WO2015119491A1

WO2015119491A1 - Proceso de obtencion de un compuesto de aspersion celular de fibroblastos y queratinocitos humanos en solucion y su uso como agente regenerativo de lesiones cutáneas

Info

Publication number: WO2015119491A1
Application number: PCT/MX2015/000001
Authority: WO
Inventors: Eduardo ALVARO GALUE
Original assignee: Alvaro Galue Eduardo
Priority date: 2014-02-04
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2015-08-13
Also published as: EP3103865A1; KR20160132007A; MX342233B; US20160271299A1; MX2014001356A; EP3103865A4; AU2015214649A1; RU2016131784A; HK1232250A1; JP2017509352A; RU2016131784A3; CA2938041A1

Abstract

El objetivo radica en un proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos y su uso como agente regenerativo de lesiones cutáneas, preferentemente de úlceras diabéticas, quemaduras de 1er, 2do y 3er grado, y un sustituto de la técnica de la utilización de colgajos. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos se comprende de las etapas de separación de la dermis y la epidermis, incubación de la capa epidermis, disgregación de la capa de dermis y proliferación de fibroblastos, disgregación de la capa de epidermis, proliferación de los queratinocitos en suspensión, preparación de la solución del agente reticulante de reacción de la solución de aspersión celular, y preparación de la solución de aspersión celular. Dicho compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos aumenta la eficiencia de aplicación y la facilidad de la misma, con el fin de ser una alternativa económica, rápida y de fácil manejo.

Description

PROCESO DE OBTENCION DE UN COMPUESTO DE ASPERSION CELULAR DE FIBROBLASTOS Y QUERATINOCITOS HUÜANOS EN SOLUCION Y SU USO COüO AGENTE RESENERATIV0 DE LESIONES

CUTÁNEAS

DESCRIPCIÓN

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objetivo radica en un proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular da fibroblastos y queratinocitos humanos y su uso como agente regeneratevo de lesiones cutáneas, preferentemente de úlceras diabéticas, quemaduras de 1er, 2do y 3er grado y un sustituto de la técnica de la utilización de colgajos. Dicho compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos aumenta la eficiencia de aplicación y la facilidad de ia misma, con el fin de ser una alternativa económica, rápida y de fácil manejo,

ANTECEDENTES

En ia actualidad el uso de injertos aiogénicos y xéno transplantes limita ia regeneración de la piel debido a procesos inflamatorios que se originan por el rechazo inmunológico que Implica el uso de piel de donantes y el uso de pie) proveniente de animales. Esto origina ¡a la baja disponibilidad de dicho material biológico para eí tratamiento de heridas cutáneas y existe el inconveniente de ia susceptibilidad a infecciones. Actualmente existen panterrtes de técnicas de impresión de células humanas vivas denominadas Bloprinting donde se impriman fibroblastos y queratinocitos sobra heridas cutáneas. Está técnica está basada en depositar mecánicamente por medio de

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HOJA OE SUSTITUÍ» (REGLA 281 un brazo robótico (con libertad de moverse en los 3 ejes dimensionales) células autólogas sobre la herida. Sumando a esto podemos encontrar en el mercado sustitutos dérmicos basados en el cultivo in vitro de queratinocitos humanos sobre matrices de piel decelularizadas de origen bovino. Su uso se basa solo en el incremento en el tiempo de cicatrización de la herida mediante el transplante de esta matriz decelularizada de origen bovino con queratinocitos humanos previamente sembradas sobre su superficie.

Sin embargo, además de utilizarse un producto de origen animal (matriz decelularizada) que no es 100% compatible con el ser humano, el uso y transplante de este producto se basa solo en incrementar el uso de epitelización y regeneración de la herida y omite la regeneración de la funcionalidad de dicha piel para crear nuevamente la pigmentación e inducción de cabello. Sumado a esto, un trauma severo ocasionado a este órgano (piel) puede ocasionar una regeneración parcial o incompleta y un atrofia mediante el uso de estas mallas con queratinocitos y una falta total para la generación de color y cabello. Otro enfoque para la epitalización y regeneración de la herida que se ha desarrollado en laboratorio se basa en el cultivo in vitro de queratinocitos humanos sobre capas de fibroblastos provenientes de embriónes de ratón con alto grado de proliferación. Este sistema creado in vitro presenta desventajas como la baja producción de matriz extracelular del bio injerto creado, un tamaño bidimensional muy limitado en grosor y soporte para cubrir la zona dañada como barrera protectora a la herida, y sobre todo omite también la regeneración de la funcionalidad de la piel durante la cicatrización de la herida. (Pigmentación e inducción de cabello) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, preferentemente fibroblastos y queratinocitos humanos autólogos y/o alogénicos suspendidos en una solución y su uso como agente regenerativo de lesiones cutáneas, el cual comprende de las siguientes etapas:: a) Separación de la dermis y la epidermis.

