EP4013455A1 - Reduktion der knochenresorption, insbesondere bei chronischen gelenkerkrankungen - Google Patents

Reduktion der knochenresorption, insbesondere bei chronischen gelenkerkrankungen

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EP4013455A1
EP4013455A1 EP20757584.6A EP20757584A EP4013455A1 EP 4013455 A1 EP4013455 A1 EP 4013455A1 EP 20757584 A EP20757584 A EP 20757584A EP 4013455 A1 EP4013455 A1 EP 4013455A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
tlr7
inhibitor
mir
sevs
pharmaceutical composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP20757584.6A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Meike Julia SAUL
Anett Birgit HEGEWALD
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Technische Universitaet Darmstadt
Original Assignee
Technische Universitaet Darmstadt
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to a TLR7 / 8 inhibitor for reducing bone resorption, in particular in chronic joint diseases, and a pharmaceutical composition comprising the inhibitor.
  • the invention also relates to a method for predicting the severity of the course of rheumatoid arthritis in a patient.
  • Bone resorption is mediated by osteoclasts and plays an important role in various diseases.
  • a negative influence of bone resorption has been described, particularly in connection with joint diseases. This applies to acute joint diseases such as arthritis, but also particularly chronic joint diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis.
  • RA rheumatoid arthritis
  • Excessive bone resorption also plays an important role in other diseases such as periodontitis or in the case of poorly or non-growing implants.
  • arthropathies are the most common chronic diseases of older people in Germany.
  • the pathology of arthropathies is complex and multifactorial, but the pathogenesis generally involves inflammation of the joints, accompanied by bone resorption, leading to chronic pain and physical impairment.
  • Two of the most common types of arthropathies are rheumatoid arthritis and arthrosis.
  • Rheumatoid arthritis is characterized by the infiltration of immune cells into the synovial fluid, which leads to local inflammation and bone resorption. Osteoarthritis is caused by daily wear and tear on the joints or by traumatic damage. Older people are therefore most often affected. Half of all women and a third of all men develop osteoarthritis after the age of 60. There is currently no curative treatment for any of the diseases mentioned. Today's therapies are aimed solely at reducing pain and maintaining patient mobility.
  • the present invention is therefore based on the object of providing substances for the curative treatment of diseases which are associated with excessive bone resorption.
  • diseases are, in particular, acute or chronic joint diseases as well as paradontitis and disorders of the growth of implants.
  • diseases are in particular bone metastasis and psoriatic arthritis.
  • the present invention lies in particular, the task of reducing the bone resorption associated with the diseases.
  • the object is achieved in particular by a TLR7 / 8 inhibitor for use to reduce bone resorption in diseases associated with excessive bone resorption, in particular in diseases selected from the group consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and periodontitis , and / or in the event of implant growth disorders.
  • the object is also achieved by a TLR7 / 8 inhibitor for use in reducing bone resorption in diseases which are associated with excessive bone resorption, in particular in diseases selected from the group consisting of bone metastasis and psoriasis arthritis.
  • TLRs toll-like receptors form a family of receptors that belong to the group of type I transmembrane glycoproteins. So far, 13 TLRs have been identified, of which TLRs 1 to 10 are expressed in humans. Of particular interest are TLR7 and TLR8, which due to their similarities are generally addressed together as TLR7 / 8. TLR7 / 8 are endosomal receptors, especially for single-stranded RNA (ssRNA (English: single stranded RNA)).
  • ssRNA Single-stranded RNA
  • TLR7 / 8 makes a decisive contribution to osteoclast differentiation and thus to bone resorption, especially in chronic joint diseases, so that an inhibition of TLR7 / 8 can be used to reduce bone resorption.
  • TLR7 / 8 can be inhibited directly by corresponding direct inhibitors such as, for example, ODN 2087, or indirectly, for example by inhibiting miR-574-5p.
  • miR-574-5p belongs to the class of so-called microRNAs (miRs), a class of small, non-coding RNAs with a function in gene regulation.
  • Extracellular miRs are secreted in so-called small extracellular vesicles (sEVs, for “small extracellular vesides”) in human body fluids such as synovial fluid, so that they are protected from breakdown by ribonucleases (Cheng L, Sharples RA, Scicluna BJ and Hill AF (2014). "Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood.” J Extracell Vesicles 3).
  • miRs bind to their target mRNA and in a sequence-dependent manner ensure their translational repression or degradation.
  • Ambros V. (2004). “The functions of animal microRNAs.” Nature 431: 350-355; Lytle JR, Yario TA and Steitz JA (2007).
  • “Target mRNAs are repressed as efficiently by microRNA-binding sites in the 5 'UTR as in the 3' UTR. "Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 9667-9672).
  • miRs can also activate gene expression by binding to RNA binding proteins and inhibiting their functions (Eiring AM, Harb JG, Neviani P., Garton C., Oaks JJ, Spizzo R., Liu S., Schwind S., Santhanam R., Hickey CJ, Becker H., Chandler JC,
  • TLR7 / 8 Toll-like receptor 7/8
  • the activation of TLR7 / 8 was recently described as an alternative mode of action of the two miRs miR-29b and miR-21 in connection with lung cancer (Fabbri M., Paone A., Calore F., Galli R., Gaudio E., Santhanam R., Lovat F., Fadda P., Mao C., Nuovo GJ, Zanesi N., Crawford M., Ozer GH, Wernicke D., Alder H., Caligiuri MA, Nana -Sinkam P, Perrotti D and Croce CM (2012).
  • MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response.
  • Exosome-delivered microRNAs promote IFN- a secretion by human plasmacytoid DCs via TLR7.
  • JCI Insight 3 MiR-574-5p has also already been identified as a TLR7 / 8 ligand (WO 2017/079983 A1).
  • miR-574-5p plays a decisive role in connection with bone resorption, in particular in chronic joint diseases.
  • miR-574-5p from sEVs from the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis leads to an increased osteoclast differentiation via activation of TLR7 / 8, as explained in detail in the example section. This is particularly surprising because so far there has been an inhibition tion of osteoclast differentiation by TLR7 / 8 agonists had been assumed (Miya-moto A. et al (2012) R848, a toll-like receptor 7 agonist, inhibits osteoclast differentiation but not survival or bone-resorbing function of mature osteoclasts).
  • the present invention thus relates to a TLR7 / 8 inhibitor for use in reducing bone resorption in diseases associated with excessive bone resorption, in particular in diseases selected from the group consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and periodontitis, and / or if there are problems with the growth of implants.
  • TLR7 / 8 inhibitors are preferred for use to reduce bone resorption in chronic joint diseases.
  • the invention also relates to a TLR7 / 8 inhibitor for use in reducing bone resorption in diseases associated with excessive bone resorption, in particular in diseases selected from the group consisting of bone metastasis and psoriatic arthritis.
  • the TLR7 / 8 inhibitors of the present invention reduce bone resorption, in particular by means of an inhibition of osteoclast genesis or osteoclast differentiation, preferably in diseases from the group consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and periodontitis, and / or in disorders of the growth of implants .
  • the preferred acute joint disease is arthritis.
  • the TLR7 / 8 inhibitors of the present invention reduce bone resorption, in particular by means of an inhibition of osteoclast genesis or osteoclast differentiation, preferably also in diseases from the group consisting of bone metastasis and psoriatic arthritis.
  • the chronic joint disease is preferably selected from the group consisting of rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
  • the chronic disease rheumatoid arthritis is particularly preferred.
  • TLR7 / 8 inhibitors inhibitors of TLR7 and / or TLR8 are referred to as TLR7 / 8 inhibitors.
  • a TLR7 / 8 inhibitor can therefore be, for example, an inhibitor of TLR7 but not an inhibitor of TLR8.
  • a TLR7 / 8 inhibitor can be an inhibitor of TLR8 but not an inhibitor of TLR7.
  • a TLR7 / 8 inhibitor is both an inhibitor of TLR7 and an inhibitor of TLR8.
  • TLR7 / 8 can be inhibited in a variety of ways.
  • the TLR7 / 8 inhibitor is preferably selected from the group consisting of low molecular weight compounds (English: small molecules) and oligonucleotides.
  • Preferred oligonucleotides are selected from the group consisting of IRS-661 (SEQ ID NO: 21; Dynayax Technologies), IRS-954 (SEQ ID NO: 22; Dynayax Technologies (Barrat et al., 2005, 2007; Guiducci et al., 2010)), DV-1179 (Dynayax Technologies (Zhu et al., 2011; Suarez-Farinas et al., 2013)), IMO-3100 (Idera (Zhu et al., 2011; Suarez-Farinas et al., 2013 )), IMO-8400 (Idera (Jiang et al., 2012; Zhu et al., 2012), IMO-9200 (Idera / Vivelix), IHN-ODN-24888 (SEQ ID NO: 23; Coley Pharmaceutical GmbH (Rommler at al., 2013, 2015)), ODN 2087 (SEQ ID NO: 24; ODN 2088 Control (
  • TLR7 / 8 primarily recognize nucleic acid structures of dsRNA, ssRNA and CpG-DNA. Therefore, oligonucleotides, especially the above-mentioned oligonucleotides, can bind to TLR7 / 8 and act as inhibitors of TLR7 / 8 by hindering the binding of TLR7 / 8 to activating ligands and thereby the activation of TLR7 / 8 inhibit.
  • oligonucleotides with inhibitory effects on TLR7 / 8 act as indirect inhibitors without direct physical interaction with TLR7 / 8, as described below.
  • Such indirect inhibitors are preferably in particular a single-stranded RNA complementary to miR-574-5p or a single-stranded RNA analogue (AntagomiR) complementary to miR-574-5p, in particular selected from the group consisting of LNA (English: “Locked nucleic acid”), BNA (English: “bridged nucleic acid”), PMO (English: “phosphorodiamidate morpholino oligomer”) and PNA (English: “peptide nucleic acid”).
  • LNA is particularly preferred.
  • PNA is particularly preferred.
  • the inhibitor is particularly preferably an miR-574-5p PNA AntagomiR.
  • a TLR7 / 8 inhibitor for the purposes of the present invention can be a direct or an indirect inhibitor.
  • a direct TLR7 / 8 inhibitor is a component which enters into direct physical interaction with TLR7 / 8 and thereby leads to an inhibition of TLR7 / 8.
  • Such direct TLR7 / 8 inhibitors are known to the person skilled in the art and can accordingly be obtained without problems.
  • Such direct TLR7 / 8 inhibitors are described, for example, in Gao W., Xiong, Y., Li Q., Yang H. (2017). "Inhibition of Toll-Like Receptor Signaling as a Promising Therapy for Inflammatory Diseases: A Journey from Molecular to Nano Therapeutics.” Frontiers in Physiology, Volume 8, Article 508. However, their use for reducing bone resorption, especially in chronic joint diseases, was previously unknown.
  • a direct TLR7 / 8 inhibitor of the present invention for use to reduce bone resorption in diseases selected from the group comprising, preferably consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and periodontitis, and / or in disorders of the ongrowth of Implants
  • the invention also relates to a direct TLR7 / 8 inhibitor of the present invention for use in reducing bone resorption in diseases selected from the group comprising, preferably consisting of bone metastasis and psoriatic arthritis.
  • An indirect TLR7 / 8 inhibitor of the present invention is a component which leads to an inhibition of TLR7 / 8 by inhibiting one or more TLR7 / 8 agonists and / or activating one or more TLR7 / 8 antagonites.
  • Inhibition of TLR7 / 8 agonists and / or activation of TLR7 / 8 antagonists can take place through direct physical interaction with the corresponding TLR7 / 8 agonists and / or TLR7 / 8 antagonists. According to the invention, however, it is also possible for TLR7 / 8 agonists to be inhibited and / or TLR7 / 8 antagonists to be activated by acting on appropriate regulatory elements such as promoters and / or enhancers.
  • TLR7 / 8 inhibitors which inhibit one or more TLR7 / 8 agonists are particularly preferred.
  • TLR7 / 8 agonists to be inhibited are preferably selected from the group consisting of miR-574-5p, miR-21 / 29a, let-7 and combinations thereof.
  • Very particularly preferred indirect TLR7 / 8 inhibitors are miR-574-5p inhibitors.
