WO2011124667A2 - Verfahren zur herstellung von im wesentlichen kugelförmigen lyophilisaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von im wesentlichen kugelförmigen lyophilisaten Download PDF

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WO2011124667A2
WO2011124667A2 PCT/EP2011/055476 EP2011055476W WO2011124667A2 WO 2011124667 A2 WO2011124667 A2 WO 2011124667A2 EP 2011055476 W EP2011055476 W EP 2011055476W WO 2011124667 A2 WO2011124667 A2 WO 2011124667A2
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freeze
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hydrophobic
reagent
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Andy Wende
Markus Jesziorski
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Qiagen Gmbh
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
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    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1688—Processes resulting in pure drug agglomerate optionally containing up to 5% of excipient

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of a substantially spherical lyophilisate.
  • the present invention further provides corresponding lyophilizates prepared by the process according to the invention and their specific use.
  • the present invention furthermore relates to the combined use of hydrophilic and hydrophobic phases for producing substantially spherical liquid volumes in the context of freeze-drying.
  • Freeze-drying also known as lyophilization or sublimation drying, is a process for gently drying high-quality products.
  • freeze-drying the ice crystals evaporate directly without the transition to the liquid state.
  • the final product of the freeze-drying is called lyophilisate.
  • freeze-drying is used to stabilize and preserve liquid reagent formulations, such as pharmaceuticals and enzyme solutions. For example, with this method it is possible to maintain the activity of sensitive enzymes at room temperature for a long time.
  • the lyophilisate is treated with an adaguative solvent, which is usually water This leads to an immediate re-dissolution of the dried ingredients, which then re-unfold their original effect in solution,
  • pulverulent formulations or porous freeze-drying cakes which are usually dried in a glass vessel equipped with a septum and subsequently sealed, are also suitable.
  • lyophilized samples in spherical form which have several advantages over lyophilizates with other geometric shapes:
  • the spherical shape of corresponding lyophilisates makes it possible or easier for the specimens to be assembled later by virtue of their compact and well-defined geometry and their free-flowing properties
  • spherical lyophilizates are inherent in that nonspecific adsorption of reagents to, for example, surfaces of the container in which the sample is lyophilized is nearly eliminated or significantly reduced.
  • cryogronulation is described, for example, in WO 03/020959 A, WO 2005/058474 A and in the article "Cryogranulation: A Potential New Final Process for Bulk Drug Substances", D, J, Schmidt et al., Biopharm, 1997 (pages 28 et seq.),
  • the processes described herein being disadvantageous in that they lead to a very rapid cooling of the reagents to be freeze-dried; processes for the preparation of spherical lyophilisates are known per se,
  • US 2005/0069898 A discloses the production of lyophilized spheres by a process in which an aqueous solution of the substance to be freeze-dried is first prepared.
  • a spherical formulation of the solution is obtained by collecting the emulsion on a support, such as a glass
  • the solution can also be introduced in liquid nitrogen.
  • the emulsion is then snap-frozen and can then be subjected to freeze-drying.
  • Further drying processes described in US 2005 / 0069898 A are simple vacuum drying and evaporation, In order to avoid agglomeration of the spherical volumes during drying, they are kept at a distance by suitable devices.
  • a disadvantage of this method is that it can only be carried out batchwise.
  • a further disadvantage consists in the handling of liquid nitrogen, which is indispensable for the process, and which leads to a high cooling rate of the sample when freezing is carried out, which, in addition, can not be influenced. High cooling rates can lead to a loading of the substance to be lyophilized Lead the sample,
  • WO 2008/144063 A A similar process for the preparation of spherical lyophilizates is disclosed in WO 2008/144063 A, in which the freeze-drying of a sucralose solution is described.
  • the sucralose solution is brought into contact with a cold surface or a cold fluid in order to freeze the solution.
  • the frozen solution is freeze-dried.
  • a droplet shape of the solution to be freeze-dried is initially produced.
  • this formation of the drop shape takes place spontaneously by introducing the solution to be freeze-dried into liquid nitrogen.
  • the use of liquid nitrogen also leads to high cooling rates and thus to a loading of the sample to be lyophilized.
  • solutions to be freeze-dried can also be sprayed in drop form into a gas carrier, the gas being cold enough to freeze the droplets , followeded by the freeze-drying of the frozen droplets,
  • gas carrier the gas being cold enough to freeze the droplets
  • lyophilisates have a spherical structure
  • a further procedure for the production of freeze-dried spherical shaped bodies is to dispense a liquid onto a cryogenically cooled hydrophobic surface, for example of diamond, silicon dioxide or PTFE.
  • the dispensing rate must be empirically determined for different sample volumes Ball volume is limited to 35 ⁇ ⁇ .
  • a corresponding method is described, for example, in US 2007/0259348 A,
  • the lyophilized spheres are always transferred after their respective production in a second operation in the final used transport, storage or reaction vessel, which is also cumbersome and especially for sensitive reagents to a decomposition or worsening the reagent,
  • the present invention is now to improve the known methods for manufacturing spherical lyophilisates by freeze-drying, in particular in view of the above-mentioned disadvantages, the object, particularly, it is an object of the present invention, a method for producing spherical lyophilisates by freeze-drying be ⁇
  • the present invention preferably has the object of providing a process for the preparation of spherical lyophilisates by freezing To provide drying, with which a continuous production of freeze-dried moldings is possible,
  • Another object which is preferably solved by the present invention, is the provision of a process for the preparation of freeze-dried lyophilizates, in which a handling of cryogenic substances, such as liquid nitrogen, is not required, the method should be simple and inexpensive to carry out ,
  • the present invention is intended to solve the particular object to provide a process for the preparation of freeze-dried lyophilizates serzustel ⁇ len, wherein the lyophilized form body no longer permanently used after their respective manufacture in the transport, storage or reaction must be transferred onsgefäß.
  • a method is preferably sought, which can already be carried out in suitable transport or storage vessels. These vessels should also be able to act in particular eakfionsgefäße in which the lyophilizates are reacted again erneuf later.
  • the present invention also provides, in particular, the object of providing a process for the production of freeze-dried shaped bodies, in which high cooling rates, such as, for example, from about 50 to 100 ° C. per second, which can lead to damage in the case of sensitive substances, are avoided become,
  • the object of the present invention is based on a process for the preparation of a molded article containing at least one reagent by freeze-drying a liquid Phase comprising the at least one reagent, characterized by the following process steps:
  • step (3) freezing the first phase in the two-phase system resulting from step (2) and removing the second phase from the system;
  • a liquid phase which comprises the reagent to be freeze-dried is first aliquoted into individual discrete predetermined volumes, i.
  • This aliquoting of the liquid phase is preferably designed so that any but predeterminable or predetermined volumes of individual aliquots are obtained. Procedures for generating corresponding volumes will be described in more detail later.
  • the lyophilisates have a volume which corresponds to the volume of the first phase
  • the volume of the lyophilisate is smaller than the liquid volume of the first phase, since freeze-drying removes the liquid phase in which the reagent was first dissolved or emulated,
  • the volumes of the lyophilisate may also be greater than the volumes of the first phase.
  • freeze-drying additives are, for example, sugar compounds such as sugar alcohols. Since the lyophilizate may expand slightly during freezing and the freeze-drying additives can thus build up an additive skeleton which may also be slightly larger than the original liquid phase, the lyophilizate may also be slightly larger than the volume of the first liquid phase in which the reagent is present.
  • the freeze-drying reagent can be dissolved or suspended in the liquid phase.
  • the reagent to be freeze-dried is in a suspension, it is preferred that the emulsion remains homogeneous until the time of complete freezing by the cooling and does not separate.
  • the first phase is preferably aliquoted; i.e. the volume of the first phase is divided into smaller individual volumes, in particular predefined volumes.
  • the aliquoting of the liquid phase which comprises at least one reagent in the first process step takes place by the combined use of a hydrophilic and a hydrophobic phase.
  • a hydrophilic phase and a hydrophobic phase are in particular understood to be phases which essentially do not are miscible with each other,
  • the method according to the invention is based on the finding that liquids which are introduced into an immiscible second liquid spontaneously form a spherical shape. If now a liquid phase which comprises a reagent to be freeze-dried miscible in a liquid not miscible with this liquid phase When a liquid is introduced, a spherical shape of the liquid phase containing the reagent spontaneously forms.
  • the first and the second phase are configured such that at a temperature of generally at least 5 ° C, preferably at least 10 ° C, more preferably at least 15 ° C, even more preferably at least 20 ° C, un ⁇ terrenz the freezing point of the first Phase, which contains the reagent to be freeze-dried, both phases are not miscible with each other and it comes in the contacting of the first and the second phase to a phase separation, not miscible with each other is understood in the present invention that the first phase coincide with the second phase to less than 10% by volume, more preferably less than 5% by volume, most preferably less than 1% by volume.
