EP4655574A1

EP4655574A1 - Kühlbarer träger sowie vorrichtung und verfahren zur herstellung gefrorener probensphären

Info

Publication number: EP4655574A1
Application number: EP24702693.3A
Authority: EP
Inventors: Hanno Hermann; Thanh Tu Hellmich-Duong; Irene Helbing
Original assignee: Applyo Jena GmbH
Current assignee: Applyo Jena GmbH
Priority date: 2023-01-26
Filing date: 2024-01-26
Publication date: 2025-12-03
Also published as: CN120826598A; WO2024156843A1; KR20250139294A; DE102023101970A1; DE102023101970B4; JP2026503524A; US20250354907A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen kühlbaren Träger (1), umfassend mindestens eine strukturierte Fläche (2) mit einer Mehrzahl von Aufnahmestrukturen (A), die jeweils der Aufnahme und Positionierung einer flüssigen Probe (5) dienen und wobei jede Aufnahmestruktur (A) eine insbesondere konkave Vertiefung (3) aufweist. Der Träger (1) ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einige der Aufnahmestrukturen (A) von der strukturierten Fläche (2) freigestellt sind, indem diese Aufnahmestrukturen (A) jeweils über eine diese Aufnahmestrukturen (A) unmittelbar umgebende Oberfläche (7) der strukturierten Fläche (2) ragen. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung des Trägers (1) und ein Verfahren zur Herstellung gefrorener Probensphären (10).

Description

Kühlbarer Träger sowie Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung gefrorener Probensphären

Die Erfindung betrifft einen kühlbaren Träger gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruchs, dessen Verwendung sowie eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Herstellung gefrorener Probensphären.

Im Folgenden werden unter dem Begriff der Cryo-Beads insbesondere kugelförmige gefrorene Lösungen (Probensphären) enthaltend unterschiedliche Wirkstoffe, insbesondere therapeutische Wirkstoffe, Hilfsstoffe, Enzyme, Proteine, genetisches Material, insbesondere Abschnitte von DNS und/oder RNS, Primer oder Oligonukleotide, Salze, organische Substanzen, Komplexe und/oder weitere Stoffe oder Moleküle, Vesikel, Chromosomen, Zellorganellen und vollständige Zellen verstanden, vorliegend auch als Reagenzmischung bezeichnet. Die Cryo-Beads können nach ihrer Herstellung vorteilhaft auch bei Vorliegen von Umgebungstemperaturen oberhalb ihrer jeweiligen Gefriertemperatur haltbar gemacht werden, indem den Cryo-Beads enthaltenes Wasser entzogen wird.

Der Vorteil solcher getrockneter Cryo-Beads liegt in der Transportierbarkeit von ursprünglich sensitiven Materialien ohne die zwingende Einhaltung von Kühlketten und somit deren Verwendbarkeit auch in Prozessen und/oder in Laboren von Ländern mit unvollständiger oder fehlender Kühl- Infrastruktur.

Um ein möglichst günstiges Verhältnis von mechanischer Stabilität sowie Volumen zur Oberfläche solcher Cryo-Beads zu erreichen, werden diese nach Möglichkeit als Kugeln hergestellt. In dieser Form sind sowohl die Cryo-Beads als auch ihre getrockneten Formen (Lyo-Beads) gegen mechanische Belastungen am stabilsten und können aufgrund ihrer kompakten Form einfach, ohne Materialverlust durch Abrieb und platzsparend transportiert und angewendet werden.

Aus dem Stand der Technik sind im Wesentlichen drei Methoden für die Herstellung von Cryo-Beads bekannt. Einer ersten Methodik folgend werden Eispartikel, z.B.

Trockeneispellets, mittels Stempel beziehungsweise Stempelpaaren und Matrizen zu Kugeln bzw. Pellets gepresst. Diese Methode ist allerdings für den Einsatz im pharmazeutischen und diagnostischen Umfeld technologisch schwer beherrschbar.

Bei Anwendung einer zweiten Herstellungsweise wird eine Reagenzmischung in beziehungsweise auf flüssigem Stickstoff oder anderen kryogenen Flüssigkeiten, zum Beispiel Silikonölen, gefroren. Ist die Menge der Tropfen der Reagenzmischung ausreichend gering, schweben infolge des „inversen Leidenfrost-Effekts“ die Flüssigkeitstropfen zunächst auf dem verdampfenden Stickstoff und erstarren kugelförmig. Durch Abkühlung der Flüssigkeitstropfen nimmt der Temperaturunterschied zum noch siedenden Stickstoff ab, so dass der Tropfen absinkt. Ist der Flüssigkeitstropfen zu groß beziehungsweise zu schwer, hält der verdampfende Stickstoff den Tropfen nicht an der Oberfläche. Beim Hinuntersinken erstarrt die Flüssigkeit dann tropfenförmig. Dieses gilt insbesondere bei nicht siedenden kryogenen Flüssigkeiten wie Silikonöl.

Infolge des Siedens des Stickstoffs können von einem noch flüssigen Tropfen kleine Volumina, sogenannte „Satellitentröpfchen“, abgelöst werden, was zu einer unerwünschten und nicht kontrollierbaren Mengenabnahme des Tropfens führt. Infolge des siedenden Stickstoffs bewegen sich die auf dem Stickstoffdampf schwebenden Tropfen hin und her und verschmelzen bei Kollision mit anderen Tropfen zu einem unerwünscht großen Tropfen. Daraus ergibt sich eine Mischung ungleich großer Beads, d.h. eine inhomogene Größenverteilung der Beads. Außerdem gelangen die Tropfen vor deren vollständigem Einfrieren unmittelbar mit dem Stickstoff und darin eventuell enthaltenen unreinen Substanzen bzw. das Produkt kontaminierenden Agenzien in Kontakt.