  • the inhibitor is preferably a single-stranded RNA that is completely complementary to miR-574-5p or a single-stranded RNA analogue that is completely complementary to miR-574-5p (Anta- gomiR), in particular selected from the group consisting of LNA (English: “locked nucleic acid”), BNA (English: “bridged nucleic acid”), PMO (English: “phosphorodiamidate morpholino oligomer”) and PNA (English : "Peptide nucleic acid”).
  • LNA is particularly preferred.
  • PNA is particularly preferred.
  • the preferred sequence of such an inhibitor is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the corresponding PNA sequence is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the inhibitor is particularly preferably an miR-574-5p PNA AntagomiR.
  • the inhibitor can also be a single-stranded RNA complementary to miR-574-5p or a single-stranded RNA analogue (AntagomiR) complementary to miR-574-5p, in particular selected from the group consisting of LNA (locked nucleic acid "), BNA (English:” bridged nucleic acid “), PMO (English:” phosphorodiamidate morpholino oligomer ”) and PNA (English:” peptide nucleic acid "), whereby the RNA or the RNA analogue is completely complementary to miR-574-5p, but does not cover the entire sequence of miR-574-5p.
  • LNA locked nucleic acid
  • BNA English:” bridged nucleic acid "
  • PMO English:” phosphorodiamidate morpholino oligomer
  • PNA English:” peptide nucleic acid "
  • sequence of a particularly preferred inhibitor is shown as an RNA sequence in SEQ ID NO: 26 and as a PNA sequence in SEQ ID NO: 28.
  • sequences of SEQ ID NOs: 26 and 28 are five residues shorter.
  • miR-574-5p inhibitors are also in accordance with the invention.
  • the invention also includes so-called “miRNA sponge” and “miRNA decoy”. These are nucleic acid molecules that contain tandem binding sites for miR-574-5p. As a result, they act as competitive inhibitors of miR-574-5p (Ebert and Sharp, 2010 and US 2017/0044541 A1).
  • the miR-574-5p inhibitor is preferably selected from the group comprising, preferably consisting of AntagomiR, miRNA sponge and miRNA decoy. AntagomiR is particularly preferred.
  • miR-574-5p inhibitors that do not interact directly with miR-574-5p, but instead act on regulatory elements of miR-574-5p, for example on its promoter and / or enhancer.
  • the extent of osteoclast differentiation can preferably be used as a measure of the extent of bone resorption.
  • Appropriate procedures for determining the Effect of a substance on osteoclast differentiation are well known to those skilled in the art. Particularly suitable methods are also described in detail in the present example section and are also known from the literature.
  • it is advantageous if the osteoclast differentiation in CD14 + monocytes or M2-like macrophages is induced with the aid of a TLR7 / 8 agonist (preferably miR-574-5p) in the presence or absence of the potentially inhibitory substance to be tested, with the desired inhibitory effect can be determined when, in the presence of the substance to be tested, a significantly lower osteoclast differentiation can be observed compared to the absence of the substance.
  • Other test methods are also possible.
  • the extent of osteoclast differentiation and / or the extent of bone resorption can alternatively or additionally be examined in an animal model, in particular an arthritis mouse model such as CIA (collagen-induced arthritis).
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a TLR7 / 8 inhibitor according to the invention, in particular an indirect TLR7 / 8 inhibitor, particularly preferably an miR-574-5p inhibitor.
  • the pharmaceutical composition preferably contains carriers which are selected from the group consisting of cell penetrating peptides (CPPs), nanocarriers (NCs) and / or cholesterol, or from the group consisting of nanocarriers (NCs) ) and / or cholesterol.
  • the carrier substances are preferably NCs.
  • Preferred NCs are nanoparticles (NPs).
  • Particularly preferred are the carrier substances nanoparticles, in particular special iron oxide nanoparticles, gold nanoparticles and / or silver nanoparticles.
  • Iron oxide nanoparticles, in particular superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs, English: superparamagnetic iron oxide nanoparticles) are particularly preferred.
  • Iron oxide nanoparticles are biodegradable so that the particles do not accumulate excessively in the body. Another advantage of iron oxide nanoparticles is that they can be enriched in the desired body region, in particular in an affected joint, by applying an external magnetic field, even with systemic administration (for example intravenously).
  • the nanoparticles of the invention preferably have a diameter in a range from 5 nm to 100 nm, more preferably 7.5 nm to 75 nm, more preferably from 10 nm to 50 nm, for example 15 nm to 40 nm or 20 nm to 30 nm , in particular about 25 nm.
  • the small diameter of the nanoparticles is particularly advantageous for their permeability to the membrane.
  • the diameter of the nanoparticles can be determined using dynamic light scattering (DLS), for example. or by means of scanning electron microscopy (SEM), the diameter in the case of an SEM determination preferably being the Martin diameter.
  • DLS dynamic light scattering
  • SEM scanning electron microscopy
  • the pharmaceutical composition very particularly preferably contains carriers, the carriers being cell penetrating peptides (CPPs).
  • CPPs are polycationic peptides that have a number of advantages.
  • Optional CPPS are penetratin, TAT (transactivator of transcription), MAP (model amphiphatic peptide), polyarginine (e.g. R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 or R12), pVEC, Transportan, MPG, and Combinations of these.
  • a particularly preferred CPP is (N-terminus) - GRK- KRWFRRRRMKWKK- (C-terminus) (SEQ ID NO: 29).
  • CPPs enable simple upscaling, in particular using solid-phase synthesis methods.
  • CPPs are associated with membrane permeability and nucleolar accumulation.
  • the inhibitor is preferably present in conjugated form to the carrier substances.
  • the inhibitor is particularly preferably covalently bound to the carrier.
  • the inhibitor is particularly preferably a miR-574-5p PNA AntagomiR.
  • Particularly preferred is a miR-574-5p PNA AntagomiR covalently bound to CPP, in particular an miR-574-5p PNA AntagomiR bound to CPP by means of a PEG linker.
  • the compounds covalently bound to CPP are bioorthogonal. They enable stronger hybridization and an increased half-life.
  • the PEG linker can have one or more ethylene glycol units. In one embodiment, the PEG linker contains one ethylene glycol unit, two or more ethylene glycol units, or three or more ethylene glycol units. The solubility can be adjusted by a suitable choice of the linker length.
  • the TLR7 / 8 inhibitor in particular a miR-574-5p-AntagomiR, can be bound to lysine or a modified lysine. This is especially true for PNA-AntagomiR.
  • the C-terminal end of a PNA-AntagomiR is particularly preferably bound to modified lysine, the modification of the lysine preferably being that an amide group (-CONH2) is present instead of the carboxyl group (-COOH).
  • This is advantageous for the synthesis of the PNA by means of solid phase synthesis.
  • the solubility of the PNA is increased.
  • the inhibitor is particularly preferably densely packed on the carrier. This results in particularly good accessibility to the membrane. In addition, the stability is increased.
  • the surface density of the TLR7 / 8 inhibitor on the carrier, in particular an miR-574-5p inhibitor (preferably AntagomiR) on the nanoparticles is preferably at least 10 10 molecules per cm 2 , more preferably at least 10 11 molecules per cm 2 preferably at least 10 12 molecules per cm 2 .
  • the surface density is preferably at most 10 14 molecules per cm 2 , more preferably at most 5 * 10 13 molecules per cm 2 , more preferably at most 2 * 10 13 Molecules per cm 2 .
  • the surface density can, for example, be in a range from 5 to 150, in particular 10 to 70 AntagomiR oligonucleotides per 10 nm of particles.
  • the present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition of the invention, comprising the following steps: a) providing a TLR7 / 8 inhibitor according to the invention, in particular an indirect TLR7 / 8 inhibitor, particularly preferably a miR-574-5p- Inhibitor, b) coupling of the TLR7 / 8 inhibitor to a carrier which is selected from the group consisting of cell penetrating peptides (CPPs), nanocarriers (NCs) and / or cholesterol, or from the group consisting of nanocarriers (NCs) and / or cholesterol, in particular on NPs, particularly preferably on NPs, which are selected from the group consisting of iron oxide nanoparticles, gold nanoparticles and / or silver nanoparticles, quite be especially preferably on iron oxide nanoparticles or on cell penetrating peptides (CPPs).
  • a carrier which is selected from the group consisting of cell penetrating peptides (CPPs), nanocarrier
  • the coupling according to step b) is preferably carried out via click chemistry, for example as described in Cutler J. I., Zheng D., Xu X., Giljohann D. A., Mirkin C. A. (2010). "Polyvalent Oligonucleotide Iran Oxide Nanoparticle“ Click ”Conjugates.” Nano Ladder 10: 1477-1480.
  • Carriers, in particular nanoparticles which are in aminated form, are particularly preferably reacted with azidobutyrate or azidoacetate, so that a free azide group results.
  • the azide group is then preferably used to bind the inhibitor to the carrier.
  • the azide group can bond with modified nucleotides, preferably with a 1: 1 stoichiometry.
  • the miR-574-5p inhibitors according to the invention are preferably RNA or RNA analogs, so that these inhibitors are particularly effective via appropriately modified nucleotides, in particular at the 5 'end or at the 3' end (preferably at the 5 ' -End), can be coupled to appropriately modified carrier materials, in particular nanoparticles, particularly preferably iron oxide nanoparticles.
  • a particularly preferred nucleotide modification in this context is a terminal alkyne group, in particular at the 5‘ end of the nucleotide.
  • the coupling according to step b) to CPPs is preferably carried out by means of a PEG linker.
  • a PEG linker Within the scope of the present invention, it is possible to synthesize CPP and TLR7 / 8 inhibitor separately and then to couple them. It is preferred, however, to build up the entire construct continuously, monomer by monomer. Embodiments in which the inhibitor is an miR-574-5p PNA AntagomiR are particularly preferred.
  • the CPP-PNA construct is preferably constructed starting with the most C-terminal PNA monomer (or the modified lysine, which is still more C-terminal) and ending with the N-terminal amino acid of the CPP part.
  • the present invention also relates to a method for predicting the severity of the disease progression of rheumatoid arthritis in a patient comprising the following steps: a) Determination of the miR-574-5p content in sEVs (small extracellular vesicles) in a patient sample, b) comparison of the content determined in step a) with the content of miR-574-5p in sEVs in samples of one or more comparison patients with known disease progression, c) prognosis of the severity of the disease progression based on the comparison result.
  • the patient sample can for example be a sample of the synovial fluid or a blood sample, in particular a plasma sample.
  • the patient sample is particularly preferably a sample of the synovial fluid.
  • the sEVs are preferably synovial sEVs.
  • the miR-574-5p content is preferably determined using RT-qPCR.
  • the present invention also relates to the use of a TLR7 / 8 inhibitor for reducing bone resorption in diseases selected from the group comprising, preferably consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and parodontitis, and / or in disorders of the growth of implants .
  • the use for reducing bone resorption in chronic joint diseases is preferred.
  • the present invention also relates to the use of a TLR7 / 8 inhibitor for reducing bone resorption in diseases which are selected from the group comprising, preferably consisting of bone metastasis and psoriatic arthritis.
  • the present invention also relates to a method for reducing bone resorption in diseases associated with excessive bone resorption, in particular in diseases selected from the group consisting of chronic joint diseases, acute joint diseases and periodontitis, and / or in disorders of growth of implants, the method comprising the step of administering an inventive Comprises a moderate TLR7 / 8 inhibitor.
  • the disease is in particular a chronic joint disease which is selected from the group consisting of rheumatoid arthritis and arthrosis.
  • the diseases can also be or include bone metastasis or psoriatic arthritis.
  • Figure 1 shows schematically the isolation of sEVs with differential ultracentrifugation.
  • Figure 2 shows schematically the induction of osteoclast genesis.
  • Figure 3 shows a significant concentration-dependent increase in osteoclasts when sEVs are added to monocytes (Figure 3A) or to M2-like macrophages (Figure 3B).
  • the results are given as mean value + SEM ("Standard error of the mean"). Differences were classified as significant for p ⁇ 0.05 (indicated as * for p ⁇ 0.05, ** for p ⁇ 0.01, *** for p ⁇ 0.001).
  • Figure 4 shows the content of various miRs in the isolated vesicles, determined with the aid of RT-qPCR.
  • a high content of miR-574-5p (SEQ ID NO: 4) was found both in the sEVs from the serum and in the sEVs from the synovial fluid (FIGS. 4A and 4B). The results are given as the mean + SEM.
  • Figure 5 shows the intracellular level and sEV level of the displayed miRs with and without 24-hour stimulation with IL-1ß (10 ng / ml) and / or TNFa (10 ng / ml).