  • the reagent to be obtained as freeze-dried lyophilisate is in the hydrophilic phase
  • This hydrophilic phase is introduced into the hydrophobic phase.
  • discrete specific volumes of hydrophilic phase preferably in spherical form, can be obtained in the hydrophobic phase by introducing the hydrophilic phase into the hydrophobic phase.
  • there is at least one reagent there is at least one reagent,
  • the melting point of the hydrophobic phase is located in this first exemplary form preferably at least 10 ° C, more preferably 15 ° C, in particular ⁇ sondere 20 ° C lower than the melting point of the hydrophilic phase, so that by freezing the mixture of hydrophilic and hydrophobic
  • the hydrophobic phase can be removed without residue. This can be done, for example, by cooling the hydrophilic and hydrophobic phase to a temperature which is lower than the melting point of the hydrophilic phase which freezes therewith and is higher than the melting point of the hydrophobic phase which remains liquid with it.
  • the two phases can be separated by conventional solid-liquid separation processes
  • the process is preferably carried out on a glass frit, so that the hydrophobic phase remaining in the liquid state can be sucked through the frit bottom.
  • alternative separation processes for the liquid hydrophobic phase from the hydrophilic phase such as decantation of the liquid hydrophobic phase from the solid frozen hydrophilic phase, can be applied
  • the densities of the hydrophilic and hydrophobic phases are matched so that the density of the hydrophilic phase is approximately equal to or greater than that of the hydrophobic phase.
  • the frit bottom can be soaked with the hydrophobic phase when using a glass frit, for example When the hydrophilic phase touches the ground, dissolution of the spherical structure of the hydrophilic phase may occur
  • the method according to the invention is characterized by the following method steps:
  • step (1.3) the mixture of hydrophilic and hydrophobic phase is frozen, so that the hydrophilic phase becomes solid and the hydrophobic phase remains liquid.
  • the rate of freezing can vary in white areas and in the case of sensitive to lyophilized.
  • the process according to the invention differs from the usual methods of cryogranulation known from the prior art and previously referenced, in which the liquid phase containing the reagent to be freeze-dried is directly associated with the reagents the cryogenic coolant, such as liquid nitrogen, is brought into Confakt. In this case, the reagent is, so to speak, flash-frozen, which can be an after-arrow for sensitive reagents,
  • the hydrophilic phase in which the at least one reagent which is to be subjected to freeze-drying is present, it is preferably an aqueous phase in which the reagent is dissolved or suspended,
  • hydrophobic phases all liquids are conceivable, which are liquid in a suitable temperature range (less than -10 ° C and greater or equal to +40 ° C) and do not interfere with the hydrophilic, preferably aqueous phase,
  • the hydrophobic phase preferably the previously described melting point (in relation to the hydrophilic phase)
  • Suitable hydrophobic phases are in particular silicone oils, paraffin oils and mineral oils, such as alkanes in the Keftenin Rail of C 7 (Hepfan) to C, 2 (Dodecane), since these have a melting point of -92 ° C (C 7 ) or, -10 ° C. (C 12 ) and a boiling point of 98 ° C (C 7 ) and 216 ° C (C, 2 ).
  • Other suitable hydrophobic phases are organic oils based on plants or animals, such as algae and yeasts, as far as their melting temperature is below -10 ° C is particular examples are unsaturated oleic acids,
  • silicone oils are particularly preferred. Furthermore, the use of silicone oils as the hydrophobic phase and of aqueous solutions or suspensions as the hydrophilic phase is particularly preferred.
  • the advantage of silicone oils as a hydrophobic phase is that they can be used in one very wide temperature range are liquid, they are very inert and often biokompati ⁇ bel,
  • silicone oil is the silicone oil DC200 from Dow Chemical.
  • the reagent to be lyophilized is present in the hydrophobic phase.
  • This hydrophobic phase is then introduced into the hydrophilic phase.
  • hydrophobic phases which have a melting point which is higher by at least 10 ° C, more preferably 15 ° C, in particular 20 ° C, than the melting point of the hydrophilic phase, so that upon cooling the re - sulting mixture initially comes only to a freezing of the hydrophobic phase, the hydrophilic phase may then - to identical or ähnli ⁇ che manner as in the first embodiment for the hydrophobic phase - are removed from the mixture, the remaining frozen hydrophobic phase is then finally fed to a freeze-drying,
  • the method according to the invention is characterized-by analogy with the first embodiment-by the following method step: (2.1) provision of a hydrophobic phase which contains at least one reagent to be freeze-dried;
  • step (2.3) freezing the hydrophobic phase in the hydrophilic and hydrophobic phase system resulting from step (2.2) and removing the hydrophilic phase from the system;
  • suitable phases for this second embodiment are water, methanol and formamide as the hydrophilic phase and silicone oils; oils; fats; essential oils of plants, animals and unicellular organisms; long-chain alkanes with C 11 chain lengths or longer carbon chains and benzene as the hydrophobic phase.
  • the hydrophilic and hydrophobic phases are preferably PCR-tolerant and tolerant to enzymatic reactions.
  • PCR-tolerant is understood to mean when the hydrophobic and hydrophilic phases used to prepare the solid spherical reagents are not lead to changes in product quality or quantity in a subsequent PCR, compared to the use of appropriate reagents which may substitute any freeze-drying, a vascular rierfrocknung without Ver ⁇ application of the hydrophobic and hydrophilic phases were subjected.
  • tolerance to enzymatic reactions is understood as meaning that the hydrophobic and hydrophilic phases used to prepare the solid spherical reagents do not lead to changes in the product quality or quantity or the enzymes used in a subsequent enzymatic reaction. tion, in comparison to the use of the corresponding reagents, which were not subjected to freeze-drying or freeze-drying without the use of the hydrophobic and hydrophilic phases,
  • the hydrophobic (first embodiment) or hydrophilic (second embodiment) phase used to form the beads may have an uneven surface and a coarse-pored internal structure.
  • Corresponding freeze-dried shaped articles obtained with complete removal of the phase for forming the spherical geometry are shown in Figure la).
  • the spherical structures shown in FIG. 1 b) result if the hydrophobic or hydrophilic phase obtained to form the spherical geometry is not completely removed,
  • the entry of the liquid phase containing the at least one Rea ⁇ gence, in the hydrophobic phase (first embodiment) or the hydrophilic phase (second embodiment) can be at room temperature or at a slightly reduced temperature, for example at temperatures of up to - 30 ° C , be performed. It is advantageous if the vessel in which the ball is to be produced, as far as possible has no smooth walls and no smooth floor, since the initially spherical solution during freezing adapt to the surface geometry of the container and thereby lose its Kugeiforrn. In the context of the present invention, the first embodiment is particularly preferred
  • the freeze-drying By the freeze-drying, the spherical structures formed by introducing the hydrophilic phase into the hydrophobic phase (first embodiment) or by introducing the hydrophobic phase into the hydrophilic phase (second embodiment) are maintained, and the freeze-dried molded articles also have a spherical shape Structure,
  • a corresponding spherical solid form of the lyophilizate is particularly preferred, as this simplifies the subsequent preparation and reduces nonspecific adsorption effects during the freeze-drying process on the vessel used,
  • the process according to the invention is particularly suitable for the production of freeze-dried moldings which comprise biologically active constituents
  • biologically active constituents are blood or its constituents, proteins, in particular enzymes, hormones, antibiotics, fatty acids, lipids, carbohydrates of any chain length, polysaccharides, Vaccines, low molecular weight chemical compounds, their salts, organics, nucleic acids, peptides, microorganisms such as viruses, bacteria, yeasts, fungi, parasites and protozoa, cells and vectors,.
  • the liquid phase can also comprise a plurality of reagents, for example mixtures of the abovementioned biologically active constituents.
  • reagents which are to be freeze-dried separately in a plurality of first phases or to emulsify and then to introduce these dissolved or emulsified first phases preferably separately into a second phase.
  • this second phase then from the individual discrete first phases, each containing a reagent, a common first phase in which then each all reagents are present
  • the freeze-drying step takes place in a plastic or glass tube.
  • the freeze-dried particles resulting from this process step can be immediately alsbehahrff in these vessels until it comes to a further application, a cumbersome transferring the freeze-dried moldings from the reaction vessel in a device for Storage is not required in the context of the present invention.
