JPH11508355A - 光学的方法による膜内外電位差の検出 - Google Patents

光学的方法による膜内外電位差の検出

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JPH11508355A
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Abstract

(57)【要約】 膜の電位を測定する方法及び組成物を提供する。一つの局面では、方法は、(a)ネルンストの式に示されているように、膜の電位の変化に応答して膜の第一表面から第二表面へ再分配しうる疎水性蛍光イオンを含む第一試薬を導入し、(b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンに供与するか、または(ii)励起状態のエネルギーを蛍光イオンより受容することによりエネルギー伝達を経験しうる発色団を含み、膜の第一表面または第二表面を標識する第二試薬を導入し、(c)膜に光を照射し、(d)蛍光イオンと第二試薬との間のエネルギー伝達を測定し、(e)エネルギー伝達を膜電位と関連づけることを含む。エネルギー伝達は典型的には蛍光共鳴エネルギー伝達により測定する。いくつかの態様では、第一試薬と第二試薬は適切なリンカーにより互いに結合している。一つの局面では、方法は、生体膜の膜電位を調節する化合物の同定に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 光学的方法による膜内外電位差の検出 発明の背景 本発明は、一般的には膜内外電位差の検出と測定に関する。特に、本発明は、 生物細胞の形質膜にかかる膜内外電位差を求めるための組成物と光学的方法に関 する。 本発明は、政府の支援の下に行われたものである（国立保健研究所認可番号No .RO1 NS27177-07）。政府は本発明において一定の権利を有する。 細胞の電気的活性の蛍光検出とイメージングは非常に重要であり、また可能性 の高い技術である(Grinvald，A.，Frosting，R.D.，Lieke，E.,and Hildesheim, R．1988．Optical imaging of neuronal activity．Physiol．Rev．68:1285-13 66; Salzberrg，B.M．1983．Optical recording of electrical activity in ne urons using molecular probes．In Current Methods in Cellular Neuerobiolo gy．J.L．Barker，editor．Wiley，New York．139-187; Cohen，L.B．and S. Le sher.1985．Optical monitoring of membrane potential: methods of multisit e optical measurement．In Optical Methods in Cell Physiology．P．de Weer and B.M．Salzberg，editors．Wiley，New York．71-99)。 膜電位を光学的に検出するメカニズムは、従来より２つの種類に大別されてい る： （１）透過性のイオンの細胞外培地から細胞内への、感受性は高いが緩やかな 再分配、及び （２）形質膜の一方の表面に結合した比較的不透過性の染料による速いが小規 模の乱れ(perturbation)。Loew，L.M.,"How to chose a potentiometric membra ne probe"，In Spectroscopic Membrane Probes．L.M Loew，ed.,139-151(1988) (CRC Press，Boca Raton); Loew，L.M.，"Potentiometric membrane dyes"，In Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity．W.T．Mason， ed.，150-160(1993)(Academic Press，San Diego)を参照のこと。 透過性イオンは、膜内外電位差が６０mV変化すると細胞の内と外の間のその濃 度比がネルンストの限界の１０倍まで変化できるため、感受性が高い。しかし ながら、新たな平衡状態を構築するのに、水相と誘電率の低い形質膜内部のそれ ぞれにおいて流動していない(unstirred)層をイオンが拡散しなければならない ため、その応答は遅い。さらに、このような染料は有効な疎水性結合部位の全て に無差別に分布する。従って、細胞種間の選択性は困難である。また、疎水性タ ンパク質または試薬を外部溶液に加えたり、あるいは疎水性表面への暴露を変え るたりすると、アーティファクトを引き起こしやすい。また、これらのインジケ ーターでは、蛍光波長がシフトしなかったり、比をとることができなかったりす る。このような２つの波長の読み取りは、染料の濃度、経路の長さ(path length )、細胞数、光源の明るさ及び検出効率を変えることにより発生するアーティフ アクトを防ぐのに有用である。 対照的に、不透過性の染料は、ほとんどあるいは全く移動を必要としないため 、非常に素早く応答することができる。しかしながら、不透過性のイオンは、分 子の長さよりも短い距離（言い換えれば、膜を横断する距離のごく一部）を動く 単位電荷の一部のみによる電界を検出するため、鈍感である。さらに、染料のシ グナル全体のうちの有意な部分は、無関係な膜または細胞上にある分子から生じ るものであり、この分子は正しい位置に存在するわずかな分子からのシグナルを 弱めてしまう。 以上の欠点から、膜内外電位差の微小な変化に対して敏感であり、且つ急激な （好ましくはミリ秒のタイムスケールの）膜電位の変化と持続性の膜電位の変化 の両方に応答可能な方法と組成物が必要である。また、外部溶液の組成変化によ る影響に左右されにくく、特定の細胞種の膜をより選択的にモニターでき、蛍光 シグナルの比を提供する方法と組成物も必要である。本発明は、この要求と、関 連する他の要求を満たすものである。 発明の概要 膜内外電気電位差（膜電位）、特に生きている細胞の最も外側の膜（形質膜） の電位を測定する方法と組成物を提供する。一つの局面においては、該方法は、 (a)ネルンストの式により示されているように、膜の電位変化に応答して膜の 第一表面から第二表面へ再分配しうる疎水性蛍光イオンを含む第一試薬を導入し 、 (b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンへ供与するか、または(ii)励起状態 のエネルギーを蛍光イオンより受容することによりエネルギー伝達を経験しうる 発色団を含み、一つの表面（通常は膜の細胞外表面）を標識する第二試薬を導入 し、 (c)膜に適切な波長（典型的には紫外または可視領域）の励起光を当て、 (d)蛍光イオンと第二試薬との間のエネルギー伝達を測定し、 (e)エネルギー伝達の程度を膜電位と関連づける ことを含む。 第二試薬は好ましくは発蛍光団である。いずれの場合も、蛍光共鳴エネルギー 伝達(fluorescence resonance energy transfer(FRET))(これは好ましい)または 電子伝達、(Dexter)交換相互作用、常磁性消光(paramagnetic quenching)もしく は促進項間交差(promoted intersystem crossing)等のその他のメカニズムによ り励起状態の相互作用が進行しうる。該方法は、生物細胞における形質膜の膜電 位の変化の検出において特に有用である。 好ましくは、疎水性イオンは形質膜の細胞外表面を標識するアニオンである。 疎水性蛍光アニオンを膜、細胞、または組織標本に添加することにより、アニオ ンが形質膜中に分配し、ネルンスト平衡に従って形質膜中で細胞外表面と細胞内 表面の間に分布する。膜電位が変化することにより蛍光アニオンが膜を横断し、 正に帯電している側の表面（細胞内表面または細胞外表面）への結合が続く。２ 種の試薬間でのエネルギー伝達の効率が試薬間の距離の関数であり、また、蛍光 アニオンが膜を行き来するよう再分配するのに応じて試薬間の距離が変化するた め、エネルギー伝達を測定することにより膜内外電位差の変化を感度よく測定す ることができる。例えば、（細胞外に対する細胞内の）膜電位が負から正へと変 化する際には、蛍光疎水性アニオンは形質膜の細胞外表面から細胞内表面へと引 き寄せられる。第二試薬が細胞外表面にある場合には、アニオンと第二試薬との 間の距離が増加し、それに伴いアニオンと第二試薬との間のFRETと消光の効率が 減少する。従って、適切な励起波長と発光波長において蛍光を測定することによ り、膜内外電位差の変化に対して感度よく蛍光を読み取ることができる。典型的 には蛍光アニオンの再分配に対する時定数は速く、ミリ秒のタイムスケールで あり、そのため、活動電位やリガンド誘発性のチャネル開放等の細胞の電気的現 象を迅速に測定するのに便利なだけでなく、イオンポンプまたはイオン交換体の 活性が変化することにより誘発される緩やかで持続的な変化を測定するのにも便 利である。 従来の電気生理学的技術では電極の先端における電位を読むため、細胞１個の 測定には限界がある。一方、本明細書に記載の光インジケーターは、特に多くの ニューロンや筋肉細胞の膜電位を同時にモニターするのに有利である。光インジ ケーターは、従来の微小電極とは異なり、膜に物理的に穴をあける必要がないも のである。多くの細胞または細胞小器官では、膜に穴をあけることは極度に細胞 を傷つけるかあるいは物理的に実施が困難である。従って光インジケーターは、 電極を刺し込むには小さすぎたりあるいは壊れやすかったりする細胞に適してい る。 本発明の別の局面においては、膜中に埋め込まれているイオン輸送体（チャネ ル、ポンプまたは交換体）の活性化／失活に対する試験サンプル（例えば、潜在 的な治療薬分子等）の効果を検出するのに電圧検出法を用いることが可能である 。 本発明の組成物には２種の試薬が含まれる。第一試薬には、膜内外電位差の変 化に応答して膜の一方の表面から他方の表面へ再分配しうる疎水性蛍光イオン（ 好ましくはアニオン）が含まれる。このアニオンを移動性アニオンまたは疎水性 アニオンと呼ぶ。アニオンの例としては、ポリメチンオキソノール(polymethine oxonol)、発蛍光団に複合したテトラアリールボレート及び希土類金属と遷移金 属の蛍光錯体が挙げられる。第二試薬には、(i)励起状態のエネルギーを蛍光ア ニオンへ供与するか、または(ii)励起状態のエネルギーを蛍光アニオンより受容 することによりエネルギー伝達を経験しうる発色団（好ましくは発蛍光団）が含 まれる。第二試薬は膜の一方の表面に選択的に結合し、また、第一試薬とは違っ て、膜内外電位差の変化に応答して再分配することはない。従って、第二試薬を 非対称結合試薬または不動性試薬と呼ぶ。第二試薬の例としては、蛍光レクチン 、蛍光脂質、蛍光炭水化物、表面膜成分に対する蛍光標識抗体、及び両親媒性の 蛍光染料が挙げられる。本発明のある好適な態様では、適切な柔軟なリンカー基 により第一試薬及び第二試薬を互いに結合させる。リンカー基は、第一試薬 を第二試薬から膜の反対側の表面に位置させ、FRETを減少させるのに充分な長さ を有する。 図面の簡単な説明 添付の図面を参照し、本発明の理解を容易にする。 図１Ａ及び１Ｂは、電圧応答性のFRETのメカニズムを示す模式図である。 図２は、（Ａ）フルオレセイン−標識麦芽アグルチニン(FL-WGA)のハンクス平 衡塩類溶液(HBSS)中での励起スペクトル及び発光スペクトルを標準化したもので あり、（Ｂ）は(１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツレート)トリメチンオキ ソノール[DiSBA−Ｃ6−(３)]のオクタノール中での励起スペクトル及び発光スペ クトルを標準化したものであり、（Ｃ）はTR-WGAのHBSS中での励起スペクトル及 び発光スペクトルを標準化したものである。 図３は、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞における２．３μMのDiSBA−Ｃ6−(３)の変位電 流（２０℃）を示す。 図４は、−３０mVの保持電位から電圧をステップ状に変化させることにより生 じた変位電流及びテール電流(tailcurrent)の間に移動したDiSBA−Ｃ6−(３)の 電圧依存性を示す。 図５は、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞におけるDiSBA−Ｃ6−(３)の変位電流の時定数 の電圧依存性を、図４と同一のデータについて示す。 図６は、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞において−７０mVから４０，８０，１２０及び １６０mVの４回の脱分極に応答したFL-WGA/DiSBA−Ｃ4−(３)対の蛍光の同時変 化を示す（２０℃）。DiSBA−Ｃ4−(３)とFL-WGAの単一波長蛍光発光をそれぞれ （Ａ）と（Ｂ）に示し、FL-WGA/DiSBA−Ｃ4−(３)の比を（Ｃ）に示す。 図７は、−７０mVから１００mVの脱分極に応答したFL-WGA/DiSBA−Ｃ10−(３) 対の蛍光の変化の時間変化を示す。 図８は、鼓動している新生児の心筋細胞において、FL-WGA/DiSBA−Ｃ4−(３) 対からの蛍光比の変化を追跡したものである。（Ａ）はFL-WGAチャネルを追跡し たもの、（Ｂ）は長波長側のオキソノールチャネルを追跡したもの、（Ｃ）はFL -WGA/オキソノールの比を追跡したものであり、（Ｃ）では動作アーティファ クト(motion artifct)が有意に減少している。 図９は、電圧固定された神経膠星状細胞腫(astrocytoma)細胞におけるFL-WGA/ DiSBA−Ｃ6−(３)対の蛍光の変化を示す。（Ａ）はDiSBA−Ｃ6−(３)の発光を追 跡したもの、（Ｂ）はFL-WGAの蛍光シグナルを追跡したもの、（Ｃ）はFL-WGA/ オキソノールの比を追跡したものである。 図１０は、蛍光テトラアリールボレートの合成を示す。 図１１は、非対称オキソノールと第二試薬への結合を示す。 図１２は、オキソノールを第二試薬に結合させることが可能な結合点（Ｘ）を 示す。 図１３は、Di-SBA−Ｃ6−(３)の合成を示す。 図１４は、二官能性リンカーの合成を示す。 図１５及び１６は、第二試薬への結合に適したリンカーを有する非対称オキソ ノールの合成を示す。 図１７は、神経膠星状細胞腫細胞におけるCou-PE（６−クロロ−７−ヒドロキ シクマリンのジミリストイルホスファチジルエタノールアミンへの複合体、FRET 供与体）とビス−(１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツレート)−トリメチン オキソノールとの間のFRETを示す。 図１８は、Ｌ−細胞におけるDMPE−グリシン−クマリン(Cou-PE)(FRET供与体) とビス−(１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツレート)−トリメチンオキソノ ールとの間のFRETを示す。 図１９は、心筋細胞におけるDMPE−グリシン−クマリン(Cou-PE)(FRET供与体) とビス−(１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツレート)−トリメチンオキソノ ールとの間のFRETを比で示したものである。 図２０は、オキソノールに対するFRET供与体として作用する代表的な蛍光ホス ファチジルエタノールアミン複合体を示す。左側の構造は代表的な発蛍光団であ り、Ｘはホスファチジルエタノールアミン(PE)の結合部位を示す。右側の構造(P E-R)は、Ｒがエタノールアミンのアミンに結合した発蛍光団であるホスファチジ ルエタノールアミンを示す。 図２１は、（Ａ）がCou-PEの発光スペクトルであり、（Ｂ）がDiSBA-Ｃ6− (５)の励起スペクトルであり、（Ｃ）がDiSBA−Ｃ6−(５)の発光スペクトルであ る。 図２２は、非対称標識Cou-PEからのFRETを用いて、１００mVの脱分極ステップ に応答して移動するDiSBA−Ｃ6(５)の速度を示す。 図２３は、[Tb(Salen)2]-1のスペクトル（上）と[Eu(Salen)2]-1のスペクトル （下）を示す。両者とも、ピペリジニウム塩をアセトニトリルに溶解した。 好適な態様の説明 以下、本発明を説明するのに用いる各用語の意味と範囲を示すため、各用語の 定義を記載する。 「ヒドロカルビル」とは、水素及び他の元素が結合した炭素鎖からなる有機基 のことをいう。これにはアルキル、アルケニル、アルキニル及びアリール基、飽 和及び不飽和結合を共に有する基、炭素環式環が含まれ、これらの基の組み合わ せも含まれる。直鎖、分枝鎖、環式構造またはこれらの組み合わせということも できる。 「アルキル」とは、炭素数１〜２０の分枝鎖または直鎖の非環式一価飽和炭化 水素基のことをいう。 「アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化 水素基のことをいい、直鎖、分枝鎖及び環式の基を含む。 「アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化 水素基のことをいい、直鎖、分枝鎖及び環式の基を含む。 本明細書中、「低級」とは、有機基または有機化合物の各々に関して６個以下 、好ましくは４個以下の炭素原子を含むものと定義する。このような基は直鎖ま たは分枝鎖であってもよい。 「ヘテロアルキル」とは、分枝鎖または直鎖の非環式一価飽和基をいい、鎖の 中に２〜４０個の原子を含み、これら原子のうち少なくとも１個はヘテロ原子（ 例えば、酸素または硫黄）である。 「低級アルキル」とは、炭素数１〜６のアルキル基をいう。これにはメチル、 エチル、n-プロピル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、n-ブチル及びt ert-ブチル、n-ヘキシル並びに３−メチルペンチル等の基が含まれる。 「シクロアルキル」とは、炭素環中に３〜１２個の炭素原子を有する一価の飽 和炭素環式基をいう。 「ヘテロシクロアルキル」とは、環中に１〜１２個の原子を有する一価の飽和 環式基をいい、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、酸素または硫黄）を環中 に有するものである。 「アルキレン」とは、炭素数１〜４０の完全に飽和した環式または非環式の二 価分枝鎖または直鎖炭化水素基をいう。これにはメチレン、エチレン、n-プロピ レン、１−エチルエチレン、及びn-ヘプチレン等の基が含まれる。 「ヘテロアルキレン」とは、鎖中の少なくとも１個の原子がヘテロ原子である アルキレン基をいう。 「ヘテロシクロ−ジイル」とは、ヘテロ環式環を含む二価基をいう。フリーバ レンス(free valence)は両方ともヘテロ環式環上にあるか、または片方もしくは 両方が環に付加したアルキレン置換基上にあってもよい。 「低級アルキレン」とは、炭素数１〜６の完全に飽和した非環式の二価分枝鎖 または直鎖炭化水素基をいう。これにはメチレン、エチレン、n-プロピレン、i- プロピレン、n-ブチレン、i-ブチレン（または２−メチルプロピレン）、イソア ミレン（または３，３−ジメチルプロピレン）、ペンチレン、及びn-ヘキシレン 等の基が含まれる。 「シクロアルキル−低級アルキル」とは、低級アルキル基に付加したシクロア ルキル基をいう。これにはシクロプロピルメチル、シクロペンチルメチル、シク ロペンチルエチル、及びシクロペンチルプロピル等の基が含まれるが、これらに 限定されない。 「置換フェニル」とは、独立にヒドロカルビル、アルキル、低級アルキル、シ クロアルキルまたはシクロアルキル−低級アルキルで一置換、二置換、三置換ま たは四置換されたフェニル基をいう。 「アリール」とは、１個の環（例えばフェニル）または多重縮合環（例えば、 ナフチル、アントラセニル）を有する芳香族一価炭素環式基をいい、独立にヒド ロカルビル、アルキル、低級アルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキル低 級アルキルで任意に一置換、二置換または三置換することもできる。 「アリーレン」とは、芳香族二価炭素環式基をいう。オープンバレンスの位置 (open valence position)は、環上のいずれの位置でもよい。二価フェニル基の 場合は、互いにオルト、メタまたはパラの位置にある。 「アラルキル」とは、低級アルキル基に付加したアリール基をいう。これには ベンジル、２−フェニルエチル及び２−(２−ナフチルエチル)等の基が含まれる が、これらに限定されない。 「アラルケニル」とは、完全に共役したアルケニル基に付加したアリール基を いう。これにはスチレニル（シス及びトランス）並びに１−フェニルブタジエニ ル及び１−ナフチルブタジエニル（二重結合に関してＺ及びＥ異性体の可能な組 み合わせを全て含む）が含まれる。 「ハロ」とは、フッ素、臭素、塩素及び沃素をいう。 「低級アルキルチオ」とは、Ｒ−Ｓ−基（Ｒは低級アルキルである）をいう。 