In einer dritten Herangehensweise werden jeweils Tropfen der zum Cryo-Bead zu verarbeitenden Lösung auf eine (ultra)kalte Platte aufgebracht, worauf sie gefrieren. Um ein Abkugeln der Tropfen (d.h. die Ausbildung einer Kugelform) zu unterstützen, kann die Platte zumindest an den dafür relevanten Bereichen ihrer Oberfläche abstoßende, insbesondere hydrophobe, Eigenschaften aufweisen. In der Regel werden mit dieser Methode Halbkugeln, Kugelsegmente oder abgeflachte, ellipsenartige Linsen erhalten, statt echte sphärische Formen zu erzeugen. Die auf einer Platte hergestellten Cryo-Beads müssen anschließend von dieser mechanisch abgelöst werden, wobei die einzelnen Cryo-Beads leicht beschädigt werden können und dann nicht mehr die angestrebte Form aufweisen und die gewünschte Menge an Reagenzmischung enthalten.

Beispiele für die Herstellung und optional für eine Trocknung der Cryo-Beads sind in den Dokumenten US 4,848,094, US 2014/0294872 A1 , US 2016/0252300 A1 , WO 2009/092703 A1 , WO 2010/125087 A1 und WO 2013/066769 A1 zu finden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine verbesserte Möglichkeit zur Herstellung gefrorener Probensphären vorzuschlagen. Es ist dabei Aufgabe der Erfindung, vorrichtungsseitige und verfahrensseitige Möglichkeiten zur Lösung der Aufgabe anzugeben.

Die Aufgabe wird mit einem Träger gemäß dem Gegenstand des Hauptanspruchs und dessen Verwendung sowie mit einer Vorrichtung und einem Verfahren gemäß den Gegenständen der nebengeordneten Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.

Der kühlbare Träger umfasst mindestens eine Fläche, die strukturiert ist mit einer Mehrzahl von Aufnahmestrukturen, die jeweils der Aufnahme und Positionierung einer vorbestimmten Menge, beispielsweise eines Aliquots, einer flüssigen Probe dienen, nachfolgend vereinfachend als "Probe" bezeichnet. Unter den Begriff einer flüssigen Probe fallen neben wässrigen Lösungen verschiedener Viskositäten auch Gele, insbesondere wenn diese aufgrund ihrer molekularen Wechselwirkungen unter geeigneten Bedingungen eine Kugelform (Sphäre) einnehmen können. Jede Aufnahmestruktur weist eine insbesondere konkave Vertiefung, auf. Die Aufnahmestrukturen sind dabei so ausgeführt, dass diese gegenüber der betreffenden Probe (Reagenzmischung) ein gewisses Haltevermögen gegen ein unerwünschtes Wegfließen oder Wegrollen zeigen. Kennzeichnend ist, dass wenigstens einige der Aufnahmestrukturen von der strukturierten Fläche freigestellt sind, indem diese jeweils über eine diese unmittelbar umgebende Oberfläche der strukturierten Fläche ragen. Ferner können wenigstens einige der Aufnahmestrukturen über denjenigen Bereich, über den sie mit der Probe in unmittelbarem Kontakt gelangen, optional eine, die Probe leicht bis moderat abstoßende, das heißt insbesondere hydrophobe, Beschichtung und/oder Oberflächenstruktur aufweisen, um die Ausbildung einer Sphäre zu unterstützen und um einen großen Kontaktwinkel zwischen Probe und Oberfläche des Trägers zu erreichen. Eine Abmessung der Vertiefung bedingt ebenfalls eine Positionierung insbesondere der noch flüssigen Probe und stellt einen mechanischen Raumwiderstand gegen ein Wegrollen der Probe dar.

Als Materialien des Trägers sind besonders solche geeignet, die eine effektive Kühlung der Aufnahmestrukturen erlauben, beispielsweise Metalle und metallische Legierungen, Komposite, insbesondere mit metallischen Lagen, also Materialien mit möglichst hoher Wärmeleitung.

In weiteren Ausführungen des erfindungsgemäßen Trägers ist der eine Vertiefung umgebende Bereich der Fläche ebenfalls mit einer (hydrophoben) Beschichtung und/oder Gestaltung der Oberfläche versehen, um einen möglichst großen Kontaktwinkel zwischen der Reagenzmischung und der Oberfläche zu erzielen.

In einer weiteren Ausführungsform ist um die in der strukturierten Fläche vorhandenen Vertiefungen jeweils ein um die Vertiefungen umlaufender Rand vorhanden. Dieser ragt über die strukturierte Fläche hinaus.

Die Vertiefung selbst weist vorteilhaft die Form eines Kugelsegments auf, um die Bildung einer Sphäre zu unterstützen. Das Kugelsegment ist charakterisiert durch den Radius der zugehörigen Kugel und die Höhe des Kugelsegments. Ist die Höhe des Kugelsegments gleich dem Radius der Kugel, entspricht das Kugelsegment einer Halbkugel. In bevorzugten Ausführungen ist das Kugelsegment flacher als eine Halbkugel, das heißt, das Verhältnis der Höhe des Kugelsegments zu dem Radius der Kugel ist kleiner als 1 , um ein Herauslösen der Cryo-Beads zu vereinfachen. In besonders bevorzugten Ausführungen ist das Verhältnis der Höhe des Kugelsegments zu dem Radius der Kugel kleiner als 0,7. Noch bevorzugter ist das Verhältnis der Höhe des Kugelsegments zum Radius der Kugel kleiner als 0,4.

Die von der strukturierten Fläche freigestellten Aufnahmestrukturen ragen vorteilhaft mindestens 1 nm, bevorzugt mindestens 0,1 pm, besonders bevorzugt mindestens 1 pm über die diese unmittelbar umgebende Oberfläche der strukturierten Fläche.

Hierzu kann um einige oder um alle der Aufnahmestrukturen eine Vertiefung bzw. ein Graben mit einem abtragenden Verfahren wie beispielsweise Fräsen, Funkenerodierung (Senk-, Bohr-, Drahterodierung etc.) erzeugt sein. Infolge ihrer derart erzeugten Freistellung umfassen die Aufnahmestrukturen basal eine Trägerstruktur, beispielsweise in Form einer Säule. Die Säule kann beispielsweise einen runden, ovalen oder n-eckigen Querschnitt aufweisen. Infolge ihrer Freistellung überragen die Aufnahmestrukturen ferner den Boden der sie unmittelbar umgebenden Vertiefung bzw. den Boden des sie unmittelbar umgebenden Grabens.