  • Figure 6 shows intracellular levels (Figure 6A) and secretion (Figure 6B) of miR-574-5p during osteoclast differentiation.
  • Figure 7A shows the miR-574-5p content in miR-574-5p oe sEVs and in a control (ScrC sEVs).
  • Figure 7B shows the results of an RNase protection experiment, according to which the RNase degradation of miR-574-5p can be significantly increased by adding a detergent.
  • Figure 8 shows the results of treatment with 1 pg / ml miR-574-5p oe sEVs or ScrC sEVs at different times of differentiation.
  • the miR-574-5p oe sEVs lead to a significant increase in the number of osteoclasts when added to monocytes or M2-like macrophages ( Figures 8A and 8B).
  • Figure 8C When added to pre-osteoclasts, however, no significant increase in the number of osteoclasts was observed (Figure 8C).
  • Figure 9 shows that neither miR-574-5p alone nor miR-574-5p in the presence of synthetic liposomal vehicles (Lipofectamine® 2000) leads to a stimulation of osteoclast genesis.
  • Figure 10 shows a direct interaction of miR-574-5p with TLR8 using MST (English: “micoscale thermophoresis”). The dissociation constant K D was 30.8 ⁇ 5.2 nM ( Figures 10A and 10B). However, there is no specific interaction between TLR8 and miR-16-5p ( Figures 10A and 10B).
  • Figures 10C and 10D show that addition of the TLR7 / 8 inhibitor ODN 2087 cancels the effect of miR-574-5p on CD14 + monocytes and M2-like macrophages.
  • Figures 10E and 10F show the influence of the TLR7 / 8 ligand R848 on osteoclast genesis.
  • FIG. 11 shows the relative IL-23 and IFNa mRNA levels after stimulation of CD14 + monocytes with the specified substances in the presence or absence of the TLR7 / 8 inhibitor ODN 2087.
  • Figure 12 schematically shows the structure of a PNA-AntagomiR (3) coupled to CPP (1).
  • the PNA-AntagomiR (3) is bound to the cell-penetrating peptide (1) by means of a PEG linker (2).
  • Figure 13 shows the results of an MTT assay for testing cytotoxicity, the viability being plotted on the y-axis. Neither the negative control ( Figure 13A) nor the miR-574-5p PNA AntagomiR ( Figure 13B) showed any significant toxicity.
  • Figure 14 shows that the CPP-coupled miR-574-5p PNA AntagomiR leads to a concentration-dependent reduction in osteoclast genesis.
  • SEVs small extracellular vesicles, sEVs
  • sEVs small extracellular vesicles, sEVs
  • ACPAs American-citrullinated protein antibodies
  • ACPAs are associated with a more severe course of the disease.
  • the vesicles were isolated using differential ultracentrifugation ( Figure 1).
  • TEM transmission electron microscopy
  • sEVs were also isolated from the serum of the patients.
  • CD14 + monocytes were isolated from PMBCs (“peripheral blood mononuclear cells”) from healthy donors and treated with M-CSF (“recombinant human macrophage colony-stimulating factor”), RANK-L (English: “receptor activator”) of NF-kB ligand ”) and different concentrations of the isolated sEVs. Both freshly isolated monocytes and differentiated M2-like macrophages were stimulated with the sEVs isolated from the synovial fluid ( Figure 2).
  • osteoclast marker TRAP American Type II osteoclast marker
  • the results show that the isolated sEVs induce osteoclast differentiation in a concentration-dependent manner.
  • the content of various miRs in the isolated vesicles was determined with the aid of RT-qPCR.
  • a high content of miR-574-5p (SEQ ID NO: 4) was found both in the sEVs from the serum and in the sEVs from the synovial fluid (FIGS. 4A and 4B). The results are given as the mean + SEM.
  • the content of the other miRs tested was significantly lower.
  • the primers were obtained from Qiagen (Hilden, Germany) (catalog number MS00043617 for miR-574; MS0031493 for miR-16; MS00031486 for miR-155; and MS00003535 for miR-146a).
  • Non-human cel-miR-39-3p (SEQ ID NO: 5), which was added to the samples at a final concentration of 200 nM for this purpose, was used as a control to normalize the extracellular content.
  • the primers were also from Qiagen (catalog number MS00019789).
  • the results show a selective accumulation of miR-574-5p in sEVs from patients with rheumatoid arthritis.
  • Synovial fibroblasts were obtained from ACPA-negative and ACPA-positive rheumatoid arthritis patients. Intracellular levels and sEV levels of the above-mentioned miRs were determined using RT-qPCR with and without stimulation with IL-1ß (10 ng / ml) and / or TNFa (10 ng / ml) for 24 hours (FIGS. 5A and 5B). The sEVs were isolated from the cell culture supernatants. To normalize the extracellular content, cel-miR-39-3p was always used. To normalize the intracellular content, snRNA U6 (SEQ ID NO: 20) was always used as an endogenous control.
  • the primers were also from Qiagen (catalog number MS00033740).
  • miR-146a-5p served as a positive control, as its induction by stimulation with I L-1 ß is known (Stanczyk J., Pedrioli DM L, Brentano F., Sanchez-pernaute O., Kolling C., Gay RE, Detmar M., Gay S. and Kyburz D. (2008). "Altered Expression of MicroRNA in Synovial Fibroblasts and Synovial Tissue in Rheumatoid Arthritis.” Arthritis Rheum 58: 1001-1009). No significant stimulation-related differences could be observed for the other miRs.
  • ACPA ACPA-negative
  • ACPA + ACPA-positive
  • FIG. 5D significantly increased amounts of miR-574-5p were found in sEVs of SFs from ACPA-positive patients compared to ACPA-negative patients, so that the content of extracellular miR-574-5p increases with the severity of the Can be related to the course of the disease.
  • M2 macrophages also secrete miR-574-5p in sEVs (Figure 6). While the intracellular level remains essentially unchanged during osteoclast differentiation (Figure 6A), significant secretion no longer takes place after 6, 9 or 12 days of differentiation ( Figure 6B). So pre-osteoclasts and osteoclasts do not contribute significantly to miR-574-5p in sEVs.
  • SFs and monocytes but not pre-osteoclasts and osteoclasts, contribute to miR-574-5p in sEVs.
  • sEVs with engineered miR-574-5p level contribute to miR-574-5p in sEVs.
  • miR-574-5p is therefore found in the vesicles that protect against RNase degradation and is only accessible for RNase degradation when released by the detergent. This experiment shows that the miR-574-5p is mainly in the sEVs and is therefore protected from degradation by RNases. The addition of the detergent enables the miR to be broken down by “destroying” the sEVs.
  • Uptake of the constructed sEVs by cells miR-574-5p oe sEVs were stained with the fluorescent dye 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) and their uptake in CD14 + monocytes was examined with confocal microscopy. Uptake of the colored vesicles into the cells was observed after 20 minutes. The maximum number of stained sEVs in the cells was reached after 40 minutes. Similar results were obtained for HeLa cells.
  • DiO 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate
  • Isolated human CD14 + monocytes were treated with 1 pg / ml miR-574-5p oe sEVs or ScrC sEVs at different times of differentiation ( Figures 8A, 8B, 8C).
  • the ScrC sEVs also lead to a significant increase in the number of osteoclasts when added to monocytes or M2-like macrophages ( Figures 8A and 8B). This is likely to be due to the miR-574-5p also present there, whose content is, however, lower by a factor of 15 compared to the miR-574-5p oe sEVs ( Figure 7A), so that the stimulation of osteoclast genesis is about 1.2-fold with ScrC sEVs is significantly lower than with miR-574-5p oe sEVs with around 1.7-fold.
  • an increase in osteoclast genesis can be achieved by adding the known TLR7 / 8 ligand R848 (Invivogen, San Diego, USA).
  • the effect of R848, however, is strongly dependent on the concentration. While a significant increase in the number of osteoclasts can be observed at 10 ng / ml, a reduction in the number of osteoclasts occurs at 1000 ng / ml. 100 ng / ml R848 when added to monocytes lead to an increase in the number of osteoclasts, but when added to M2-like macrophages, to a decrease ( Figures 10E and 10F). The effect could be neutralized by adding the TLR7 / 8 inhibitor ODN 2087. As with miR-574-5p ( Figure 8C), no significant increase in osteoclast genesis was observed when the TLR7 / 8 agonist R848 was added to pre-osteoclasts.
  • CD14 + monocytes were obtained with sEVs from the synovial fluid of ACPA-positive patients with rheumatoid arthritis (4 pg / ml), with miR-574-5p oe sEVs (1 pg / ml) or with ScrC sEVs (1 pg / ml), respectively 4 hours stimulated.
  • the total RNA was then isolated and the mRNA levels of IL-23, IL-8, INF ⁇ , IL-1 ⁇ and TNF ⁇ were analyzed with RT-qPCR.
  • These cytokines are for it known to influence osteoclast differentiation (Amarasekara DS, Yun H., Kim S., Lee N. and Rho J. (2018).
  • a miR-574-5p PNA AntagomiR was covalently bound to a cell-penetrating peptide (CPP) via a PEG linker (see scheme in Figure 12).
  • the miR-574-5p PNA AntagomiR is a single-stranded RNA analogue that is complementary to miR-574-5p, namely a so-called “peptide nucleic acid” (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the AntagomiR is completely complementary to miR-574-5p, but does not cover the entire sequence of miR-574-5p.
  • the AntagomiR sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the AntagomiR sequence was linked C-terminally to a modified Ly sin.
  • the modification consisted in the fact that instead of the carboxyl group (-COOH) an amide group (-CONH2) was present.
  • the modified lysine is used for anchoring to the resin framework during the synthesis (see next paragraph). As a spacer to the resin, the modified lysine improves the efficiency of the first critical coupling. In addition, the modified lysine increases the solubility of the CPP-PNA construct.
  • Standard solid phase synthesis methods were used.
  • the entire CPP-PNA construct was built on a resin framework, as all the synthetic building blocks used are compatible with one another. The synthesis took place from the C-terminal to the N-terminal direction.
  • the most C-terminal synthetic building block (here modified lysine) was first immobilized on a resin framework.
  • the next N-terminal synthesis building block was then with the one on the resin immobilized synthesis building block brought to reaction. This reaction cycle was repeated for each building block so that the macromolecule on the resin grows building block by building block.
  • the finished CPP-PNA construct would be detached from the resin scaffold.
  • the CPP-PNA construct used can be represented as follows (from N-terminus to C-terminus): GRKKRWFRRRRMKWKK- (eg1) -ctcacacacacacactca (K-CONH2).
  • the first part is the CPP (SEQ ID NO: 29).
  • the expression (eg-1) describes the PEG linker, which in the present case exactly comprises an ethylene glycol unit. This is followed by the PNA AntagomiR of SEQ ID NO: 28.
  • the construct contains a modified lysine with an amide group (-CONH2) instead of a carboxyl group (-COOH).
  • the modified lysine is described by the expression (K-CONH2).
  • the cytotoxicity was tested with an MTT assay in which the eponymous dye MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is used.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • a negative control a PNA with a sequence not complementary to miR-574-5p was tested (SEQ ID NO: 30), which was also bound to CPP by means of the PEG linker.
  • the used CPP-PNA construct of the negative control can be represented as follows (from N-terminus to C-terminus): GRKKRWFRRRRMKWKK- (eg1) -gctattaccttaacccag (K-NH2).
  • the negative control differs from the construct according to the invention described above only with regard to the PNA sequence.
  • the influence of the CPP-coupled miR-574-5p PNA AntagomiR on osteoclast genesis was tested.
  • the scheme of induction of osteoclast genesis is shown in Figure 2. This scheme was adapted so that on day 1 the CPP-coupled miR-574-5p PNA AntagomiR (CPP-PNA) was added in concentrations of 10 mM or 20 pM. The negative control was carried out without the addition of CPP-PNA (0 pm CPP-PNA). The results are shown in FIG.
  • the CPP-coupled miR-574-5p PNA Anta gomiR leads to a concentration-dependent reduction in osteoclast genesis. Freshly isolated human monocytes were also used for this experiment.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen TLR7/8-Inhibitor zur Reduktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den Inhibitor. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prognose der Schwere des Krankheitsverlaufs der rheumatoiden Arthritis eines Patienten.

