EP4051383A1 - Inhibitoren für bromodomänen - Google Patents

Inhibitoren für bromodomänen

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Publication number
EP4051383A1
EP4051383A1 EP20797744.8A EP20797744A EP4051383A1 EP 4051383 A1 EP4051383 A1 EP 4051383A1 EP 20797744 A EP20797744 A EP 20797744A EP 4051383 A1 EP4051383 A1 EP 4051383A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alkyl
polysubstituted
mono
group
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20797744.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Carsten Bolm
Marcus FRINGS
Jan-Hendrik SCHÖBEL
Nicolas CHATAIN
Bianca ALTENBURG
Giulia ROSSETTI
Jonas GOSSEN
Steffen KOSCHMIEDER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH, Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP4051383A1 publication Critical patent/EP4051383A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/78—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • HATs histone acetyltransferases
  • HDACs histone deacetylases
  • BET bromodomains
  • BET proteins are important because they regulate normal transcription processes, but in various types of cancer they also determine the transcription of oncogenes such as c-myc and Bcl-2. A selective inhibition of the BET proteins is therefore of great importance for cancer therapies. Among other things, it could be shown that in acute myeloid leukemia (AML) and myeloproliferative neoplasias (MPN) BRD4 is a possible therapeutic target.
  • AML acute myeloid leukemia
  • MPN myeloproliferative neoplasias
  • WO 2010/141074 A2 also describes inhibitors of UDP-N-acetylglucosamine peptide N-acetylglucosaminyltransferase (O-GlcNAc -Transferase).
  • the compounds are structurally very similar.
  • a secondary sulfonamide group connects the western part of the molecule to which differently substituted aryls are bound. Modifications of the compounds concentrate on variations in the east and west halves of the Molecules There is a need for other compounds that can be used in the treatment of cancer and the development of new drugs.
  • X is selected from O or NR 1 , where R 1 is selected from the group comprising hydrogen, cyano, C 1-6 -alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-6 -alkyl C 3 -7 - Cycloalkyl, aryl, or hetaryl;
  • Y is selected from the group consisting of C 1-6 alkyl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-6 -alkyl-substituted C 3 -7-cycloalkyl, aryl or hetaryl, NH 2, NHR 2 and / or NR 2 R 3, wherein R 2 and R 3 are selected from the group consisting of C 1-6 - alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-2 -alkyl-substituted C 3 -7-cycloalkyl, aryl or hetaryl;
  • Z is selected from cyclohexyl aryl or hetaryl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-6 -alkyl, C 1-5 -alkoxy or mono- or polysubstituted by halogen-substituted C 1-6 -alkyl; and Me is methyl. It has been found that the compounds show pronounced inhibitory activity in various hematopoietic cell lines. This is particularly unexpected since there are significant structural differences in the central functionality compared to the known BET inhibitor PFI-1, and in particular changes in central functional groups such as the sulfonamide group of PFI-1 usually result in a loss of activity.
  • a variation of the substituents on the nitrogen atoms of the sulfonediimide or sulfonimidamide group or a variation of the alkyl group of the sulfoximine or sulfonediimide group allows optimization and adjustment of the selectivity. Such variations are not possible with sulfonamide structures.
  • the sulfoximine, sulfonimidamide and sulfonediimide groups open up the use of the stereochemistry at the central sulfur atom.
  • Sulphoximine, sulphonimidamide and sulphonediimide groups have a stereocenter with this, the substituents of which cannot change their relative days to one another, and this allows various spatial arrangements.
  • the compounds of the formula (1) can therefore exist in the form of the racemates, diastereomers or pairs of enantiomers.
  • the stereoisomers can be obtained by conventional methods, for example by means of high performance liquid chromatography (HPLC), racemate resolution or asymmetric synthesis.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the stereoisomeric compounds can differ with regard to their inhibitory activity. For example, it could be shown that the (S) -enantiomer of a sulfoximine had a higher inhibitory effect on the growth and viability of furkemia cell lines compared to PFI-1.
  • sulfonimidamides compounds in which the substituent Y is selected from NH 2 , NHR 2 or NR 2 R 3 , can also be present in the form of their tautomers.
  • C 1-6 -alkyl includes, if not stated otherwise, straight-chain or branched alkyl groups with 1 to 6 carbon atoms, in particular selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl, Neopentyl, hexyl and isohexyl.
  • C 3-7 cycloalkyl groups are preferably selected from the group comprising cyclopropyl, cyclopentyl and / or cyclohexyl.
  • C 1-5 alkoxy groups are preferably selected from the group comprising methoxy, ethoxy, linear or branched propoxy and / or butoxy.
  • aryl is to be understood as meaning aromatic radicals with 6 to 10 carbon atoms.
  • aryl preferably includes carbocycles, in particular phenyl.
  • heteroaryl is to be understood as meaning monocyclic or bicyclic heteroaryl groups comprising one, two, three or four heteroatoms selected from the group comprising N, O and / or S.
  • Preferred heteroaryl groups are monocyclic heteroaryl groups, in particular C 5-6 heteroaryls.
  • Preferred monocyclic heteroaryl groups have a heteroatom selected from N, O or S.
  • Preferred heteroaryl groups are selected from the group comprising pyridyl and / or pyrimidyl, with pyridyl being preferred.
  • halogen includes fluorine, chlorine, bromine and iodine, with fluorine or chlorine being preferred.
  • salt is to be understood as meaning forms of the compound in which it assumes an ionic form or is charged and is present with cations or anions as a counterion or is in solution.
  • pharmaceutically acceptable salts in the context of this invention are understood as meaning salts formed with a physiologically acceptable inorganic or organic base which are physiologically acceptable, in particular when used in humans.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds according to the invention are selected, for example, from the group comprising sodium, potassium and / or lithium salts.
  • salt is to be understood in particular to include pharmaceutically acceptable addition salts, in particular base addition salts, for example salts of the compounds with inorganic bases such as alkali or alkaline earth metal hydroxides.
  • a preferred group of compounds are sulfoximines.
  • the substituent X is oxygen.
  • the substituents are:
  • Y is selected from the group consisting of C 1-6 - alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-2 -alkyl-substituted C 3 -7-cycloalkyl, aryl or hetaryl; and
  • Z is selected from cyclohexyl, aryl or hetaryl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-6 -alkyl, C 1-5 -alkoxy or mono- or polysubstituted by halogen-substituted C 1-6 -alkyl.
  • Y is selected from the group consisting of C 1-5 - alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-2 alkyl substituted C 5-6 cycloalkyl or phenyl, preferably selected from C 1-3 alkyl, especially methyl or ethyl; and
  • Z is selected from cyclohexyl or phenyl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-3 -alkoxy, in particular cyclohexyl or phenyl, in each case unsubstituted or monosubstituted by methoxy.
  • the substitution is preferably in the ortho position.
  • the compound is selected from the group comprising the compounds according to the following formulas (MF1), (MF2), (MF3) or (MF4):
  • the compounds MF1, MF2 and MF3 showed pronounced inhibitory activity in various hematopoietic cell lines, in particular erythroleukemia cell lines and acute myeloid leukemia (AML) cell lines. In particular, a level comparable to PFI-1 could be achieved Activity of the respective racemic mixtures of the compounds MF1, MF2 and the achiral compound MF3 can be shown.
  • the compound is the (S) -enantiomer of the compounds of the formulas (MF1) or (MF2).
  • the compound is the (S) -enantiomer of the compound of the formula (MF2). This has the following formula (MF2-S):
  • the (S) -enantiomer of the compound of the formula (MF2) MF2-S showed an excellent inhibition of the cell proliferation of hematopoietic cell lines.
  • MF2-S was able to reduce the metabolic activity of the erythroleukemia cell line HEL (JAK2V617F positive) and the AML line Molm-14 (FLT3-ITD positive) significantly more than the well-known BET inhibitor PFI-1.
  • the (S) -enantiomer of the compound of the formula (MF2) also showed a better activity in the inhibition of cell division and the induction of cell death in the HEL and AML cell lines.
  • MF2-S a connection can be made available that has an improved efficiency compared to PFI-1.
  • the (S) - enantiomer of the compound of the formula (MF2) showed better inhibition of cell growth than PFI-1 in human samples from AML patients.
  • the compound can also be the (R) -enantiomer of the compound of the formula (MF2) corresponding to the compound according to the following formula (MF2-R):
  • MF2-R showed an inhibition of cell proliferation of Feukemia cell lines, while MF2-S showed a higher efficiency.
  • substituent Z in particular cyclohexyl or phenyl, can each be monosubstituted by methoxy. The substitution is preferably in the ortho position.
  • the sulfoximine can have a structure according to the following formula (MF1):
  • the racemic mixture of the compound (MF1) also showed inhibitory activity in the hematopoietic cell lines, in particular erythroleukemia cell lines and acute myeloid leukemia (AML) cell lines.
  • the compound is the (S) -enantiomer of the compound of formula (MF1).
  • This has the following formula (MF1-S):
  • the (S) -enantiomer MF1-S showed a comparable effect on the metabolic activity of the hematopoietic cell lines of HEL and Molm-14 cells such as PFI-1.
  • the compound can further be the (R) -enantiomer of the compound of the formula (MF1).
  • This has the following formula (MF1-R):
  • the (R) -enantiomer MF1-R showed a low inhibitory effect in hematopoietic cell lines.
  • the compound is one of the enantiomers of the compound of the formula (MF4) selected from (+) - N- (3-methyl -2-oxo- 1, 2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) -S- cyclohexyI-5-methyisulfoximine and (-) - N- (3-methyl -2-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) -S-cyclohexyl-5-methyisulfoximine.
  • Another preferred group of compounds are sulfonediimides.
  • the substituent X is a group NR 1 .
  • the substituents are:
  • X is NR 1 wherein R 1 is selected from the group consisting of hydrogen, cyano, C 1-6 - alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-2 - alkyl substituted C3 -7 cycloalkyl, aryl or Hetaryl;
  • Y is selected from the group comprising C 1 -6 - alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted with C 1-2 -alkyl-substituted C 3 -7-cycloalkyl, aryl or hetaryl;
  • Z is selected from cyclohexyl, aryl or hetaryl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-6 -alkyl, C 1-5 -alkoxy or mono- or polysubstituted by halogen-substituted C 1-6 -alkyl.
  • R 1 is selected from the group comprising hydrogen, C 1-5 -alkyl or aryl, in particular methyl or phenyl or hydrogen;
  • Y selected from the group comprising C 1-5 -alkyl and / or in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-2 -alkyl, C 5-6 -cycloalkyl or phenyl, preferably selected from C 1-3 -alkyl, in particular methyl ;
  • Z selected from aryl, especially phenyl.
  • the compound is selected from the group comprising the compounds according to the following formulas (JHS1), (JHS2) or (JHS3) or is one of their stereoisomers:
  • JHS1 also showed inhibitory activity in the hematopoietic cell lines, in particular erythroleukemia cell lines and acute myeloid leukemia (AML) cell lines. JHS1 was able to inhibit the metabolic activity of HEL and Molm-14 cells at concentrations of 10 and 20 ⁇ M.
  • the compound is the (S) -enantiomer of the compound of the formula (JHS1).
  • This has the following formula (JHS1-S):
  • the (S) -enantiomer JHS1-S showed a comparable effect on the metabolic activity of the hematopoietic cell lines of HEL and Molm-14 cells such as PFI-1.
  • the (R) -enantiomer JHS1-R showed an inhibitory effect in hematopoietic cell lines that was almost as high as that of the (5) -enantiomer JHS1-S.
  • sulfonediimides can be selected from the compounds according to the formulas (JHS2) and (JHS3). These compounds showed a low inhibitory activity in the examined leukemia cell lines.
  • Another preferred group of compounds are sulfonimidamides and their tautomers.
  • the substituent Y is an amino group NH 2 , NHR 2 or NR 2 R 3 .
  • the substituents are:
  • Y selected from the group comprising NH 2 , NHR 2 and / or NR 2 R 3 , where R 2 and R 3 are selected from the group comprising C 1-6 -alkyl and / or each unsubstituted or singly or multiply with C. 1-2 -alkyl-substituted C 3 -7 cycloalkyl, aryl or hetaryl; and
  • Z is selected from cyclohexyl, aryl or hetaryl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-6 -alkyl, C 1-5 -alkoxy or mono- or polysubstituted by halogen-substituted C 1-6 -alkyl.
  • Y selected from NH 2 , NHR 2 and / or NR 2 R 3 , where R 2 and / or R 3 is selected from the group comprising C 1-6 -alkyl and / or in each case unsubstituted or singly or multiply with C 1-2 alkyl-substituted C 3 -7-cycloalkyl, aryl or hetaryl; in particular, NR 2 R 3 is piperidyl.
  • Z is selected from cyclohexyl or phenyl, in each case unsubstituted or mono- or polysubstituted by C 1-3 alkoxy, in particular phenyl.
  • the compound is selected from the group comprising the compound according to the following formula (JHS4) or one of its enantiomers:
  • the compounds are used as inhibitors of the bromodomain, in particular the protein family of the BET proteins, for. B. BRD2-4, which influence the initiation and elongation of gene transcription and cell growth, are suitable for the treatment of diseases associated with bromodomains.
  • diseases associated with bromodomains include autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancers.
  • a use of the compounds in the treatment of autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancer diseases, in particular cancerous cell growth mediated by BET proteins, is therefore a further aspect of the present invention.
