BR102021004303B1 - Método de obtenção de curativo biológico a partir da membrana amniótica de placenta humana - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE OBTENÇÃO DE CURATIVO BIOLÓGICO A PARTIR DA MEMBRANA AMNIÓTICA DE PLACENTA HUMANA O método de obtenção de curativo biológico a partir da membrana amniótica de placenta humana, objeto da presente invenção, compreende um produto de terapia celular, um tecido perinatal (a membrana amniótica), para utilização como curativo biológico, complementar às alternativas atuais de transplantes de pele alógeno, para casos de queimaduras, feridas de pele em geral, tais como feridas de pé-diabético, úlceras varicosas, entre outros. Este método possibilita a geração de uma alternativa de tecido biológico que possa complementar a demanda dos bancos de pele no Brasil (armazenam fragmentos de pele de doadores de órgãos) em casos de desastres e eventos que resultem em um número significativo de pacientes com queimaduras graves, pois a membrana amniótica possui disponibilidade de coleta de um material (placenta) que normalmente é descartado após o nascimento do bebê nos partos. Como há muitos partos, há uma oferta grande do material para o processamento e preservação.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção descreve um método de obtenção de curativo biológico a partir da membrana amniótica de placenta humana. Mais especificamente compreende um produto de terapia celular, um tecido perinatal (a membrana amniótica), para utilização como curativo biológico, complementar às alternativas atuais de transplantes de pele aló- geno, para casos de queimaduras, feridas de pele em geral, tais como feridas de pé-diabético, úlceras varicosas, entre outros.

[02] Este método resulta em um curativo biológico obtido através do uso de uma membrana amniótica intacta, com mínimo processamento para manter as células presentes, disposta sobre gaze e em forma de rolo, criopreservada a ultrabaixa temperatura, que é dotado com um tubo plástico para facilitar o manuseio do médico e/ou enfermeiro de forma a melhorar a aplicação e utilização do curativo biológico.

[03] Além disso, este método possibilita a geração de uma alternativa de tecido biológico que possa complementar a demanda dos bancos de pele no Brasil (armazenam fragmentos de pele de doadores de órgãos) em casos de desastres e eventos que resultem em um número significativo de pacientes com queimaduras graves, pois a membrana amnió- tica possui disponibilidade de coleta de um material (placenta) que normalmente é descartado após o nascimento do bebê nos partos. Como há muitos partos, há uma oferta grande do material para o processamento e preservação.

[04] A membrana amniótica poderá ser utilizada no tratamento de uma série de feridas, incluindo: reparo de tendão, reparo de cartilagem, fís-tulas, tratamento de distúrbio da superfície ocular e como enxerto cirúrgico oftálmico; usos vasculares, por exemplo, reparação de vasos sanguíneos, construção e substituição de um vaso sanguíneo; utiliza-ções cardiológicas, por exemplo, como um dispositivo protético na construção de válvulas doentes; tecido ausente nas barreiras de ade-são (por exemplo, reparo do septo nasal, reparo da parede vaginal, re-paro da parede abdominal, ressecção de tumor), feridas dérmicas (por exemplo, queimaduras de espessura parcial, necrólise epidérmica tó-xica, epidermólise bolhosa , pioderma gangrenoso, úlceras, por exem-plo, úlceras diabéticas (por exemplo, pé), úlceras venosas da perna), feridas cirúrgicas, substituição de periósteo, quelóides, lacerações de órgãos, defeitos epiteliais e reparo ou substituição de uma membrana timpânica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[05] A queimadura é uma lesão dos tecidos orgânicos, em decorrência de um trauma de origem térmica, que varia desde uma pequena bolha até formas graves, capazes de desencadear respostas sistêmicas pro-porcionais à extensão e à profundidade (GUIRRO, 2004).

[06] São lesões que podem levar à desfiguração, à incapacidade e até à morte, de modo que em muitos casos, há a necessidade de interven-ções através de curativos, para que o processo de reparação tecidual prossiga sem complicações, que possam retardá-lo, assim como, man-ter a perfusão tecidual adequada e a integridade da pele em áreas não queimadas (LEE et al., 1989).

[07] Atualmente, existem diversos tratamentos que buscam amenizar o trauma de forma imediata e a reparação completa do tecido, através do enxerto e processamento de pele em bancos específicos e/ou através da utilização de curativos sintéticos. No entanto, estes tratamentos apresentam um custo elevado que acabam encarecendo sua utilização e aplicação no mercado.

[08] No tratamento das lesões, as principais dificuldades são o uso de enxerto de pele autóloga (do próprio paciente) que torna-se difícil em lesões extensas devido a restrição de sítios doadores do paciente. De forma semelhante, o uso de pele alogênica (principalmente de doação post-mortem) costuma apresentar maior risco de rejeição e baixa dis-ponibilidade. Já os substitutos cutâneos desenvolvidos em laboratório, com diferentes tipos de matrizes biosintéticas, com ou sem acréscimo de células, costumam ter um elevado custo e demanda de tempo para produção. Em casos em que há necessidade de troca dos curativos também pode ter um custo ainda mais elevado.

[09] Assim, o presente inventor buscando melhorar e facilitar o trata-mento de lesões de pele, desenvolveu um método de formação de um curativo biológico através do processamento da membrana amniótica a qual possui naturalmente fatores de crescimento e citocinas que pro-movem analgesia e aceleração da cicatrização, diferentemente dos métodos atuais de utilização da membrana amniótica que optam por des- celularizar a mesma. Além disso, o processamento da membrana am- niótica realizado para formar o curativo biológico evita a manipulação extensa do tecido para não alterar a matriz celular, ou seja, não inviabilizar as células presentes na composição que é a que liberará os fatores de crescimento e citocinas que promovem analgesia e aceleração da cicatrização. Sendo que o método de criopreservação da membrana é enrolada em tubo plástico de forma a facilitar o manuseio, melhorando a aplicação e utilização do curativo pelo profissional.

[010] Em pesquisa realizada no estado da técnica identificamos diver-sos documentos que descrevem métodos de utilização da membrana amniótica para o tratamento de queimaduras, onde podemos destacar os seguintes documentos:

[011] O documento US20200078492 (Alvaro, Eduardo. 2018) descreve um processo de obtenção de um substituto dérmico funcional composto de membrana amniótica descelularizada a partir da placenta (para obtenção apenas da “malha de colágeno”) e queratinócitos autólogos ou halogênicos humanos, para a geração de um enxerto de pele artificial em laboratório. Estes queratinócitos serão cultivados in vitro em laboratório. Eles utilizaram opcionalmente o crioprotetor contendo: DMSO, RPMI, Hank's solution, F-12, Solução de cloreto de sódio 0.9%. Eles realizaram o congelamento da MA na temperatura de -20 a -90°C. O substituto dérmico pode ser mantido congelado por mais de 1 ano em uma faixa de -70 graus. C. a -100 graus. C, uma vez montada em gaze vaselina dentro de bolsa Tyvek para dispositivo médico e impregnada com solução crioprotetora para ser mantida em ultracongelador por um período de pelo menos um ano.

