EP3621701A1 - Procede d'obtention d'un extrait aqueux d'anethum graveolens enrichi en petits arn - Google Patents

Procede d'obtention d'un extrait aqueux d'anethum graveolens enrichi en petits arn

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Publication number
EP3621701A1
EP3621701A1 EP18721357.4A EP18721357A EP3621701A1 EP 3621701 A1 EP3621701 A1 EP 3621701A1 EP 18721357 A EP18721357 A EP 18721357A EP 3621701 A1 EP3621701 A1 EP 3621701A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
extract
weight
nucleotides
small
phase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18721357.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Elodie OGER
Jean-Marie Botto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ISP Investments LLC
Original Assignee
ISP Investments LLC
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Filing date
Publication date
Application filed by ISP Investments LLC filed Critical ISP Investments LLC
Publication of EP3621701A1 publication Critical patent/EP3621701A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
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    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/805—Corresponding aspects not provided for by any of codes A61K2800/81 - A61K2800/95

Definitions

  • the invention relates to a process for obtaining an aqueous Anethum graveolens extract enriched in small RNA (ribonucleic acids) of a maximum length of 150 nucleotides (nt) as well as the extracts obtained by the process and the compositions.
  • cosmetics comprising such extracts and their cosmetic uses.
  • the family Apiaceae (Apiaceae), also known as Umbelliferae, is composed of dicotyledonous plants and comprises nearly 3000 species distributed in 420 genera especially present in the temperate regions of the world. This family also includes herbs such as parsley, coriander, and fennel. Anethum graveolens, belongs to the family Apiaceae. Its species name admits several synonyms such as Anethum sowa, Peucedanum graveolens and Peucedanum sowa (Janeen et al, The Herb Society of America's Essential Guide to Dill, Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009).
  • the fragrant dill (Anethum graveolens) is widespread in the world and is a very rich species in different families of molecules such as essential oils, fatty acids, proteins, carbohydrates, furanocoumarin, polyphenols, minerals and many other biologically active molecules. It is particularly used in traditional medicine.
  • the name of dill derives from a Greek word “aneeson” or “aneeton” and means "strong smell”. This plant has a long and ancient history in many countries as a culinary and medicinal herb.
  • RNA of small molecular weight ribonucleic acids
  • solvents that are not considered cosmetic solvents
  • these extraction and purification protocols only make it possible to obtain the purified nucleic acid fraction.
  • This fraction of RNA or DNA or small RNA nucleic acids is devoid of any other molecule of interest such as secondary metabolites, vitamins, sugars, peptides, etc. which can have beneficial effects for the skin and are therefore of cosmetic interest.
  • the invention firstly relates to a process for obtaining an aqueous extract of Anethum graveolens enriched in small RNAs having a length of at most 150 nucleotides from a plant material comprising the following steps:
  • EDTA tetrasodium ethylene diamine tetraacetic acid
  • At least one filtration of the aqueous crude extract is carried out to obtain the aqueous extract enriched in small RNAs of a length of at most 150 nucleotides whose pH is controlled and if necessary readjusted to a value between 6 and 8, preferably between 6 and 6.5.
  • the subject of the invention is an aqueous extract of the aerial parts of Anethum graveolens enriched in small RNAs of a length of at most 150 nucleotides and devoid of DNA, obtained by the process according to the invention, characterized in that it comprises by weight of the total weight of the extract, from 5 to 30 g / kg of dry extract, 0.5 to 10 g / kg of protein fragments, 0.5 to 10 g / kg of sugars 0.1 to 3 g / kg of amino acids, 50 to 2000 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the invention also makes it possible to prepare a composition comprising, as an anti-aging active agent, an extract according to the invention, and a physiologically acceptable medium.
  • Bioanalyzer representing the quantification of the RNAs of a dill extract obtained according to Example 1;
  • FIG. 2 represents a graph resulting from a Bioanalyzer analysis representing the quantification of the RNAs of a dill extract obtained after a step of precipitation of the small RNAs according to Example 2;
  • Figure 3 shows a graph resulting from a Bioanalyseur® analysis representing the quantification of the RNAs of a dill extract obtained by conventional extraction according to Example 3;
  • the invention relates to a method implemented for obtaining an aqueous extract enriched in small RNAs of a length of up to 150 nucleotides from dried or fresh aerial parts of dill.
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • a) of the process according to the invention the plant material is brought into contact with the ground aerated parts of dill with water, preferably in a vegetable matter / water ratio of 4 to 20% by weight. weight, more preferably in a ratio of 5 to 10%, for example in a ratio of 5.7 or 10 w / w.
  • the water used is a distilled or demineralised water or a water rich in mineral salts and / or trace elements, preferably distilled water.
  • the aerial parts of the dill are in dry form.
  • the plant material is milled before being placed in the presence of water in step a). Grinding is a mechanical action that allows better extraction. Mechanical grinding followed by alkaline lysis in the presence of EDTA promotes the complete destructuration of the cell membrane and in particular of the nuclear membrane. Tetrasodium EDTA is then added in a step b) to the mixture obtained in a).