  • the term “cancer” is understood to mean generally malignant (malignant) diseases which are characterized by an uncontrolled proliferation of altered cells.
  • Another object of the invention relates to a use of the compounds for the production of a medicament, in particular for the production of a medicament for the treatment of a disease associated with bromodomains.
  • Diseases associated with bromodomains are preferably selected from autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancer diseases, in particular acute myeloid leukemia or myeloproliferative neoplasias.
  • a corresponding object of the invention relates to a compound according to the invention for use as a medicament, in particular for use in the treatment of a disease associated with bromodomains, preferably autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancers, in particular acute myeloid leukemia or myeloproliferative neoplasms.
  • Cancer diseases are in particular bone marrow diseases or leukemias ("blood cancer").
  • Leukemia is the term used to describe malignant diseases that mostly originate in the bone marrow or hematopoietic stem cells and that can usually first be detected in the blood.
  • a distinction can also be made here between acute and chronic leukemia.
  • bone marrow diseases are acute lymphocytic leukemia (ALL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL), which affect lymphocytic cells, and acute myeloid leukemia (AML) or myelodysplastic syndrome (MDS).
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • the term myeloproliferative neoplasia is a group of rare, malignant diseases of the bone marrow in which too many red blood cells, white blood cells and / or platelets are formed.
  • the MPN includes the Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia (CML) and the Philadelphia chromosome negative polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF), whereby the PV and the ET are one Myelofibrosis can develop, which drastically worsens the clinical picture.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • PV Philadelphia chromosome negative polycythemia vera
  • ET essential thrombocythemia
  • PMF primary myelofibrosis
  • Acute leukemia can develop from MPN rather less often.
  • BET proteins have been identified as possible targets of therapy, both single therapies and combination therapies.
  • Treatment can include therapeutic and / or prophylactic treatment
  • Treatment of a disease associated with bromodomains in a mammal is preferred.
  • a preferred group of compounds are sulfoximines, preferably the compounds of the formula (MF2), in particular the (S) -enantiomers of the formulas (MF2-S), or of the formula (MF1), in particular the (S) -enantiomer of the formula (MF1 -S).
  • Another preferred group of compounds are sulfonediimides, preferably the compound of the formula (JHS1), in particular the (S) -enantiomer of the formula (JHS1-S) or the (R) -enantiomer of the formula (JHS1-R).
  • Another preferred group of compounds are sulfonimidamides in which the substituent Y is an amino group NH 2 , NHR 2 or NR 2 R 3 or their tautomeric form, preferably the compounds according to the formula (JHS4).
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition or a medicament containing at least one compound according to the invention, in particular for use in the treatment of a disease associated with bromodomains, preferably cancer diseases, in particular acute myeloid leukemia or myeloproliferative neoplasias.
  • the compounds according to the general formula (1) show a pronounced inhibitory activity in various hematopoietic cell lines. These effects make it possible to use the compounds in medicaments for the treatment of diseases which are related to bromodomains, preferably autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancer diseases, in particular acute myeloid leukemia or myeloproliferative neoplasias.
  • diseases which are related to bromodomains, preferably autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancer diseases, in particular acute myeloid leukemia or myeloproliferative neoplasias.
  • the pharmaceutical composition or the medicament preferably contains a sulfoximine, preferably the compounds according to the formula (MF2), in particular the (S) -enantiomers of the formulas (MF2-S), or of the formula (MF1), in particular the (S) -enantiomer of Formula (MF1-S).
  • the pharmaceutical composition or the drug further preferably contains a sulfonediimide, preferably the compound of the formula (JHS1), in particular the (S) -enantiomer of the formula (JHS1-S) or the (R) -enantiomer of the formula (JHS1-R).
  • the pharmaceutical composition or the drug further preferably contains a sulfonimidamide in which the substituent Y is an amino group NH 2 , NHR 2 or NR 2 R 3 , or their tautomeric form, preferably the compounds according to the formula (JHS4).
  • composition or the medicament can furthermore comprise pharmaceutically acceptable auxiliary substances and / or carriers.
  • auxiliary substances can be present, for example, as tablets, film tablets or capsules, also in retarded form, and can contain conventional excipients such as binders, fillers, lubricants, disintegrating agents such as starch or wetting agents.
  • a tablet is soluble in water.
  • Oral liquid preparations can be in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups, or elixirs Sprays are available.
  • Carrier substances that can be used are, for example, organic or inorganic substances which are suitable for enteral, for example oral or rectal, or parenteral administration and which do not react with the compounds, for example water, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols, glycerol triacetate and other fatty acid glycerides, gelatin, soy lecithin , Carbohydrates such as lactose or starch, magnesium stearate, talc or cellulose.
  • organic or inorganic substances which are suitable for enteral, for example oral or rectal, or parenteral administration and which do not react with the compounds, for example water, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols, glycerol triacetate and other fatty acid glycerides, gelatin, soy lecithin , Carbohydrates such as lactose or starch, magnesium stearate, talc or cellulose.
  • the drug or the composition can be present and / or administered as a liquid, semi-solid or solid drug form, for example in the form of injection solutions, drops, juices, syrups, sprays, suspensions, tablets, capsules or in the form of pellets or granules. Preparations in the form of tablets, coated tablets, capsules or granules are preferably suitable for oral administration.
  • the drug or composition can be sterilized.
  • the composition or the medicament can be administered orally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally.
  • FIG. 1 shows the metabolic activity, which indicates the viability, after incubation for 72 hours with the compounds MF1-R, MF1-S, JF1S1-R and JF1S1-S in the stated concentration for FIEL, Molm-14 and K562 cells, respectively in Figure 1A-C. Standard deviations (SD) are shown.
  • FIG. 2 shows the metabolic activity after incubation for 72 h with the compounds JHS1,
  • FIG. 2A shows the metabolic activities after incubation for 72 h with the compounds PFI-1,
  • FIG. 4 shows the average cell numbers during the incubation with the compounds PFI-1, MF2, MF2-S and MF2-R for FIEL, Molm-14 and K562 cells in each case in FIGS. 4A-C, the relative viability in FIG. 4D 72 h incubation and in FIG. 4E the cell cycle analysis.
  • FIG. 5 shows the viability after incubation with the compounds PFI-1, MF2, MF2-S and MF2-R for HEL, Molm-14 and K562 cells in FIGS. 5A-C, the relative viability in FIG. 5D after incubation for 72 h and in FIG. 5E Western blots of the cell lysates,
  • FIG. 6 shows the number of colonies in colony forming assays (CFU assays) with mononuclear cells of peripheral blood (PBMC) or CD34 + cells from healthy donors treated with 5 ⁇ M PFI-1 or MF2-S in FIG. 6A
  • FIG. 6B shows the results of the CFU assays of 3 AML patients
  • FIG. 6C the results of the CFU assays with mononuclear cells from three MPN patients (PV, PMF, ET),
  • FIG. 7 shows the selectivity of the compound MF2-S and the comparison compound PFI-1 on the basis of the ATm values obtained by a thermal shift assay in FIG. 7A.
  • FIG. 7B shows the specificity of proteins containing bromodomains for the comparison compound PFI-1, and FIG. 7C for the compound MF2-S.
  • the patients' peripheral blood and bone marrow were provided by the Clinic for Flematology, Oncology, Flemostaseology and Stem Cell Transplantation (Med. Clinic IV) (EK 127/12) and the centralized biomaterial bank, University Clinic Aachen.
  • the healthy controls were provided by the Institute for Transfusion Medicine (EK099 / 149), University Hospital Aachen. All donors / patients have given a written declaration of consent.
  • cell lines FIEL, Molm-14- and K562 obtained from DSMZ: ACC-11, ACC-10 and ACC-777 were carried out under sterile conditions under the sterile bench. The incubation took place at 37 ° C. in an incubator with a CO 2 saturation of 5%. For the passage of the suspension cells, the cells were transferred to a Falcon with PBS (phosphate buffered saline) and centrifuged for 5 min at 1200 rpm. All three cell lines were cultivated in RPMI-1640 medium (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Darmstadt, Germany) with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin.
  • RPMI-1640 medium Gibco, Thermo Fischer Scientific, Darmstadt, Germany
  • the cell number and viability were determined using Trypan blue staining. The corresponding concentrations of the inhibitors were added per mL of medium or the correspondingly highest volume of DMSO was added as a control group.
  • the viability and metabolic activity of the cells were measured with the MTT assay.
  • the yellow, water-soluble MTT (3- (3,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-dephenyltetrazolium bromide) is a tetrazolium salt that is reduced to the dark blue formazan in living cells.
  • the insoluble formazan is released by adding isopropanol-HCl and its intensity can be determined photometrically at a wavelength of 550 nm. In this way, the proportion of living cells is measured in comparison to a specific control sample.
  • the cells were counted, washed with PBS and 30,000 cells were seeded in triplicates per well in a 96-well plate. The stated final concentrations were used for the inhibitor treatment. For this purpose, 10 ⁇ L of the corresponding inhibitor dilution were placed in the 96-well plates and 90 ⁇ L of cell suspension were then pipetted into it. The plates were incubated for 72 h in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). After incubation, 10 ⁇ L of MTT solution (5 mg / mL) were applied to the sore using a multi-channel pipette and thoroughly resuspended. This was followed by incubation for 4 hours in the dark at room temperature.
  • the cells were then resuspended in 100 ⁇ L isopropanol-HCl, lysed and the absorption was measured photometrically with the plate reader (Kayto, RT-2100C) at a wavelength of 550 nm.
  • the influence of the inhibitors used on the cell cycle was examined by means of propidium iodide staining of the fixed cells.
  • the cells were fixed with 95% ethanol at -20 ° C, RNA was destroyed by RNase (100 ⁇ g / mL) for 15 min at 37 ° C and the DNA was destroyed by means of propidium iodide (50 ⁇ g / mL) stained.
  • the cell cycle phases were analyzed on a flow cytometer (Gallios (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) and the data evaluated using FlowJo software (version 10).
  • Cell lysates were produced with RIPA lysis buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1% Triton-X, 15% glycerol, 0.5% sodium deoxycholate, and protease / phosphatase inhibitors). Protein concentrations were determined with the Bradford Protein Assay on a Nanodrop Spectrometer (NanoDrop 2000 / 2000c System, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany) at 595 nm. 4xLämmli sample buffer was added to 25 ⁇ g of the protein lysate, 5 min at 65 ° C denatured and inserted into the SDS page.
  • RIPA lysis buffer 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1% Triton-X, 15% glycerol, 0.5% sodium deoxycholate, and protease / phosphatase inhibitors. Protein concentrations were determined with the Bradford Protein As
  • the proteins were transferred to a PVDF membrane at 100 mA overnight using the wet blot method in Towbin buffer (3 g Tris, 14.4 g glycine, 5% methanol per liter ddH2O).
  • Towbin buffer 3 g Tris, 14.4 g glycine, 5% methanol per liter ddH2O.
  • the membrane was blocked with 10% BSA in TBS-T buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05% IGEPAL).
  • the primary antibodies were incubated with the membrane overnight at 4 ° C. and the HRP-labeled for 45 min at room temperature.
  • the proteins were detected using PCA-ECL solution on a chemiluminescence detector (Fusion SL, PeqLab).
  • the colony formation capacity of individual cells can be determined in a semi-solid methyl cellulose medium (MethoCult H4434, StemCell Technologies, Cologne, Germany). The number of colonies was determined after 7-11 days.
  • Mononuclear cells of the bone marrow from AML patients 7x10 5 cells / mL PBMCs from PV, ET or PMF patients: 4x10 5 cells / mL
  • CD34 + toes (G-CSF mobilized from stem cell donors) of the healthy donors 2x10 4 cells / mL; PBMCs of the healthy volunteers: 4x10 5 cells / mL.
  • Vital sterile mononuclear bone marrow cells from AML patients were placed in 1.5 mL BIT medium in 8.5 mL IMDM medium (mixed with 5 ⁇ L FLT3 ligand, 10 ⁇ L rh SCF, 2 ⁇ L rh IL-3, 2 ⁇ L rh G-CSF, 50 ⁇ L ciprofloxacin and 6.99 ⁇ L ß mercaptoethanol in 1: 100 dilution) before they were used in the CFU assay. Melting points (m.p.)
  • the melting points were determined in open capillaries in a metal heating block with a digital thermometer.
  • NMR measurements were carried out for the nuclei 1 H and 13 C at the measuring frequencies 600 MHz or 400 MHz ( 1 H) and 151 MHz or 101 MHz ( 13 C) in deuterated solvents such as e.g. B. chloroform, dichloromethane or dimethyl sulfoxide. 13 C-NMR spectra were measured without exception 1 H broadband decoupled.
  • the sample measurement was carried out with attenuated total reflection (ATR).
  • ATR attenuated total reflection
  • EI electron impact ionization
  • CI chemical ionization
  • ESI electrospray ionization
  • the specific rotation values [ ⁇ ] D have the unit deg cm 3 dm -1 g -1 .
  • the concentration c was given with the unit g (100 mL) -1 .
  • 6-Bromo-3-methyl-3,4-dihydroquinazolin-2 (1 H) -one was prepared as described in WO 2013/027168 A1.