「脱離基」とは、化学反応において求核試薬によって置換されうる基をいい、 例えばハロ、アルキルスルホン酸（メタンスルホン酸等）、アリールスルホン酸 、ホスフェート、スルホン酸、スルホン酸塩、イミダゾリド、Ｎ−ヒドロキシコ ハク酸イミド等である。 「リンカー」とは、任意の化学的及び生物学的に適合した原子の共有結合基を いい、本発明の第一試薬と第二試薬を互いに結合させる働きをすることができる 。通常、好適なリンカーは端から端まで２０〜４０、好ましくは２５〜３０の結 合を有し、分枝鎖または直鎖であってよく、また環を含んでいてもよい。結合は 、炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合あるいはヘテロ原子−ヘテロ原子 結合である。結合は疎水性または親水性となるよう設計することが可能である。 結合基には単結合及び／または二重結合、０〜１０個のヘテロ原子（Ｏ、Ｓが好 ましい）、及び飽和または芳香族環が含まれる。結合基にはエステル、エーテル 、スルフィド、ジスルフィド等の基が含まれていてもよい。 「両親媒性」とは、親水性及び疎水性タンパク質の両者を有する分子をいう。 膜電位の生物学的システムの変化を検出する方法及び組成物を提供する。検出 法の一局面は、 (a)膜の電位変化に応答して膜の第一表面から第二表面へ再分配しうる疎水性 蛍光アニオンを含む第一試薬を導入し、 (b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光アニオンへ供与するか、または(ii)励起状 態のエネルギーを蛍光アニオンより受容することによりエネルギー伝達を経験し うる発蛍光団を含み、膜の第一表面または第二表面を標識する第二試薬を導入し 、 (c)膜に適切な波長の励起光を当て、 (d)蛍光アニオンと第二試薬との間のエネルギー伝達を測定し、 (e)エネルギー伝達を形質膜の膜電位の変化と関連づける ことを含む。 エネルギー伝達の好適なモードは蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)である。該方 法は、生物細胞における形質膜の膜電位の変化の検出において特に有用である。 本発明の方法で使用される組成物には２種類の試薬が含まれる。第一の試薬に は、膜内外電位差の変化に応答して膜の一方の表面から他方の表面へ迅速に再分 配しうる疎水性蛍光アニオンが含まれる。このアニオンを移動性アニオンまたは 疎水性アニオンと呼ぶ。第二の試薬には、(i)励起状態のエネルギーを蛍光アニ オンへ供与するか、または(ii)励起状態のエネルギーを蛍光アニオンより受容す ることにより、典型的にはFRETにより、エネルギー伝達を経験しうる発蛍光団が 含まれる。 第一試薬及び第二試薬は互いに分光学的に相補的であり、これは、試薬のスペ クトルの特徴が、励起状態のエネルギー伝達が試薬間で起こり得るようなもので あることを意味する。いずれの試薬も供与体または受容体として作用可能であり 、この場合、もう一方の試薬はそれぞれその相補体（即ち、受容体または供与体 ）である。FRETと消光の両者は、２種の試薬間の距離に対して非常に敏感である 。例えば、FRETで観察される非放射性Forster型消光は供与体と受容体の間の距 離の６乗に反比例して変化する。従って、膜電位が変化し、疎水性蛍光アニオン が第二試薬から遠く離れるように移動する場合には２種の試薬間のFRETは有意に 減少し、疎水性アニオンが第二試薬へ近づくように移動する場合には２種の試薬 間のFRETは有意に増強する。電子伝達、Dexter交換相互作用、常磁性消光もしく は促進項間交差等のその他のメカニズムは、もっと近距離で作用するもので あり、２種の試薬が衝突するかあるいは互いに少なくとも１nm以内に近づくこと が必要である。 今までに報告されている電圧応答性の蛍光インジケーターは、電位によって発 蛍光団が膜中に再分配するものであるが、応答時間が＞１００msであり、数分に 及ぶこともある。本発明の一局面は、より速い速度で膜中を移動する蛍光強度の 強いアニオン染料を提供することであり、その対数時定数は通常約１０ms未満で あり、特に５ms未満、さらには約１〜３ms、最も好ましくは１ms未満（例えば、 ０．１〜１ms）のタイムスケールである。この移動速度は、膜の細胞外表面上に 第二試薬があるかどうかとは無関係である。各神経細胞の個々の活動電位を正確 に測定するためには＜１msの応答時間が必要であり、この＜１msの応答時間は、 本明細書中に記載さている数種の染料（例えば、ヘキシル−置換ペンタメチンオ キソノール、DiSBA−Ｃ6−(５)）により得られる。本明細書中に記載されている その他の染料の応答時間は２〜５msの範囲であり、心臓及び平滑筋の電圧変化を モニターしたり、ニューロン集団の平均発火活性を測定したり（例えば、感覚の 刺激に対する中枢神経系の各領域での電気的な共鳴をマッピングしたり）、各ニ ューロンのシナプス電位をまとめて測定するには充分な速さである。本発明のイ ンジケーターは、タイムスケールが秒〜分であるような緩やかな電圧変化にも対 応可能である。 Ｉ．第一試薬−疎水性蛍光アニオン 本発明の組成物及び方法では、第一試薬には、電圧センサーとして作用し、且 つ膜内外電位差の変化に応答して膜中を一方の表面から他方の表面へ移動する疎 水性イオン（蛍光供与体、受容体または消光体）が含まれる。２つの膜−液界面 （細胞外界面と細胞内界面）間での疎水性イオンの分配は、膜電位によって決ま る。カチオンは負に帯電している膜界面に集合する傾向があり、これに対し、ア ニオンは正に帯電している界面へ移動する。本発明の固有感度は、膜電位の生理 学的変化に関連して、移動性イオンの濃度が界面において大きく変化することに 基づく。可能性としては、６０mVの変化により、各界面におけるアニオン濃度の 比が１０倍変化する。本発明の方法は、この界面濃度の変化を蛍光として効率 よく読み取るものであり、膜内外電位差の変化を検出する感度の高い方法を提供 する。蛍光が変化する速度は、疎水性イオンの膜移動の速度に依存する。 好ましくは、形質膜を横断する蛍光イオンは、形質膜に強固に結合し、膜内外 電位差の変化に応答して形質膜中を迅速に移動できるよう、疎水性である。好ま しくは、イオンは染料の特定の部分に局在化することのない１個の電荷を有し、 好ましくはその電荷は染料全体にわたる。電荷の非局在化により、帯電した分子 が親水性環境から疎水性環境へ移動するのに必要なボルン帯電エネルギー(Born charging energy)を減らすことができ、イオンの迅速な移動が促進される(Benz ，R．1988．"Structural requirement for the rapid movement of charged mol ecules across membranes"，Biophys．J．54:25-33)。疎水性が増すことにより 、結合染料の形質膜からの離脱が最小限に抑えられ、イオンが膜中により深く埋 め込まれるようになる。これにより、移動に要する静電的な活性化エネルギーを 減らすことができる。イオン上の極性基を最小限に維持し、二重層の頭部(head group)領域における望ましくない溶媒和をできるだけ防がなければならない。し かしながら、染料を細胞へロードさせるのにある程度の水溶性が必要であるため 、疎水性を増加させるのことには限界がある。必要ならば、β−シクロデキスト リン、Pluronic F-127等のプルロニック(Pluronic)、またはPEG４００等のポリ エチレングリコールといった、疎水性イオンの水溶液への可溶化を助ける両親媒 性の可溶化剤によって染料をロードさせることができる。 疎水性イオンの「疎水性」とは、生理食塩水溶液（例えばHBSS）とオクタノー ルとの間の分配係数が好ましくは少なくとも約５０、より好ましくは少なくとも 約１０００であるものをいう。リン脂質二重層（例えば、ヒト赤血球細胞由来の 膜）に対するその吸着係数は、少なくとも約１００nm、好ましくは少なくとも約 ３００nmである（膜厚３nmの場合）。分配係数及び吸着係数を求める方法は、当 業者には公知である。 通常、疎水性染料はアニオン性のものであるのが好ましい。生体膜のエステル 基は、膜の炭化水素コア内にかなり大きな双極子電位を生じさせる。この電位は アニオンが疎水性層中を移動するのを助けるが、カチオンの場合には障害となる 。従って、膜移動に関係しては、アニオンはカチオンよりも格段に速い固有速度 を 有するため有利である。例えば、構造の等しいイオンであるテトラフェニルホス ホニウムカチオンとテトラフェニルボレートアニオンの場合には、アニオンはカ チオンよりもはるかに透過性の高いことが知られている(Flewelling，R.F．and Hubbell，W.L．1986．"The membrane dipole potential in a total membrane p otential model"，Biophys．J．49:541-552)。 好ましくは、アニオンは、水溶液中で遊離の状態でいる際には蛍光強度は最小 限でなければならない一方、膜に吸着した時の蛍光強度が強くなくてはならない 。好ましくは、アニオン発蛍光団は膜に吸着した際に、少なくとも４倍、より好 ましくは少なくとも約８倍の明るさでなければならない。本明細書中に記載のチ オバルビツレートオキソノール(thiobarbiturate oxonol)の場合には、膜中での 蛍光強度は水中での強度の約２０倍である。原理的には、染料が膜に強固に結合 した場合、水溶液中で遊離の状態でいる時よりも高い蛍光比は要求されないもの である。しかしながら、実際には膜の体積が水溶液に比べて非常に小さく、染料 を細胞や組織中へロードさせるにはある程度の水溶性が必要であるため、第一試 薬は膜中で水溶液中の少なくとも約４倍の蛍光強度を有するのが望ましい。 また、アニオンはイオン輸送担体(ionophore)、特にプロトン輸送担体(proton ophore)として作用するものであってはならない。これは、このような挙動によ り持続的な漏れ電流が発生するからである。従って、アニオンのプロトン化（ｐ Ｋａ）は典型的には７よりも充分に低く、好ましくは５未満、より好ましくは３ 未満である。組織による散乱とヘムによる吸光を避けるため、赤から赤外の波長 での励起と発光が好ましい。光力学的な損傷はできるだけ少なく抑えなければな らない。三重項状態の形成とそれに伴う一重項酸素の発生を最小限に抑えるのが 最も有効である。 蛍光疎水性イオンには、ポリメチンオキソノール、発蛍光団に複合したテトラ アリールボレート及び希土類金属と遷移金属の蛍光錯体が含まれる。 Ａ．ポリメチンオキソノール 「ポリメチンオキソノール」とは、ポリメチン鎖を介して結合した２個の潜在 的な酸性基を含み、２個の酸性基の間に非局在化している１個の負電荷を有する 分子をいう。好適な酸性基は、バルビツレートまたはチオバルビツレートである 。これらは対称または非対称である。即ち、２個の（チオ）バルビツレートが互 いに同一であるかまたは異なっている。対称な（チオ）バルビツレートオキソノ ールをDiBA−Ｃn−(ｘ)及びDiSBA−Ｃn−(ｘ)（DiBAは２個のバルビツレートが 存在することを表し、DiSBAは２個のチオバルビツレートが存在することを表し 、Ｃnは（チオ）バルビツレートの窒素原子上のｎ個の炭素原子を有するアルキ ル置換基を表し、ｘは（チオ）バルビツレートに結合するポリメチン鎖中の炭素 原子数を表す）と記す。今回、長鎖アルキル置換基（例えば、ヘキシルよりも長 いＣn、特にペンタメチンオキソノールにおけるデシル）を有するオキソノール が驚くべき速さで形質膜を横断することを予想外にも見出したのである。 これらのオキソノールの特に有用な特性は、５６０nmで最大となる蛍光発光が 、膜に結合した際には水溶液中よりも２０倍も明るくなることである(Rink，T.J .，Monteacucco，C.，Hesketh，T.R.，and Tsien,R.Y．1980．Lymphocyte membr ane poterial assessed with fluorescent probes．Biochim．Biophys．Acta 59 5:15-30)。さらに、負電荷が、電荷の大部分を占める４個の等価な酸素原子を有 する発色団全体にわたって非局在化している。チオバルビツレート部分の電子親 和性が高いため、プロトン化が妨げられ（ｐＫａ＜１）、光酸化的脱色(photoox idative bleaching)に対して耐性となる。４個のＮ−アルキル基とチオカルボニ ルにより、膜に強固に結合して迅速に移動するのに必要な疎水性が分子に備わる 。 本発明で使用するオキソノール化合物は式Ｉ （式中、Ｒは独立にＨ、ヒドロカルビル及びヘテロアルキルよりなる群から選ば れ、Ｘは独立に酸素または硫黄であり、ｎは１〜３の整数である） の一般的な構造を有し、これらの塩も含むものである。 オキソノールアニオンは、通常カチオン（典型的にはＨ+、アルカリ金属、置 換アンモニウム、またはピリジニウム）を伴った塩としてロードされる。 好ましくはＸは硫黄である。即ち、疎水性アニオンは、ビス−(１，３−ジア ルキル−２−チオバルビツレート)−ポリメチンオキソノールまたはその誘導体 である。 Ｒがヒドロカルビル基の場合には、アルキル、アリール、アラルキル、シクロ アルキル及びシクロアルキル低級アルキルよりなる群から独立に選ばれる。典型 的には、これらの基は約４〜約４０個の炭素原子を有し、より好ましくは約５〜 約２０個の炭素原子を有する。アリール基はヒドロカルビル、アルキル、低級ア ルキル、ヘテロアルキル及びハロゲン基で置換することができる。本発明では、 個々の（チオ）バルビツレート部分にあるＲ基が互いに異なるオキソノールであ ることを特に意図しており、非対称尿素誘導体より調製することができる。 いくつかの態様では、Ｒは式 −(ＣＨ2)p(ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2)q(ＣＨ2)rＣＨ3 （式中、ｐは１〜約２０、好ましくは約１〜２の整数であり、ｑは１〜約６、好 ましくは１〜２の整数であり、二重結合の立体化学はシスまたはトランス、好ま しくはシスであり、ｒは１〜約２０、好ましくは約１〜３の整数であり、ｐ＋３ ｑ＋ｒ＋１は４０、好ましくは約４〜２０，より好ましくは約６〜１０である） のヒドロカルビル基である。 ポリメチンオキソノールの別の態様では、Ｒは式 −(ＣＨ2)xＡy(ＣＨ2)zＣＨ3 （式中、Ａは酸素または硫黄であり、ｘは独立に１〜約２０、好ましくは約１０ 〜１５であり、ｙは独立に０または１であり、ｚは独立に１〜約２０、好ましく は約１０〜１５の整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚは４０、好ましくは約５〜２５、より 好ましくは約５〜１０の整数である） のヘテロアルキル基である。 別の態様では、Ｒはヒドロカルビル、ヘテロアルキル、ハロゲン及びＨよりな る群から選ばれる４個までの置換基で独立に置換されたフェニル基である。 別の態様では、下記のIII節に述べるように、４個のＲ基のうちの一つは第二 試薬に結合するリンカーを包含する。 オキソノールの負電荷は、発色団全体にわたって分布している。ビス（チオバ ルビツレート）トリメチンオキソオールは、５４２nmで吸光し（ext.係数＝２０ ０，０００Ｍ-1cm-1）、５６０nmで発光し、オクタノール中での量子収量は０． ４である。Ｒ＝n-ヘキシル、DiSBA−Ｃ6−(３)であるオキソノールは、電圧固定 された哺乳類細胞中を時定数（τ）＜３msで移動する。対応するデシル化合物Di SBA−Ｃ10−(３)は、時定数＜２msで移動する。迅速な移動のための分子の要件 は対称オキソノールで充分満たされる。ビス（チオバルビツレート）ペンタメチ ンオキソノールは〜６３０nmで吸光し、〜６６０nmで発光する。このようなレッ ドシフトしたオキソノールでは、負電荷はさらに非局在化する。予想通り、ペン タメチンオキソノールの移動速度はトリメチンオキソノールよりも速い。DiSBA −Ｃ4−(５)はτ＜３msで膜を横断し、対応するトリメチンオキソノールよりも ６倍速い。DiSBA−Ｃ6−(５)は２０℃で時定数τ〜０．４msで移動する。 Ｂ．テトラアリールボレート−発蛍光団複合体 蛍光疎水性アニオンの別の有用な分類は、式II [(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2−Ｙ−ＦＬＵ]- （式中、Ａｒ1はアリール基であり、Ａｒ2は二官能性アリーレン基であり、Ｂは ホウ素であり、Ｙは酸素または硫黄であり、ＦＬＵは中性発蛍光団である） の一般構造を有するテトラアリールボレートである。 多くの場合、Ａｒ1は１個または２個の電子求引性基で置換され、置換基とし てはＣＦ3が挙げられるが、これに限定されない。選ばれた態様では、Ａｒ1とＡ ｒ2は以下の式III （式中、各Ｒ'は独立にＨ、ヒドロカルビル、ハロゲン、ＣＦ3またはリンカー基 であり、ｎは０〜５の整数であり、各Ｘは独立にＨ、ハロゲンまたはＣＦ3であ り、ｍは０〜４の整数であり、Ｙは酸素または硫黄であり、ＦＬＵは中性発蛍光 団である） の構造示にされるように任意に置換されたフェニル基である。 Ｒ'がヒドロカルビルである場合、典型的にはＲ'の炭素数は１〜約４０、好ま しくは３〜約２０、より好ましくは約５〜１５である。好ましくは、Ｒ'は低級 アルキル基であり、より好ましくはＲ'は全てＨである（合成が容易であるため ）。Ｒ'がヒドロカルビルではない場合、多くの場合Ｒ'はＣＦ3であり、ｎ＝１ である。選ばれた態様では、Ｘ＝Ｆであり、ｍ＝４である。Ｘは典型的には、テ トラアリールボレートから発蛍光団への光誘導性電子伝達を防ぐよう電子求引性 である（光誘導性電子伝達が起こると発蛍光団は消光してしまう）。Ｘ＝Ｆが最 も好適である。 １．テトラアリールボレートの合成−発蛍光団複合体 蛍光テトラアリールボレートアニオンの一般的な合成は既に開発されており、 蛍光ビマン(bimane)テトラアリールボレート複合体（Bormaneによって同定、図 １０の化合物IV）を例として図１０に示す。 一般的には、トリアリールボランを保護フェノキシまたはチオフェノキシ有機 金属試薬（例えば、有機リチウム誘導体）と反応させる。続いて保護基を除去し 、マスクされていないフェノール（またはチオフェノール）を脱離基を有する発 蛍光団と反応させる。脱離基を求核的に置換し、続いて粗反応生成物を通常通り 精製し、発蛍光団に複合したテトラアリールボレートアニオンを得る。置換基Ｒ 'とＸは、出発トリアリールボランとフェノキシ（またはチオフェノキシ）有機 金属試薬を適当に選択することにより変えられる。適切な出発原料は、Aldrich Chemical Co.(Milawaukee，WI)や当業者に公知の他の業者から入手可能である。 従って、これらの反応では、発蛍光団を官能化ボレートコアに複合させる。この 一般的な合成方法では、任意の発蛍光団をボレートアニオンへ結合させることが 可能である。 ２．中性発蛍光団 極性発色団は膜移動速度を遅らせるため、テトラアリールボレートに複合させ る発蛍光団を中性にするのが好適である。本発明では、中性発蛍光団を、帯電し た官能基を含まない蛍光分子と定義することができる。脱離基を有し、複合させ るのに適した蛍光分子は、それぞれMolecular Probes(Portland，OR),Eastman K odak(Huntington，TN),Pierce Chemical Co.(Rockville MD)及び当業者に公知の 他の業者から入手できる。また、当業者に公知の方法を用いて脱離基を蛍光分子 へ導入することもできる。 テトラアリールボレートに複合でき、本発明に従って使用するのに特に適した 中性発蛍光団としては、ビマン、ボディピ(bodipy)、及びクマリン(coumarin)が 挙げられるが、これらに限定されない。 ボディピ（即ち、ジフルオロボラジアザインダセン）は式IV （式中、各Ｒ1は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル、アリール 、 ヘテロ芳香族、アラルケニル及びアルキレン連結点よりなる群から独立に選ばれ 、各Ｒ2は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル、フェニル及びア ルキレン連結点よりなる群から独立に選ばれる） の一般構造で表すことができる。 本発明の開示においては、「アルキレン連結点」とは、−(ＣＨ2)t−基または −(ＣＨ2)t−Ｃ(Ｏ)−基をいう（式中、ｔは１〜１０の整数であり、原子価結合 の一方が発蛍光団に結合し、他方の原子価結合がテトラアリールボレートに結合 している）。好ましくは、ｔ＝１、即ちアルキレン連結点はメチレン基である。 当業者には明らかなように、発蛍光団は全て１個の連結点を有し、この点でテト ラアリールボレートに複合する。通常、発蛍光団をテトラアリールボレートに複 合させるのに使用する前駆体分子は、連結点に脱離基を有する。この前駆体をテ トラアリールボレート上の適切な求核基（例えば、アミン、ヒドロキシまたはチ オール）と反応させることにより、連結点で互いに結合した発蛍光団−テトラア リールボレート複合体が得られる。