el fabricante.
Bis-(1,3-dibutil-2-tiobarbiturato)-trimetino-oxonol DiSBA-C_{4}-(3)
Se sintetizó DiSBA-C_{4}-(3) sobre la base del procedimiento para el derivado etilado [Patente Británica 1.231.884]. Se disolvió 1,3-dibutil-tiobarbituraro (500 mg, 2 milimoles) en 700 \mul de piridina. Se añadió a esta solución una mezcla de 181 \mul (1,1 milimoles) de malonaldehido-bis(dimetil-acetal) y 100 \mul de HCl 1 M. La solución se volvió inmediatamente de color rojo. Al cabo de 3 h, se retiró la mitad de la mezcla de reacción y se añadieron dos equivalentes del malonaldehído protegido cada hora durante 4 h a la mezcla restante. La mezcla de reacción se filtró luego para recoger cristales de color púrpura/negro de la sal de piridinio de DiSBA-C_{4}-(3). Después de lavado de los cristales con agua y secado subsiguiente a vacío (0,5 torr), se recogieron 67,2 mg de producto puro. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 8,91 (2H, d, J = 5,1 Hz, py), 8,76 (1H, t, J = 13,7 Hz, metino central), 8,52 (1H, t, J = 8,0 Hz, py), 8,16 (2H, d, J = 13,9 Hz, metino), 8,00 (2H, dd, J_{1} \approx J_{2} = 6,9 Hz, py), 4,47 (8H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,69 (8H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,39 (8H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,95 (12H, t, J = 6,4 Hz, metilo).
Para preparar tiobarbiturato de 1,3-dibutilo, se disolvieron lentamente 1,22 g de Na (53 milimoles) en 20 ml de etanol seco en atmósfera de argón. Se añadieron a la solución de etóxido 8,5 g (8 ml, 53 milimoles) de malonato de dietilo seguidos por 5 g (26,5 milimoles) de dibutiltiourea. La mezcla de reacción se calentó y se mantuvo a reflujo durante 3 días. Después de enfriar, se filtró la mezcla. Se clarificó el filtrado con adición de agua. Se añadió luego HCl concentrado hasta que el pH fue 1-2. El filtrado ácido se extrajo luego tres veces con hexanos. El extracto se concentró y se separaron de la solución por precipitación 5,5 g de producto bruto. Se recristalizó el sólido en metanol con adición de pequeñas cantidades de agua, obteniéndose 4,23 g del ácido barbitúrico puro (75%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 4,33 (4H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 3,71 (2H, s, CH_{2} del anillo), 1,63 (4H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,35 (4H, cm, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,94 (6H, t, J = 6,2 Hz, metilo).
Bis-(1,3-dihexil-2-tiobarbiturato)-pentametino-oxonol (DiSBA-C_{6}-(5))
Se mezclaron ácido 1,3-dihexil-2-tiobarbitúrico (200 mg, 0,64 milimoles) y monohidrocloruro de glutacondialdehido-dianilo (cuyo nombre en Chem. Abs. es monohidrocloruro de N-[5-(fenilamino)-2,4-pentadienilideno]bencenamina) (91 mg, 0,32 milimoles) en 1 ml de piridina. En el transcurso de 10 s, la solución se volvió azul. Después de dejar la mezcla de reacción en agitación durante 1,5 h, se eliminó el disolvente a un vacío elevado. El residuo se disolvió en CHCl_{3} y se cromatografió sobre gel de sílice, eluyendo con una solución (93:7) de CHCl_{3}/MeOH. Se recuperó el oxonol azul puro (72 mg) ^{1}H NMR (CDCl_{3}/CD_{3}OD): d 7,60-7,80 (cm, 4H, metinos), 7,35 (t, J = 11,3 Hz, 1H, metino central), 4,31 (cm, 8H, NCH_{2}R), 1,57 (cm, 8H, NCH_{2}CH_{2}R), 1,20 (br m, 24H, la mayor parte de los metilenos), 0,74 (br t, 12H, metilo).
Se prepararon otros oxonoles utilizando el mismo procedimiento, partiendo de la tiourea apropiada preparada a partir de la amina primaria requerida y disulfuro de carbono [Bortnick, N., Luskin, L.S., Hurwitz, M.D., y Rytina, A.W. 1956. t-Carbinaminas, R'R''CNH_{2}. III. La preparación de isociyanatos, isotiocianatos y compuestos afines. J. Am. Chem. Soc. 78: 4358-4361]. Una síntesis ilustrativa de Di-SBA-C_{6}-(3) se presenta en la Fig. 13.
Ejemplo II Síntesis de fosfolípidos fluorescentes
Cou-PE: Se sintetizó 3-amidoglicina-6-cloro-7-butiriloxi-cumarina como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación, Nº de Serie 08/407.554, presentada el 20 de marzo de 1995, como se expone a continuación. Para la síntesis de 2,4-dihidroxi-5-clorobenzaldehído, se disolvieron 21,7 g (0,15 moles) de 4-clororresorcinol en 150 ml de éter dietílico seco y se añadieron 27 g de cianuro de cinc-(II) finamente pulverizado y 0,5 g de cloruro de potasio, con agitación. La suspensión se enfrió en hielo. Se pasó una corriente intensa de cloruro de hidrógeno gaseoso a través de la solución con agitación enérgica. Al cabo de aproximadamente 30 minutos, se disolvieron las sustancias reaccionantes. Se continuó la adición de cloruro de hidrógeno gaseoso hasta que dejó de ser absorbido en la solución etérea (aproximadamente 1 hora). Durante este tiempo se formó un precipitado. La suspensión se agitó en hielo durante una hora más. A continuación se dejó sedimentar el sólido. Se separó el sólido por vertido de la solución etérea. Se trató el sólido con 100 g de hielo y se calentó a 100ºC en un baño de agua. Después de enfriar, el producto se separó de la solución cristalizado en placas brillantes. Se separaron las placas por filtración y se secaron sobre hidróxido de potasio. El rendimiento fue 15,9 g (0,092 moles, 61%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 6,23 ppm (s, 1H, fenol), \delta 6,62 ppm (s, 1H, fenilo), \delta 7,52 ppm (s, 1H, fenilo), \delta 9,69 ppm (s, 1H, formilo), \delta 11,25 ppm (s, 1H, fenol).
Para preparar 3-carboxi-6-cloro-7-hidroxi-cumarina, se disolvieron 5,76 g (0,033 moles), de 2,4-dihidroxi-5-clorobenzaldehído y 7,2 g (0,069 moles) de ácido malónico en 5 ml de piridina moderadamente caliente. Se agitaron 75 microlitros de anilina en la solución y se dejó en reposo la mezcla de reacción a la temperatura ambiente durante 3 días. El sólido amarillo que se formó se rompió en trozos más pequeños y se añadieron 50 ml de etanol. La suspensión cremosa se filtró a través de una frita de vidrio y el sólido se lavó tres veces con ácido clorhídrico 1 N y a continuación con agua. Se agitó luego el sólido con 100 ml de acetato de etilo, 150 ml de etanol y 10 ml de ácido clorhídrico semi-concentrado. El volumen de disolvente se redujo a vacío y el precipitado se recuperó por filtración, se lavó con éter dietílico y se secó sobre pentóxido de fósforo. Se obtuvieron 4,97 g (0,021 moles, 63%) de producto como un polvo blanco. ^{1}H NMR (d-DMSO): \delta 6,95 ppm (s, 1H), \delta 8,02 ppm (s, 1H), \delta 8,67 ppm (s, 1H).
Para preparar 7-butiriloxi-3-carboxi-6-clorocumarina, se disolvieron 3,1 g (12,9 milimoles) de 3-carboxi-6-cloro-7-hidroxicumarina en 100 ml de dioxano y se trataron con 5 ml de anhídrido butírico, 8 ml de piridina y 20 mg de dimetil-aminopiridina a la temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de reacción se añadió con agitación a 300 ml de heptano, después de lo cual se formó un precipitado blanco. Se recuperó el mismo por filtración y se disolvió en 150 ml de acetato de etilo. Se eliminó por filtración el material no disuelto y el filtrado se extrajo dos veces con 50 ml de ácido clorhídrico 1 N/salmuera (1:1) y a continuación con salmuera. La solución se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación a vacío produjo 2,63 g (8,47 milimoles, 66%) de producto. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, metilo butírico), \delta 1,85 ppm (m, 2H, J_{1} \approx J_{2} = 7,4 Hz, metileno butírico), \delta 2,68 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, metileno butírico), \delta 7,37 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 7,84 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 8,86 ppm (s, 1H, cumarina).
La preparación de 7-butiriloxi-3-benciloxicarbonilmetilaminocarbonil-6-cloro-cumarina se realiza como sigue. Se disolvieron 2,5 g (8,06 milimoles) de 7-butiriloxi-3-carboxi-6-clorocumarina, 2,36 g de hidrato de hidroxibenzotriazol (16 milimoles) y 1,67 g (8,1 milimoles) de diciclohexil-carbodiimida en 30 ml de dioxano. Una solución en tolueno de o-bencilglicina [preparada por extracción de 3,4 g (10 milimoles) de sal de tosilo de bencilglicina con acetato de etilo-tolueno-bicarbonato acuoso saturado-agua (1:1:1:1, 250 ml), secado de la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro y reducción del volumen de disolvente a 5 ml] se añadió gota a gota a la solución de cumarina. La reacción se mantuvo a la temperatura ambiente durante 20 horas, después de lo cual el precipitado se separó por filtración y se lavó a fondo con acetato de etilo y acetona. Las fracciones de disolvente reunidas se redujeron a 50 ml en un evaporador rotativo, después de lo cual se añadió un volumen de tolueno y el volumen se redujo ulteriormente a 30 ml. El producto que precipitó se recuperó por filtración y se disolvió en 200 ml de cloroformo-etanol absoluto (1:1). La solución se redujo a 50 ml en un evaporador rotativo y el producto se separó por filtración y se secó a vacío, obteniéndose 1,29 g del producto del título. La reducción ulterior del volumen de disolvente produjo una segunda cosecha (0,64 g). Rendimiento total: 1,93 g (4,22 milimoles, 52%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,08 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, metilo butírico), \delta 1,84 ppm (m, 2H, J_{1} \approx J_{2} = 7,4 Hz, metileno butírico), \delta 2,66 ppm (t, 2H, J = 7,4 Hz, metileno butírico), \delta 4,29 ppm (d, 2H, J = 5,5 Hz, metileno de glicina), \delta 5,24 ppm (s, 2H, bencilo), \delta 7,36 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 7,38 ppm (s, 5H, fenilo), \delta 7,77 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 8,83 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 9,15 ppm (t, 1H, J = 5,5 Hz, amida).