Obtener una muestra de piel de paciente en condiciones estériles por medio de un dermatoma para obtener una lámina de piel, preferentemente de 0.015 pulgadas. Porteriormente, lavar la muestra de piel al menos 3 veces con una solución salina de fosfatos (PBS) 1X conteniendo 10% v/v de una solución de antibiótico/antimicótico. Después, lavar al menos 3 veces con una solución de PBS 1X conteniendo 1% v/v de antibiótico/antimicótico. Preferentemente, la solución de antibiótico/antimicótico es estreptomicina/penicilina. Después del lavado de la muestra de piel, incubar con una enzima proteolica de disgregación celular, preferentemnete dispasa, a una concentración de 1.79 unidades/mg en condiciones de temperatura de 4°C por al menos 16 horas para obtener una capa de epidermis y una capa de dermis. Al cabo de las 16 horas, separar las dos capas mediante el uso de pinzas estériles y se colocar dichas capas en contenedores estériles e independientes. b) Incubación de la capa epidermis.

Separar y lavar la capa de epidermis en un contenedor independiente al menos 3 veces con la solución PBS 1X e incubar dicha capa de epidermis en una solución de tripsina a una concentración de 0.025% de tripsina en un volumen final de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) por 20 minutos a una temperatura de 37 °C para obtener una epidermis tripsinizada. c) Disgregación de la capa de dermis y proliferación de fibroblastos

Colocar la capa de dermis en un contenedor y disgregar mecánicamente con una herramienta pulso cortante en condiciones estériles para obtener pedazos de dermis como máximo de 1mm x 1mm, e incubar por un periodo de al menos 10 minutos, agregar cuidadosamente 33.33% del volumen del contenedor de un medio de cultivo celular para fibroblastos por las paredes del contenedor y evitar mover los fragmentos de la dermis e incubar a 37 °C, 95% de humedad relativa, 5% C0₂ y 20% O2 por un periodo de para obtener fibroblastos en monocapa. d) Disgregación de la capa de epidermis.

Neutralizar la epidermis tripsinada con 50% de un medio de cultivo de queratinocitos humanos conteniendo Suero bovino fetal al 10% y agitar vigorosamente por al menos 30 segundos para obtener una solución celular. Posteriormente, filtrar la solución celular por un filtro de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 40pm para obtener los queratinocitos humanos en suspensión en el producto filtrado.

e) Proliferación de ios queratinocitos en suspensión.

Sembrar la suspensión de queratinocitos en monocapa en condiciones asépticas en un contenedor con un medio de cultivo celular e incubar a 37 °C, 95% de humedad relativa, 5% C0₂ y 20% 0₂ por un periodo de 2 a 4 semanas bajo condiciones asépticas, y cambiar el medio de cultivo celular cada segundo o tercer día hasta llegar a una confluencia del 100% para queratinocitos para obtener mayor cantidad de queratinocitos en monocapa. f) Preparación de la solución del agente reticulante de reacción de la solución de aspersión celular

Generar en condiciones asépticas 15ml de trombina bovina de pulmón al 27% v/v a una concentración de 11U/ml en cloruro de sodio al 0.9% v/v y cargar 15ml del agente reticulante de reacción en una jeringa de 15 ce para obtener el agente reticulante de reacción de la solución de aspersión celular. g) Preparación de la solución de aspersión celular

Centrifugar a 400 g por 5 minutos una 50cc de sangre periférica autóloga, preferentemente plaquetas humanas (proveniente de toma de muestra del paciente) o crio preservado de plaquetas (banco de sangre) para obtener 15 % v/v de suero acelular plasmático y resuspender con 10 x 10⁶ fibroblastos en monocapa y 10 x 10⁶ queratinocitos en monocapa y cargar 15ml de la solución de aspersión celular en una jeringa de 15 ce y mezclar dicho compuesto de aspersión celular con la solución de aspersión celular con la implementacion de un aspersor fibrijet para obtener un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos.