  • d, h a freeze-dried shaped body
  • a hydrophobic phase comprising a silicone oil
  • the reagent to be freeze-dried is introduced into this hydrophobic phase in the form of a injected aqueous phase, at this injection point, the temperature of the fluid of silicone oil and aqueous phase is about 20 ° C. It comes to the formation of individual specific spherical volumes of the aqueous phase in the hydrophobic silicone oil phase.
  • the fluid of silicone oil and aqueous phase is in a cold zone, which is operated at, for example, -50 ° C, transferred in this cold zone, there is a solidification of the aqueous phase in spherical form, while the silicone oil remains liquid, the solidified spheres of the aqueous phase sink to the bottom, then the vessel with the solidified spheres is removed and a final freeze-drying using vacuum results in sublimation of the remaining hydrophilic aqueous phase and obtaining freeze-dried shaped body at the bottom of the reservoir.
  • the process according to the invention is particularly suitable for the preparation of lyophilizates for lab-on-chip applications, since the dried reagent spheres can be prepared directly in the containers, which later serve for the transport and the redissolving of the dried reagents.
  • the present invention will be further illustrated by the following examples, which examples do not limit the present invention: 1. Forming balls in silicone oil and freeze-drying them
  • the samples were transferred in the frozen state (-80 ° C) in the lyophilus and dried at ca, 0.02 mbar. This was followed by drying at 30 ° C.
  • the anhydrous QMM products thus obtained were subjected to a quality control test and compared with a non-lyophilized [QMM + 10% trehalose] mixture. In this multiplex PCR, 10 amplicons of mouse gDNA are generated. Weakening or elimination of individual bands indicates a deteriorated PCR efficiency of the respective mix.
  • FIG. 1 The results of the quality control (QC) test are shown in FIG.
  • the figure shows the following samples (from left): lane 1, DNA size marker; Lanes 2 and 3, non-lyophilized reagents; Lanes 4 and 5, according to method d) treated and lyophilized reagents; Lane 6, reagents treated according to method a) and lyophilized; Lane 7, reagents treated according to method b) and lyophilized; Lane 8, method c) treated and lyophilized reagents,
  • the QC test showed that the drying according to methods b) and d) produces a product that can still amplify all 10 PCR products.
  • the product produced by method a) shows a weakening of the two largest bands.
  • the lyophilisates prepared according to method c) showed that the silicone oil AP100 used had a strongly inhibiting effect on the PCR reaction. Reaction has and thus unsuitable as a medium for ball forming.
  • the silicone oil DC200 Dow Chemical was the ⁇ sen PCR QC test very well. 3. Preparation of spherical products in a large volume range
  • FIG. 5 shows the lyophilized spheres.
  • the slight deformation, in particular of the bulky lyophilisates, is due to the fact that they initially dropped in liquid form onto the frit bottom of the vessel and partly assumed their shape due to their own specific weight.
  • each filter pillars consists of a coarsely porous frit material, prevents the buffer ⁇ balls cling and during the freezing process to the bottom surface thereby change their shape, since both products (Strip and Plate) with a vacuum station by The silicone oil was removed in this way from the frozen buffer ball, then the spheres were cooled to -80 ° C and then lyophilized, In the experiment described here were the frozen balls from the 96er Plate and transferred to a septum-sealable Gtas glass tube and freeze dried therein,
  • the lyophilizates prepared in the present example still have a residual content of silicone oil which is at least determined by NMR spectroscopy (see US Pat. No. 6,436,715) or GC / MS coupling (An epidemic of sticky silicone oil at the Rotterdam Eye Hospital, Patient review and chemical analyzes, Marc A, Veckeneer, Simone de Voogd, Eric W. Lindstedt, Dirk-Henning Menz and Jan C. van Meurs (2008) Graefe's Archive for Clinical and Experimental Oph- thalmology, Vol 246 (6): 917-22) is detectable

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von einem im Wesentlichen kugelförmigen Festkörper durch Gefriertrocknung,

Description

Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisaten Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einem im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisat. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind entsprechende durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellte Lyophilisate sowie deren spezifische Verwendung, Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die kombinierte Verwendung von hydrophilen und hydrophoben Phasen zur Erzeugung von im Wesentlichen kugelförmigen Flüssigkeitsvoluminaim Rahmen der Gefriertrocknung.
Die Gefriertrocknung, auch als Lyophilisation oder Sublimationstrocknung bezeichnet, ist ein Verfahren zur schonenden Trocknung hochwertiger Produkte. Bei der Gefriertrocknung verdampfen die Eiskristalle direkt ohne den Übergang in den flüssigen Zustand. Das Endprodukt der Gefriertrocknung wird als Lyophilisat bezeichnet. In der Biotechnologie und Pharmaindustrie dient die Gefriertrocknung der Stabilisierung und Haltbarmachung von flüssigen Reagenzienformulierungen, wie Pharmaka und Enzymlösungen. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, die Aktivität von empfindlichen Enzymen bei Raumtemperatur für lange Zeit aufrecht zu erhalten. Um den Inhalt der getrockneten Probe ein- zusetzen (als Pharmakum oder für biologische Reaktionen, wie beispielsweise der PCR (Polymerase Chain Reaction {PCR, Polymerase Kettenreaktion))) wird das Lyophilisat mit einem adäguaten Lösungsmittel, bei welchem es sich in der Regel um Wasser handelt, versetzt, Dies führt zu einer sofortigen Rücklösung der getrockneten Inhaltsstoffe, welche dann in Lösung wie- der ihre ursprüngliche Wirkung entfalten,
In der Pharmaindustrie überwiegen pulverförmige Formulierungen bzw, poröse Gefriertrocknungskuchen, die üblicherweise in einem mit einem Septum bestückten Glasgefäß getrocknet und anschließend verschlossen werden, Daneben ist es aber auch möglich, lyophilisierte Proben in Kugelform herzu- stellen, welche mehrere Vorteile im Vergleich zu Lyophilisaten mit anderen geometrischen Formen aufweisen:
So ermöglicht bzw. erleichtert die Kugelform von entsprechenden Lyophili- säten das spätere Konfektionieren der Proben durch ihre kompakte und wohldefinierte Geometrie sowie ihre Rieselfähigkeit,
Darüber hinaus sind kugelförmige Lyophilisate dahingehend inhärent, als dass eine unspezifische Adsorption von Reagenzien an beispielsweise Ober- flächen des Behälters, in dem die Probe gefriergetrocknet wird, nahezu ausgeschlossen oder deutlich reduziert ist.