Se preparó 7-butiloxi-3-carboximetilaminocarbonil-6-clorocumarina como sigue. Se disolvieron 920 mg (2 milimoles) de 7-butiloxi-3-benciloxicarbonilmetilaminocarbonil-6-clorocumarina en 50 ml de dioxano. Se añadieron a la solución 100 mg de paladio sobre carbono (10%) y 100 microlitros de ácido acético, y la suspensión se agitó enérgicamente en una atmósfera de nitrógeno a la temperatura ambiente. Después que hubo cesado la absorción de hidrógeno, se filtró la suspensión. El producto que contenía carbono se extrajo 5 veces con 25 ml de dioxano hirviente. Las soluciones en dioxano reunidas se dejaron enfriar, después de lo cual precipitó el producto como un polvo blanco. La reducción del disolvente a 20 ml precipita más producto. La solución en dioxano restante se calienta a ebullición y se añade heptano hasta que la solución se vuelve turbia. Los pesos de los polvos secados eran 245 mg, 389 mg y 58 mg, totalizando 692 mg (1,88 milimoles, 94%) de producto blanco. ^{1}H NMR (d-DMSO): \delta 1,02 ppm (t, 3H, J = 7,4 Hz, metilo butírico), \delta 1,73 ppm (m, 2H, J_{1} \approx J_{2} = 7,3 Hz, metileno butírico), \delta 2,70 ppm (t, 2H, J = 7,2 Hz, metileno butírico), \delta 4,07 ppm (d, 2H, J = 5,6 Hz, metileno de glicina), \delta 7,67 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 8,35 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 8,90 ppm (s, 1H, cumarina), \delta 9,00 ppm (t, 1H, J = 5,6 Hz, amida).
Se disolvió ácido 6-cloro-7-(n-butiriloxi)cumarin-3-carboxamidoacético (26,2 mg, 100 milimoles) en 2 ml de CHCl_{3}/dioxano 1:1. Se añadió cloroformiato de isobutilo (14,3 ml, 110 milimoles) en atmósfera de Ar a 4ºC y se mantuvo en agitación durante 30 min. Por separado, se disolvió dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) (20 mg, 31,5 milimoles) en 1 ml de CHCl_{3} con una gota de MeOH seco y se añadieron 6 ml (34,5 milimoles) de diisopropiletilamina (DIEA). La solución de anhídrido mixto se pipeteó luego en la solución de fosfolípido. Al cabo de 2 h, se eliminó el disolvente a vacío. El residuo se disolvió en 3 ml de MeOH y se mezcló con 3 ml de NaHCO_{3} 0,25 M. La solución se volvió casi inmediatamente de color amarillo y se agitó durante 15 min. La solución se extrajo luego 3-5 veces con CHCl_{3}. Se formó una emulsión falsa. Los extractos se reunieron y se concentraron. El residuo se disolvió en 1 ml de MeOH/H_{2}O 1:1 y se purificó en una columna de fase inversa C_{18} (1,7 X 7 cm). Por elución con el mismo disolvente, pasó una banda fluorescente a través de la columna, seguida por otra más lenta. La polaridad del disolvente se redujo a MeOH/H_{2}O 9:1 y la banda amarilla principal se eluyó luego de la columna. Después de concentración y secado, se recogieron 2,5 mg (2,74 milimoles) de producto puro. ^{1}H NMR (CD_{3}OD): d 8,72 (s, 1H, cumarina), 7,81 (s, 1H, cumarina), 6,84 (s, 1H, cumarina), 5,25 (cm, 2H), 4,43 (dd, J_{1} = 12,1 Hz, J_{2} = 3,2 Hz, 4,22 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,13 (s, \sim4H), 3,7-4,1 (cm, \sim11H), 3,47 (cm, \sim3H), 3,2-3,3 (\simq), 2,31 (cm, \sim7H), 1,57 (br s, \sim8H, CH_{2} a respecto a carbonilo), 1,2-1,5 (cm, \sim63H, la mayor parte de los CH_{2}'s), 0,92 (t sin resolver, \sim12H, CH_{3}). Pulverización electrónica (ion negativo) MS [MeOH/H_{2}O: 95/5] (pico, intensidad relativa) 456,8 (M^{-2}, 20), 524,5 (50), 704,9 (6), 734,7 (100), 913,9 (M^{-1}, 95); M descompuesto = 915,3 amu (unidades de masa atómica); M calculado: 915,5 amu. UV-vis (MeOH/HBSS; 2/1) \lambda_{max} = 414 nm. Fluorescencia (MeOH/HBSS; 2/1) \lambda_{max} = 450 nm. Rendimiento cuántico = 1,0.
Cy5-PE: Se disolvió DMPE (1,0 mg, 1,6 milimoles) en 650 ml de CHCl_{3}/-MeOH (12:1) y se añadió DIEA (1 ml, 5,7 milimoles). Por separado, se disolvió Cy5-OSu (Amersham; Arlington Heights, IL), el éster de N-hidroxisuccinimida de N-etil-N'-(5-carboxipentil)-5,5'-disulfoindodicarbocianina (0,5 mg, 1 milimol) en 150 ml de CHCl_{3}/MeOH (2:1) y se añadió a la solución de fosfolípido. Después de 3 h, se eliminó el disolvente a vacío. El residuo se disolvió en MeOH y se cargó en una columna de fase inversa C_{18} (1 X 10 cm) equilibrada con MeOH/H_{2}O 1:1. Eluyendo con el mismo disolvente, se separó el éster hidrolizado. La polaridad se redujo a MeOH/H_{2}O 9:1 y el producto puro de color azul se eluyó de la columna, obteniéndose 400 mg (310 \mumol, 31%).
Ejemplo III Síntesis de enlazador para donantes y aceptores
Este ejemplo hace referencia a las Figs. 14-16.
12-p-Metoxibenciltio-1-dodecanol (1): Se disolvió Na (800 mg, 34,8 milimoles) en 30 ml de MeOH seco. En atmósfera de argón, se añadió p-metoxibencilmercaptano (2,75 ml, 3,04 g, 19,7 milimoles) a la solución de metóxido. Al cabo de unos cuantos minutos, se introdujo gota a gota 12-bromododecanol (2,5 g, 9,43 milimoles) en la mezcla de reacción. En el transcurso de 5 minutos comenzó a separarse un sólido de la solución. Al cabo de un mínimo de 3 h, se filtró la mezcla de reacción y se lavó 3 veces con MeOH frío, obteniéndose 2,874 g (8,49 milimoles, 90%) de producto puro después de secado. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H, AA' del sistema aromático AA' BB'), 6,85 (d, J = 8,8 Hz, 2H, BB' del sistema aromático AA' BB'), 3,80 (s, 3H, metoxi), 3,66 (s, 2H, bencilo), 3,64 (dt, J_{1} = 6,6 Hz, J_{2} = 5,5 Hz, 2H, RCH_{2}OH), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2H, RSCH_{2}R), 1,50-1,65 (cm, 4H, CH_{2} b respecto a los heteroátomos), 1,2-1,4 (cm, 16H, la mayor parte de los metilenos).
12-t-Metoxibenciltio-1-bromododecano (2): Se mezcló (1) (500 mg, 1,48 milimoles) con tetrabromuro de carbono (611 mg, 1,85 milimoles) en 2,5 ml de CH_{2}Cl_{2} y se enfrió en un baño de hielo hasta que comenzó a separarse un sólido de la solución. Se retiró el baño de hielo y se añadió trifenilfosfina (348 mg, 2,22 milimoles) a la mezcla de reacción. La solución se volvió inmediatamente de color amarillento. El material de partida se había consumido al cabo de 30 min de acuerdo con la cromatografía en capa fina (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography) (EtOAc/hexano, 1:1). Se eliminó el disolvente y se añadieron al residuo sólido 50 ml de hexano. Después de agitar durante una noche, la solución se filtró y se concentró para dar un sólido. El sólido se mezcló luego con aproximadamente 10-15 ml de hexano y se filtró nuevamente. El filtrado concentrado produjo 537 mg (1,34 milimoles, 91%) de producto puro después de secado. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 7,23 (d, J = 8,6 Hz, 2H, AA' del sistema aromático AA' BB'), 6,85 (t, J = 8,7 Hz, 2H, BB' del sistema aromático AA' BB'), 3,80 (s, 3H, metoxi), 3,67 (s, 2H, bencilo), 3,41 (t, J = 6,9 Hz, 2H, RCH_{2}Br), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2H, RSCH_{2}R), 1,86 (cm, 2H, CH_{2} b respecto a Br), 1,15-1,45 (cm, 18H, la mayor parte de los metilenos).
Ácido 12-(12-p-metoxibenciltio-1-dodeciltio)-dodecanoico (3): Se disolvió Na (116 mg, 5 milimoles) en MeOH seco. Se añadió a la solución de metóxido ácido 12-mercapto-1-dodecanoico (340 mg, 1,46 milimoles) - sintetizado de acuerdo con JACS 115, 3458-3474, 1993. Después de agitar con calentamiento durante 5 min, se añadió a la mezcla de reacción (2) (497 mg, 1,24 milimoles). La mezcla de reacción se volvió muy viscosa y se introdujeron 1,75 ml de MeOH adicionales. La reacción se dejó luego transcurrir durante una noche. Se extinguió la reacción con ácido acético al 10%. La mezcla de reacción semejante a una pasta se tranfirió a un embudo separador de 500 ml disuelto en volúmenes iguales de EtOAc/hexano (1:1) y la solución de ácido acético. Se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo luego dos veces más. Los extractos reunidos se concentraron, obteniéndose 740,3 mg (1,34 milimoles) de producto bruto. El exceso de ácido acético se separó como un azeótropo con tolueno. Se cristalizó el sólido en éter isopropílico, obteniéndose 483 mg (71%). La TLC y la NMR detectan una impureza que se cree es un producto secundario de disulfuro. El material se purificó ulteriormente por cromatografía instantánea, eluyendo con CHCl_{3}/MeOH/AA (99:0,5:0,5), obteniéndose 334 mg (0,604 milimoles, 49%) de producto puro. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 9,45 (br s, 1H, COOH), 7,23 (d, J = 8,8 Hz, 2H, AA' del sistema aromático AA' BB'), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, BB' del sistema aromático AA' BB'), 3,80 (s, 3H, metoxi), 3,66 (s, 2H, bencilo), 2,50 (t, J = 7,3 Hz, 4H, RCH_{2}SCH_{2}R), 2,40 (t, J = 7,3 Hz, 2R, RSCH_{2}R), 2,35 (t, J = 7,5 Hz, 2H, RCH_{2}COOH), 1,5-1,7 (cm, 8H, CH_{2} b respecto a los heteroátomos), 1,15-1,45 (dm, 30H, la mayor parte de los metilenos). ^{13}C NMR (CDCl_{3}): d 179,5 (COOH), 129,9 (aromático, 2C), 113,9 (aromático, 2C), 55,2 (MeOR), 35,6 (CH_{2}), 33,7 (CH_{2}), 32,2 (CH_{2}), 31,3 (CH_{2}), 29,7 (CH_{2}), 29,4 (CH_{2}), 29,2 (CH_{2}), 28,9 (CH_{2}), 24,6 (CH_{2}).
Tiobarbiturato del ácido 1-butil-3-(12-(12-pentiltio-1-dodeciltio)-dodecanoico (13): Se desprotegió (3) (73,8 mg, 133,5 \mumoles) en 2 ml de TFA seco/anisol (14:1) a 70ºC durante 2,5 h. Se eliminó el disolvente a vacío y el residuo se disolvió en 10 ml de EtOH seco. Se añadió borohidruro de sodio (330 mg) y la mezcla se agitó durante una noche. Se acidificó luego la solución con HCl conc. hasta que cesó el desprendimiento de gas. La solución se extrajo luego cuatro veces con éter. Los extractos reunidos se concentraron dejando un sólido blanco. El sólido se disolvió luego y se concentró dos veces con MeOH desgasificado. Después de secado a alto vacío, se recuperaron 69,5 mg de sólido. Se estimó por TLC que este sólido era una mezcla 1:1 del producto desprotegido y di-p-metoxifenilmetano (104 \mumoles, 78%). El enlazador desprotegido se disolvió en 0,5 ml de DMF seca, con calentamiento. Se añadió NaH (\sim550 \mumoles), lo que produjo cierto desprendimiento de gas. Se añadió luego (8) (38,5 mg, \sim 100 \mumoles) a la mezcla de reacción en 100 \mul de DMF, y la reacción se dejó transcurrir durante una noche a 60ºC. La TLC en EtOAc/MeoH/AA (90:8:2) indicó que se había formado un nuevo ácido barbitúrico más apolar. Se separó el disolvente y se disolvió el residuo en EtOAc/hexano (1:1) y se lavó con agua. El material se purificó luego por cromatografía, eluyendo con EtOAc/MeOH/AA (90:8:2). La NMR del producto exhibió resonancia respecto a ácido barbitúrico y al enlazador. Pulverización electrónica (ion negativo) MS [MeOH/H_{2}O: 95/5] (pico, intensidad relativa) 516,4 (95), 699,4 (M^{-1}, 100), 715,1 (M^{-1} + 16, 40), 1024,0 (M^{-1} + 32, 25); M^{-1} calculado = 700,1 amu. El enlazador etéreo parece oxidarse parcialmente a sulfóxido.