「連結点」とは、より広くは、発蛍光団また は二官能性リンカーのいずれかと反応して蛍光複合体及び／または本明細書中で 開示する結合第一及び第二試薬を形成するのに適した化学基をいう。多くの場合 、これらの連結点は脱離基（例えば、アルキルトシレート、複合させる基の求核 基と反応できる活性化エステル（無水物、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルエス テル等））を有する。当業者であれば、互いに結合し合う分子上の脱離基と求核 基の相対的な位置関係が逆になり得ることを理解できるであろう。 クマリン及び関連する発蛍光団は、一般式Ｖ及びVI （式中、各Ｒ3は同一または異なっていてもよく、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル ，ＣＮ、ＣＦ3、ＣＯＯＲ5、ＣＯＮ(Ｒ5)2、ＯＲ5、及び連結点からなる群より 独 立に選ばれ、Ｒ4はＯＲ5及びＮ(Ｒ5)2よりなる群から選ばれ、ＺはＯ、Ｓまたは ＮＲ5であり、各Ｒ5は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル及びア ルキレン連結点よりなる群から独立に選ばれる） の構造で表すことができる。 ビマンは一般式VII （式中、各Ｒ5は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキルまたはアル キレン連結点より独立に選ばれる）の構造で表すことができる。 クマリン及びビマンが結合した蛍光テトラアリールボレートは既に調製されて いる。これらの蛍光ボレートは、電圧固定した線維芽細胞中をτ＜３msで移動す る。例示の蛍光テトラアリールボレートの合成は実施例Ｖに記載する。 Ｃ．遷移金属を有する発蛍光団錯体 ランタニドイオン（例えば、Ｔｂ3+及びＥｕ3+等）は、緑及び赤の可視光領域 で発光し、その寿命はミリ秒程度である。発光は複数のシャープなバンドからな り、各バンドは励起状態にある原子に由来する。イオンの直接励起は深ＵＶ光(d eep UV light)を用いて行うことができる。ランタニドイオンが、励起エネルギ ーをイオンに伝達することのできる吸収リガンドによりキレートを形成する場合 、ランタニドイオンを長波長で励起することが可能であり、直接励起された場合 のように特徴的な発光をすることができる。Ｔｂ3+及びＥｕ3+と吸収リガンドと のランタニド錯体は、吸収リガンドが４個の負電荷を有するため正味の電荷は− １となるが、電圧応答性FRETメカニズムにおいて移動性イオンとして作用するこ とができる。Ｔｂ3+及びＥｕ3+の寿命はミリ秒の電圧変化を測定するのには充分 な速さである。 本発明は、第一試薬において蛍光疎水性アニオン（FRET供与体）として作用す るこのような錯体も提供する。リガンドビス−(サリチルアルデヒド)エチレンジ アミン(Salen)2-を用いることにより、[Tb(Salen)2]-1及び[Eu(Salen)2]-1が得 られる。これらの錯体は３５０nmで最大吸光し、３８０nmまで有意に吸光し、特 徴的な原子発光を伴って発光する（図１０）。ランタニド錯体を供与体として用 いることにより、いくつかの優れた利点が得られる。散乱、細胞自己蛍光、及び 直接励起された受容体からの発光はナノ秒あるいはそれより短い寿命を有し、発 光を集光する時間を調整することにより除くことができる（例えば、Marriott, G.，Heidecker，M.，Diamandis，E.P.，Yan-Marriott，Y．1994．Time-resolved delayed luminescence image microscopy using an europium ion chelate com plex．Biophys．J．67:957-965参照）。寿命の短い発光を除くことにより、バッ クグラウンドが減少し、ノイズに比べて強いシグナルが得られる。ランタニドキ レートを供与体として用いることにより得られるその他の主な利点は、励起状態 の寿命内に、膜内での側方拡散によってFRETのレンジが増強されることである(T homas，D.D.，Carlsen，W.F.，Stryer，L．1978．Fluorescence energy transfe r in the rapid diffusion limit．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:5746-5750) 。この特徴により、効率的なFRETを維持するために受容体を高濃度で用いる必要 性が大幅に減少する。高濃度の染料による細胞系の乱れやストレスを減らせるだ けでなく、拡散によりFRETが増強されるため、静的な場合よりも高感度の電圧応 答性が得られる。ランタニドキレートは、トリメチンオキソノール及びペンタメ チンオキソノール等の移動性受容体に対する非対称標識供与体としても用いるこ とができ、上述したような同様の利点が得られる。 疎水性蛍光アニオンとして用いることのできる代表的なランタニド錯体を式XI 及びXIIに示す。 （式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アル キル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキルであり 、Ｘ及びＹは独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級(Ｃ１〜Ｃ４) アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈであるか、あるいは Ｘ及びＹは一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ＝１，２−エタンジイル、１ ，３−プロパンジイル、２，３−ブタンジイル、１，２−シクロヘキサンジイル 、１，２−シクロペンタンジイル、１，２−シクロヘプタンジイル、１，２−フ ェニレンジイル、３−オキサ−１，５−ペンタンジイル、３−アザ−３−(低級 アルキル)−１，５−ペンタンジイル、ピリジン−２，６−ビス(メチレン)また はテトラヒドロフラン−２，５−ビス(メチレン)である） （式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８アル キル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキルであり 、Ｘ'及びＹ'は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級(Ｃ１〜Ｃ ４)アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈであるか、ある いはＸ'及びＹ'は一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ'は独立に原子価結合 、ＣＲ2、ピリジン−２−６−ジイルまたはテトラヒドロフラン−２，５−ジイ ルである） II．不動性非対称結合第二試薬 第二試薬は蛍光供与体、受容体または消光体であり、第一試薬に対して相補的 であり、疎水性アニオンであり、形質膜の細胞外表面または細胞内表面のいずれ かに結合する。従って、膜の一方またはもう一方に第二試薬が存在することによ り、膜の対称性が失われる。先に記載したように、適切な波長を有する光を当て ることにより、疎水性イオンが形質膜中を行き来するのに応答して変化する蛍光 を読み取ることができる。当業者には明らかなように、蛍光的に活性な対称性減 少化剤として作用することのできる多数の分子が存在する。この成分の主な特徴 は、形質膜の一方の表面に位置し、膜内外電位差の変化として膜内を往復する疎 水性イオンに対して相補的に（即ち、蛍光供与体、受容体または消光体として） 作用することである。 第二試薬の例としては、蛍光レクチン、蛍光脂質、疎水性置換基を有する蛍光 炭化水素、蛍光ペプチド、表面膜成分に対する蛍光標識抗体、または膜への結合 を促進し、膜を透過をしないようにするために疎水性及び親水性置換基を有する キサンテン、シアニン及びクマリンが挙げられる。 Ａ．蛍光レクチン 第二試薬の種類の一つは蛍光標識を有するレクチンである。本発明では、レク チンを、形質膜の細胞外表面上の糖タンパク質及び糖脂質に結合する糖結合タン パク質と定義することができる。Roth，J.,"The Lectins: Molecular Probes in Cell Biology and Membrane Reserch"，Exp．Patholo．(Supp.3)，(Gustav Fis cher Verlag，Jena，1978)参照。レクチンには、コンカナバリンＡ、各種アグル チニン（豆アグルチニン、落花生アグルチニン、麦芽アグルチニン等）、リシン 、Ａ鎖等が含まれる。各種レクチンはSigma Chemical Co.，St．Louis，MO.から 入手できる。 蛍光レクチンに用いるのに適した蛍光標識としては、キサンテン（フルオレセ イン、ローダミン及びロードール(rhodol)等）、ボディピ、シアニン、及び発光 性遷移金属錯体が挙げられるが、これらに限定されない。以下に述べる蛍光標識 が、本明細書中の他の第二試薬に対してではなくて、単にレクチンに対してのみ 用いられるわけではないことは理解できるであろう。今日までにレクチンを用い たものとしては、蛍光標識した麦芽アグルチニン(FL-WGA)を用いて最良の結果を 得ている。 １．キサンテン 蛍光標識のうちの好適な種類の一つには、一般式VIIIまたは式IX （式中、Ｒ6は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル、ＳＯ3Ｈ及びアルキレン連結 点よりなる群から選ばれ、Ｒ7はＨ、低級アルキル、アルキレン連結点及びＲ8よ りなる群から選ばれ、Ｒ8は （式中、ａ及びａ'はそれぞれ独立にＨ及びアルキレン連結点よりなる群から選 ばれる） よりなる群から選ばれ、ＧはＨ、ＯＨ、ＯＲ9、ＮＲ9Ｒ9及びアルキレン連結点 よりなる群から選ばれ、ＴはＯ、Ｓ、Ｃ(ＣＨ3)2及びＮＲ9よりなる群から選ば れ、ＭはＯ及びＮＲ9Ｒ9よりなる群から選ばれ、各Ｒ9は同一または異なってい てもよく、独立にＨまたはヒドロカルビルである） の構造を有するキサンテン発色団が含まれる。 ２．シアニン 蛍光標識の他の好適な種類は、一般式Ｘ （式中、Ｒ15は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ＯＰ Ｏ3Ｈ2、ＣＯＯＨ、及びアルキレン連結点よりなる群から選ばれ、Ｒ16はＨ、低 級アルキル、(ＣＨ2)jＣＯＯＨ、(ＣＨ2)jＳＯ3Ｈ、及びアルキレン連結点より なる群から選ばれ、ｊは１〜１０の整数であり、Ｔ'はＯ、Ｓ、Ｃ(ＣＨ3)2、− ＣＨ＝ＣＨ−、及びＮＲ17よりなる群から選ばれ、Ｒ17はＨまたはヒドロカルビ ルであり、ｎは１〜６の整数である） の構造を有するシアニン染料である。 Ｂ．蛍光脂質 蛍光標識された両親媒性脂質、特にリン脂質もよく用いられる。本発明では、 両親媒性脂質を、細胞膜に結合しているが容易に膜を通過できない疎水性基と親 水性基の両方を有する分子と定義することができる。蛍光標識リン脂質は第二試 薬として特に有用である。 本明細書中で定義したように、「リン脂質」にはホスファチジン酸（ＰＡ）、 及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホ スファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ） 、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、並びにホスファチジル−コリン、セリン、イ ノシトール、エタノールアミン脂質誘導体（例えば、卵ホスファチジルコリン（ ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホス ファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン 、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジ ルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホ スファチジルイノシトール、及びこれらの混合物）が含まれる。これらは不飽和 脂 質であり、天然または合成のものである。各ホスファチジン酸成分は対称であっ てもよいし（即ち、両アシル基が同一である）、対称でなくてもよい（即ち、ア シル基が異なる）。 特に好適な態様には、６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン標識ホスファチジ ルエタノールアミン(Cou-PE)、フルオレセイン標識ホスファチジルエタノールア ミン(FL-PE)、Ｎ−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４− イル)ホスファチジルエタノールアミン(NBD-PE)、及び５，５'−ジスルホインド ジカルボシアニン標識ホスファチジルエタノールアミン(Cy5-PE)が含まれる。蛍 光基は、適切には蛍光レクチンの調製の際に有用であるとして述べたものから選 択する。好適な蛍光リン脂質には、Cou-PE、FL-PE、NBD-PEまたはCy5-PEが含ま れる。Cou-PEを供与体として用い、DiSBA-Ｃ6−(３)を受容体として用いること により、形質膜の膜電位変化１００mVに対して比が８０％変化し、同一のオキソ ノールを用いたFL-WGAの場合よりも２倍も強いシグナル比が得られる。 Ｃ．蛍光標識抗体 糖脂質や膜タンパク質といった表面抗原に対する抗体も蛍光標識することがで き、第二試薬として用いることができる。例えば、糖脂質ＧＤ３に対するFITC- 標識抗体はメラノーマ細胞株Ｍ２１の外側表面を染色し、DiSBA-Ｃ6−(３)を移 動性蛍光アニオンとして用いることにより１０％／１００mVまで比を変化させる 。特定の細胞種に対する特異性は、ほぼ全ての表面マーカーに対する抗体を得る ことができるため、レクチンを用いた場合よりも抗体を用いた場合の方が容易に 得られる。また、マイクロインジェクトされた抗体であれば、レクチンに対する 炭水化物結合部位が存在しない形質膜の細胞質側の表面上にある部位を標識する こともできる。 Ｄ．チトクロム チトクロムＣを第二試薬として用いた場合も、形質膜の外側表面へ結合する消 光体として作用することを見出した。従って、第二試薬の他の適切な種類には、 他の第二試薬のところで述べた蛍光基を有するまたは有さないチトクロムＣまた はアポチトクロムＣが含まれる。 Ｅ．蛍光炭水化物 また、第二試薬の別の好適な態様には、形質膜の細胞外表面に選択的かつ強固 に結合する蛍光標識された両親媒性の炭水化物（例えばシクロデキストリン）が 含まれる。典型的には、炭水化物を疎水性テールで官能化し、膜へのインターカ レーションと強固な結合を促進させる。環状糖では、細胞へロードさせるための 優れた水溶性が得られ、膜を透過するのを防ぐ。別の利点としては、シクロデキ ストリンによりオキソノールのロードが促進される。 Ｆ．蛍光ペプチド及びタンパク質 第二試薬の別の好適な態様としては、蛍光標識された両親媒性ペプチドが挙げ られる。典型的には、このようなペプチドは、負に帯電したリン脂質の頭部に静 電的に結合するリジンやアルギニンといった複数の塩基性基と、ペプチドを膜へ 固定する複数の疎水性基を含む。任意に、Ｎ−ミリストイル、Ｎ−パルミトイル 、Ｓ−パルミトイル、またはＣ−末端プレニル基等の長鎖アルキル置換基により 疎水性を導入しても良い。蛍光標識は、典型的にはリジンのε−アミノ基または システインのスルフヒドリル基を介して結合させる。 第二試薬のさらに別の好適な態様としては、オワンクラゲ(Aequorea victoria )のグリーン蛍光タンパク質(GFP)等の天然の蛍光タンパク質が挙げられる(Cubit t，A.B．et al．1995.Understanding，improving，and using green fluorescen t proteins．Trends Biochem．Sci．20:448-455; Chalfie，M.，and Prasher, D .C．US 5,491,084)。このようなタンパク質は、GFPと天然タンパク質をコードす るＤＮＡ配列がフレーム内でコンカテネートしている縦列ＤＮＡ構築物を発現さ せることにより、天然形質膜タンパク質に融合する。また、GFPは、グリコシル ホスファチジルイノシトールアンカーの結合とタンパク質の形質膜へのターゲテ ィングをもたらすモチーフと融合することも可能である。 上述の説明に示されており、当業者にも容易に予測できるように、多種多様な 公知の供与体／受容体対も第一及び第二試薬として使用することができる。特に 好適な組み合わせ（供与体／受容体）には、フルオレセイン／ビス−チオバルビ ツレートトリメチンオキソノール、グリーン蛍光タンパク質／ビス−チオバルビ ツレートトリメチンオキソノール、グリーン蛍光タンパク質／ビス−チオバルビ ツレートペンタメチンオキソノール、クマリン／ビス−チオバルビツレートトリ メチンオキソノール、クマリン／ビス−チオバルビツレートペンタメチンオキソ ノール、ビス−チオバルビツレートトリメチンオキソノール／テキサスレッド、 ビスチオバルビツレートトリメチンオキソノール／レゾルフィン、ビス−チオバ ルビツレートトリメチンオキソノール／Cy5、ビス−チオバルビツレートトリメ チンオキソノール／ビス−チオバルビツレートペンタメチンオキソノール、テキ サスレッド／ビス−チオバルビツレートペンタメチンオキソノール、NBD／ビス −チオバルビツレートトリメチンオキソノール、NBD／ビス−チオバルビツレー トペンタメチンオキソノールが含まれるが、これらに限定されない。 III．第一試薬と第二試薬の間のリンカー基 本発明の組成物及び方法の好適な態様のいくつかでは、第一発蛍光団と第二発 蛍光団の間にリンカー基を使用する。リンカー基は、第一発蛍光団と第二発蛍光 団がたとえ低濃度であっても膜の同じ側にある場合には、両者の間に一定の距離 （これ以上近づけない間隔）を維持し、供与体と受容体（あるいは発蛍光団と消 光体）の間に効率的なエネルギー伝達を確保する。良好なエネルギー伝達により 、供与体の発光を受容体の吸光より分離し、電圧応答性の比変化が理論値からず れる原因となるスペクトルのクロストークを改善する。リンカーのその他の主な 利点は、系を単分子現象に変換することである。これにより、蛍光の読み取りが 格段に容易になり、供与体と受容体（あるいは発蛍光団と消光体）が１：１の化 学量論に維持され、最適な電圧応答性の蛍光変化を得るために供与体と受容体の 相対的なロードレベルを最適化する必要がなくなる（この他に、細胞の乱れや毒 性を最小限にできる利点を有する）。リンカー基は、膜全体に充分伸長できる長 さを有する。 疎水性蛍光アニオンと第二試薬を、二官能性リンカーにより互いに結合させる 。「リンカー基」とは、第一試薬と第二試薬の間の「化学的なアーム」という意 味 である。当業者には明らかなように、必要な化学構造を得るためには、反応体の それぞれに必要な反応性基が含まれていなければならない。 このような基の組み合わせの代表例としては、アミド結合を形成するアミノ基 とカルボキシル基、エステル結合を形成するカルボキシル基とヒドロキシル基、 アルキルアミノ結合を形成するアミノ基とハロゲン化アルキル、ジスルフィドを 形成するチオール基とチオール基、あるいはチオエーテルを形成するチオール基 とマレイミドまたはハロゲン化アルキルが挙げられる。明らかなように、ヒドロ キシル、カルボキシル、アミノ及び他の官能性基が存在しない場合には、これら の基を公知の方法で導入することができる。同様に、当業者には明らかなように 、多種多様な結合基を用いることが可能である。結合の構造は、２種の試薬を互 いにつなぐ安定な共有結合でなければならない。リンカーの第二試薬に最も近い 部分は親水性であってもよいが、移動性蛍光アニオンに最も近い部分は、膜への 挿入を可能にし且つアニオンの電圧応答性の移動を遅らせないよう疎水性でなけ ればならない。共有結合は、細胞にロードさせる際の溶液の条件に対して安定で なければならない。通常、好適な結合基には、端から端までで２０〜４０個の結 合と０〜１０個のヘテロ原子（ＮＨ、Ｏ、Ｓ）が含まれ、分枝鎖または直鎖であ る。先の記載に限定されることなく、化学的に適合している原子の組み合わせの みで結合基が形成されていることは当業者にとって明らかであろう。例えば、炭 素−炭素結合と組み合わせたアミド、エステル、チオエーテル、チオエステル、 ケト、ヒドロキシル、カルボキシル、エーテル基が、化学的に許容される適合性 の結合基の例として挙げられる。他の化学的に適合しているリンカーは、米国特 許5,470,997（第２欄及び第４〜７欄）及び5,470,843（第１１〜１３欄）に記載 されている。 適切な第二試薬発蛍光団／消光体に複合しうる末端反応性基を含むＮ−置換リ ンカーを有するオキソノールの合成に用いるため、非対称１，３−置換チオ尿素 を調製した。一例では、オキソノール置換基は末端臭素化またはトシル化基を有 するペンチル鎖（Ｃ5）である。これらのチオ尿素とマロン酸ジエチルからエト キシド／エタノール中でチオバルビツレートを合成した。