  • the sulfoximines, achiral, racemic or their respective (S) - and (R) -enantiomers, were prepared according to methods as described in Angew. Chem. 2016, 128, 7319-7323 or Chem. Commun. 2017, 53, 348-351 or Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 909-912 or Acta Chem. Scand. 1996, 50, 305-315.
  • the sulfonediimides were prepared by methods as described in Angew. Chem. 2012, 124, 4516-4519.
  • the sulfonimidamides were prepared by methods as described in Chem. Eur. J. 2017, 23, 15189-15193.
  • the reaction mixture was cooled to room temperature, water was added and the mixture was stirred for 1 h.
  • the solid was filtered off with suction and examined by NMR spectroscopy.
  • the volume of the filtrate was reduced in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 40 ° C. until solid again precipitated, which was again filtered off with suction and analyzed by NMR spectroscopy. This procedure was repeated several times. Sufficiently clean solid fractions were combined and the product was isolated as a sand-colored solid with a melting point> 240 ° C. (decomposition). The connection was confirmed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry studies.
  • a pressure tube was filled with 5- (2-methoxyphenyl) -5-methylsulfoximine (1.6 equiv.), 6-bromo-3-methyl-3,4-dihydroquinazolin-2 (1H) -one, cesium carbonate (1.6 equiv.), Tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0) (0.13 equiv.), 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (0.22 equiv.) and a magnetic stir bar.
  • the pressure tube was evacuated in a high vacuum and vented with argon.
  • connection was confirmed by infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry studies.
  • test tube was filled with (S) -S- (2-methoxyphenyl) -S-methylsulfoximine, (3-methyl-2-oxo-1, 2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) boronic acid (1.8 equiv.), Copper (II) acetate (0.17 equiv.) And a magnetic stir bar.
  • Dry methanol (c 0.26 mol / L) was added to the test tube.
  • the test tube was placed in a round bottom flask on which a drying tube filled with calcium chloride was placed.
  • the reaction mixture was stirred in air at room temperature for 43 hours.
  • the solvent was in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 50 ° C away.
  • the remaining residue was column chromatography (silica gel,
  • test tube was placed in a round bottom flask on which a drying tube filled with calcium chloride was placed.
  • the reaction mixture was stirred in air at room temperature for 22 hours.
  • the solvent was removed in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 50 ° C.
  • the remaining residue was column chromatography (silica gel,
  • test tube was filled with (S) -S-methyl-S-phenylsulfoximine, (3-methyl-2-oxo-1, 2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) boronic acid (2.0 equiv.), Copper (II) acetate (0.11 equiv.) and a magnetic stir bar.
  • Dry methanol (c 0.3 mol / L) was added to the test tube.
  • the test tube was placed in a round bottom flask on which a drying tube filled with calcium chloride was placed.
  • the reaction mixture was stirred in air at room temperature for 40 hours.
  • the solvent was removed in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 50 ° C. The remaining residue was column chromatography (silica gel,
  • test tube was filled with (R) -S-methyl-S-phenylsulfoximine, (3-methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) boronic acid (2.3 equiv.), Copper (II) acetate (0.11 equiv.) and a magnetic stir bar.
  • Dry methanol (c 0.3 mol / L) was added to the test tube.
  • the test tube was placed in a round bottom flask on which a drying tube filled with calcium chloride was placed.
  • the reaction mixture was stirred in air at room temperature for 23 hours.
  • the solvent was removed in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 50 ° C.
  • a pressure tube was filled with 5,5-diphenylsulfoximine, 6-bromo-3-methyl-3,4-dihydroquinazolin-2 (1H) -one (1.7 equiv.), Cesium carbonate (2.1 equiv.), Tris (dibenzylidene acetone) dipalladium (0 ) (0.11 equiv.), 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (0.18 equiv.) And a magnetic stir bar.
  • the pressure tube was evacuated in a high vacuum and vented with argon.
  • the diethyl ether was pipetted off and the product was isolated as a white solid with a melting point of 225-227 ° C.
  • the connection was confirmed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry and infrared spectroscopy studies.
  • the compound was synthesized by two methods A and B.
  • Method A A pressure tube was filled with S-cyclohexyl-S-methylsulfoximine, 6-bromo-3-methyl-3,4-dihydroquinazolin-2 (1 H) -one (1.7 equiv.), Cesium carbonate (2.4 equiv.), Tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0) (0.1 equiv.), 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (0.15 equiv.) and a magnetic stir bar.
  • the pressure tube was evacuated in a high vacuum and vented with argon.
  • the enantiomer (-) - N- (3-methyl-2-oxo-1, 2,3,4-tetrahydroquinazolin-6-yl) -5-cyclohexyl-5-methylsulfoximine had a melting point of 195-
  • the Schenk tube was evacuated in a high vacuum and vented with argon.
  • Method B The sulfonediimide or sulfonimidamide (3-methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydroquinazoIin-6-yl) boronic acid (1.5 equiv.) and copper (II) acetate (0.2 equiv.) added.
  • the Schenk tube was evacuated in a high vacuum and vented with argon. Dry dimethylformamide or methanol was added in argon countercurrent, the septum was replaced by a drying tube filled with calcium chloride and the solution was stirred for 24 hours at room temperature.
  • the solvent in the filtrate was removed in a membrane pump vacuum at a water bath temperature of 40 ° C. and the residue was purified by column chromatography on silica gel with a dichloromethane / methanol gradient solution (1: 0 to 30: 1).
  • connection was successfully produced using method A as well as method B in DMF, confirmed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry and infrared spectroscopy examinations and had a melting point of 102-103 ° C.
  • the compound was prepared using Method B in methanol, using
  • the compound was prepared using Method B in methanol, using
  • Nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry and infrared spectroscopy investigations confirmed and had a melting point of 92-93 ° C.
  • the compound was produced using Mathode A and Method B in DMF, confirmed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry and infrared spectroscopy examinations and had a melting point of 129-130 ° C.
  • Example 2 Investigation of the effects of the enantiomers MF1-R, MF1-S, JHS1-R and JHS1-S on the metabolic activity in leukemia cell lines
  • the erythroleukemia cell line HEL (JAK2V617F-positive), the AML cell line Molm-14 and the chronic myeloid leukemia (CML) cell line K562 (BCR-ABL- positive) were used for cell experiments.
  • the compounds MF1-R, MF1-S, JHS1-R and JHS1-S were dissolved in DMSO and used in concentrations of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 20 ⁇ M, respectively. Accordingly, DMSO was carried out as a control treatment and its metabolic activity was set as 100%.
  • the cell lines HEL, Molm-14 and K562 were with the respective compounds in the various Treated concentrations and after 72 h in culture, the metabolic activity, which provides information about the growth of the cells, was determined by means of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay.
  • Example 3 Investigation of the effects of the compounds JHS1, JHS2, MF2 and JHS3 on the metabolic activity in leukemia cell lines
  • Racemic mixtures of the compounds JHS1, JHS2, MF2 and JHS3 were dissolved in DMSO and used in concentrations of 10 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 20 ⁇ M and DMSO was carried out as a control treatment in each case.
  • the cell lines HEL, Molm-14 were treated as described in Example 2 with the respective compounds in the various concentrations and, after 72 hours, the metabolic activity was determined by means of the MTT assay.
  • Example 4 Investigation of the effects of the enantiomers MF2-R and MF2-S on the metabolic activity in leukemia cell lines
  • the two enantiomers of MF2 were each synthesized individually and MF2-R and MF2-S were examined individually in the MTT cell experiment as described under Example 2 and compared with the racemic mixture MF2 and PFI-1.
  • the mean inhibitory concentration (IC50) was also calculated.
  • FIGS. 3A-C The metabolic activities determined for the HEF, Molm-14 and K562 cells are shown in FIGS. 3A-C, respectively.
  • the IC 50 values for the HEF, Molm-14 and K562 cells are each shown in FIG. 3D-F.
  • FIG. 3 it was found that the compound MF2-S significantly increased the metabolic activity of HEF cells (FIG. 3A, D; 37.24% ⁇ 6.19 vs.
  • Example 5 Investigation of the effects of the enantiomers MF2-R and MF2-S on the proliferation in leukemia cell lines
  • HEL, Molm-14 and K562 cells were incubated in triplicate with 1 or 5 ⁇ M each of the enantiomers MF2-R and MF2-S and the cell counts of the cells treated in this way were determined at the start time and after 24, 48 and 72 h determined and documented after Trypan blue staining in the Thoma chamber.
  • the cell growth described here is called proliferation and provides information about the cell divisions carried out in the specified period.
  • FIGS. 4A-C The respective average cell numbers for HEL, Molm-14 and K562 cells are shown in FIGS. 4A-C, respectively.
  • FIG. 4D shows the relative cell number and FIG. 4E the average cell population.
  • the (S) -enantiomer MF2-S was compared to PFI-1 significantly reduced the cell proliferation of HEL and Molm-14.
  • FIG. 4D shows the significant reduction for 5 ⁇ M MF2-S compared to PFI-1.
  • the synthesis phase (S phase) was more strongly inhibited by MF2-S than by PFI-1, the increase in the G0 / G1 phase being typical of a block in the cell cycle.
  • the subG1 phase indicates the percentage of dead cells and here, too, significantly higher proportions of HEL and Molm-14 cells were enriched when treated with MF2-S.
  • FIG. 5D shows the relative viability for 5 ⁇ M PFI-1 and MF2-S. As can be seen from FIGS. 5A-D, especially MF2-S in a concentration of 5 ⁇ M significantly reduced the viability of the HEL and Molm-14 cells compared to PFI-1.
  • a possible induction of apoptosis in the cell lines described by the compound MF2 was investigated.
  • the cleavage of the protein PARP1 is an indication of the beginning apoptosis (cell death) of the cells and accordingly the cleavage products of PARP1 were examined by means of Western blot.
  • cell lysates were produced with RIPA lysis buffer. Protein concentrations were determined with the Bradford Protein Assay on a Nanodrop Spectrometer at 595 nm. 4xLämmli sample buffer was added to 25 ⁇ g of the protein lysate, denatured for 5 min at 65 ° C. and inserted into the SDS page. The proteins were transferred to a PVDF membrane at 100 mA overnight using the wet blot method. The membrane was blocked with 10% BSA in TBS-T buffer. The primary antibodies were incubated with the membrane overnight at 4 ° C. and the HRP-labeled for 45 min at room temperature.
  • the proteins were detected using PCA-ECL solution on a chemiluminescence detector (Fusion SL, PeqLab). Cells treated with DMSO served as controls. The protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) was determined in order to demonstrate a uniform application of the amount of protein.
  • GADPH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Figure 5E shows the Western blots of the HEL, Molm-14 and K562 cell extracts.
  • the marked band for the PARP1 cleavage product in HEL cells was more pronounced after 48 h treatment with MF2-S than after PFI-1 treatment, while the band appeared equally strong in Molm-14 cells .
  • less uncleaved PARP1 could be seen after 48 h treatment with 5 ⁇ M MF2-S.
  • MF2-S 5 ⁇ M
  • CFU assays colony formation assays
  • PB MC mononuclear toes from peripheral blood
  • CD34 + cells CD34-positive stem toes
  • Figure 6A shows the colony numbers of the four controls.
  • treatment with 5 ⁇ M PFI-1 or MF2-S reduced the number of colonies in controls 1 (PB MC) and 2 (CD34 + cells).
  • PB MC controls 1
  • CD34 + cells controls 1
  • a concentration of 1 ⁇ M MFS-2 or PFI-1 was also used in CD34 + controls 3 and 4.
  • 1 ⁇ M MFS-2 or PFI-1 reduced the number of colonies in the controls to a lesser extent.
  • the number of colonies was not significantly reduced by 1 ⁇ M MF2-S.
  • Figure 6B shows the results of the CFU assays of three AML patients.
  • MF2-S in the respective concentrations of 1 ⁇ M and 5 ⁇ M reduced the number of colonies significantly more than PFI-1.
  • 1 ⁇ M MF2-S was found to be just as efficient as 5 ⁇ M PFI-1.
  • FIG. 6C shows the results of the CFU assays of the three MPN patients.
  • Myeloproliferative neoplasms include three classic Philadelphia chromosome negative (BCR-ABF negative) disease entities which are polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF). Both PV and ET can progress into myelofibrosis (MF), which usually means a fatal worsening of the disease and the success of the treatment. All MPN patients involved in these studies were JAK2V617F- positive.
  • the treatment of the cells in the CFU assay with 5 ⁇ M MF2-S resulted in a significantly greater reduction in the number of colonies.
  • 1 ⁇ M MF2-S reduced the number of colonies from material from the PMF patient very efficiently, whereas this was not the case with the material from the ET patient compared to PFI-1.
  • FIG. 7A shows the ⁇ Tm values obtained by the thermal shift assay against DMSO control for the compound MF2-S and the comparison compound PFI-1.
  • MF2-S binds proteins of the BET family equally well or better than the comparison compound PFI-1.
  • FIG. 7B illustrates the specificity of all analyzed bromodomain-containing proteins for the comparison compound PFI-1
  • FIG. 7C for the compound MF2-S.
  • temperature changes with increasing radius are given for higher Tm values. How to do the

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1), sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels insbesondere zur Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, wie Krebserkrankungen.