1-(1,3-Dibutil-tiobarbiturato)-3-(1-butil-3-(12-(12-pentiltio-1-dodeciltio)-ácido dodecanoico)-tiobarbiturato)-trimetino-oxonol (14): Se desprotegió (3) (73,8 mg, 133,5 \mumoles) en 2 ml de TFA seco/anisol (14:1) a 70ºC durante 2,5 h. Se eliminó el disolvente a vacío y se disolvió el residuo en 20 ml de EtOH seco. Se añadió borohidruro de sodio (330 mg) y la mezcla se agitó durante una noche. La solución se acidificó luego con HCl conc. hasta que cesó el desprendimiento de gas. La solución se extrajo luego 4 veces con éter. Los extractos reunidos se concentraron, dejando un sólido blanco. El sólido se disolvió luego y se concentró dos veces con MeOH desgasificado. Después de secado a alto vacío, se recuperaron 71,1 mg de sólido. Se estimó por TLC que este sólido era una mezcla 1:1 del producto desprotegido y di-p-metoxifenilmetano (106 \mumoles, 79%). El enlazador desprotegido se disolvió en 1 ml de DMF seca, con calentamiento. Se añadió NaH (\sim350 \mumoles), lo que causó cierto desprendimiento de gas. Se añadió luego (12) (35,5 \mumoles) a la mezcla de reacción en 200 \mul de DMF. La reacción no continuaba aparentemente al cabo de 1 h, por lo que se añadieron 4 mg de N.H. (60%) a la mezcla de reacción. La solución se volvió entonces de color anaranjado en lugar de roja, y comenzó a formarse un segundo oxonol apolar. La reacción, calentada a 60ºC, se dejó continuar durante 18 h. La mitad de la mezcla de reacción se trató como sigue. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de decantación de 30 ml en \sim12 ml de tolueno. Se añadieron aproximadamente 4 ml de una solución de ácido acético al 10% y 3 ml de agua La mayor parte del oxonol se distribuyó en la capa orgánica, la cual se lavó tres veces con solución de ácido acético/agua (1:1). La capa orgánica se concentró luego y se purificó por cromatografía instantánea (2,5 x 18 cm). La columna se compactó y se eluyó primeramente con CHCl_{3}/MeOH/AA (93:5:2). Después de separar un oxonol apolar, se aumentó la polaridad del disolvente a CHCl_{3}/MeOH/AA (90:8:2). Esto hizo que el producto oxonol se eluyera de la columna. Después de concentración de las fracciones y secado, se obtuvieron 7,2 mg de producto puro (7,25 \mumoles, 20%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}/MeOH): d 8,54 (t, J = 13,8 Hz, 1H, metino central), 7,97 (d, J = 14,2 Hz, 2H, metinos), 4,39 (cm, 8H, NCH_{2}R), 2,46 (t, J = 7,3 Hz, 8H, RCH_{2}SCH_{2}R), 2,2 (t, 2H, RCH_{2}COOH), 1,5-1,8 (la mayor parte de los metilenos), 1,2-1,4 (la mayor parte de los metilenos), 0,92 (t, J = 7,2 Hz, 9H, metilos). Pulverización electrónica (ion negativo) MS [MeOH/H_{2}O: 95/5] (pico, intensidad relativa) 683 (50), 977,8 (30), 992,1 (M^{-1}, 100), 1008,1 (M^{-1} + 16, 40), 1024,0 (M^{-1} + 32, 10); M^{-1} calc. = 922,5 amu. Los picos +16 y +32 sugieren oxidación de tioéteres a grupos sulfóxido. Se ha sintetizado también con éxito (14) a partir de (13) utilizando (10) de manera similar a la descrita en la síntesis de (11).
1-(1,3-Dibutil-tiobarbiturato)-3-(1-butil-3-(12-(12-pentiltio-1-dodeciltio)-N-hidroxisuccinimida-dodecanoato)- tiobarbiturato)-trimetino-oxonol (15): Se hicieron reaccionar 22,5 \mumoles de (14) con carbonato de disuccinimidilo (57 mg, 225 \mumoles) en 0,5 ml de CH_{2}Cl_{2} en presencia de DIEA (39 \mul, 225 milimoles). Al cabo de 1,5 horas, la TLC (EtOAc/MeOH) (9:1) indicó que se habían formado tres nuevas bandas apolares. Se eliminó el disolvente y se purificaron dos bandas de oxonol apolares por cromatografía instantánea, eluyendo con (EtOAc/MeOH) (95:5). Pulverización electrónica (ion negativo) MS [MeOH/H_{2}O: 95/5] (pico, intensidad relativa) 1089,3 (M^{-1}, 20), 1105,1 (M^{-1} + 16, 100), 1121,0 (M^{-1} + 32, 60); M^{-1} calc. = 1089,5 amu.
Ejemplo IV Medida del potencial de membrana con colorantes oxonol como aceptores fret y lectinas fluorescentes como donantes fret
Se adquirió FL-WGA de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se preparó TR-WGA a partir de WGA y Rojo Texas (Molecular Probes; Eugene, OR) en un tampón de bicina 10 mM a pH 8,5. Se hizo reaccionar una solución 73 \muM de WGA con un exceso de Rojo Texas de 6 veces durante 1 h a la temperatura ambiente. El conjugado de proteínas se purificó en una columna Sephadex G-25.
Todas las células se cultivaron y manipularon como L-M(TK^{-}) excepto en los casos en que se indica. Las células L-M(TK^{-}) se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (Gibco; Grand Island, NY) con 10% de suero de bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS) (Gemini; Calabasas, CA). Las células B104 se diferenciaron con ácido retinoico 1 \muM durante 5 días antes de utilizarlas. Las células se extendieron en placas sobre cubreobjetos de vidrio al menos un día antes de utilizarlas. Las células adherentes se lavaron y mantuvieron en 2,5-3,0 ml de HBSS con 1 g/l de glucosa y HEPES 20 mM a pH 7,4. Se obtuvo una solución acuosa 75 \muM recién preparada del oxonol apropiado antes de un experimento a partir de una solución concentrada en DMSO. Las células se tiñeron mezclando 100 \mul de la solución de oxonol con 750 \mul del baño y añadiendo luego la solución diluida a las células. El colorante se dejó durante 30-40 minutos a una concentración de baño de 2,3 mM. Fue necesaria \beta-ciclodextrina 1,5 mM en la solución de baño para cargar las células de DiSBA-C_{6}-(3). Los derivados butílico y etílico eran suficientemente solubles en agua para cargar las células sin complejación con \beta-ciclodextrina. Se cargó DiSBA-C_{10}-(3) en una solución de pH 7,4 que contenía sacarosa 290 mM y HEPES 10 mM, 364 mOsm, durante 10 min a una concentración de baño de 10 \muM. La marcación de DiSBA-C_{10}-(3) se extinguió por reemplazamiento del baño con solución de HBSS. Las células se tiñeron con 15 \mug/ml de FL-WGA durante 15 minutos. Las células B104 requerían una concentración de baño de 125 \mug/ml para dar una tinción de lectina satisfactoria. Los colorantes en exceso se eliminaron por lavados repetidos con HBSS. Si el exceso de derivados de etil- o butil-oxonol se dejaba en el baño, se observaban corrientes lentas y cambios de fluorescencia debidos a la redistribución de los colorantes en la célula durante despolarizaciones mayores que 1 s. Los miocitos cardíacos [Henderson, S.A., Spencer, M., Sen, A., Kumar, C., Siddiqui, M.A.Q., y Chien, K.R. 1989. Organización de la estructura, y expresión del gen de la cadena ligera 2 de la miosina cardíaca de la rata. J. Biol. Chem. 264: 18142-18146] eran obsequio del Profesor Kenneth Chien, UCSD. Las suspensiones de linfocitos Jurkat se cultivaron en medios RPMI con FBS al 5% inactivado por calentamiento y 1% de PS. Partes alícuotas de 15-20 ml de la suspensión celular se lavaron 3 veces antes y después de la tinción con el colorante por centrifugación a 100 x g durante 4 minutos, seguido por adiciones de HBSS reciente.
Las células marcadas fluorescentemente se excitaron con luz procedente de una lámpara de xenon de 75 W pasada a través de filtros de interferencia de excitación de 450-490 nm. La luz se reflejó sobre la muestra utilizando un espejo dicroico de 505 nm. La luz emitida se recogió con una lente Zeiss 63X (abertura numérica 1,25 ó 1,4), se pasó a través de un filtro de 505 nm de longitud de paso y se dirigió contra un dicroico G-1B de 550 nm (Omega; Brattleboro, VT). La luz reflejada de este segundo dicroico se pasó a través de un filtro de paso de banda 515 DF35 y produjo la señal FL-WGA. La luz transmitida se pasó a través de un filtro de 560 ó 570 LP y comprendía la señal de oxonol. Para los experimentos que utilizaron el oxonol como donante para TR-WGA, se utilizó el dicroico de 550 nm para excitación y se utilizó un dicroico de 580 nm para descomponer la emisión. La fluorescencia del Rojo Texas de longitud de onda larga se pasó a través de un filtro de paso de banda de 605 nm DF55. Los cambios de fluorescencia dependientes del voltaje en las células simples se midieron utilizando un microscopio Nikon conectado a un fotómetro Photoscan II equipado con dos PMTs R928 para registros de emisión dual. Se aplicó una rutina de alisado de 7 puntos Savitsky-Golay a todos los datos ópticos [Savitsky, A. y Golay, M.J.E. 1964. Alisado y diferenciación de datos por un procedimiento de mínimos cuadrados simplificado. Anal. Chem. 36. 1627-1639], a no ser que se indique otra cosa. Los datos de longitud de onda simple de 1-2 Hz se adquirieron con un programa Axobasic que utilizaba la rutina de recuento de pulsos TTL LEVOKE. Las imágenes confocales se adquirieron utilizando un microcoscopio confocal de alta velocidad construido en el laboratorio de los autores [Tsien, R.Y., y B.J. Bacskai. 1924. Microscopía confocal a régimen de vídeo. En Handbook of Biological Confocal Microscopy. J.B. Pawley, compilador. Plenum Press, Nueva York]. La célula se inmovilizó por voltaje a un potencial de retención de -70 mV. Después de un retardo de 200 ms, se aplicó a la célula un pulso de voltaje cuadrado de despolarización de 200 ms a 50 mV. Se recogieron imágenes de color falso que mostraban la relación de las emisiones de FL-WGA a oxonol cada 67 ms y mostraban claramente un cambio de relación, localizado en la membrana plasmática, después de despolarización de la célula a +50 mV.