官能化リンカーを有す るバルビツレート１当量より調製された混合ペンタメチンオキソノールと１，３ −ジブチルチオバルビツレートを同定した。合成例を図１１に示す。Ｃ5以外長 さのアルキル鎖を有するオキソノールもこのような方法で容易に調製でき、本発 明の範囲に含まれるものであることは明らかであろう。 適切なリンカーの一例としては、形質膜に伸長するのに適切な長さ（２５〜３ ０炭素当量）を有する二官能化ポリアルキレングリコールオリゴマー（ポリエチ レングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール等）、例 えば８〜１０ＰＥＧ単位が挙げられる。酸素（または対応するチオ−類似体の場 合には硫黄）は疎水性を調節するものであり、結果として移動速度及びロードを 調節する。このようなリンカー基によって結合された化合物は、一般式 Ｘ−(ＣＨ2)m−Ｚq−(ＣＨ2)m'−Ｚ'q'−(ＣＨ2)m"−Ｚ"q"−Ｙ （式中、Ｘは疎水性蛍光アニオンであり、Ｙは蛍光第二試薬であり、Ｚ、Ｚ'、 Ｚ"は独立にＯ、Ｓ、ＳＳ、ＣＯ、ＣＯＯであり、ｍ、ｍ'及びｍ"は０〜約３２ の整数であり、ｑ、ｑ'及びｑ"は独立に０または１であり、ｍ＋ｑ＋ｍ'＋ｑ'＋ ｍ"＋ｑ"は約２０〜４０（好ましくは２５〜３５）である） を有する。 好ましくはＺはＳであり（即ち、リンカーがポリアルキレンチオエーテルであ り）、ｍ＝５、Ｚ＝Ｓ、ｑ＝１、ｍ'＝１２、Ｚ'＝Ｓ、ｑ'＝１、ｍ"＝１１、Ｚ "＝ＣＯ、及びｑ"＝１である。 適切なリンカーの別の種類には、中心にジスルフィド結合を形成する末端チオ ール基を有する官能化アルキル鎖が含まれる。ジスルフィドは膜の中心で疎水性 スイベル(swivel)として作用する。これらの化合物は一般式 Ｘ−(ＣＨ2)nＳＳ(ＣＨ2)２n'−Ｙ （式中、Ｘは疎水性蛍光アニオンであり、Ｙは蛍光第二試薬であり、ｎ及びｎ' は０〜約３２の整数であり、ｎ＋ｎ'は３３以下である） を有する。 当業者であれば容易に予測できるように、リンカー基は、従来のカップリング 化学を用いて置換または官能化第一及び第二発蛍光団と適切に反応することがで きる。さらに、リンカー基が様々な位置で発蛍光団に結合できることも明らかで ある。リンカーの結合にとって重要な位置（Ｘ）をオキソノールを例にとって図 １２に示す。 IV．測定法 本発明の態様の一つでは、膜の一方の表面における疎水性イオンの蛍光は、FR ET以外のメカニズムで消光する。FRETは距離が遠くても作用するため必要な受容 体の濃度を最低限に抑えることができ、２つの発光波長において比を読み取るこ とができるという利点がある。しかしながら、FRETが膜の厚さよりもはるかに離 れた距離でも充分に有効である場合、膜の同じ側にある受容体と反対側にある受 容体どうしを識別することができない。その他の消光のメカニズムは、もっと近 距離で作用するものであり、膜の厚さ全体に対して有効なものではない。 第二発蛍光団／消光体は、細胞内表面または細胞外表面に対して特異的であれ ば、どちらかに位置することができる。本明細書に報告されている特定の例では 、細胞外表面を標的とするのが便利である。 FRETまたは蛍光消光は、発光の比をとることにより最もよく検出される。発光 の比をとることで、移動性発蛍光団の２つの集団（即ち、膜の細胞外表面に結合 したものと膜の細胞内表面に結合したもの）を識別することができる。特に、蛍 光受容体を用いたFRETにより、レーザー走査共焦点顕微法に適した発光比の変化 が得られ、供与体のロード、細胞の厚さと位置の変化（動作アーティファクトを 含む）、並びに励起強度が内的に補整される。発光比は、通常単一の発光波長の みの場合よりも大幅に変化する。これは、供与体と受容体の発光が反対方向に変 化し、比をとると相互に増強し合うためである。発光の比をとるのが望ましくな いまたは可能でない場合には、いずれの波長も単独で使用するか、あるいは供与 体の励起状態の寿命の変化を監視する。 発光の比は、一つの検出器の前で波長選択フィルターのパスバンドを変えるこ とにより、あるいは好ましくは放射された光をダイクロイックミラーを用いて分 光し、二つの波長バンドを同時に二つの検出器（それぞれさらに別の波長選択フ ィルターを前に置いてもよい）で測定することにより測定することができる。第 一の方法では、波長選択フィルターは、異なるパスバンドを有する２枚以上の干 渉フィルターであって、検出器の前に交互に配置されるか、あるいは連続的に波 長を変えられるモノクロメーターであって、波長範囲全体を繰り返し走査する。 第一の方法の利点は、検出器を一つだけ用いればよいことであり、検出器の節約 になり、二つの検出器を正確に一致させる面倒がない。ダイクロイックミラーと 二つの検出器を用いる第二の方法の利点は、二つの発光を同時に測定することに より順番に測定するよりも正確に測定できることであり、サンプルから放出され たフォトンをより有効に利用できる。 混合集団中の特定の細胞種に対する分子特異性は、細胞に特異的な抗体または レクチンを細胞外蛍光標識の担体として用いることにより、あるいは目的の細胞 種において特異的に発現されるグリーン蛍光タンパク質を細胞内または細胞外標 識として用いることにより導入することができる。特異的に標識された細胞もバ ックグラウンド染色を減少させ、複雑な組織中での蛍光の変化を顕著にする。 電圧センサー（即ち、第一試薬の疎水性アニオン）が少なくとも完全な単位電 荷で膜のほぼ全幅を移動する際に、高感度が達成される。特異的なイオンチャネ ルまたはイオン輸送体がなくても、イオンが負に帯電し、しかも局在化せず、疎 水性であれば、このような移動は非常に速く行われる。例えば、ジピクリアミン （２，２'，４，４'，６，６'−ヘキサニトロジフェニルアミン）の脂質溶解性 の非蛍光アニオンは、ミリ秒以下のキネティクスで興奮性の組織中に変位電流を 生じさせ、ナトリウムチャネルのゲーティング電流の速度に匹敵する[Benz，R． and Conti，F．1981．Strucure of the squid axon membrane as derived from charge-plus relaxation sutudies in the presence of absorbed lipophilic i ons．J．Membrane Biol．59:91-104; Benz，R．and Nonner，W．1981．Structur e of the axolemma of frog myelinated nerve: relaxation experiments with a lipophilic probe ion．J．Membrane Biol．59:127-134; Fernandez，J.M.，T aylor，R.E.，and Bezanilla，F．1983．Induced capacitance in the squid gi ant axon．J．Gen．Physiol．82:331-346]。しかしながら、電圧応答は、流動し ていない水層全体へイオンをさらに拡散させることを必要としてはならない。と いうのは、イオンの拡散により、応答が遅れ、持続性の漏れ電流が発生するから である。 形質膜の一方の側から他方の側への蛍光疎水性イオン（即ち、第一試薬）の移 動を光学的に読み取るためには、移動するイオンと形質膜の片方の表面に固定さ せた発蛍光団または消光体（即ち、第二試薬）との間のFRETまたは蛍光消光を利 用する。最も簡便には、細胞外表面を利用する。 例として、移動するイオンが、細胞外に固定された供与体発蛍光団の発光スペ クトルと重なる波長で吸光するアニオン性蛍光受容体である場合を模式的に図１ に示すが、これに限定されるわけではない。静止状態の負の膜電位（Ａ）では、 透過可能なオキソノールは形質膜の細胞外表面に高濃度で存在し、細胞外に結合 したFL-WGA（フルオレセイン−麦芽アグルチニン）からエネルギー伝達を受ける 。FRETをレクチンからオキソノールへの直線の矢印で表す。正の膜電位（Ｂ）で は、アニオンは主に形質膜の細胞内表面に存在し、細胞外表面上の供与体からの 平均距離が増加するため、エネルギー伝達が大幅に減少する。 電圧応答性の蛍光応答の速度は、発蛍光団が一方の側から他方の側へ移動する 速度に依存する。DiSBA-Ｃ6−(３)の場合の応答速度を図５と一般式（１）及び （２）に示す。この式から判るように、生物学的に意味のある膜内外電位差の変 化に応答してミリ秒のタイムスケールで膜を横断する蛍光イオンは、迅速な分極 ／脱分極キネティクスに従わなければならない。ゆっくり移動するイオンは、例 えば、神経組織における高速電気シグナル（本発明の組成物及び方法の主な用途 ）を追跡するのにはあまり有用ではない。蛍光性であるとの制約を付加されたこ のような分子を、開発したり見出したりすることは容易ではない。 移動性疎水性アニオンは、受容体よりもむしろ供与体であり得る。二者のいず れにもそれぞれ利点がある。FRET供与体である疎水性イオンを用いる例は、DiSB A-Ｃ6−(３)／テキサスレッドWGAの組み合わせである。この組み合わせの主な利 点は、膜中の疎水性染料分子の濃度を最小限に抑えられることであり、これによ り、変位電流や任意の光力学効果により生じる細胞の乱れと毒性が低減する。他 の利点は、膜中での発蛍光団の量子収量がタンパク質や水での場合よりも一般的 に高いことであり、これにより、決まった距離でより優れたFRETが得られる。 ビス−(１，３−ジアルキル−２−チオバルビツレート)−トリメチンオキソノ ール（ここで、アルキルはn-ヘキシル及びn-デシル（それぞれDiSBA-Ｃ6−(３) 及びDiSBA-Ｃ10−(３)）である）を、テキサスレッドで標識した麦芽ア グルチニン(TR-WGA)に対する供与体として、また蛍光標識レクチン(FL-WGA)に対 する受容体として作用させた場合を示す。電圧固定された線維芽細胞では、これ らのオキソノールの移動を、２０℃にて１００mVの脱分極に対し時定数約２msを 有する変位電流として測定した（これは蛍光の変化の速度に匹敵する）。線維芽 細胞、神経膠星状細胞腫細胞、鼓動している心筋細胞及びＢ１０４神経芽細胞腫 細胞では、１００mVの脱分極に対し、蛍光の比が４〜３４％変化したことが観察 された。蛍光が大幅に変化することにより、共焦点イメージングを高速で行うこ とが可能となる。 実施例中では単一細胞を使用するため、光学的なシグナルを、単一細胞にのみ 適用できる従来の微小電極技術（例えば、パッチクランプ）より判っている電圧 変化と精度よく比較することができる。しかしながら、染料が、微小電極が適用 できないような多くの用途に使用できることは明白である。単に正確な校正を行 うだけでなく、蛍光シグナルを発生させるメカニズムが本明細書に記載されてい るようなものであることを証明するためにも、微小電極との比較が必要である。 本明細書に記載されている２種の試薬組成物と方法により、光学的シグナルが空 間的にイメージされるかあるいはプールされるかに応じて、多くの隣接細胞また は１個の細胞の隣接部分の様々な電気電位を解明する、あるいは全ての膜位置に 対して平均的な測定値を得ることが可能となる。 本明細書に記載されている方法は、多種多様な膜へ適用することができる。特 に、生物細胞の膜における膜電位を検出及びモニターすることができる。本方法 では、形質膜、特に哺乳類細胞の最も外側の形質膜に対して最も有用である。膜 の代表例としては、細胞内小器官、小胞体の膜、分泌顆粒、ミトコンドリア、ミ クロソーム及び分泌小胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用可能な細 胞種としては、ニューロン、心臓細胞、リンパ球（Ｔ及びＢリンパ球）、神経細 胞、筋肉細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。 Ｖ．薬剤のスクリーニング 本発明は、生物細胞の膜電位に影響を及ぼす潜在的な治療薬等の試験サンプル をスクリーニングする方法も提供する。これらの方法は、試験サンプルの存在下 及び不存在下（対照測定）にて上述したように膜電位を測定するものである。対 照測定は通常、試験サンプルのうち推定薬剤以外の成分を全て含むサンプルを用 いて行う。対照に対して試験薬剤の存在下での膜電位の変化を検出できれば、試 験薬剤は活性である。公知の活性を有する薬剤（即ち、標準薬剤）または推定の 活性を有する薬剤（即ち、試験薬剤）の存在下または不存在下にて膜電位を求め ることもできる。膜電位の電位差を本明細書に開示された方法で検出することに より、試験薬剤の活性と標準薬剤の活性を比較することが可能となる。薬剤スク リーニングプロトコールを様々に組み合わせたり順序を変えたりすることは当業 者には公知であり、本明細書に開示された膜電位の測定方法と組み合わせて膜電 位に影響を及ぼす化合物の同定に容易に適用できることは明らかであろう。本明 細書で開示された膜電位測定技術をこのような方法の全てと組み合わせて用いる ことも、本発明の意図するところである。特定の用途においては、本発明は、膜 中のイオンチャネル、ポンプ、または交換体の活性を調節する化合物を同定する 方法を提供するものであり、該方法は、 (a)第一試薬及び第二試薬（これらは共に上述したように膜電位を測定するも のである）を細胞にロードし、 (b)上述したように膜電位を測定し、 (c)細胞を試験サンプルに暴露し、 (d)膜電位を再度測定し、 (b)の結果と比較して試験サンプルの効果を求め、 (e)任意に、イオンチャネル、ポンプまたは交換体を調節する刺激物質に膜を 暴露し、膜電位を再度測定して(d)の結果と比較し、刺激物質に対する応答に及 ぼす試験サンプルの効果を求める ことを含む。 別の用途においては、本発明は、膜中のイオンチャネル、ポンプまたは交換体 の活性を調節する化合物を同定するために試験サンプルをスクリーニングする方 法を提供するものであり、該方法は、 (a)第一試薬及び第二試薬（これらは共に膜電位を測定するものである）を細 胞の第一群及び第二群にロードし、 (b)任意に、細胞の第一群と第二群の両方を、イオンチャネル、ポンプまたは 交換体を調節する刺激物質に暴露し、 (c)細胞の第一群を試験サンプルに暴露し、 (d)細胞の第一群及び第二群の膜電位を測定し、 (e)細胞の第一群と第二群の間の膜電位の電位差を、試験サンプル中に含まれ る化合物の膜中のイオンチャネル、ポンプまたは交換体の活性を調節する能力に 関連付ける ことを含む。 目的のイオンチャネルには、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、カリ ウムチャネル、非特異的カチオンチャネル及び塩化物イオンチャネルが含まれる が、これらに限定されない。これらのチャネルはいずれも、常時開放しているか 、電圧作動性、リガンド作動性であり、あるいは細胞内シグナル伝達経路により 調節されるものである。 スクリーニング可能な生物細胞には、哺乳類細胞の一次培養物、哺乳類組織よ り分離した細胞（分離直後のものあるいは一次培養後のもの）が含まれるが、こ れらに限定されない。細胞種には、白血球系細胞（例えば白血球）、肝細胞、膵 臓β−細胞、ニューロン、平滑筋細胞、腸上皮細胞、心筋細胞、グリア細胞等が 含まれるが、これらに限定されない。本発明には、イオン輸送体、イオンチャネ ル、ポンプ及び交換体を組み込み、遺伝子工学により発現させた組み換え細胞を 用いることも含まれる。このような輸送体に対するｃＤＮＡ配列が数多くクロー ン化されており（米国特許5,380,836のクローン化ナトリウムチャネルを参照） 、目的の細胞株においてこれらを発現させる方法は、当業者の常識の範囲内であ る（米国特許5,436,128参照）。ヒト及び他の哺乳類由来の培養細胞株の代表例 としては、ＬＭ（ＴＫ-）細胞、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞）、３Ｔ３線 維芽細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＲＡＴ１及びＨＬＨｅｐＧ２細胞が挙げら れる。 本明細書に記載されているスクリーニング方法は、固体表面上で培養したまた は固体表面上に堆積させた細胞に適用することができる。共通の技術は、マイク ロタイタープレートウエルを用い、市販の蛍光プレートリーダーにより蛍光測定 を行うことである。自動システム及び半自動システムの両者における大量スクリ ーニングも本発明に含まれる。このような方法の一つは、Costar９６ウェルマイ クロタイタープレート（底が平らで透明なもの）内で細胞を使用し、二つの発光 波長を用いてCytoFluorマルチウェルプレートリーダー（Perseptive Biosystems ，Inc.，MA）により蛍光シグナルを測定し、蛍光発光比を記録するものである。 以下の実施例を参照することにより、本発明の理解がさらに深まるものと思料 するが、以下の実施例は例示のためのものであり、本発明の範囲をなんら限定す るものではない。 実施例 実施例Ｉ−オキソノール染料の合成 出発原料と試薬は全て市販の最高純度のものを入手し(Aldrich; Milwaukee，W I)、特に断らない限り精製せずに使用した。溶剤はHPLC等級であり(Fisher)、３ Åの活性化モレキュラーシーブにて乾燥させた。ＮＭＲスペクトルはVarian Gem ini ２００MHzスペクトロメーター(Palo Alto，CA)で得た。スペクトルを残留溶 剤のピーク（CHCl3＝７．２４ppm）に対して参照した。蛍光スペクトルはSPEX F luorolog-2(Edison，NJ)で得、製造元より入手した校正ファイルを使用してラン プと検出器の波長変動を校正した。ビス−(１，３−ジブチル−２−チオバルビツレート)−トリメチンオキソノール DiSBA−Ｃ4−(３) エチル誘導体の合成手順（英国特許1,231,884）に基づいてDiSBA−Ｃ4−(３) を合成した。１，３−ジブチル−チオバルビツレート（５００mg、２ミリモル） を７００μlのピリジンに溶解した。この溶液に、１８１μl(１．１ミリモル)の マロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）と１００μlの1M HCl の混合物を 添加した。溶液は直後に赤へ変わった。３時間後、反応混合物の半量を取り出し 、残りの混合物に保護マロンアルデヒドを１時間毎に２当量ずつ計４時間にわた って添加した。次いで反応混合物を濾過し、DiSBA−Ｃ4−(３)ピリジニウム塩の 紫／黒の結晶を回収した。結晶を水で洗浄した後、真空下（０．５トル）で 乾燥させ、６７．２mgの純粋な生成物を回収した。1H NMR(CDCl3): 8.91(2H,d ,J=5.1Hz,py)，8.76(1H,t,J=13.7Hz,中央のメチン)，8.52(1H,t,J=8.0Hz,py)，8 .16(2H,d,J=13.9Hz,メチン)，8.00(2H,dd,J1〜J2=6.9Hz,py)，4.47(8H,cm,NCH 2C H2CH2CH3)，1.69(8H,cm,NCH2CH 2CH2CH3)，1.39(8H,cm，NCH2CH2CH 2CH3)，0.95(1 2H,t,J=6.4Hz,メチル) １，３−ジブチル−チオバルビツレートを調製するため、アルゴン下で１．２ ２ｇのNa（５３ミリモル）を２０mlの乾燥エタノールにゆっくりと溶解した。エ トキシド溶液に８．５ｇ（８ml、５３ミリモル）のマロン酸ジエチルを添加し、 続いて５ｇ（２６．５ミリモル）のジブチルチオ尿素を添加した。反応混合物を 加熱し、３日間還流させた。冷却後、混合物を濾過した。水を加えて濾液を透明 にした。次いで、ｐＨが１〜２になるまで濃塩酸を添加した。酸性の濾液を次い でヘキサンで３回抽出した。抽出液を濃縮し、５．５ｇの粗生成物を溶液より沈 澱させた。少量の水を添加して、固体をメタノールより再結晶させ、４．２３ｇ の純粋なバルビツール酸を得た（６５％）。1H NMR(CDCl3): 4.33(4H,cm,NCH 2 CH2CH2CH3)，3.71(2H,s,環CH2)，1.63(4H,cm,NCH2CH 2CH2CH3)，1.35(4H,cm，NCH2 CH2CH 2CH3)，0.94(6H,t,J=6.2Hz,メチル)ビス−（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツレート）−ペンタメチンオキソ ノール（DiSBA−Ｃ6−(５)） １，３−ジヘキシル−２−チオバルビツール酸（２００mg、０．６４ミリモル ）とグルタコンジアルデヒドジアニル一塩酸塩(Chem．Abs.名がＮ−[５−(フェ ニルアミノ)−２，４−ペンタジエニリデン]ベンゼンアミン、一塩酸塩である) （９１mg、０．３２ミリモル）を１mlのピリジン中で混合した。１０秒以内に、 溶液が青に変わった。反応混合物を１．５時間攪拌した後、溶剤を高真空下で除 去した。残渣をCHCl3中に溶解し、シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、（９ ３：７）CHCl3/MeOH溶液で溶出した。純粋な青色のオキソノール（７２mg）を回 収した。