Die Anwendung der Gefriertrocknung als Kryogronulierung ist beispielsweise in WO 03/020959 A, WO 2005/058474 A und aus dem Artikel „Cryogranulati- on: A Potential New Final Process for Bulk Drug Substances", D, J, Schmidt et al. Biopharm, 1997 (Seiten 28 ff.) bekannt, wobei die hierin beschriebenen Verfahren dahingehend nachteilig sind, dass sie zu einer sehr schnellen Abkühlung der zu gefriertrocknenden Reagenzien führen, Verfahren zur Herstellung von kugelförmigen Lyophilisaten sind an sich bekannt,
So offenbart beispielsweise die US 2005/0069898 A die Herstellung von lyophilisierten Kugeln durch ein Verfahren, in welchem zunächst eine wässrige Lösung der zu gefriertrocknenden Substanz hergestellt wird, Eine kugelförmige Ausbildung der Lösung ergibt sich durch das Auffragen der Emulsion auf einem Träger, wie einem Glas oder einem beschichteten Aluminiummaterial, auf einer kryogenen Flüssigkeit oder einer durch eine kryogene Flüssigkeit gekühlten Oberfläche, Ferner kann die Lösung auch in flüssigem Stickstoff eingetragen werden, Hierdurch wird die Emulsion schockgefroren und kann anschließend einer Gefriertrocknung unterworfen werden, Weitere Trocknungsverfahren, die in der US 2005/0069898 A erwähnt werden, sind einfache Vakuumtrocknung und Verdampfung, Um während der Trocknung eine Agglomeration von den kugelförmigen Volumina zu vermeiden, werden diese durch geeignete Vorrichtungen auf Abstand gehalten. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es nur batchweise durchgeführt werden kann. Ein weiterer Nachteil bestehf in dem für das Verfahren uner- lässlichen Umgang mit flüssigem Stickstoff, durch welchen es bei der Durchführung des Einfrierens zu einer hohen Abkühlrate der Probe kommt, die darüber hinaus nicht beeinflussbar ist, Hohe Abkühlraten können dabei zu einer Belastung der zu lyophilisierenden Probe führen,
Ein ähnliches Verfahren zur Herstellung von kugelförmigen Lyophilisaten wird in der WO 2008/144063 A offenbart, in welcher die Gefriertrocknung einer Sucralose-Lösung beschrieben wird. Zu diesem Zweck wird die Sucralose-Lö- sung mit einer kalten Oberfläche oder einem kalten Fluid in Kontakt gebracht, um die Lösung einzufrieren, Anschließend wird die eingefrorene Lösung gefriergetrocknet. Vor dem eigentlichen Schockfrieren wird jedoch zunächst eine Tröpfchenform der zu gefriertrocknenden Lösung erzeugt. In den Beispielen der WO 2008/144063 A erfolgt diese Bildung der Tropfenform spontan durch Einbringen der zu gefriertrocknenden Lösung in flüssigen Stickstoff. Auch bei diesem Verfahren kommt es durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff zu hohen Abkühlraten und damit zu einer Belastung der zu lyophilisierenden Probe, Ferner können die zu gefriertrocknenden Lösungen auch in Tropfenform in einen Gasträger gesprüht werden, wobei das Gas kalt genug ist, die Tröpfchen einzufrieren, Anschließend erfolgt dann die Gefriertrocknung der eingefrorenen Tröpfchen, Auch diese Lyophilisate weisen eine kugelförmige Struktur auf,
Eine weitere Vorgehensweise zur Herstellung von gefriergetrockneten kugelförmigen Formkörpern besteht darin, eine Flüssigkeit auf eine kryogen gekühlte hydrophobe Oberfläche, beispielsweise aus Diamant, Siliziumdioxid oder PTFE, zu dispensieren, Die Dispensiergeschwindigkeit ist für verschie- dene Probenvolumina empirisch zu bestimmen, Das maximal herstellbare Kugelvolumen ist jedoch auf 35 μ\ begrenzt. Ein entsprechendes Verfahren ist beispielsweise in der US 2007/0259348 A beschrieben,
Diese aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten kugelförmigen Formkörpern sind dahingehend nachteilig, als dass das herstellbare Kugelvolumen begrenzt ist. Zur Herstellung der entsprechenden gefriergetrockneten Formkörper ist ferner der Umgang mit kryogenen Substanzen, wie beispielsweise Flüssigstickstoff, zwingend erforderlich, was die jeweiligen Verfahren umständlich macht und darüber kos- tenintensiv ist. Ferner kann es durch die Verwendung entsprechender kryo- gener Substanzen zu Belastungen der zu lyophilisierenden Substanzen aufgrund hoher Abkühlraten kommen,
Darüber hinaus ist es bei den vorbeschriebenen Verfahren erforderlich, dass die lyophilisierten Kugeln nach ihrer jeweiligen Herstellung immer in einem zweiten Arbeitsgang in das final benutzte Transport-, Lager- bzw, Reaktionsgefäß umgefüllt werden, was ebenfalls umständlich ist und insbesondere bei empfindlichen Reagenzien zu einer Zersetzung oder Verschlechterung des Reagenz führen kann,
Ferner sind Verfahren zur Aliquotierung von Reagenzien bekannt, wie aus EP 2 168 557 A und CA 2,016,285, die jedoch keine Anwendung in der Gefriertrocknung umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt sich nunmehr die Aufgabe, die bekannten Verfahren zur Herstellung von kugelförmigen Lyophilisate durch Gefriertrocknung insbesondere im Hinblick auf die vorstehend genannten Nachteile zu verbessern , Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von kugelförmigen Lyophilisaten durch Gefriertrocknung be¬ reitzustellen, bei welchem das herstellbare Kugelvolumen im Wesentlichen keiner Begrenzung unterliegt, Des Weiteren stellt sich die vorliegende Erfindung vorzugsweise die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von kugelförmigen Lyophilisaten durch Gefrier- trocknung bereitzustellen, mit welchem eine kontinuierliche Herstellung von gefriergetrockneten Formkörpern möglich ist,
Eine weitere Aufgabe, welche von der vorliegenden Erfindung vorzugsweise gelöst wird, ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von gefriergetrockneten Lyophilisaten, bei welchem ein Umgang mit kryogenen Substanzen, wie beispielsweise Flüssigstickstoff, nicht erforderlich ist, Hierdurch soll das entsprechende Verfahren einfach und kostengünstig durchführbar sein.
Ferner soll die vorliegende Erfindung insbesondere die Aufgabe lösen, ein Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Lyophilisaten bereitzustel¬ len, bei welchem die lyophilisierenden Formkörper nach ihrer jeweiligen Herstellung nicht mehr in das endgültig benutzte Transport-, Lager- bzw. Reakti- onsgefäß umgefüllt werden müssen. Gemäß dieser Aufgabe wird somit vorzugsweise ein Verfahren nachgesucht, welches bereits in geeigneten Transport- bzw. Lagergefäßen durchgeführt werden kann. Bei diesen Gefäßen soll es sich insbesondere auch um eakfionsgefäße handeln können, in welchen die Lyophilisate später wieder erneuf umgesetzt werden.
Schließlich stellt sich die vorliegende Erfindung insbesondere auch die Auf¬ gabe, ein Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Formkörpern bereitzustellen, bei welchem hohe Abkühlraten, wie beispielsweise von ca. 50 bis 100 °C pro Sekunde, die bei empfindlichen Substanzen zu Schäden führen können, vermieden werden,
Die vorstehenden Aufgaben werden durch das im Folgenden beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneten Lyophilisaten gelöst, wobei einzelne der vorstehenden Aufgaben insbesondere durch bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst werden,
Die Lösung der der vorliegenden Erfindung zugrundliegenden Aufgabe geht aus von einem Verfahren zur Herstellung von einem fesfen Formkörper, ent- haltend mindestens ein Reagenz, durch Gefriertrocknung einer flüssigen Phase, welche das mindestens eine Reagenz umfasst, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
( 1 ) Bereitstellung einer ersten Phase, welche mindestens ein zu gefriertrocknendes Reagenz enthält;
(2) Inkontaktbringen der ersten Phase mit einer zweiten Phase, wobei eine der beiden Phasen hydrophob ist und die andere Phase hydrophil ist;
(3) Einfrieren der ersten Phase in dem aus Verfahrensschritt (2) resultierenden System aus zwei Phasen und Entfernen der zweiten Phase aus dem System; und
(4) Gefriertrocknen der aus Verfahrensschritt (3) verbleibenden ersten Phase unter Erhalt eines im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisats.
Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass eine flüssige Phase, welche das zu gefriertrocknende Reagenz umfasst, zunächst in einzelne diskrete vorbe- stimmte Volumina aliquotiert, d.h. aufgeteilt, wird, Diese Aliquotierung der flüssigen Phase ist vorzugsweise so ausgebildet, dass beliebige, jedoch vorbestimmbare bzw, vorbestimmte Volumina einzelner Aliquots erhalten werden, Verfahrensweisen zur Erzeugung entsprechender Volumina werden später näher beschrieben,
Anschließend werden die aliquotierten Volumina der flüssigen Phase abgekühlt und gefriergetrocknet, wobei entsprechende Lyophilisate erhalten werden, Je nach Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können unterschiedliche Volumina des Lyophilisats erreicht werden:
In einer ersten Ausgestaltung weisen die Lyophilisate ein Volumen auf, welches dem Volumen der ersten Phase entspricht,
Auch ist es in einer zweiten Ausgestaltung möglich, dass das Volumen des Lyophilisats kleiner ist als das Flüssigkeitsvolumen der ersten Phase, da durch die Gefriertrocknung die flüssige Phase, in welcher das Reagenz zunächst gelöst oder emulisiert war, entfernt wird,
Schließlich können in einer dritten Ausgestaltung die Volumina der Lyophili- sate auch größer sein als die Volumina der ersten Phase, Dieses ist im All- gemeinen dann der Fall, wenn man Gefriertrocknungsadditive verwendet, mit welchen die für das Lyophilisat erforderliche Stabilität erreicht werden kann, Geeignete Gefriertrocknungsadditive sind zum Beispiel Zuckerverbindungen, wie Zuckeralkohole. Da sich das Lyophilisat beim Einfrieren gege- benenfalls geringfügig ausdehnen kann und die Gefriertrocknungsadditive somit ein Additivgerüst aufbauen können, welches auch geringfügig größer sein kann als die ursprüngliche flüssige Phase, kann auch das Lyophilisat etwas größer sein als das Volumen der ersten flüssigen Phase, in welcher das Reagenz vorliegt.
Das zu gefriertrocknende Reagenz kann dabei in der flüssigen Phase gelöst oder suspendiert vorliegen. Wenn das zu gefriertrocknende Reagenz in einer Suspension vorliegt, ist es bevorzugt, wenn die Emulsion bis zum Zeitpunkt des vollständigen Einfrierens durch die Abkühlung homogen bleibt und sich nicht entmischt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die erste Phase vorzugsweise aliquotiert; d.h. das Volumen der ersten Phase wird auf kleinere einzelne, insbesondere vordefinierte Volumina aufgeteilt.