  • the pH at this stage is basic and should be adjusted, if necessary, to a value between 10.5 and 11 by the addition of sodium hydroxide (NaOH). During step b) it is essential to maintain the basic pH between 10.5 and 11.
  • this pH level associated with the action of EDTA, causes the destructuring of the cell membrane, including nuclear membrane, lysis of cells and denaturation of DNA (the two strands of the double helix are separated).
  • the pH control in step b) shows that it remains basic and stabilizes between 9 and 11.
  • the concentration of tetrasodium EDTA is preferably between 2 and 15 mM, and more preferably of 10 mM
  • Tetrasodium EDTA will weaken, destructure the pectocellulosic membranes of plant cells by sequestering by complexation divalent ions such as calcium ions that form ionic bridges between the pectin molecules surrounding the cellulose microfibrils. This has the effect of promoting the release of cellular content during extraction.
  • the EDTA treatment step is essential to enrich the small molecular weight RNA extract.
  • the EDTA treatment step preferably lasts at least 1 h at a temperature of between 20 and 80 ° C. During this step, the mixture obtained in a) is advantageously stirred.
  • a step c) the pH of the mixture obtained in b) is then adjusted to a value of between 6 and 8.
  • the pH is adjusted by adding a solution of hydrochloric acid (HC1) or any acid which can regulate the pH which is compatible with a cosmetic use such as citric or lactic acid.
  • HC1 hydrochloric acid
  • any acid which can regulate the pH which is compatible with a cosmetic use such as citric or lactic acid.
  • a step d) the mixture obtained in c) is purified so as to remove the plant material and recover an aqueous crude extract. Any method known to those skilled in the art may be used.
  • the mixture obtained in c) is centrifuged at low speed, for example for at least 10 min at 4000 g, so as to sediment the residual plant material in the pellet and recover an aqueous crude extract in the supernatant.
  • a step d) the pH is controlled and readjusted to a value between 6 and 8.
  • the pH is readjusted to a value between 6 and 6.5, even more preferably at 6.5.
  • the pH is readjusted by adding a solution of hydrochloric acid (HC1) or sodium hydroxide (NaOH).
  • a pH below 6 can cause the precipitation of nucleic acids in general, so that of small molecular weight RNAs of a length of at most 150 nucleotides.
  • step of adjusting the pH in step d) of the process according to the invention is an essential step for the optimal extraction of small molecular weight RNAs.
  • the readjustment of the pH of step d) is preceded by at least one filtration of the aqueous crude extract. obtained in d).
  • successive filtrations will be carried out by lowering the filtration threshold from 50 to 20 ⁇ to 0.4; 0.3; 0.2 or 0.1 ⁇ .
  • the second subject of the invention is an aqueous extract of dill enriched with small RNAs having a length of at most 150 nucleotides of the invention obtained by the method described above.
  • This extract does not contain DNA (deoxyribonucleic acid).
  • Such an aqueous extract enriched in small RNAs having a length of at most 150 nucleotides comprises, before dilution, by weight of the total weight of the extract, 10 to 30 g / kg of dry weight extract, 2 to 10 g / kg of protein fragments, 2 to 10 g / kg of sugars, 0.2 to 3 g / kg of amino acids, 100 to 2000 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg of small weight RNA molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • the extract thus obtained is considered concentrated. It can then be diluted in a physiologically acceptable solvent for cosmetic use, so that the concentration of the extract is then adjusted to a particular dry weight of interest.
  • physiologically acceptable solvents mention may be made of water, glycerol, ethanol, propanediol and its natural version called Zemea® from corn, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • the extract obtained by the process according to the invention is diluted in a solvent such as 30% glycerol and water, and comprises by weight of the total weight of the extract.
  • the extract obtained by the process according to the invention further comprises from 5-15 g / kg of solids, from 50 to 1000 mg / kg of polyphenols, 0.5-10 g / kg of protein fragments, 0.5 -10 g / kg of sugars, from 0.1 to 1 g / kg of amino acids and from 10 to 100 mg / kg of small RNAs up to 150 nucleotides in length.
  • RNA RNA enriched in small molecular weight RNA (up to 150 nucleotides in length) is obtained from dill (Anethum graveolens) of the family Apiaceae.
  • a first step 5% of dried aerial parts of dill in powder form are placed in distilled water and 10 mM of tetrasodium EDTA are added, ie 50 g of dried dill powder in 950 g of distilled water and 3.8 g of tetrasodium EDTA.
  • the pH at this stage must be basic and between 10.5 and 11 for optimal enrichment of the extract.
  • RNA of small molecular weight RNA of small molecular weight.
  • the mixture is then heated for 2 hours at 55 ° C. with stirring.
  • the mixture is then centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid material.
  • the pH is controlled, before possible dilution, to place it if necessary between 6 and 6.5 and preserve the small RNA extract.
