ES2060803T5 - Soporte biologico para cultivos celulares constituido por proteinas plasmaticas coaguladas por trombina, su utilizacion para el cultivo de los queratinocitos, su recuperacion y su transporte con fines de utilizacion terapeutica. - Google Patents
Soporte biologico para cultivos celulares constituido por proteinas plasmaticas coaguladas por trombina, su utilizacion para el cultivo de los queratinocitos, su recuperacion y su transporte con fines de utilizacion terapeutica.Info
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Abstract
SOPORTE BIOLOGICO PARA CULTIVOS CELULARES CONSTITUIDO POR LA MEZCLA COAGULADA DE UN CONCENTRADO DE PROTEINAS PLASMATICAS Y TROMBINA. EL CONCENTRADO DE PROTEINAS SE OBTIENE POR PRECIPITACION DE PLASMA FRESCO EN ETANOL, Y CONTIENE PROPORCIONES EQUILIBRADAS DE FIBRINOGENO, FACTOR XIII Y FIBRONECTINA. LA CONCENTRACION EN TROMBINA SE AJUSTA PARA CONSEGUIR LA CONSISTENCIA DESEADA DEL SOPORTE COAGULADO BAJO FORMA DE PELICULA. EL SOPORTE BIOLOGICO SE UTILIZA PREFERIBLEMENTE PARA EL CULTIVO DE QUERATINOCITOS, SU RECUPERACION BAJO FORMA DE TEJIDO RECONSTITUIDO Y EL TRANSPORTE DE ESTE. EL TEJIDO RECONSTITUIDO SE ADAPTA ASI ESPECIALMENTE PARA EL USO COMO INJERTO.
Description
Soporte biológico para cultivos celulares
constituido por proteínas plasmáticas coaguladas por trombina, su
utilización para el cultivo de los queratinocitos, su recuperación
y su transporte con fines de utilización terapéutica.
La presente invención se refiere a la utilización
para el cultivo de queratinocitos y su transporte en forma de
epidermis reconstituidos de un soporte biológico para cultivos
celulares, constituido por la mezcla coagulada de un concentrado de
proteínas plasmáticas y de trombina y a la utilización de éstas
epidermis reconstituidas con fines terapéuticos.
La reconstrucción en laboratorio de una piel viva
semejante a la piel humana a partir de células de una biopsia o de
una piel simplificada que asegura las funciones fisiológicas de la
piel normal constituye el objeto de numerosos estudios con objeto
de reemplazar la piel lesionada por una afección grave (genética
...) o destruida por quemaduras importantes.
La piel es un órgano complejo compuesto de tres
tejidos yuxtapuestos: la epidermis, constituida por 85% de
queratinocitos que elaboran la capa córnea impermeable que aísla el
cuerpo del medio exterior; la dermis que comprende células, entre
ellas los fibrocitos, separados por un tejido conjuntivo
constituido sobre todo por colágeno; la dermis reposa sobre la
hipodermis que comprende las células especializadas en el
almacenamiento de las grasas. La reconstrucción artificial de un
órgano tan complejo presenta por consiguiente numerosos
problemas.
El primer tejido que ha sido reconstruido
parcialmente in vitro es la dermis, por el equipo de Bell
(Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 - 1979 - 1274). A partir de
biopsias de piel, los fibroblastos han podido ser puestos en
cultivo, en primer lugar en monocapas y luego, después de varias
pasadas, dispersando estas células en un medio de cultivo que
contiene colágeno (extraído de tendones de rabos de ratas),
constituyendo éste un gel y permitiendo un cultivo tridimensional.
En este cultivo se ve que los fibroblastos interaccionan con la
matriz del colágeno, la organizan y la contraen como en una dermis
normal. Este tejido reconstruido in vitro se conoce con el
nombre de "dermis equivalente". Al cabo de varias semanas de
cultivo, las cualidades mecánicas de la dermis equivalente permiten
utilizarla como injerto para un enfermo o un herido. La misma no
parece ser rechazada por el receptor. Sin embargo, esta dermis
equivalente no es más que un apósito provisional: la misma no puede
restaurar la función de barrera cutánea.