1H NMR(CDCl3/CD3OD): d 7.60-7.80(cm,4H,メチン)，7.35(t,J=11.3H z，1H，中央のメチン)，4.31(cm,8H,NCH2R)，1.57(cm,8H,NCH2CH2R)，1.20(brm, 24H,嵩高なメチレン)，0.74(br t,12H,メチル) 必要な第一級アミンと二硫化炭素より調製した適切なチオ尿素を出発原料とし 、他のオキソノールを同様の手順で製造した[Bortnick，N,，Luskin，L.S.，Hur witz，M.D.，and Rytina，A.W．1956．t-Carbinamines，RR'R"CNH2．III．The p reparation of isocyanates，isothiocyanates and related compounds．J．Am ．Chem．Soc．78:4358-4361]。DiSBA−Ｃ6−(３)の合成例を図１３に示す。実施例II−蛍光リン脂質の合成 Cou-PE 係続中の米国特許出願08/407,554（１９９５年３月２０日出願）に記載されて いるように、３−アミドグリシン−６−クロロ−７−ブチリルオキシクマリンを 合成した。２，４−ジヒドロキシ−５−クロロベンズアルデヒドを合成するため に、２１．７ｇ（０．１５モル）の４−クロロレゾルシノールを１５０mlの乾燥 ジエチルエーテルに溶解し、２７ｇの微粉末シアン化亜鉛(II)と０．５ｇの塩化 カリウムを攪拌下に添加した。懸濁液を氷冷した。溶液を激しく攪拌しながら、 塩化水素ガスの気流を勢いよく吹き込んだ。約３０分後、反応体が溶解した。エ ーテル溶液に吸収されなくなるまで塩化水素ガスを添加し続けた(約１時間)。こ の間に沈澱が生成した。懸濁液を氷冷しながらさらに１時間攪拌した。次いで固 体を沈降させた。エーテル様の溶液を固体からあけた。固体を１００ｇの氷で処 理し、水浴中で１００℃まで加熱した。冷却したところ、光沢のある板状の生成 物が溶液から結晶化した。板状の結晶を濾過により除去し、水酸化カリウムにて 乾燥させた。収量は１５．９ｇ(０．０９２モル、６１％)であった。1H NMR(CD Cl3):δ 6.23ppm(s,1H,フェノール)，δ 6.62ppm(s,1H,フェニル)，δ 7.52p pm(s,1H,フェニル)，δ 9.69ppm(s,1H,ホルミル)，δ 11.25ppm(s,1H,フェノ ール) ３−カルボキシ−６−クロロ−７−ヒドロキシクマリンを調製するため、５． ７６g(０．０３３モル)の２,４−ジヒドロキシ−５−クロロベンズアルデヒド及 び７．２g(０．０６９モル)のマロン酸を５mlの温ピリジンに溶解した。７５μl のアニリンを攪拌しながら溶液に添加し、反応を室温で３日間続けた。生成した 黄色の固体がさらに細かく砕け、５０mlのエタノールを添加した。クリーム 状の懸濁液をガラスフリットで濾過し、１Ｎ塩酸で固体を３回洗浄し、次いで水 で洗浄した。固体を１００mlの酢酸エチル、１５０mlのエタノール及び１０mlの 半濃縮塩酸と共に攪拌した。真空下で溶剤容積を減らし、沈澱を濾過により回収 し、ジエチルエーテルで洗浄し、五酸化リンにて乾燥させた。４．９７ｇ（０． ０２１モル、６３％）の生成物を白色粉末として得た。1H NMR(dDMSO):δ 6.9 5ppm(s,1H)，δ 8.02ppm(s,1H)，8.67ppm(s,1H) ７−ブチリルオキシ−３−カルボキシ−６−クロロクマリンを調製するために 、３．１g(１２．９ミリモル)の３−カルボキシ−６−クロロ−７−ヒドロキシ クマリンを１００mlのジオキサンに溶解し、５mlの無水酪酸、８mlのピリジン及 び２０mgのジメチルアミノピリジンで室温にて２時間処理した。反応溶液を攪拌 しながら３００mlのヘプタンに添加し、白色の沈澱を形成させた。これを濾過に より回収し、１５０mlの酢酸エチルに溶解した。溶解しない物質を濾過により除 去し、濾液を５０mlの１Ｎ塩酸／かん水（１：１）で２回抽出し、次いでかん水 で抽出した。溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥させた。真空下で蒸発させるこ とにより、２．６３ｇ(８．４７ミリモル、６６％)の生成物を得た。1H =7.4Hz,酪酸メチレン)，δ 2.68ppm(t,2H,J=7.4Hz,酪酸メチレン)，δ 7.37pp m(s,1H,クマリン)，δ 7.84ppm(s,1H,クマリン)，δ 8.86ppm(s,1H,クマリン) 。 ７−ブチリルオキシ−３−ベンジルオキシカルボニルメチルアミノカルボニル −６−クロロクマリンの調製を以下のように行った。２．５ｇ（８．０６ミリモ ル）の７−ブチリルオキシ−３−カルボキシ−６−クロロクマリン、２．３６ｇ のヒドロキシベンズトリアゾール水和物（１６ミリモル）及び１．６７ｇ（８． １ミリモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを３０mlのジオキサンに溶解し た。Ｏ−ベンジルグリシンのトルエン溶液（３．４ｇ（１０ミリモル）のベンジ ルグリシントシル塩を酢酸エチル−トルエン−飽和重炭酸塩水溶液−水（１：１ ：１：１、２５０ml）で抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤 の容積を５mlに濃縮して調製した）をクマリン溶液に滴下した。反応を２０時間 室温に維持し、その後沈澱を濾過により除去し、酢酸エチルとアセトンで洗浄し た。溶剤フラクションを合わせ、ロータリーエバポレーターで５０mlへ濃 縮し、次いでトルエンを１倍量加えてさらに３０mlへ濃縮した。沈澱した生成物 を濾過により回収し、２００mlのクロロホルム−無水エタノール（１：１）に溶 解した。溶液をロータリーエバポレーターで５０mlへ濃縮し、生成物を濾別し、 真空下で乾燥させ、１．２９ｇの標記化合物を得た。さらに溶剤の容積を減らし 、第二群を得た（０．６４ｇ）。全収率：１．９３ｇ（４．２２ミリモル、５２ ％）。1H NMR(CDCl3):δ 1.08ppm(t,3H,J=7.4Hz,酪酸メチル)，δ 1.84pp δ 4.29ppm(d,2H,J=5.5Hz,グリシンメチレン),δ 5.24ppm(s,2H,ベンジル),δ 7.36ppm(s,1H,クマリン)，δ 7.38ppm(s,5H,フェニル)，δ 7.77ppm(s,1H, クマリン)，δ 8.83ppm(s,1H,クマリン)，δ 9.15ppm(t,1H,J=5.5Hz,アミド) ７−ブチリルオキシ−３−カルボキシメチルアミノカルボニル−６−クロロク マリンを以下のように調製した。９２０mg（２ミリモル）の７−ブチリルオキシ −３−ベンジルオキシカルボニルメチルアミノカルボニル−６−クロロクマリン を５０mlのジオキサンに溶解した。１００mgのパラジウム担持炭素（１０％）と １００μlの酢酸を溶液に添加し、水素雰囲気下、周囲圧力にて懸濁液を激しく 撹拌した。水素を取り込ませた後、懸濁液を濾過した。炭素を含む生成物を２５ mlの沸騰ジオキサンで５回抽出した。ジオキサン溶液を合わせて冷却し、生成物 を白色粉末として沈澱させた。溶剤を２０mlへ濃縮して生成物をさらに沈澱させ た。残りのジオキサン溶液を加熱沸騰させ、溶液が濁るまでヘプタンを添加した 。白色生成物の乾燥粉末の重量は２４５mg、３８９mg及び５８mgであり、合計で ６９２mg（１．８８ミリモル、９４％）であった。1H NMR(dDMSO):δ 1. ン)，δ 2.70ppm(t,2H,J=7.2Hz,酪酸メチレン)，δ 4.07ppm(d,2H,J=5.6Hz,グ リシンメチレン)，δ 7.67ppm(s,1H,クマリン)，δ 8.35ppm(s,1H,クマリン), δ 8.90ppm(s,1H,クマリン)，δ 9.00ppm(t,1H,J=5.6Hz,アミド) ６−クロロ−７−(ｎ−ブチリルオキシ)クマリン−３−カルボキサミド酢酸（ ２６．２mg、１００ミリモル）を２mlの１：１CHCl3／ジオキサンに溶解した。 クロロ蟻酸イソブチル（１４．３ml、１１０ミリモル）をアルゴン下、４℃で添 加し、３０分間撹拌した。別に、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミ ン(DMPE)（２０mg、３１．５ミリモル）を１mlのCHCl3に溶解し、乾燥メタノー ル１滴と６ml（３４．５ミリモル）のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を添加 した。次いで混合無水物溶液をピペットでリン脂質溶液に滴下した。２時間後、 溶剤を真空下にて除去した。残渣を３mlのMeOHに溶解し、３mlの０．２５ＭNaHC O3と混合した。溶液はほぼ直後に黄色に変わり、１５分間撹拌した。次いで溶液 をCHCl3で３〜５回抽出した。状態の良くないエマルションが生成した。抽出液 を合わせて濃縮した。残渣を１mlの１：１MeOH/H2Oに溶解し、Ｃ18逆相カラム（ １．７×７cm）で精製した。同じ溶剤で抽出したところ、蛍光バンドがカラムを 通過し、遅れてもう一つ蛍光バンドが続いた。溶剤の極性を９：１MeOH/H2Oまで 低下させ、主に黄色のバンドをカラムから溶出させた。濃縮乾燥後、２．５mg（ ２．７４ミリモル）の純粋な生成物を回収した。1H NMR(CD3OD): d 8.72(s,1 H,クマリン)，7.81(s,1H,クマリン)，6.84(s,H,クマリン)，5.25(cm,2H)，4.43( dd,J1=12.1Hz,J2=3.2Hz)，4.22(d,J=6.6Hz,1H)，4.13(s,〜4H)，3.7-4.1(cm,〜1 1H)、3.47(cm,〜3H)，3.2-3.3(〜q)，2.31(cm,〜7H)，1.57(br s,〜8H,カルボニ ルに対するCH2a)，1.2-1.5(cm,〜63H,嵩高なCH2)，0.92(unres t,〜12H,CH3)。 電子スプレー（陰イオン）MS[MeOH/H2O:95/5](ピーク,相対強度)456.8(M-2,20 )，524.5(50),704.9(6)，734.7(100)，913.9(M-1,95)；分解物 M=915.3amu;理論 値M=915.5amu。UV-vis(MeOH/HBSS；2/1)1max=414nm。蛍光(MeOH/HBSS；2/1)1ema x =450nm。量子収量=1.0。Cy5-PE DMPE（１．０mｇ、１．６ミリモル）を６５０mlの（１２：１）CHCl3/MeOHに 溶解し、DIEA（１ml、５．７ミリモル）を添加した。別に、Cy5-OSu(Amersham, Arlington Heights，IL)、Ｎ−エチル−Ｎ'−(５−カルボキシペンチル)−５． ５'−ジスルホインドジカルボシアニンのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ ル（０．８mg、１ミリモル）を１５０mlの（２：１）CHCl3/MeOHに溶解し、リン 脂質溶液に加えた。３時間後、溶剤を真空下にて除去した。残渣をMeOHに溶解し 、１：１MeOH/H2Oで平衡化したＣ18逆相カラム（１×１０cm）にかけた。同 じ溶剤で抽出し、加水分解されたエステルを除去した。極性を９：１MeOH/H2Oま で低下させて純粋な青色の生成物をカラムから溶出し、４００mg（３１０ナノモ ル、３１％）を得た。実施例III−供与体と受容体のためのリンカーの合成 本実施例は図１４〜１６を参照されたい。１２−ｐ−メトキシベンジルチオ−１−ドデカノール（１） Na（８００mg、３４．８ミリモル）を３０mlの乾燥MeOHに溶解した。アルゴン 下、ｐ−メトキシベンジルメルカプタン（２．７５ml、３．０４ｇ、１９．７ミ リモル）をメトキシド溶液へ添加した。数分後、１２−ブロモドデカノール（２ ．５ｇ、９．４３ミリモル）を反応混合物に滴下した。５分以内に固体が溶液か ら析出し始めた。最低３時間後に、反応混合物を濾過し、冷MeOHで３回洗浄し、 乾燥後に２．８７４ｇ（８．４９ミリモル、９０％）の純粋な生成物を得た。1H NMR(CDCl3): d 7.23(d,J=8.8Hz,2H,AA'BB'芳香族系のAA')，6.85(d,J=8.8Hz ,2H,AA'BB'芳香族系のBB')，3.80(s,3H,メトキシ)，3.66(s,2H,ベンジル)，3.64 (dt,J1=6.6Hz,J2=5.5Hz,2H,RCH2OH)，2.40(t,J=7.3Hz,2H,RSCH2R)，1.50-1.65(c m,4H,ヘテロ原子に対するCH2b)，1.2-1.4(cm,16H,嵩高なメチレン)１２−ｐ−メトキシベンジルチオ−１−ブロモドデカン（２） （１）（５００mg、１．４８ミリモル）を２．５mlのCH2Cl2中で四臭素化炭素 （６１１mg、１．８５ミリモル）と混合し、固体が溶液から析出し始めるまで氷 浴中で冷却した。氷浴を外し、トリフェニルホスフィン（３４８mg、２．２２ミ リモル）を反応混合物へ添加した。溶液は直ちに黄色に変わった。ＴＬＣ（EtOA c/Hex,１：１）によれば、３０分後には出発原料が消費された。溶剤を除去し、 ５０mlのヘキサンを固体残渣に添加した。一晩撹拌した後、溶液を濾過し、濃縮 乾固させた。次いで固体を約１０〜１５mlのヘキサンと混合し、再度濾過した。 濾液を濃縮し、乾燥させた後、５３７mg（１．３４ミリモル、９１％）の純粋な 生成物を得た。1H NMR(CDCl3): d 7.23(d,J=8.6Hz,2H,AA'BB'芳香族系のAA') ，6.85(d,J=8.7Hz,2H,AA'BB'芳香族系のBB')，3.80(s,3H,メトキシ)，3.67 (s,2H,ベンジル)，3.41(t,J=6.9Hz,2H,RCH2Br)，2.40(t,J=7.3Hz,2H,RSCH2R)，1 .86(cm,2H,Brに対するCH2b)，1.15-1.45(cm,18H,嵩高なメチレン)１２−(１２−ｐ−メトキシベンジルチオ−１−ドデシルチオ)−ドデカン酸（３ ） Na（１１６mg、５ミリモル）を乾燥MeOHに溶解した。１２−メルカプト−１− ドデカン酸（３４０mg、１．４６ミリモル）(JACS 115,3458-3474,1993に従って 合成)をメトキシド溶液に添加した。加熱しながら５分間撹拌し、（２）（４９ ７mg、１．２４ミリモル）を反応混合物へ添加した。反応混合物は非常に粘度が 高くなったため、さらに１．７５mlのMeOHを導入した。次いで反応混合物を一晩 放置した。反応を１０％酢酸で停止させた。ペースト状の反応混合物を５００ml の分液ロートに移し、同体積のEtOAc/Hex（１：１）と酢酸溶液に溶解させた。 有機層を分離した。次いで水層を２回以上抽出した。抽出液を合わせて濃縮し、 ７４０．３mg（１．３４ミリモル）の粗生成物を得た。過剰の酢酸は、トルエン を共沸剤として除去した。固体をイソプロピルエーテルから結晶化させ、４８３ mg（７１％）を得た。ＴＬＣ及びＮＭＲより、不純物はジスルフィド側の生成物 と思われる。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにかけ、CHCl3/MeOH/AA（ ９９：０．５：０．５）で溶出してさらに精製し、３３４mg（０．６０４ミリモ ル、４９％）の純粋な生成物を得た。1H NMR(CDCl3): d 9.45(brs,1H,COOH) ，7.23(d,J=8.8Hz,2H,AA'BB'芳香族系のAA')，6.85(d,J=8.7Hz,2H,AA'BB'芳香族 系のBB')，3.80(s,3H,メトキシ)，3.66(s,2H,ベンジル)，2.50(t,J=7.3Hz,4H,RC H2SCH2R)，2.40(t,J=7.3Hz,2H,RSCH2R)，2.35(t,J=7.5Hz,2H,RCH2COOH)，1.5-1. 7(cm,8H,ヘテロ原子に対するCH2b)，1.15-1.45(cm,30H,嵩高なメチレン)。13C NMR(CDCl3): d 179.5(COOH)，129.9(芳香族,2C)，113.9(芳香族,2C)，55.2(MeOR )，35.6(CH2)，33.7(CH2)，32.2(CH2)，31.3(CH2)，29.7(CH2)，29.4(CH2)，29. 2(CH2)，28.9(CH2)，24.6(CH2)１−ブチル−３−(１２−(１２−ペンチルチオ−１−ドデシルチオ)−ドデカン 酸)チオバルビツレート（１３） （３）（７３．８mg、１３３．５マイクロモル）を２mlの乾燥TFA/アニソール （１４：１）中で７０℃にて２．５時間脱保護した。溶剤を真空下で除去し、残 渣を１０mlの乾燥EtOHに溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３３０mg）を添加 し、混合物を一晩撹拌した。次いで、ガスの発生が止むまで溶液を濃塩酸で酸性 にした。溶液を次いでエーテルで４回抽出した。抽出液を合わせて濃縮し、白色 固体を析出させた。固体を次いで脱気MeOHで溶解して濃縮し、この操作を２回繰 り返した。高真空下で乾燥させた後、６９．５mgの固体を回収した。ＴＬＣより 、この固体には脱保護体とジ−ｐ−メトキシフェニルメタンが１：１で含まれる ものと推定された（１０４マイクロモル、７８％）。脱保護リンカーを加熱下に ０．５mlの乾燥DMFに溶解した。NaH（〜５５０マイクロモル）を添加したところ 、ガスが発生した。次いで１００μlのDMFに溶解した（８）（３８．５mg、〜１ ００マイクロモル）を反応混合物に添加し、６０℃で一晩放置した。EtOAc/MeOH /AA（９０：８：２）中でのＴＬＣより、新規なより非極性のバルビツール酸が 生成したことが判明した。溶剤を除去し、残渣をEtOAc/Hex（１：１）に溶解し て水で洗浄した。生成物を次いでクロマトグラフィーにかけ、EtOAc/MeOH/AA（ ９０：８：２）で溶出させて精製した。生成物のＮＭＲより、バルビツール酸と リンカーからの共鳴が観察された。電子スプレー（陰イオン）MS[MeOH/H2O:95/5 ](ピーク,相対強度)516.4(95)，699.4(M-1,100)，715.1(M-1+16,40)，1024.0(M- 1 +32,25)，理論値M-1=700.1amu。エーテルリンカーは部分的に酸化されてスルホ キシドになっているようである。１−(１，３−ジブチルチオバルビツレート)−３−(１−ブチル−３−(１２−( １２−ペンチルチオ−１−ドデシルチオ)−ドデカン酸)チオバルビツレート)ト リメチンオキソノール（１４） （３）（７３．８mg、１３３．５モル）を２mlの乾燥TFA/アニソール（１４： １）中で７０℃にて２．５時間脱保護した。溶剤を真空下で除去し、残渣を２０ mlの乾燥EtOHに溶解した。水素化ホウ素ナトリウム（３３０mg）を添加し、混合 物を一晩撹拌した。次いで、ガスの発生が止むまで溶液を濃塩酸で酸性にした。 溶液を次いでエーテルで４回抽出した。抽出液を合わせて濃縮し、白色固体 を析出させた。固体を次いで脱気MeOHで溶解して濃縮し、この操作を２回繰り返 した。高真空下で乾燥させた後、７１．１mgの固体を回収した。ＴＬＣより、こ の固体には脱保護体とジ−ｐ−メトキシフェニルメタンが１：１で含まれるもの と推定された（１０６マイクロモル、７９％）脱保護リンカーを加熱下に１mlの 乾燥DMFに溶解した。NaH（〜３５０マイクロモル）を添加したところ、ガスが発 生した。次いで２００μlのDMFに溶解した（１２）（３５．５マイクロモル）を 反応混合物に添加した。１時間後、反応が進行しなくなったため、４mgのN.H.（ ６０％）を反応混合物へ添加した。この際、溶液は赤からオレンジ色となり、第 二の非極性オキソノールが形成し始めた。反応を６０℃で加熱し、１８時間行っ た。反応混合物の半量を以下のように後処理した。反応混合物を３０mlの分液ロ ートに移し、〜１２mlのトルエンに溶解した。約４mlの１０％酢酸溶液と３mlの 水を加えた。オキソノールの大部分は有機層に分配し、この有機層を酢酸溶液／ 水（１：１）で３回洗浄した。有機層を次いで濃縮し、フラッシュクロマトグラ フィー（２．５×１８cm）により精製した。カラムを充填し、まずCHCl3/MeOH/A A（９３：５：２）で溶出した。一つ目の非極性オキソノールを回収した後、溶 剤の極性をCHCl3/MeOH/AA（９０：８：２）へ上げた。これにより、オキソノー ル生成物がカラムから溶出した。フラクションを濃縮乾固した後、７．２mgの純 粋な生成物（７．２５マイクロモル、２０％）を得た。1H NMR(CDCl3/MeOH):d 8.54(t,J=13.8Hz,1H,中央のメチン)，7.97(d,J=14.2Hz,2H,メチン)，4.39(cm, 8H,NCH2R)，2.46(t,J=7.3Hz,8H,RCH2SCH2R)，2.2(t,2H,RCH2COOH),1.5-18(嵩高 なメチレン)，1.2-1.4(嵩高なメチレン)，0.92(t,J=7.2Hz,9H,メチル)。電子ス プレー（陰イオン）MS[MeOH/H2O:95/5](ピーク,相対強度)683(50)，977.8(30)， 992.1(M-1,100)，1008.1(M-1+16,40)，1024.0(M-1+32,10)，理論値M-1=992.5amu 。＋１６及び＋３２ピークより、チオエーテルが酸化してスルホキシド基になっ ていることが示唆される。（１４）も、（１１）の合成のところで述べたのと同 様の手順で（１０）を用いて（１３）から合成した。