Vorteilhaft ist der Graben um eine einzelne Aufnahmestruktur wenigstens so groß, dass die lichte Breite der die Aufnahmestruktur umlaufenden Grabenwand mindestens dem Durchmesser der zu formenden Probensphäre entspricht.

Sind die auf der strukturierten Fläche vorhandenen Aufnahmestrukturen so nah beieinander angeordnet, dass sich deren jeweilige Gräben berühren oder einander ganz oder teilweise durchdringen, verbleiben von der ursprünglichen Oberfläche der strukturierten Fläche jeweils nur die Stirnflächen und/oder Reste der Grabenwände.

Die Grabenwände können bei einer vollständigen Durchdringung auch gänzlich wegfallen, sodass nur die Aufnahmestrukturen und optional eine außen um alle Aufnahmestrukturen angeordnete Berandung des Trägers wenigstens 1 nm über den Boden der Gräben ragen. Mit anderen Worten werden bei dieser Ausführung die Aufnahmestrukturen mit einem abtragenden Verfahren aus der ursprünglichen Oberfläche herausgearbeitet, ohne dass Sekundärstrukturen wie beispielsweise Grabenwandreste zwischen oder neben den Aufnahmestrukturen bestehen bleiben. Die optionale Berandung kann vorzugsweise als Auflage und Führung für einen Abstreifer (siehe weiter unten) dienen, mit dem die hergestellten gefrorenen Probensphären automatisiert von dem Träger entfernt werden können. In hierzu ähnlicher Weise können bei anderen Ausführungsformen einige oder alle der Aufnahmestrukturen die mindestens eine Fläche überragen, indem beispielsweise die Aufnahmestrukturen mit einem additiven Verfahren wie beispielsweise einem 3D- Druckverfahren (z.B. SLS, SLA, FDM etc.) oder Sputtern auf der Fläche erzeugt werden. Auch bei diesen Ausführungen umfassen die Aufnahmestrukturen basal eine Trägerstruktur, die insbesondere in Form einer Säule ausgebildet ist. Wiederum kann die Säule beispielsweise einen runden, ovalen oder n-eckigen Querschnitt aufweisen. Die Aufnahmestrukturen ragen wiederum wenigstens 1 nm über die strukturierte Fläche hinaus.

Um die Gefahr eines Verschmelzens zweier benachbarter Probensphären zu minimieren, beträgt der mittlere Abstand zwischen zwei Aufnahmestrukturen (das Abstandsmaß zwischen ihren gedachten Mittenlinien bzw. Längsachsen) vorteilhaft wenigstens dem einfachen und besonders bevorzugt wenigstens dem 1 ,1 -fachen Durchmesser der zu formenden Probensphären.

In jeder der genannten Ausführungsformen kann die Ausbildung einer Probensphäre unterstützt werden, indem ein Verhältnis eines Durchmessers der Vertiefung der Aufnahmestruktur zu einem Durchmesser der Aufnahmestruktur mindestens 0,7, vorteilhaft mindestens 0,8 und bevorzugt mindestens 0,9 beträgt. Das bedeutet, dass die über die unmittelbar umgebende Oberfläche ragende Aufnahmestruktur beziehungsweise der Rand (siehe oben) von seiner Außenseite bis zur Vertiefung jeweils lediglich einen recht scharf begrenzten und in einer Richtung parallel zur strukturierten Fläche möglichst gering ausgedehnten Bereich aufweist. Eine derartige Ausführung unterstützt die Ausbildung einer Probensphäre, da ein Kontakt mit einem Material höherer Dichte - und damit einer potenziell höheren Benetzbarkeit - reduziert ist. Auf diese Weise können selbst stark benetzende Reagenzmischungen mit kleinem Kontaktwinkel sicher in der Vertiefung der Aufnahmestruktur gehalten und eingefroren werden. Zusätzlich kann auch hier wieder eine beispielsweise hydrophob wirkende Beschichtung auf der Stirnseite des Randes beziehungsweise der Wandung der Vertiefung ausgebildet sein.

Die Aufnahmestrukturen können beispielweise Durchmesser aufweisen, die aus einem Bereich von 0,1 mm bis 20 mm ausgewählt sind. Damit können beispielsweise Volumina der flüssigen Probe von weniger als 1 pl bis 4000 pl aufgebracht und prozessiert werden. Je Träger sind vorteilhaft aber nicht ausschließlich Aufnahmestrukturen eines Typs und einer Dimensionierung vorhanden, um eine effiziente Herstellung gefrorener Probensphären zu erlauben.

Es ist auch möglich, Träger mit Aufnahmestrukturen unterschiedlicher Typen und/oder unterschiedlicher Dimensionierungen zu versehen. Derartige Träger sind beispielsweise verwendbar, um geeignete Aufnahmestrukturen für eine bestimmte Reagenzmischung (Probe) zu finden, zu testen und gegebenenfalls zu optimieren.

Die Erfindung dient nicht zuletzt dazu, eine effiziente Herstellung einer Vielzahl von gefrorenen Probensphären zu ermöglichen. Dazu sind die Aufnahmestrukturen vorteilhaft in einem regelmäßigen Muster, insbesondere zeilen- und/oder spaltenweise, auf der strukturierten Fläche des Trägers angeordnet. Eine Regelmäßigkeit der Anordnung erlaubt einerseits eine vorteilhafte Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Ausdehnung der strukturierten Fläche und andererseits eine vorhersagbare Positionierung der Vertiefungen beziehungsweise der gefrorenen Probensphären, um diese vorzugsweise automatisiert handhaben zu können (siehe unten).