  • Sequential filtrations on decreasing porosity filters are then carried out in order to clarify the plant extract until a sterilizing filtration at 0.2 ⁇ m.
  • EXAMPLE 2 Characterization of the Dill Extract of Example 1 In general, an aqueous extract of light green dill is obtained, titrating from 10 to 30 g / kg of dry weight extract, 2 at 10 g / kg of protein fragments, 2 to 10 g / kg of sugars, 0.1 to 3 g / kg of amino acids, 300 to 750 mg / kg of compounds phenolics and 10 to 100 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extracts obtained may show significant variability according to factors such as the place of harvest, the year of harvest, the season, climatic conditions, etc.
  • Example 2 In the extraction of Example 1, an aqueous extract was obtained containing 12 g / kg of dry weight extract.
  • the physicochemical analysis shows that this extract has a concentration of 2.55 g / kg of protein fragments, 3 g / kg of sugars, 340 g / kg of amino acids, 650 mg / kg of phenolic compounds and 50 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extract is then diluted with a cosmetic solvent, in particular with 30% glycerin or butylene glycol or propanediol.
  • the extract After dilution, the extract has a concentration of 1.7 g / kg of protein fragments, 2 g / kg of sugars, 240 g / kg of amino acids, 455 mg / kg of phenolic compounds and 35 mg / kg of RNA of small molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • the total protein content of the dill extract was determined by a Lowry protein assay (Lowry et al., 1951). The absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 550 nm. The protein content is determined using a standard BSA curve.
  • the amino acid content of the extract was determined from a protocol published by Moore et al (1948), the free amino acid content of the extract was evaluated by the formation of a colored complex, continued at the disruption of the amino and carboxyl functions by the ninhydrin reagent. The absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 570 nm. The total amino acid content is determined relative to an amino acid pool as standard.
  • the total sugar content of the extract was determined by an adaptation of the assay described by Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Colorimetric method for the determination of sugars and related substances", Anal Chem, 1956, 28 (3), 350-356). This analysis consists of dissolving the raw material in concentrated sulfuric acid and then reacting with phenol to form a colored complex. The absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 490 nm. The sugar content is determined using a standard glucose curve.
  • the polyphenol content of the extract was determined using the Folin-Ciocalteu assay (Singleton et al., Analysis of Total Phenols and Other Oxidation and Antioxidant Substrates Using the Folin-Ciocalteu Reagent, 1999). , 299: 152).
  • the polyphenol compounds in the sample react with the Folin-Ciocalteu reagent, the oxidation of the reagent gives a blue color.
  • the absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 760 nm. The content was expressed in gallic acid equivalents using a standard gallic acid curve.
  • RNAs The quantification of low molecular weight RNAs by means of a Bioanalyseur® (Agilent) which allows miniaturized electrophoresis to be carried out using electronic chips specific to nucleic acid analysis such as small molecular weight RNAs. It allows to determine the size and concentration contained in an extract from a few microliters. The result is in the form of a graph with an arbitrary fluorescence unit on the ordinate (FU) and on the abscissa the number of nucleotides (nt). An internal marker is added to each analysis (peak 25 nt in Figure 1), and serves as internal control to validate the smooth running of the analysis.
  • Example 3 Study of the influence of the final pH in the preparation of extracts of dill (Anethum graveolens) in order to obtain a dill extract devoid of small RNAs
  • the extraction process is carried out under the same operating conditions as Example 1, in order to enrich a small molecular weight RNA extract, except for the final step of adjusting the pH.
  • This extraction process is carried out with a tetrasodium EDTA treatment step, but with a final adjustment of the extract at an acidic pH of between 4 and 4.5 instead of a pH of between 6 and 8.
  • EXAMPLE 4 Production of a conventional extract obtained by maceration of dill (Anethum graveolens) Demonstration of the role of an EDTA treatment step for the implementation of a small RNA extraction process.
  • 5% of dill is crushed and water is added, ie 50 g of dill in 950 g of distilled water.
  • the pH is measured and is 5.5, the mixture is stirred for 1 h at 55 ° C.
  • the extract is centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid matter.
  • Sequential filtrations are then carried out on decreasing porosity filters with a size of between 50 and 20 ⁇ m and then up to a porosity of 0.4 to 0.3 ⁇ m.
  • a light green aqueous extract is then obtained, titrating at 13 g / kg of dry weight extract, containing 3.3 g / kg of protein fragments, 2.2 g / kg of sugars, 380 mg / kg of acids. amino, and 410 mg / kg of phenolic compounds.
  • the extract is then diluted to be 8 g / kg dry weight, by only adding water.
  • the physico-chemical analysis shows that, after dilution, the plant extract has a protein fragment concentration of 2.8 g / kg, and sugars of 1.7 g / kg, in amino acids of 240 mg / kg, and in phenol compounds of 280 mg / kg.
  • the Bioanalyseur® analysis indicates that the concentration of low molecular weight RNA is zero for this extract (as shown in Figure 3).