Description

Inhibitoren für Bromodomänen
B e s c h r e i b u n g
Durch posttranslationale Modifikation kontrollieren Histonacetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs) den Acetylierungszustand von Lysinen im Chromatin. Hierdurch wird die Expression von Genen positiv oder negativ reguliert. Für diesen Vorgang sind hochselektive Acetyllysin-spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen von Bedeutung, die durch Protein- Interaktionsmodule orchestriert werden. Zu diesen gehören die Bromodomänen (BRD), die eine tiefe hydrophobe Acetyllysin-Bindungstasche aufweisen. Proteine mit zwei BRD und einer extraterminalen Domäne kennzeichnen die Bromo- und Extra-Terminale Domänen (BET) Familie, zu denen beispielsweise BET Familien-Proteine BRD2, BRD3, BRD4 und BRDT gehören. BET Proteine sind wichtig, da sie normale Transkriptionsvorgänge regulieren, bei verschiedenen Krebsarten bestimmen sie jedoch auch die Transkription von Onkogenen wie c-myc und Bcl-2. Eine selektive Inhibition der BET Proteine ist für Krebstherapien daher von großer Bedeutung. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass in der akuten myeloischen Leukämie (AML) und myeloproliferativen Neoplasien (MPN) BRD4 als therapeutisches Ziel in Frage kommt.
In den Jahren 2012 und 2013 berichteten Fish et al. (J. Med. Chem. 2012, 55, 9831-9837) und Picaud et al. (Cancer Res. 2013, 73, 3336-3346) über die Identifizierung eines BET Inhibitors (PFI-1), der selektiv BRD4 adressiert. Die heterocyclischen Verbindungen werden ebenfalls in der WO 2013/027168 A1 beschrieben. Seither wurden weitere strukturell sehr ähnliche Moleküle beschrieben, die ebenso mit Bromodomänen wechselwirken, bevorzugt aber Vertreter der "Plant Homeodomain Finger-containing" Proteinfamilie inhibieren. Beispielsweise beschreiben die WO 2011/137089 A1 und WO 2010/042867 A2 Aktivatoren der humanan Pyruvatkinase. Weiter beschreibt die WO 2010/141074 A2 Inhibitoren der UDP-N-Acetylglucosamin-Peptid N-acetylglucosaminyltransferase (O-GlcNAc-Transferase). Die Verbindungen sind strukturell sehr ähnlich. Neben einem heterocyclischen Fragment auf der Ostseite verbindet eine sekundäre Sulfonamidgruppe den westlichen Teil des Moleküls, an dem unterschiedlich substituierte Aryle gebunden sind. Modifizierungen der Verbindungen konzentrieren sich hierbei auf Variationen der Ost- und Westhälften der Moleküle. Es besteht Bedarf an weiteren Verbindungen, die in der Behandlung von Krebserkrankungen und der Entwicklung neuer Medikamente verwendbar sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue Verbindungen bereitzustellen, die als Inhibitoren für Bromodomänen und damit zur Behandlung von Krebserkrankungen geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (1) wie nachstehend angegeben und/oder deren Stereoisomere, Tautomere, Solvate, Flydrate und pharmazeutisch verträgliche Salze: worin:
X ist ausgewählt aus O oder N-R1, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Cyano, C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-6-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1-6-Alkyl, jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-6-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl, NH2, NHR2 und/oder NR2R3, wobei R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl; und Me ist Methyl. Es wurde gefunden, dass die Verbindungen eine ausgeprägte inhibitorische Aktivität in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien zeigen. Dies ist insbesondere unerwartet, da gegenüber dem bekannten BET Inhibitor PFI-1 signifikante Strukturunterschiede der zentralen Funktionalität bestehen, und insbesondere Änderungen zentraler funktionaler Gruppen wie der Sulfonamid-Gruppe von PFI-1 üblicherweise in einem Verlust der Aktivität resultieren. Eine Variation der Substituenten an den Stickstoffatomen der Sulfondiimid- bzw. der Sulfonimidamidgruppe oder eine Variation der Alkylgruppe der Sulfoximin- bzw. Sulfondiimidgruppe erlaubt eine Optimierung und Anpassung der Selektivität. Derartige Variationen sind bei Sulfonamidstrukturen nicht möglich.
Insbesondere eröffnen die Sulfoximin-, Sulfonimidamid- und Sulfondiimidgruppe die Nutzung der Stereochemie am zentralen Schwefelatom. Sulfoximin-, Sulfonimidamid- und Sulfondiimidgruppen weisen mit diesem ein Stereozentrum auf, dessen Substituenten ihre relative Tage zueinander nicht ändern können und hierdurch sind verschiedene räumliche Anordnungen möglich. Die Verbindungen der Formel (1) können daher in Form der Racemate, Diastereomere oder Enantiomerenpaare vorliegen. Die Stereoisomere können nach klassischen Methoden, beispielsweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC), Racematspaltung oder asymmetrischer Synthese, erhalten werden. Die stereoisomeren Verbindungen können sich in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität unterscheiden. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass das (S)-Enantiomer eines Sulfoximines eine verglichen mit PFI-1 höhere inhibitorische Wirkung auf das Wachstum und die Viabilität von Feukämie-Zelllinien zeigte.
Weiterhin können Sulfonimidamide, Verbindungen, bei welchen der Substituent Y ausgewählt ist aus NH2, NHR2 oder NR2R3, auch in Form ihrer Tautomere vorliegen.
Der Begriff "C1-6-Alkyl" umfasst, wenn nicht abweichend angegeben, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere ausgewählt aus Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert-Butyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl und Isohexyl.
C3-7-Cycloalkylgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cyclopropyl, Cyclopentyl und/oder Cyclohexyl. C1-5- Alkoxy gruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methoxy, Ethoxy, lineares oder verzweigtes Propoxy und/oder Butoxy.
Unter dem Begriff "Aryl" sind aromatische Reste mit 6 bis 10 Kohlenstoff-Atomen zu verstehen. Der Begriff "Aryl" umfasst bevorzugt Carbocyclen, insbesondere Phenyl.
Unter dem Begriff "Hetaryl" sind mono- oder bi-cyclische Heteroarylgruppen umfassend ein, zwei, drei oder vier Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe umfassend N, O und/oder S zu verstehen. Bevorzugte Heteroarylgruppen sind monocyclische Heteroarylgruppen, insbesondere C5-6- Heteroaryle. Bevorzugte monocyclische Heteroarylgruppen weisen ein Heteroatom ausgewählt aus N, O oder S auf. Bevorzugte Heteroarylgruppen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyridyl und/oder Pyrimidyl, wobei Pyridyl bevorzugt ist.
Der Begriff "Halogen" umfasst Fluor, Chlor, Brom und Jod, wobei Fluor oder Chlor bevorzugt sind.
Unter dem Begriff "Salz" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Formen der Verbindung zu verstehen, in denen diese eine ionische Form annimmt bzw. geladen ist und mit Kationen oder Anionen als Gegenion vorliegt oder sich in Fösung befindet. Insbesondere versteht man unter pharmazeutisch verträglichen Salzen im Sinne dieser Erfindung mit einer physiologisch verträglichen anorganischen bzw. organischen Base gebildete Salze, die physiologisch insbesondere bei Anwendung im Menschen verträglich sind. Pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Natrium-, Kalium- und/oder Lithium-Salze. Unter dem Begriff "Salz" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere auch pharmazeutisch verträgliche Additionssalze zu verstehen, insbesondere Basenadditionssalze, beispielsweise Salze der Verbindungen mit anorganischen Basen wie Alkali- oder Erdalkalihydroxiden.
Eine bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfoximine. Bei diesen Verbindungen ist der Substituent X Sauerstoff. In Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X Sauerstoff; Y ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und
Z ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
In bevorzugten Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X Sauerstoff;
Y ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1-5- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C5-6-Cycloalkyl oder Phenyl, vorzugsweise ausgewählt aus C1-3-Alkyl, insbesondere Methyl oder Ethyl; und
Z ausgewählt aus Cyclohexyl oder Phenyl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-3-Alkoxy, insbesondere Cyclohexyl oder Phenyl jeweils unsubstituiert oder einfach substituiert mit Methoxy. Die Substitution ist dabei vorzugsweise in ortho-Position.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Verbindungen gemäß den nachstehenden Formeln (MF1), (MF2), (MF3) oder (MF4):
Die Verbindungen MF1, MF2 und MF3 zeigten eine ausgeprägte inhibitorische Aktivität in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien, insbesondere Erythroleukämie -Zelllinien und Zelllinien der akuten myeloischen Leukämie (AML). Insbesondere konnte eine zu PFI-1 vergleichbar hohe Aktivität der jeweiligen racemischen Gemische der Verbindungen MF1, MF2 und der achiralen Verbindung MF3 gezeigt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung das (S)-Enantiomer der Verbindungen der Formeln (MF1) oder (MF2). In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung das (S)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF2). Dieses weist die nachstehende Formel (MF2-S) auf:
Das (S)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF2) MF2-S zeigte eine hervorragende Inhibition der Zellproliferation hämatopoetischer Zelllinien. So konnte MF2-S in einer Konzentration von 1 μM signifikant stärker die metabolische Aktivität der Erythroleukämie -Zelllinie HEL (JAK2V617F positiv) und der AML -Linie Molm-14 (FLT3-ITD positiv) reduzieren als der bekannte BET-Inhibitor PFI-1. Das (S)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF2) zeigte weiterhin eine bessere Wirksamkeit in der Inhibition der Zellteilung und der Induktion des Zelltods in den HEL- und AML- Zelllinien. Somit kann mit MF2-S eine Verbindung zur Verfügung gestellt werden, die im Vergleich zu PFI-1 eine verbesserte Effizienz aufweist. Von besonderem Vorteil ist ferner, dass das (S)- Enantiomer der Verbindung der Formel (MF2) eine bessere Inhibition des Zellwachstums als PFI-1 in humanen Proben von AML-Patienten zeigte.
Die Verbindung kann auch das (R)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF2) entsprechend der Verbindung gemäß der nachstehenden Formel (MF2-R) sein:
MF2-R zeigte eine Inhibition der Zellproliferation von Feukämie-Zelllinien, während MF2-S eine höhere Effizienz aufwies. In weiteren Ausführungsformen der Sulfoximine kann der Substituent Z, insbesondere Cyclohexyl oder Phenyl, jeweils einfach mit Methoxy substituiert sein. Die Substitution ist dabei vorzugsweise in ortho- Position. Das Sulfoximin kann eine Struktur gemäß der nachstehenden Formel (MF1) aufweisen:
Das racemische Gemisch der Verbindung (MF1) zeigte ebenfalls eine inhibitorische Aktivität in den hämatopoetischen Zelllinien, insbesondere Erythroleukämie -Zelllinien und Zelllinien der akuten myeloischen Leukämie (AML).
Vorzugsweise ist die Verbindung das (S)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF1). Dieses weist die nachstehende Formel (MF1-S) auf:
Das (S)-Enantiomer MF1-S, zeigte einen vergleichbaren Effekt auf die metabolische Aktivität der hämatopoetischen Zelllinien von HEL- und Molm-14-Zellen wie PFI-1.
Die Verbindung kann weiter das (R)-Enantiomer der Verbindung der Formel (MF1) sein. Dieses weist die nachstehende Formel (MF1-R) auf:
Das (R)-Enantiomer MF1-R zeigte eine geringe inhibitorische Wirkung in hämatopoetischen Zelllinien. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung eines der Enantiomere der Verbindung der Formel (MF4) ausgewählt aus (+)-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S- cycIohexyI-5-methyIsuIfoximin und (-)-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S- cycIohexyI-5-methyIsuIfoximin.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfondiimide. Bei diesen Verbindungen ist der Substituent X eine Gruppe N-R1. In diesen Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X ist N-R1, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Cyano, C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2- Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1 -6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und
Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
In bevorzugten Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X N-R1, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, C1-5-Alkyl oder Aryl, insbesondere Methyl oder Phenyl oder Wasserstoff;
Y ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1-5- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2- Alkyl substituiertes C5-6-Cycloalkyl oder Phenyl, vorzugsweise ausgewählt aus C1-3-Alkyl, insbesondere Methyl; und
Z ausgewählt aus Aryl, insbesondere Phenyl.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Verbindungen gemäß den nachstehenden Formeln (JHS1), (JHS2) oder (JHS3) oder ist eines deren Stereoisomere:
Die Verbindung (JHS1) zeigte ebenfalls eine inhibitorische Aktivität in den hämatopoetischen Zelllinien, insbesondere Erythroleukämie -Zelllinien und Zelllinien der akuten myeloischen Leukämie (AML). So konnte JHS1 die metabolische Aktivität von HEL- und Molm-14-Zellen bei Konzentrationen von 10 und 20 μM inhibieren.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung das (S)-Enantiomer der Verbindung der Formel (JHS1). Dieses weist die nachstehende Formel (JHS1-S) auf:
Das (S)-Enantiomer JHS1-S zeigte einen vergleichbaren Effekt auf die metabolische Aktivität der hämatopoetischen Zelllinien von HEL- und Molm-14-Zellen wie PFI-1.
Auch bevorzugt ist das (R)-Enantiomer der Verbindung der Formel (JHS1). Dieses weist die nachstehende Formel (JHS1-R) auf:
Das (R)-Enantiomer JHS1-R zeigte eine nahezu gleich hohe inhibitorische Wirkung in hämatopoetischen Zelllinien wie das (5)-Enantiomer JHS1-S.