Für eine effektive Beladung des Trägers sowie für eine ebenfalls einfache und möglichst automatisierbare Ablösung der gefrorenen Probensphären („Ernte“) ist der erfindungsgemäße Träger beispielsweise in Form einer Platte ausgebildet. Um mehrere plattenförmig Träger miteinander zu verbinden, kann ein Grundkörper des Trägers als ein Stab mit n-eckigem Querschnitt ausgebildet sein, wobei mindestens eine der n Seitenflächen eine strukturierte Fläche ist. Der mindestens eine plattenförmige Träger kann auswechselbar auf dem Grundkörper montiert sein. Ein solcher Grundkörper mit mehreren darauf vorhandenen strukturierten Flächen kann vorteilhaft um seine Längsachse gesteuert drehbar sein, sodass jeweils eine bestimmte Fläche einer vorgesehenen Arbeitsposition zugestellt werden kann. Beispielsweise kann eine der Fläche an ihrer aktuellen Position mit flüssiger Probe beladen werden, während eine andere Fläche an ihrer aktuellen Position abgeerntet wird.

Den Gedanken einer drehbaren Anordnung von Flächen weiter folgend, kann der erfindungsgemäße kühlbare Träger mit einer gewölbten strukturierten Fläche ausgebildet sein. Eine gewölbte strukturierte Fläche kann ein Zylinderabschnitt sein. Um eine gleichsinnige Bewegung eines Trägers mit einer gewölbten Fläche in Hinblick auf eine Automatisierung zu unterstützen, kann die gewölbte Fläche die Mantelfläche eines Zylinders sein.

Die Aufgabe der Erfindung wird neben dem erfindungsgemäßen Träger durch eine Vorrichtung zur Herstellung gefrorener Probensphären (Cryo Beads) gelöst. Die Vorrichtung umfasst mindestens einen erfindungsgemäßen Träger sowie eine Kühlvorrichtung zur Kühlung des Trägers. Die Kühlvorrichtung kann beispielsweise ein an dem Träger angeordnetes elektrisches Peltierelement sein. Alternativ kann eine Kältemaschine eine Kühlflüssigkeit an den Träger transportieren und der Träger kann Kühlkanäle aufweisen, durch die das Kühlmittel zirkuliert. Möglich ist auch eine Kühlung mittels flüssigem Stickstoff oder mittels Trockeneis; zur Vergrößerung der Oberfläche kann insbesondere die von der strukturierten Fläche abgewandte Seite (Unterseite) des Trägers zu diesem Zweck beispielsweise Kühlrippen aufweisen. Um bei der Verwendung der Vorrichtung hergestellte gefrorene Probensphären wieder von den Aufnahmestrukturen trennen zu können, ist ein Abstreifer vorhanden. Die strukturierte Fläche und der Abstreifer sind relativ gegeneinander beweglich angeordnet, wobei der Abstreifer entlang der ortsfesten Fläche, die strukturierte Fläche gegen den ortsfesten Abstreifer oder beide gegeneinander beweglich sein können.

Um die gefrorenen Probensphären aus den Vertiefungen zu entfernen, ohne dabei die Probensphären zu beschädigen, kann der Abstreifer mit einer geneigten Kontaktfläche ausgebildet sein. Die Neigung ist dabei vorteilhaft einer Richtung der Relativbewegung zwischen strukturierter Fläche und Abstreifer in einem stumpfem Winkel entgegen gerichtet, sodass der Abstreifer im Sinne eines Keils die gefrorenen Probensphären aus den jeweiligen Vertiefungen hebt, wie weiter unten noch beschrieben wird.

In einer weiteren Ausführung der Vorrichtung kann eine Einrichtung zum automatisierten Auftrag der flüssigen Probe in die Vertiefungen vorhanden sein, die beispielsweise als ein Pipettierkopf, ein Dispenser oder ein Mehrkanalpipettensystem, beispielsweise ein 12-Kanal- Pipettorsystem, ausgebildet sein kann. Wird beispielsweise ein Pipettierkopf in einem 16x24 Format verwendet, können zeitgleich 384 Vertiefungen mit flüssiger Probe befüllt werden.

Andere Raster oder Formate wie z.B. 1x8, 8x12, 32x48 etc. sind ebenso denkbar. Ein solche Parallelisierung des Vorgangs reduziert die sogenannte Cycle-Time je aufzubringender flüssiger Probe auf wenige Millisekunden im Gegensatz zu Verfahren des Standes der Technik, beispielsweise gegenüber dem Eintropfen in flüssigen Stickstoff.

Die Einrichtung sowie ein Antrieb des Trägers und/oder des Abstreifers können mittels einer Steuerung aufeinander abgestimmt angesteuert und bewegt beziehungsweise betätigt werden.

Bevorzugt kann die Vorrichtung in einer kontrollierten Gasatmosphäre betrieben werden. Hierfür kann die Vorrichtung eine Zuführung mit einer Austrittsöffnung für ein Gas und optional eine Einhausung aufweisen. Die Zuführung kann starr auf den Träger gerichtet oder beweglich angeordnet sein. Eine bewegliche Zuführung ermöglicht vorteilhaft ein Nachführen der Austrittsöffnung über eine jeweilige Pipettierposition. Die Einhausung kann zumindest den Träger und optional den Abstreifer, den Pipettierkopf und/oder die Kühlung umschließen. Bei dem Gas kann es sich insbesondere um ein Schutzgas oder um eine Gasmischung (auch atmosphärische Luft) mit einem möglichst geringem Wasseranteil handeln.

Der erfindungsgemäße Träger beziehungsweise die erfindungsgemäße Vorrichtung können in einem Verfahren zur Herstellung gefrorener Probensphären verwendet werden. Ein derartiges Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens eines erfindungsgemäßen Trägers oder einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Es folgt ein Aufbringen einer flüssigen Probe auf mindestens eine der Aufnahmestrukturen. Dabei kann die flüssige Probe beispielsweise durch Pipettieren oder Dispensieren aufgebracht werden. Dabei kann ein Gesamtvolumen V beispielsweise durch simultane Abgabe von einer der Anzahl der Aufnahmestrukturen entsprechenden Anzahl von Einzelvolumen, beispielsweise mittels eines entsprechend dimensionierten Pipettierkopfes, oder auch durch schnelle sequenzielle Abgabe von entsprechend vielen Tröpfchen mit Tröpfchen-Volumina TV im pL-, nL- oder pL- Bereich in Frequenzen f von wenigen Hz bis mehreren hundert kHz) aufgebracht werden. Für das Dispensieren gilt, dass die Kombination aus Gesamtvolumen V und Wiederholfrequenz f der Tröpfchen-Volumenabgaben TV so gewählt ist, dass die Gesamtdauer t der Gesamtvolumenabgabe V im Bereich t = 0.01 s bis t = 60 s, bevorzugt im Bereich t = 0.5 s bis t = 15 Sekunden, liegt. Andere Methoden des Liquid Transfers wie beispielsweise ultraschallbasierte Transfers oder andere sind ebenfalls denkbar.