１−(１，３−ジブチルチオバルビツレート)−３−(１−ブチル−３−(１２−( １２−ペンチルチオ−１−ドデシルチオ)−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドドデ カノエート)チオバルビツレート)トリメチンオキソノール（１５） ２２．５マイクロモルの（１４）を、DIEA（３９μl、２２５ミリモル）の存 在下にて０．５mlのCH2Cl2中でジコハクサ酸イミジル炭酸塩（５７mg、２２５マ イクロモル）と反応させた。１．５時間後、３つの新しい非極性バンドが形成さ れたことがＴＬＣ(EtOAc/MeOH)（９：１）より判明した。溶剤を除去し、フラッ シュクロマトグラフィーかけてEtOAc/MeOH（９５：５）で溶出させることにより 二つの非極性オキソノールバンドを精製した。電子スプレー（陰イオン）MS[MeO H/H2O:95/5](ピーク,相対強度)1089.3(M-1,20)，1105.1(M-1+16,100)，1121.0(M-1 +32,60)，理論値M-1=1089.5amu。実施例IV−FRET受容体としてのオキソノール染料及びFRET供与体としての蛍光レ クチンを用いた膜電位の測定 FL-WGAはSigma Chemical Co.(St．Louis，MO)より入手した。TR-WGAは、１０ ０mMのビシン(bicine)緩衝液中でｐＨ８．５にてWGAとテキサスレッド(Molecula r Probes，Eugene，OR)より調製した。WGAの７３μM溶液を６倍過剰のテキサス レッドと室温で１時間反応させた。タンパク質複合体をG-25Sephadexカラムで精 製した。 細胞は全て培養し、特に断らない限りＬ−Ｍ（ＴＫ-）と同様に扱った。Ｌ− Ｍ（ＴＫ-）細胞は、１０％牛胎児血清（FBS）と１％ペニシリンストレプトマイ シン（PS）(Gemini; Calabsas，CA)を含むダルベッコの改良イーグル培地(Gibco ; Grand Island，NY)中で培養した。Ｂ１０４細胞は使用前に１μMのレチノン酸 (retinoic acid)で５日間分化させた。細胞は使用前に少なくとも１日間ガラス 製カバーガラス上で培養した。付着細胞を洗浄し、１ｇ/Lのグルコースと２０mM のHEPESを含む２．５〜３．０mlのHBSS（ｐＨ７．４）中に維持した。実験の前 に、適切なオキソノールの７５μM水溶液をDMSOストック溶液から新たに調製し た。１００μlのオキソノール溶液を７５０μlの浴(bath)と混合し、希釈した溶 液を細胞に添加することにより細胞を染色した。染料を２．３μMの浴濃度で３ ０〜４０分間放置した。細胞にDiSBA-Ｃ6−(３)をロードするのに１．５mMの浴 濃度のβ−シクロデキストリン溶液が必要であった。ブチル及びエチ ル誘導体は、β−シクロデキストリンを併用しなくても細胞にロードできるくら い充分に水溶性であった。DiSBA-Ｃ10−(３)を、２９０mMのショ糖と１０mMのHE PES、３６４mOsmを含むｐＨ７．４の溶液中で１０分間、１０μMの浴濃度にてロ ードさせた。浴をHBSS溶液と置換することによりDiSBA-Ｃ10−(３)の標識を終了 した。細胞を１５μg/mlのFL-WGAで１５分間染色した。Ｂ１０４細胞では、レク チン染色には１２５μg/mlの浴濃度を要した。HBSSでの洗浄を繰り返して過剰の 染料を除去した。過剰のエチルまたはブチルオキソノール誘導体が浴中に残存す る場合には、１秒を超える脱分極の際に染料が細胞中へ再分配することによる遅 延電流と蛍光変化が観察された。心筋細胞[Henderson，S.A.，Spencer，M.，Sen ，A.，Kumar，C.，Siddiqui，M.A.Q.，and Chien，K.R．1989．Structure organ ization，and expression of the rat cardiac myosin light chain-2 gene．J. Biol．Chem．264:18142-18146]は、Kenneth Chien，UCSD教授より提供を受けた 。Jurkatリンパ球の懸濁液を５％の加熱不活化FBSと１％PSを含むPRMI培地中で 培養した。染料で染色する前及び後に、１００×ｇで４分間遠心分離した後新鮮 なHBSSを添加することにより、１５〜２０mlの細胞懸濁液アリコートを３回洗浄 した。 ４５０〜４９０nmの励起干渉フィルターを通した７５Ｗのキセノンランプから の光で蛍光標識細胞を励起した。５０５nmのダイクロイックを用いて光をサンプ ル上で反射させた。６３ＸのZeiss（開口数１．２５または１．４）レンズを用 いて放射された光を集め、５０５nmのロングパスフィルターに通し、Ｇ−１Ｂ５ ５０nmダイクロイック(オメガ、Brattleboro，VT)へ当てた。この２番目のダイ クロイックにより反射された光を５１５ ＤＦ３５バンドパスフィルターに通し 、FL-WGAのシグナルとした。透過した光を５６０または５７０ＬＰフィルターに 通し、オキソノールのシグナルとした。TR-WGAに対する供与体としてオキソノー ルを用いた実験では、励起に５５０nmのダイクロイックを使用し、発光を分光す るのに５８０nmのダイクロイックを使用した。長波長テキサスレッド蛍光は６０ ５nmのＤＦ５５バンドパスフィルターに通した。単一細胞における電圧応答性の 蛍光変化を、２つの発光を記録するために２個のR928 PMTを備えたフォトスキャ ンII光度計に接続したニコン顕微鏡で測定した。特に断ら ない限り、７−ポイントSavitsky-Golayの補整方法を全データに適用した[Savit sky，A．and Golay，M.J.E．1964．Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedure．Anal．Chem．36:1627-1639]。TTLパル スカウンティングルーチンLEVOKEを使用するAxobasicプログラムを用いて１〜２ KHzの単一波長データを得た。手製の高速共焦点顕微鏡を用いて共焦点イメージ を得た[Tsien，R.Y．and B.J．Bacskai．1994．Video-rate confocal microscop y．In Handbook of Biological Confocal Microscopy．J.B．Pawley，editor．P lenum Press，New York]。細胞は、−７０mVの保持電位で電圧固定した。２００ ms遅れて、細胞に２００msの脱分極矩形電圧を加えて５０mVにした。オキソノー ル発光に対するFL-WGAの発光比を示す擬色イメージを６７ms毎に集め、細胞を脱 分極させて＋５０mVにした際の形質膜に局在している比の変化を明らかにした。 Axon Instruments(Foster City，CA)製のＣＶ−４ヘッドステージを備えたAxo patch１−Ｄ増幅器を用いて、パッチクランプを記録した。データをデジタル化 し、PCLAMPソフトウエアを用いて蓄積した。使用したｐＨ７．４の細胞内溶液に は１２５mMのグルコン酸カリウム、１mMのCaCl2・2H2O、２mMのMgCl2・6H2O、１ １mMのEGTA、及び１０mMのHEPESが含まれていた。Ｂ１０４細胞の場合には、４m MのATP及び０．５mMのGTPを添加した。 エタノール中におけるローダミンＢに対するDiSBA−Ｃ6−(３)の量子収量を求 めた（ F＝０．９７）[Weber，G．and Teale，F.W.K．1957．Determination of the absolute quantum yield of fluorescent solutions．Faraday Soc．Trans ．53:646-655]。標準的な手順に従ってＲ0を計算した[Wu，P．and Brand，L．19 94．Resonance energy transfer: methods and applications．Anal．Biochem. 218:1-13]。HBSS中のFL-WGAのスペクトルとオクタノール中のDiSBA−Ｃ6−(３) のスペクトルを用いて、重なり積分を求めた。屈折率及び配向ファクターとして それぞれ１．４及び０．６７の値を使用した。 上述の設計基準に基づいて蛍光イオンを迅速に移動させるための候補と同様に 、対称ビス(チオバルビツレート)オキソノールを選択した。対称ビス(チオバル ビツレート)オキソノールは、膜中で５４０nmにて強い吸光極大（〜２００，０ ０ ０M-1cm-1）と良好な量子収量（０．４０）示すため、細胞中で蛍光供与体また は受容体として用いるのに適している。DiSBA−Ｃ6−(３)の蛍光励起スペクトル と蛍光発光スペクトルを、FL-WGA及びTR-WGAのものと一緒に図２に示す。波長の 短い方が励起スペクトルである。膜環境を真似るため、オクタノールをオキソノ ールの溶剤として選択した。 細胞全体の電圧固定を記録することにより、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞における移 動速度を検討した。Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞はバックグラウンド電流が非常に小さ く、パッチクランプがし易いため、この細胞を選択した。これらの細胞は−５mV の静止電位を有するが、明らかに電圧によって活性化される電流は有していない 。 ２０℃におけるDiSBA−Ｃ6−(３)からの変位電流を図３に示す。−７０mVの保 持電位より１５mVずつステップ状に電圧を上げ、それぞれ１２．５ms間細胞に電 圧をかけた。Axopatch増幅器のキャパシタンス及び直列抵抗の補償能を用いるこ とにより、単純な膜キャパシタンスの過渡電流に起因する大きく且つ速い過渡電 流を最小に抑えることができ、変位電流をはっきりと観察することが可能であっ た。電流は、８回の脱分極に応答して膜に結合したオキソノールが再分配するこ とに起因するものである。変位電流の時定数は１２０mVの脱分極で２msである。 電圧印加の開始時と終了時に等量の電荷が相反する方向に移動することは、貯蔵 されたイオンが一方のエネルギー最低値から形質膜を横断して他方のエネルギー 最低値へ再分配することと一致する。さらにオキソノールの移動により誘導され たキャパシタンスdq/dVは、１００mVの脱分極に対し〜５ｐFと計算される。この 値は、染料を含まない膜のキャパシタンスのおよそ３分の１に相当する。興味深 いことに、ナトリウムチャネルのゲーティング変化も、小規模の脱分極に対する イカの軸索の全キャパシタンスの約３３％に対して応答性である[Hodgkin，A．1 975．The optimum density of sodium channels in an unmyelinated nerve．Ph ilos．Trans．R．Soc．Lond.[Biol]270:297-300]。オキソノールの不存在下では 、無視できる電流が観測された。DiSBA−Ｃ10−(３)ではほぼ同一速度の変位電 流が発生したが、Ｒ＝ブチル及びエチルの類似体ではさらに遅い電流が発生した 。ブチル化合物の時定数は〜１８msであり、エチル化合物からの電流は非常に小 さいうえ遅いため、観測が困難であった。 図４及び５には、図３の場合の４倍のオキソノールをロードした細胞中の電荷 移動に対する電圧依存性と時定数を示す。図４中、丸は応答からのデータであり 、四角はテール電流からのデータである。生データを一次指数関数にフィッティ ングさせ、移動した電荷（面積）を電流の振幅と時定数の産物として計算した。 実験データは、脂質二重層の水界面に近い２つのエネルギー最低値の間の疎水性 イオンの輸送モデルと理論的に一致している[Ketterer，B.，Neumcke，B.，and Lauger，P．1971．Transport mechanism of hydrophobic ions through lipid b ilayer membranes．J．Membrane Biol．5:225-245; Andersen，O.S．and Fuchs, M．1975．Potential energy barriers to ion transport within lipid bilaye r．Biophys．J．15:795-830; Benz，R.，Lauger，P.，and Janko，K．1976．Tra nsport kinetics of hydrophobic ions in lipid bilayer membranes．Biochim ．Biophys．Acta 455:701-720]。これらのモデルより、平衡な電荷変位(equilib rium charge displacement)ｑ(Ｖ)と移動時定数τ(Ｖ)が、以下に示すように、 外部から加えられた膜電位Ｖに依存していなければならないことが予測される。 Ｖhは同数のイオンが各ポテンシャルエネルギー井戸の中に存在する場合の膜 電位であり、膜の非対称性からゼロにはならない。βは実際に感知された外部印 加電位を移動するイオンで割った値であり、ｑは各イオンの電荷であり、ｋ及び Ｔはボルツマン定数と絶対温度である。ｑmax及びτmaxは、それぞれＶ＝Ｖhの 時の各エネルギー井戸中の電荷を合計したものと移動の時定数である。図４の滑 らかな曲線は、ｑmax＝４７７０±１４０fC、β＝０．４２±０．０２、Ｖh＝− ３．８±１．５mVで式（１）にフィッティングさせたものである。同様に、図５ の 滑らかな曲線は、Ｖh＝−５mV及びβ＝０．４２でτmax＝２．９msで式（２）に フィッティングさせたものである。 これらの結果より、オキソノールは膜にかかる電界の有意な部分を感知し、〜 ３ms以下で移動し、最高感度と移動の直線性が膜電位の関数として生理学的に適 切な範囲内にあることが判明した。 電荷変位を光学的なシグナルに変換するため、膜内の細胞内側及び細胞外側の 結合部位におけるオキソノールの蛍光を異なるものにした。蛍光の非対称性は、 細胞外膜表面に結合する蛍光標識レクチンを導入することにより創出した。図１ に示すように、FL-WGAの励起により、膜内の細胞外側の結合部位に位置するオキ ソノールに対してエネルギー伝達を誘導する。FL-WGAの吸光係数と蛍光量子収量 を測定したところ、それぞれ２２２，０００M-1cm-1（〜３フルオレセイン／タ ンパク質）及び０．２３であった。FL-WGAで標識したJurkat細胞懸濁液中では、 DiSBA−Ｃ−(３)の滴定(titration)によりレクチンの蛍光強度が３０％まで消光 した。消光の全てがエネルギー伝達によるものである最良の場合では、レクチン から膜結合オキソノールまでの平均距離は５０Å（FL-WGA/オキソノール対に対 するForster距離Ｒ0の理論値）よりもまだ長い。FL-WGAの発光とDiSBA−Ｃ6−( ３)の励起との間のスペクトルの重なりを図２に示す。FRETが２つの発蛍光団を 隔てる距離の６乗に反比例して減衰するため、膜内の細胞内側にあるオキソノー ル（さらに４０Å離れている）へのエネルギー伝達は無視できる程度である。 脱分極により、細胞内部位により多く結合し、細胞外部位により少なく結合す るようにオキソノール分子が再分配する。この変化によりエネルギー伝達が低下 し、その結果FL-WGAの蛍光が増加し、それに伴ってオキソノールの発光が減少す る。DiSBA−Ｃ4−(３)／FL-WGA対により標識したＬ−Ｍ（ＴＫ-）細胞を電圧固 定し、電圧を４回ステップ状に上げて脱分極させた際の蛍光シグナルを図６に示 す。データは２９回繰り返してその平均をとったものである。１２０mVの脱分極 に対してFL-WGAの発光は７〜８％増加し、オキソノールの蛍光は１０％減少し、 FL-WGA／オキソノールの発光比は１９％変化した。供与体と受容体の発光の同時 変化は図１に示すFRETメカニズムと一致する。脱分極によるオキソノー ル発光の減少は、細胞内でオキソノールが電圧に応答してゆっくり取り込まれる 際に見られる現象[Rink et al．1980，前掲]とは逆である。蛍光変化の時定数は ２０℃で〜１８msであり、DiSBA−Ｃ4−(３)の変位電流と一致している。FL-WGA の不存在下では蛍光の大きな変化は観察されない。DiSBA−Ｃ4−(３)の移動速度 は温度が上がると速くなる。時定数は２９℃では７〜８msに減少する（これは、 〜１７kcal／モルの活性化エネルギーに相当する）。しかしながら、温度が上が るとレクチンのインターナリゼーションも増加し、その結果蛍光の変化が小さく なる。Ｒ＝エチル及びブチルのオキソノールは内部細胞膜にも到達するため、能 動的な膜のインターナリゼーションはおそらく必要ではない。フルオレセインと オキソノールのスペクトルが重なると、電圧依存性のFRETシグナルがさらに弱く なるため、フルオレセイン発光チャネルにおける光にはオキソノールからのもの が含まれ、オキソノール発光チャネルにおける光にはフルオレセインからのもの が含まれる。 オキソノール上のアルキル鎖の長さを長くすることにより応答時間が有意に改 善される。DiSBA−Ｃ6−(３)／FL-WGA対の時定数は２０℃で〜３msであり、一方 DiSBA−Ｃ10−(３)／FL-WGA対は図７に示すように２msの時定数で応答する。実 線は時定数２msで一次指数関数にフィッティングさせたものである。データは２ ０℃で３個のＬ−Ｍ（ＴＫ-）細胞の平均をとったものであり、２kHzで得たもの である。図中の応答は補整しているため実際の値よりわずかに遅い。蛍光の時定 数は変位電流の時定数と一致している（例えば、図３）。長いアルキル鎖の形状 でオキソノールに疎水性を付加する場合、その効果には限界がある。オキソノー ルコアのブチルをヘキシルに置き換えることにより、移動速度は６倍速くなるが 、ヘキシルをデシル化合物にしようとメチレン基を２個多く付加させても、速度 は２倍も速くならない。これらの移動速度の速いオキソノールは本質的に水に不 溶性であり、細胞にロードするためには手順の改良が必要である。DiSBA−Ｃ6− (３)は、アルキル鎖と複合するβ−シクロデキストリン（１．５mM）を添加した 通常の培地中で容易にロードできる。ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中の非蛍光性 DiSBA−Ｃ6−(３)凝集体は、β−シクロデキストリンの添加により蛍光性となる 。DiSBA−Ｃ10−(３)は、ショ糖で等張化したイオン強度の低い培地中 でロードしなくてはならない。疎水性は、染料の第一膜からの脱着を防ぐのにお そらく充分であるため、標識は主に形質膜に限られる。実施例Ｖ−FRET受容体としてのオキソノール染料及び蛍光脂質FRET供与体を用い た膜電位の測定 Ａ．トリメチンオキソノール グリシンリンカーを介してジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(D MPE)へ複合させた６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン(Cou-PE)を調製し、ビス −(１，３−ジアルキル−２−チオバルビツレート)−トリメチンオキソノールに 対して優れた電圧応答性FRET供与体として作用することを見出した。この新しい FRET対は、神経膠星状細胞腫細胞において１００mVの脱分極に対し８０％の比変 化をもたらした。この変化は、細胞中で観察される電圧応答性の光学的シグナル のなかで最も応答性が高いものである（図１７）。このFRET対の電圧応答性は、 各種細胞種においてFL-WGA／トリメチンオキソノールの場合の２〜３倍である。 Ｌ−細胞では、比の値は２５〜５０％であり、両方のチャネルにおいて変化の割 合は等しい（図１８）。新生児の心筋細胞では、自然発生した活動電位に対し５ 〜３０％の蛍光比の変化が観察された。最も大きなシグナルはFL-WGA／トリメチ ンオキソノールの場合のはぼ４倍である。心臓細胞の単一集団で得られた大きな 変化の例を図１９に示す。比を読み取ることの利点は図から明らかである。上の 図では、個々の波長より、発蛍光団の脱色に起因してベースラインが下がってい ることが判る。下の図に示した比のデータでは両方のチャネルにおける強度の損 失が補整され、その結果、平らなベースラインが得られている。さらに、動作ア ーティファクトにより各波長の応答がブロードになっている。比のデータでは、 これらの動作アーティファクトが減少し、実際の電圧変化をより正確に表すより シャープなシグナルが得らていれる。この新しいFRET対に対するより高い応答性 は、ファクターの組み合わせに起因しているようである。供与体が膜表面近傍へ 移動し、Forster伝達距離（Ｒo）が減少すると、FRETにより同じ側にある移動性 イオンと膜の反対側にある移動性イオンの区別がつきやすくなる。また、スペク トルが分離することにより、供与体と受容体の発光の集光が容 易になり、クロストークによるシグナルの損失が減少する。 Ｂ．ペンタメチンオキソノール １，３−置換チオバルビツール酸をグルタコンジアルデヒドジアニル一塩酸塩 （Ｎ−[５−(フェニルアミノ)−２，４−ペンタジエニリデン]ベンゼンアミン一 塩酸塩としても公知）と縮合させることにより、ビス−(１，３−ジアルキル− ２−チオバルビツレート)−ペンタメチンオキソノールを調製した。ペンタメチ ンオキソノールは６３８nmで吸光し（ｅ＝２２５，０００M-1cm-1）、蛍光はエ タノール中では６６３nmで最大となる。吸光と発光は、トリメチンオキソノール に比べて１００nm長波長側へシフトする。