Description

Reduktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen TLR7/8-lnhibitorzur Reduktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen sowie eine pharmazeutische Zusammen setzung umfassend den Inhibitor. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prognose der Schwere des Krankheitsverlaufs der rheumatoiden Arthritis eines Patienten.
Knochenresorption wird durch Osteoklasten vermittelt und spielt eine wichtige Rolle bei ver schiedenen Erkrankungen. Insbesondere im Zusammenhang mit Gelenkerkrankungen ist ein negativer Einfluss der Knochenresorption beschrieben worden. Dies betrifft akute Gelenker krankungen wie die Arthritis, aber insbesondere auch chronische Gelenkerkrankungen wie die rheumatoide Arthritis (RA) und die Arthrose. Auch bei anderen Erkrankungen wie beispiels weise der Parodontitis oder bei schlecht oder nicht anwachsenden Implantaten spielt übermä ßige Knochenresorption eine wichtige Rolle.
Chronische Gelenkerkrankungen (Arthropathien) sind die häufigsten chronischen Erkrankungen älterer Individuen in Deutschland. Die Pathologie von Arthropathien ist komplex und multifaktori ell, aber die Pathogenese beinhaltet generell eine Entzündung der Gelenke, die von Knochen resorption begleitet wird und zu chronischen Schmerzen und physischen Beeinträchtigungen führt. Zwei der häufigsten Arten von Arthropathien sind die rheumatoide Arthritis und die Arth rose.
Rheumatoide Arthritis ist durch Infiltration von Immunzellen in die Synovialflüssigkeit gekenn zeichnet, wodurch es zu lokaler Entzündung und Knochenresorption kommt. Arthrose wird durch tägliche Abnutzung der Gelenke oder durch traumatische Schäden hervorgerufen. Ältere Menschen sind daher am häufigsten betroffen. Die Hälfte aller Frauen und ein Drittel aller Män ner entwickeln nach dem 60. Lebensjahr eine Arthrose. Zurzeit gibt es für keine der genannten Erkrankungen eine kurative Behandlung. Heutige Therapien zielen allein auf Schmerzlinderung und eine Beibehaltung der Mobilität der Patienten.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde Stoffe zur kurativen Behandlung von Erkrankungen bereitzustellen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einhergehen. Solche Erkrankungen sind insbesondere akute oder chronische Gelenkerkrankungen sowie Pa rodontitis und Störungen des Anwachsens von Implantaten. Solche Erkrankungen sind insbe sondere auch Knochenmetastasierung und Psoriasisarthritis. Der vorliegenden Erfindung liegt insbesondere die Aufgabe zugrunde, die mit den Erkrankungen einhergehende Knochenresorp tion zu reduzieren.
Die Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Die Aufgabe wird insbesondere gelöst durch einen TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung zur Re duktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die mit einer übermäßigen Knochenresorp tion einhergehen, insbesondere bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe beste hend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Parodontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten. Die Aufgabe wird auch gelöst durch einen TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankun gen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einhergehen, insbesondere bei Erkrankun gen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Knochenmetastasierung und Pso riasisarthritis.
TLRs (toll-like receptors) bilden eine Familie von Rezeptoren, die zur Gruppe der Typ I Transmembran-Glycoproteine gehören. Bislang wurden 13 TLRs identifiziert, von denen die TLRs 1 bis 10 im Menschen exprimiert werden. Von besonderem Interesse sind TLR7 und TLR8, die aufgrund ihrer Gemeinsamkeiten generell gemeinsam als TLR7/8 adressiert werden. TLR7/8 sind endosomale Rezeptoren, insbesondere für einzelsträngige RNA (ssRNA (englisch: single stranded RNA)).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass TLR7/8 entscheidend zur Osteoklastendiffe renzierung und somit zur Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankun gen, beiträgt, so dass eine Inhibition von TLR7/8 zur Reduktion der Knochenresorption verwen det werden kann. Insbesondere kann TLR7/8 erfindungsgemäß direkt durch entsprechende di rekte Inhibitoren wie beispielsweise ODN 2087 oder indirekt, beispielsweise durch Inhibition von miR-574-5p, inhibiert werden. miR-574-5p gehört zur Klasse der sogenannten microRNAs (miRs), einer Klasse kleiner, nicht- kodierender RNAs mit Funktion in der Genregulation. Extrazelluläre miRs werden in sogenann ten kleinen extrazellulären Vesikeln (sEVs, für englisch: „small extracellular vesides“) in hu mane Körperflüssigkeiten wie die Synovialflüssigkeit sezerniert, so dass sie vor dem Abbau durch Ribonukleasen geschützt sind (Cheng L, Sharples R. A., Scicluna B. J. and Hill A. F. (2014). "Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood." J Extracell Vesicles 3).
Funktionell lassen sich zwei grundlegend verschiedene Hauptwirkungsweisen von miRs unter scheiden. Zum einen binden miRs in einer sequenzabhängigen Weise an ihre Ziel-mRNA und sorgen für deren translationale Repression oder Degradation (Ambros V. (2004). "The functions of animal microRNAs." Nature 431: 350-355; Lytle J. R., Yario T. A. and Steitz J. A. (2007). "Target mRNAs are repressed as efficiently by microRNA-binding sites in the 5' UTR as in the 3' UTR." Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 9667-9672). Zum anderen kön nen miRs aber auch die Genexpression aktivieren, indem sie an RNA-Bindungs-Proteine binden und deren Funktionen inhibieren (Eiring A. M., Harb J. G., Neviani P., Garton C., Oaks J. J., Spizzo R., Liu S., Schwind S., Santhanam R., Hickey C. J., Becker H., Chandler J. C.,
Andino R., Cortes J., Hokland P., Huettner C. S., Bhatia R., Roy D. C., Liebhaber S. A., Caligiuri M. A., Marcucci G., Garzon R., Croce C. M., Calin G. A. and Perrotti D. (2010). "miR-328 functions as an RNA decoy to modulate hnRNP E2 regulation of mRNA translation in leukemic blasts." Cell 140(5): 652-665; Saul M. J., Baumann I., Bruno A., Emmerich A. C., Wellstein J., Ottinger S. M., Contursi A., Dovizio M., Donnini S., Tacconelli S., Raouf J., Idborg H., Stein S., Korotkova M., Savai R., Terzuoli E., Sala G., Seeger W., Jakobsson P. J., Patrignani P., Suess B. and Steinhilber D. (2019). "miR-574-5p as RNA decoy for CUGBP1 stimulates human lung tumor growth by mPGES-1 induction." Fasebj: fj201802547R.). Kürzlich wurde die Aktivierung von TLR7/8 („Toll-like receptor 7/8“) als alternative Wirkungsweise der beiden miRs miR-29b und miR-21 im Zusammenhang mit Lungenkrebs beschrieben (Fabbri M., Paone A., Calore F., Galli R., Gaudio E., Santhanam R., Lovat F., Fadda P., Mao C., Nuovo G. J., Zanesi N., Crawford M., Ozer G. H., Wernicke D., Alder H., Caligiuri M. A., Nana-Sinkam P., Perrotti D. and Croce C. M. (2012). "MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response." Proc Natl Acad Sei U S A 109: E2110-2116; Salvi V., Sozzani S., Bosisio D., Salvi V., Gianello V., Busatto S., Bergese P., Andreoli L., Oro U. D., Zingoni A., Tincani A., Sozzani S. and Bosisio D. (2018). "Exosome-delivered microRNAs promote IFN- a secretion by human plasmacytoid DCs via TLR7." JCI Insight 3). Auch miR-574-5p wurde be reits als TLR7/8-Ligand identifiziert (WO 2017/079983 A1).
Eine Rolle von miRs bei der Knochenresorption bei chronischen Gelenkerkrankungen war je doch bislang nicht bekannt. Insbesondere war auch nicht bekannt, dass EV-vermittelte miRs ähnlich wie ein Hormon wirken können.
Vorliegend wurde gefunden, dass miR-574-5p eine entscheidende Rolle im Zusammenhang mit Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen, spielt. miR-574-5p aus sEVs aus der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis führt über eine Akti vierung von TLR7/8 zu einer gesteigerten Osteoklastendifferenzierung, wie im Beispielteil im Detail erläutert. Dies ist insbesondere auch deshalb überraschend, da bislang von einer Inhibi- tion der Osteoklastendifferenzierung durch TLR7/8-Agonisten ausgegangen worden war (Miya- moto A. et al (2012) R848, a toll-like receptor 7 agonist, inhibits osteoclast differentiation but not survival or bone-resorbing function of mature osteoclasts).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit einen TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einher gehen, insbesondere bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Parodontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten. Bevorzugt sind TLR7/8-lnhibitoren zur Verwen dung zur Reduktion der Knochenresorption bei chronischen Gelenkerkrankungen. Die Erfin dung betrifft auch einen TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einhergehen, insbesondere bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Knochenmetastasierung und Psoriasisarthritis.
Die TLR7/8-lnhibitoren der vorliegenden Erfindung reduzieren die Knochenresorption, insbe sondere mittels einer Inhibition der Osteoklastengenese bzw. der Osteoklastendifferenzierung, bevorzugt bei Erkrankungen aus der Gruppe bestehend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Parodontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten. Bevorzugte akute Gelenkerkrankung ist die Arthritis. Die TLR7/8-lnhibitoren der vorliegenden Erfindung reduzieren die Knochenresorption, insbesondere mittels einer Inhibition der Osteoklastengenese bzw. der Osteoklastendifferenzierung, bevorzugt auch bei Erkrankun gen aus der Gruppe bestehend aus Knochenmetastasierung und Psoriasisarthritis.
Die chronische Gelenkerkrankung ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis und Arthrose. Besonders bevorzugt ist die chronische Erkrankung rheu matoide Arthritis.
Als TLR7/8-lnhibitor werden erfindungsgemäß Inhibitoren von TLR7 und/oder TLR8 bezeichnet. Ein TLR7/8-lnhibitor kann also beispielsweise ein Inhibitor von TLR7 aber kein Inhibitor von TLR8 sein. Umgekehrt kann ein TLR7/8-lnhibitor ein Inhibitor von TLR8 aber kein Inhibitor von TLR7 sein. Bevorzugt ist ein TLR7/8-lnhibitor sowohl ein Inhibitor von TLR7 als auch ein Inhi bitor von TLR8.
TLR7/8 kann auf vielfältige Art und Weise inhibiert werden. Bevorzugt ist der TLR7/8-lnhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus niedermolekularen Verbindungen (englisch: small molecules) und Oligonukleotiden. Bevorzugte niedermolekulare Verbindungen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxychloroquin, Hydroxychloroquinsulfat, Chloroquin, Quinacrin (=Mepacrin), CpG-52634 (Pfizer (Lipford et al. , 2007)), SM934 (Shanghai Institute of Materia Medica (Hou et al. , 2011;
Wu et al., 2016)), ST2825 (Loiarro et al., 2007; Capolunghi et al., 2010) und Kombinationen da von. Hydroxychloroquin, Hydroxychloroquinsulfat, Chloroquin und Quinacrin sind Anti-Malaria- Medikamente, die inhibitorisch auf TLR7/8 wirken. CpG-52634 ist ein Quinacrin-Derivat. SM934 ist ein Analogon des Anti-Malaria-Medikaments Artemisinin. ST2825 ist eine peptidomimetische Komponente, die die MyD88-Dimerisierung von TLRs inhibiert.
Bevorzugte Oligonukleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IRS-661 (SEQ ID NO:21; Dynayax Technologies), IRS-954 (SEQ ID NO:22; Dynayax Technologies (Barrat et al., 2005, 2007; Guiducci et al., 2010)), DV-1179 (Dynayax Technologies (Zhu et al. , 2011; Suarez- Farinas et al., 2013)), IMO-3100 (Idera (Zhu et al., 2011; Suarez-Farinas et al., 2013)), IMO- 8400 (Idera (Jiang et al., 2012; Zhu et al., 2012), IMO-9200 (Idera/Vivelix), IHN-ODN-24888 (SEQ ID NO:23; Coley Pharmaceutical GmbH (Rommler at al., 2013, 2015)), ODN 2087 (SEQ ID NO:24; ODN 2088 Control (ODN2087), MiltenyiBiotec, Bergisch-Gladbach, GER) und Kom binationen davon. TLR7/8 erkennen in erster Linie Nukleinsäurestrukturen von dsRNA, ssRNA und CpG-DNA. Daher können Oligonukleotide, insbesondere die oben genannten Oligonukleo tide, an TLR7/8 binden und als Inhibitoren von TLR7/8 wirken, indem sie die Bindung von TLR7/8 an aktivierende Liganden behindern und dadurch die Aktivierung von TLR7/8 inhibieren.