Die in die jeweiligen Vertiefungen eingebrachte flüssige Probe wird stark gekühlt, sodass jeweils eine gefrorene Probensphäre erzeugt wird. Die Temperierung kann dabei mittels z.B. flüssigem Stickstoff, Trockeneis, elektrischen Peltierelementen, Kältemittel bereitgestellt von einer Kältemaschine usw. erfolgen. Für eine Temperierung wird der Träger selbst oder durch direkten Kontakt des Trägers mit zum Beispiel einer aktiv gekühlten Grundplatte gekühlt. Der Träger, insbesondere in einer Ausführung als Zylinder oder n-eckiger Säule, kann in weiteren Ausführungen durch Wirkung eines Kühlmittels (z.B. Flüssigstickstoff, temperiertes (Silikon)ÖI etc.) über eine Kältemaschine temperiert sein. Das Kühlmittel kann dabei den Träger durchfließen und gelangt nicht in direkten Kontakt mit der flüssigen Probe oder den gefrorenen Probensphären.

Zu Ernte der gefrorenen Probensphären werden diese optional durch Wirkung beispielsweise des Abstreifers von der jeweiligen Aufnahmestruktur entfernt. In weiteren Ausgestaltungen kann der Träger nach dem Gefrieren der Probensphären so orientiert werden, dass diese infolge der wirkenden Schwerkraft aus den Vertiefungen fallen und aufgefangen werden können. Dazu können die Vertiefungen beispielsweise mit einer Beschichtung und/oder Oberflächenstruktur versehen sein, auf der die gefrorene Probensphären beispielsweise in einer Schräg- oder Überkopfposition keinen hinreichenden Halt finden.

Die aufgefangenen Probensphären müssen weiterhin so stark gekühlt werden, dass diese keine unkontrollierte Temperatur-Erhöhung erfahren bzw. nicht wieder an- oder gar auftauen. Die so hergestellten gefrorenen Probensphären können im gekühlten Zustand aufbewahrt und später verwendet werden. Um diese jedoch auch bei Temperaturen oberhalb ihrer jeweiligen Gefriertemperatur lagern, transportieren und anwenden zu können, werden die Probensphären vorteilhaft getrocknet, insbesondere lyophilisiert.

Vorteile der Erfindung liegen zum Einem darin, dass die flüssige Probe und die gefrorenen Probensphären nicht in direkten Kontakt mit dem Kühlmittel gelangen und somit eine Kontamination ausgeschlossen werden kann. Es können gefrorene Probensphären mit einer geringen herstellungsbedingten Varianz ihrer Abmessungen bzw. ihres Volumens erzeugt werden, was für die Reproduzierbarkeit der Anwendungen von großer Bedeutung ist, bei denen die hergestellten Probensphären, ggf. im getrockneten Zustand, verwendet werden. Dementsprechend ist die Ausschussrate gering. Die effiziente Herstellung gepaart mit einem vergleichsweise einfachen Aufbau der Herstellungsvorrichtung erlaubt es, gefrorene Probensphären hoher Qualität mit kleinen und kostengünstigeren Anlagen zu produzieren.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können Probensphären beispielsweise ausgewählt aus einem Durchmesserbereich von 0,5 bis 20mm und mit Volumina von weniger als 1 bis zu 4000 pl hergestellt werden. In Versuchen wurden mehrere tausend Probensphären mit je 10 pL Volumen als Mock-Beads, ebenfalls mehrere tausend Stück RT- qPCR Beads mit Volumina von 5 pL, 10 pL und 25 pL sowie mehrere hundert Stück LAMP- Beads zu je 10 pL hergestellt, anschließend gefriergetrocknet und funktionell getestet. Die Leistungsparameter nach der Gefriertrocknung haben sich nicht vom Standardverfahren unterschieden. Die Anzahl der Zyklen kann 72.000 je Stunde erreichen, die Produktion von 125.000 Probensphären benötigt beispielsweise lediglich 1 ,75 Stunden.

In ihrem gefriergetrockneten Zustand können die erfindungsgemäß hergestellten Probensphären insbesondere als Vorstufen, beispielsweise als Zugabe für eine Nachweisreaktion oder als inaktive Vorstufe eines gebrauchsfertigen Reaktionsansatzes oder einer gebrauchsfertigen Pufferlösung etc. verwendet werden. Diese werden beispielsweise für RT-qPCR (und andere PCR Varianten), isothermale Amplifikation, Immunoassays, Enzyme und Proteine, konjugierte Antikörper, Collagene, pharmazeutische Wirkstoffe bzw. Therapeutika bzw. Medikamente etc. genutzt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers; Fig. 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 5 eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 6 eine schematische Darstellung eines sechsten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 7 eine schematische Darstellung eines siebten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 8 eine schematische Darstellung eines achten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 9 eine schematische Darstellung eines neunten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 10 eine schematische Darstellung eines zehnten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägers;

Fig. 11 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung gefrorener Probensphären;

Fig. 12 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung gefrorener Probensphären und

Fig. 13 ein schematischer Ablauf einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Darstellungen sind schematisch und nicht maßstäblich. Gleiche Bezugszeichen geben in den unterschiedlichen Abbildungen gleiche technische Elemente an.