Weitere Sulfondiimide können ausgewählt sein aus den Verbindungen gemäß den Formeln (JHS2) und (JHS3). Diese Verbindungen zeigten eine geringe inhibitorische Aktivität in den untersuchten Leukämie -Zelllinien.
Eine weitere bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfonimidamide und deren Tautomere. Bei diesen Verbindungen ist der Substituent Y eine Aminogruppe NH2, NHR2 oder NR2R3. In diesen Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X Sauerstoff;
Y ausgewählt aus der Gruppe umfassend NH2, NHR2 und/oder NR2R3, wobei R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsub- stituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und
Z ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
In bevorzugten Ausführungsformen der Verbindung (1) sind die Substituenten:
X Sauerstoff;
Y ausgewählt aus NH2, NHR2 und/oder NR2R3, wobei R2 und/oder R3 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; insbesondere ist NR2R3 Piperidyl. Z ausgewählt aus Cyclohexyl oder Phenyl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-3-Alkoxy, insbesondere Phenyl.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Verbindung gemäß der nachstehenden Formel (JHS4) oder eines deren Enantiomere:
Die Verbindungen sind als Inhibitoren der Bromodomäne, insbesondere der Proteinfamilie der BET- Proteine z. B. BRD2-4, die die Initiation und Elongation der Gen-Transkription und das Zellwachstum beeinflussen, zur Behandlung von Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang stehen, geeignet. Hierzu zählen Autoimmunerkrankungen, inflammatorische Erkrankungen und Krebserkrankungen. Eine Verwendung der Verbindungen in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, inflammatorischen Erkrankungen und von Krebserkrankungen, insbesondere durch BET-Proteine vermittelten krebsartigen Zellwachstums ist daher ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Unter dem Begriff "Krebserkrankung" werden im Sinne der vorliegenden Erfindung allgemein bösartige (maligne) Erkrankungen, die durch eine unkontrollierte Vermehrung von veränderten Zellen gekennzeichnet sind, verstanden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht. Erkrankungen, die mit Bromodomänen in Zusammenhang stehen sind vorzugsweise ausgewählt aus Autoimmunerkrankungen, inflammatorischen Erkrankungen und Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien. Ein entsprechender Gegenstand der Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße Verbindung zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, vorzugsweise von Autoimmunerkrankungen, inflammatorischen Erkrankungen und Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien. Krebserkrankungen sind insbesondere Knochenmarkerkrankungen bzw. Leukämien ("Blutkrebs"). Als Leukämie werden bösartige Erkrankungen bezeichnet, die zumeist im Knochenmark bzw. hämatopoetischen Stammzellen ihren Ursprung haben und die zumeist zuerst im Blut nachgewiesen werden können. Hierbei kann ebenfalls zwischen akuten und chronischen Leukämien unterschieden werden. Beispiele dieser Knochenmarkserkrankungen sind die akute lymphatische Leukämie (ALL) und chronische lymphatische Leukämie (CLL), die die lymphozytären Zellen beeinflussen, und die akute myeloische Leukämie (AML) oder das myelodysplastische Syndrom (MDS). Unter dem Begriff myeloproliferative Neoplasien (MPN) wird eine Gruppe seltener, bösartiger Erkrankungen des Knochenmarks zusammengefasst, bei denen zu viele rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und/oder Blutplättchen gebildet werden. Zu den MPN gehört die Philadelphia-Chromosom-positive chronisch myeloische Leukämie (CML) und die Philadelphia-Chromosom-negativen Polycythaemia Vera (PV), Essentielle Thrombozythämie (ET) und die primäre Myelofibrose (PMF), wobei aus der PV und der ET eine Myelofibrose entstehen kann, was das Krankheitsbild drastisch verschlechtert. Eher seltener kann sich aus einer MPN eine akute Leukämie entwickeln. In unterschiedlichen Formen der Leukämie und myeloproliferativer Erkrankungen wurden BET Proteine als mögliche Ziele einer Therapie, sowohl Einzel-Therapien als auch Kombinations-Therapien, ausgemacht.
Die Behandlung kann eine therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung beinhalten·
Bevorzugt ist eine Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in einem Säuger in Zusammenhang steht.
Für die Beschreibung der Verbindungen, insbesondere gemäß der allgemeinen Formel (1), wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen. Eine bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfoximine, vorzugsweise die Verbindungen gemäß der Formel (MF2), insbesondere die (S)- Enantiomere der Formeln (MF2-S), oder der Formel (MF1) insbesondere das (S)-Enantiomer der Formel (MF1-S). Eine weitere bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfondiimide, vorzugsweise die Verbindung der Formel (JHS1), insbesondere das (S)-Enantiomer der Formel (JHS1-S) oder das (R)-Enantiomer der Formel (JHS1-R). Eine weitere bevorzugte Gruppe an Verbindungen sind Sulfonimidamide, bei welchen der Substituent Y eine Aminogruppe NH2, NHR2 oder NR2R3 oder deren tautomere Form ist, vorzugsweise die Verbindungen gemäß der Formel (JHS4). Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, vorzugsweise von Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (1) eine ausgeprägte inhibitorische Aktivität in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien zeigen. Diese Effekte erlauben es, die Verbindungen in Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, vorzugsweise von Autoimmunerkrankungen, inflammatorischen Erkrankungen und Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien, zu verwenden. Für die Beschreibung der Erkrankungen wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen.
Für die Beschreibung der Verbindungen, insbesondere gemäß der allgemeinen Formel (1), wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen. Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel ein Sulfoximin, vorzugsweise die Verbindungen gemäß der Formel (MF2), insbesondere die (S)-Enantiomere der Formeln (MF2-S), oder der Formel (MF1) insbesondere das (S)-Enantiomer der Formel (MF1-S). Weiter bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel ein Sulfondiimid, vorzugsweise die Verbindung der Formel (JHS1), insbesondere das (S)-Enantiomer der Formel (JHS1-S) oder das (R)-Enantiomer der Formel (JHS1-R). Weiter bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel ein Sulfonimidamid, bei welchen der Substituent Y eine Aminogruppe NH2, NHR2 oder NR2R3, oder deren tautomere Form ist, vorzugsweise die Verbindungen gemäß der Formel (JHS4).
Die Zusammensetzung oder das Arzneimittel können neben der Verbindung als Wirkstoff weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe und/oder Träger umfassen. Die Art der Zusatz-, Träger- und/oder Hilfsstoffe hängt von der gewünschten Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tablette, Filmtablette oder Kapsel, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien enthalten, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, desintegrierende Mittel wie Stärke oder Netzmittel. Vorzugsweise ist eine Tablette in Wasser lösbar. Orale flüssige Präparate können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays vorliegen. Als Trägersubstanzen sind beispielsweise organische oder anorganische Stoffe verwendbar, die sich für eine enterale, beispielsweise orale oder rektale, oder parenterale Applikation eignen und mit den Verbindungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat und andere Fettsäureglyceride, Gelatine, Sojalecithin, Kohlenhydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talkum oder Cellulose.
Das Arzneimittel oder die Zusammensetzung kann als flüssige, halbfeste oder feste Arzneiform, beispielsweise in Form von Injektionslösungen, Tropfen, Säften, Sirupen, Sprays, Suspensionen, Tabletten, Kapseln oder in Form von Pellets oder Granulaten vorliegen und/oder verabreicht werden. Für eine orale Verabreichung eignen sich bevorzugt Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Granulaten. Das Arzneimittel oder die Zusammensetzung kann sterilisiert sein. Die Zusammensetzung oder das Arzneimittel kann oral, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar sein.
Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
In den Figuren zeigt:
Figur 1 die metabolische Aktivität, welche die Viabilität angibt, nach Inkubation über 72 h mit den Verbindungen MF1-R, MF1-S, JF1S1-R und JF1S1-S in angegebener Konzentration für FIEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 1A-C. Standardabweichungen (SD) sind eingezeichnet.
Figur 2 die metabolische Aktivität nach Inkubation über 72 h mit den Verbindungen JHS1 ,
JF1S2, MF2 und JF1S3 (Figur 2A) in angegebener Konzentration für FIEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 2A-C. Standardabweichungen sind eingezeichnet. Figur 3 die metabolischen Aktivitäten nach Inkubation über 72 h mit den Verbindungen PFI-1,
MF2, MF2-S und MF2-R in den angegebenen Konzentrationen für FIEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 3A-C und die entsprechenden IC50-Werte jeweils in Figur 3D-F.
Figur 4 die durchschnittlichen Zellzahlen während der Inkubation mit den Verbindungen PFI- 1, MF2, MF2-S und MF2-R für FIEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 4A-C, die relative Viabilität in Figur 4D nach 72 h Inkubation und in Figur 4E die Zellzyklusanalyse.
Figur 5 die Viabilität nach Inkubation mit den Verbindungen PFI-1, MF2, MF2-S und MF2-R für HEL-, Molm-14- und K562-Zellen in Figur 5A-C, die relative Viabilität in Figur 5D nach 72 h Inkubation und in Figur 5E Western Blots der Zelllysate,
Figur 6 die Kolonien-Anzahl in Colony-forming-Assays (CFU-Assays) mit mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) bzw. CD34+ Zellen aus gesunden Spendern behandelt mit 5 μM PFI-1 oder MF2-S in Figur 6A, Figur 6B zeigt die Ergebnisse der CFU-Assays von 3 AML-Patienten und Figur 6C die Ergebnisse der CFU-Assays mit mononukleären Zellen von drei MPN-Patienten (PV, PMF, ET),
Figur 7 die Selektivität der Verbindung MF2-S und der Vergleichs Verbindung PFI-1 anhand der durch einen Thermal Shift Assay erhaltenen ATm-Werte in Figur 7A. Figur 7B zeigt die Spezifität Bromodomänen-beinhaltender Proteine für die Vergleichs Verbindung PFI-1, Figur 7C für die Verbindung MF2-S.
Methoden:
Patientenmaterial
Peripheres Blut und Knochenmark der Patienten wurde durch die Klinik für Flämatologie, Onkologie, Flämostaseologie und Stammzelltransplantation (Med. Klinik IV) (EK 127/12) und der zentralisierten Biomaterialbank, Universitätsklinikum Aachen, zur Verfügung gestellt. Die gesunden Kontrollen wurden vom Institut für Transfusionsmedizin (EK099/149), Universitätsklinikum Aachen, zur Verfügung gestellt. Alle Donoren/Patienten haben eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben.
Zellkultur
Alle Arbeiten mit den genannten Zelllinien FIEL, Molm-14- und K562 (vom DSMZ bezogen: ACC- 11, ACC-10 und ACC-777), wurden unter keimfreien Bedingungen unter der Sterilbank durchgeführt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C im Brutschrank bei einer C02-Sättigung von 5%. Für die Passagierung der Suspensionszellen wurden die Zellen in einem Falcon mit vorgelegtem PBS (phosphate buffered saline) überführt und bei 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Alle drei Zelllinien wurden in RPMI-1640 Medium (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Darmstadt, Germany) mit 10% FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin kultiviert.
Zellzahlbestimmung und Proliferationsassay
Die Bestimmung der Zellzahl und der Viabilität erfolgte nach Trypan-Blau Färbung. Pro mL Medium wurden die entsprechenden Konzentrationen der Inhibitoren hinzugegeben bzw. das entsprechend höchste Volumen an DMSO hinzugegeben als Kontrollgruppe.
MTT-Assay
Die Viabilität und Stoffwechselaktivität der Zellen wurde mit dem MTT-Assay gemessen. Das gelbe, wasserlösliche MTT (3-(3,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyltetrazolium bromide) ist ein Tetrazoliumsalz, das in lebenden Zellen in das dunkelblaue Formazan reduziert wird. Das unlösliche Formazan wird durch Zugabe von Isopropanol-HCl freigesetzt und seine Intensität kann photometrisch bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt werden. Somit wird der Anteil lebender Zellen im Vergleich zur einer bestimmten Kontrollprobe gemessen.
Die Zellen wurden gezählt, mit PBS gewaschen und 30.000 Zellen wurden pro Well in einer 96-Well- Platte in Triplikaten ausgesät. Für die Inhibitorbehandlung wurden die angegebenen Endkonzentrationen eingesetzt. Dafür wurden 10 μL der entsprechenden Inhibitor- Verdünnung in die 96-Well-Platten vorgelegt und anschließend 90 μL Zellsuspension hinzu pipettiert. Die Platten wurden für 72 h im Brutschrank (37 °C, 5% CO2) inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 μL MTT-Lösung (5 mg/mL) mit einer Mehrkanalpipette auf die Wehs gegeben und gründlich resuspendiert. Danach erfolgte eine Inkubation für 4 h im Dunkeln bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Zellen in 100 μL Isopropanol-HCl resuspendiert, lysiert und die Absorption wurde photometrisch mit dem Plate Reader (Kayto, RT-2100C) bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.
Zellzyklus-Analyse
Der Einfluss der eingesetzten Inhibitoren auf den Zellzyklus wurde mittels Propidium-Iodid-Färbung der fixierten Zellen untersucht. Die Zellen wurden hierfür mit 95% Ethanol bei -20 °C fixiert, RNA wurde durch RNase (100 μg/mL) für 15 min bei 37 °C zerstört und die DNA mittels Propidium-Iodid (50 μg/mL) angefärbt. An einem Durchflusszytometer (Gallios (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) wurden die Zellzyklusphasen analysiert und die Daten mittels FlowJo Software (Version 10) ausgewertet.