Andere bevorzugte Oligonukleotide mit inhibitorischer Wirkung auf TLR7/8 wirken als indirekte Inhibitoren ohne direkte physische Interaktion mit TLR7/8, wie unten beschrieben. Solche indi rekten Inhibitoren sind bevorzugt insbesondere eine einzelsträngige, zu miR-574-5p komple mentäre RNA oder ein einzelsträngiges, zu miR-574-5p komplementäres RNA-Analogon (Anta- gomiR), insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LNA (englisch: „locked nu- cleic acid“), BNA (englisch: „bridged nucleic acid“), PMO (englisch: „phosphorodiamidate Mor- pholino oligomer“) und PNA (englisch: „peptide nucleic acid“). LNA ist besonders bevorzugt. PNA ist besonders bevorzugt. Besonders bevorzugt ist der Inhibitor ein miR-574-5p PNA Anta- gomiR.
Ein TLR7/8-lnhibitor im Sinne der vorliegenden Erfindung kann ein direkter oder ein indirekter Inhibitor sein.
Ein direkter TLR7/8-lnhibitor ist erfindungsgemäß eine Komponente, die in direkte physische Wechselwirkung mit TLR7/8 tritt und dadurch zu einer Inhibition von TLR7/8 führt. Solche direk ten TLR7/8-lnhibitoren sind dem Fachmann bekannt und entsprechend ohne Probleme erhält lich. Solche direkten TLR7/8-lnhibitoren sind beispielsweise beschrieben in Gao W., Xiong, Y., Li Q., Yang H. (2017). "Inhibition of Toll-Like Receptor Signaling as a Promising Therapy for Inflammatory Diseases: A Journey from Molecular to Nano Therapeutics." Frontiers in Physiology, Volume 8, Article 508. Unbekannt war jedoch bislang deren Verwendung zur Re duktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen. Bevorzugt ist ein direkter TLR7/8-lnhibitor der vorliegenden Erfindung zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, bevor zugt bestehend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Paro dontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten wobei der Inhibitor ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxychloroquin, Hydroxychloroquinsulfat, Chloro- quin, Quinacrin (=Mepacrin), CpG-52634, SM934, ST2825, IRS-661, IRS-954, DV-1179, IMO- 3100, IMO-8400, IMO-9200, IHN-ODN-24888, ODN 2087 (ODN 2088 Control (ODN2087)) und Kombinationen davon. Die Erfindung betrifft auch einen direkten TLR7/8-lnhibitor der vorliegen den Erfindung zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus Knochenmetastasierung und Psoriasisarthritis.
Ein indirekter TLR7/8-lnhibitor der vorliegenden Erfindung ist eine Komponente, die zu einer In hibition von TLR7/8 führt, indem ein oder mehrere TLR7/8-Agonisten inhibiert und/oder ein oder mehrere TLR7/8-Antagonsiten aktiviert werden. Eine Inhibition von TLR7/8-Agonisten und/oder eine Aktivierung von TLR7/8-Antagonisten können durch direkte physische Interaktion mit den entsprechenden TLR7/8-Agonisten und/oder TLR7/8-Antagonisten erfolgen. Es ist erfindungs gemäß jedoch auch möglich, dass eine Inhibition von TLR7/8-Agonisten und/oder eine Aktivie rung von TLR7/8-Antagonisten durch Einwirkung auf entsprechende regulatorische Elemente wie beispielsweise Promoter und/oder Enhancer erfolgt.
Besonders bevorzugt sind indirekte TLR7/8-lnhibitoren, die einen oder mehrere TLR7/8-Agonis- ten inhibieren. Zu inhibierende TLR7/8-Agonisten sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-574-5p, miR-21/29a, let-7 und Kombinationen davon. Ganz besonders be vorzugte indirekte TLR7/8-lnhibitoren sind miR-574-5p-lnhibitoren.
Verschiedene Möglichkeiten zur Inhibition von miRs sind dem Fachmann bekannt und werden beispielsweise in US 2017/0044541 A1 oder US 2009/0286852 A1 beschrieben. Dem Fach mann sind außerdem verschiedene antisense-Verfahren (beispielsweise siRNA) bekannt. Einen geeigneten Inhibitor gegen eine gegebene miR bereitzustellen, ist somit ohne weiteres möglich.
Bevorzugt ist der Inhibitor eine einzelsträngige, zu miR-574-5p vollständig komplementäre RNA oder ein einzelsträngiges, zu miR-574-5p vollständig komplementäres RNA-Analogon (Anta- gomiR), insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LNA (englisch: „locked nu- cleic acid“), BNA (englisch: „bridged nucleic acid“), PMO (englisch: „phosphorodiamidate Mor- pholino oligomer“) und PNA (englisch: „peptide nucleic acid“). LNA ist besonders bevorzugt.
PNA ist besonders bevorzugt. Die bevorzugte Sequenz eines solchen Inhibitors ist in SEQ ID NO:25 gezeigt. Die entsprechende PNA-Sequenz ist in SEQ ID NO:27 gezeigt. Besonders be vorzugt ist der Inhibitor ein miR-574-5p PNA AntagomiR.
Der Inhibitor kann auch eine einzelsträngige, zu miR-574-5p komplementäre RNA oder ein ein- zelsträngiges, zu miR-574-5p komplementäres RNA-Analogon (AntagomiR) sein, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LNA (englisch: „locked nucleic acid“), BNA (eng lisch: „bridged nucleic acid“), PMO (englisch: „phosphorodiamidate Morpholino oligomer“) und PNA (englisch: „peptide nucleic acid“), wobei die RNA oder das RNA-Analogon zwar vollständig komplementär zu miR-574-5p ist, allerdings nicht die gesamte Sequenz der miR-574-5p ab deckt. LNA ist besonders bevorzugt. PNA ist besonders bevorzugt. Die Sequenz eines beson ders bevorzugten Inhibitors ist als RNA-Sequenz in SEQ ID NO:26 und als PNA-Sequenz in SEQ ID NO:28 gezeigt. Im Vergleich zu den die gesamte Sequenz der miR-574-5p abdecken den Sequenzen der SEQ ID NOs: 25 und 27 sind die Sequenzen der SEQ ID NOs: 26 und 28 um fünf Reste kürzer.
Andere miR-574-5p-lnhibitoren sind ebenfalls erfindungsgemäß. Beispielsweise umfasst die Er findung auch sogenannte „miRNA sponge“ und „miRNA decoy“. Dabei handelt es sich um Nuk leinsäure-Moleküle, die Tandem-Bindestellen für miR-574-5p enthalten. Dadurch wirken sie als kompetitive Inhibitoren von miR-574-5p (Ebert und Sharp, 2010 sowie US 2017/0044541 A1). Bevorzugt ist der miR-574-5p-lnhibitor ausgewählt aus der Gruppe umfassend, bevorzugt be stehend aus AntagomiR, miRNA sponge und miRNA decoy. AntagomiR ist besonders bevor zugt. Erfindungsgemäß sind auch miR-574-5p-lnihibitoren, die nicht direkt mit miR-574-5p inter agieren, sondern stattdessen auf regulatorische Elemente von miR-574-5p einwirken, beispiels weise auf dessen Promoter und/oder Enhancer.
Bevorzugt ist der TLR7/8-lnhibitor ausgewählt aus der Gruppe umfassend, bevorzugt beste hend aus miR-574-5p-AntagomiR, miR574-5p-sponge, miR574-5p-decoy, Hydroxychloroquin, Hydroxychloroquinsulfat, Chloroquin, Quinacrin (=Mepacrin), CpG-52634, SM934, ST2825, IRS-661, IRS-954, DV-1179, IMO-3100, IMO-8400, IMO-9200, IHN-ODN-24888 und ODN 2087 (ODN 2088 Control (ODN2087).
Erfindungsgemäß kann bevorzugt das Ausmaß der Osteoklastendifferenzierung als Maß für das Ausmaß der Knochenresorption verwendet werden. Geeignete Verfahren zur Ermittlung der Wirkung einer Substanz auf die Osteoklastendifferenzierung sind dem Fachmann bestens be kannt. Besonders geeignete Verfahren werden auch im vorliegenden Beispielteil ausführlich be schrieben und sind ebenfalls aus der Literatur bekannt. Zusammenfassend ist es vorteilhaft, wenn die Osteoklastendifferenzierung in CD14+ Monozyten oder M2-artigen Makrophagen mit Hilfe eines TLR7/8-Agonisten (bevorzugt miR-574-5p) in Anwesenheit beziehungsweise Abwe senheit der jeweils zu testenden, potentiell inhibitorischen Substanz induziert wird, wobei die gewünschte inhibitorische Wrkung dann festzustellen ist, wenn in Anwesenheit der zu testen den Substanz eine im Vergleich zur Abwesenheit der Substanz signifikant geringere Osteoklas tendifferenzierung zu beobachten ist. Andere Testverfahren sind ebenfalls möglich. Beispiels weise können das Ausmaß der Osteoklastendifferenzierung und/oder das Ausmaß der Kno chenresorption alternativ oder zusätzlich in einem Tiermodell, insbesondere einem Arthritis- Mausmodell wie CIA (collagen-induced arthritis) untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen erfindungsgemäßen TLR7/8-lnhibitor, insbesondere einen indirekten TLR7/8-lnihibitor, besonders bevorzugt einen miR-574-5p-lnhibitor.
Bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung Trägerstoffe, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus zellpenetrierenden Peptiden (englisch: „cell penetrating pepti- des (CPPs)“), Nanocarriern (NCs) und/oder Cholesterol, oder aus der Gruppe bestehend aus Nanocarriern (NCs) und/oder Cholesterol. Bevorzugt sind die Trägerstoffe NCs. Bevorzugte NCs sind Nanopartikel (NPs). Besonders bevorzugt sind die Trägerstoffe Nanopartikel, insbe sondere Eisenoxid-Nanopartikel, Gold-Nanopartikel und/oder Silber-Nanopartikel. Eisenoxid- Nanopartikel, insbesondere Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIONs, englisch: superparamagnetic iron oxide nanoparticles), sind besonders bevorzugt.
Eisenoxid-Nanopartikel sind biologisch abbaubar, so dass es nicht zu einer übermäßigen unge wünschten Anreicherung der Partikel im Körper kommt. Ein weiterer Vorteil von Eisenoxid-Na- nopartikeln ist, dass diese durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes auch bei systemischer Gabe (beispielsweise intravenös) in der gewünschten Körperregion, insbesondere in einem be troffenen Gelenk angereichert werden können.
Die Nanopartikel der Erfindung haben bevorzugt einen Durchmesser in einem Bereich von 5 nm bis 100 nm, weiter bevorzugt 7,5 nm bis 75 nm, weiter bevorzugt von 10 nm bis 50 nm, bei spielsweise 15 nm bis 40 nm oder 20 nm bis 30 nm, insbesondere etwa 25 nm. Der geringe Durchmesser der Nanopartikel ist besonders vorteilhaft für deren Membrangängigkeit. Der Durchmesser der Nanopartikel kann beispielsweise mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) oder mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) bestimmt werden, wobei der Durchmesser im Falle einer REM-Bestimmung bevorzugt der Martin-Durchmesser ist.
Ganz besonders bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung Trägerstoffe, wobei die Trägerstoffe zellpenetrierende Peptide (englisch: „cell penetrating peptides (CPPs)“) sind. CPPs sind polykationische Peptide, die eine Vielzahl an Vorteilen mit sich bringen. Optionale CPPS sind Penetratin, TAT (transactivator of transcription), MAP (model amphiphatic peptide), Polyarginine (z.B. R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 oder R12), pVEC, Transportan, MPG, und Kombinationen davon. Ein besonders bevorzugtes CPP ist (N-Terminus)- GRK- KRWFRRRRMKWKK-(C-Terminus) (SEQ ID NO:29). CPPs ermöglichen ein einfaches Up- scaling, insbesondere unter Verwendung von Festphasensynthese-Verfahren. CPPs gehen mit Membranpermeabilität und nucleolarer Akkumulation einher.