  • This result confirms that an extract obtained from an extraction process in the absence of EDTA treatment (at basic pH) does not contain low molecular weight RNA.
  • the EDTA treatment step is essential to obtain an extract rich in low molecular weight RNA according to the invention.
  • the aqueous extracts enriched in small RNAs obtained according to the invention are advantageously used in the preparation of cosmetic compositions comprising, as active agent, such a small RNA extract according to the invention, and a physiologically acceptable medium.
  • effective amount is meant the minimum amount of extract according to the invention which is necessary to obtain the activity of the extract, in particular cosmetic and more particularly to improve the appearance of the skin, to fight against the signs of aging cutaneous or the improvement of the hydration of the skin, without this quantity being toxic.
  • the small RNA extract according to the invention is used, preferably diluted in a cosmetic solvent, at a dry weight of between 5 and 15 g / kg.
  • the small RNA extract according to the invention is present in the composition at a concentration of 0.1 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • a physiologically acceptable medium means a vehicle adapted for contact with the outer layers of the skin or mucous membranes, without toxicity, irritation, undue and similar allergic response or intolerance reaction, and proportionate to a reasonable benefit / risk ratio.
  • compositions that can be used according to the invention can be applied by any appropriate route, in particular oral or external topical, and the formulation of the compositions will be adapted by those skilled in the art.
  • compositions according to the invention are in a form suitable for topical application.
  • These compositions must therefore contain a physiologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin and integuments, without risk of discomfort during their application and cover all the appropriate cosmetic forms.
  • topical application it is meant to apply or spread the aqueous extract enriched in small RNA according to the invention, and more particularly a composition containing it, on the surface of the skin or mucosa.
  • Skin refers to the skin of the face, including the eye area and mouth, nose, forehead, neck, hands, but also the skin of the entire body.
  • compositions for the implementation of the invention may especially be in the form of an aqueous solution, hydro-alcoholic or oily, an oil-in-water emulsion, water-in-oil or multiple emulsions; they can also be in the form of suspensions, or powders, suitable for application on the skin, mucous membranes, lips and / or hair.
  • compositions may be more or less fluid and may also have the appearance of a cream, lotion, milk, serum, ointment, gel, paste or paste. a foam. They can also be in solid form, as a stick or be applied to the skin in aerosol form.
  • adjuvants necessary for the formulation such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition are chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they may be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the aqueous extract enriched in small RNAs according to the invention can be encapsulated or included in a cosmetic vector such as liposomes or any other nanocapsule or microcapsule used in the field of cosmetics or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites.
  • a cosmetic vector such as liposomes or any other nanocapsule or microcapsule used in the field of cosmetics or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites.
  • composition according to the invention may comprise, in addition to the active agent according to the invention, at least one other active agent having cosmetic effects similar to and / or complementary to those of the invention.
  • this active agent is defined as an "additional active agent”.
  • the additional active agent (s) may be chosen from: anti-aging, firming, lightening, moisturizing, draining, microcirculatory promoting agents, exfoliants, desquamating agents, stimulating the extracellular matrix, activating energy metabolism, antibacterials, antifungal agents, soothing, anti-radical, anti-UV, anti-acne, anti-inflammatory, anesthetic, providing a feeling of warmth, providing a feeling of freshness, slimming.
  • Such additional active agents may be selected from the groups comprising:
  • vitamin A and in particular retinoic acid, retinol, retinol proprionate, retinol palmitate;
  • vitamin B3 and more particularly niacinamide, tocopherol nicotinate;
  • vitamin B5 vitamin B6, vitamin B12, panthenol
  • vitamin C especially ascorbic acid, ascorbyl glucoside, ascorbyl tetrapalmitate, magnesium and sodium ascorbyl phosphate;
  • metalloproteinase inhibitors or a TIMP activator
  • amino acids such as arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, methionine and its derivatives, N-acyl amino acid compounds;
  • the natural or synthetic peptides including di-, tri-, tetra-, penta- and hexapeptides and their lipophilic derivatives, isomers and complexed with other species such as a metal ion (for example copper, zinc, manganese) , magnesium, and others).