Por otra parte, el equipo de Green (H. Green et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 1979, 5665) ha puesto a punto un
método y un medio de cultivo que permiten cultivar de manera
prolongada queratinocitos. Este método comprende la inoculación de
los queratinocitos dispersados en tripsina sobre una monocapa
preestablecida de fibroblastos, en particular células 3T3,
irradiadas letalmente y que sirven como capa nutricia y matriz. La
lámina epidérmica se desarrolla muy rápidamente para formar un
tejido de 3 a 5 células de espesor; la misma podrá ser injertada a
un paciente y continuar diferenciándose in situ. Grandes
quemaduras han podido ser ya salvadas por esta técnica (G. Gallico
et al. New. England J. Med. 311, 1984, 448).
Por la técnica de Green se puede obtener, a
partir de una biopsia de dos centímetros cuadrados, una epidermis
de un metro cuadrado al cabo de tres semanas.
La recuperación del tejido reconstituido para
hacer un injerto del mismo plantea todavía problemas técnicos. En
efecto, es necesario desprender las células de la caja de cultivo,
por un tratamiento enzimático, sin que se disocien entre sí; en el
curso de esta operación se observa siempre una retracción del tapiz
celular y por tanto una pérdida de cierto porcentaje de la
superficie del injerto. Una vez desprendido el tejido reconstituido,
es necesario fijarlo a un soporte que permita su transporte y su
injerto al paciente. Se utiliza generalmente un apósito de gasa
impregnada con vaselina. Este conjunto de manipulaciones es
delicado y requiere mucho tiempo.
Sería por consiguiente muy ventajoso disponer de
nuevos soportes biológicos, reabsorbibles en el curso del tiempo
por el paciente injertado y que simplifiquen la manipulación de las
células. Además, para garantizar la disponibilidad de los mismos,
estos soportes con sus constituyentes deberían ser susceptibles de
ser preparados y acondicionados según procedimientos
industriales.
La solicitante ha puesto así a punto un soporte
biológico para cultivos celulares, constituido por la mezcla de un
concentrado de proteínas plasmáticas coagulables por la trombina y
la cantidad de trombina cálcica necesaria para desencadenar la
coagulación.
La coagulación de las proteínas del plasma en
presencia de trombina, es debida principalmente a la formación de
una red de fibrina polimerizada, que imita la formación del coágulo
sanguíneo. Para constituir un soporte adaptado para el cultivo de
las células, la coagulación se realiza en condiciones que favorecen
la formación de una película y más particularmente en cápsulas de
Petri o en cualquier frasco adaptado para el cultivo de células.
El concentrado de proteínas plasmáticas ha sido
ya descrito por la solicitante en la solicitud de patente europea
88.401 961.3: el mismo se obtiene por precipitación de plasma
reciente, por dos tratamientos sucesivos con etanol al 10%, a 4ºC.
El concentrado comprende más de 90% de fibrinógeno, y, por gramo de
proteínas, al menos 0,1 UI de Factor XIII y de 0,03 a 0,1 gramos de
fibronectina. El concentrado se acondiciona y liofiliza para ser
conservado hasta su utilización.
La presente invención concierne, por lo tanto, a
la utilización de una película compatible con la multiplicación de
células de tipo queratinocitos humanos, y que se obtienen:
por el acondicionado separado y el liofilizado de
cada uno de los dos componentes
a) un concentrado de proteínas coagulabes con
trombina, obtenido por tratamiento con etanol de plasma humano, y
que contiene proporciones equilibradas de fibrinógeno y,
preferentemente, mas de un 90% de factor XIII, y preferentemente,
al menos, 0/1 Ul/g, y de fibronectina y, preferentemente desde 0,03
hasta 0,1 g/g,
b) la cantidad de trombina cálcica necesaria
para iniciar la coagulación la simple redisolución acuosa de los dos
componentes a) y b) su mezclado sobre una caja de tipo cápsula de
Petri y por ajuste de la presión osmótica de dicha película a una
presión fisiológica comprendida entre 260 y 340 mosM,
preferentemente con medio de cultivo para células, para constituir
por cultivo, empleándose dicha película como soporte biológico de
queratinocitos humanos, un tejido de substitución, directamente
recuperable, transportable y aplicable como injerto.