Se realizaron registros de inmovilización por parche utilizando un amplificador Axopatch 1-D equipado con una platina superior CV-4, de Axon Instruments (Foster City, CA). Los datos se digitalizaron y se almacenaron utilizando el equipo lógico PCLAMP. La solución intracelular de pH 7,4 utilizada contenía gluconato de potasio 125 mM, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 1 mM, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 2 mM, EGTA 11 mM, y HEPES 10 mM. Para las células B104, se añadieron ATP 4 mM y GTP 0,5 mM.
Se determinó el rendimiento cuántico de DiSBA-C_{6}-(3) con relación a rodamina B en etanol (_{f} = 0,97) [Weber, G. y Teale, F.W.K. 1957. Determinación del rendimiento cuántico absoluto de soluciones fluorescentes. Faraday Soc. Trans. 53: 646-655]. Se calculó R_{o} siguiendo procedimientos estándar [Wu, P. y Brand, L. 1994. Transferencia de energía de resonancia: métodos y aplicaciones. Anal. Biochem. 218: 1-13]. Los espectros de FL-WGA en HBSS y DiSBA-C_{6}-(3) en octanol se utilizaron para determinar la integral de superposición. Se utilizaron valores de 1,4 y 0,67 para el índice de refracción y el factor de orientación, respectivamente. Se eligieron bis(tiobarbiturato)oxonoles simétricos como candidatos probables para iones fluorescentes de transposición rápida sobre la base de los criterios de diseño anteriores. El máximo de absorbancia fuerte (\sim200.000 M^{-1} cm^{-1}) a 540 nm y el rendimiento cuántico satisfactorio (0,40) en membranas hace que los mismos sean deseables para uso como donantes o aceptores de fluorescencia en las células. Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia de DiSBA-C_{6}-(3) se muestran en la Fig. 2 junto con los correspondientes a FL-WGA y TR-WGA. Los espectros de excitación son el más corto de cada par. Se seleccionó octanol como el disolvente de los oxonoles a fin de mimetizar el entorno de la membrana.
Las tasas de transposición se estudiaron en células L-M(TK^{-}) utilizando registro de inmovilización por voltaje de la célula entera. Se seleccionaron las células L-M(TK^{-}) debido a que tienen corrientes de fondo muy bajas y son fáciles de someter a inmovilización por parche. Estas células tienen un potencial residual de -5 mV y carecen de corrientes activadas por voltaje evidentes.
Las corrientes de desplazamiento de DiSBA-C_{6}-(3) a 20ºC se presentan en la Fig. 3. Se aplicaron a la célula pasos de voltaje de 12,5 ms de longitud a incrementos de 15 mV, desde un potencial de retención de -70 mV. Las extracorrientes mayores y más rápidas debidas a extracorrientes de capacitancia de membrana simple podían minimizarse utilizando las capacidades de compensación de capacitancia y resistencia en serie del multiplicador Axopatch, que permitía observar claramente las corrientes de desplazamiento. Las corrientes se deben a la redistribución del oxonol fijado a la membrana en respuesta a 8 despolarizaciones. La constante de tiempo para la corriente de desplazamiento es 2 ms para despolarización de 120 mV. Cantidades iguales de carga se desplazan al principio y al final del paso de voltaje, pero en direcciones opuestas, coherentemente con la redistribución de los iones almacenados desde un mínimo de energía al otro a través de la membrana plasmática. Adicionalmente, se calcula que la capacitancia inducida dq/dV del movimiento de oxonol es \sim5 pF para despolarización de 100 mV. Este valor corresponde aproximadamente a un tercio de la capacitancia de membrana sin el colorante. Resulta interesante que las cargas de discriminación de los canales de sodio son también responsables de aproximadamente el 33% de la capacitancia total de los axones de calamar para despolarizaciones pequeñas [Hodgkin, A. 1975. La densidad óptima del canal de sodio en un nervio desmielinado. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [Biol] 270: 297-300]. Se observaron corrientes insignificantes en ausencia del oxonol. DiSBA-C_{10}-(3) daba corrientes de desplazamiento de aproximadamente la misma velocidad, mientras que los análogos con R = butilo y etilo daban corrientes mucho más lentas. El compuesto butílico tenía una constante de tiempo de \sim18 ms, y las corrientes del compuesto etílico eran muy pequeñas, lentas y difíciles de observar.
Las Figs. 4 y 5 muestran la dependencia de voltaje y las constantes de tiempo para la transposición de carga en una célula cargada con aproximadamente 4 veces más oxonol que en el experimento de la Fig. 3. En la Fig. 4, los círculos son los datos a partir de la respuesta en funcionamiento y los cuadrados corresponden a las corrientes de cola. Los datos brutos se ajustaron a una exponencial simple y la carga desplazada, el área, se calculó como el producto de la amplitud de corriente y la constante de tiempo. Los datos experimentales están razonablemente de acuerdo con los modelos existentes de transporte de iones hidrófobos entre dos mínimos de energía cerca de las interfases acuosas de la bicapa lipídica [Ketterer, B., Neumcke, B., y Läuger, P. 1971. Mecanismo de transporte de iones hidrófobos a través de membranas de bicapa lipídica. J. Membrane Biol. 5: 225-245; Andersen, O.S., y Fuchs, M. 975. Barreras de energía potencial para el transporte de iones dentro de una bicapa lipídica. Biophys. J. 15: 795-830; Benz, R., Läuger P., y Hanko, K. 1976. Cinética del transporte de iones hidrófobos en membranas de bicapa lilpídica. Biochim. Biophys. Acta. 455: 701-720]. Estos modelos predicen que el desplazamiento de la carga de equilibrio q(V) y la constante de tiempo de transposición (V) dependerían del potencial de membrana V aplicado externamente, de la manera siguiente:
(1)\Delta q(V)= \Delta q_{max} tanh \left[\frac{q \beta (V-V_{h})}{2KT}\right]
(2)\tau (V) = \tau _{max} sech \left[\frac{q \beta (V-V_{h})}{2KT}\right]
V_{h}, el potencial de membrana para el cual existen números iguales de iones en cada manantial de energía potencial, podría diferir de cero debido a la asimetría de la membrana. \beta es la fracción del potencial aplicado externamente percibida eficazmente por el ion que sufre la transposición, q es la carga en cada ion, k y T son la constante de Boltzmann y la temperatura abosluta. q_{max} y \tau_{max} son respectivamente la carga total en cada manantial de energía y la constante de tiempo para la transposición, ambas para V = V_{h}. La curva alisada de la Fig. 4 es el ajuste para la ecuación 1 con q_{max} = 4470 \pm 140 fC, \beta = 0,42 \pm 0,02, y V_{h} = -3,8 \pm 1,5 mV. Análogamente, la curva alisada de la Fig. 5 es el ajuste para la ecuación 2 con t_{max} = 2,9 ms para V_{h} = -5 mV y \beta = 0,42.
Estos resultados demuestran que el oxonol detecta una parte significativa del campo eléctrico a través de la membrana, que el mismo se transpone en \sim 3 ms o menos, y que la sensibilidad y linealidad máxima de transposición en función del potencial de membrana se encuentra en el intervalo fisiológicamente relevante.
Para transducir los desplazamientos de carga en señales ópticas, las fluorescencias de oxonol en los sitios de fijación de la membrana intracelulares y extracelulares se hacen diferentes. Se crea asimetría de fluorescencia con la introducción de lectinas marcadas fluorescentemente fijadas a la superficie extracelular de la membrana. La excitación de FL-WGA conduce a transferencia de energía a los oxonoles localizados en el sitio de fijación extracelular de la membrana como se muestra en la Fig. 1. Se midieron el coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico de fluorescencia de FL-WGA, encontrándose que eran 222.000 M^{-1} cm^{-1} (\sim3 fluoresceína/proteína) y 0,23, respectivamente. En las suspensiones de células Jurkat marcadas con FL-WGA, hasta 30% de la intensidad de fluorescencia de la lectina se extinguió después de la titulación de DiSBA-C_{4}-(3). En el mejor de los casos, en el que la totalidad de la extinción es debida a transferencia de energía, la distancia media desde la lectina al oxonol fijado a la membrana es todavía mayor que 50 \ring{A}, la distancia R_{o} Föster calculada para el par FL-WGA/oxonol. La superposición espectral entre la emisión de FL-WGA y la excitación de DiSBA-C_{6}-(3) se da en la Fig. 2. Dado que la FRET disminuye con la sexta potencia inversa de la distancia que separa los dos fluoróforos, la transferencia de energía a los oxonoles en el sitio de membrana intracelular, alejado 40\ring{A} adicionales, es probablemente insignificante.
Después de la despolarización, las moléculas de oxonol se redistribuyen de tal manera que un mayor número se fijan al sitio intracelular y un número menor al sitio extracelular. Este cambio se manifiesta por sí mismo con una disminución de la transferencia de energía, dando como resultado un aumento en la fluorescencia de la FL-WGA y una disminución concomitante en la emisión de oxonol. Las señales de fluorescencia en una célula L-M(TK^{-}) inmovilizada por voltaje con el par DiSBA-C_{4}-(3)/FL-WGA y despolarizada con 4 pasos de aumento de voltaje se muestran en la Fig. 6. Los datos son el valor medio de 29 barridos. La emisión de FL-WGA aumenta 7-8%, la fluorescencia de oxonol disminuye 10% y la relación de emisión FL-WGA/oxonol cambia 19% para una despolarización de 120 mW. Los cambios simultáneos en las emisiones de donante y aceptor son coherentes con el mecanismo FRET reseñado en la Fig. 1. La disminución en la emisión de oxonol con la despolarización es opuesta a lo que se observa para la absorción lenta sensible al voltaje de oxonoles en las células [Rink et al., 1980, supra]. Los cambios de fluorescencia tienen constantes de tiempo de \sim 18 ms a 20ºC, de acuerdo con las corrientes de desplazamiento de DiSBA-C_{4}-(3). No se observan en ningún caso cambios de fluorescencia grandes en ausencia de FL-WGA. La tasa de transposición de DiSBA-C_{4}-(3) se acelera con la temperatura creciente. La constante de tiempo desciende a 7-8 ms a 29ºC, correspondiendo a una energía de activación de \sim 17 kcal/mol. Sin embargo, el aumento de temperatura incrementa también la internalización de la lectina y finalmente reduce el cambio de fluorescencia. Los oxonoles con R = etilo y butilo alcanzan también las membranas celulares internas, aunque probablemente no es necesaria la internalización de la membrana activa. La dilución adicional de las señales FRET dependientes del voltaje surge de la superposición espectral de la fluoresceína y el oxonol, de tal modo que una parte de la luz en el canal de emisión de fluoresceína procede del oxonol, y viceversa.