[012] Já o método reivindicado no presente pedido difere deste por uti-lizarmos a MA íntegra, sem promover a descelularização. Além disso, é utilizado apenas a Membrana Amniótica, sem adição in vitro de outros componentes celulares, evitando ao máximo a manipulação do tecido em laboratório. O método desenvolvido acomoda a Membrana Amnió- tica sobre uma compressa de gaze estéril (material de uso corriqueiro em ambulatórios e centros cirúrgicos), mas sem vaselina, o que au-menta a viabilidade das células pelos nossos estudos, pois permite maior integração da solução criopreservante. Também é demarcado o lado epitelial e estromal, garantindo que o lado de matriz celular possa ser colocado de forma correta sobre a ferida devido a forma de criopre- servação em rolo, e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. O método de congelamento se baseia no uso do crioprotetor composto de DMSO 10% e DMEM-F12 e congelamento a temperaturas ultrabaixas (< - 150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos.

[013] O documento CN107714609 (Zheng, Nan. 2017) descreve uma membrana de base de membrana amniótica, uma máscara de membrana amniótica com base em membrana de membrana amniótica e um método de preparação da mesma para resolver a composição química existente, estimulação da membrana facial e danos à pele, e a máscara biológica tem um único tipo, eficácia única e membrana amniótica. Um método para preparar a membrana amniótica à base de máscara facial membrana amniótica compreende as seguintes etapas: Coleta e limpeza da placenta, A membrana amniótica é separada da placenta lavada e a membrana amniótica separada é primeiro removida do cotilédone e, em seguida, a camada de fibrócitos são removidas; nutrir e esterelizar, A membrana amniótica após é lavada para formar a membrana basal da membrana amniótica; Preparação da máscara da membrana amniótica: o portador da máscara é anexado ao procedimento, Prepare a superfície da camada densa da membrana amniótica. Vitamina C e sulfato de condroitina são adicionados a solução salina fisiológica estéril, e a solução desinfetante é adicionada em água destilada com uma fração de massa de 15% -20. % de ácido peracético. A MA é selada com uma mistura de glicerol e DMEM e armazenado a uma temperatura inferior a 80 graus Celsius negativos. Armazenada por até 6 meses.

[014] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos uma Membrana Amniótica íntegra, com manipulação mínima e sem o processo de descelularização. Os tecidos são criopreservados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (< -150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[015] O documento EP3400031 (Cryolife. 2016) descreve enxertos de tecidos e, em particular, enxertos de tecidos derivados de placenta hu-mana, métodos e artigos para a fabricação e utilização dos mesmos. A membrana amniótica fetal humana processada descrita é composta de ambas as camadas de amnion e córion. O processamento compre-ende: remover células decíduas maternas e células de uma camada de trofoblasto da membrana (descelularização); descontaminar a mem-brana para reduzir sua carga biológica; comprimir a membrana; e desi-dratação da membrana, em que o processamento fornece uma matriz densa com uma quantidade reduzida de células decíduas maternas. Eles descrevem processos de conservação e armazenamento a tem-peratura ambiente que podem durar até 24 meses. Se o tecido for to-talmente desidratado e comprimido em algumas técnicas pode ser es-tocado a temperatura ambiente até 5 anos. Eles apresentam diferentes formatos de embalar os tecidos, podendo ser dobrada em formatos quadrados, retângulos, entre outros, ou enrolada. Utilizam diferentes materiais de suporte rígido perfurada, que podem compreender aço inoxidável, titânio, alumínio ou outro metal adequado ou um plástico rígido que podem apresentar as carcaterísticas de ser permeável a umidade, líquido e vapor.

[016] Já o método reivindicado difere deste uma vez que não é reali-zada a descelularização e desidratação do tecido, evitando a extensa manipulação do tecido e dando prioridade a sua forma íntegra. Além disso é utilizado como forma de preservação o método de criopreser- vação, com o crioprotetor DMSO 10% e DMEM-F12 a temperaturas ul- trabaixas (< -150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos. O material de suporte para a Membrana Amniótica se baseia principalmente na utilização de compressa de gaze estéril (material de uso corriqueiro em ambulatórios e centros cirúrgicos). Também é demarcado os lados epitelial e matriz celular, garantindo que a matriz possa ser colocada de forma correta sobre a ferida devido a forma de criopreservação em rolo e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. A forma de apresentação do produto poderá ser tanto a Membrana Amniótica reta cortada nos tamanhos desejados, como enrolada sobre um suporte de plástico perfurado rígido, sendo ambas acomodadas posteriormente em embalagem criogênica para congelamento a ul- trabaixa temperatura.

[017] O documento CN105028386 (Reziwan. 2015) descreve um método de preservação de membrana amniótica ativa com alta segurança e confiabilidade, e é simples e eficiente de implementar. Membrana de âmnio fresco livre de vírus que foi enxaguada primeiro com PBS contendo antibiótico, o tempo de imersão é de 5 min-10 min e, em seguida, lavando o membrana amniótica 3 vezes com PBS. x 5min, o antibiótico inclui 50.000 U / L de penicilina, 80.000 U / L de tobramicina e 100 mg / L de estreptomicina; 2 na mesa asséptica com a membrana amniótica voltada para cima e achatada na membrana de celulose, o âmnio é seco naturalmente até que o conteúdo de água da membrana amniótica esteja entre 0,1% e 5%, e então cortado em (1cm- 3cm) * (1cm-3cm) Retangular, glicerina e DMEM são utilizados como solução de preservação contida no frasco de armazenamento, selar imediatamente o selo do frasco com o selo de álcool com a lâmpada de álcool e, em seguida, selar a boca da garrafa com calor e o embutido Armazenado em um frasco de armazenamento embebido em âmnio solução de preservação a -80 ° C. A membrana amniótica ativa imersa na solução de preservação selada no frasco de preservação a ° C geralmente tem uma vida útil de 2 anos.