En el momento de su utilización, el concentrado
de proteínas coagulables con la trombina se redisuelve en una
solución acuosa salina o en una solución que contiene un inhibidor
polivalente de las proteasas, preferiblemente la aprotinina, en una
concentración de 3000 UIK/ml.
Para desencadenar el proceso de coagulación y por
consiguiente la formación de la película que sirve de soporte para
las células, se añade trombina con o sin calcio. El proceso
comprende la transformación de fibrinógeno en fibrina bajo la
acción de la trombina y la polimerización de la fibrina monómera
con la fibronectina bajo la acción del Factor XIII activado por los
iones Ca^{++}.
Para constituir el soporte según la invención,
particularmente favorable para los cultivos celulares, se ajusta
con preferencia la concentración de trombina a aproximadamente 10
UI/ml (concentración mucho menor que la que se utiliza cuando la
consistencia buscada es diferente, como en el caso de las colas
biológicas - Patente 88:401 961.3, citada anteriormente).
Según modos diferentes de realización de la
invención, se pueden incorporar en el soporte diversos aditivos
destinados particularmente a favorecer la multiplicación celular
in vitro o in situ y favorecer así la cicatrización
de la herida después del injerto.
El soporte puede contener por tanto un aditivo
que favorezca la multiplicación de las células como un factor de
crecimiento y más particularmente el EGF ("epidermal growth
factor").
Se puede incorporar también un agente
cicatrizante y/o un antibiótico.
El soporte según la invención es particularmente
favorable para el cultivo de los queratinocitos humanos. Estas
células pueden ser, o bien cultivos primarios derivados de biopsias
de piel de un paciente y que han sufrido entre 1 y 4 pasadas en
dilución 1/15 a 1/20, o bien células conservadas en forma de banco
en nitrógeno líquido.
Estos queratinocitos establecidos en tapiz
confluente se tripsinizan y se ponen de nuevo en suspensión en un
medio de cultivo apropiado en el momento de su siembra sobre el
soporte de acuerdo con la invención.
La utilización del soporte biológico según la
invención se puede adaptar de tres maneras diferentes.
Según un primer modo de utilización, el soporte
biológico se prepara en forma de película, por la mezcla de sus dos
constituyentes en una caja de cultivo; se siembra una suspensión de
queratinocitos sobre esta película, en medio de cultivo apropiado.
Cuando el cultivo de queratinocitos ha llegado a ser confluente o
semiconfluente, el mismo constituye un tejido de reemplazamiento
directamente recuperable como injerto, que se puede desprender con
ayuda de pinzas y transportar desde la cámara al paciente al que se
aplica como tal, sin necesitar un soporte transitorio tal como la
gasa. Esto permite un importante ahorro de tiempo operatorio y una
recuperación del 100% del tejido en cultivo.
Según otro modo de utilización del soporte de
acuerdo con la invención, los dos constituyentes del soporte se
mezclan con la suspensión de queratinocitos a fin de integrar las
células en la película que se formará ulteriormente. Según este
modo de utilización, la mezcla de los dos constituyentes con la
suspensión de células se puede realizar en una caja de cultivo y
utilizarse a continuación como injerto, como en el modo de
utilización precedente; dicha mezcla puede realizarse también
directamente sobre la herida del paciente, preparada para recibir
un injerto, particularmente en pulverización del soporte biológico
y de las células con ayuda de un gas vector (nitrógeno) a una
presión de 2 a 2,5 bares.
Según otro modo de utilización del soporte de
acuerdo con la invención, la mezcla de sus dos constituyentes se
realiza sobre un tapiz celular de queratinocitos preestablecido en
una caja de cultivo, de tal manera que las células se depositen
como revestimiento en la película formada y puedan ser de este modo
desprendidas y transportadas para su aplicación como injerto.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin
limitar, no obstante, el alcance de la misma.
Se prepara un soporte biológico para cultivos
celulares mezclando un concentrado de proteínas plasmáticas
coagulables y la cantidad de trombina cálcica necesaria para
desencadenar la coagulación.