El aumento de la longitud de las cadenas alquílicas en el oxonol mejora significativamente los tiempos de respuesta. El par DiSBA-C_{6}-(3)/FL-WGA, tiene una constante de tiempo de \sim 3 ms a 20ºC, mientras que el par DiSBA-C_{10}-(3)/FL-WGA, responde con una constante de tiempo de 2 ms, como se muestra en la Fig. 7. La curva de trazo continuo es un ajuste a una exponencial simple con una constante de tiempo de 2 ms. Los datos son el valor medio de 3 células L-M(TK^{-}), a 20ºC adquiridos a 2 kHz. La respuesta en la figura es ligeramente más lenta que el valor verdadero, al alisado. Las constantes de tiempo de fluorescencia están de acuerdo con las de las corrientes de desplazamiento, por ejemplo en la Fig. 3. El efecto beneficioso de la adición de carácter hidrófobo al oxonol en forma de cadenas alquílicas más largas alcanza una meseta. Se produce un aumento grande de 6 veces en la tasa de transposición cuando se emplea hexilo en sustitución de butilo en el nucleo del oxonol. Sin embargo, la adición de dos veces más grupos metileno al pasar del compuesto hexilo al compuesto decilo da como resultado un aumento inferior al doble. Estos oxonoles de transposición más rápida son esencialmente insolubles en agua y requieren procedimientos modificados para su carga en las células. DiSBA-C_{6}-(3) se carga fácilmente en medio normal suplementado con \beta-ciclodextrina 1,5 mM para complejar las cadenas alquílicas. Los agregados DiSBA-C_{6}-(3) no fluorescentes en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) se vuelven fluorescentes por adición de \beta-ciclodextrina. DiSBA-C_{10}-(3) requiere carga en un medio de baja fuerza iónica con osmolaridad mantenida con sacarosa. La marcación se confina casi exclusivamente a la membrana plasmática, debido probablemente a que el carácter hidrófobo es ahora lo suficientemente grande para impedir la desorción de la membrana principal que encuentra el colorante.
Ejemplo V Medida del potencial de membrana con colorantes de oxonol como aceptores fret y donantes fret constituidos por lípidos fluorescentes A. Trimetino-oxonoles
Se ha preparado una 6-cloro-7-hidroxicumarina conjugada a dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPS) a través de un enlazador glicina, Cou-PE, y se ha encontrado que funciona como un donante FRET excelente sensible al voltaje para bis-(1,3-dialquil-2-tiobarbiturato)-trimetino-oxonoles. Este nuevo par FRET ha dado un cambio de relación de 80% para una despolarización de 100 mV en una célula de astrocitoma, que es la mayor señal óptica sensible al voltaje observada en una célula, Fig. 17. La sensibilidad al voltaje de este par FRET es consistentemente 2-3 veces mejor que la de FL-WGA/trimetino-oxonol en una diversidad de tipos de células. En las células L, se encuentran valores de relación entre 25 y 50%, con cambios de porcentaje iguales encontrados en ambos canales, Fig. 18. En los cardiomiocitos neonatales se observaron cambios de relación de fluorescencia de 5-30% para potenciales de acción generados espontáneamente. Las señales principales son aproximadamente 4 veces mayores que las posibles con FL-WGA/trimetino-oxonol. Un ejemplo de un cambio tan grande a partir de una agrupación simple de células cardíacas se da en la Fig. 19. Las ventajas de una señal de salida de relación son evidentes en la figura. Las longitudes de onda individuales, en la parte superior de la figura, muestran una línea base decreciente que es debida al blanqueo del fluoróforo. Los datos de relación que se muestran en la parte inferior de la figura compensan la pérdida de intensidad en ambos canales y dan como resultado una línea base plana. Adicionalmente, el movimiento causa artificialmente el ensanchamiento de las respuestas de longitud de onda individuales. Los datos de relación reducen estos artefactos y dan como resultado una señal más aguda que representa más estrechamente los cambios de voltaje reales. La mayor sensibilidad de este nuevo par FRET es debida muy probablemente a una combinación de factores. El movimiento del donante más próximo a la superficie de la membrana y la disminución de la distancia de transferencia Forster, R_{o}, puede dar como resultado una discriminación FRET incrementada entre los iones móviles en el mismo lado y en lados opuestos de la membrana. Asimismo, la separación espectral incrementada facilita la recogida de la emisión de donante y aceptor y reduce la pérdida de señal debida al cruce de señales.
B. Pentametino-oxonoles
Se han preparado bis-(1,3-dialquil-2-tiobarbiturato)-pentametino-oxonoles por condensación de ácidos tiobarbitúricos sustituidos en 1,3 con monohidrocloruro de glutacondialdehido-dianilo, conocido también como monohidrocloruro de N-[5-(fenilamino)-2,4-pentadienilideno]bencenamina. Los pentametino-oxonoles absorben a 638 nm (e = 225.000 M^{-1} cm^{-1}) y emiten el máximo de fluorescencia a 663 nm en etanol. La absorbancia y la emisión están desplazadas 100 nm hacia longitudes de onda mayores, en comparación con los trimetino-oxonoles. Este desplazamiento es consistente con otros colorantes de polimetino, tales como cianinas, en los cuales la adición de dos unidades metino adicionales da como resultado desplazamientos de longitud de onda de 100 nm hacia el rojo.
Los pentametinos pueden cargarse en células en cultivo de la misma manera que el trimetino-oxonol. El compuesto butílico, DiSBA-C_{4}-(5), puede cargarse en Solución Salina Equilibrada de Hanks, mientras que el compuesto hexílico, DiSBA-C_{6}-(5), requiere la adición de \beta-ciclodextrina para enmascaras las cadenas laterales de hexilo y solubilizar el oxonol hidrófobo.
La FRET sensible al voltaje a partir de diversos donantes fluorescentes unidos a la membrana plasmática para los pentametino-oxonoles se ha demostrado en células aisladas. Se ha observado que FL-WGA sufre FRET con el pentametino y da cambios de relación comparables a los observados para el trimetino-oxonol. En las células de astrocitoma, se registraron cambios de relación de 15 a 30% para un paso de despolarización de 100 mV a partir de -70 mV. Aparentemente, la disminución de FRET debida a la integral de superposición reducida, J, al desplazar la absorbancia del oxonol 100 mm más, se compensa por una selectividad incrementada de FRET hacia la cara extracelular de la membrana con relación a la cara intracelular, y/o superposición espectral reducida.
Se ha encontrado también que los conjugados de fosfatidiletanolamina fluorescentes funcionan como donantes FRET para el pentametino-oxonol. Las estructuras de los conjugados con PE ensayados se muestran en la Fig. 20. El par NBD-PE/pentametino-oxonol ha dado cambios de relación de 1-10% para 100 mV. El Cou-PE/pentametino-oxonol ha dado cambios de relación de 15-30% en astrocitomas inmovilizados por voltaje para despolarización de 100 mV. Este par es notable, debido a que los máximos de emisión de Cou-PE y de absorbancia de DiSBA-C_{6}-(5) están separados 213 mm y apenas existe alguna superposición visible, Fig. 21. La gran extinción para longitudes de onda largas del pentametino permite la FRET entre la cumarina y el pentametino-oxonol. Se ha calculado que el valor R_{o} para este par es 37 \ring{A}, utilizando un valor de rendimiento cuántico de 1,0 para la Cou-PE.
Las tasas de transposición de membrana para los pentametinos son 5-8 veces más rápidas que para los trimetinos análogos. Las corrientes de desplazamiento de DiSBA-C_{4}-(5) en células de astrocitoma inmovilizadas por voltaje demostraron que el butil-pentametino-oxonol salta a través de la membrana plasmática con una constante de tiempo de \sim2 ms en respuesta a pasos de voltaje de +20-120 mV. El análogo de trimetino se transpone \sim 18 ms en condiciones idénticas. Las corrientes de desplazamiento de DiSBA-C_{6}-(5) decaen muy rápidamente y son difíciles de separar de la capacitancia de la célula. Como resultado de la gran señal dependiente del voltaje del par Cou-PE/DiSBA-C_{6}-(5), fue posible medir ópticamente la velocidad de respuesta al voltaje de DiSBA-C_{6}-(5). La constante de tiempo para la transposición de DiSBA-C_{6}-(5) se midió ópticamente a 0,383 \pm 0,032 ms en respuesta a un paso de despolarización de 100 mV, utilizando FRET a partir de Cou-PE marcada asimétricamente. Los datos de relación y la respuesta exponencial se muestran en la Fig. 22. Las tasas de transposición aumentadas resultan de la mayor deslocalización de la carga y del carácter hidrófobo ligeramente mayor de los pentametino-oxonoles. La rápida respuesta al voltaje de DiSBA-C_{6-}-(5) es la más rápida conocida para una molécula permeante, altamente fluorescente. La respuesta inferior al milisegundo es suficientemente rápida para registrar exactamente potenciales de acción de neuronas simples.
Ejemplo VI Medida del potencial de membrana con colorantes de oxonol como donantes fret
La dirección de transferencia de energía puede invertirse utilizando TR-WGA en lugar de FL-WGA. DiSBA-C_{6}-(3) funciona como donante FRET para TR-WGA en células L-M(TK^{-}) con el mismo tiempo de respuesta que FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3). La superposición espectral de este par FRET se muestra en la Fig. 2. Sin embargo, el cambio de señal es solamente la mitad que en el caso de FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3).
DiSBA-C_{6}-(3) ha sido utilizado con éxito como donante FRET para PE marcada con Cy5, en células de neuroblastoma B104. Los cambios de relación de 5-15%/100 mV son los máximos observados con el ion móvil actuando como donante.
Ejemplo VII Medición de potenciales de membrana en tipos de células diferentes
Se ensayó el sistema FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3) en una diversidad de líneas de células. En miocitos cardíacos neonatales, los dos fluoróforos podían cargarse sin afectar al latido espontáneo. Por esta razón, la capacitancia añadida a partir de la corriente de desplazamiento de oxonol no impedía la generación de potenciales de acción. Los potenciales de acción periódicos de 90 mV [Conforti, L., Tohse, N., y Sperelakis, N. 1991. influencia de la inervación simpática sobre las propiedades eléctricas de la membrana de los cardiomiocitos neonatales de rata en cultivo. J. Devel. Physiol. 15: 237-246] podían observarse en un barrido simple, Fig. 8C. El cambio de relación sin sustracción de ninguna fluorescencia de fondo era 4-8%. Se observaron artefactos de movimiento en los datos de longitudes de onda simples. En Fig. 8A y B, se observaron grandes cambios lentos en la luz detectada en ambos canales. Satisfactoriamente, estos efectos se eliminaban esencialmente en los datos de relación. Los datos se adquirieron a 100 Hz y se añadieron 10 \muM de isoproterenol a la solución de baño. Los cambios de fluorescencia dependientes del voltaje son más rápidos que los artefactos basados mecánicamente, como era de esperar [Hill, B.C. y Courtney, K.R. 1982. Colorantes sensibles al voltaje que discriminan la contracción y las señales eléctricas en el miocardio. Biophys. J. 40: 255-257]. Algunas células, cargadas con oxonol a 2,3 \muM, dejaban de latir al cabo de aproximadamente 7 segundos de exposición continua a la iluminación del arco de xenón. Para una carga de 0,6 \muM, se reducían la fototoxicidad y desafortunadamente la señal. En células de neuroblastoma B104 diferenciadas se registró un aumento de relación de 8%, sin sustracción alguna por ruido de fondo, para una despolarización de 120 mV. Las corrientes de sodio hacia el interior no se deterioraban debido a efectos fototóxicos durante los experimentos con exposiciones de excitación que totalizaban 10-20 s. Las células de astrocitoma 1321N marcadas con FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3) exhibían fluorescencia de oxonol y FL-WGA casi exclusivamente en la membrana plasmática. Se observaron cambios de relación de 22-34% para 1100 mV en experimentos de fotometría tales como la Fig. 9. Después de una demora de 50 ms, el potencial de membrana se despolarizó 100 mV desde -70 mV durante 100 ms. Las trazas son el valor medio de 4 barridos realizados a 300 Hz, sin alisado alguno. La constante de tiempo para los cambios de fluorescencia es menor que 3,3 ms, consistente con las corrientes de desplazamiento, tales como las de la Fig. 3. Se sustrajo una pequeña señal de fondo de la señal inicial, <5% para el canal de oxonol y <15% para el canal de fluoresceína. Las intensidades de fluorescencia en los canales de fluoresceína y oxonol aumentaban \sim17% y disminuían \sim16% respectivamente para despolarización de 100 mV. En estas células, al contrario que las células L-M(TK^{-}), el cruce de señales entre los canales de emisión se reducía y se producían cambios mayores en la señal de fluoresceína. Estos cambios de señal son los mayores cambios de relación dependientes del potencial de membrana en milisegundos observados en células simples. Investigaciones previas han demostrado que 4-ANEPPS da un cambio de relación de excitación de 9%/100 mV [Montana, V., Farkas, D.L., y Loew, L.M. 1989. Medidas ratiométricas del potencial de membrana por fluorescencia de longitud de onda dual. Biochemistry 28: 4536-4539]. Adicionalmente, los cambios de fluorescencia de FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3) en cada canal de emisión son comparables a los mayores cambios consignados, por ejemplo, el cambio de 21%/100 mV en una célula de neuroblastoma utilizando RH-421 [Grinvald, A., Fine, A., Farber, I.C., y Hildesheim, R. 1983. Control por fluorescencia de las respuestas eléctricas de las neuronas pequeñas y sus procesos. Biophys. J. 42: 195-198]. Las grandes señales de FL-WGA/DiSBA-C_{6}-(3) hicieron posible registrar imágenes de relación de cambios de potencial de membrana en células L-M(TK^{-}) y de astrocitoma inmovilizadas por voltaje utilizando un microscopio confocal de alta velocidad.