[018] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos a MA íntegra, sem processos de desidratação. Os tecidos são criopreservados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (< - 150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[019] O documento EP3185918 (Mimedx. 2014) descreve enxertos de tecido multicamadas compreendendo colágeno e tecido placentário e / ou componentes do cordão umbilical e métodos associados. Esta in-venção é baseada na descoberta de que a adição de camadas de co- lágeno humano, derivado de tecido imunoprivilegiado, a camadas de tecido placentário (por exemplo, como âmnio) e / ou camadas de com-ponentes do cordão umbilical cria um enxerto de tecido com maior re-sistência à tração e resistência à transparência do que apenas o tecido da placenta. Nesta invenção os enxertos de tecido de múltiplas camadas aqui descrito são desidratados ou liofilizados, podendo ser armazenados à temperatura ambiente por longos períodos de tempo. Já o método reivindicado no presente pedido difere por ser composto apenas de Membrana Amniótica íntegra, sem manipulações para des- celularização, desidratação ou liofilização. Além disso, é utilizado o método de criopreservação com DMSO 10% a temperaturas ultrabai- xas (< -150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos. Também é utilizado como suporte a gaze estéril e conservamos o lado da matriz extracelular intacto, para garantir que a matriz possa ser colocada de forma correta sobre a ferida e aumen-tando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. A compressa de gaze estéril com a Membrana Amniótica poderá ser apresentado na forma reta (do tamanho desejado) ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[020] O documento US9808491 (Tissuetech. 2014) descreve composições de tecido de membrana amniótica morselized e tecido de cordão umbilical morselized (isto é, composições que são preparadas a partir de materiais de membrana amniótica, incluindo a membrana amniótica, cordão umbilical, estroma amniótico e geléia amniótica, líquido amniótico e geléia de Wharton). Pelo menos um componente das composições é obtido a partir de tecido de membrana amniótica ou preparações de tecido de cordão umbilical. Também são descritas neste documento composições nas quais pelo menos um componente da composição é obtido da placenta humana, líquido amniótico e córion. As amostras de cordão umbilical e de membrana amniótica foram armazenadas a -80 ° C em DMEM / glicerol 1: 2 (v / v) até o uso. O suporte inerte compreende um material selecionado do grupo que consiste em: colágeno; hidrogéis; queratina; poliuretano hidrofílico; polietilenoglicóis; poli (ácidos láctico-co-glicólicos); e hidrocolóides. Nos materiais contendo a atividade biológica natural do tecido da membrana amniótica fragmentada e do tecido do cordão umbilical fragmentada é substancialmente preservada por pelo menos 15 dias após a obtenção inicial. Pelo menos um tecido é criopreservado, liofilizado ou uma combinação dos mesmos. As formulações do cordão umbilical e as composições de membrana amniótica aqui descritas incluem aquelas adequadas para administração tópica. As composições típicas aqui descritas incluem uma ampla variedade de formas físicas: soluções, loções, cremes, óleos, géis, bastões, sprays, pomadas, bálsamos, xampu e pastas, entre outras. As composições podem ser aplicadas topicamente na pele ou podem ser aplicadas na forma de um dispositivo de distribuição transdérmica, tal como uma microagulha, um adesivo, curativo ou compressa de gaze conhecida na técnica. Os produtos utilizam como conservantes: para-hidroxibenzoato de metilo, para- hidroxibenzoato de etilo, ácido desidroacético, ácido salicílico e ácido benzóico.

[021] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar-mos a Membrana amniótica íntegra, como um suporte para proteger a área lesionada, não sendo “macerada” ou processada para obter as composições. O produto possui processamentos mínimos do tecido e não tem adição de outros componentes celulares (como de cordão umbilical ou líquido amniótico). É utilizado como suporte compressa de gaze estéril, que poderá ser apresentado na forma reta ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreser- vante. Além disso, é utilizado o método de criopreservação a tempera-turas ultrabaixas (< -150°C) com criopreservantes DMSO 10% e DMEM-F12, garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido.

[022] O documento EP3139935 (Osiris Therapeutics. 2014) descreve uma ou mais composições da placenta compreendendo células da placenta e outros componentes da placenta derivados do tecido da placenta, por exemplo, uma placenta inteira ou parte dela. Outros componentes da placenta podem compreender um ou mais fatores terapêuticos, componentes da matriz extracelular e semelhantes. A (s) composição (ões) podem ser obtidas por manipulação mecânica (por exemplo, dissecção ou picagem ou homogeneização), digestão enzimática ou combinações das mesmas. Um tecido da placenta pode ser opcionalmente um âmnio, cório, uma mistura de âmnio e cório ou outro tecido aqui descrito, incluindo, por exemplo, tecido do cordão umbilical e geleia de Wharton. A presente tecnologia também fornece um método para fazer uma ou mais composições placentárias. Os tecidos podem ser criopreservados com os seguintes compostos: Dimetilsulfóxido (DMSO), um glicerol, um glicol, um propilenoglicol, um etilenoglicol, propanodiol, polietilenoglicol (PEG), 1,2-propanodiol (PROH) ou uma combinação disso. A composição da placenta é colocada em um recipiente farmaceuticamente aceitável que pode suportar temperaturas de criopreservação, com pelo menos um agente de criopreservação e criopreservado por congelamento (por exemplo, de cerca de -20 ° C a cerca de -196 ° C, tal como cerca de -80 ° C), por dois anos ou mais com retenção de alta viabilidade (pelo menos 40-70% de retenção de células viáveis) uma vez descongeladas. Um método de administração da presente tecnologia é a administração tópica. A administração da presente tecnologia também pode envolver a administração a um tecido interno onde o acesso é obtido por um procedimento cirúrgico. Alternativamente, a composição da placenta pode ser injetada através de uma seringa ou agulha. As composições placentárias são autólogas, alogênicas ou xenogênicas. As composições da placenta aqui divulgadas também podem ser usadas com um transportador para formar uma composição. Os andaimes biocompatíveis adequados e / ou os transportadores adequados incluem, aloenxertos, autoenxertos, xenoenxertos, cerâmicas, biovidro, sulfato de cálcio, matriz óssea desmineralizada, coral, colágeno, compósitos de enxerto, andaimes condrônicos, andaimes sintéticos de todos tipos, andaimes naturais / biológicos de todos os tipos e semelhantes (por exemplo, fosfatos de cálcio, hidroxiapatita e fosfato tricálcico, compósito de colágeno / cerâmica, PCL, PLLA, PLGA, PEG, PGA, alginatos, seda, colágeno, gelatina de dextrana, elastina, agarose , quitosana, hialuronana, HA-TCP-Collagen, GraftJacket®, Alloderm®, PriMatrix® e outros).