La preparación del concentrado de proteínas ha
sido ya descrita por la solicitante en la solicitud de patente
europea 88.401 961.3. En resumen, se utiliza plasma humano no
crioprecipitado; se somete el mismo a dos precipitaciones sucesivas
con etanol al 10%, a pH 7,2 y a 4ºC. Entre las dos precipitaciones,
el producto sufre un tratamiento de inactivación vírica. El
precipitado, separado del sobrenadante por centrifugación, se lava
con etanol a 4ºC y se centrifuga de nuevo. El precipitado se pone
de nuevo en suspensión en tampón Tris/citrato, se ajusta a una
concentración de proteínas de aproximadamente 35 g/l y se le añade
lisina a una concentración final de 0,1 a 0,2 g por gramo de
proteínas. Después de diafiltración para eliminar el alcohol y el
citrato y para ajustar la fuerza iónica, el concentrado se
acondiciona en frascos y se liofiliza.
Este concentrado de proteínas contiene, para un
gramo de proteínas, al menos 0,9 g de fibrinógeno, de 0,03 a 0,06 g
de fibronectina y de 0,15 a 0,30 UI de Factor XIII.
El concentrado de proteínas descrito
anteriormente se pone de nuevo en suspensión en una solución
acuosa, con o sin aprotinina a 3000 UIK/ml (unidades de inhibidor
de calicreína/ml).
Se mezcla esta solución con un volumen igual de
trombina cálcica a 10 UI/ml. Para una cápsula de Petri de 10 cm de
diámetro se utilizan 2 ml de suspensión de proteínas y 2 ml de
trombina, inyectándose estas dos soluciones simultáneamente
mediante dos jeringuillas unidas por una boquilla mezcladora. Se
agita la cápsula de Petri a fin de obtener un reparto uniforme y se
deja luego en reposo durante 15 a 20 minutos. La preparación forma
una película que recubre la caja.
Las cajas de cultivo son de calidad "no tratada
para cultivo celular" lo que permite al soporte no adherirse de
manera permanente, lo cual facilita su recuperación ulterior.
Esta película se recubre a continuación con medio
de cultivo para células. Este medio se renueva varias veces hasta
que la presión osmótica de la película se estabilice en una gama
compatible con la fisiología de la célula, es decir entre 260 y 340
mosM (miliosmoles).
Alternativamente, se puede dializar el
concentrado de proteínas reconstituido antes de mezclarlo con la
trombina.
Se utilizan cultivos primarios de queratinocitos
realizados según la técnica clásica de Green a partir de
biopsia(s) de piel de un paciente (o de piel de un embrión
para constituir bancos de células fetales). Estos cultivos
primarios pueden sufrir cuatro a cinco pasadas en dilución 1/10.
Un tapiz de queratinocitos confluentes se
tripsiniza, se pone de nuevo en suspensión en medio de cultivo y se
siembra en dilución 1/10 sobre una cápsula de Petri recubierta de
una película del soporte biológico descrito en el ejemplo 1.
Al cabo de varias horas, las células se adhieren
al soporte; las mismas se multiplican en él a continuación
normalmente hasta formar un fragmento de epidermis confluente y que
tiene un espesor de 3 ó 4 capas de células.
Este fragmento de epidermis reconstituida,
adherente al soporte, puede desprenderse de la caja de cultivo con
ayuda de pinzas y aplicarse como tal sobre una herida preparada
para recibir un injerto.
Gracias a la adherencia de las células al
soporte, no es necesario fijar la epidermis reconstituida sobre
otro soporte tal como la gasa impregnada con vaselina que debe ser
utilizada con los otros tipos de cultivos. Esto permite un
importante ahorro de tiempo operatorio: se llegan a manipular 40
cajas por hora en lugar de 4 por las técnicas clásicas.
Además, este soporte resiste satisfactoriamente
las manipulaciones y no se contrae en el momento en el que se
desprende, lo cual permite recuperar el 100% de la superficie del
tapiz celular en cultivo.