Las células de astrocitoma daban un aumento de relación de 10-20% que estaba localizado en la membrana plasmática para una despolarización de 120 mV.
Ejemplo VIII Síntesis de tetraaril-boratos fluorescentes
Con referencia a la Fig. 10, en un matraz de 25 ml con dos bocas, secado a la llama, se disolvieron 0,788 g (580 \mul, 2,2 milimoles) de compuesto I en 6 ml de hexano seco, en atmósfera de argón. Después de enfriar el matraz a -70ºC, se añadieron 1,46 ml de una solución 1,5 M de n-butil-litio (2,2 milimoles) por medio de una jeringuilla. En un matraz separado se disolvieron 0,60 de borano II seco en una mezcla desoxigenada de 6 ml de hexano y 1,5 ml de THF recién destilado. La solución de borano se añadió luego por medio de una jeringuilla al reactivo de litio. Precipitó inmediatamente un sólido. Después de 30 min, se retiró el baño frío y se dejó que la mezcla de reacción se calentara lentamente. Tres horas más tarde se separó el disolvente por decantación y el sólido se lavó con más hexano. Se disolvió el sólido en acetonitrilo y agua y se vertió luego en un embudo de decantación. La capa acuosa se lavó nuevamente con hexano y se extrajo luego con acetato de etilo. La mitad del extracto se concentró, obteniéndose 124,9 mg (170,5 \mumoles) del producto deseado. Este producto se mezcló luego con 97 mg de fluoruro de tetrabutilamonio en acetonitrilo durante 15 min a la temperatura ambiente. Después del tratamiento, se recuperaron 129,1 mg de compuesto III como la sal de tetrabutilamonio (93%). ^{1}H NMR (d_{6}-acetona) 7,61 (br d, 2H, grupo CF_{3}-fenilo), 7,43 (cm, \sim3H, grupo CF_{3}-fenilo), 6,90-7,26 (cm, \sim7H, grupo CF_{3}-fenilo), 3,43 (cm, 8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,81 (cm, \sim8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,42 (cm, \sim8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}).
Con referencia a la Fig. 10, para la síntesis del compuesto IV, en un matraz de fondo redondo de 5 ml se mezclaron 14 mg (17,2 \mumoles) de compuesto III, 7 mg (25,8 \mumoles) de bromometilbimano, 27,3 mg (172 \mumoles) de carbonato de potasio, y 5 mg (18,9 \mumoles) de 18-corona-6, en 0,6 ml de acetonitrilo seco. La mezcla se calentó a 70ºC durante 1,5 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción se disolvió en acetato de etilo y se lavó tres veces con agua. El residuo orgánico se purificó por cromatografía instantánea eluyendo con tolueno/acetona (2:1). Se recogió la banda principal obteniéndose 12,1 mg (70%) de la sal de tetrabutilamonio del producto IV puro. ^{1}H NMR (d_{6}-acetona) 7,58 (br d, 2H, grupo CF_{3}-fenilo), 7,4-7,5 (cm, 2H, grupo CF_{3}-fenilo), 7,0-7,3 (cm, \sim10H, grupo CF_{3}-fenilo), 5,29 (d, J = 1,6 Hz, 2H, CH_{2}), 3,46 (cm, 8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 2,56 (d, J = 0,7 Hz, 3H, metilo de bimano), 1,84 (cm, \sim8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 1,79 (d, J = 0,8 Hz, 3H, metilo de bimano), 1,76 (s, 3H, metilo de bimano), 1,44 (cm, \sim8H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,98 (t, J = 7,2 Hz, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}); _{f} = 0,73 en dioxano basado en sulfato de quinina en H_{2}SO_{4} 0,1 N; _{f} = 0,55.
Ejemplo IX Síntesis de oxonoles asimétricos con un grupo enlazador (A) Este ejemplo ilustra la síntesis de oxonoles asimétricos que contienen un grupo enlazador incorporado, no reivindicada
Con referencia a la Fig. 11, para la síntesis del compuesto V se disolvieron 4,35 g (21,7 milimoles) de 1,12-diaminododecano en 40 ml de CH_{2}Cl_{2} seco. Por medio de una jeringuilla, se añadieron al matraz de reacción 2,62 ml (2,17 milimoles) de butil-isotiocianato. Al cabo de 15 minutos había precipitado un sólido blanco. Una hora después de la adición, se filtró la mezcla de reacción. El filtrado se evaporó luego, dejando un sólido blanco. El sólido se redisolvió en 45 ml de CH_{2}Cl_{2} seco y se mezcló con 2,44 ml de N,N-diisopropiletilamina (DIEA) y 3,9 g (17,9 milimoles) de dicarbonato de di-terc-butilo. Después de dejar reaccionar durante 1 hora, se vertió la mezcla en un embudo de decantación y se lavó con bicarbonato de sodio al 5%. Se precipitó un sólido de la solución y se separó por filtración (<100 mg). la solución orgánica se lavó luego con agua y una solución saturada de salmuera. La capa orgánica se secó luego con MgSO_{4} y se filtró. El filtrado se evaporó dejando un sólido blanco, que se recristalizó en éter isopropílico produciendo 4,30 g (10,3 milimoles) del compuesto V puro (rendimiento global 48%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) 5,73 br s, 2H, tioamida), 4,50 (br s, 1H, carbamato), 3,40 (br s, 4H, NCH_{2}), 3,10 (q, J = 7,2 Hz, \sim3H, CH_{2} próximo a carbamato), 1,44 (s, 9H, t-butilo), 1,2-1,7 (cm, la mayor parte de los grupos CH_{2}), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, metilo de n-butilo).
Para preparar el compuesto VI, se disolvieron 441 mg (19,2 milimoles) de sodio en 5 ml de etanol seco en atmósfera de argón. Cuando se hubo disuelto prácticamente la totalidad del sodio, se añadieron 2,92 ml (3,1 g, 19,2 milimoles) de malonato de dietilo a la solución de etóxido. Precipitó de la solución cierta cantidad de sólido. Se añadieron 4,0 g (9,6 milimoles) de compuesto V, y la mezcla se calentó a reflujo en atmósfera de argón a 100ºC durante 70 horas. Después de enfriar, la mezcla de reacción se filtró y se lavó con etanol. Se añadió agua al filtrado y precipitó de la solución un sólido blanco. El sólido (779 mg, la mayor parte de material de partida que no había reaccionado) se separó por filtración. El filtrado se acidificó luego a pH \sim2 y se extrajo después en acetato de etilo. La capa orgánica se secó luego con MgSO_{4} y se filtró. Después de separar el disolvente, se recuperaron 1,6 g (3,3 milimoles) de un aceite amarillo (34%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) 4,22 (cm, 4H, NCH_{2} próximo a barbiturato), 3,63 (s, 2H, CH_{2} de anillo), 2,99 (cm, 2H, CH_{2} próximo a carbamato), 1,53 (cm, 4H, NCH_{2}CH_{2}), 1,354 (s, 9H, t-butilo), 1,1-1,3 (cm, la mayor parte de los grupos CH_{2}), 0,85 (t, J = 7,4 Hz, metilo de n-butilo).
Para preparar el compuesto VII, se añadió 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA) con agitación a 200 mg (0,41 milimoles) de compuesto VI disuelto en 3 ml de CH_{2}Cl_{2}. Al cabo de 1,25 horas, todo el disolvente se separó a presión reducida. Se añadió 1 equivalente de cada uno de monohidrocloruro de N-[5-(fenilamino)-2,4-pentadienilideno]anilina y tiobarbiturato de 1,3-di-n-butilo, y se disolvieron la totalidad de los tres componentes en 1 ml de piridina, después de lo cual se dejaron en reposo durante una noche. El producto se purificó de los otros pentametino-oxonoles por cromatografía instantánea. Los productos apolares se eluyeron con CHCl_{3}/ CH_{3}OH (9:1). El producto puro que contenía el enlazador se eluyó con CHCl_{3}/ CH_{3}OH (1:1). El producto se unía muy fuertemente al gel del sílice y se recuperaron únicamente 10 mg de producto. ^{1}H NMR (CDCl_{3}/CD_{3}OD) 7,5-7,8 (cm, 4H, metinos de vinilo), 7,35 (t, J = \sim14 Hz, 1H, metino central), 4,34 (br t, \sim10H, NCH_{2} próximo a barbiturato), 2,72 (cm, \sim3H, CH_{2} próximo a amina), 1,4-1,7 (br cm, \sim12H, EDCH_{2}CH_{2}), 1,0-1,4 (cm, \sim40H, la mayor parte de los grupos CH_{2}), 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 9H, metilo de n-butilo).
(B) Este ejemplo particular hace referencia a las Figs. 15 y 16
N-butil-N-5-pentanol-tiourea (6): Se disolvió 5-amino-1-pentanol (1,416 ml, 13 milimoles) en 7 ml de CH_{2}Cl_{2}. En atmósfera de argón, se añadió butil-isotiocianato (1,570 ml, 13 milimoles) por medio de una jeringuilla. Al cabo de 2,5 h, se separó el disolvente a vacío, dejando un aceite. Bajo un vacío elevado, el aceite se liofilizó dos veces con nitrógeno líquido y se dejó a presión reducida durante una noche. A la mañana siguiente, se recogieron 2,615 g de producto sólido puro (12 milimoles, 92%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 5,90 (br s, 2H, NH), 3,66 (t, J = 6,2 Hz, 2H, RCH_{2}OH), 3,42 (br m, 4H, NHCH_{2}R), 1,80 (br s, 1H, OH); 1,3-1,7 (cm's sin resolver, 10H, la mayor parte de los metilenos), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H, metilo), ^{13}C NMR (CDCl_{3}): d 181,5 (tiocarbonilo), 62,2 (RCH_{2}OH), 44,2 (NHCH_{2}R), 44,1 (NHCH_{2}R), 31,9 (CH_{2}), 31,0 (CH_{2}), 28,6 (CH_{2}), 23,0 (CH_{2}), 19,9 (CH_{2}), 132,6 (CH_{3}).