  • a metal ion for example copper, zinc, manganese
  • Examples include commercially known peptides known as Matrixyl ®, ARGIRELINE ®, TM Chronogen, LAMINIXYL IS TM, Peptide Q10 TM, Collaxyl TM (patent FR2827170, ASHLAND®) PEPTIDE VINCI 01 TM (patent FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02 TM (patent FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide TM (patent FR2846883, ASHLAND®) or the synthetic peptide of Arg-Gly-Ser-NH 2 sequence, sold under the name ATPeptide TM by ASHLAND®;
  • plant peptide extracts such as flax extracts (Lipigenin TM, patent FR2956818, ASHLAND®), extracts of soya, spelled, grapevine, rapeseed, flax, rice, maize, pea;
  • yeast extracts for example Dynagen TM (patent FR2951946, ASHLAND®) or Actopontine TM (patent FR2944526, ASHLAND®);
  • DHA - dehydroacetic acid
  • salicylic acid and its derivatives alpha- and beta-hydroxy acids, silanols;
  • cyclic AMP and its derivatives the activating agents of the adenylate cyclase enzyme and the phosphodiesterase enzyme inhibitory agents, the Centella asiatica extract, the asiaticoside and the Asian acid, the methyl xanthines, the theine , caffeine and its derivatives, theophylline, theobromine, forskolin, esculin and esculoside, ACE inhibitors, Val-Trp peptide, neuropeptide Y inhibitors, enkephalin, extract of Ginkgo biloba, dioscorea extract, rutin, yerba mate extract, guarana extract, oligosaccharides, polysaccharides, carnitine, ivy extract, fucus extract, extract hydrolyzed Prunella vulgaris, hydrolysed extract of Celosia cristata, Anogeissus leiocarpus extract, Manihot utilisissima leaf extract, palmitoylcarnitine, carnosine
  • Example 5 Balm for the eye contour
  • phase C In a separate beaker, mix until homogeneous. Sprinkle in phase D and mix well until well blended;
  • phase E At 25 ° C, add phase E to the main container and mix until homogeneous;
  • premix phase F add it to the main container and mix until homogeneous
  • the composition is thus in the form of a purple pearlescent cream gel, with a pH of between 5.70 and 6.20 and a viscosity (OD) of 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT / Spindle C / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • Emulsynt TM GDL ester Glyceryl Dilaurate 3 Emulsynt TM GDL ester Glyceryl Dilaurate 3, 00
  • phase C is added to the main vessel and homogenize for 10 minutes;
  • phase E at 60 ° C. Mix well to homogenize for 10 minutes;
  • phase H sprinkle Natrosol TM in water at room temperature and homogenize while heating at 60 ° C;
  • composition is thus in the form of a cream butter rose, with a pH between 4.90 and 5.40 and a viscosity (D0) of 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT / Spindle D / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • Disodium EDTA Disodium EDTA 0.10
  • phase A 1. In a beaker at room temperature, weigh the ingredients of phase A and mix. Sprinkle phase B and homogenize;
  • phase D At room temperature, add phase D to phase ABC and continue homogenizing;
  • the composition is thus in the form of a smooth gel, translucent, creamy yellow, with a pH between 6.30 and 7.10 and a viscosity (OD) of 10,000-15,000 cps (Brookfield RVT / Spindle B / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • phase A 1. At 25 ° C, homogenize phase A in the main container; 2. At 25 ° C sprinkle in phase B and mix well until homogeneous;
  • phase D in a separate beaker and add to the main container at 25 ° C; 5. At 25 ° C, add phase E to the main container and mix well;
  • phase G into a separate beaker and add to the main container until homogeneous
  • composition is thus in the form of a cream gel with scintillating green effects, with a pH between 5.30 and 5.80 and a viscosity (D0) of 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT / Spindle C / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • composition is thus in the form of a smooth serum, semi-opaque, with a pH between 5.75 and 6.25 and a viscosity (OD) of 1,100 - 1,400 cps (Brookfield RVT / spindle 3/20 rpm / 25 ° C / 1 minute).
  • the cosmetic compositions described above can be used to improve the appearance of the skin, fight against the signs of skin aging or improve skin hydration.
  • improving the appearance of the skin is meant that the grain of the skin appears finer, the brightness more intense and the complexion more homogeneous.
  • “Signs of skin aging” means any changes in the appearance of the skin due to aging such as, for example, fine lines and wrinkles, cracks, bags under the eyes, dark circles, wilting, loss of skin. elasticity, firmness and / or tone of the skin, but also any internal changes in the skin that do not systematically result in a modified external appearance such as, for example, thinning of the skin, or any internal damage to the skin. skin resulting from environmental stresses such as pollution and UV radiation.
  • skin hydration enhancement is meant any improvement in skin surface changes due to dehydration, such as drought, tightness and discomfort.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait aqueux d'Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir d'une matière végétale comprenant les étapes suivantes a) on met en présence les parties aériennes d'aneth dans de l'eau; b) on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique à un pH compris entre 10,5 et 11; c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8; d) on purifie le mélange obtenu en c); et e) on contrôle le pH et on le réajuste si nécessaire entre 6 et 8. L'invention concerne également un extrait aqueux d'Anethum graveolens, enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides, obtenu par le procédé.

Description

PROCEDE D'OBTENTION D'UN EXTRAIT AQUEUX D'ANETHUM GRAVEOLENS ENRICHI EN PETITS ARN
L'invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait à' Anethum graveolens aqueux enrichi en petits ARN (acides ribonucléiques ) d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides (nt) ainsi que les extraits obtenus par le procédé et les compositions cosmétiques comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmétiques .
La famille des Apiacées (Apiaceae) , appelées aussi Ombellifères, est constituée de plantes dicotylédones et comprend près de 3 000 espèces réparties en 420 genres surtout présentes dans les régions tempérées du monde. Cette famille inclut aussi des herbes comme le persil, la coriandre, le fenouil. Anethum graveolens, fait partie de la famille des Apiaceae. Son nom d'espèce admet plusieurs synonymes tels que Anethum sowa, Peucedanum graveolens et Peucedanum sowa (Janeen et al ; The Herb Society of America 's Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009) . L'aneth odorant (Anethum graveolens) est largement répandue dans le monde et est une espèce très riche en différentes familles de molécules telles que des huiles essentielles, des acides gras, des protéines, des carbohydrates, de la furanocoumarine, des polyphénols, des minéraux et encore beaucoup d'autres molécules biologiquement actives. Elle est notamment très utilisée en médecine traditionnelle. Le nom de l'aneth dérive d'un mot grec «aneeson» ou « aneeton» et signifie « forte odeur ». Cette plante a une histoire longue et ancienne dans de nombreux pays comme une herbe culinaire et médicinale. Son utilisation est commune en médecine ayurvédique (médecines traditionnelles de l'Inde), principalement pour lutter contre l' inconfort abdominal et l'indigestion) (Jana et Shekhawat Shekhawat GS . Phytochemical Analysis and Antibacterial Screening of in vivo and invitro Extracts of Indian Médicinal Herb: Anethum graveolens. Res. J. Med. Plant. 2010a; 4 (4 ): 206-212. 2010; Janeen et al., The Herb Society of America 's Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio : The Herb Society of America, 2009). En France et dans plusieurs autres pays de l'Europe de l'ouest cette plante fait partie de nombreuses préparations médicinales traditionnelles pour ses propriétés digestives et fortifiantes qui subsistent encore aujourd'hui. La littérature scientifique décrit notamment des effets antimicrobien, anti-inflammatoire, analgésique, une protection des muqueuses respiratoires et des effets comme relaxant musculaire.
De nombreux extraits de graines d'aneth sont décrits dans la littérature en partie pour l'utilisation de ses huiles essentielles, en revanche peu d'études ont été réalisées sur des extraits issus des parties aériennes de l'aneth. De plus la plupart des extractions décrites d'aneth sont effectuées avec des solvant organiques de type apolaire et peu sont issus d'extraction avec un solvant polaire comme l'eau. De plus très peu de ces extraits sont revendiqués pour une utilisation cosmétique .
Malgré les différents produits cosmétiques anti-âge sur le marché pour le traitement de la peau, il reste un besoin de compositions cosmétiques efficaces appliquées topiquement qui présentent des effets anti-âges pour la peau et les cheveux en utilisant des ingrédients naturels comme agent actif.
Les produits dits « non naturels » et synthétisés chimiquement peuvent être perçus comme dangereux pour l'environnement ainsi que pour les personnes. En revanche, les produits naturels sont perçus comme supérieurs aux produits synthétisés chimiquement. De nombreux produits naturels extraits de plantes ou d'herbes sont connus pour contenir des agents antioxydants / radicaux libres qui peuvent neutraliser les effets des dégâts des radicaux libres telles que les polyphénols. L'aneth est une plante très riche en composés phénoliques et d'autres familles de molécules reconnues pour leurs effets bénéfiques sur la peau. En particulier, le procédé d'extraction décrit dans l'invention permet d'enrichir l'extrait final avec des ARN de petit poids moléculaire .
Les protocoles d'extraction des acides ribonucléiques (ARN ARN de petit poids moléculaire) classiquement décrits sont adaptés aux pratiques de laboratoire, et donc réalisés à petite échelle. Ils utilisent des solvants qui ne sont pas considérés comme des solvants cosmétiques (Zumbo, P. 2014 "Phenol- chloroform Extraction", 2014) . De plus, ces protocoles d'extraction et purification ne permettent d'obtenir que la fraction d'acides nucléiques purifiée. Cette fraction d'acides nucléiques ARN ou ADN ou petits ARN est dépourvue de tout autre molécule d'intérêt telle que les métabolites secondaires, vitamines, sucres, peptides, etc. qui peuvent avoir des effets bénéfiques pour la peau et présentent donc un intérêt cosmétique.
L'invention a pour premier objet un procédé d'obtention d'un extrait aqueux à' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir d'une matière végétale comprenant les étapes suivantes :
a) Solubilisation des parties aériennes d'aneth avec de l'eau ;
b) auquel on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) , le pH du mélange étant compris entre 10,5 et 11 ;
c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;
d) on purifie le mélange obtenu en séparant la matière soluble de celle qui est insoluble c) de manière à récupérer un extrait brut aqueux ; et
e) on réalise au moins une filtration de l'extrait brut aqueux pour obtenir l'extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides dont le pH est contrôlé et si nécessaire réajusté à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5. De plus, l'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux des parties aériennes d' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et dépourvu d'ADN, obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en poids du poids total de l'extrait, de 5 à 30 g/kg d'extrait sec, 0,5 à 10 g/kg de fragments protéiques, 0,5 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 50 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
L' invention permet également de préparer une composition comprenant, en tant qu'agent actif anti-âge, un extrait selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable.