[023] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar apenas a Membrana amniótica íntegra, sem processamento para separação das células e componentes da matriz. Desta forma, ela pode ser utilizada sob a área lesionada de forma inteira ou do tamanho desejado. Os produtos apresentados acima, tratam-se de matrizes acelulares. E o produto reivindicado no presente pedido possui processamentos mínimos do tecido e não tem adição de outros componentes celulares, sendo constituído única e exclusivamente da Membrana amniótica com ambos os lados epitelial e matriz celular. A forma de apresentação compreende compressa de gaze estéril e Membrana Amniótica que são também criopreservados a ultrabaixas temperaturas (< -150°C) com cri- opreservante DMSO 10%. O produto poderá ser apresentado na forma reta ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[024] O documento US2017224870 (Dario, Hernan. 2014) descreve um método de embalagem de membrana amniótica humana (AM) para obter um produto que está pronto para ser usado como enxerto em cirurgias, como suporte para cultura ou para fins diagnósticos ou terapêuticos. A MA é separada do resto dos anexos fetais (córion), lavada com soluções que contenham antibióticos e antifúngicos, eliminando as sobras de sangue, a MA é fixada por desidratação a um suporte de: etileno-acetato de vinila estéril, plumavit ou papel, Colar com adesivos sintéticos (cianoacrilato ou outras colas) a membrana amniótica juntamente com o suporte para o interior de um recipiente rígido de: vidro, poliestireno, plumavit, plástico ou acrílico; e Irradiação com luz ultravioleta por um período de 20 a 60 minutos. Proteção do recipiente no interior de um envelope trilaminar estéril (poliestireno- poliamida-alumínio) termo-selado para armazenamento e transporte.

[025] Já o metodo reivindicado no presente pedido difere por utilizar a MA íntegra, sem desidratação do produto e não envolve irradiação com luz UV para não haver risco de dano às células. Além disso, é utilizado como suporte compressas de gazes estéreis enroladas que serão acondicionadas em embalagem criogênica para congelamento em ul- trabaixa temperatura (< -150°C).

[026] O documento US2014342015 (Wake Forest. 2014) descreve uma composição para induzir a cicatrização de feridas e regeneração de tecidos, em que a composição compreende membrana amniótica. Em uma modalidade, a composição compreende pó de membrana amniótica. Em uma modalidade, a composição compreende membrana amniótica solubilizada (SAM). Em uma modalidade, a composição está na forma de uma pomada. Em uma modalidade, a composição está na forma de um spray de aerossol. Ou ainda a composição compreende um andaime. O andaime é um hidrogel, um biopolímero, ou um polímero sintético. O método compreende o isolamento de uma membrana amniótica de um mamífero; lavar a membrana amniótica; liofilizando a membrana amniótica; e triturar a membrana amniótica para formar um pó. Em uma modalidade, o método compreende ainda formar uma mistura de pó de membrana amniótica, pepsina e uma solução; centrifugar a mistura para formar um sobrenadante e um pellet; e remover o sobrenadante, formando assim a membrana amniótica solubilizada (SAM). Em uma modalidade, o mamífero é um humano. Em uma modalidade, o método compreende descelularizar a membrana amniótica.

[027] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar-mos a MA íntegra, sem descelularizar, liofinizar ou triturar a MA. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[028] O documento EP3750569 (Univ. Of Nottingham. 2013) descreve uma membrana amniótica preservada, em particular uma membrana amniótica seca a vácuo. Também se refere ao uso de membrana amniótica seca a vácuo e métodos para fazer uma membrana amniótica seca a vácuo.

[029] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos a MA íntegra, sem processos de desidratação. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[030] O documento CN103074295 (Shenyang. 2013) descreve um método para a construção de um banco de reserva de tecido de membrana amniótica humana médica que utiliza totalmente os apêndices fetais - membrana amniótica como recursos. Pegue a membrana fetal da cesariana ou do parto normal que atenda ao padrão médico e separe sem corte a membrana amniótica da membrana fetal; (3) Após enxágüe repetido com tampão fosfato ou solução salina fisiológica 0,9%, corte aleatoriamente em um círculo ou quadrado de um determinado tamanho da membrana e marque a superfície da membrana basal com suturas estéreis; Mergulhe por 30-40 minutos em tampão fosfato ou solução salina 0,9% contendo 1000 U / ml de gentamicina e 2,5 μg / ml de anfotericina B; Coloque em solução tampão de fosfato contendo 4% ~ 100% de glicerol ou 0,9% de solução salina fisiológica mista, frasco ou saco plástico de cultura celular estéril de 75ml ~ 250 m, coloque em geladeira criogênica profunda de -20-80 °C para preservação congelada; Após a membrana amniótica humana preparada pelo método acima ser esterilizada por irradiação com cobalto 60, a dose de irradiação é de 25 kGy, ou seja, a membrana amniótica humana médica é obtida.

[031] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos DMSO 10% como criopreservante e ultrabaixas temperaturas (< -150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, o tecido é acomodado sobre compressa de gaze estéreis (material de uso corriqueiro em ambulatórios). O produto poderá ser apresentado na forma não dobrada ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[032] O documento US20200330520 (Osiris. 2011) descreve um pro-duto da placenta compreendendo uma membrana coriônica imunocom- patível (com ou sem MA). Esses produtos da placenta podem ser crio- preservados e conter células terapêuticas viáveis após o descongelamento. Em algumas modalidades, o produto da placenta compreende ainda uma membrana amniótica que é seletivamente desvitalizada. Um produto da placenta que é seletivamente eliminado de todas as células imunogênicas, que não contém células cultivadas ex vivo, que compre-ende pelo menos um de Fator de Crescimento Epidérmico, IGFBP1 e Adiponectina. Em uma modalidade, o produto da placenta pode com-preender uma camada estromal com arquitetura nativa, compreende uma membrana basal com arquitetura nativa, uma camada reticular com arquitetura nativa, ou as 3 camadas intactas. Opcionalmente, o meio de criopreservação compreende um ou mais criopreservativos que permeiam as células selecionados de DMSO, um glicerol, um gli- col, um propilenoglicol, um etilenoglicol ou uma combinação dos mes-mos. A criopreservação consiste em colocar a placenta sobre papel de nitrocelulose. Opcionalmente, a etapa de congelamento compreende a redução da temperatura a uma taxa de cerca de 1 grau / minuto. A cri-opreservação pode compreender, por exemplo, incubar o produto pla- centário em 4 graus. C. por 30-60 min e, em seguida, incubando a -80 °. C. até o uso.