In der vorliegenden Erfindung erfolgt die in dem ersten Verfahrensschritt erforderliche Aliquotierung der flüssigen Phase, welche mindestens ein Reagenz umfasst, durch die kombinierte Verwendung von einer hydrophilen und einer hydrophoben Phase, Unter einer hydrophilen und einer hydrophoben Phase werden insbesondere Phasen verstanden, welche im Wesentlichen nicht miteinander mischbar sind,
Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, dass Flüs- sigkeiten, die in eine nicht mischbare, zweite Flüssigkeit eingebracht werden, spontan eine Kugelform ausbilden, Wenn nun eine flüssige Phase, welche ein zu gefriertrocknendes Reagenz umfasst, in eine nicht mit dieser flüssigen Phase mischbare Flüssigkeit eingebracht wird, bildet sich spontan eine Kugelform der flüssigen Phase, enthaltend das Reagenz, aus, Bei der Ge- friertrocknung wird diese Kugelform aufrecht gehalten, Die erste und die zweite Phase sind so ausgebildet, dass bei einer Temperatur von im Allgemeinen mindestens 5 °C, bevorzugt mindestens 10 °C, weiter bevorzugt mindestens 15 °C, noch weiter bevorzugt mindestens 20 °C, un¬ terhalb des Gefrierpunkts der ersten Phase, welche das zu gefriertrocknende Reagenz enthält, beide Phasen nicht miteinander mischbar sind und es bei dem Inkontaktbringen der ersten und der zweiten Phase zu einer Phasentrennung kommt, Unter nicht miteinander mischbar wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die erste Phase sich mit der zweiten Phase zu weniger als 10 Vol-%, bevorzugter zu weniger als 5 Vol-%, am be- vorzugtesten zu weniger als 1 Vol-%, mischt.
Im Folgenden werden zwei Ausführungsformen beschrieben, in welchen es unter Verwendung von einer hydrophilen und einer hydrophoben Phase zu einer Aliquotierung des Volumens der einen Phase, enthaltend das mindes- tens eine Reagenz, in der anderen Phase kommt.
In einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Reagenz, welches als gefriergetrockneter Lyophilisat erhalten werden soll, in der hydrophilen Phase vor,
Diese hydrophile Phase wird in die hydrophobe Phase eingetragen. Durch die Auswahl entsprechender hydrophiler und hydrophober Phasen können durch das Einbringen der hydrophilen Phase in die hydrophobe Phase diskrete spezifische Volumina an hydrophiler Phase, vorzugsweise in Kugelform, in der hydrophoben Phase erhalten werden. In diesen spezifischen einzelnen kugelförmigen Volumina der hydrophilen Phase liegt das mindestens eine Reagenz vor,
Der Schmelzpunkt der hydrophoben Phase liegt in dieser ersten Ausführungs- form vorzugsweise um mindestens 10 °C, besonders bevorzugt 15 °C, insbe¬ sondere 20 °C, niedriger als der Schmelzpunkt der hydrophilen Phase, so dass durch Einfrieren der Mischung aus hydrophiler und hydrophober Phase die hydrophobe Phase vorzugsweise rückstandsfrei entfernt werden kann, Dieses kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die hydrophile und hyd- rophobe Phase auf eine Temperatur abgekühlt wird, welche niedriger ist als der Schmelzpunkt der hydrophilen Phase, die damit einfriert, und höher ist als der Schmelzpunkt der hydrophoben Phase, die damit flüssig bleibt, Wenn diese entsprechende Temperatur erreicht wurde, können die beiden Phasen durch übliche Fest-Flüssig-Abtrennungsverfahren getrennt werden, Das erfin- dungsgemäße Verfahren wird dabei vorzugsweise auf einer Glasfritte durchgeführt, so dass die im flüssigen Zustand verbleibende hydrophobe Phase durch den Frittenboden abgesaugt werden kann, Auch alternative Abtrennverfahren für die flüssige hydrophobe Phase von der hydrophilen Phase, wie beispielsweise ein Abdekantieren der flüssigen hydrophoben Phase von der festen eingefrorenen hydrophilen Phase, können angewendet werden,
Im Allgemeinen werden in dieser ersten Ausführungsform die Dichten der hydrophilen und hydrophoben Phase so aufeinander abgestimmt, dass die Dichte der hydrophilen Phase ungefähr gleich oder größer ist als die der hydrophoben Phase, In der ersten Ausführungsform führt das dazu, dass bei einem Eintragen der hydrophilen Phase in die hydrophobe Phase die hydrophile Phase auf den Boden des Gefäßes, in welchem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, sinkt, Um eine Bodenberührung der hydrophilen Phase in dem Gefäß zu vermeiden, kann bei Verwendung einer Glasfritte beispielsweise der Frittenboden mit der hydrophoben Phase getränkt werden, Wenn die hydrophile Phase den Boden berührt, kann es zu einer Auflösung der kugelförmigen Struktur der hydrophilen Phase kommen,
In einer bevorzugten Ausgestaltung der ersten Ausführungsform wird das er- findungsgemäße Verfahren durch folgende Verfahrensschritte charakterisiert:
(1 ,1) Bereitstellung einer hydrophilen Phase, welche mindesfens ein zu gefriertrocknendes Reagenz enthält;
(1 ,2) Inkontaktbringen der hydrophilen Phase mit einer hydrophoben Phase, so dass sich eine Flüssigkeitskugel der hydrophilen Phase in der hydrophoben Phase ausbildet; (1 ,3) Einfrieren der hydrophilen Phase in dem aus Verfahrensschrift (1 ,2) resultierenden System aus hydrophiler und hydrophober Phase und Entfernen der flüssigen hydrophoben Phase aus dem System; und (1.4) Gefriertrocknen der aus Verfahrensschrift (1 ,3) resultierenden hydrophilen Phase unter Erhalf eines im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisats.
Im Verfahrensschritt (1.3) wird die Mischung aus hydrophiler und hydropho- ber Phase eingefroren, so dass die hydrophile Phase fest wird und die hydrophobe Phase flüssig bleibt, Die Geschwindigkeit des Einfrierens kann dabei in weifen Bereichen variieren und in dem Fall von empfindlichen zu lyophili- sierenden Reagenzien kann das Einfrieren mit einer möglichst langsamen Einfriergeschwindigkeit durchgeführt werden, Dieses unterscheidet das erfin- dungsgemäße Verfahren von den üblichen aus dem Stand der Technik bekannten und zuvor referierten Verfahren der Kryogranulierung, bei welchen die flüssige Phase, enthaltend das zu gefriertrocknende Reagenz, unmittelbar mit dem kryogenen Kühlmittel, beispielsweise flüssigem Stickstoff, in Konfakt gebracht wird. Hierbei wird das Reagenz sozusagen schockgefroren, was bei empfindlichen Reagenzien ein Nachfeil sein kann,
Bei der hydrophilen Phase, in welcher das zumindest eine Reagenz, das einer Gefriertrocknung unterworfen werden soll, vorliegt, handelt es sich vorzugsweise um eine wässrige Phase, in welcher das Reagenz gelöst oder sus- pendiert ist,
Als hydrophobe Phasen sind alle Flüssigkeiten denkbar, die in einem geeigneten Temperaturbereich (kleiner gleich -10 °C und größer gleich +40 °C) flüssig sind und zu keiner Durchmischung mit der hydrophilen, vorzugsweise wässrigen Phase führen, Darüber hinaus weist die hydrophobe Phase vorzugsweise den zuvor bezeichneten Schmelzpunkt (im Verhältnis zur hydrophilen Phase) auf,
Geeignete hydrophobe Phasen sind insbesondere Silikonöle, Paraffinöle und Mineralöle, wie Alkane im Keftenlängenbereich von C7 (Hepfan) bis C,2 (Do- dekan), da diese eine Schmelztemperatur von -92 °C (C7) bzw, -10 °C (C12) und eine Siedetemperatur von 98 °C (C7) bzw. 216 °C (C,2) besitzen, Weitere geeignete hydrophobe Phasen sind organische Öle auf Basis von Pflanzen oder Tieren, wie beispielsweise Algen und Hefen, soweit ihre Schmelztemperatur unter -10 °C liegt, Besondere Beispiele sind ungesättigte Ölsäuren,
Von den vorstehend genannten hydrophoben Phasen sind insbesondere Silikonöle bevorzugt, Des Weiteren ist insbesondere die Verwendung von Silikonölen als hydrophobe Phase und von wässrigen Lösungen bzw, Suspensionen als hydrophile Phase bevorzugt, Der Vorteil von Silikonölen als hydro- phobe Phase liegt darin, dass sie in einem sehr breiten Temperaturbereich flüssig sind, Außerdem sind sie sehr reaktionsträge und häufig biokompati¬ bel,
Besonders bevorzugt als Silikonöl ist das Silikonöl DC200 von Dow Chemical.