Bevorzugt liegt der Inhibitor in an die Trägerstoffe konjugierter Form vor. Besonders bevorzugt liegt der Inhibitor kovalent an den Trägerstoff gebunden vor. Besonders bevorzugt ist der Inhi bitor ein miR-574-5p PNA AntagomiR. Besonders bevorzugt ist ein kovalent an CPP gebunde nes miR-574-5p PNA AntagomiR, insbesondere ein mittels PEG-Linker an CPP gebundenes miR-574-5p PNA AntagomiR. Die kovalent an CPP gebundenen Verbindungen sind bioorthogo nal. Sie ermöglichen eine stärkere Hybridisierung und eine erhöhte Halbwertszeit. Der PEG-Lin ker kann eine oder mehrere Ethylenglykoleinheiten aufweisen. In einer Ausführungsform enthält der PEG-Linker eine Ethylenglykoleinheit, zwei oder mehr Ethylenglykoleinheiten oder drei oder mehr Ethylenglykoleinheiten. Durch geeignete Wahl der Linkerlänge kann die Löslichkeit einge stellt werden.
Der TLR7/8-lnhibitor, insbesondere ein miR-574-5p-AntagomiR, kann an Lysin oder ein modifi ziertes Lysin gebunden sein. Dies gilt insbesondere für PNA-AntagomiR. Besonders bevorzugt ist das C-terminale Ende eines PNA-AntagomiR an modifiziertes Lysin gebunden, wobei die Modifikation des Lysins bevorzugt darin besteht, dass anstelle der Carboxylgruppe (-COOH) eine Amidgruppe (-CONH2) vorhanden ist. Dies ist vorteilhaft für die Synthese der PNA mittels Festphasensynthese. Außerdem wird die Löslichkeit der PNA erhöht.
Besonders bevorzugt liegt der Inhibitor dicht gepackt auf dem Trägerstoff vor. Dadurch ergibt sich eine besonders gute Membrangängigkeit. Außerdem wird die Stabilität erhöht. Bevorzugt beträgt die Oberflächendichte des TLR7/8-lnhibitors auf dem Trägerstoff, insbesondere eines miR-574-5p-lnhibitors (bevorzugt AntagomiR) auf den Nanopartikeln, mindestens 1010 Moleküle pro cm2, weiter bevorzugt mindestens 1011 Moleküle pro cm2, weiter bevorzugt mindestens 1012 Moleküle pro cm2. Bevorzugt beträgt die Oberflächendichte jedoch höchstens 1014 Moleküle pro cm2, weiter bevorzugt höchstens 5*1013 Moleküle pro cm2, weiter bevorzugt höchstens 2*1013 Moleküle pro cm2. Die Oberflächendichte kann beispielsweise in einem Bereich von 5 bis 150, insbesondere 10 bis 70 AntagomiR-Oligonukleotiden pro 10 nm Partikel liegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen TLR7/8-lnhibitors, insbesondere eines indi rekten TLR7/8-lnihibitors, besonders bevorzugt eines miR-574-5p-lnhibitors, b) Koppeln des TLR7/8-lnhibitors an einen Trägerstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zellpenetrierenden Peptiden (englisch: „cell penetrating pep- tides (CPPs)“) Nanocarriern (NCs) und/oder Cholesterol, oder aus der Gruppe be stehend aus Nanocarriern (NCs) und/oder Cholesterol, insbesondere an NPs, be sonders bevorzugt an NPs, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ei- senoxid-Nanopartikeln, Gold-Nanopartikeln und/oder Silber-Nanopartikeln, ganz be sonders bevorzugt an Eisenoxid-Nanopartikel, oder an zellpenetrierende Peptide (englisch: „cell penetrating peptides (CPPs)“).
Bevorzugt erfolgt die Kopplung gemäß Schritt b) über Click-Chemie, beispielsweise wie be schrieben in Cutler J. I., Zheng D., Xu X., Giljohann D. A., Mirkin C. A. (2010). "Polyvalent Oligonucleotide Iran Oxide Nanoparticle “Click” Conjugates." Nano Leiters 10: 1477-1480. Be sonders bevorzugt werden Trägerstoffe, insbesondere Nanopartikel, die in aminierter Form vor liegen, mit Azidobutyrat oder Azidoacetat umgesetzt, so dass sich eine freie Azidgruppe ergibt. Die Azidgruppe wird dann bevorzugt dazu genutzt, den Inhibitor an den Trägerstoff zu binden. Beispielsweise kann die Azidgruppe mit modifizierten Nukleotiden eine Bindung eingehen, be vorzugt mit einer 1:1 Stöchiometrie. Wie oben beschrieben sind die erfindungsgemäßen miR- 574-5p-lnhibitoren bevorzugt RNA oder RNA-Analoga, so dass sich diese Inhibitoren besonders gut über entsprechend modifizierte Nukleotide, insbesondere am 5‘-Ende oder am 3‘-Ende (be vorzugt am 5‘-Ende), an entsprechend modifizierte Trägerstoffe, insbesondere Nanopartikel, besonders bevorzugt Eisenoxid-Nanopartikel koppeln lassen. Eine besonders bevorzugte Nuk leotidmodifikation ist in diesem Zusammenhang eine terminale Alkingruppe, insbesondere am 5‘-Ende des Nukleotids.
Die Kopplung gemäß Schritt b) an CPPs erfolgt bevorzugt mittels eines PEG-Linkers. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich CPP und TLR7/8-lnhibitor getrennt zu synthetisie ren und anschließend zu koppeln. Bevorzugt ist es jedoch, das gesamte Konstrukt kontinuier lich Monomer für Monomer aufzubauen. Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, in de nen der Inhibitor ein miR-574-5p PNA AntagomiR ist. In solchen Ausführungsformen wird das CPP-PNA-Konstrukt bevorzugt beginnend mit dem C-terminalsten PNA-Monomer (bzw. dem noch C-terminaleren modifizierten Lysin) und endend mit der N-terminalsten Aminosäure des CPP Teils aufgebaut.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prognose der Schwere des Krank heitsverlaufs der rheumatoiden Arthritis eines Patienten umfassend die folgenden Schritte: a) Bestimmung des Gehalts an miR-574-5p in sEVs (kleine extrazelluläre Vesikel, englisch: „small extracellular vesicles“) in einer Patientenprobe, b) Vergleich des in Schritt a) bestimmten Gehalts mit dem Gehalt an miR-574-5p in sEVs in Proben eines oder mehrerer Vergleichspatienten mit bekanntem Krank heitsverlauf, c) Prognose der Schwere des Krankheitsverlaufs basierend auf dem Vergleichsergeb nis.
Die Patientenprobe kann beispielsweise eine Probe der synovialen Flüssigkeit oder eine Blut probe, insbesondere eine Plasmaprobe, sein. Besonders bevorzugt ist die Patientenprobe eine Probe der synovialen Flüssigkeit.
Bevorzugt handelt es sich bei den sEVs um synoviale sEVs.
Bevorzugt wird der Gehalt an miR-574-5p mit RT-qPCR bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines TLR7/8-lnhibitors zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, be vorzugt bestehend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Pa rodontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten. Bevorzugt ist die Verwen dung zur Reduktion der Knochenresorption bei chronischen Gelenkerkrankungen. Die vorlie gende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines TLR7/8-lnhibitors zur Reduktion der Kno chenresorption bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus Knochenmetastasierung und Psoriasisarthritis.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einhergehen, insbesondere bei Erkrankungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chronischen Gelenkerkran kungen, akuten Gelenkerkrankungen und Parodontitis, und/oder bei Störungen des Anwach sens von Implantaten, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens eines erfindungsge- mäßen TLR7/8-lnhibitors umfasst. Die Erkrankung ist insbesondere eine chronische Gelenker krankung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis und Arth rose. Die Erkrankungen können auch Knochenmetastasierung oder Psoriasisarthritis sein oder beinhalten.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt schematisch die Isolation von sEVs mit differentieller Ultrazentrifugation.
Abbildung 2 zeigt schematisch die Induktion von Osteoklastengenese.
Abbildung 3 zeigt einen signifikanten konzentrationsabhängigen Anstieg der Osteoklasten bei Zugabe von sEVs zu Monozyten (Abbildung 3A) oder zu M2-artigen Makrophagen (Abbildung 3B). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (englisch: „Standard error of the mean“) angege ben. Unterschiede wurden als signifikant eingestuft für p < 0,05 (angegeben als * für p < 0,05, ** für p < 0,01 , *** für p < 0,001).
Abbildung 4 zeigt den mit Hilfe von RT-qPCR bestimmten Gehalt verschiedener miRs in den isolierten Vesikeln. Ein hoher Gehalt an miR-574-5p (SEQ ID NO:4) wurde sowohl in den sEVs aus dem Serum als auch in den sEVs aus der Synovialflüssigkeit festgestellt (Abbildung 4A und 4B). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM angegeben.
Abbildung 5 zeigt intrazelluläre Level und sEV-Level der angezeigten miRs mit und ohne 24- stündige Stimulation mit IL-1ß (10 ng/ml) und/oder TNFa (10 ng/ml).
Abbildung 6 zeigt intrazelluläre Level (Abbildung 6A) und Sezernierung (Abbildung 6B) von miR-574-5p während der Osteoklasten-Differenzierung.
Abbildung 7A zeigt den Gehalt an miR-574-5p in miR-574-5p oe sEVs und in einer Kontrolle (ScrC sEVs). Abbildung 7B zeigt Ergebnisse eines RNase-Protektionsexperiments, wonach der RNase-Abbau der miR-574-5p durch Zugabe eines Detergens signifikant erhöht werden kann.
Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse einer Behandlung mit 1 pg/ml miR-574-5p oe sEVs oder ScrC sEVs zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung. Die miR-574-5p oe sEVs führen zu ei nem signifikanten Anstieg der Osteoklasten-Anzahl bei Zugabe zu Monozyten oder M2-artigen Makrophagen (Abbildung 8A und 8B). Bei Zugabe zu Pre-Osteoklasten war hingegen kein sig nifikanter Anstieg der Osteoklasten-Anzahl zu beobachten (Abbildung 8C).
Abbildung 9 zeigt, dass weder miR-574-5p allein, noch miR-574-5p in Gegenwart synthetischer liposomaler Vehikel (Lipofectamine® 2000) zu einer Stimulation der Osteoklasten-Genese führt. Abbildung 10 zeigt eine direkte Interaktion von miR-574-5p mit TLR8 mittels MST (englisch: „micoscale thermophoresis“). Die Dissoziationskonstante KD betrug 30,8 ± 5,2 nM (Abbildung 10A und 10B). Eine spezifische Interaktion zwischen TLR8 und miR-16-5p besteht hingegen nicht (Abbildung 10A und 10B). Abbildungen 10C und 10D zeigen, dass Zugabe des TLR7/8- Inhibitors ODN 2087 den Effekt von miR-574-5p auf CD14+ Monozyten und M2-artige Makro phagen aufhebt. Abbildungen 10E und 10F zeigen den Einfluss des TLR7/8-Liganden R848 auf die Osteoklastengenese.
Abbildung 11 zeigt die relativen IL-23 und IFNa mRNA Level nach Stimulation von CD14+ Mo nozyten mit den angegebenen Stoffen in Gegenwart oder Abwesenheit des TLR7/8-lnhibitors ODN 2087.
Abbildung 12 zeigt schematisch den Aufbau eines an CPP (1) gekoppelten PNA-AntagomiR (3). Das PNA-AntagomiR (3) ist mittels eines PEG-Linkers (2) an das zellpenetrierende Peptid (1) gebunden.
Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse eines MTT-Assays zur Testung der Zytotoxizität, wobei auf der y-Achse die Lebensfähigkeit aufgetragen ist. Weder bei der Negativkontrolle (Abbildung 13A) noch bei miR-574-5p PNA AntagomiR (Abbildung 13B) ergab sich eine signifikante Toxizi tät.
Abbildung 14 zeigt, dass das CPP-gekoppelte miR-574-5p PNA AntagomiR zu einer konzentra tionsabhängigen Reduktion der Osteoklastengenese führt.