1-Butil-3-(5-pentanol)-tiobarbiturato (7): Se disolvieron en EtOH seco 345 mg (15 milimoles) de Na. Después que se hubo disuelto casi la totalidad del Na, se añadió malonato de dietilo (2,278 ml, 15 milimoles) en atmósfera de argón. La mezcla se calentó luego a 60ºC para disolver el malonato de sodio precipitado. Se retiró luego el calor y se añadió N-butil-N-5-pentanol-tiourea (6) (1,310 g, 6 milimoles). La mezcla de reacción se calentó a reflujo a 100ºC durante 3,5 días. Después de enfriar, se filtró la mezcla de reacción y se lavó con EtOH. Se añadió un volumen aproximadamente igual de H_{2}O al filtrado y se acidificó a pH 1-2 con HCl conc. La solución acuosa se extrajo tres veces con EtOAc/hexanos 1:1. Los extractos reunidos se secaron con MgSO_{4}, se filtraron, y se concentraron dejando un aceite. La TLC con EtOAc/MeOH (4:1) demostró que, además del producto principal de barbiturato, existían dos impurezas apolares. La cromatografía instantánea con gel de sílice proporcionó cierta purificación (4 x 17 cm), eluyendo con EtOAc/MeOH 84:1). El material era todavía un aceite y se realizó una una segunda cromatografía en columna, eluyendo con CHCl_{3}/MeOH/AA (90:8:2). A pesar de ser un aceite, se recuperaron 0,726 g (2,54 milimoles, 42%) de producto puro. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 4,31 (cm, 4H, NCH_{2}R), 3,71 (br s, 2H, metileno de anillo), 3,63 (t, J = 6,3 Hz, 2H, RCH_{2}OH), 2,75 (br s, 1H, OH), 1,5-1,8 (cm, 6H, la mayor parte de los metilenos), 1,2-1,5 (cm, 4H, la mayor parte de los metilenos), 0,94 (t, J = 7,2 Hz, 3H, metilo).
1-Butil-3-(5-bromopentano)-tiobarbiturato (8): Se disolvió (7) (98 mg, 343 \mumoles) en 600 \mul de CH_{2}Cl_{2} seco, y se mezcló con tetrabromuro de carbono (142 mg, 429 \mumoles). La solución se enfrió en hielo y se añadió trifenilfosfina (135 mg, 515 \mumoles). La solución borboteó y se volvió amarilla inmediatamente. Al cabo de 30 min, se eliminó el disolvente y se añadió hexano al residuo sólido. La mezcla se dejó en agitación durante una noche. La TLC mostró solamente un barbiturato en solución hexánica junto con óxido de trifenilfosfina. La impureza se eliminó por cromatografía instantánea en gel de sílice (2,5 x 22 cm) compactado en EtOAc/MeOH (98:2). La impureza apolar se eluyó de la columna utilizando el disolvente de compactación seguido por EtOAc/MeOH (90:10). El producto deseado se eluyó con CHCl_{3}/MeOH/AA (93:5:2), obteniéndose 40 mg (115 \mumoles, 34%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 4,33 (cm, 4H, NCH_{2}R), 3,72 (s, 2H, metileno de anillo), 3,42 (t, J = 6,7 Hz, 2H, RCH_{2}Br), 1,91 (cm, 2H, metileno), 1,66 (cm, 4H, metilenos), 1,52 (cm, 2H, metileno), 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 3H, metilo).
Tiobarbiturato de 1,3-dibutil-5-(3-fenilamino-propendienilo) (10): Se disolvió malonaldehido-bis(fenilimina) (500 mg, 1,69 milimoles) en 20 ml de DMF seca. Por separado, se disolvió tiobarbiturato de 1,3-di-butilo (430 mg, 1,76 milimoles) en 5 ml de piridina seca y se puso en un embudo de decantación de 10 ml. La solución de tiobarbiturato se añadió lentamente en el transcurso de 5 min, y se dejó la reacción en agitación durante 5 h. Se añadieron a la mezcla aproximadamente 20 ml de agua y precipitó de la solución un sólido amarillo. Se filtró el sólido y se secó, obteniéndose 575 mg (1,5 milimoles, 89%). Las impurezas menores, con inclusión de oxonol, se eliminaron por cromatografía instantánea con gel de sílice (3 x 15 cm) eluyendo con EtOAc/hexanos (1:1). Precipitó algo de material en la columna. Sin embargo, después de secar, se recuperaron 390 mg de producto puro (1 milimol, 59%). ^{1}H NMR (CDCl_{3}/MeOH): d 8,10 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,3-7,5 (cm, 3H), 7,1-7,25 (cm, 3H), 4,40 (cm, 4H, NCH_{2}R), 1,65 (cm, 4H, NCH_{2}CH_{2}R), 1,36 (cm, 4H, NCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,90 (t, J = 7,3 Hz, 6H, metilos).
1-(1,3-Dibutil-tiobarbiturato)-3-(1-butil-3-(5-hidroxipentil)tiobarbiturato)-trimetino-oxonol, sal de trietilamonio (11): Se mezcló el compuesto (7) (85 mg, 297 \mumoles) con (10) (114 mg, 297 \mumoles) en 1,2 ml de piridina seca y se dejó en agitación durante 17 h. La TLC con EtOAc/MeOH demostró que estaban presentes tres productos de oxonol principales. Se añadió HCl conc. a 80% de la mezcla de reacción, lo que hizo que precipitara un sólido de la solución. Se filtró el sólido y se lavó con agua. Después de secar, se recuperaron 220 mg de un sólido rojo. Se mezclaron 96 mg de éste sólido con 1-2 ml de EtOAc y se filtró. El sólido restante se disolvió en CHCl_{3}/MeOH (95:5) y se cargó en una columna de gel de sílice de 19 x 2,5 cm. Por elución con el mismo disolvente, se eluyó de la columna el oxonol más apolar. Se cambió luego el disolvente a CHCl_{3}/MeOH/Et_{3}N (90:8:2) para diluir la banda media, que era el producto deseado según se demostró por NMR. Después de concentrar y secar, se recuperaron 18,5 mg (28 \mumol, 27%) de producto puro. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 8,60 (t, J =13,9 Hz, 1H, metino central), 8,14 (dd, J_{1} 0 13,8 Hz, J_{2} = 2,2 Hz, 2H, metinos), 4,45 (cm, 8H, NCH_{2}R), 3,66 (t, J = 6,3 Hz, 2H, RCH_{2}OH), 3,20 (q, J = 7,3 Hz, 6H, trietilamonio), 1,5-1,8 (cm, 8H, NCH_{2}CH_{2}R), 1,2-1,5 (cm, 10H, la mayor parte de los metilenos), 1,35 (t, J = 7,3 Hz, 9H, trietilamonio), 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 9H, metilo terminal). MS.
1-(1,3-Dibutil-tiobarbiturato)-3-(1-butil-3-(5-tosiloxipentil)tiobarbiturato)-trimetino-oxonol (12): En 4 ml de piridina, se mezcló (11) (86,1 mg, 131 \mumoles) con cloruro de tosilo (333 mg, 1,75 milimoles). La mezcla de reacción se agitó durante 3,5 h antes de eliminar el disolvente a vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó dos veces con HCl 1 M, seguido por salmuera saturada. La TLC con EtOAc/MeOH (9:1) demostró que la mayor parte del material de partida se convirtió en un producto más apolar. Sin embargo, se encontraba envidentemente una impureza polar de oxonol y el material tuvo que purificarse ulteriormente por cromatografía instantánea. La columna se compactó en CHCl_{3}/MeOH (97:3). Fue necesario aumentar la polaridad a CHCl_{3}/MeOH (92:8) a fin de separar el producto por elución. Las fracciones que contenían el producto deseado se reunieron y secaron, obteniéndose 74,8 mg (102 \mumol, 78%) de producto. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): d 8,50 (t, 1H, metino central), 7,92 (dd, J_{1} = 14 Hz, J_{2} = 2 Hz, 2H, metinos), 7,81 (d, 2H, tosilo), 7,35 (d, J = 8,2 Hz, 2H, tosilo), 4,37 (cm, 8H, NCH_{2}R), 4,09 (br t, 2H, RCH_{2}OTs), 2,45 (s, 3H, metilo de tosilo), 1,2-1,9 (cm sin resolver, la mayor parte de los metilenos), 0,91 (t, J = 7,2 Hz, 9H, metilo terminal).
Ejemplo X Síntesis de quelatos lantánidos fluorescentes con una carga negativa simple
Terbio(III)-bis-(N,N'-bis(salicilideno)etilenodiamina), sal de piperidinio, Hpip^{+} Tb(SALEN)_{2}^{-}: Se disolvió N,N'-bis(salicilideno)etilenodiamina (SALEN) (0,719 g, 2,68 milimoles) en 40 ml de MeOH a 60ºC. Se añadió a la solución cloruro de terbio hexahidratado (0,5 g, 1,34 milimoles) disuelto en 1 ml de agua. Se añadió piperidina (536 \mul, 5,42 milimoles) y se formó inmediatamente un precipitado amarillo. Al cabo de 1 hora, se retiró la fuente de calor y se dejó la mezcla de reacción en agitación durante una noche. Se filtró el sólido y se secó, obteniéndose 709 mg (0,91 milimoles, 68%) del complejo deseado. Pulverización electrónica (ion negativo) MS [MeOH/H_{2}O: 95/5] (pico, intensidad relativa) 691,2 (M^{-1}, 100), M^{-1} calc. = 691,5 amu.
Europio(III)-bis-(N,N'-bis(salicilideno)etilenodiamina)-piperidinio, Hpip^{+}Eu(SALEN)_{2}^{-}: Se disolvió N,N'-bis(salicilideno)etilenodiamina (SALEN) (0,360 g, 1,34 milimoles) en 40 ml de MeOH y piperidina (298 \mul, 3,02 milimoles) a 60ºC. Se añadió a la solución cloruro de europio hexahidratado (0,246 g, 0,67 milimoles) disuelto en 0,5 ml de agua, y se separó inmediatamente de la solución un precipitado amarillo. Al cabo de 1 h, se retiró la fuente de calor y la mezcla de reacción se dejó durante 2 horas. Se filtró el sólido y se secó, obteniéndose 341 mg (0,44 milimoles, 66%) del complejo deseado.

Claims (46)

1. Un método de determinación del potencial eléctrico a través de una membrana, que comprende:
(a) introducir un primer reactivo que comprende un anión hidrófobo fluorescente capaz de redistribuirse desde una primera cara de la membrana a una segunda cara de la membrana en respuesta a los cambios en el potencial de la membrana;
(b) introducir un segundo reactivo que marca la primera cara o la segunda cara de la membrana, comprendiendo dicho segundo reactivo un cromóforo capaz de sufrir transferencia de energía sea por (i) donación de energía de estado excitado al ion fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado del ion fluorescente;
(c) exponer la membrana a luz de excitación;
(d) medir la transferencia de energía entre el ion fluorescente y el segundo reactivo; y
(e) relacionar la transferencia de energía con el potencial de la membrana, en donde el primer reactivo y el segundo reactivo no están unidos covalentemente por un enlazador.
2. El método de la reivindicación 1, en el cual la transferencia de energía entre el ion fluorescente y el segundo reactivo es por transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).