In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das zu lyophilisierende Reagenz in der hydrophoben Phase vor, Diese hydrophobe Phase wird dann in die hydrophile Phase eingetragen, Durch die Auswahl entsprechender hydrophiler und hydrophober Phasen können - analog zur ersten Ausführungsform - bei dem Einbringen der hydrophoben Phase in die hydrophile Phase spezifische Volumina an hydrophober Phase erhalten werden, In diesen spezifischen Volumina der hydrophoben Phase, welche insbesondere in Kugelform ausgebildet sind, liegt das mindestens eine zu lyophilisierende Reagenz vor,
In dieser zweiten Ausführungsform werden vorzugsweise hydrophobe Phasen verwendet, welche einen Schmelzpunkt aufweisen, der um mindestens 10 °C, besonders bevorzugt 15 °C, insbesondere 20 °C, höher liegt als der Schmelzpunkt der hydrophilen Phase, so dass es bei dem Abkühlen der re- sultierenden Mischung zunächst nur zu einem Einfrieren der hydrophoben Phase kommt, Die hydrophile Phase kann dann - auf identische oder ähnli¬ che Weise wie in der ersten Ausführungsform für die hydrophobe Phase - aus der Mischung entfernt werden, Die verbleibende eingefrorene hydrophobe Phase wird dann abschließend einer Gefriertrocknung zugeführt, In einer bevorzugten Ausgestaltung der zweiten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren - in Analogie zu der ersten Ausführungsform - durch folgende Verfahrensschritfe charakterisiert: (2.1) Bereitstellung einer hydrophoben Phase, welche mindestens ein zu gefriertrocknendes Reagenz enthält;
(2.2) Inkontaktbringen der hydrophoben Phase mit einer hydrophilen Phase, so dass sich die Flüssigkeitskugel der hydrophoben Phase in der hyd- rophilen Phase ausbildet;
(2.3) Einfrieren der hydrophoben Phase in dem aus Verfahrensschritt (2.2) resultierenden System aus hydrophiler und hydrophober Phase und Entfernen der hydrophilen Phase aus dem System; und
(2.4) Gefriertrocknen der aus Verfahrensschritt (2.3) resultierenden hydrophoben Phase unter Erhalt eines im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisats,
Das Einstellen des Volumens derjenigen Phase, welche das zu gefrierfrock- nende Reagenz enthält, in der anderen Phase erfolgt in beiden Ausführungsformen durch Auswahl geeigneter Mengen an hydrophiler und hydrophober Phase. Beispiele geeigneter Phasen für diese zweite Ausführungsform sind Wasser, Methanol und Formamid als hydrophile Phase und Silikonöle; Öle; Fette; ätherische Öle von Pflanzen, Tieren und Einzellern; langkettige Alkane mit C 11 -Kettenlängen oder längere Kohlenstoffketten und Benzol als hydrophobe Phase.
In einer besonderen Ausgestaltung der ersten und der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen sind die hydrophile und die hydrophobe Phase vorzugsweise PCR-tolerant und tolerant gegenüber enzymatischen Reaktionen. Unter PCR-tolerant wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, wenn die hydrophobe und die hydrophile Phase, welche zur Herstellung der festen kugelförmigen Reagenzien verwendet werden, nicht zu Veränderungen der Produktqualität oder -quantität in einer anschließenden PCR führen, im Vergleich zur Verwendung der entsprechenden Reagenzien, welche keiner Gefriertrocknung bzw, einer Gef rierfrocknung ohne Ver¬ wendung der hydrophoben und hydrophilen Phasen unterworfen wurden. Unter tolerant gegenüber enzymatischen Reaktionen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, wenn die hydrophobe und die hydrophile Phase, welche zur Herstellung der festen kugelförmigen Reagenzien verwendet werden, nicht zu Veränderungen der Produktqualität oder -quantität bzw, der verwendeten Enzyme in einer anschließenden enzymatischen Reak- tion führen, im Vergleich zur Verwendung der entsprechenden Reagenzien, welche keiner Gefriertrocknung bzw, einer Gefriertrocknung ohne Verwendung der hydrophoben und hydrophilen Phasen unterworfen wurden,
Um die nahezu perfekt kugelförmige Geometrie und glatte Oberfläche der gefrorenen Kügelchen während der Gefriertrocknung zu erhalten, ist es vorteilhaft darauf zu achten, dass die zur Ausformung der Kugeln verwendete hydrophobe (erste Ausführungsform) bzw, hydrophile (zweite Ausführungsform) Phase vor Beginn der Gefriertrocknung möglichst vollständig entfernt wird, Anderenfalls können die getrockneten Kugeln eine ungleichmäßige Oberfläche und eine grobporige innere Struktur erhalten, Entsprechende gefriergetrocknete Formkörper, welche erhalten wurden unter vollständiger Entfernung der Phase zur Ausbildung der kugelförmigen Geometrie, sind in Figur la) dargestellt. Demgegenüber ergeben sich die in Figur 1 b) dargestellten kugelförmigen Strukturen, wenn die zur Ausbildung der kugelförmigen Geo- metrie erhaltene hydrophobe bzw, hydrophile Phase nicht vollständig entfernt wird,
Das Eintragen der flüssigen Phase, enthaltend das mindestens eine Rea¬ genz, in die hydrophobe Phase (erste Ausführungsform) oder die hydrophile Phase (zweite Ausführungsform) kann bei Raumtemperatur oder aber bei leicht erniedrigter Temperatur, beispielsweise bei Temperaturen von bis zu - 30 °C, durchgeführt werden. Dabei ist vorteilhaft, wenn das Gefäß, in dem die Kugel hergestellt werden soll, möglichst keine glatten Wände und keinen glatten Boden aufweist, da sich die zunächst kugelförmige Lösung während des Einfrierens an die Oberflächengeometrie des Behälters anpassen und dadurch seine Kugeiforrn verlieren kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die erste Ausführungsform insbesondere bevorzugt,
Durch die Gefriertrocknung werden die kugelförmigen Strukturen, welche durch Eintragen der hydrophilen Phase in die hydrophobe Phase (erste Ausführungsform) bzw, durch das Eintragen der hydrophoben Phase in die hydrophile Phase (zweite Ausführungsform) gebildet wurden, aufrechterhalten und die gefriergetrockneten Formkörper erhalten ebenfalls eine kugelförmige Struktur,
Eine entsprechende kugelförmige feste Form des Lyophilisats ist insbesondere bevorzugt, da diese das spätere Konfektionieren vereinfacht und unspezifische Adsorptionseffekte während des Gefrierfrocknungsprozesses an dem verwendeten Gefäß verringert,
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff einer kugelförmigen Struktur verstanden, dass der Formkörper bzw, das Lyophilisat die Beziehung LI = 1 bis 1 ,5 x L2 erfüllt, wenn LI der größte Durchmesser und L2 der kleinste Durchmesser eines entsprechenden Formkörpers darstellt, Eine entsprechende Darstellung eines erfindungsgemäßen Formkörpers einschließlich der Darstellung von zwei entsprechenden Durchmessern LI und L2 ist in der Figur 2 dargestellt,
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von gefriergetrockneten Formkörpern, welche biologisch aktive Bestandteile umfassen, Beispiele für biologisch akfive Bestandfeile sind Blut bzw, dessen Bestandteile, Proteine, insbesondere Enzyme, Hormone, Antibiotika, Fettsäuren, Lipide, Kohlenhydrate mit beliebiger Kettenlänge, Polysaccharide, Impfstoffe, niedermolekulare chemische Verbindungen, deren Salze, Organika, Nukleinsäuren, Peptide, Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien, Hefen, Pilzen, Parasiten und Protozoen, Zellen und Vektoren, . In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann die flüssige Phase auch mehrere Reagenzien, beispielsweise Mischungen der zuvor genannten biologisch aktiven Bestandteile, umfassen, Auch ist es möglich, mehrere, beispielsweise zwei oder drei Reagenzien, die gefriergetrocknet werden sollen, separat in mehreren ersten Phasen aufzulösen oder zu emulgieren und diese aufgelösten oder emulgierten ersten Phasen dann jeweils vorzugsweise separat in eine zweite Phase einzubringen, In dieser zweiten Phase wird dann aus den einzelnen diskreten ersten Phasen, enthaltend jeweils ein Reagenz, eine gemeinsame erste Phase, in der dann jeweils alle Reagenzien vorliegen, Durch diese Verfahrensweise kann darauf verzichtet werden, die einzelnen Reagenzien vor dem Einbringen in die zweite Phase zu mischen, In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung erfolgt der Gefriertrocknungsschritt in einem Plastik- oder Glasröhrchen. Auch die Verwendung von Glasfritten, wie vorstehend erläutert, kommt in Frage, Die aus diesem Verfahrensschritt resultierenden gefriergetrockneten Teilchen können in diesen Gefäßen unmittelbar aufgewahrf werden, bis es zu einer weiteren Anwendung kommt, Ein umständliches Umfüllen der gefriergetrockneten Formkörper aus dem Reaktionsgefäß in eine Vorrichtung zur Lagerung ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, Vorzugsweise wird in jedem Gefäß nur ein Lyophilisat, d, h, ein gefriergetrockneter Formkörper, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt,
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl bafchweise als auch kontinuierlich durchgeführt werden,
In dem Fall, in welchem eine kontinuierliche Verfahrensweise Anwendung finden soil, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch parallelisiert durchgeführt werden, Eine entsprechende Vorrichtung ist in der Figur 3 dargestellt.