[033] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar apenas a Membrana Amniótica, sem a presença de outros componen-tes da placenta. É acomodada a Membrana Amniótica sobre uma com-pressa de gaze estéril (material de uso corriqueiro em ambulatórios), o que aumenta a viabilidade das células pelos nossos estudos. Também é demarcado o lado epitelial e estromal, garantindo que o lado de matriz celular possa ser colocado de forma correta sobre a ferida devido a forma de criopreservação em rolo, e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. O método de congelamento se baseia no uso do crioprotetor composto de DMSO 10% e DMEM-F12 e congelamento a temperaturas ultrabaixas (< -150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos.

[034] O documento EP3061468 (Tissue Technology. 2009) descreve, em certas modalidades, um produto UCAM (membrana amniótica de cordão umbilical). Composição possui integridade estrutural natural do UCAM isolado e preservada por pelo menos 15 dias após a obtenção inicial até 60 dias. Em algumas modalidades, a composição é criopre- servada, liofilizada, esterilizada terminalmente ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição é uma folha subs-tancialmente achatada. Em algumas modalidades, a composição é uma folha tubular. Em algumas modalidades, a composição é um pó pulverizado ou um homogenato. É divulgado aqui, em algumas modalidades, um método de produção de um produto UCAM, compreendendo: a obtenção do cordão umbilical pré-congelado e a separação do UCAM da veia umbilical e das artérias umbilicais e pelo menos uma porção da geléia de Wharton, em que o estrutural natural a integridade do produto UCAM é substancialmente preservada por pelo menos 15 dias após a aquisição inicial. O cordão umbilical pode ser seco ou congelado. Se o cordão umbilical não for congelado, ele é processado imediatamente. Em algumas modalidades o produto UCAM é congelado. É mantido a -80 ° C até que o doador e a elegibilidade da amostra sejam determinados. Em algumas modalidades, o produto UCAM ou UCAM isolado é liofilizado, ou liofilizado após o congelamento. Em algumas modalidades, o produto UCAM ou UCAM isolado é congelado por exposição a uma temperatura abaixo de cerca de -100 ° C. Em algumas modalidades, o produto UCAM ou UCAM isolado é congelado por exposição a um gás líquido. UCAM foi mantido em 50% DMEM + 50% glicerol em freezer -80 ° C por 2 semanas após o processamento. O tamanho das seções depende do uso desejado do produto (por exem-plo, enxerto de tecido) derivado do cordão umbilical. O tamanho da fo-lha UCAM depende do uso desejado da folha UCAM. Em algumas mo-dalidades, o UCAM ou o produto UCAM é armazenado em 50% DMEM + 50% Glicerol, ou 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de glicerol, ou 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de propilenoglicol. Em algumas modalidades, o UCAM ou um produto UCAM é orientado de modo que o estroma esteja em contato com o substrato. Em algumas modalidades, o UCAM ou um produto UCAM é orientado de modo que o lado epitelial esteja em con-tato com o substrato. Em algumas modalidades, o UCAM isolado ou um produto UCAM é anexado ao substrato (nitrocelulose (NC), membrana de náilon (NM) ou membrana de polietersulfona (PES)).

[035] Já o método reivindicado no presente pedido difere por ser com-posto apenas de Membrana Amniótica íntegra, sem manipulações como liofinização. Além disso, é utilizado o método de criopreservação com DMSO 10% a temperaturas ultrabaixas (< -150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos. Também é utilizado como suporte a gaze estéril e conservamos o lado da matriz extracelular intacto, para garantir que a matriz possa ser colocada de forma correta sobre a ferida devido a forma de criopreservação em rolo e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. A compressa de gaze estéril com a Membrana Amniótica poderá ser apresentado na forma reta (do tamanho desejado) ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[036] O documento EP2133105 (Amnos. 2008) descreve uma membrana amniótica seca usada na presente invenção pode ser produzida irradiando simultaneamente uma membrana amniótica fresca com um micro-ondas e um raio infravermelho distante sob pressão reduzida. Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos a MA íntegra, sem processos de desidratação. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[037] O documento BRPI05143870 (Cellresearch. 2005) descreve um método para isolar células-tronco/progenitoras da membrana amniótica do cordão umbilical, em que o método compreende separar a membrana amniótica dos outros componentes do cordão umbilical in vitro, cultivara tecido de membrana amniótica sob condições que permitem proliferação de célula e isolar as células-tronco/progenitoras das culturas de tecido. Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos uma Membrana Amniótica íntegra, com manipulação mínima e sem o processo de separar as células do tecido para uso. Os tecidos são criopre- servados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (<-150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[038] O documento EP1789534 (Cellresearch. 2004) descreve um método para isolar células-tronco/progenitoras da membrana amniótica do cordão umbilical, o método compreendendo: separar a membrana amniótica dos outros componentes do cordão umbilical in vitro; separar a membrana amniótica dos outros componentes do cordão umbilical in vitro; separar as células do tecido da membrana amniótica antes do cultivo por uma técnica selecionada do grupo que consiste em digestão enzimática e explante de tecido direto. Separar as células do tecido da membrana amniótica antes do cultivo por uma técnica selecionada do grupo que consiste em digestão enzimática e explante de tecido direto. A invenção fornece um método para isolar células-tronco / progenitoras epiteliais e / ou mesenquimais, células-tronco embrionárias. Cultivar as células-tronco / progenitoras em condições que permitem a diferenciação das referidas células em células epiteliais e / ou células mesenqui- mais; e isolar as células diferenciadas. Preservar as células-tronco / progenitoras isoladas para uso posterior. De acordo com o acima, a invenção também é dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo uma célula-tronco / progenitora isolada da membrana amnió- tica do cordão umbilical pelo método inventivo acima. A composição farmacêutica pode ser de qualquer tipo e geralmente compreende as células-tronco / progenitoras ou um extrato celular das mesmas juntamente com um transportador / excipiente adequado terapeuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adaptada para aplicação sistêmica ou tópica. Nosso produto difere por utilizarmos a Membrana amniótica íntegra que pode ser utilizada sob a área lesionada de forma inteira ou do tamanho desejado.