SDS-Page und Western Blot
Zelllysate wurden mit RIPA Lysepuffer hergestellt (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM sodium Chloride, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X, 15 % glycerol, 0.5 % sodium deoxycholate, and Protease/Phosphatase Inhibitoren). Protein-Konzentrationen wurden mit dem Bradford Protein Assay bestimmt an einem Nanodrop Spectrometer (NanoDrop 2000/2000c System, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany) bei 595 nm. 25 μg der Proteinlysate wurde mit 4xLämmli-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 65 °C denaturiert und in die SDS-Page eingesetzt. Die Proteine wurden im Wet-Blot-Verfahren in Towbin-Puffer (3 g Tris, 14.4 g Glycine, 5 % Methanol pro Liter ddH2O) auf eine PVDF-Membran übertragen bei 100 mA über Nacht. Die Membran wurde mit 10% BSA in TBS-T-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05 % IGEPAL) blockiert. Die primären Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C und der HRP-gelabelte 45 min bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Die Proteine wurden mittels PCA-ECL-Lösung an einem Chemilumineszenz-Detektor (Fusion SL, PeqLab) detektiert.
CFU- Assay
Mit Hilfe des CFU Assays kann das Koloniebildungsvermögen einzelner Zellen in einem semi-soliden Methylcellulose-Medium (MethoCult H4434, StemCell Technologies, Köln, Germany) bestimmt werden. Die Anzahl der Kolonien wurde nach 7-11 Tagen bestimmt.
Unterschiedliche Zellzahlen wurden eingesetzt:
Mononukleäre Zellen des Knochenmarks aus AML-Patienten: 7x105Zellen/mL PBMCs von PV, ET bzw PMF Patienten: 4x105Zellen/mL
CD34+ Zehen (G-CSF mobilisiert von Stammzellspendern) der gesunden Donoren: 2x104Zellen/mL; PBMCs der gesunden Probanden: 4x105 Zellen/mL.
Vital sterile mononukleäre Knochenmarkszellen von AML-Patienten wurden für 24 h in 1.5 mL BIT Medium in 8.5 mL IMDM Medium (versetzt mit 5 μL FLT3 ligand, 10 μL rh SCF, 2 μL rh IL-3, 2 μL rh G-CSF, 50 μL Ciprofloxacin und 6.99 μL ß Mercaptoethanol in 1: 100 Verdünnung) kultiviert, bevor sie in den CFU-Assay eingesetzt wurden. Schmelzpunkte (Smp.)
Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillaren in einem Metallheizblock mit Digitalthermometer ermittelt.
Kernspinresonanz (NMR)-Daten
NMR-Messungen erfolgten für die Kerne 1 H und 13C bei den Messfrequenzen 600 MHz oder 400 MHz (1H) bzw. 151 MHz oder 101 MHz (13C) in deuterierten Lösungsmitteln wie z. B. Chloroform, Dichlormethan oder Dimethylsulfoxid. 13C-NMR-Spektren wurden ausnahmslos 1 H- breitbandentkoppelt gemessen.
Infrarotspektroskopische (IR) Daten
Die Probenmessung erfolgte mit abgeschwächter Totalreflexion (ATR).
Massenspektrometrische (MS) Daten
Die Daten wurden durch Elektronenstoß-Ionisation (EI), chemische Ionisation (CI) oder Elektrospray- Ionisation (ESI) erhoben.
Polarimetrie
Die Messungen wurden bei Raumtemperatur mit monochromatischer Strahlung der Wellenlänge λ = 589 nm in einer Küvette der Länge d = 1 dm durchgeführt. Die spezifischen Dreh werte [α]D tragen die Einheit deg cm3 dm -1 g-1. Die Konzentration c wurde mit der Einheit g (100 mL) -1 aufgeführt.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Für die analytische HPLC wurden Säulen mit chiraler stationärer Phase eingesetzt, die eine Länge von 250 mm und einen Durchmesser von 4.6 mm besaßen. Enantiomerenüberschüsse (ee) wurden aus den Enantiomerenverhältnissen der HPLC-Chromatogramme berechnet.
Chemikalien
6-Brom-3-methyl-3,4-dihydrochinazolin-2( 1 H)-on wurde hergestellt wie in WO 2013/027168 A1 beschrieben. Die Sulfoximine, achiral, razemisch oder ihre jeweiligen (S)- und (R)-Enantiomere, wurden hergestellt nach Methoden wie in Angew. Chem. 2016, 128, 7319-7323 oder Chem. Commun. 2017, 53, 348-351 oder Tetrahedron: Asymmetry 1997, 8, 909-912 oder Acta Chem. Scand. 1996, 50, 305-315 beschrieben. Die Sulfondiimide wurden hergestellt nach Methoden wie in Angew. Chem. 2012, 124, 4516-4519 beschrieben. Die Sulfonimidamide wurden hergestellt nach Methoden wie in Chem. Eur. J. 2017, 23, 15189-15193 beschrieben.
Beispiel 1: Herstellung der Verbindungen
1.1 Herstellung von (3-Methyl-2-oxo-l,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure
Ein Dreihalskolben wurde mit [1,1'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen]dichlorpalladium(II) (0,02 Äquiv.) und 2-Dicyclohexylphosphino-2‘,6‘-dimethoxybiphenyl (0,04 Äquiv.) befüllt. Nach Zugabe von trockenem Ethanol (c = 0.2 mol/L) wurde 20 min unter Argon bei einer Ölbadtemperatur von 95 °C gerührt. Zu dem abgekühlten Gemisch wurden im Argon-Gegenstrom 6-Brom-3-methyl-3,4- dihydrochinazolin-2( 1 H)-on, Kaliumacetat (2,9 Äquiv.) und Tetrahydroxydiboron (3,0 Äquiv.) hinzugefügt. Es wurde 5 h bei einer Ölbadtemperatur von 95 °C gerührt und anschließend über Nacht bei 50 °C. Kontrolle über Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/ Aceton = 1:1) zeigte unvollständigen Umsatz an, so dass weiteres Tetrahydroxydiboron (0,5 Äquiv.) hinzugegeben und erneut bei einer Ölbadtemperatur von 95 °C gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser versetzt und 1 h gerührt. Der Feststoff wurde abgesaugt und NMR-spektroskopisch untersucht. Das Volumen des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 °C reduziert, bis erneut Feststoff ausfiel, der wieder abgesaugt und NMR-spektroskopisch analysiert wurde. Diese Prozedur wurde mehrfach wiederholt. Hinreichend saubere Feststoff-Fraktionen wurden vereinigt und so das Produkt als sandfarbener Feststoff mit einem Schmelzpunkt >240 °C (Zersetzung) isoliert. Die Verbindung wurde mittels Kernspinresonanzspektroskopie- und Massenspektrometrie-Untersuchungen bestätigt.
Synthese vor Schriften und Analytik der Sulfoximine:
1.2 Herstellung von rac-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S-(2-methoxyphenyl)- S-methylsulfoximin (MF1)
Ein Druckröhrchen wurde mit 5-(2-Methoxyphenyl)-5-methylsulfoximin (1.6 Äquiv.), 6-Brom-3- methyl-3,4-dihydrochinazolin-2(1H)-on, Cäsiumcarbonat (1.6 Äquiv.), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (0.13 Äquiv.), 2-Dicyclohexylphosphino-2’,4’,6’- triisopropylbiphenyl (0.22 Äquiv.) und einem Magnet-Rührfisch befüllt. Das Druckröhrchen wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes 1 ,4-Dioxan (c = 0.06 mol/L) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 22 h bei einer Ölbadtemperatur von 110 °C gerührt. Die abgekühlte Suspension wurde über Kieselgur abgesaugt und die Kieselgur-Schicht mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Das Rohprodukt wurde zweimal säulenchromatographisch (Kieselgel, Aceton bzw. Diethylether/ Aceton = 2:1) aufgearbeitet. Das Produkt wurde mit wenig Diethylether versetzt und die Suspension im Ultraschallbad behandelt. Der Diethylether wurde abpipettiert und das Produkt als weißer Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 194-196 °C isoliert.
Die Verbindung wurde mittels Infrarotspektroskopie-, Kernspinresonanzspektroskopie- und Massenspektrometrie-Untersuchungen bestätigt.
1.3 Herstellung von (S)-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 , 2,3, 4-tetrahydrochinazolni -6-yl )-.S-(2-methoxy phenyl)- S-methylsulfoximin (MF1-S)
Ein Reagenzglas wurde mit (S)-S-(2-Methoxyphenyl)-S-methylsulfoximin, (3-Methyl-2-oxo-1, 2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure (1.8 Äquiv.), Kupfer(II)acetat (0.17 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. In das Reagenzglas wurde trockenes Methanol (c = 0.26 mol/L) gegeben. Das Reagenzglas wurde in einen Rundkolben gestellt, auf den ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr gesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 43 h an der Luft gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde säulenchromatographisch (Kieselgel,
Diethylether/ Aceton = 2:1) behandelt und das Produkt als hellbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt >218 °C (Zersetzung) erhalten. Die Verbindung wurde mittels Kernspinresonanzspektroskopie-Untersuchungen bestätigt. Der spezifische Drehwert [α ]D betrug +279,3 (c = 0,51 in CHCl3).
1.4 Herstellung von (R)-N-(3-Methyl-2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-5-(2-methoxyphenyl)- 5-methylsulfoximin (MF1-R) Ein Reagenzglas wurde mit (R)-S-(2-Methoxyphenyl)-S-methylsulfoximin, (3-Methyl-2-oxo-1, 2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure (1.8 Äquiv.), Kupfer(II)acetat (0.15 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. In das Reagenzglas wurde trockenes Methanol (c = 0.25 mol/L) gegeben. Das Reagenzglas wurde in einen Rundkolben gestellt, auf den ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr gesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 22 h an der Luft gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde säulenchromatographisch (Kieselgel,
Diethylether/ Aceton = 2:1) behandelt und das Produkt als hellbrauner Peststoff mit einem Schmelzpunkt >212 °C (Zersetzung) erhalten. Die Verbindung wurde mittels Kernspinresonanzspektroskopie-Untersuchungen bestätigt. Der spezifische Drehwert [α ]D betrug -270, 1 (c = 0,47 in CHCl3) .
1.5 Herstellung von rac-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-5-methyl-5- phenylsulfoximin (MF2) Ein Druckröhrchen wurde mit S-Methyl-S-phenylsulfoximin (1.7 Äquiv.), 6-Brom-3-methyl-3,4- dihydrochinazolin-2(1H)-on, Cäsiumcarbonat (2.2 Äquiv.), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (0.1 Äquiv.), 2-Dicyclohexylphosphino-2’,4’,6’-triisopropylbiphenyl (0.14 Äquiv.) und einem Magnet-Rührfisch befüllt. Das Druckröhrchen wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes 1 ,4-Dioxan (c = 0.2 mol/L) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 42 h bei einer Ölbadtemperatur von 130 °C gerührt. Die abgekühlte Suspension wurde über Kieselgur abgesaugt und die Kieselgur-Schicht mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Das Rohprodukt wurde zweimal säulenchromatographisch (Kieselgel,
Diethylether/ Aceton = 1:1 bzw. Diethylether/ Aceton = 2:1) behandelt. Das Produkt wurde als gelber Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 196-197 °C isoliert. Die Verbindung wurde mittels Infrarotspektroskopie-, Kernspinresonanzspektroskopie- und Massenspektrometrie-Untersuchungen bestätigt.
1.6 Herstellung von (S)-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S-methyl-S- phenylsulfoximin (MF2-S)
Ein Reagenzglas wurde mit (S)-S-Methyl-S-phenylsulfoximin, (3-Methyl-2-oxo-1, 2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure (2.0 Äquiv.), Kupfer(II)acetat (0.11 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. In das Reagenzglas wurde trockenes Methanol (c = 0.3 mol/L) gegeben. Das Reagenzglas wurde in einen Rundkolben gestellt, auf den ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr gesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 40 h an der Luft gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde säulenchromatographisch (Kieselgel,
Diethylether/ Aceton = 2:1) behandelt und das Produkt als hellgelber Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 135-137 °C erhalten. Die Verbindung wurde mittels
Kernspinresonanzspektroskopie-Untersuchungen bestätigt. Der spezifische Drehwert [α ]D betrug +136,9 (c = 0,35 in CHCl3). 1.7 Herstellung von (R)-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S-methyl-S- phenylsulfoximin (MF2-R)
Ein Reagenzglas wurde mit (R)-S-Methyl-S-phenylsulfoximin, (3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure (2.3 Äquiv.), Kupfer(II)acetat (0.11 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. In das Reagenzglas wurde trockenes Methanol (c = 0.3 mol/L) gegeben. Das Reagenzglas wurde in einen Rundkolben gestellt, auf den ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr gesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 23 h an der Luft gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde zweimal säulenchromatographisch (Kieselgel, Diethylether/ Aceton = 2:1 bzw. Dichlormethan/ Aceton = 1:1) behandelt und das Produkt als weißer Leststoff mit einem Schmelzpunkt von 133-135 °C erhalten. Die Verbindung wurde mittels Kernspinresonanzspektroskopie-Untersuchungen bestätigt. Der spezifische Drehwert [α ]D betrug -100,7 (c = 0,29 in CHCl3).