3. El método de la reivindicación 1, en el cual la membrana es una membrana plasmática de una célula biológica.
4. El método de la reivindicación 3, en el cual la célula es una célula de mamífero.
5. El método de la reivindicación 4, en el cual la membrana se encuentra en un orgánulo intracelular.
6. El método de la reivindicación 4, en el cual la célula se selecciona del grupo constituido por células L-M(TK^{-}), células de neuroblastoma, células de astrocitoma y miocitos cardíacos neonatales.
7. El método de la reivindicación 1, en el cual la membrana comprende una bicapa de fosfolípido.
8. El método de la reivindicación 1, en el cual el ion es un anión.
9. El método de la reivindicación 8, en el cual el anión lleva una carga simple.
10. El método de la reivindicación 8, en el cual el anión se selecciona del grupo constituido por polimetino-oxonoles, tetraaril-boratos y complejos de metales de transición.
11. El método de la reivindicación 10, en el cual el anión es un oxonol de la fórmula
12
en la cual:
R se selecciona independientemente del grupo constituido por H, hidrocarbilo y heteroalquilo;
X es oxígeno o azufre; y
n es un número entero de 1 a 3;
y sus sales.
12. El método de la reivindicación 11, en el cual X es azufre.
13. El método de la reivindicación 11, en el cual:
cada R es idéntico y es un grupo hidrocarbilo seleccionado de grupos alquilo C_{1-10}; y
n = 2.
14. El método de la reivindicación 10, en el cual el anión es un tetraaril-borato de la fórmula
[(Ar^{1})_{3}B-Ar^{2}-Y-FLU]^{-}
en la cual:
Ar^{1} es un grupo arilo;
Ar^{2} es un grupo arileno;
B es boro;
Y es oxígeno o azufre; y
FLU es un fluoróforo neutro;
y sus derivados.
15. El método de la reivindicación 14, en el cual:
Ar^{1} es trifluorometilfenilo;
Ar^{2} es tetrafluorofenilo; e
Y es oxígeno.
16. El método de la reivindicación 14, en el cual el fluoróforo neutro se selecciona del grupo constituido por bimanos, difluoroboradiazaindacenos y cumarinas.
17. El método de la reivindicación 16, en el cual el fluoróforo neutro es un bimano de la fórmula
13
en la cual:
cada R^{5}, que puede ser igual o diferente, es independientemente H, alquilo C_{1-6} o un punto de fijación alquileno.
18. El método de la reivindicación 16, en el cual el fluoróforo neutro es un difluoroboradiazaindaceno de la fórmula
14
en la cual:
cada R^{1}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, arilo, heteroaromático, aralquenilo y un punto de fijación alquileno;
cada R^{2}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo C_{1-6}, fenilo y un punto de fijación alquileno.
19. El método de la reivindicación 16, en el cual el fluoróforo neutro es un compuesto de las fórmulas (V) o (VI)
Fórmula V 
\hskip3cm
Fórmula VI
15
en la cual:
cada R^{3}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, halógeno, alquilo C_{1-6}, CN, CF_{3}, OR_{5}, CON(R^{5})_{2}, OR^{5}, y un punto de fijación;
cada R^{4}, que puede ser igual o diferente, se selecciona del grupo constituido por H, OR^{5}, N(R^{5})_{2} y un punto de fijación alquileno; y
Z es O, S o NR^{5}; y
cada R^{5}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo C_{1-6} y un punto de fijación alquileno.
20. El método de la reivindicación 16, en el cual el fluoróforo neutro es un complejo de un metal de transición de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual
n = Tb, Eu, o Sm;
R es independientemente H, alquilo C1-C8, cicloalquilo C1-C8 o perfluoroalquilo C1-C4;
X e Y son independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, CF_{3}, alquilo inferior (C1-C4), CN, Ph, O-(alquilo inferior), u OPh; o X e Y juntos son -CH=CH-; y
Z = alquilenodiílo, heteroalquilenodiílo o heterociclodiílo.
21. El método de la reivindicación 20, en el cual
Z = 1,2-etanodiílo, 1,3-propanodiílo, 2,3-butanodiílo, 1,2-ciclohexanodiílo, 1,2-ciclopentanodiílo, 1,2-cicloheptanodiílo, 1,2-fenilenodiílo, 3-oxa-1,5-pentanodiílo, 3-aza-3-(alquilo inferior)-1,5-pentanodiílo, piridina-2,6-bis(metileno) o tetrahidrofurano-2,5-bis(metileno).
22. El método de la reivindicación 16, en el cual el fluoróforo neutro es un complejo de un metal de transición de la fórmula
17
en la cual:
Ln = Tb, Eu, o Sm;
R es independientemente H, alquilo C1-C8, cicloalquilo C1-C8 o perfluoroalquilo C1-C4;
X' e Y' son independientemente H, F, Cl, Br, I, NO_{2}, CF_{3}, alquilo inferior (C1-C4), CN, Ph, O-(alquilo inferior), u OPh; o X' e Y' juntos son -CH=CH-; y
Z' es independientemente un enlace de valencia, CR_{2}, piridina-2,6-diílo o tetrahidrofuran-2,5-diílo.
23. El método de la reivindicación 1, en el cual el segundo reactivo es un fluoróforo.
24. El método de la reivindicación 23, en el cual el segundo reactivo se selecciona del grupo constituido por lectinas, lípidos, carbohidratos, citocromos, anticuerpos, péptidos y proteínas, cada uno de los cuales está marcado con un fluoróforo.
25. El método de la reivindicación 24, en el cual el fluoróforo se selecciona del grupo constituido por xantenos, cianinas y cumarinas.
26. El método de la reivindicación 24, en el cual el segundo reactivo es un lípido, que es un fosfolípido.
27. El método de la reivindicación 24, en el cual el segundo reactivo es el compuesto de la fórmula:
18
en la cual PE representa una fosfatidiletanolamina enlazada en N.
28. El método de la reivindicación 24, en el cual el segundo reactivo es el compuesto de una fórmula Cou-PE, en la cual:
Cou es una cumarina de la fórmula:
19
en la cual:
cada R^{3}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, halógeno, alquilo inferior, CN, CF_{3}, COOR^{5}, CON(R^{5})_{2}, OR^{5}, y un punto de fijación;
R^{4} se selecciona del grupo constituido por OR^{5} y N(R^{5})_{2};
Z es O, S o NR^{5}; y
cada R^{5}, que puede ser igual o diferente, se selecciona independientemente del grupo constituido por H, alquilo inferior y un punto de fijación alquileno; y
PE es una fosfatidiletanolamina enlazada en N.
29. El método de la reivindicación 24, en el cual el segundo reactivo es fosfatidiletanolamina marcada con 6-cloro-7-hidroxicumarina.
30. El método de la reivindicación 24, en el cual el segundo reactivo comprende una proteína fluorescente verde.
31. Un estuche (kit) para determinar el potencial eléctrico a través de una membrana, que comprende:
(a) un primer reactivo que comprende un ion hidrófobo fluorescente capaz de redistribuirse desde una primera cara de una membrana a una segunda cara de la membrana en respuesta a cambios en el potencial de membrana; y
(b) un segundo reactivo que marca la primera cara o la segunda cara de la membrana, comprendiendo dicho segundo reactivo un cromóforo capaz de sufrir transferencia de energía por (i) donación de energía de estado excitado al ion fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado del ion fluorescente, en donde el primer reactivo y el segundo reactivo no están unidos covalentemente por un enlazador.
32. El estuche de la reivindicación 31, en el cual:
el primer reactivo se selecciona del grupo constituido por polimetino-oxonoles, tetraaril-boratos y complejos de metales de transición; y
el segundo reactivo se selecciona del grupo constituido por lectinas, lípidos, carbohidratos, citocromos y anticuerpos, cada uno de los cuales está marcado con un fluoróforo.
33. El estuche de la reivindicación 31, que comprende adicionalmente un agente solubilizante.
34. Un método de identificación de una muestra de ensayo, que afecta al potencial de membrana en una célula, que comprende:
(a) cargar las células con un primer y un segundo reactivos, que determinan juntos el potencial de membrana por el método de la reivindicación 1;
(b) exponer la membrana a la muestra de ensayo;
(c) determinar el potencial de la membrana; y
(d) comparar el potencial en (c) con el potencial en ausencia de la muestra de ensayo, determinando con ello el efecto de la muestra de ensayo sobre el potencial de membrana.
35. El método de la reivindicación 34, que comprende adicionalmente:
(e) exponer la membrana a un estímulo que modula la actividad de un canal, bomba o cambiador de iones;
(f) determinar el potencial de membrana;
(g) determinar nuevamente el potencial de la membrana en presencia de la muestra de ensayo; y
(h) comparar los potenciales de membrana en (f) y (g) para determinar el efecto de la muestra de ensayo sobre el estímulo.
36. Los métodos de las reivindicaciones 34 ó 35, en los cuales la célula es una célula de mamífero.
37. Un método de escrutinio de muestras de ensayo para identificar un compuesto que modula la actividad de un canal, bomba o cambiador de iones en una membrana, que comprende:
(a) cargar un primer grupo y un segundo grupo de células con reactivos primero y segundo que miden juntos el potencial de membrana por el método de la reivindicación 1;
(b) opcionalmente, exponer ambos grupos de células primero y segundo a un estímulo que modula un canal, bomba o cambiador de iones;
(c) exponer el primer grupo de células a una muestra de ensayo;
(d) medir el potencial de membrana del primer y el segundo grupo de células; y
(e) relacionar la diferencia en los potenciales de membrana entre el primer y el segundo grupo de células con la capacidad de un compuesto contenido en la muestra de ensayo para modular la actividad de un canal, bomba o cambiador de iones en la membrana.
38. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 y 34 a 37, en el cual dicha transferencia de energía es detectada por al menos un detector.
39. Un método de acuerdo con la reivindicación 38, en el cual dicha transferencia de energía es detectada por medida de relaciones de emisión.
40. Un método de acuerdo con la reivindicación 38, en el cual dicha transferencia de energía se mide por cambio de la banda de paso de al menos un filtro selectivo a la longitud de onda frente a al menos uno de dicho(s) detector(es).
41. Un método de acuerdo con la reivindicación 40, en el cual dicho al menos un filtro selectivo a la longitud de onda comprende dos o más filtros de interferencia con diferentes bandas de paso situados frente a al menos uno de dicho(s) detector(es).
42. Un método de acuerdo con la reivindicación 40, en el cual dicho al menos un filtro selectivo a la longitud de onda comprende un monocromador sintonizable continuamente que se somete a barrido en un intervalo de longitudes de onda.
43. Un método de acuerdo con la reivindicación 38, en el cual dicha transferencia de energía se detecta por medida de relaciones de emisión mediante descomposición de la luz emitida con un espejo dicroico.
44. Una célula, que comprende:
a) un primer reactivo que comprende un ion hidrófobo fluorescente capaz de redistribuirse desde una primera cara de una membrana a una segunda cara de dicha membrana en respuesta a cambios en el potencial de dicha membrana, y
b) un segundo reactivo que marca dicha primera cara de dicha membrana o dicha segunda cara de dicha membrana, comprendiendo dicho segundo reactivo un cromóforo capaz de sufrir transferencia de energía por (i) donación de energía de estado excitado a dicho ion fluorescente, o (ii) aceptación de energía de estado excitado de dicho ion fluorescente, en donde el primer reactivo y el segundo reactivo no están unidos covalentemente por un enlazador.
45. La célula de la reivindicación 44, en la cual dicho primer reactivo se selecciona del grupo constituido por polimetino-oxonoles, tetraaril-boratos y complejos de metales de transición.
46. La célula de la reivindicación 45, en la cual dicho primer reactivo es un oxonol.
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