[039] Já o método reivindicado no presente pedido possui processa-mentos mínimos do tecido e não tem adição de outros componentes celulares, sendo constituído única e exclusivamente da Membrana am- niótica com ambos os lados epitelial e matriz celular. A forma de apre-sentação compreende compressa de gaze estéril enrolada e Membrana Amniótica que são também criopreservados a ultrabaixas temperaturas (< -150°C) com criopreservante DMSO 10%. O produto poderá ser apresentado na forma reta ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[040] O documento EP2700309 (Celularity. 2002) descreve um método de preparação de um biofabric de colágeno da placenta, de preferência uma placenta humana, que resulta em um novo biofabric de colágeno com propriedades físicas e biofísicas melhoradas. Este método produz um biofabric desidratado e descelularizado que pode permanecer estável sob condições de armazenamento estéril à temperatura ambiente e que é subsequentemente reidratado e enxertado ou implantado em um sujeito. Fornece uma membrana amniótica derivada da placenta ou biofabric que pode ser armazenado como folhas desidratadas sem congelamento ou criopreservação. o biofabric de colágeno pode ser impregnado com um ou mais fatores de crescimento. Em algumas modalidades, as camadas de membrana amniótica produzidas de acordo com os métodos da invenção podem ser colocadas em contato umas com as outras na presença de um adesivo para formar um laminado de membrana amniótica (pode ser qualquer cola biológica conhecida por um versado na técnica, de preferência uma cola biocompatível, incluindo, mas não se limitando a, cola natural, por exemplo, fibronectina, fibrina, cola sintética). A invenção fornece um biofabric de colágeno, um laminado de membrana amniótica ou uma estrutura tridimensional compreendendo ainda uma ou mais composições de hidrogel e métodos de preparação dos mesmos. A composição de hidrogel pode compreender um polímero incluindo, mas não se limitando a, álcool polivinílico, poli- etilenoglicol, ácido hialurônico e seus derivados e análogos. Os mesmos podem ser ainda preenchidos com células, tais como células- tronco, células adultas diferenciadas, células progenitoras e semelhantes, de preferência humanos para que o as células são uniformes e confluentes. A preservação das membranas placentárias (que são de origem animal ou humana) em álcool etílico a 95% ou gli- cerol misturado em proporções de 50-50% com meio de cultura de te-cidos tem sido utilizada para preservação da membrana amniótica an-tes do congelamento. Podem ser suportados em nitrocelulose / papel de filtro.

[041] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar-mos uma Membrana Amniótica íntegra, com manipulação mínima e sem o processo de descelularização ou adição in vitro de outros tipos celulares. Os tecidos são criopreservados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (< -150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, o tecido é acomodado sobre compressa de gaze estéreis enrolada (material de uso corriqueiro em ambulatórios e centros cirúrgicos). O produto poderá ser apresentado na forma reta ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[042] O documento RU2214091 (Miljudin, E S. 2002) descreve uma membrana amniótica doadora destinada a transplante. O resultado técnico é alcançado pelo fato de os pedaços purificados da membrana amniótica serem tratados adicionalmente em uma solução de clorexidina 0,02%, em seguida, eles são colocados em uma solução contendo 40 mg / ml de gentamicina e 2,5 mg / ml de anfotericina B , então os pedaços da membrana amniótica são imersos por 20 minutos em glicerol, então são fixados em uma estrutura, por exemplo, metal, após o que os pedaços da membrana amniótica são secos em condições estéreis sobre sílica gel por 18-24 horas, separados dos quadros e embalados. A vida útil da membrana amniótica assim preservada não é inferior a 1,5 anos em embalagens hermeticamente fechadas, em condições ambientais. Já o método reivindicao no presente pedido difere por utilizar a MA íntegra, sem processos de desidratação. Os tecidos são criopreservados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (< -150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[043] O documento CN1205333 (General Hospital of Tianjin. 2002) descreve um método de membrana amniótica de estrutura de tecido de membrana amniótica completamente descelularizado. O método pode remover todas as células da membrana amniótica sem usar água de amônia ou outros materiais de informação biológica destruidores, proporcionando assim uma estrutura de engenharia de tecidos qualificada para fazer tecidos e órgãos humanos por métodos de bioengenharia. Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos uma Membrana Amniótica íntegra, com manipulação mínima e sem o processo de descelularização. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[044] O documento EP1383868 (Ramos, Maria T. Furtado. 2001) des-creve um método para a preparação de membranas amnióticas imu- nologicamente inertes usando membranas fetais de cesarianas programadas em condições esterilizadas. O método da invenção compreende as seguintes etapas: a. Separação do âmnio do corião e resíduos da decídua, b. Lavar o âmnio com solução salina eliminando qualquer fragmento contaminante do lado materno, c. Alongar o âmnio em folha metálica perfurada, secar com gaze e cobrir com gaze toda a superfície da membrana, d. Cobrir a gaze com uma segunda folha metálica perfurada e dobrar as duas arestas da folha, de forma a constituir a embalagem fechada, e. Selagem da embalagem fechada em uma luva esterilizante, f. Manter a embalagem fechada por 96 horas à temperatura de 37 C em atmosfera contendo 5% De C02. g. Reidratação da membrana em solução fisiológica (0,9% de NaCl). h. Criopreservando a membrana em meio de cultura contendo 10% de dimetilsulfóxido. No entanto, eles não indicam qual a temperatura de criopreservação.

[045] Já o método reivindicado no presente pedido difere pelo tecido ser criopreservado em ultrabaixas temperaturas (<-150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos perí-odos, o que não é descrito nesta patente. No processo acima, ao desi-dratar o tecido na incubadora de CO2, sem meio de cultura, a matriz ficará descelularizada, o que não ocorre no nosso processamento, onde procuramos manter a viabilidade das células. Também é utilizado como suporte a gaze estéril e conservamos o lado da matriz extracelu- lar intacto, para garantir que a matriz possa ser colocada de forma cor-reta sobre a ferida e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. A compressa de gaze estéril com a Membrana Amniótica poderá ser apresentado na forma reta (do tamanho desejado) ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[046] O documento WO200073421 (Lifebank. 1999) descreve células epiteliais amnióticas humanas derivadas da placenta no momento da entrega e aos métodos para isolá-las, cultivá-las e criopreservá-las para futuras utilizações terapêuticas. Além disso, a presente invenção é direcionada a métodos para induzir a diferenciação dessas células multipotenciais, para testar os tipos de células derivados e para manipular as células por transfecção de genes e outros meios para aplicações terapêuticas, incluindo, mas não se limitando a, substituição enzimática e terapia genética, regeneração e reposição de tecidos, bem como curativos para queimaduras e feridas. A própria membrana amniótica pode ser criopreservada em uma solução crioprotetora compreendendo um meio ou tampão e um agente crioprotetor. Exemplos de meios são Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio 199 (M199), Meio F-12 e Meio RPMI. Um exemplo de tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS). Exemplos de agentes crioprotetores são dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol. Exemplos de soluções crioprotetoras são: DMEM / glicerol (1: 1), DMEM / 7,5% DMSO, M199 / 7,5% DMSO e PBS / 3,5 M DMSO. Opcionalmente, a membrana amniótica pode ser tratada com antibióticos, como penicilina ou estreptomicina, antes da criopreservação. A criopreservação pode ser realizada usando um método rápido de congelamento instantâneo ou por métodos de congelamento de taxa controlada mais convencionais em nitrogênio líquido. Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizarmos uma Membrana Amniótica íntegra, com manipulação mínima e sem o processo de separar as células do tecido para uso. Os tecidos são criopre- servados em DMSO 10% a ultrabaixas temperaturas (<-150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do tecido por longos períodos. Além disso, descreve um método de criopreservação em rolo da membrana de forma a garantir que a matriz celular possa ser colocada de forma correta sobre a ferida.