Beispiele
Isolation von sEVs aus der Synovialflüssigkeit und dem Serum von ACPA+ RA-Patienten
Aus der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis, die positiv für ACPAs (eng lisch: „anti-citrullinated protein antibodies“) waren, wurden sEVs (kleine extrazelluläre Vesikel, englisch: „small extracellular vesicles“, sEVs) isoliert. ACPAs sind mit einem schwereren Verlauf der Erkrankung assoziiert. Die Isolation der Vesikel erfolgte mit differentieller Ultrazentrifugation (Abbildung 1).
Mit Hilfe von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde gezeigt, dass die isolierte Population die typische vesikuläre Morphologie und sEVs-Größe von 30 nm bis 150 nm hatte. Durch Western Blot wurde zudem nachgewiesen, dass typische Marker von sEVs (CD63, CD9, Hsp70 und CD81) vorhanden waren. Die isolierten Vesikel sind demnach sEVs.
Auf dieselbe Art und Weise wurden auch sEVs aus dem Serum der Patienten isoliert.
Induktion von Osteoklastengenese durch die aus der Synovialflüssigkeit isolierten Vesikel
CD14+ Monozyten wurden aus PMBCs (englisch: „peripheral blood mononuclear cells“) gesun der Spender isoliert und mit M-CSF (englisch: „recombinant human macrophage colony-stimula- ting factor“), RANK-L (englisch: “receptor activator of NF-kB ligand”) und unterschiedlichen Kon zentrationen der isolierten sEVs stimuliert. Sowohl frisch isolierte Monozyten als auch differen zierte M2-artige Makrophagen wurden mit den aus der Synovialflüssigkeit isolierten sEVs stimu liert (Abbildung 2).
Nach 9 bis 12 Tagen wurden die Zellen fixiert und auf den Osteoklasten-Marker TRAP (eng lisch: „tartrate-resistant acid phosphatase“) getestet. Zellen, die sowohl positiv für TRAP waren als auch mindestens drei Kerne aufwiesen, wurden als Osteoklasten eingestuft und mit dem Lichtmikroskop gezählt.
Es wurde ein signifikanter konzentrationsabhängiger Anstieg der Osteoklasten von ungefähr 30% beobachtet, wenn sEVs zu Monozyten hinzugegeben wurden (Abbildung 3A). Ein ähnli cher Anstieg wurde erreicht, wenn die sEVs zu M2-artigen Makrophagen hinzugegeben wurden (Abbildung 3B). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM (englisch: „Standard error of the mean“) angegeben. Die statistische Analyse erfolgte mit einem ungepaarten zweiseitigen t-Test unter Verwendung der Software GraphPad Prism 6.0. Unterschiede wurden als signifikant ein gestuft für p < 0,05 (angegeben als * für p < 0,05, ** für p < 0,01 , *** für p < 0,001 und **** für p < 0,0001).
Die Ergebnisse zeigen, dass die isolierten sEVs die Osteoklasten-Differenzierung in einer kon zentrationsabhängigen Weise induzieren.
Hoher Gehalt an miR-574-5p in isolierten Vesikeln
Mit Hilfe von RT-qPCR wurde der Gehalt verschiedener miRs in den isolierten Vesikeln be stimmt. Ein hoher Gehalt an miR-574-5p (SEQ ID NO:4) wurde sowohl in den sEVs aus dem Serum als auch in den sEVs aus der Synovialflüssigkeit festgestellt (Abbildung 4A und 4B). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM angegeben. Der Gehalt an den anderen getesteten miRs (miR-16-5p, miR-155-5p und miR-146a-5p; SEQ ID NOs: 1-3) war demgegenüber deutlich ge ringer. Die Primer wurden jeweils von der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) bezogen (Kata lognummer MS00043617 für miR-574; MS0031493 für miR-16; MS00031486 für miR-155; und MS00003535 für miR-146a).
Als Kontrolle zur Normalisierung des extrazellulären Gehalts wurde nicht-humane cel-miR-39- 3p (SEQ ID NO:5) verwendet, die den Proben zu diesem Zweck in einer Endkonzentration von 200 nM zugesetzt wurde. Die Primer stammten ebenfalls von Qiagen (Katalognummer MS00019789).
Die Ergebnisse zeigen eine selektive Anreicherung von miR-574-5p in sEVs von Patienten mit rheumatoider Arthritis.
Synoviale Fibroblasten und Monozyten als zelluläre Quellen von extrazellulärem miR- 574-5p
Synoviale Fibroblasten (SFs) wurden von ACPA-negativen und ACPA-positiven Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen. Intrazelluläre Level und sEV-Level der oben genannten miRs wurden mit RT-qPCR mit und ohne 24-stündiger Stimulation mit IL-1ß (10 ng/ml) und/oder TNFa (10 ng/ml) bestimmt (Abbildungen 5A und 5B). Die sEVs wurden aus den Zellkulturüber- ständen isoliert. Zur Normalisierung des extrazellulären Gehalts wurde stets cel-miR-39-3p ein gesetzt. Zur Normalisierung des intrazellulären Gehalts diente stets snRNA U6 (SEQ ID NO:20) als endogene Kontrolle. Die Primer stammten ebenfalls von Qiagen (Katalognummer MS00033740). miR-146a-5p diente als Positivkontrolle, da dessen Induktion durch Stimulation mit I L-1 ß be kannt ist (Stanczyk J., Pedrioli D. M. L, Brentano F., Sanchez-pernaute O., Kolling C., Gay R. E., Detmar M., Gay S. and Kyburz D. (2008). "Altered Expression of MicroRNA in Synovial Fibroblasts and Synovial Tissue in Rheumatoid Arthritis." Arthritis Rheum 58: 1001-1009). Für die anderen miRs konnten keine signifikanten stimulationsbedingten Unterschiede beobachtet werden.
Auffällig ist die selektive Anreicherung von miR-574-5p in den sEVs. Während der intrazelluläre Gehalt an miR-574-5p in den SFs im Vergleich zum intrazellulären Gehalt an miR-16-5p deut lich geringer ist, finden sich in den isolierten sEVs vergleichbare Gehalte der beiden miRs (Ab bildungen 5A und 5B).
Interessanterweise konnten zudem Unterschiede zwischen SFs aus ACPA-negativen (ACPA) und ACPA-positiven (ACPA+) Patienten beobachtet werden. ACPAs sind mit einem schwereren Verlauf der Erkrankung assoziiert und sind insofern als Indikator für die Schwere des Krank heitsverlaufs geeignet. Wie in Abbildung 5D gezeigt, wurden in sEVs von SFs aus ACPA-positi- ven Patienten im Vergleich zu ACPA-negativen Patienten signifikant erhöhte Mengen miR-574- 5p festgestellt, so dass der Gehalt an extrazellulärem miR-574-5p mit der Schwere des Krank heitsverlaufs in Zusammenhang gebracht werden kann.
Neben SFs sezernieren auch M2-Makrophagen miR-574-5p in sEVs (Abbildung 6). Während der intrazelluläre Level während der Osteoklasten-Differenzierung im Wesentlichen unverändert bleibt (Abbildung 6A), findet eine maßgebliche Sezernierung nach 6, 9 oder 12 Tagen Differen zierung nicht mehr statt (Abbildung 6B). Pre-Osteoklasten und Osteoklasten tragen also nicht wesentlich zu miR-574-5p in sEVs bei.
Zusammenfassend tragen SFs und Monozyten, nicht jedoch Pre-Osteoklasten und Osteoklas ten zu miR-574-5p in sEVs bei. sEVs mit konstruiertem miR-574-5p Level
Mit Hilfe von XMIRXpress-Konstrukten (System Bioscience, Palo Alto, USA) in HEK 293 Zellen wurden sEVs mit verschiedenen Gehalten an miR-574-5p konstruiert. Der Gehalt an miR-574- 5p in den miR-574-5p oe sEVs war ungefähr 15-mal höher im Vergleich zur Kontrolle (ScrC sEVs), die mit Hilfe einer Kontroll-miR (XMIRXP-NT, System Biosciences, Palo Alto, USA) er halten wurde (Abbildung 7A). In einem RNase-Protektionsexperiment wurde gezeigt, dass der RNase-Abbau der miR-574-5p durch Zugabe eines Detergens signifikant erhöht werden kann (Abbildung 7B). miR-574-5p be findet sich also in den Vesikeln, die vor RNase-Abbau schützen, und wird erst bei Freisetzung durch das Detergens für den Abbau durch RNase zugänglich. Dieses Experiment zeigt, dass die miR-574-5p hauptsächlich in den sEVs ist und daher vor dem Abbau durch RNasen ge- schütz wird. Durch die Zugabe des Detergens ist ein Abbau der miR durch die „Zerstörung“ der sEVs erst ermöglicht.
Aufnahme der konstruierten sEVs durch Zellen miR-574-5p oe sEVs wurden mit dem fluoreszenten Farbstoff 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) angefärbt und deren Aufnahme in CD14+ Monozyten mit konfokaler Mikrosko pie untersucht. Aufnahme der gefärbten Vesikel in die Zellen wurde nach 20 Minuten beobach tet. Die maximale Anzahl gefärbter sEVs in den Zellen wurde nach 40 Minuten erreicht. Ähnli che Ergebnisse wurden für HeLa-Zellen erhalten.
Induktion der Osteoklastengenese durch sEVs mit hohem Gehalt an miR-574-5p
Isolierte humane CD14+ Monozyten wurden mit 1 pg/ml miR-574-5p oe sEVs oder ScrC sEVs zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung behandelt (Abbildung 8A, 8B, 8C).
Die miR-574-5p oe sEVs führen zu einem signifikanten Anstieg der Osteoklasten-Anzahl bei Zugabe zu Monozyten oder M2-artigen Makrophagen (Abbildung 8A und 8B). Bei Zugabe zu Pre-Osteoklasten war hingegen kein signifikanter Anstieg der Osteoklasten-Anzahl zu beobach ten (Abbildung 8C).
Auch die ScrC sEVs führen zu einem signifikanten Anstieg der Osteoklasten-Anzahl bei Zugabe zu Monozyten oder M2-artigen Makrophagen (Abbildung 8A und 8B). Dies dürfte auf die dort ebenfalls vorhandene miR-574-5p zurückzuführen sein, deren Gehalt jedoch im Vergleich zu den miR-574-5p oe sEVs um den Faktor 15 geringer ist (Abbildung 7A), so dass die Stimulation der Osteoklasten-Genese mit etwa 1,2-fach bei ScrC sEVs deutlich geringer ausfällt als bei miR-574-5p oe sEVs mit etwa 1,7-fach.
Der beobachtete Stimulationseffekt ist davon abhängig, dass miR-574-5p in sEVs vorhanden ist. Weder miR-574-5p allein, noch miR-574-5p in Gegenwart synthetischer liposomaler Vehikel (Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)) führt zu einer Stimulation der Osteoklasten-Genese (Abbildung 9). Induktion der Osteoklastengenese durch Interaktion von miR-574-5p mit TLR7/8 vermittelt
Eine direkte Interaktion von miR-574-5p mit TLR8 wurde im Rahmen der vorliegenden Erfin dung mittels MST (englisch: „micoscale thermophoresis“; Wienken C. J., Baaske P., Rothbauer U., Braun D. and Duhr S. (2010). "Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis." Nat Commun 1: 100) nachgewiesen. Die Dissoziationskonstante KD betrug 30,8 ± 5,2 nM (Abbildung 10A und 10B). Eine spezifische Interaktion zwischen TLR8 und miR- 16-5p besteht hingegen nicht (Abbildung 10A und 10B). Für die MST-Experimente wurden Cy5- markiertes miR-574-5p (SEQ ID NO:18) und Cy5-markiertes miR-16-5p (SEQ ID NO:19) einge setzt.
Zugabe des TLR7/8-lnhibitors ODN 2087 (ODN 2088 Control (ODN2087), MiltenyiBiotec, Ber- gisch-Gladbach, GER) hebt den oben beschriebenen Effekt von miR-574-5p auf CD14+ Mo nozyten und M2-artige Makrophagen auf, so dass miR-574-5p in Gegenwart von ODN 2087 nicht zu einer signifikante Erhöhung der Osteoklasten-Anzahl führen kann (Abbildung 10C und 10D).