Ein erfindungsgemäßer Träger 1 weist mindestens eine strukturierte Fläche 2, insbesondere eine Seitenfläche, auf, in der mindestens eine als eine Aufnahmestruktur A dienende Vertiefung 3 ausgebildet ist. In der Fig. 1 sind beispielhaft drei Zeilen mit jeweils drei Vertiefungen 3 gezeigt. Die Vertiefungen 3 sind insbesondere konkav in das Material des Trägers 1 hinein gewölbt und stellen beispielsweise je ein Kugelsegment dar. In einem zweiten Ausführungsbeispiel ist die Vertiefung 3 von einem Rand 4 umgeben (Fig. 2). Vertiefung 3 und Rand 4 bilden gemeinsam die Aufnahmestruktur A. Der Rand 4 ist an seiner der strukturierten Fläche 2 abgewandten Stirnfläche in radialer Richtung schmal gehalten, um einer in die Vertiefung 3 eingebrachten flüssigen Probe 5 (siehe Fig. 3) eine geringe potenzielle Benetzungsfläche zu bieten. In Fig. 2 ist beispielhaft lediglich eine Aufnahmestruktur A gezeigt. Ein Träger 1 kann jedoch eine Mehrzahl solcher Aufnahmestrukturen A aufweisen.

Um die potenzielle Benetzungsfläche gering zu halten und um die Ausformung der flüssigen Probe 5 zu einer Sphäre zu unterstützen, kann jede der Vertiefungen von einem Graben 6 umgeben sein, der zum Beispiel durch lokalen Materialabtrag der strukturierten Fläche 2 geschaffen ist. Die so geschaffene Aufnahmestruktur A ist freigestellt und ragt über die sie unmittelbar umgebende Oberfläche 7 (Boden des jeweiligen Grabens 6). Infolge der Freistellung umfasst die Aufnahmestruktur A eine basal angeordnete Trägerstruktur T. In Fig. 3 sind zwei verschiedenen Ausformungen von Aufnahmestrukturen A zu sehen. Rechts im Bild weist die als Säule verbliebene Aufnahmestruktur A einen vergleichsweise geringen Durchmesser und eine nur sehr flache Vertiefung 3 auf. Eine solche Ausführung ist beispielsweise für kleine Mengen einer flüssigen Probe 5 und/oder für Reagenzmischungen mit einem starken Bestreben sich abzukugeln geeignet.

Auf einer der links im Bild gezeigten Aufnahmestrukturen A ist eine flüssige Probe 5 aufgebracht. Deren Menge und deren Zusammensetzung erlaubt aufgrund molekularer Wechselwirkungen die Ausbildung einer Kugelform (Sphäre). Dieser Vorgang wird zudem dadurch unterstützt, dass die Vertiefung ausgeprägt als ein Kugelsegment ausgebildet ist.

In dem zu Fig. 4 dargestellten vierten Ausführungsbeispiel sind die Positionierungen der einzelnen Aufnahmestrukturen A so nah beieinander und die jeweiligen Gräben 6 so groß dimensioniert, dass sich Letztere teilweise durchdringen. Im Beispiel steht ein Durchmesser D1 der Vertiefung 3 mit einem Durchmesser D2 der Aufnahmestruktur A in einem Verhältnis von etwas mehr als 0,7. Die der verbleibenden Oberfläche 7 abgewandte kreisringförmige Stirnfläche der Aufnahmestruktur A kann optional mit einer für die flüssige Probe 5 abstoßenden Beschichtung und/oder Oberflächenstrukturierung versehen sein.

Eine noch ausgeprägtere gegenseitige Durchdringung der Gräben 6 ist zu einem fünften Ausführungsbeispiel in der vergrößerten Detaildarstellung zu sehen (Fig. 5). Von der ursprünglichen Fläche 2 sind lediglich einige Säulen mit kissenförmigen Querschnitten verblieben. Der Träger 1 ist als eine Platte im SBS-Format ausgebildet und weist 768 Aufnahmestrukturen A zur Herstellung von gefrorenen Probensphären 5 (Fig. 3) oder 10 (Cryo-Beads, siehe Fig. 11) mit je 10 pl auf. Die Aufnahmestrukturen A sind in Zeilen und Spalten angeordnet, wobei jede zweite um die Distanz einer Aufnahmestruktur A und eines Anteils des Durchmessers des sie umgebenden Grabens 6 in Richtung der Spalten gegeneinander versetzt, um den verfügbaren Platz effektiv zu nutzen.

Die Fig. 6 zeigt ein sechstes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Trägers 1 mit ebenfalls in Zeilen und Spalten angordneten und gegeneinander versetzten Aufnahmestrukturen A, deren Gräben 6 sich gegenseitig teilweis durchdringen. Die Anzahl der Aufnahmestrukturen A beträgt im Beispiel 192.

Der gleichen grundsätzlichen Ausführungsform folgt ein siebtes Ausführungsbeispiel (Fig. 7) mit 384 Aufnahmestrukturen A.

Dagegen durchdringen sich die Gräben 6 der 384 Aufnahmestrukturen A gemäß eines achten Ausführungsbeispiels nicht (Fig. 8). Diese sind wiederum in Zeilen und Spalten angeordnet, ohne allerdings gegeneinander versetzt zu sein.

Ebenfalls keinen gegenseitigen Versatz weisen die Aufnahmestrukturen A beziehungsweise die Vertiefungen 3 auf der strukturierten Fläche 2 eines als Ausschnitt gezeigten Trägers 1 in Form einer Platte gemäß eines neunten Ausführungsbeispiels gemäß Fig. 9 auf. Der Träger 1 besitzt eine Anzahl unterschiedlich ausgebildeter Aufnahmestrukturen A, wobei die Aufnahmestrukturen A jeweils zweier benachbarter Spalten gleich sind. Der besseren Übersichtlichkeit halber sind die Aufnahmestrukturen A in Richtung der Zeilen einer von drei Sektionen S1 bis S3 zugeordnet. Die am weitesten rechts gezeigten Aufnahmestrukturen A der ersten Sektion S1 sind als konkave Vertiefungen 3 in der strukturierten Fläche 2 ausgebildet.

Nach links folgen Aufnahmestrukturen A der zweiten Sektion S2, die jeweils von einem Graben 6 umgeben sind, wobei sich die Gräben nicht gegenseitig durchdringen. Die Relationen der Durchmesser der Aufnahmestrukturen A und der im Durchmesser gleichbleibenden Gräben 6 ändern sich alle zwei Spalten, wobei die Aufnahmestrukturen A jeweils sehr flache Vertiefungen 3 aufweisen.