[047] O documento EP918529 (Tissuetech. 1997) descreve uma membrana amniótica humana, obtida e preservada de uma nova maneira, é transformada em um enxerto. A membrana amniótica sepa-rada, como uma folha, é montada / aposta sobre um substrato, por exemplo, um filtro de nitrocelulose estéril, de modo que a superfície epi- telial seja mantida voltada para cima quando achatada. a camada estromal / fibrobística fica no filtro. Folhas de membranas amnióticas que foram aderidas / montadas no filtro de nitrocelulose são cortadas em tamanhos diferentes. Um meio eficaz é constituído por 50% de Meio de Eagle Modificado por Dubecco (doravante "meio DMEM") (de GIBCO) e 50% de glicerol (V / V). Uma faixa de 30% a 50% de glicerol é utilizável.

[048] Já o método reivindicado no presente pedido difere por utilizar-mos DMSO 10% como criopreservante e ultrabaixas temperaturas (< - 150°C), garantindo a durabilidade e conservação da viabilidade do te-cido por longos períodos. Além disso, o tecido é acomodado sobre compressa de gaze estéreis enrolada (material de uso corriqueiro em ambulatórios e centros cirúrgicos). O produto poderá ser apresentado na forma não dobrada ou enrolada em torno de um tubo de plástico perfurado para circulação do criopreservante.

[049] Portanto, o presente inventor tomando conhecimento dos produ-tos contidos no estado da técnica e no mercado, desenvolveu um mé-todo de geração de um curativo biológico que utiliza a membrana am- niótica íntegra sem promover a descelularização e sem a adição de ou-tros componentes celulares de forma a evitar ao máximo a manipulação do tecido em laboratório. O método desenvolvido acomoda a Mem-brana Amniótica sobre uma compressa de gaze estéril, mas sem vase-lina, o que aumenta a viabilidade das células, além disso, é demarcado o lado epitelial e estromal, garantindo que o lado de matriz celular possa ser colocado de forma correta sobre a ferida devido a forma de criopre- servação em rolo, e aumentando o contato da lesão com as células responsáveis pela secreção dos bioativos terapêuticos. O método de congelamento se baseia no uso do crioprotetor composto de DMSO 10% e DMEM-F12 e congelamento a temperaturas ultrabaixas (< - 150°C), o qual garante uma durabilidade e viabilidade do tecido por longos períodos

[050] Desta forma, é objeto da presente invenção, um método de ob-tenção de curativo biológico a partir da membrana amniótica de pla-centa humana que compreende um produto de terapia celular, um te-cido perinatal (a membrana amniótica), para utilização como curativo biológico, complementar às alternativas atuais de transplantes de pele alógeno, para casos de queimaduras, feridas de pele em geral, tais como feridas de pé-diabético, úlceras varicosas, entre outros. Este mé-todo possibilita a geração de uma alternativa de tecido biológico que possa complementar a demanda dos bancos de pele no Brasil (arma-zenam fragmentos de pele de doadores de órgãos) em casos de de-sastres e eventos que resultem em um número significativo de pacien-tes com queimaduras graves, pois a membrana amniótica possui dis-ponibilidade de coleta de um material (placenta) que normalmente é descartado após o nascimento do bebê nos partos. Como há muitos partos, há uma oferta grande do material para o processamento e pre-servação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[051] É característica da presente invenção uma membrana amniótica intacta, com mínimo processamento para manter as células presentes.

[052] É característica da presente invenção uma membrana amniótica disposta sobre gaze e em forma de rolo, congelado com DMSO em 10% em ultrabaixa temperatura (-150°C), dotado com um tubo plástico para o manuseio, aplicação e utilização do curativo biológico.

[053] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê o processamento da placenta em até 48hrs após o parto.

[054] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê uma etapa de separação da membrana amniótica (MA) do córion, evitando uma manipulação excessiva da MA para preservar as camadas epitelial e matriz estromal.

[055] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê a realização de pontos de sutura na MA com cuidado para marcar o lado epitelial.

[056] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê lavar a MA em solução salina estéril, para lavagem e remoção de resquícios de sangue e debris - repetir este processo 2 vezes até estar totalmente transparente.

[057] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê incubar a MA em coquetel de antibióticos e antifúngico em geladeira durante 2 horas.

[058] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê lavar a MA em solução salina para retirada dos antibióticos/antifúngico da MA - repetir este processo 2 vezes até estar totalmente transparente.

[059] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê acomodar as gazes estéreis sobre o campo plástico, conforme os tamanhos e apresentações desejados, pode ser reta ou enrolada em suporte de plástico perfurado, em diferentes tamanhos.

[060] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê colocar a MA sobre as compressas de gaze de acordo com os modelos definidos (fragmentos de 7cm (L) x 15cm (C) e acomodá-las com o lado estromal voltado para fora (epitelial em contato com a gaze.

[061] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê enrolar o fragmento em um tubo de Teflon perfurado, de largura 10cm e diâmetro 8mm, de forma que a membrana fique pelo lado de fora do rolo e a gaze pelo lado de dentro.

[062] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê acomodar cada unidade de amostra dentro de uma embalagem de criopreservação.

[063] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê adicionar os volumes da solução crioprotetora (DMSO 10% + DMEM-F12 + anfotericina B) em cada envelope.

[064] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê com o auxílio da seladora, selar a embalagem criogênica com o tecido.

[065] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê etiquetar cada embalagem criogênica com etiqueta criogênica contendo informações do produto, validade e modo de uso.

[066] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê acomodar as embalagens identificadas nos cassetes metálicos.

[067] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê realizar o congelamento, processo que dura cerca de 1 hora, conforme a curva padrão de congelamento programado.

[068] É característica da presente invenção um método de obtenção de curativo biológico que provê armazenar imediatamente os cassetes metálicos contendo as embalagens de criopreservação no tanque de armazenamento, em vapor de nitrogênio.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[069] A figura 1 apresenta a forma de preparo e separação da membrana amniótica do córion de forma manual.