L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, au regard de la figure 1 annexée :
- la Figure 1 est un graphique résultant d'une analyse au
Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu selon l'exemple 1 ;
la Figure 2 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu après une étape de précipitation des petits ARN selon l'exemple 2 ;
la Figure 3 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth obtenu par extraction conventionnelle selon l'exemple 3 ;
Description de l'invention :
L' invention concerne un procédé mis en œuvre pour l'obtention d'un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir des parties aériennes séchées ou fraîches d'aneth.
Par « parties aériennes » on entend les feuilles, tiges et fleurs de l'aneth.
Les graines ne sont pas comprises dans les « parties aériennes » au sens de l'invention.
Dans le cours de la description les termes « aneth » et
« Anethum graveolens » seront utilisées indifféremment, avec la même signification.
Par « petits ARN » ou « ARN de petit poids moléculaire », on entend des ARN (acides ribonucléiques ) non codants de petit poids moléculaire, d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides, tels que tous types de petits ARN non messager, simple et/ou double brins, par exemple les micro-ARN, les ARN interférents , les introns, les petits ARN nucléaires ou encore tout fragment d' ARN.
Dans une première étape a) du procédé selon l'invention, on met en présence la matière végétale soit les parties aériennes broyées séchées d'aneth avec de l'eau, préférentiellement dans un rapport matière végétale / eau de 4 à 20% en poids/poids, plus préférentiellement dans un rapport de 5 à 10%, par exemple dans un rapport de 5,7 ou 10 en poids/poids.
L'eau utilisée est une eau distillée, déminéralisée ou encore une eau riche en sels minéraux et/ou oligo-éléments, préférentiellement une eau distillée.
De préférence les parties aériennes de l'aneth sont sous forme sèche.
Préférentiellement, la matière végétale est broyée avant d'être mise en présence d'eau dans l'étape a) . Le broyage est une action mécanique qui permet une meilleure extraction. Le broyage mécanique, suivi d'une lyse alcaline en présence d'EDTA favorise la complète déstructuration de la membrane cellulaire et notamment de la membrane nucléaire. On ajoute ensuite dans une étape b) de l'EDTA tétrasodique dans le mélange obtenu en a) . Le pH à cette étape est basique et doit être ajusté, si nécessaire, à une valeur comprise entre 10,5 et 11 par l'ajout de soude (NaOH) . Lors de l'étape b) il est essentiel de maintenir le pH basique entre 10,5 et 11. En effet, ce niveau de pH, associé à l'action de l'EDTA, provoque la déstructuration de la membrane cellulaire, y compris la membrane nucléaire, la lyse des cellules et la dénaturation de l'ADN (les 2 brins de la double hélice sont séparés) . Le contrôle du pH lors de l'étape b) montre que celui-ci reste basique et se stabilise entre 9 et 11.
La concentration en EDTA tétrasodique est préférentiellement comprise entre 2 et 15mM, et plus préférentiellement de 10 mM
Cette concentration est choisie pour optimiser le rendement d'extraction des ARN de petit poids moléculaire dans l'extrait final. L'EDTA tétrasodique va fragiliser, déstructurer les membranes pecto-cellulosiques des cellules végétales en séquestrant par complexation les ions divalents tels que les ions calcium qui forment des ponts ioniques entre les molécules de pectines entourant les microfibrilles de cellulose. Ceci a pour conséquence de favoriser la libération du contenu cellulaire au cours de l'extraction. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.
L'étape de traitement par l'EDTA dure préférentiellement au moins lh, à une température comprise entre 20 et 80 °C. Pendant cette étape, le mélange obtenu en a) est avantageusement mis sous agitation.
Dans une étape c) , on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8.
Par exemple, on ajuste le pH par ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou encore n'importe quel acide pouvant réguler le pH qui soit compatible avec une utilisation cosmétique tel que l'acide citrique ou lactique.
Cette étape d'acidification provoque la renaturation brutale de l'ADN (réappariement des brins du duplex) . Néanmoins l'ADN chromosomique, très long, ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. Au contraire, les petits ARN, beaucoup plus courts, restent en solution. L'ADN et les petits ARN sont ainsi séparés en deux phases distinctes ; une phase solide contenant entre autres l'ADN chromosomique, et une phase liquide contenant, entre autres, les petits ARN.
Dans une étape d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale et récupérer un extrait brut aqueux. Toute méthode connue par l'homme du métier pourra être utilisé. Préférentiellement le mélange obtenu en c) est centrifugé à faible vitesse, par exemple pendant au moins 10 min à 4000 g, de manière à sédimenter la matière végétale résiduelle dans le culot et récupérer un extrait brut aqueux dans le surnageant.