EJEMPLO 1. MODO PREFERENCIAL DE EMPLEO DEL COMPUESTO DE ASPERSIÓN CELULAR DE QUERATINOCITOS Y FIBROBLASTOS HUMANOS SOBRE LESIONES CUTÁNEAS.

Conectar la jeringa de 15cc con el compuesto de. aspersión celular y la jeringa de 15cc con el agente reticulatne de reacción de la solución de aspersión celular al aspersor fibrijet. Conectar el aspersor fibrijet a la unidad de regulador de aire comprimido. Conectar el reguladro de aire comprimido a una fuente de alimentación de aire comprimido a 25psi/1.75 bar. Colocar el fibrijet a una distancia no menor a de 3cm sobre la superficie del tejido.

Abrir la fuente de aire comprimido y empujar el émbolo de ambas jeringas al mismo tiempo para la pulverización de los queratinocitos y fibroblastos humanos.

Alternativamente el compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos se prepara 5% v/v de una solución compuesta de 225 gramos /mi de fibrinógeno de sangre de bovino disuelto en buffer de fosfato salino a una concentración de 1x.

Alternativamente el compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos se puede obtener utilizando el producto de fibrinógeno de donador humano mediante el producto denominado "Tissucol" de laboratorios Baxter.

Alternativamente la solución del agente reticulante de reacción de la solución de aspersión se obtiene cargando una jeringa de 15cc con CaCI₂ al 1% v/v. Alternativamente la solución del agente reticulante de reacción de la solución de aspersión se puede obtener utilizando el producto de trombina humana de donador denominado "Tissucol" de laboratorios Baxter.

EJEMPLO 2. MODO PREFERENCIAL DE LA INVENCIÓN.

El compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos autólogo y/o de donador está compuesta por una solución de aspersión celular y una solución de agente reticulante de reacción de la solución de aspersión celular que al momento de la pulverización a presión se combinaran ambas moléculas para encapsular las células vivas las cuales se depositarán sobre la superficie del tejido y formarán sobre esta una película y/o relleno gelifcante con células vivas en su interior para la generación de nueva matriz extracelular.

EJEMPLO 3. MODO DE MANIPULACIÓN DEL COMPUESTO DE ASPERSIÓN CELULAR.

En condiciones de quirófano se realiza el proceso de aspersión celular mediante la pulverización simultánea de 2 soluciones por un dispositivo médico (aplicador de gas fibrijet-micromedics) para generar una película gelificante y/o relleno sobre la herida o lesión cutánea como tratamiento de re-epitelización y potencializador de la regeneración de la piel mediante la encapsulación de células vivas sobre la película gelificante.

EJEMPLO 4. USO PREFERENCIAL DE LA INVENCIÓN.

En condiciones de quirófano se realiza el proceso de aspersión celular el cual consiste en 2 soluciones pulverizadas al mismo tiempo por un dispositivo médico (aplicador de gas fibrijet-micromedics) para generar una película gelificante y/o relleno sobre la herida o lesión cutánea con células vivas encapsuladas como tratamiento de re-epitelización.

El dispositivo médico (aplicador de gas fibrijet-micromedics) contendrá dos jeringas (de 5 ce) con las dos soluciones a reaccionar: solución de aspersión celular (fibrinógeno, fibroblastos y queratinocitos) y la solución del agente reticulante de reacción (trombina) de la solución de aspersión celular.

La aspersión se hará directamente sobre la herida cutánea a no menos 3 cm de distancia a través del dispositivo médico (aplicador de gas fibrijet- micromedics) conectado a un suministro de aire comprimido. La presión necesaria para ejercer la pulverización será de 25PSI /1.75 bar de aire comprimido que empujará las dos jeringas y pulverizará su contenido con finas gotas sobre la herida obteniendo una película gelificante de fibrina conteniendo fibroblastos y queratinocitos que promoverá la producción de matriz extracelular nueva sobre la herida. Para obtener un proceso de pulverización con gotas gruesas, la pulverización será de 15PSI / 1.0 bar de aire comprimido. Por consiguiente, este proceso otorgará una re-epitelización de la herida en un tiempo corto, una re-organización de tejido y una regeneración temprana de la lesión evitando la exposición a infecciones.

El compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos que que está en contacto con la lesión cutánea, proveerá con el transcurso del tiempo una re-epitelización y una regeneración más pronta por la adición de los fibroblastos vivos incrustados dentro de esta red de fibrina (fibrinógeno humano, plasma acelular humano, fibrinógeno bovino) estimulando nueva generación de matriz extracelular y fibras de colágeno.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Un proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos caracterizado porque se comprende de las siguientes etapas:

a) Separación de la dermis y epidermis,

b) incubación e la capa de epidermis,

c) disgregación de la capa de dermis y proliferación de

fibroblastos,

d) disgregación de la capa de epidermis,

e) proliferación de los queratinocitos en suspesión,

f) preparación de la solución del agente reticulatne de reacción de la solución de aspersión celular, y

g) preparación de la solución de aspersión celular.

2. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa a) se obtiene una muestra de piel de un paciente en condiciones estériles por medio de un dermatoma para obtener una lámina de piel; posteriormente, se lava la muestra de piel al menos 3 veces con una solución salina de fosfatos (PBS) 1X conteniendo 10% v/v de antibiótíco/antimicótico; después, lava al menos 3 veces con una solución de PBS 1X conteniendo 1% v/v de antibiótico/antimicótico; después del lavado de la muestra de piel, se incuba con una enzima proteólica de disgregación celular, a una concentración de 1.79 unidades/mg en condiciones de temperatura de 4°C por al menos 16 horas para obtener una capa de epidermis y una capa de dermis; al cabo de las 16 horas, separar las dos capas mediante el uso de pinzas estériles y se colocar dichas capas en contenedores estériles e independientes.

3. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la lámina de piel es preferentemente de 0.015 pulgadas.

4. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la solución antibiótico/antimicótico es preferentemente estreptomicina/penicilina.

5. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la enzima es preferentemente dispasa.

6. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b), se separar y se lava la capa de epidermis en un contenedor independiente al menos 3 veces con la solución PBS 1X y se incuba dicha capa de epidermis en una solución de tripsina a una concentración de 0.025% de tripsina en un volumen final de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) por 20 minutos a una temperatura de 37 °C para obtener una epidermis tripsinizada.

7. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa c), se coloca la capa de dermis en un contenedor y se disgrega mecánicamente con una herramienta pulso cortante en condiciones estériles para obtener pedazos de dermis como máximo de 1mm x 1mm, y se incuba por un periodo de al menos 10 minutos, se agrega cuidadosamente 33.33% del volumen del contenedor de un medio de cultivo celular para fibroblastos por las paredes del contenedor y se evita mover los fragmentos de la dermis y se incuba a 37 °C, 95% de humedad relativa, 5% C0₂ y 20% 0₂ por un periodo de para obtener fibroblastos en monocapa.

8. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa d), se neutraliza la epidermis tripsinizada con 50% de un medio de cultivo de queratinocitos humanos conteniendo Suero bovino fetal al 10% y agitar vigorosamente por al menos 30 segundos para obtener una solución celular, posteriormente, se filtra la solución celular por un filtro de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 40pm para obtener los queratinocitos humanos en suspensión en el producto filtrado.

9. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa e), se siembra la suspensión de queratinocitos en monocapa en condiciones asépticas en un contenedor con un medio de cultivo celular e incubar a 37 °C, 95% de humedad relativa, 5% C0₂ y 20% 0₂ por un periodo de 2 a 4 semanas bajo condiciones asépticas, y se cambia el medio de cultivo celular cada segundo o tercer día hasta llegar a una confluencia del 00% para queratinocitos para obtener mayor cantidad de queratinocitos en monocapa.

10. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa f), se genera en condiciones asépticas 15ml de trombina bovina de pulmón al 27% v/v a una concentración de U/ml en cloruro de sodio al 0.9% v/v y cargar 15ml del agente reticulante de reacción en una jeringa de 15 ce para obtener el agente reticulante de reacción de la solución de aspersión celular.

11. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación

I , caracterizado porque en la etapa g), se centrifuga a 400 g por 5 minutos una 50 ce de sangre periférica autóloga para obtener 15 % v/v de suero acelular plasmático y se resuspende con 10 x 10⁶ fibroblastos en monocapa y 10 x 10⁶ queratinocitos en monocapa y se carga 15ml de la solución de aspersión celular en una jeringa de 15 ce y mezclar dicho compuesto de aspersión celular con la solución de aspersión celular con la implementación de un aspersor fibrijet para obtener un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos.

12. El proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación

I I , caracterizado porque la sangre periférica autóloga es preferentemente plaquetas humanas o crio preservado de plaquetas.

13. EI proceso de obtención de un compuesto de aspersión celular de fibroblastos y queratinocitos humanos, de conformidad con la reivindicación de la 1 a la 12 como agente regenerativo de lesiones cutáneas.