Se ponen en cultivo queratinocitos según el
método clásico de Green, en una cápsula de Petri cubierta con una
capa de fibroblastos irradiados letalmente.
Cuando el tapiz de queratinocitos es confluente y
está constituido por varias capas de células, se elimina el medio
de cultivo, se añade una solución de EDTA durante una hora y media,
y se efectúan luego dos lavados en PBS. Se vierte a continuación el
soporte biológico directamente sobre el tapiz de células, según el
método descrito en el ejemplo 2.
Cuando la película está formada sobre las
células, la misma puede desprenderse con pinzas y utilizarse como
injerto, como en el ejemplo anterior.
Se prepara una jeringuilla de solución de
proteínas y una jeringuilla de trombina que contiene los
queratinocitos en suspensión. Estos queratinocitos puede provenir
de un cultivo reciente, tripsinizado, o de un banco de células
conservadas en nitrógeno líquido.
Las dos jeringuillas se unen con ayuda de una
boquilla mezcladora y se pulveriza el soporte que contiene las
células sobre la cápsula de Petri (o sobre la herida a injertar);
las células se encuentran así retenidas en la película durante su
coagulación. Esta pulverización se puede hacer con ayuda de un gas
vector (el nitrógeno a una presión de 2 a 2,5 bares).
Esta pulverización no desnaturaliza las células y
se observa la reformación de un tapiz celular, en cultivo in
vitro. Las células deberían multiplicarse por tanto normalmente
o cuasi normalmente cuando la mezcla se pulveriza, en capa muy
fina, directamente sobre una herida.
Claims (11)
1. Utilización de una película, compatible con la
multiplicación de células de tipo queratinocitos humanos, y que se
obtiene:
por el acondicionado separado y el liofilizado de
cada uno de los dos componentes
a) un concentrado de proteínas coagulabes con
trombina, obtenido por tratamiento con etanol de plasma humano, y
que contiene proporciones equilibradas de fibrinógeno y,
preferentemente, mas de un 90% de factor XIII, y preferentemente,
al menos, 0/1 Ul/g, y de fibronectina y, preferentemente desde 0,03
hasta 0,1 g/g,
b) la cantidad de trombina cálcica necesaria
para iniciar la coagulación
- -
- la simple redisolución acuosa de los dos componentes a) y b)
- -
- su mezclado sobre una caja de tipo cápsula de Petri
- -
- y por ajuste de la presión osmótica de dicha película a una presión fisiológica comprendida entre 260 y 340 mosM, preferentemente con medio de cultivo para células, para constituir por cultivo, empleándose dicha película como soporte biológico de queratinocitos humanos, un tejido de substitución, directamente recuperable, transportable y aplicable como injerto.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque la trombina cálcica está mezclada con
el concentrado de proteínas redisuelto, a una dosis de
aproximadamente 10 Ul/ml.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizada porque dicha película contiene, como aditivo,
una substancia que favorece la multiplicación celular.
4. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha película
contiene, como aditivo, un antibiótico.
5. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la película
contiene, como aditivo, una substancia que favorece la
cicatrización de las heridas.
6. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 caracterizada porque la mezcla de los
dos constituyentes del soporte biológico se realiza de tal manera,
que se constituya una película uniforme en una caja de cultivo y
que los queratinocitos en suspensión en el medio de cultivo se
siembran sobre esta película.
7. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque los dos
constituyentes del soporte biológico se mezclan con una suspensión
de queratinocitos con el fin de integrar las células en la película
formada ulteriormente.
8. Utilización según las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizada porque la suspensión de queratinocitos se
realiza después de dispersión de un tapiz celular preestablecido,
reciente.
9. Utilización según las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizada porque la suspensión de queratinocitos se
realiza a partir de un banco de células conservadas en nitrógeno
líquido.
10. Utilización según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para la recuperación y el transporte de un
cultivo preestablecido de queratinocitos humanos.
11. Utilización según la reivindicación 10,
caracterizada porque la mezcla de los dos constituyentes del
soporte biológico se realiza sobre el tapiz celular preestablecido
en una caja de cultivo.
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| FR2639958A1 (fr) | 1990-06-08 |
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