1.8 Herstellung von N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-5,5-diphenylsulfoximin (MF3)
Ein Druckröhrchen wurde mit 5,5-Diphenylsulfoximin, 6-Brom-3-methyl-3,4-dihydrochinazolin- 2(1H)-on (1.7 Äquiv.), Cäsiumcarbonat (2.1 Äquiv.), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (0.11 Äquiv.), 2-Dicyclohexylphosphino-2’,4’,6’-triisopropylbiphenyl (0.18 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. Das Druckröhrchen wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes 1,4-Dioxan (c = 0.1 mol/L) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 27 h bei einer Ölbadtemperatur von 130 °C gerührt. Die abgekühlte Suspension wurde über Kieselgur abgesaugt und die Kieselgur-Schicht mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Das Produkt wurde säulenchromatographisch (Kieselgel, Diethylether/ Aceton = 2:1) gereinigt. Anschließend wurde die Substanz mit wenig Diethylether versetzt und die Suspension kurz im Ultraschallbad behandelt. Der Diethylether wurde abpipettiert und das Produkt als weißer Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 225-227 °C isoliert. Die Verbindung wurde mittels Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt.
1.9 Herstellung von rac-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S-cyclohexyl-.S- methylsulfoximin (MF4)
Die Verbindung wurde mittels zweier Verfahren A und B synthetisiert.
Methode A: Ein Druckröhrchen wurde mit S-Cyclohexyl-S-methylsulfoximin, 6-Brom-3-methyl-3,4- dihydrochinazolin-2( 1 H)-on (1.7 Äquiv.), Cäsiumcarbonat (2.4 Äquiv.), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (0.1 Äquiv.), 2-Dicyclohexylphosphino-2’,4’,6’- triisopropylbiphenyl (0.15 Äquiv.) und einem Magnet-Rührfisch befüllt. Das Druckröhrchen wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes 1 ,4-Dioxan (c = 0.13 mol/L) hinzugegeben und das Reaktionsgemisch 27 h bei einer Ölbadtemperatur von 130 °C gerührt. Die abgekühlte Suspension wurde über Kieselgur abgesaugt und die Kieselgur-Schicht mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde säulenchromatographisch (Kieselgel, Diethylether/ Aceton = 2:1) behandelt. Das isolierte Produkt wurde durch eine zweite Säulenchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat/Methanol = 10:1) gereinigt und als weißer Feststoff erhalten.
Methode B: Ein Reagenzglas wurde mit S-Cyclohexyl-S-methylsulfoximin, (3-Methyl-2-oxo-1, 2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)boronsäure (1.4 Äquiv.), Kupfer(II)acetat (0.1 Äquiv.) und einem Magnet- Rührfisch befüllt. In das Reagenzglas wurde trockenes Methanol (c = 0.25 mol/L) gegeben. Das Reagenzglas wurde in einen Rundkolben gesteht, auf den ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr gesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 45 h an der Luft gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 50 °C entfernt. Der verbliebene Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Kieselgel, Diethylether/ Aceton = 2:1) aufgearbeitet. Das Produkt wurde zwei weitere Male säulenchromatographisch (Kieselgel, Aceton bzw. Ethylacetat/Methanol = 10:1) gereinigt und als gelbbrauner Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 165-167 °C isoliert. Die Verbindung wurde mittels Infrarotspektroskopie-, Kernspinresonanzspektroskopie- und Massenspektrometrie- Untersuchungen bestätigt.
Die Produkte der zwei Ansätze wurden vereinigt und die Enantiomere mittels einer präparativen HPLC-Säule unter den Bedingungen für die analytische AD-Säule voneinander getrennt.
Anschließend wurden die einzelnen Enantiomere jeweils erneut säulenchromatographisch (Kieselgel, Ethylacetat/Methanol = 10:1) aufgereinigt und als weiße Feststoffe erhalten.
Das Enantiomer (+)-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-S-cyclohexyl-S- methylsulfoximin wies einen Schmelzpunkt von 191-193 °C und einen spezifischen Drehwert [α ]D von +22,4 (c = 0,38 in CHCl3) auf. Das Enantiomer (-)-N-(3-Methyl-2-oxo-1, 2,3,4- tetrahydrochinazolin-6-yl)-5-cyclohexyl-5-methylsulfoximin wies einen Schmelzpunkt von 195—
197 °C und einen spezifischen Drehwert [α ]D von -22,2 (c = 0,37 in CHCl3) auf.
1.10 Herstellung und Analytik der Sulfondiimide und Sulfonimidamide:
Methode A:
In ein ausgeheiztes Schlenk-Rohr mit Magnet-Rührfisch und Septum wurde das Sulfondiimid oder Sulfonimidamid, 6-Bromo-3-methyl-3,4-dihydrochinazolin-2(1H)-on (1.5 Äquiv.), Cäsiumcarbonat (1.5 Äquiv.), Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (0.15 Äquiv.), und 2-Dicyclohexylphosphino- 2',4',6'-triisopropylbiphenyl (0.3 Äquiv.) gegeben. Das Schenk-Rohr wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes 1 ,4-Dioxan hinzugefügt und das Reaktionsgemisch 12 h bei einer Ölbadtemperatur von 110 °C gerührt. Die abgekühlte Suspension wurde über eine Celite-Schicht (Celite Standard Super Cel, pH = 7-8) filtriert und mit einer Dichlormethan/Methanol-Lösung (10:1) nachgespült. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 °C entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch an Kieselgel mit einer Dichlormethan/Methanol-Gradientenlösung (1:0 bis 30:1) aufgereinigt.
Methode B : In ein ausgeheiztes Schlenk-Rohr mit Magnet-Rührfisch und Septum wurde das Sulfondiimid oder Sulfonimidamid, (3-MethyI-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazoIin-6-yl)boronsäure (1.5 Äquiv.) und Kupfer(II)acetat (0.2 Äquiv.) gegeben. Das Schenk-Rohr wurde im Hochvakuum evakuiert und mit Argon belüftet. Im Argon-Gegenstrom wurde trockenes Dimethylformamid oder Methanol hinzugefügt, das Septum durch ein mit Calciumchlorid gefülltes Trockenrohr ersetzt und die Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde über eine Celite-Schicht (Celite Standard Super Cel, pH = 7-8) filtriert und mit einer Dichlormethan/Methanol -Lösung (10:1) nachgespült. Das Lösungsmittel des Filtrats wurde im Membranpumpenvakuum bei einer Wasserbadtemperatur von 40 °C entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch an Kieselgel mit einer Dichlormethan/Methanol-Gradientenlösung (1:0 bis 30:1) aufgereinigt.
1.10.1 rcr-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-N’-phenyl-S-methyl-S- phenylsulfondiimid (JHS1)
Die Verbindung wurde mittels Methode A wie Methode B in DMF erfolgreich hergestellt, mittels Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 102-103 °C auf.
1.10.2 (S)-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-N'-phenyl-S-methyl-S- phenylsulfondiimid (JHS1-S)
Die Verbindung wurde mittels Methode A hergestellt, mittels Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 83-84 °C und einen spezifischen Drehwert [α ]D von -612,8 (c = 1.95 in CHCI3) auf.
1.10.3 (R)-N-(3-Methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-N'-phenyl-S-methyl-S- phenylsulfondiimid (JHS1-R) Die Verbindung wurde mittels Methode A hergestellt, mittels Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 84-85 °C und einen spezifischen Drehwert [α ]D von 601,5 (c = 1.95 in CHCI3) auf.
1.10.4 rac-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-N,-H-S-methyl-S- phenylsulfondiimid (JHS2)
Die Verbindung wurde mittels Methode B in Methanol hergestellt, mittels
Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 119-120 °C auf. 1.10.5 rac-N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-yl)-N,-methyl-S-methyl-S- phenylsulfondiimid (JHS3)
Die Verbindung wurde mittels Methode B in Methanol hergestellt, mittels
Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 92-93 °C auf.
1.10.6 rac- 1 - [ N-(3- Methyl -2-oxo- 1 ,2,3, 4-tetrahydroch i nazol i n-6-y l -S-phenl yl su lfon i m idoyl ] piperidin (JHS4)
Die Verbindung wurde mittels Mathode A und Methode B in DMF hergestellt, mittels Kernspinresonanzspektroskopie-, Massenspektrometrie- und Infrarotspektroskopie-Untersuchungen bestätigt und wies einen Schmelzpunkt von 129-130 °C auf.
Beispiel 2: Untersuchung der Effekte der Enantiomere MF1-R, MF1-S, JHS1-R und JHS1-S auf die metabolische Aktivität in Leukämie -Zelllinien
Für Zellexperimente wurden die Erythroleukämie -Zelllinie HEL (JAK2V617F-positiv), die AML- Zelllinie Molm-14 und die chronisch myeloische Leukämie (CML) -Zelllinie K562 (BCR-ABL- positiv) verwendet.
Die Verbindungen MF1-R, MF1-S, JHS1-R und JHS1-S wurden in DMSO gelöst und jeweils in Konzentrationen von 0,1 μM, 1 μM, 10 μM und 20 μM eingesetzt. Entsprechend wurde DMSO jeweils als Kontroll-Behandlung mitgeführt und deren metabolische Aktivität als 100% gesetzt. Die Zelllinien HEL, Molm-14 und K562 wurden mit den jeweiligen Verbindungen in den verschiedenen Konzentrationen behandelt und nach 72 h in Kultur wurde die metabolische Aktivität, die Auskunft über das Wachstum der Zellen gibt, mittels MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid] -Assay bestimmt.
Die bestimmten Absorptionen, die der metabolischen Aktivität entsprechen, sind für die HEL-, Molm- 14- und K562-Zellen jeweils in Figur 1A-C dargestellt. Wie man der Figur 1 entnimmt, zeigte das (S)- Enantiomer MF1-S einen vergleichbaren Effekt auf die metabolische Aktivität von HEL- und Molm- 14-Zellen wie PFI-1, während das (R)-Enantiomer MF1-R demgegenüber nahezu inaktiv war. Dies zeigt, dass die Chiralität der Verbindung MF1 Auswirkung auf die Aktivität hat. Ein solcher Effekt war bei den Enantiomeren JHS1-R und JHS1-S kaum zu beobachten. K562-Zellen wurden als Negativkontrollen genutzt, die kaum einen Effekt auf die Inhibition von BRD4 zeigen (Figur IC). Entsprechend sank die metabolische Aktivität der behandelten K562-Zellen durch die Behandlung mit den Verbindungen kaum.
Beispiel 3: Untersuchung der Effekte der Verbindungen JHS1, JHS2, MF2 und JHS3 auf die metabolische Aktivität in Leukämie -Zelllinien
Racemische Gemische der Verbindungen JHS1, JHS2, MF2 und JHS3 wurden in DMSO gelöst und jeweils in Konzentrationen von 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM und 20 μM eingesetzt und entsprechend DMSO jeweils als Kontroll-Behandlung mitgeführt. Die Zelllinien HEL, Molm-14 wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit den jeweiligen Verbindungen in den verschiedenen Konzentrationen behandelt und nach 72 h die metabolische Aktivität mittels MTT- Assay bestimmt.
Die bestimmten metabolischen Aktivitäten sind für die HEL-, Molm-14- und K562 -Zellen jeweils in Figur 2A-C dargestellt. Wie man der Figur 2 entnimmt, reduzierten die racemischen Gemische der Verbindungen MF2 und JHS1 die metabolische Aktivität von HEL und Molm-14-Zehen bei Konzentrationen von 10 und 20 μM. Demgegenüber waren die Verbindungen JHS2 und JHS3 inaktiv.
Beispiel 4: Untersuchung der Effekte der Enantiomere MF2-R und MF2-S auf die metabolische Aktivität in Leukämie-Zelllinien Im Folgenden wurden die zwei Enantiomere von MF2 jeweils individuell synthetisiert und MF2-R und MF2-S in dem MTT-Zell versuch wie unter Beispiel 2 beschrieben einzeln untersucht und mit dem racemischen Gemisch MF2 und PFI-1 verglichen. Des Weiteren wurde die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) berechnet.
Die bestimmten metabolischen Aktivitäten sind für die HEF-, Molm-14- und K562 -Zellen jeweils in Figur 3A-C dargestellt. Die IC50-Werte für die HEF-, Molm-14- und K562-Zellen sind jeweils in Figur 3D-F dargestellt. Wie man der Figur 3 entnimmt, zeigte sich, dass die Verbindung MF2-S signifikant stärker die metabolische Aktivität von HEF-Zellen (Figur 3A, D; 37.24% ± 6.19 vs.
72.95% ± 12.7) und Molm-14-Zellen (Abb. 3B, E; 55.19% ± 0.72 vs. 80.43% ± 1.324) reduzierte als die Vergleichs Verbindung PFI-1 in einer Konzentration von 1 μ M.
Dies zeigt, dass die Aktivität des racemischen MF2 verbessert und mit dem (S)-Enantiomer MF2-S eine Verbindung generiert wurde, die eine verbesserte Effizienz aufweist im Vergleich zu PFI-1. Demgegenüber verlor das (R)-Enantiomer MF2-R im Vergleich zu MF2 an inhibitorischer Aktivität. Bei höheren Konzentrationen der Inhibitoren (10 μ M und 20 μM) glich sich die Effizienz der Reduktion der metabolischen Aktivität wieder an. Eine Reduktion der benötigten Dosis ist jedoch von entscheidender Wichtigkeit, da hierdurch potentielle Nebenwirkungen reduziert werden könnten.