このシフトは、シアニン等の他のポリ メチン染料でも同様であり、２個のメチン単位がさらに付加されることにより、 波長が１００nm赤側へシフトする。 ペンタメチンは、トリメチンオキソノールと同様の方法で培養中の細胞へロー ドすることができる。ブチル化合物(DiSBAＣ4(５))はハンクス平衡塩類溶液中で ロードできるが、ヘキシル化合物(DiSBAＣ6(５))ではβ−シクロデキストリンを 添加してヘキシル側鎖をマスクし、疎水性オキソノールを可溶化することが必要 である。 形質膜に結合した各種蛍光供与体からペンタメチンオキソノールへの電圧応答 性FRETを単一細胞中で検討した。FL-WGAはペンタメチンと共にFRETを経験し、ト リメチンオキソノールで観察された比変化に匹敵する比変化が得られることが判 明した。神経膠星状細胞腫細胞では、−７０mVから１００mVの脱分極ステップに 対して１５〜３０％の比変化が記録された。明らかなように、オキソノールの吸 光が１００nm長波長側へシフトするのに伴って重なり積分（Ｊ）が減少し、それ によるFRETの減少分は、膜の細胞内表面に比べて細胞外表面へのFRETの選択性が 増大すること及び／またはスペクトルの重なりが低減することで相殺される。 蛍光ホスファチジルエタノールアミン複合体も、ペンタメチンオキソノールに 対するFRET供与体として作用することを見出した。試験したPE複合体の構造を図 ２０に示す。NBD-PE／ペンタメチンオキソノール対では、１００mVにつき１ 〜１０％比が変化した。Cou-PE／ペンタメチンオキソノールでは、電圧固定した 神経膠星状細胞腫細胞において１００mVの脱分極に対して１５〜３０％比が変化 した。Cou-PEの発光とDiSBAＣ6(５)の吸光の最大値が２１３nm離れており、その 他重なりもほとんどないため、この対は顕著である（図２１）。ペンタメチンは 長波長で大きく励起するため、クマリンとペンタメチンオキソノールとの間のFR ETが可能となる。この対に対するＲoは、Cou-PEに対する量子収量値が１．０で あることから３７Åと計算された。 ペンタメチンの膜移動速度は、トリメチン類似体の５〜８倍の速さである。電 圧固定された神経膠星状細胞腫細胞におけるDiSBAＣ4(５)の変位電流より、＋２ ０〜１２０mVの電圧ステップに応答してブチルペンタメチンオキソノールが時定 数〜２msで形質膜を横断することが判明した。トリメチン類似体は、同一の条件 下では〜１８msで移動する。DiSBAＣ6(５)の変位電流は非常に速く消滅し、細胞 のキャパシタンスから分離するのが困難である。Cou-PE/DiSBAＣ6(５)対からの 電圧依存性のシグナルが大きいため、DiSBAＣ6(５)の電圧応答の速度を光学的に 測定することが可能であった。DiSBAＣ6(５)の移動に対する時定数は、非対称標 識Cou-PEからのFRETを用いて光学的に測定したところ、１００mVの脱分極ステッ プに応答して０．３８３±０．０３２msであった。比のデータと指数応答を図２ ２に示す。ペンタメチンオキソノールはトリメチン類似体に比べ電荷が局在化し ておらず、疎水性もわずかに強いため、移動速度が向上した。DiSBAＣ6(５)の迅 速な電圧応答は、透過性であり且つ蛍光強度の強い分子で知られているどの応答 よりも速い。ミリ秒以下の応答は、単一ニューロンの活動電位を正確に記録する のに充分な速さである。実施例VI−FRET供与体としてオキソノール染料を用いた膜電位の測定 FL-WGAの代わりにTR-WGAを用いると、エネルギー伝達の方向を逆にすることが できる。DiSBA−Ｃ6−(３)は、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞においてFL-WGA/DiSBA−Ｃ6 −(３)と同等の応答時間でTR-WGAに対するFRET供与体として作用する。このFRET 対のスペクトルの重なりを図２に示す。しかしながら、シグナル変化はFL-WGA/D iSBA−Ｃ6−(３)の場合のわずか半分である。 Ｂ１０４神経芽細胞腫細胞では、DiSBAＣ6(３)をCy5標識PEに対するFRET供与 体として使用した。５〜１５％／１００mVの比変化は、供与体として移動性イオ ンを用いて観察される変化のうちで最大のものである。実施例VII−各種細胞種における膜電位の測定 FL-WGA/DiSBA−Ｃ6−(３)系を各種細胞株で試験した。新生児の心筋細胞では 、２種の発蛍光団を自発的な鼓動に影響を与えずにロードすることができた。従 って、オキソノールの変位電流より生じたキャパシタンスは活動電位の発生を妨 げなかった。１回の試験では、周期的な９０mVの活動電位を観測することができ た[Conforti，L.，Tohse，N.，and Sperelakis，N．1991．Influence of sympat hetic innervation on the membrane electrical properties of neonatal rat cardiomyocytes in culture．J．Devel．Physiol．15:237-246]（図８Ｃ）。バ ックグラウンド蛍光を除かない場合の比の変化は４〜８％であった。単一の波長 データにおいて動作アーティファクトが観察された。図８のＡ及びＢでは、両方 のチャネルにおいて検出光の緩やかな変化が観察された。比のデータではこれら の影響を実質的に除いた。データを１００Hzで得、１０μMのイソプロテレノー ルを浴溶液に添加した。電圧応答性の蛍光変化は、予想されたように、機械的な アーティファクトよりも速い[Hill，B.C．and Courtney，K.R．1982．Voltage-s ensitive dyes discerning contraction and electrical signals in myocardiu m．Biophys．J．40:255-257]。オキソノールを２．３μMでロードした細胞のい くつかでは、約７秒間キセノンアークを連続的に照射したところ鼓動が止まった 。０．６μMのロードでは、光毒性が減少したが、シグナルも減少してしまった 。分化させたＢ１０４神経芽細胞腫細胞では、バックグラウンドを除かなくても １２０mVの脱分極に対して比が８％増加した。内部ナトリウム電流では、励起照 射を合計で１０〜２０秒行った実験でも光毒性効果が減少しなかった。FL-WGA/D iSBA−Ｃ6−(３)標識１３２１Ｎ神経膠星状細胞腫細胞では、オキソノールとFL- WGAの蛍光は主に形質膜上で見られた。図９のような吸光分光分析の実験では、 比は１００mVに対して２２〜３４％変化した。５０ms遅れて、膜電位を−７０mV から１００mVへ１００ms間脱分極させた。３００Hzで４回試験を行 い、補整せずにその平均をとった。蛍光の変化に対する時定数は、３．３ms未満 であり、図３に示したような変位電流と一致する。最初のシグナルから小さなバ ックグラウンドシグナルを除いた（オキソノールチャネルでは＜５％、フルオレ セインチャネルでは＜１５％）。フルオレセインチャネルとオキソノールチャネ ルの蛍光強度は、それぞれ１００mVの脱分極に対して〜１７％増強し、〜１６％ 減少した。これらの細胞中では、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）とは違って、発光チャネル間 のクロストークが減少し、フルオレセインのシグナルが大きく変化した。これら のシグナルの変化は、単一細胞中で観察されるミリ秒単位の膜電位依存性の比変 化のうちで最大のものである。先の研究により、4-ANEPPSでは励起の比が９％／ １００mV変化することが判明している[Montana,V.，Farkas，D.L.，and Loew，L .M.1989．Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membra ne potential．Biochemistry 28:4536-4539]。さらに、各発光チャネルにおける FL-WGA/DiSBA−Ｃ6−(３)の蛍光の変化は、記録された変化のうちで最大のもの に匹敵する（例えば、神経芽細胞腫細胞でRH-421を用い場合の変化は２１％／１ ００mVである[Grinvald，A.，Fine，A.，Farber，I.C.，and Hildesheim，R．19 83．Fluorescence monitoring of electrical response from small neurons an d their proesses．Biophys．J．42:195-198]）。FL-WGA/DiSBA−Ｃ6−(３)から の大きなシグナルにより、高速共焦点顕微鏡を用いて、電圧固定したＬ−Ｍ（Ｔ Ｋ-）及び神経膠星状細胞腫細胞における膜電位の変化の比のイメージを記録す ることができる。 神経膠星状細胞腫細胞では、１２０mVの脱分極に対して比が１０〜２０％増加 し、その変化は細胞膜に集中していた。実施例VIII−蛍光テトラアリールボレートの合成 図１０を参照して、２５ml容の乾燥２口フラスコ中にて０．７８８ｇ（５８０ μl、２．２ミリモル）の化合物Ｉを６mlの乾燥ヘキサンにアルゴン下で溶解し た。フラスコを−７０℃まで冷却した後、１．５Mのn-ブチルリチウム溶液１． ４６ml（２．２ミリモル）をシリンジにて添加した。セパレートフラスコ中にて ０．６の乾燥ボランIIを、６mlのヘキサンと１．５mlの新鮮な蒸留THFの脱酸 素混合物に溶解した。次いでボラン溶液をシリンジにてリチウム試薬へ添加した 。固体が直ちに沈澱した。３０分後、冷浴を外し、反応混合物をゆっくりと加熱 した。３時間後に溶剤をデカンテーションにより除去し、固体をさらにヘキサン で洗浄した。固体をアセトニトリルと水に溶解し、次いで分液ロートに注ぎ込ん だ。水層をヘキサンで再度洗浄し、次いで酢酸エチルで抽出した。抽出液の半量 を濃縮して１２４．９mg（１７０．５マイクロモル）の所望の生成物を得た。こ の生成物を次いで９７mgのフッ化テトラブチルアンモニウムとアセトニトリル中 で１５分間室温で混合した。後処理後、１２９．１mgの化合物IIIをテトラブチ ルアンモニウム塩として回収した（９３％）。1H NMR（d6アセトン）7.61(br d, 2H，CF3-フェニル基)，7.43(cm,〜3H,CF3-フェニル基)，6.90-7.26(cm,〜7H,CF3 -フェニル基)，3.43(cm,8H,NCH 2CH2CH2CH3)，1.81(cm,〜8H,NCH2CH 2CH2CH3)，1 .42(cm,〜8H,NCH2CH2CH 2CH3)，0.93(t,J=7.1Hz,NCH2CH2CH2CH 3) 図１０を参照して、化合物IVを合成した。５ml容の丸底フラスコ中にて、１４ mg（１７．２マイクロモル）の化合物III、７mg（２５．８マイクロモル）のブ ロモメチルビマン、２７．３mg（１７２マイクロモル）の炭酸カリウム及び５mg （１８．９マイクロモル）の１８−クラウン−６を０．６mlの乾燥アセトニトリ ル中で混合した。混合物を７０℃で１．５時間加熱した。冷却後、反応混合物を 酢酸エチルに溶解し、３回水で洗浄した。有機残渣をフラッシュクロマトグラフ ィーにかけ、トルエン／アセトン（２：１）で溶出して精製した。主なバンドを 回収し、１２．１mg（７０％）の純粋な生成物IVのテトラブチルアンモニウム塩 を得た。1H NMR（d6アセトン）7.58(br d，2H，CF3-フェニル基)，7.4-7.5(cm,2 H,CF3-フェニル基)，7.0-7.3(cm,〜10H,CF3-フェニル基)，5.29(d,J=1.6Hz,2H,C H2)，3.46(cm,8H,NCH 2CH2CH2CH3)，2.56(d,J=0.7Hz,3H,ビマンメチル)，1.84(cm ,〜8H,NCH2CH 2CH2CH3)，1.79(d,J=0.8Hz,3H,ビマンメチル)，1.76(s,3H,ビマン メチル)，1.44(cm,〜8H,NCH2CH2CH 2CH3)，0.98(t,J=7.2Hz,NCH2CH2CH2CH 3)；０ ．１NのH2SO4中の硫酸キニン f=0.55に対してジオキサン中 f=0.73。実施例IX−リンカー基を有する非対称オキソノールの合成 （Ａ）本実施例はリンカー基を組み込んだ(built-in)非対称オキソノールの合 成を例示するものである。図１１を参照して、化合物Ｖを合成した。４．３５ｇ （２１．７ミリモル）の１，１２−ジアミノドデカンを４０mlの乾燥CH2Cl2へ溶 解した。シリンジより、２．６２ml（２．１７ミリモル）のイソチオシアン酸ブ チルを反応フラスコへ添加した。１５分後に白色の固体が沈澱した。１時間後、 さらに、反応混合物を濾過した。濾液を蒸発させて白色固体を得た。固体を４５ mlの乾燥CH2Cl2へ再度溶解し、２．４４mlのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミ ン(DIEA)と３．９ｇ（１７．９ミリモル）のジ−ｔ−ブチルジカーボネートと混 合した。１時間反応させた後、混合物を分液ロートへ注ぎ込み、５％重炭酸ナト リウムで洗浄した。固体が溶液から析出し、これを濾別した（＜１００mg）。有 機溶液を次いで水及び飽和塩類溶液で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾 過した。濾液を蒸発させて白色固体を得、イソプロピルエーテル中で再結晶させ 、４．３０ｇ（１０．３ミリモル）の純粋な化合物Ｖ（合計で４８％）を得た。1 H NMR(CDCl3) 5.73(br s,2H,チオアミド)，4.50(br s,1H,カルバメート)，3.4 0(br s,4H,NCH 2)，3.10(q,J=7.2Hz,〜3H,カルバメートの隣のCH 2)，1.44(s,9H,t -ブチル)，1.2-1.7(cm,嵩高なCH 2s)，0.94(t,J=7.2Hz,n-ブチルメチル) 化合物VIを調製するため、４４１mg（１９．２ミリモル）のナトリウムをアル ゴン下で５mlの乾燥エタノールに溶解した。ナトリウムのほぼ全てを溶解させ、 ２．９２ml（３．１ｇ、１９．２ミリモル）のマロン酸ジエチルをエトキシド溶 液に添加した。固体が溶液から沈澱した。４．０ｇ（９．６ミリモル）の化合物 Ｖを添加し、混合物をアルゴン下で１００℃、７０時間還流させた。冷却後、反 応混合物を濾過し、エタノールで洗浄した。水を濾液に加え、白色の固体を溶液 から沈澱させた。固体（７７９mg、ほとんどが未反応出発材料）を濾別した。濾 液を次いでｐＨ〜２まで酸性にし、酢酸エチル中へ抽出した。有機層を次いでMg SO4で乾燥させ、濾過した。溶剤を除去した後、１．６ｇ（３．３ミリモル）の 黄色の油状物質を回収した（３４％）。1H NMR(CDCl3) 4.22(cm,4H,バルビツレ ートの隣のNCH 2)，3.63(s,2H,環CH 2)2.99(cm,2H,カルバメート隣のCH 2)，1.53(c m,4H,NCH2CH 2)，1.34(s,9H,t-ブチル)，1.1-1.3(cm,嵩高なCH 2s)，0.85(t,J=7.4 Hz,n-ブチルメチル) 化合物VIIを調製するため、１mlのトリフルオロ酢酸(TFA)を撹拌下に、３ml のCH2Cl2に溶解した２００mg（０．４１ミリモル）の化合物VIIへ添加した。１ ．２５時間後、減圧下にて溶剤を全て除去した。Ｎ−[５−(フェニルアミノ)− ２，４−ペンタジエニルジエン]アニリン一塩酸塩と１，３−ジ−ｎ−ブチルチ オバルビツレートをそれぞれ１当量添加し、３成分全てを１mlのピリジンに溶解 して一晩放置した。生成物を他のペンタメチンオキソノールよりフラッシュクロ マトグラフィーにて精製した。非極性の生成物をCHCl3/CH3OH（９：１）で溶出 させた。リンカーを含む純粋な生成物をCHCl3/CH3OH（１：１）で溶出させた。 生成物は非常に強固にシリカゲルに結合したため、１０mgの生成物を回収したに とどまった。1H NMR(CDCl3/CD3OD) 7.5-7.8(cm,4H,ビニルメチン)，7.35(t,J= 〜14HZ,1H,中央のメチン)，4.34(br t,〜10H,バルビツレートの隣のNCH 2)2.72(c m,〜3H,アミンの隣のCH 2)，1.4-1.7(br cm,〜12H,NCH2CH 2)，1.0-1.4(cm,〜40H, 嵩高なCH 2s)，0.81(t,J=7.3Hz,9H,n-ブチルメチル) （Ｂ）本実施例は図１５及び１６を参照する。Ｎ−ブチル−Ｎ−５−ペンタノールチオ尿素（６） ５−アミノ−１−ペンタノール（１．４１６ml、１３ミリモル）を７mlのCH2C l2に溶解した。アルゴン下で、イソチオシアン酸ブチル（１．５７０ml、１３ミ リモル）をシリンジより添加した。２．５時間後、溶剤を真空下にて除去して油 状物質を得た。高真空下にて、油状物質を液体窒素で２回凍結乾燥させ、減圧下 に一晩放置した。次の朝、２．６１５ｇの純粋な固体生成物を回収した（１２ミ リモル、９２％）。1H NMR(CDCl3)：d 5.90(br s,2H,NH)，3.66(t,J=6.2Hz,2H,R CH2OH)，3.42(br m,4H,NHCH2R)，1.80(br s，1H,OH),1.3-1.7(unres．cm's,10H, 嵩高なメチレン)，0.94(t,J=7.2Hz,3H,メチル)。13C NMR(CDCl3): d 181.5(チオ カルボニル)，62.2(RCH2OH)，44.2(NHCH2R),44.1(NHCH3R)，31.9(CH2)，31.0(CH2 )，28.6(CH2)，23.0(CH2)，19.9(CH2)，13.6(CH3)。１−ブチル，３−(５−ペンタノール)チオバルビツレート（７） 乾燥EtOH中で、３４５mg（１５ミリモル）のNaを溶解した。Naのほぼ全てを溶 解した後、マロン酸ジエチル（２．２７８ml、１５ミリモル）をアルゴン下 に添加した。次いで混合物を６０℃まで加熱し、沈澱したマロン酸ナトリウムを 溶解した。次いで熱をとり、Ｎ−ブチル−Ｎ−５−ペンタノールチオ尿素（６） （１．３１０ｇ、６ミリモル）を添加した。反応混合物を１００℃で３．５日間 還流させた。冷却後、反応混合物を濾過し、EtOHで洗浄した。ほぼ等量のH2Oを 濾液に添加し、濃塩酸でｐＨ１〜２まで酸性にした。水溶液を１：１EtOAc/ヘキ サンで３回抽出した。抽出液を合わせ、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して油 状物質を得た。ＴＬＣEtOAc/MeOH（４：１）より、主成分のバルビツレート生成 物の他に、２種の非極性不純物が含まれていることが判明した。フラッシュシリ カゲルクロマトグラフィー（４×１７cm）にかけ、EtOAc/MeOH（４：１）で溶出 して精製した。物質がまだ油状であったため、２回目のカラムにかけてCHCL3/Me OH/AA（９０：８：２）で溶出させた。油状物質ではあるが、０．７２６ｇ（２ ．５４ミリモル、４２％）の純粋な生成物を回収した。1H NMR(CDCl3)：d 4.31( cm,4H,NCH2R)，3.71(br s,2H,環メチレン)，3.63(t,J=6.3Hz,2H,RCH2OH)，2.75( br s,1H,OH)，1.5-1.8(cm,6H,嵩高なメチレン)，1,2-1.5(cm,4H,嵩高なメチレン )，0.94(t,J=7.2Hz,3H,メチル)１−ブチル，３−(５−ブロモペンタン)チオバルビツレート（８） （７）（９８mg、３４３マイクロモル）を６００μlの乾燥CH2Cl2に溶解し、 四臭化炭素（１４２mg、４２９マイクロモル）と混合した。溶液を氷冷し、トリ フェニルホスフィン（１３５mg、５１５マイクロモル）を添加した。溶液は発泡 し、直後に黄色に変わった。３０分後、溶剤を除去し、ヘキサンを固体残渣へ添 加した。混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣより、ただ１種のバルビツレートがヘキ サン溶液中に酸化トリフェニルホスフィンと共に含まれていることが判明した。 EtOAc/MeOH（９８：２）で充填したフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ ２．５×２２cm）で不純物を除去した。充填溶剤と続いてEtOAc/MeOH（９０：１ ０）を用いて、非極性の不純物をカラムから溶出させた。所望の生成物をCHCl3/ MeOH/AA（９３：５：２）で溶出し、４０mg（１１５マイクロモル、３４％）得 た。1H NMR(CDCl3)：d 4.33(cm,4H,NCH2R)，3.72(s,2H,環メチレン)，3.42(t,J= 6.7Hz,2H,RCH2Br)，1.91(cm,2H,メチレン)，1.66(cm,4H,メチレン)，1. 52(cm,2H,メチレン)，0.95(t,J=7.2Hz,3H,メチル)１，３−ジ−ブチル−５−(３−フェニルアミノプロペンジエニル)チオバルビツ レート（１０） マロンアルデヒドビス(フェニルイミン)（５００mg、１．６９ミリモル）を２ ０mlの乾燥DMFに溶解した。別に、１，３−ジ−ブチルチオバルビツレート（４ ３０mg、１．７６ミリモル）を５mlの乾燥ピリジンに溶解し、１０ml容の滴下ロ ートに移した。チオバルビツレート溶液を５分間ゆっくりと添加し、反応混合物 を５時間撹拌した。約２０mlの水を混合物へ添加し、黄色の固体を溶液から沈澱 させた。固体を濾過し、乾燥させて５７５mg（１．