Umgekehrt kann eine Steigerung der Osteoklastengenese durch Zugabe des bekannten TLR7/8-Liganden R848 (Invivogen, San Diego, USA) erreicht werden. Der Effekt von R848 ist allerdings stark konzentrationsabhängig. Während bei 10 ng/ml eine signifikante Erhöhung der Osteoklasten-Anzahl zu beobachten ist, stellt sich bei 1000 ng/ml eine Reduktion der Osteo klasten-Anzahl ein. 100 ng/ml R848 führen bei Zugabe zu Monozyten zu einer Erhöhung der Osteoklasten-Anzahl, bei Zugabe zu M2-artigen Makrophagen hingegen zu einer Verringerung derselben (Abbildung 10E und 10F). Der Effekt konnte durch Zugabe des TLR7/8-lnhibitors ODN 2087 aufgehoben werden. Wie bei miR-574-5p (Abbildung 8C) wurde keine signifikante Zunahme der Osteoklastengenese beobachtet, wenn der TLR7/8-Agonist R848 zu Pre-Osteo- klasten gegeben wurde.
Die in Abbildung 10 gezeigten Ergebnisse belegen, dass der Effekt von miR-574-5p oe sEVs auf die Erhöhung der Osteoklasten-Anzahl durch Interaktion mit TLR7/8 vermittelt wird. miR-574-5p induziert IFNa und IL-23 mRNA in CD14+ Monozyten durch TLR7/8-Aktivie- rung
CD14+ Monozyten wurden mit sEVs aus der Synovialflüssigkeit von ACPA-positiven Patienten mit rheumatoider Arthritis (4 pg/ml), mit miR-574-5p oe sEVs (1 pg/ml) oder mit ScrC sEVs (1 pg/ml) jeweils für 4 Stunden stimuliert. Dann wurde die Gesamt-RNA isoliert und die mRNA-Le- vel von IL-23, IL-8, INFa, IL-1ß und TNFa mit RT-qPCR analysiert. Diese Zytokine sind dafür bekannt, die Osteoklasten-Differenzierung zu beeinflussen (Amarasekara D. S., Yun H., Kim S., Lee N. and Rho J. (2018). "Regulation of Osteoclast Differentiation by Cytokine Networks." Immune Netw 18: 1-18). Die Sequenzen der verwendeten Primerpaare sind im Sequenzproto koll gezeigt (SEQ ID NOs: 6-7 für lNFa, SEQ ID NOs: 8-9 für IL-23, SEQ ID NOs: 10-11 für TNFa, SEQ ID NOs: 12-13 für IL-1ß und SEQ ID NOs: 14-15 für IL-8). Zur Normalisierung der cDNA-Mengen in verschiedenen Proben wurden die Level von ß-Actin verwendet (Primerpaar: SEQ ID NOs: 16-17).
Die Level von TNFa, IL-1ß und IL-8 wurden unter keiner der getesteten Bedingungen durch miR-574-5p beeinflusst. Hingegen konnte ein etwa dreifacher Anstieg der INFa mRNA durch Stimulation mit sEVs beobachtet werden, die aus der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen wurden (Abbildung 11 B). Stimulation mit miR-574-5p oe sEVs führte sogar zu einem etwa fünffachen Anstieg der INFa mRNA und zu einem etwa zweifachen Anstieg der IL-23 mRNA, während mit ScrC sEVs kein Anstieg zu beobachten war (Abbildung 11C und 11D). Vergleichbare Resultate wurden durch Stimulation der Monozyten mit 10 ng/ml des TLR7/8-Liganden R848 erzielt (Abbildung 11 E und 11 F). Die beobachteten Effekte konnten durch Zugabe des TLR7/8-lnhibitors ODN 2087 aufgehoben werden.
Reduktion der Osteoklastengenese durch an CPP gekoppeltes miR-574-5p AntagomiR
Ein miR-574-5p PNA AntagomiR wurde über einen PEG-Linker kovalent an ein zellpenetrieren des Peptid (CPP) gebunden (siehe Schema in Abbildung 12). Das miR-574-5p PNA AntagomiR ist ein einzelsträngiges, zu miR-574-5p komplementäres RNA-Analogon, nämlich eine soge nannte „peptide nucleic acid“ (PNA). Das AntagomiR ist vollständig komplementär zu miR-574- 5p, deckt allerdings nicht die gesamte Sequenz der miR-574-5p ab. Die AntagomiR-Sequenz ist in SEQ ID NO:28 gezeigt. Die AntagomiR-Sequenz war C-terminal mit einem modifizierten Ly sin verbunden. Die Modifikation bestand darin, dass anstelle der Carboxylgruppe (-COOH) eine Amidgruppe (-CONH2) vorhanden war. Das modifizierte Lysin wird zur Ankerung an das Harz gerüst bei der Synthese verwendet (siehe nächster Absatz). Als Abstandshalter zum Harz ver bessert das modifizierte Lysin die Effizienz der ersten kritischen Kopplung. Des Weiteren erhöht das modifizierte Lysin die Löslichkeit des CPP-PNA Konstrukts.
Es wurden Standardmethoden der Festphasensynthese verwendet. Das gesamte CPP-PNA Konstrukt wurde auf einem Harzgerüst aufgebaut, da alle verwendeten Synthesebausteine mit einander kompatibel sind. Die Synthese erfolgte von C-terminaler zu N-terminaler Richtung. Der C-terminalste Synthesebaustein (hier modifiziertes Lysin) wurde zunächst auf einem Harzgerüst immobilisiert. Der nächst N-terminalere Synthesebaustein wurde dann mit dem auf dem Harz immobilisierten Synthesebaustein zur Reaktion gebracht. Dieser Reaktionszyklus wurde für je den Baustein wiederholt, sodass das auf dem Harz befindliche Makromolekül Baustein für Bau stein wächst. Wenn der N-terminalste Baustein zur Reaktion gebracht wurde, wurde das fertige CPP-PNA Konstrukt von dem Harzgerüst gelöst werden.
Das verwendete CPP-PNA-Konstrukt kann wie folgt dargestellt werden (von N-Terminus zu C- Terminus): GRKKRWFRRRRMKWKK-(eg1)-ctcacacacacacactca(K-CONH2). Der erste Teil ist das CPP (SEQ ID NO:29). Der Ausdruck (eg-1) beschreibt den PEG-Linker, der vorliegend ge nau eine Ethylenglykoleinheit umfasst. Es folgt das PNA AntagomiR der SEQ ID NO:28. Ab schließend enthält das Konstrukt ein modifiziertes Lysin mit Amidgruppe (-CONH2) anstatt Car- boxylgruppe (-COOH). Das modifizierte Lysin ist durch den Ausdruck (K-CONH2) beschrieben.
Die Zytotoxizität wurde mit einem MTT-Assay getestet, bei dem der namensgebende Farbstoff MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zum Einsatz kommt. Als Ne- gativkontrolle wurde eine PNA mit nicht zu miR-574-5p komplementärer Sequenz getestet (SEQ ID NO:30), die ebenfalls mittels des PEG-Linkers an CPP gebunden war. Das verwen dete CPP-PNA-Konstrukt der Negativkontrolle kann wie folgt dargestellt werden (von N-Termi- nus zu C-Terminus): GRKKRWFRRRRMKWKK-(eg1)-gctattaccttaacccag(K-NH2). Von dem oben beschrieben erfindungsgemäßen Konstrukt unterscheidet sich die Negativkontrolle ledig lich im Hinblick auf die PNA-Sequenz.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 13 gezeigt, wobei auf der y-Achse die Lebensfähigkeit aufge tragen ist. Weder bei der Negativkontrolle (Abbildung 13A) noch bei miR-574-5p PNA Anta gomiR (Abbildung 13B) ergab sich eine signifikante Toxizität. Bei miR-574-5p PNA AntagomiR konnte sogar eine gesteigerte Lebensfähigkeit im Vergleich zu unbehandelten Kontrolle festge stellt werden. Die Zytotoxizität wurde an frisch isolierten humanen Monozyten getestet.
Der Einfluss des an CPP-gekoppelten miR-574-5p PNA AntagomiR auf die Osteoklasten genese wurde getestet. Das Schema der Induktion der Osteoklastengenese ist in Abbildung 2 gezeigt. Dieses Schema wurde dahingehend angepasst, dass an Tag 1 das CPP-gekoppelte miR-574-5p PNA AntagomiR (CPP-PNA) in Konzentrationen von 10 mM oder 20 pM hinzugege ben wurde. Die Negativkontrolle wurde ohne Zugabe von CPP-PNA durchgeführt (0 pm CPP- PNA). Die Ergebnisse sind in Figur 14 gezeigt. Das CPP-gekoppelte miR-574-5p PNA Anta gomiR führt zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der Osteoklastengenese. Auch für dieses Experiment wurden frisch isolierte humane Monozyten verwendet. Nach Abschluss der Differenzierung wurden maturierte Osteoklasten mit Hilfe einer histologischen Färbung (Nach weis von tartrat-resistenten sauren Phosphatasen, TRAP) visualisiert. Anschließend werden multinukleare TRAP positive Zellen unter einem Lichtmikroskop quantifiziert. Bezuqszeichenliste
1 Zellpenetrierendes Peptid (CPP)
2 PEG-Linker
3 miR-574-5p PNA AntagomiR

Claims

Ansprüche
1. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung zur Reduktion der Knochenresorption bei Erkrankungen, die mit einer übermäßigen Knochenresorption einhergehen, insbesondere bei Erkrankun gen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chronischen Gelenkerkrankungen, akuten Gelenkerkrankungen und Parodontitis, und/oder bei Störungen des Anwachsens von Implantaten.
2. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Erkrankung eine chronische Gelenkerkrankung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis und Arthrose.
3. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der TLR7/8-lnhibitor ein direkter oder ein indirekter Inhibitor ist, wobei ein direkter TLR7/8-lnhibitor eine Komponente ist, die in direkte physische Wechselwirkung mit TLR7/8 tritt und dadurch zu einer Inhibition von TLR7/8 führt und wobei ein indirekter TLR7/8-lnhi- bitor eine Komponente ist, die zu einer Inhibition von TLR7/8 führt, indem ein oder mehrere TLR7/8-Agonisten inhibiert und/oder ein oder mehrere TLR7/8-Antagonsiten aktiviert wer den.
4. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprü chen, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-574-5p-Anta- gomiR, miR574-5p-sponge, miR574-5p-decoy, Hydroxychloroquin, Hydroxychloroquinsul- fat, Chloroquin, Quinacrin (=Mepacrin), CpG-52634, SM934, ST2825, IRS-661, IRS-954, DV-1179, IMO-3100, IMO-8400, IMO-9200, IHN-ODN-24888 und ODN 2087 (ODN 2088 Control (ODN2087).
5. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Inhibitor ein einzelsträngiges, zu miR-574-5p (SEQ ID NO:4) komplementäres RNA-Analogon (AntagomiR) ist.
6. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Inhibitor ein PNA AntagomiR ist.
7. TLR7/8-lnhibitor zur Verwendung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knochenresorption mittels einer Inhibition der Osteoklastendifferenzierung redu ziert wird.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen TLR7/8-lnhibitor nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung Trä gerstoffe enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nanocarriern (NCs) und/oder Cholesterol.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die NCs Nanopartikel (NPs) sind.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 8 oder 9, wo bei die Trägerstoffe Eisenoxid-Nanopartikel sind.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei die Nanopartikel einen Durchmesser in einem Bereich von 5 nm bis 100 nm aufwei sen.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 11, wo bei der Inhibitor kovalent an den Trägerstoff gebunden vorliegt.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung Trä gerstoffe enthält, die zellpenetrierende Peptide (CPPs) sind.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der TLR7/8-lnhibitor mittels eines PEG-Linkers kovalent an das CPP gebunden ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 14 und 15, wobei der TLR7/8-lnhibitor ein einzelsträngiges, zu miR-574-5p (SEQ ID NO:4) komple mentäres RNA-Analogon (AntagomiR) ist.
17. Verfahren zur Prognose der Schwere des Krankheitsverlaufs der rheumatoiden Arthritis ei nes Patienten umfassend die folgenden Schritte: a) Bestimmung des Gehalts an miR-574-5p in sEVs (kleine extrazelluläre Vesikel, englisch: „small extracellular vesicles“) in einer Patientenprobe, b) Vergleich des in Schritt a) bestimmten Gehalts mit dem Gehalt an miR-574-5p in sEVs in Proben eines oder mehrerer Vergleichspatienten mit bekanntem Krank heitsverlauf, c) Prognose der Schwere des Krankheitsverlaufs basierend auf dem Vergleichsergeb nis.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Gehalt an miR-574-5p mit RT-qPCR bestimmt wird.
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