In dieser Vorrichtung wird beispielsweise eine hydrophobe Phase, umfassend ein Silikonöl, im Kreis gefahren und an einer vorbesfimmten Stelle wird in diese hydrophobe Phase das zu gefriertrocknende Reagenz in der Form ei- ner wässrigen Phase eingespritzt, An dieser Einspritzstelle beträgt die Temperatur des Fluids aus Silikonöl und wässriger Phase ungefähr 20 °C. Es kommt zu der Ausbildung einzelner spezifischer kugelförmiger Volumina der wässrigen Phase in der hydrophoben Silikonölphase. Das Fluid aus Silikonöl und wässriger Phase wird in eine Kältezone, welche bei beispielsweise -50 °C betrieben wird, überführt, In dieser Kältezone kommt es zu einer Verfestigung der wässrigen Phase in Kugelform, während das Silikonöl flüssig bleibt, Die verfestigten Kugeln der wässrigen Phase sinken auf den Boden, Im An- schluss wird das Gefäß mit den verfestigten Kugeln entfernt und eine ab- schließende Gefriertrocknung unter Anwendung von Vakuum führt zu einem Sublimieren der verbleibenden hydrophilen wässrigen Phase und den Erhalt von gefriergetrocknetem Formkörper am Boden des Reservoirs.
Diese kontinuierliche Verfahrensweise kann selbstverständlich auch im Rah- men der zweiten Ausführungsform realisiert werden, nämlich dann, wenn die hydrophile Phase im Kreislauf gefahren wird und in die hydrophile Phase eine hydrophobe Phase eingespeist wird, welche mindestens ein zu hydrophi- lisierendes Reagenz umfasst, Ein wesentlicher Vorfeil der Lehre der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass das Aliquotieren des Kugelvolumens vom Einfrieren der Flüssigkeit getrennt erfolgt. Diese Trennung der Verfahrensschritte erlaubt variable Abkühlraten, was insbesondere sensible Reagenzienformuiierungen schont, Darüber hinaus beeinflusst die Abkühlrafe auch die Größe der entstehenden Lyophilisate (z.B. Kristalle), welche wiederum Einfluss hat auf die Effektivität, mit der das gefrorene Lösungsmittel sublimiert werden kann, Weiferhin ist das erfindungsgemäße Verfahren mit erheblich geringerem technischem Aufwand durchführbar und ermöglicht die Verarbeitung größerer Probenvolumina,
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet sich insbesondere zur Herstellung von Lyophilisaten für Lab-on-Chip Anwendungen an, da die getrockneten Reagenzienkugeln direkt in den Behältern hergestellt werden können, die später zum Transport und zum Rücklösen der getrockneten Reagenzien die- nen. Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, wobei die einzelnen Beispiele die vorliegende Erfindung nicht beschränken: 1. Ausformung von Kugeln in Silikonöl und deren Gefriertrocknung
Es wurde Silikonöl DC 200 von Dow Corning mit einer Viskosität von 10 mPa ■ s in Wells einer Mikrotiterplatte gegeben und im Tiefkühlschrank auf -30 °C abgekühlt, Dann wurden 5μΙ Aliquots Qiagen Multiplex PCR Mastermix (im Folgenden als QMM bezeichnet) in das Öl pipettiert, welche sich zu Kugeln formten und innerhalb weniger Sekunden durchfroren, Anschließend wurden die befüllte Mikrotiterplatte auf -80°C abgekühlt, Es ist nicht möglich, den PCR Mastermix direkt in -80 °C kaltes Öl pipettieren, da dieser bei Eintauchen der Pipeftenspitze sofort in selbiger einfriert, Nach mehreren Stunden Lagerung bei -80 °C wurden die QMM-Kugeln aus dem Silikonöl entfernt und mit einer Pinzette in PCR-Reagiergefäße überführt, in welchen auch die Gefriertrocknung erfolgte, Dazu wurden die PCR-Tubes in -80 ° C kalten Aluminiumblöcken in eine Gefriertrocknungsanlage der Firma Christ (Christ Alpha 2-4) überführt und über Nacht bei ca, 0,02 mbar getrocknet, Am nächsten Tag erfolgte eine Nachtrocknung bei 30 °C und demselben Vakuum, Die auf diese Weise präparierten QMM-Lyophilisate wiesen noch immer eine Kugelform auf,
2, Kompatibilität der Silikonöl-Methode mit nachfolgenden enzymati- sehen Reaktionen
Für die Anwendbarkeit der hier beschriebenen Methode zur Herstellung kugelförmiger Lyophilisate ist es von Vorteil, dass sie kompatibel mit nachfolgenden enzymatischen Reaktionen ist; insbesondere, da für bestimmte Sili- konöle inhibitorische Eigenschaften auf PCR-Reaktionen bekannt sind,
In diesem Versuch wurde untersucht, wie sich unterschiedliche Probenvorbereitungen auf die Qualität des fertigen Lyophilisats auswirken, Dazu wurde QMM mit 0,2 Volumen 50 % (w/v) Trehalose-Lösung versetzt, sodass die fi- nale Trehalosekonzentration bei 10 % (w/v) lag, Diese Lösung wurde auf 4 verschiedene Weisen für die Gefriertrocknung vorbereitet: Die Mischung wurde a) in flüssigen Stickstoff getropft, b) in Silikonöl DC200 (erhältlich von Dow Chemical) aliquotiert, eingefroren und anschließend vom Silikonöl getrennt, in Silikonöl API 00 (erhältlich von Wacker) aliquotiert, eingefroren und anschließend vom Silikonöl getrennt, oder d) in ein 200 μΙ PCR-Tube pipettiert, welches in einen -80 °C kalten Alu- miniumblock gestellt und dadurch eingefroren wurde,
Die Proben wurden in gefrorenem Zustand (-80 °C) in die Lyophille überführt und bei ca, 0.02 mbar getrocknet. Danach erfolgte eine Nachtrocknung bei 30 °C. Die so erhaltenen wasserfreien Q MM -Produkte wurden einem Quali- tätskontrolltesf unterzogen und mit einem nicht lyophilisierten [QMM + 10% Trehalose]-Gemisch verglichen. In dieser Multiplex-PCR werden 10 Amplikons von Maus-gDNA erzeugt. Schwächung oder Wegfall einzelner Banden zeigt eine verschlechterte PCR-Effizienz des betreffenden Mixes an.
Die Ergebnisse des Qualitätskontroll (QC)-Testes sind in der Figur 4 darge- stellt. Die Abbildung zeigt folgende Proben (von links): Bahn 1, DNA- Größenmarker; Bahnen 2 und 3, nicht lyophilisierte Reagenzien; Bahnen 4 und 5, nach Methode d) behandelte und lyophilisierte Reagenzien; Bahn 6, nach Methode a) behandelte und lyophilisierte Reagenzien; Bahn 7, nach Methode b) behandelte und lyophilisierte Reagenzien; Bahn 8, nach Metho- de c) behandelte und lyophilisierte Reagenzien,
Der QC-Test zeigte dabei, dass die Trocknung nach den Methoden b) und d) ein Produkt erzeugt, dass noch alle 10 PCR-Produkte amplifizieren kann, Das nach Methode a) erzeugte Produkt zeigt eine Schwächung der beiden größ- ten Banden. Die nach Methode c) hergestellten Lyophilisate zeigten, dass das verwendete Silikonöl AP100 eine stark inhibierende Wirkung auf die PCR- Reaktion hat und somit als Medium zur Kugelformung ungeeignet ist. im Gegensatz dazu bestand das Silikonöl DC200 der Firma Dow Chemical die¬ sen PCR-QC-Test sehr gut. 3. Herstellung von kugelförmigen Produkten in einem großen Volumenbereich
Die hier beschriebene Methode zur Herstellung kugelförmiger Lyophilisate hat das Potenzial, das verarbeitbare Flüssigkeitsvolumen erheblich über die technische Machbarkeit gemäß der Patentanmeldung US 2007/0259348 AI zu erweitern. In der US 2007/0259348 AI wird die Herstellung von entsprechenden Volumina bis 35 μΙ beschrieben.