Beispiel 5 : Untersuchung der Effekte der Enantiomere MF2-R und MF2-S auf die Proliferation in Leukämie -Zelllinien
In weiteren Versuchen wurden HEL-, Molm-14- und K562-Zellen in Triplikaten mit jeweils 1 oder 5 μM der Enantiomere MF2-R und MF2-S inkubiert und die Zellzahlen der so behandelten Zellen wurden zum Startzeitpunkt sowie nach 24, 48 und 72 h nach Trypan-Blau-Färbung in der Thoma- Kammer bestimmt und dokumentiert. Das hier beschriebene Zellwachstum wird als Proliferation bezeichnet und gibt Aufschluss über die durchgeführten Zellteilungen im angegebenen Zeitraum.
Die jeweiligen durchschnittlichen Zellzahlen sind für HEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 4A-C dargestellt. Figur 4D zeigt die relative Zellzahl und Figur 4E die durchschnittliche Zellpopulation. Wie man der Figur 4 entnimmt, wurde durch das (S)-Enantiomer MF2-S im Vergleich zu PFI-1 die Zellproliferation von HEL und Molm-14 signifikant reduziert. Figur 4D zeigt die signifikante Reduktion für 5 μ M MF2-S im Vergleich zu PFI-1.
Während der Proliferation durchlaufen die Zellen unterschiedliche Stadien des Zellzyklus, in denen die genomische DNA repliziert, der Zellkern abgebaut und die Zellteilung stattfindet, wodurch zwei identische Zellen entstehen. Wie man der Figur 4E entnimmt, wurde die Synthesephase (S-Phase) durch MF2-S stärker gehemmt als durch PFI-1, wobei der Anstieg der G0/G1 -Phase typisch für einen Block des Zellzyklus ist. Die subGl -Phase gibt den prozentualen Anteil der toten Zellen an und auch hier waren signifikant höhere Anteile der HEL- und Molm-14-Zellen, wenn mit MF2-S behandelt, angereichert.
Während der Untersuchung der Zellproliferation wurde ebenfalls die Viabilität der Zelllinien anhand der Trypan-Blau-Färbung bestimmt. Trypan-Blau kann nicht in lebende Zellen eindrigen. Die Viabilität ist für die HEL-, Molm-14- und K562-Zellen jeweils in Figur 5A-C dargestellt. Figur 5D zeigt die relative Viabilität für 5 μM PFI-1 und MF2-S. Wie man der Figur 5A-D entnimmt, reduzierte vor allem MF2-S in einer Konzentration von 5 μM die Viabilität der HEL- und Molm-14-Zellen signifikant im Vergleich zu PFI-1.
Weiterhin wurde eine mögliche Induktion der Apoptose in den beschriebenen Zelllinien durch die Verbindung MF2 untersucht. Hierzu wurde die Spaltung des Proteins Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1) nach 24 und 48 h Behandlung der HEL-, Molm-14- und K562 -Zellen mit jeweils 5 μM des racemischen Gemischs MF2 sowie der (S)- und (R) -Enantiomere MF2-S und MF2-R im Vergleich zu PFI-1 untersucht. Die Spaltung des Proteins PARP1 ist ein Hinweis auf die beginnende Apoptose (Zelltod) der Zellen und entsprechend wurden mittels Western Blot die Spaltprodukte von PARP1 untersucht. Im Detail, wurden nach Inhibitor-Behandlung Zelllysate mit RIPA Lysepuffer hergestellt. Protein-Konzentrationen wurden mit dem Bradford Protein Assay bestimmt an einem Nanodrop Spectrometer bei 595 nm. 25 μg der Proteinlysate wurde mit 4xLämmli-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 65 °C denaturiert und in die SDS-Page eingesetzt. Die Proteine wurden im Wet-Blot-Verfahren auf eine PVDF-Membran übertragen bei 100 m A über Nacht. Die Membran wurde mit 10% BSA in TBS- T-Puffer blockiert. Die primären Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C und der HRP-gelabelte 45 min bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Die Proteine wurden mittels PCA-ECL-Lösung an einem Chemilumineszenz-Detektor (Fusion SL, PeqLab) detektiert. Mit DMSO behandelte Zellen dienten als Kontrolle. Das Protein Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GADPH) wurde bestimmt, um eine gleichmäßige Auftragung der Proteinmenge nachzuweisen.
Figur 5E zeigt die Western Blots der HEL-, Molm-14- und K562-Zellextrakte. Wie man der Figur 5E entnimmt, war in HEL-Zellen die markierte Bande für das PARP1 -Spaltprodukt nach 48 h Behandlung mit MF2-S stärker ausgeprägter als bei PFI-1 -Behandlung, während die Bande in Molm- 14-Zellen gleich stark erschien. Jedoch war weniger ungespaltenes PARP1 nach 48 h Behandlung mit 5 μM MF2-S zu erkennen. Es wird angenommen, dass die Inhibition von BRD4 in den untersuchten Zelllinien verstärkt zur Reduktion der metabolischen Aktivität und Proliferation führte und weniger zu einer Induktion der Apoptose der Zehen. Dennoch induzierte MF2-S (5μM) stärker Apoptose als die weiteren untersuchten Verbindungen.
Beispiel 6: Untersuchung der Effekte der Enantiomere MF2-R und MF2-S auf humanes Gewebe
Um zu untersuchen, ob das Enantiomer MF2-S ebenfalls in Primärmaterial von AML (akute myeloische Leukämie) -Patienten und MPN (myeloproliferative Neoplasie)-Patienten ein verbessertes Ansprechen zeigt, wurden sogenannte colony formation assays (CFU-Assays) durchgeführt. Hierfür wurden mononukleäre Zehen (PB MC: Mononukleäre Zehen aus dem peripheren Blut) oder CD34- positive Stammzehen (CD34+ Zellen) aus dem Blut von vier gesunden Kontrollen und drei AML- bzw. MPN-Patienten isoliert und in semi-solides Medium, das mit jeweils 1 μM oder 5 μM an MFS-2 oder PFI-1 versetzt wurde, gegeben. Einzelzellen bilden im CFU-Assay nach 12 Tagen in Kultur Zellkolonien, sofern ihre Ausbildung nicht durch Inhibitoren verhindert wird.
Figur 6A zeigt die Kolonie-Anzahl der vier Kontrollen. Wie man der Figur 6A entnehmen kann, reduzierte in den Kontrollen 1 (PB MC) und 2 (CD34+ Zellen) eine Behandlung mit 5 μM PFI-1 oder MF2-S die Menge der Kolonien gleichsam. Um diesen unspezifischen Effekt auf gesunde Zellen zu reduzieren, wurde in den CD34+-Kontrollen 3 und 4 ebenfalls eine Konzentration von 1 μM MFS-2 oder PFI-1 eingesetzt. Wie der Figur 6A entnommen werden kann, wurde durch 1 μM MFS-2 oder PFI-1 die Kolonienanzahl der Kontrollen weniger stark reduziert. In der Kontrolle 4 wurde die Kolonienanzahl durch 1 μM MF2-S nicht signifikant reduziert. Figur 6B zeigt die Ergebnisse der CFU-Assays von drei AML-Patienten. Wie man der Figur 6B entnimmt, reduzierte MF2-S in den jeweiligen Konzentrationen von 1 μM und 5 μM jeweils die Kolonienanzahl signifikant stärker als PFI-1. Ferner zeigte sich hier 1 μM MF2-S ebenso effizient wie 5 μM PFI-1.
Figur 6C zeigt die Ergebnisse der CFU-Assays der drei MPN-Patienten. Myeloproliferative Neoplasien beinhalten drei klassische Philadelphia Chromosom-negative (BCR-ABF-negative) Krankheitsentitäten, welche die Polycythemia vera (PV), die essentielle Thrombozythämie (ET) und die primäre Myelofibrose (PMF) sind. Sowohl die PV als auch die ET kann in eine Myelofibrose (MF) fortschreiten, was meist eine fatale Verschlechterung des Krankheitszustands und des Behandlungserfolgs bedeutet. Alle in diesen Studien involvierten MPN-Patienten waren JAK2V617F- positiv. Wie man der Figur 6C entnehmen kann, führte die Behandlung der Zellen im CFU-Assay mit 5 μM MF2-S jeweils zu einer signifikant stärkeren Reduktion der Kolonienzahl. Zudem wurde durch 1 μM MF2-S die Kolonienzahl aus Material des PMF-Patienten sehr effizient reduziert, während dies im Vergleich zur PFI-1 beim Material des ET-Patienten nicht der Fall war.
Zudem wurde durch in silico docking Analysen und molecular dynamics (MD) Simulationen mit Hilfe der Röntgen-Struktur der von PFI-1 -gebundenen Bromodomäne des BRD4 bestätigt, dass MF2-S der beste Ligand der Bromodomäne sein sollte. Hierbei zeigte sich, dass sich im Falle von MF2-S die (S)- S-Methyl-S-phenylsulfonimidoylgruppe zu einer hydrophoben Region des BRD4 orientiert, während das (R)-S-Methyl-S-phenylsulfonimidoylfragment des MF2-R in die entgegengesetzte Richtung zeigte. Es wird angenommen, dass hierdurch die Interaktion verloren geht. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass dies die verbesserte Effizienz des (S)-Enantiomers MF2-S im Vergleich zum (R)-Enantiomer MF2-R erklärt.
Beispiel 7 : Untersuchung der Selektivität des Enantiomers MF2-S
Um die Selektivität der Verbindung MF2-S zu untersuchen, wurde bei der Firma Reaction Biology Corp. (PA, USA) ein Thermal Shift Assay (BromoMELT™ assay) mit der Verbindung MF2-S und als Vergleichsverbindung PFI-1 durchgeführt. Dieser Assay gibt Auskunft über die spezifische Bindung von MF2-S an 76 Bromodomänen-beinhaltende Proteine. Der Versuch wurde in Duplikaten bei einer Konzentration von 10 μM durchgeführt. Die Dissoziation der Inhibitoren (3 = PFI-1; (S)-4a = MF2-S) von den Bromodomänen-beinhaltenden Proteinen bei steigenden Temperaturen im Vergleich zu einer DMSO-Kontrolle wird durch den Wert ATm wiedergegeben.
Figur 7A zeigt die durch den Thermal Shift Assay erhaltenen ΔTm-Werte gegen DMSO-Kontrolle für die Verbindung MF2-S und die Vergleichs Verbindung PFI-1. Wie der Figur 7A entnommen werden kann, bindet MF2-S, bis auf BRDT-2, gleich gut oder besser Proteine der BET Familie als die Vergleichsverbindung PFI-1. Ebenfalls konnte eine höhere Spezifität für BRD4 festgestellt werden. Figur 7B illustriert die Spezifität sämtlicher analysierter Bromodomänen-beinhaltender Proteine für die Vergleichs Verbindung PFI-1, und Figur 7C für die Verbindung MF2-S. Flierbei sind Temper aturänderungen mit steigendem Radius für höhere Tm-Werte angegeben. Wie man den
Figuren 7B und 7C entnimmt, binden sowohl PFI-1 als auch MF2-S spezifisch die Proteine der BET Familie, wobei PFI-1 stärker BRD2 und MF2-S spezifischer BRD4 bindet.
Die Ergebnisse zeigen insgesamt, dass neue Bromodomänen-Inhibitoren zur Verfügung gestellt werden können, wobei die Verbindung MF2-S im Vergleich zum ursprünglichen Bromodomänen- Inhibitor PFI-1 bessere Ergebnisse zeigte. Diese Ergebnisse konnten in primärem Patientenmaterial von AML- und MPN-Patienten bestätigt werden.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (1) wie nachstehend angegeben und/oder deren Stereoisomere, Tautomere, Solvate, Hydrate und pharmazeutisch verträgliche Salze: worin:
X ist ausgewählt aus O oder N-R1, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Cyano, C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-6-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1-6-Alkyl, jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-6-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl, NH2, NHR2 und/oder NR2R3, wobei R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl; und
Me ist Methyl.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass:
X ist Sauerstoff;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1 -6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2- Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und
Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Verbindungen gemäß den nachstehenden Formeln (MF1), (MF2), (MF3) oder (MF4):
4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung das (S)- Enantiomer der Verbindungen der Formeln (MF1) oder (MF2) ist.
5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass:
X ist N-R1, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, Cyano, C1-6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2- Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend C1 -6- Alkyl und/oder jeweils unsubstituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 -7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und
Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Verbindungen gemäß den nachstehenden Formeln (JF1S1),
(JHS2) oder (JHS3):
7. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: X ist Sauerstoff;
Y ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend NH2, NHR2 und/oder NR2R3, wobei R2 und R3 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend C1 -6- Alkyl und/oder jeweils unsub- stituiertes oder einfach oder mehrfach mit C1-2-Alkyl substituiertes C3 7-Cycloalkyl, Aryl oder Hetaryl; und Z ist ausgewählt aus Cyclohexyl, Aryl oder Hetaryl, jeweils unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert mit C1-6-Alkyl, C1-5-Alkoxy oder einfach oder mehrfach mit Halogen substituiertem C1-6-Alkyl.
8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Verbindung gemäß der nachstehenden Formel (JHS4) oder eines deren Enantiomere:
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, vorzugsweise von Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien.
10. Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung einer Erkrankung, die mit Bromodomänen in Zusammenhang steht, vorzugsweise von Krebserkrankungen, insbesondere der akuten myeloischen Leukämie oder myeloproliferativen Neoplasien.
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