[070] A figura 2 apresenta a demarcação com fio de sutura do lado epitelial da membrana amniótica.

[071] A figura 3 apresenta a lavagem da membrana com solução salina para remoção de debris e sangue.

[072] A figura 4 apresenta a assepsia com banho de antibióticos por 2 horas.

[073] A figura 5 apresenta a lavagem da membrana para remoção dos antibióticos.

[074] A figura 6 apresenta a definição dos tamanhos e forma de apresentação da membrana amniótica, conforme o tamanho coletado.

[075] A figura 7 apresenta a preparação das gazes estéreis e rolos com suporte para a membrana amniótica.

[076] A figura 8 apresenta a acomodação dos tecidos em embalagem criogênica com o meio crioprotetor.

[077] A figura 9 apresenta o fluxograma de crioproteção da membrana amniótica.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[078] O método de obtenção de curativo biológico a partir da membrana amniótica de placenta humana, objeto da presente invenção, compreende um método de para geração de um substituo dérmico funcional a partir da Membrana amniótica de placenta humana que evita a manipulação extensa do tecido de forma a não alterar a matriz celular, através do seguinte protocolo de obtenção:

[079] A placenta será processada em até 48hs após o parto;

[080] Em laboratório será realizado o procedimento de separação da membrana amniótica (MA) do córion, evitando uma manipulação ex-cessiva da MA para preservar as camadas epitelial e matriz estromal, conforme demonstrado na figura 1;

[081] Com auxílio do porta-agulha e o fio agulhado de seda-trançado preto será realizado pontos de sutura na MA com cuidado para marcar o lado epitelial, conforme demonstrado na figura 2;

[082] Lavar a MA em solução salina estéril, para lavagem e remoção de resquícios de sangue e debris - Repetir este processo 2 vezes até estar totalmente transparente, conforme demonstrado na figura 3;

[083] Incubar a MA em coquetel de antibióticos e antifúngico em gela-deira durante 2 horas, conforme demonstrado na figura 4;

[084] Após, lavar a MA em solução salina para retirada dos antibióti- cos/antifúngico da MA - Repetir este processo 2 vezes até estar total-mente transparente, conforme demonstrado na figura 5;

[085] Acomodar as gazes estéreis sobre o campo plástico, conforme os tamanhos e apresentações desejados (MA reta ou enrolada em suporte de plástico perfurado, em diferentes tamanhos), conforme demonstrado na figura 6;

[086] Colocar a MA sobre as compressas de gaze de acordo com os modelos definidos (fragmentos de 7cm (L) x 15cm (C) e acomodá-las com o lado estromal voltado para fora (epitelial em contato com a gaze);

[087] Enrolar o fragmento em um tubo de Teflon perfurado, de largura 10cm e diâmetro 8mm, de forma que a membrana fique pelo lado de fora do rolo e a gaze pelo lado de dentro, conforme demonstrado na figura 7 e 8;

[088] Acomodar cada unidade de amostra dentro de uma embalagem de criopreservação;

[089] Adicionar os volumes da solução crioprotetora (DMSO 10% + DMEM-F12 + anfotericina B) em cada envelope;

[090] Com o auxílio da seladora, selar a embalagem criogênica com o tecido;

[091] Etiquetar cada embalagem criogênica com etiqueta criogênica contendo informações do produto, validade e modo de uso;

[092] Acomodar as embalagens identificadas nos cassetes metálicos, conforme demonstrado na figura 9;

[093] Realizar o congelamento, processo que dura cerca de 1 hora, conforme a curva padrão de congelamento programado como: 1) Wait at Chamber = 0,0°C until Sample = 4,0°C 2) Ramp 1,0°C/min until Sample = -6,0°C 3) Ramp 25,0°C/min until Chamber = -58°C 4) Ramp 15,0°C/min until Chamber = -20°C 5) Ramp 1,0°C/min until Chamber = -45°C 6) Ramp 10,0°C/min until Sample = -120°C 7) End

[094] Ao término do congelamento programado, armazenar imediata-mente os cassetes metálicos contendo as embalagens de criopreser- vação no tanque de armazenamento, em vapor de nitrogênio.

[095] O produto resultante do método é um curativo biológico obtido através do uso de uma membrana amniótica intacta, com mínimo pro-cessamento para manter as células presentes, disposta sobre gaze e em forma de rolo, congelado com DMSO em 10% em ultrabaixa tem-peratura (-150°C), que é dotado com um tubo plástico para facilitar o manuseio do médico e/ou enfermeiro de forma a melhorar a aplicação e utilização do curativo biológico.

Claims (1)

1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE CURATIVO BIOLÓGICO que com-preende o seguinte protocolo: • a placenta será processada em até 48hs após o parto; • em laboratório é realizado o procedimento de separação da membrana amniótica (MA) do córion, evitando uma manipulação excessiva da MA para preservar as camadas epitelial e matriz estromal; • com auxílio do porta-agulha e o fio agulhado de seda-trançado preto será realizado pontos de sutura na MA com cuidado para marcar o lado epitelial; • lavar a MA em solução salina estéril, para lavagem e remoção de resquícios de sangue e debris - repetir este processo 2 vezes até estar totalmente transparente; • incubar a MA em coquetel de antibióticos e antifúngico em gela-deira durante 2 horas; • após, lavar a MA em solução salina para retirada dos antibióti- cos/antifúngico da MA - repetir este processo 2 vezes até estar totalmente transparente, caracterizado por: • acomodar as gazes sobre o campo plástico e colocar a MA sobre as compressas de gaze de acordo com os modelos definidos (fragmentos de 7cm (L) x 15cm (C) e acomodá-las com o lado estromal voltado para fora e epitelial em contato com a gaze; • enrolar o fragmento em um tubo de Teflon perfurado, de largura 10cm e diâmetro 8mm, de forma que a membrana fique pelo lado de fora do rolo e a gaze pelo lado de dentro; • o tubo plástico com a membrana enrolada ser congelado com DMSO em 10% em ultrabaixa temperatura de -150°C; • etiquetar cada embalagem criogênica com etiqueta criogênica contendo informações do produto, validade e modo de uso; • acomodar as embalagens identificadas nos cassetes metálicos; • realizar o congelamento, processo que dura cerca de 1 hora, conforme a curva padrão de congelamento programado; • ao término do congelamento programado, armazenar imediata-mente os cassetes metálicos contendo as embalagens de crio- preservação no tanque de armazenamento, em vapor de nitro-gênio.

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