５ミリモル、８９％）得た。 微量の不純物（オキソノールを含む）をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ ー（３×１５cm）にかけてEtOAc／ヘキサン（１：１）で溶出して除去した。カ ラム上に物質がいくらか析出した。乾燥後、３９０mgの純粋な生成物を回収した （１ミリモル、５９％）。1H NMR(CDCl3/MeOH)：d 8.10(d,J=3.0Hz,1H)，8.04(s ,1H)，7.3-7.5(cm,3H)，7.1-7.25(cm,3H)，4.40(cm,4H,NCH2R)，1.65(cm,4H,NCH2 CH2R)，1.36(cm,4H,NCH2CH2CH2CH3)，0.90(t,J=7.3Hz,6H,メチル)１−(１，３−ジブチルチオバルビツレート)−３−(１−ブチル，３−(５−ヒド ロキシペンチル)チオバルビツレート)トリメチンオキソノールトリエチルアンモ ニウム塩（１１） 化合物（７）（８５mg、２９７マイクロモル）を１．２mlの乾燥ピリジン中で （１０）（１１４mg、２９７マイクロモル）と混合し、１７時間撹拌した。ＴＬ ＣEtOAc/MeOHより、３種の主なオキソノールが生成した。濃塩酸を反応混合物の ８０％まで添加し、固体を溶液から沈澱させた。固体を濾過し、水で洗浄した。 乾燥後、２２０mgの赤色固体を回収した。この固体の９６mgを１〜２mlのEtOAc と混合し、濾過した。残りの固体をCHCl3/MeOH（９５：５）中に溶解し、１９× ２．５cmのシリカゲルカラムへかけた。同一の溶剤で溶出し、大部分非極性のオ キソノールをカラムから溶出させた。溶剤をCHCl3/MeOH/Et3N（９０： ８：２）に変えて中間のバンドを溶出した。このバンドは、NMRより所望の生成 物であることが判明した。濃縮して乾燥させた後、１８．５mg（２８マイクロモ ル、２７％）の純粋な生成物を回収した。1H NMR(CDCl3)：d 8.60(t,J=13.9Hz,1 H,中心のメチン)，8.14(dd,J1=13.8Hz,J2=2.2Hz,2H,メチン)，4.45(cm,8H,NCH2R )，3.66(t,J=6.3Hz,2H,RCH2OH)，3.20(q,J=7.3Hz,6H,トリエチルアンモニウム) ，1.5-1.8(cm,8H,NCH2CH2R)，1.2-1.5(cm,10H,嵩高なメチレン)，1.35(t,J=7.3H z,9H,トリエチルアンモニウム)，0.95(t，J=7.2Hz,9H,末端のメチル)１−(１，３−ジブチルチオバルビツレート)−３−(１−ブチル−３−(５−トシ ルオキシペンチル)チオバルビツレート)トリメチンオキソノール（１２） ４mlのピリジン中で、（１１）（８６．１mg、１３１マイクロモル）を塩化ト シル（３３３mg、１．７５ミリモル）と混合した。反応混合物を３．５時間撹拌 し、溶剤を真空下で除去した。残渣をEtOAc中に溶解し、１MのHClで洗浄し、次 いで飽和塩類溶液で２回洗浄した。ＴＬＣEtOAc/MeOH（９：１）より、出発原料 の大部分がより非極性の化合物へと変換されたことが判明した。しかしながら、 極性のオキソノール不純物が含まれていることは確かであり、物質をフラッシュ クロマトグラフィーにてさらに精製しなければならなかった。カラムにCHCl3/Me OH（９７：３）を充填した。生成物を溶出させるためには、極性をCHCl3/MeOH（ ９２：８）まで上げる必要があった。所望の生成物を含むフラクションを合わせ て乾燥させ、７４．８mg（１０２マイクロモル、７８％）の生成物を得た。1H N MR(CDCl3)：d 8.50(t,1H,中央のメチン)，7.92(dd,J1=14Hz,J2=2Hz,2H,メチン) ，7.81(d,2H,トシル)，7.35(d,J=8.2Hz,2H,トシル)，4.37(cm,8H,NCH2R)，4.09( br t,2H,RCH2OTs)，2.45(s,3H,トシルメチル)，1.2-1.9(unres．cm，嵩高なメチ レン)，0.91(t,J=7.2Hz,9H,末端のメチル)実施例IX−１個の負電荷を有する蛍光ランタニドキレートの合成 テルビウム(III)ビス−(Ｎ，Ｎ’−ビス(サリチリデン)エチレンジアミン)ピペ リジニウム塩、Hpip+Tb(SALEN)2 - Ｎ，Ｎ’−ビス(サリチリデン)エチレンジアミン(SALEN)（０．７１９ｇ、２ ． ６８ミリモル）を４０mlのMeOHに６０℃で溶解した。１mlの水に溶解した塩化テ ルビウム六水和物（０．５ｇ、１．３４ミリモル）を溶液に添加した。ピペリジ ン（５３６μl、５．４２ミリモル）を添加したところ、直後に黄色の沈澱が生 成した。１時間後、熱をとり、反応混合物を一晩撹拌した。固体を濾過し、乾燥 させて７０９mg（０．９１ミリモル、６８％）の所望の錯体を得た。電子スプレ ー（陰イオン）MS[MeOH/H2O:95/5]（ピーク、相対強度）691.2(M-1,100)理論値M-1 =691.5amuユウロピウム(III)ビス−(Ｎ，Ｎ’−ビス(サリチリデン)エチレンジアミン)ピ ペリジニウム、Hpip+Eu(SALEN)2 - Ｎ，Ｎ’−ビス(サリチリデン)エチレンジアミン(SALEN)（０．３６０ｇ、１ ．３４ミリモル）を４０mlのMeOHとピペリジン（２９８μl、３．０２ミリモル ）に６０℃で溶解した。０．５mlの水に溶解した塩化ユウロピウム六水和物（０ ．２４６ｇ、０．６７ミリモル）を溶液に添加したところ、直後に黄色の沈澱が 溶液から析出した。１時間後、熱をとり、反応混合物を２時間放置した。固体を 濾過し、乾燥させて３４１mg（０．４４ミリモル、６６％）の所望の錯体を得た 。 以上、理解を明確にする目的で、実施例を挙げて発明をいくぶん詳細に記載し てきた。当業者であれば、添付の請求の範囲内で変更や改良を行うことができる のは明らかであろう。従って、上記の記載が例示を目的とするものであって、限 定を目的とするものではないことを理解されたい。従って、本発明の範囲は上記 の記載により定まるものではなく、以下に添付する請求の範囲と、このような請 求の範囲を与える均等物の範囲を全て含めて定めるべきものである。 本出願に引用された特許、特許出願及び文献の全ては、別々に記載されていて も、その記載内容の全てが本明細書に含まれるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｄ 213/74 Ｃ０７Ｄ 213/74 215/22 215/22 215/48 215/48 215/50 215/50 215/54 215/54 Ｃ０７Ｆ 5/00 Ｃ０７Ｆ 5/00 Ｄ 5/02 5/02 Ａ Ｄ Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．膜にかかる電気電位を測定する方法であって、 (a)膜電位の変化に応答して膜の第一表面から第二表面へ再分配しうる疎水 性蛍光イオンを含む第一試薬を導入し、 (b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンへ供与するか、または(ii)励起状 態のエネルギーを蛍光イオンより受容することによりエネルギー伝達を経験しう る発色団を含み、膜の第一表面または第二表面を標識する第二試薬を導入し、 (c)膜に励起光を当て、 (d)蛍光イオンと第二試薬との間のエネルギー伝達を測定し、 (e)エネルギー伝達を膜電位と関連づける ことを含む前記方法。 ２．蛍光イオンと第二試薬の間のエネルギー伝達が蛍光共鳴エネルギー伝達(FRE T)によるものである請求項１記載の方法。 ３．膜が生物細胞の形質膜である請求項１記載の方法。 ４．細胞が哺乳類細胞である請求項３記載の方法。 ５．膜が細胞内小器官のものである請求項４記載の方法。 ６．細胞を、Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠星状芽細胞腫細 胞及び新生児心筋細胞よりなる群から選択する請求項４記載の方法。 ７．膜がリン脂質二重層を含む請求項１記載の方法。 ８．イオンがアニオンである請求項１記載の方法。 ９．アニオンが１個の電荷を有する請求項８記載の方法。 10．アニオンを、ポリメチンオキソノール、テトラアリールボレート及び遷移金 属の錯体よりなる群から選択する請求項８記載の方法。 11．アニオンが式 （式中、Ｒは独立にＨ、ヒドロカルビル及びヘテロアルキルよりなる群から 選ばれ、Ｘは酸素または硫黄であり、ｎは１〜３の整数である） のオキソノール及びその塩である請求項１０記載の方法。 12．Ｘが硫黄である請求項１１記載の方法。 13．各Ｒが同一であり、Ｃ1-10アルキル基から選ばれるヒドロカルビル基であり 、ｎ＝２である請求項１１記載の方法。 14．アニオンが式 [(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2−Ｙ−ＦＬＵ]- （式中、Ａｒ1はアリール基であり、Ａｒ2はアリーレン基であり、Ｂはホウ 素であり、Ｙは酸素または硫黄であり、ＦＬＵは中性発蛍光団である） のテトラアリールボレート及びその誘導体である請求項１０記載の方法。 15．Ａｒ1がトリフルオロメチルフェニルであり、Ａｒ2がテトラフルオロフェニ ルであり、Ｙが酸素である請求項１４記載の方法。 16．中性発蛍光を、ビマン、ジフルオロボラジアザインダセン及びクマリンより なる群から選択する請求項１４記載の方法。 17．中性蛍光団が式 （式中、各Ｒ5は同一または異なっていてもよく、独立にＨ、低級アルキル またはアルキレン連結点である） のビマンである請求項１６記載の方法。 18．中性発蛍光団が式 （式中、各Ｒ1は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル、アリ ール、ヘテロ芳香族、アラルケニル及びアルキレン連結点よりなる群から独立に 選ばれ、各Ｒ2は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル、フェニル 及びアルキレン連結点よりなる群から独立に選ばれる） のジフルオロボラジアザインダセンである請求項１６記載の方法。 19．中性発蛍光団が式 （式中、各Ｒ3は同一または異なっていてもよく、Ｈ、ハロゲン、低級アル キル、ＣＮ、ＣＦ3及びＯＲ5よりなる群から独立に選ばれ、Ｒ4は同一または異 なっていてもよく、Ｈ、ＯＲ5及びアルキレン連結点よりなる群から選ばれ、Ｚ はＯ、ＳまたはＮＲ”であり、Ｒ5はＨ、低級アルキル及びアルキレン連結点よ りなる群から選ばれる） のクマリンである請求項１６記載の方法。 20．中性発蛍光団が式 （式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８ アルキル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキルで あり、Ｘ及びＹは独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級(Ｃ１〜 Ｃ４)アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈであるか、あ るいはＸ及びＹは一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ＝アルキレンジイル、 ヘテロアルキレンジイルまたはヘテロシクロジイルである） の遷移金属の錯体である請求項１６記載の方法。 21．Ｚ＝１，２−エタンジイル、１，３−プロパンジイル、２，３−ブタンジイ ル、１，２−シクロヘキサンジイル、１，２−シクロペンタンジイル、１，２− シクロヘプタンジイル、１，２−フェニレンジイル、３−オキサ−１，５−ペン タンジイル、３−アザ−３−(低級アルキル)−１，５−ペンタンジイル、ピリジ ン−２，６−ビス(メチレン)またはテトラヒドロフラン−２，５−ビス(メチレ ン)である請求項２０記載の方法。 22．中性発蛍光団が式 （式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８ アルキル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキ ルであり、Ｘ'及びＹ'は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級( Ｃ１〜Ｃ４)アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈである か、あるいはＸ'及びＹ'は一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ’は独立に原 子価結合、ＣＲ2、ピリジン−２−６−ジイルまたはテトラヒドロフラン−２， ５−ジイルである） の遷移金属の錯体である請求項１６記載の方法。 23．第二試薬が発蛍光団である請求項１記載の方法。 24．第二試薬を、レクチン、脂質、炭水化物、チトクロム及び抗体（各々、発蛍 光団で標識されている）よりなる群から選択する請求項２３記載の方法。 25．発蛍光団を、キサンテン、シアニン及びクマリンよりなる群から選択する請 求項２４記載の方法。 26．第二試薬が脂質であり、リン脂質である請求項２４記載の方法。 27．第一試薬と第二試薬がリンカーにより共有結合している請求項１記載の方法 。 28．リンカーが式 Ｘ−(ＣＨ2)m−Ｚq−(ＣＨ2)m'−Ｚ'q'−(ＣＨ2)m"−Ｚ"q"−Ｙ （式中、Ｘはポリメチンオキソノール及び蛍光テトラアリールボレートより なる群から選ばれる疎水性蛍光アニオンであり、Ｙはレクチン及びリン脂質より なる群から選ばれる蛍光第二試薬であり、Ｚ、Ｚ'、Ｚ"は独立にＯ、Ｓ、ＳＳ、 ＣＯ、ＣＯＯであり、ｍ、ｍ'及びｍ"は０〜約３２の整数であり、ｑ、ｑ'及び ｑ"は独立に０または１であり、ｍ＋ｑ＋ｍ'＋ｑ'＋ｍ"＋ｑ"は約２０〜４０で ある） の化合物である請求項２７記載の方法。 29．リンカーがチオエーテルである請求項２８記載の方法。 30．(a)膜電位の変化に応答して膜の第一表面から第二表面へ再分配しうる疎水 性蛍光イオンを含む第一試薬、及び (b)(i)励起状態のエネルギーを蛍光イオンへ供与するか、または(ii)励起状 態のエネルギーを蛍光イオンより受容することによりエネルギー伝達を経験しう る発色団を含み、膜の第一表面または第二表面を標識する第二試薬を含むキット 。 31．第一試薬をポリメチンオキソノール、テトラアリールボレート及び遷移金属 の錯体よりなる群から選択し、第二試薬をレクチン、脂質、炭水化物、チトクロ ム及び抗体（各々、発蛍光団で標識されている）よりなる群から選択する請求項 ３０記載のキット。 32．可溶化剤をさらに含む請求項３０記載のキット。 33．式Ａ−Ｌ−Ｂの化合物（式中、Ａは独立にポリメチンオキソノールまたは発 蛍光団に結合したテトラアリールボレートであり、Ｌはリンカーであり、Ｂは膜 不透過性発蛍光団または発蛍光団の膜不透過性複合体である）。 34．Ａが式 （式中、Ｒは独立にＨ、ヒドロカルビル及びヘテロアルキルよりなる群から 選ばれ、Ｘは酸素または硫黄であり、ｎは１〜３の整数である。但し、Ｒの少な くとも一つはアルキレン基である） のポリメチンオキソノールである請求項３３記載の化合物。 35．式Cou-PEの化合物（式中、Couは式 （式中、各Ｒ3は同一または異なっていてもよく、Ｈ、ハロゲン、低級アル キル，ＣＮ、ＣＦ3、ＣＯＯＲ5、ＣＯＮ(Ｒ5)2、ＯＲ5、及び連結点よりなる群 から独立に選ばれ、Ｒ4はＯＲ5及びＮ(Ｒ5)2よりなる群から選ばれ、ＺはＯ、Ｓ またはＮＲ5であり、各Ｒ5は同一または異なっていてもよく、Ｈ、低級アルキル 及びアルキレン連結点よりなる群から独立に選ばれる）のクマリンであり、PEは Ｎ−結合ホスファチジルエタノールアミンである）。 36．式 (式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８ アルキル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキルで あり、Ｘ及びＹは独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級(Ｃ１〜 Ｃ４)アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈであるか、あ るいはＸ及びＹは一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ＝アルキレンジイル、 ヘテロアルキレンジイルまたはヘテロシクロジイルである)の化合物。 37．Ｚ＝１，２−エタンジイル、１，３−プロパンジイル、２，３−ブタンジイ ル、１，２−シクロヘキサンジイル、１，２−シクロペンタンジイル、１，２− シクロヘプタンジイル、１，２−フェニレンジイル、３−オキサ−１，５−ペン タンジイル、３−アザ−３−(低級アルキル)−１，５−ペンタンジイル、ピリジ ン−２，６−ビス(メチレン)またはテトラヒドロフラン−２，５−ビス(メチレ ン)である請求項３６記載の化合物。 38．式 （式中、Ｌｎ＝Ｔｂ、Ｅｕ、またはＳｍであり、Ｒは独立にＨ、Ｃ１〜Ｃ８ アルキル、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキルまたはＣ１〜Ｃ４パーフルオロアルキルで あり、Ｘ'及びＹ'は独立にＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＦ3、低級(Ｃ１ 〜Ｃ４)アルキル、ＣＮ、Ｐｈ、Ｏ−(低級アルキル)、またはＯＰｈであるか、 あるいはＸ'及びＹ'は一緒になって−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｚ’は独立に原子価 結合、ＣＲ2、ピリジン−２−６−ジイルまたはテトラヒドロフラン−２，５− ジイルである）の化合物。 39．式 （式中、Ｘは酸素または硫黄であり、ＲはＣ4-12ヒドロカルビルであり、ｎ は１〜３の整数である。但し、ｎが１の場合、ＲはＣ7-12ヒドロカルビルである ） のポリメチンオキソノール及びその塩。 40．式 （式中、PEはＮ−結合ホスファチジルエタノールアミンである）の化合物。 41．細胞の膜電位に作用する試験サンプルを同定する方法であって、 (a)第一試薬及び第二試薬（これらは共に、請求項１に記載の方法により膜 電位を測定するものである）を細胞にロードし、 (b)膜を試験サンプルに暴露し、 (c)膜の電位を測定し、 (d)(c)の電位を試験サンプルの不存在下での電位と比較し、試験サンプルの 膜電位に及ぼす効果を求める ことを含む前記方法。 42．(e)イオンチャネル、ポンプまたは交換体の活性を調節する刺激物質に膜を 暴露し、 (f)膜電位を測定し、 (g)試験サンプルの存在下での膜電位を再度測定し、 (h)(f)の膜電位をと(g)の膜電位を比較し、刺激物質に対する試験サンプル の効果を求める ことをさらに含む請求項４１記載の方法。 43．細胞が哺乳類細胞である請求項４１または４２記載の方法。 44．膜中のイオンチャネル、ポンプまたは交換体の活性を調節する化合物を同定 するために試験サンプルをスクリーニングする方法であって、 (a)第一試薬及び第二試薬（これらは共に、請求項１記載の方法により膜電 位を測定するものである）を細胞の第一群及び第二群にロードし、 (b)任意に、細胞の第一群と第二群の両方をイオンチャネル、ポンプまた は交換体を調節する刺激物質に暴露し、 (c)細胞の第一群を試験サンプルに暴露し、 (d)細胞の第一群及び第二群の膜電位を測定し、 (e)細胞の第一群と第二群の間の膜電位の差を、試験サンプル中に含まれる 化合物の膜中のイオンチャネル、ポンプまたは交換体の活性を調節する能力に関 連づける ことを含む前記方法。 45．式 [(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2−Ｙ−ＦＬＵ]- （式中、Ａｒ1はアリール基であり、Ａｒ2はアリーレン基であり、Ｂはホウ 素であり、Ｙは酸素または硫黄であり、ＦＬＵは中性発蛍光団である） の蛍光テトラアリールボレートを合成する方法であって、 (a)トリアリールボラン(Ａｒ1)3Ｂを式（Ｐ−Ｙ−Ａｒ2）−Ｍ（式中、Ｐは 保護基であり、Ｍは金属である）の有機金属試薬で処理して保護テトラアリール ボレート(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2−Ｙ−Ｐを形成し、 (b)保護テトラアリールボレートから保護基を除去して(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2− ＹＨを形成し、 (c)(Ａｒ1)3Ｂ−Ａｒ2−ＹＨを、脱離基を有する発蛍光団ＦＬＵで処理して 蛍光テトラアリールボレートを形成する ことを含む前記方法。 46．式 （式中、各Ｒ'は独立にＨ、ヒドロカルビル、ハロゲン、ＣＦ3たはリンカー 基であり、ｎは０〜５の整数であり、各Ｘは独立にＨ、ハロゲンまたはＣＦ3で あり、ｍは０〜４の整数であり、Ｙは酸素または硫黄であり、ＦＬＵはキサンテ ン、クマリン、シアニン、ビマン及びジフルオロボラジアザインダセンよりなる 群から選ばれる中性発蛍光団である）の化合物。
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