In der dritten Sektion S3 sind die Aufnahmestrukturen A ebenfalls mit Gräben 6 umgeben. Die Relationen der Durchmesser der Aufnahmestrukturen A und der im Durchmesser gleichbleibenden Gräben 6 nehmen nach links zu, d.h. die Durchmesser der Aufnahmestrukturen A werden alle zwei Spalten kleiner. Die auf den dem Betrachter zugewandten Stirnseiten vorhandenen Vertiefungen 3 sind konkav, insbesondere in Form von Kugelsegmenten, ausgebildet.

Ein gemäß des neunten Ausführungsbeispiels ausgebildeter Träger 1 kann vorteilhaft verwendet werden, um für eine bestimmte Reagenzmischung und/oder für gewünschte Volumina der herzustellenden gefrorenen Probensphären 10 eine geeignete Aufnahmestruktur A zu ermitteln. Dies geschieht vorteilhaft unter Beachtung des Zusammenwirkens mit jeweiligen Herstellungsbedingungen wie zum Beispiel einer jeweiligen T emperatur des T rägers 1 und der flüssigen Probe 5 und einer Zeitspanne für das Ausbilden einer Probensphäre und deren vollständigen Überführung in den gefrorenen Zustand.

Die oben beschriebenen Träger 1 in Form von Platten können in manuellen oder automatisierten Herstellungsverfahren für gefrorene Probensphären 10 verwendet werden. Um eine kontinuierliche Beladung des Trägers 1 mit der flüssigen Probe 5 und der Ernte gefrorener Probensphären 10 zu fördern, ist gemäß eines zehnten Ausführungsbeispiels der Träger 1 mit einem zylinderförmigen oder n-eckigen Grundkörper 11 ausgebildet. In der Fig. 10 ist ein Träger 1 gemäß eines zehnten Ausführungsbeispiels mit einem zylinderförmigen Grundkörper 11 gezeigt, dessen nach außen weisende Oberfläche durch die strukturierte Fläche 2 gebildet ist. Die Aufnahmestrukturen A sind zeilenweise angeordnet, wobei benachbarte Zeilen im gezeigten Ausführungsbeispiel gegeneinander versetzt sind, um eine bessere Ausnutzung der verfügbaren Flächengröße zu erreichen.

Der walzenförmige Träger 1 kann in einer Vorrichtung 8 vorhanden sein (siehe auch Fig. 11 ). Dabei kann das Beladen der Aufnahmestrukturen A mit der flüssigen Probe 5 mittels einer dafür ausgebildeten Einrichtung 13 erfolgen, die beispielsweise als Dispensier- oder Pipettierkopf 17 ausgebildet sein kann.

Ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 8 zur Herstellung gefrorener Probensphären 10 ist vereinfacht in Fig. 11 dargestellt. Der Träger 1 wird mittels einer Kühleinrichtung 9 auf die gewünschte Temperatur gebracht und gehalten. Die flüssige Probe 5 wird mittels einer als Pipettierkopf 17 realisierten Einrichtung 13 zum Aufbringen der flüssigen Probe 5 in die jeweilige Vertiefung 3 einer Aufnahmestruktur A (siehe oben) eingebracht und gefriert dort. Die so hergestellten gefrorenen Probensphären 10 werden mittels eines Abstreifers 14 aus den Vertiefungen 3 entfernt. Dies kann rein mechanisch mittels einer durch den Abstreifer 14 auf die gefrorene Probensphäre 10 übertragenen Druckkraft erfolgen. Sind die Vertiefungen 3 als Kugelsegment, insbesondere als (nahezu) Halbkugelsegmente ausgebildet, ist ein geneigter Abstreifer 14 von Vorteil. In Fig. 11 ist ein Abstreifer 14 gezeigt, dessen Kontaktfläche 15 entgegen einer Relativbewegung in Bezug auf den Träger 1 geneigt ist. Eine vorhandene Steuerung 12 ist in einer zur Übertragung von Daten geeigneten Weise mit dem Pipettierkopf 17, einem Antrieb 16 für den Abstreifer 14 und der Kühleinrichtung 9 verbunden und steuert diese mit Steuerbefehlen an.

Im Beispiel wird der Abstreifer 14 gesteuert von links nach rechts gegen die gefrorenen Probensphären 10 geführt. Die Kontaktfläche 15 des Abstreifers 14 ist nach links geneigt, sodass diese wie ein Keil die gefrorenen Probensphären 10 aus den entsprechenden Vertiefungen 3 hebt, ohne dabei die gefrorenen Probensphären 10 zu beschädigen. Eine Relativbewegung zwischen Träger 1 und Abstreifer 14 wird mittels des Antriebs 16 erzeugt.

Außerdem weist die Vorrichtung 8 der Fig. 11 eine Zuführung 19 auf, über die ein Schutzgas an den Träger 1 geleitet werden kann. Zur optimalen Aufrechterhaltung einer kontrollierten Gasatmosphäre ist die Vorrichtung 8 zudem mit einer Einhausung 18 versehen.

In dem Ausführungsbeispiel der Fig. 12 ist eine Vorrichtung 8 mit einem kühlbaren walzenförmigen Träger 1 (vgl. Fig. 10) kombiniert. Der walzenförmige Träger 1 dreht sich nach jeder Abgabe von flüssigen Probentröpfchen 5 aus den zeilenförmig auf der gekrümmten strukturierten Fläche 2 angeordneten Aufnahmestrukturen A um eine Position weiter. Nach einer Drehung von > 90° bis < 360°, bevorzugt zwischen > 180° bis < 360° und idealerweise bei 270° erreichen die bereits applizierten und inzwischen gefrorenen Probensphären 10 den bevorzugt stationären Abstreifer 14. Bei der weiteren Drehung des Trägers 1 werden die Probensphären 10 gegen den Abstreifer 14 gedrückt und dadurch aus den Vertiefungen 3 herausgelöst bzw. geerntet. Auch in diesem Ausführungsbeispiel ist die Kontaktfläche 15 des Abstreifers 14 geneigt.