Die erfindungsgemäße Vorgehensweise hingegen erlaubt, wie nachfolgen- des Experiment zeigt, mindestens bis zu 100 μΙ Puffervolumen zu einem kugeligen Produkt zu verarbeiten,
In dem nachfolgenden Versuch wurde von der Möglichkeit Gebrauch gemacht, die zu trocknende Lösung in nicht vorgekühltes Silikonöl zu pipeffie- ren und dieses erst nachfolgend abzukühlen,
Zu diesem Zweck wurde die untere Öffnung eines TurboFilter 8 Strip (Fa. QIAGEN) mit Klebefolie verschlossen. Die einzelnen Säulchen wurden mit 300 μΙ Silikonöl DC200 (Viskosität: lOmPa ■ s befüllt und ungekühlt mit 3, 5, 10, 20, 35, 75 bzw, 100 μΙ QMM inklusive 5 % Trehalose beladen, Daraufhin formte sich die wässrige Lösung zu einer Kugel und sank auf Grund der höheren Dichte an den Boden des verwendeten Gefäßes, Danach wurde die QMM-Lösung durch Inkubation auf -30 °C gefroren, Die einzelnen Proben sind in Figur 5 dargestellt.
Das Silikonöl wurde durch Verwendung einer Vakuumstafion entfernt, die gefrorenen Kugeln auf -80 °C gebracht und abschließend in dem TurboFilter 8 Strip lyophilisiert. Figur 5 zeigt die lyophilisierten Kugeln, Die leichte Deformation insbesondere der großvolumigen Lyophilisate rührt daher, dass diese in zunächst flüssiger Form auf den Frittenboden des Gefäßes absanken und auf Grund des eigenen spezifischen Gewichts teilweise dessen Form annahmen.
4, Entfernen des Silikonöls
Im folgenden Experiment wird eine bevorzugte Möglichkeit beschrieben, dass Silikonöl von der gefrorenen Pufferkugel zu trennen, Diese Trennme- thode eignet sich durch die Möglichkeit der Poralieiisierung des Prozesses auch zur Herstellung größerer Stückzahlen an Lyophilisaten.
Um das zur Ausformung der Reagenzienkugel verwendete Silikonöl vor der Gefriertrocknung zu entfernen, wird folgendes Vorgehen durchgeführt: Das Öl wurde in ein oben und unten offenes Gefäß (TurboFilter 8 Strip bzw. Tur- boFilter 96 Plate; beide Fa. QIAGEN) gefüllt, dessen untere Öffnung zuvor verschlossen wurde (entweder mit Klebefolie oder durch Anpressen einer Schaumstoffmatfe). Anschließend wurde die zu lyophilisierende Lösung in das vorgekühlte Silikonöl gegeben. Daraufhin formte sich die wässrige Lö- sung zu einer Kugel und sank auf Grund der höheren Dichte an den Boden des verwendeten Gefäßes und fror bei der nachfolgenden Inkubation bei - 30 °C durch. Der Umstand, dass der Boden der einzelnen Filter-Säulchen aus einem grobporigen Frittenmaterial besteht, verhindert, dass sich die Puffer¬ kugeln während des Einfrierprozesses an die Bodenfläche anschmiegen und dadurch ihre Form verändern, Da beide Produkte (Strip sowie Plate) mit einer Vakuumstation mittels Unterdruck durch die am Boden befindliche Öffnung entleert werden können, wurde das Silikonöl auf diesem Wege von der gefrorenen Pufferkugel entfernt, Anschließend wurden die Kugeln auf -80 °C abgekühlt und danach lyophilisiert, Im hier beschriebenen Experiment wur- den die gefrorenen Kugeln aus der 96er-Platte entfernt und in ein mit einem Septum verschließbaren Gtas-Glasröhrchen überführt und darin gefriergetrocknet,
Durch die Verwendung von „TurboFilter 96 Plates" und einer Mehrkanalpi- pette (hier 8-Kanal, aber auch 96-Kanal Pipettierkopf verwendbar) ist es möglich, ohne großen Aufwand mehrere hundert Pufferkugeln pro Tag zu formen und zu trocknen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung lässt sich feststellen, ob Lyophilisate durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden:
So weisen die in dem vorliegenden Beispiel hergestellten Lyophilisate noch einen Restgehalt an Silikonöl auf, der zumindest per NMR-Spektroskopie (vgl. US 6,436,715) oder GC/MS-Kopplung (An epidemic of sticky siiicone oil at the Rotterdam Eye Hospital, Patient review and chemical analyses, Marc A, Veckeneer, Simone de Voogd, Eric W. Lindstedt, Dirk-Henning Menz and Jan C. van Meurs (2008) Graefe's Archive for Clinical and Experimental Oph- thalmology, Vol 246(6):917-22) nachweisbar ist,

Claims

Patentansprüche
1 , Verfahren zur Herstellung von einem festen Formkörper, enthaltend mindestens ein Reagenz, durch Gefriertrocknung einer flüssigen Phase, welche das mindestens eine Reagenz umfasst, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
P ) Bereitstellung einer ersten Phase, welche mindestens ein zu ge¬ friertrocknendes Reagenz enthält;
(2) Inkontaktbringen der ersten Phase mit einer zweiten Phase, wobei eine der beiden Phasen hydrophob ist und die andere Phase hydrophil ist;
(3) Einfrieren der ersten Phase in dem aus Verfahrensschritt (2) resultierenden System aus zwei Phasen und Entfernen der zweiten Phase aus dem System; und
(4) Gefriertrocknen der aus Verfahrensschritt (3) verbleibenden ersten Phase unter Erhalt eines im Wesentlichen kugelförmigen Lyophilisats.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Phase, welche das mindestens eine Reagenz umfasst, eine hydrophobe Phase ist,
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Phase dadurch aiiquotiert wird, dass sie in Kontakt gebracht wird mit einer zweiten hydrophilen Phase,
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Phase, welche das mindestens eine Reagenz umfasst, eine hydrophile Phase ist,
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Phase dadurch aiiquotiert wird, dass sie in Kontakt gebracht wird mit einer zweiten hydrophoben Phase, , Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Phase eine alkoholische oder wässrige Phase ist, , Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe Phase einen Bestandteil aufweist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Silikonöl, Paraf- f'inöl, organischen Ölen auf tierischer oder pflanzlicher Basis sowie auf Basis von Einzellern. , Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Phase einen Schmelzpunkt aufweist, welcher um mindestens 10 °C, vorzugsweise 15 °C, besonders bevorzugt 20 °C, niedriger ist als der Schmelzpunkt der ersten Phase. , Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile und die hydrophobe Phase PC -tolerant und/oder tolerant gegenüber enzymatischen Reaktionen sind, 0, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Blut bzw, dessen Bestandteile, Proteine, insbesondere Enzyme, Hormone, Antibiotika, Fettsäuren, Lipide, Kohlenhydrate mit beliebiger Kettenlänge, Polysaccharide, Impfstoffe, niedermolekulare chemische Verbindungen, deren Salze, Organika, Nukleinsäuren, Peptide, Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien, Hefen, Pilzen, Parasiten und Protozoen, Zellen und Vektoren,
11 , Formkörper, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Verwendung von Formkörpern gemäß Anspruch 11 zur Aliquotierung, Lagerung und Bereitstellung von Reagenzien, umfassend Salze, niedermolekulare Stoffe wie pH-Puffersubstanzen, Hormone, weiterhin Proteine, insbesondere Enzyme wie hydrolytische Enzyme, DNA-Polymera- sen, Resfriktionsendonukleasen, Ligasen, weiterhin Nukleinsäuren, ins- besondere Oligonukleotide wie Primer und fluoreszenzmarkierte Sonden, weiterhin Antibiotika, Fettsäuren, Lipiden oder Impfstoffen, Kombinierte Verwendung von hydrophilen und hydrophoben Phasen zur Erzeugung von im Wesentlichen kugelförmigen Flüssigkeitsvolumina im Rahmen der Gefriertrocknung,
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