Die geernteten gefrorenen Probensphären 10 können in einen Sammelbehälter zur weiteren Bearbeitung oder Lagerung gelangen. Um die gefrorenen Probensphären 10 auch ohne weitere Kühlung lagern, transportieren und verwenden zu können, werden diese vorteilhaft nachfolgend gefriergetrocknet (lyophilisiert).

Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 13 vereinfacht dargestellt. Nachdem mindestens ein erfindungsgemäßer Träger 1 bereitgestellt ist, wird dieser auf eine Prozesstemperatur gekühlt, bei der die zu verwendende Reagenzmischung gefriert. Die Prozesstemperatur liegt dabei typischerweise in einem Bereich zwischen 10 K und 350 K, vorteilhaft 75 K bis 277,15 K. Als vorteilhaft gilt eine Temperatur des Trägers 1 in einem Bereich von ± 50K um die Schmelztemperatur T_m oder der eutektischen Temperatur T_eut der Reagenzmischung oder der Kollapstemperatur Tc.

Auf den die gewünschte Prozesstemperatur aufweisenden Träger 1 werden die entsprechenden Volumina flüssiger Probe 5 in die jeweiligen Vertiefungen 3 der Aufnahmestrukturen A eingebracht. Dort formen die jeweiligen Volumina der flüssigen Probe 5 aufgrund molekularer Wechselwirkungen der Inhaltsstoffe eine Sphäre, die nachfolgend eingefroren wird.

Die so erzeugten gefrorenen Probensphären 10 werden geerntet und nachfolgend optional getrocknet. Bezuqszeichen

1 Trager

2 strukturierte Fläche

3 Vertiefung

3a Stirnfläche

3b Trägerstruktur

4 Rand

5 flüssige Probe

6 Graben

7 Grabenboden, verbleibende Oberfläche

8 Vorrichtung

9 Kühlvorrichtung

10 gefrorene Probensphäre

11 Grundkörper

12 Steuerung

13 Einrichtung

14 Abstreifer

15 Kontaktfläche

16 Antrieb

17 Pipettierkopf

18 Einhausung

19 (Schutzgas-)Zuführung

A Aufnahmestruktur

D1 Durchmesser der Vertiefung 3 D2 Durchmesser der Aufnahmestruktur 3

T Trägerstruktur

Claims

Patentansprüche

1. Kühlbarer Träger (1), umfassend mindestens eine strukturierte Fläche (2) mit einer Mehrzahl von Aufnahmestrukturen (A), die jeweils der Aufnahme und Positionierung einer flüssigen Probe (5) dienen, wobei jede Aufnahmestruktur (A) eine insbesondere konkave Vertiefung (3) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einige der Aufnahmestrukturen (A) von der strukturierten Fläche (2) freigestellt sind, indem diese Aufnahmestrukturen (A) jeweils über eine diese Aufnahmestrukturen (A) unmittelbar umgebende Oberfläche (7) der strukturierten Fläche (2) ragen.

2. Kühlbarer T räger (1 ) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens einigen der Aufnahmestrukturen (A) eine basal angeordnete Trägerstruktur (T) umfassen.

3. Kühlbarer T räger (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass um die wenigstens einigen der Aufnahmestrukturen (A) je ein Graben (6) in der strukturierten Fläche (2) ausgebildet ist.

4. Kühlbarer T räger (1 ) nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung (3) auf einer Stirnfläche (3a) jeder Aufnahmestruktur (A) ausgebildet ist.

5. Kühlbarer T räger (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung (3) die Form eines Kugelsegmentes aufweist.

6. Kühlbarer T räger (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmestrukturen (A) Durchmesser ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 mm bis 20 mm aufweisen.

7. Kühlbarer Träger (1) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verhältnis eines Durchmessers der Vertiefung (3) zu einem Durchmesser der Aufnahmestruktur (A) mindestens 0,7, vorteilhaft mindestens 0,8 und bevorzugt mindestens 0,9 beträgt.

8. Kühlbarer T räger (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmestrukturen (A) zeilen- und/oder spaltenweise auf der strukturierten Fläche (2) ausgebildet sind.

9. Kühlbarer Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1 ) in Form einer Platte ausgebildet ist.

10. Kühlbarer T räger (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Grundkörper (11 ) des Trägers (1 ) als ein Stab mit n-eckigem Querschnitt ausgebildet ist und mindestens eine der n Seitenflächen eine strukturierte Fläche (2) ist.

11. Kühlbarer T räger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (1 ) mit einer gewölbten strukturierten Fläche (2) ausgebildet ist.

12. Vorrichtung (8) zur Herstellung gefrorener Probensphären (10) umfassend einen

Träger (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, eine Kühlvorrichtung (9) zur Kühlung des Trägers (1) und einen Abstreifer (14) mit geneigter Kontaktfläche, der dem Abstreifen auf den Aufnahmestrukturen (A) vorhandener gefrorener Probensphären (10) dient, wobei der T räger (1 ) und der Abstreifer (14) relativ zueinander bewegbar sind.

13. Vorrichtung (8) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (8) zum Zweck des Betriebs in einer kontrollierten Gasatmosphäre eine Zuführung mit einer Austrittsöffnung für ein Gas und optional eine zumindest den T räger (1 ) umschließende Einhausung aufweist.

14. Verwendung eines T rägers (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Verfahren zur Herstellung gefrorener Probensphären (10).

15. Verfahren zur Herstellung von Probensphären (10), umfassend die Schritte

- Bereitstellen eines Trägers (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ; - Aufbringen einer flüssigen Probe (5) auf mindestens eine der gekühlten Aufnahmestrukturen (A);

- Gefrieren der flüssigen Probe (5), sodass eine gefrorene Probensphäre (10) erzeugt wird; und - optional Abstreifen der gefrorenen Probensphäre (10) von der jeweiligen

Aufnahmestruktur (A).

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probensphären (10) getrocknet, insbesondere lyophilisiert, werden.