Dans une étape d) on contrôle le pH et on le réajuste à une valeur comprise entre 6 et 8. Préférentiellement le pH est réajusté à une valeur comprise entre 6 et 6,5, encore plus préférentiellement à 6,5. Le pH est réajusté par l'ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou de soude (NaOH) .
En effet, un pH inférieur à 6 peut entraîner la précipitation des acides nucléiques en général, donc celle des ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides .
L'étape d'ajustement du pH à l'étape d) du procédé selon l'invention est une étape indispensable à l'extraction optimale des ARN de petit poids moléculaire.
Avantageusement le réajustement du pH de l'étape d) est précédé par au moins une filtration de l'extrait brut aqueux obtenu en d) . Préférentiellement des filtrations successives seront réalisées en abaissant le seuil de filtration de 50 à 20 μπι jusqu'à 0,4 ; 0,3 ; 0,2 ou 0,1 μπι. L'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux d' aneth enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides de l'invention obtenu par le procédé décrit ci-dessus.
Cet extrait ne contient pas d'ADN (acide désoxyribonucléique) .
Un tel extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides comprend, avant dilution, en poids du poids total de l'extrait, 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,2 à 3 g/kg d'acides aminés, 100 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait ainsi obtenu est considéré comme concentré. Il peut être ensuite dilué dans un solvant physiologiquement acceptable pour un usage cosmétique, de telle sorte que la concentration de l'extrait est alors ajustée à un poids en extrait sec particulier d'intérêt.
A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs de solvants physiologiquement acceptables, on peut citer l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol ainsi que sa version naturelle appelée Zemea® issue du maïs, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.
Préférentiellement, l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention est dilué dans un solvant tel que 30% de glycérol et de l'eau, et comprend en poids du poids total de l'extrait. L'extrait obtenu par le procédé selon l'invention comprend en outre de 5-15 g/kg d'extrait sec, de 50 à 1000 mg/kg de polyphénols 0,5-10 g/kg de fragments protéiques, 0,5-10 g/kg de sucres, de 0,1 à 1 g/kg d'acides aminés et 10-100 mg/kg de petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
A titre illustratif, des exemples préférés de mode de réalisation du procédé selon l'invention sont décrits ci- dessous.
Exemple 1 : Préparation d'un extrait d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN
Un extrait aqueux enrichi en ARN de petit poids moléculaire (d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides) est obtenu à partir d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae.
Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth sous forme de poudre sont placés dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique. Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en
ARN de petit poids moléculaire.
Le mélange est ensuite chauffé 2h à 55°C sous agitation. Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.
A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.
Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration stérilisante à 0,2 ym.
Exemple 2 : Caractérisation de l'extrait d' aneth de l'exemple 1 D'une manière générale, on obtient un extrait aqueux d' aneth de couleur vert clair titrant de 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 300 à 750 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Néanmoins, pour des parties aériennes d' aneth de l'espèce Anethum graveolens, les extraits obtenus peuvent présenter une variabilité importante en fonction de facteurs tels que le lieu de récolte, l'année de récolte, la saison, les conditions climatiques, etc.
Dans l'extraction de l'exemple 1, on a obtenu un extrait aqueux titrant 12 g/kg d'extrait de poids sec.
L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 2,55 g/kg de fragments protéiques, 3 g/kg de sucres, 340 g/kg d'acides aminés, 650 mg/kg de composés phénoliques et 50 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol. Après dilution l'extrait présente une concentration de 1,7 g/kg de fragments protéiques, 2 g/kg de sucres, 240 g/kg d'acides aminés, 455 mg/kg de composés phénoliques et 35 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Méthodes utilisées dans le dosage de spectrophotométrie pour déterminer la quantité de composés différents dans l'extrait d' aneth :
La teneur totale en protéines de l'extrait d' aneth a été déterminée par un dosage de protéines de Lowry (Lowry et al, 1951) . L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. La teneur en protéines est déterminée à l'aide d'une courbe standard de BSA.
La teneur en acides aminés de l'extrait a été déterminée à partir d'un protocole publié par Moore et al (1948), la teneur en acides aminés libre de l'extrait a été évaluée par la formation d'un complexe coloré, suite à la rupture des fonctions aminé et carboxylique par le Réactif ninhydrine. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. La teneur totale en acide aminées est déterminée par rapport à un pool d'acide aminés comme standard.
La teneur totale en sucres de l'extrait a été déterminée par une adaptation du dosage décrit par Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des substances apparentées", Anal. Chem., 1956, 28 (3 ) , 350- 356) . Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en réagissant avec du phénol pour former un complexe coloré. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucre est déterminée à l'aide d'une courbe standard de glucose. La teneur en polyphénols de l'extrait a été déterminée à l'aide du dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., Analyse des phénols totaux et d'autres substrats d'oxydation et antioxydants au moyen du réactif folin-ciocalteu, 1999, 299: 152) . Les composés de type polyphénols dans l'échantillon réagissent avec le réactif Folin-Ciocalteu, l'oxydation du réactif donne une couleur bleue. L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. Le contenu a été exprimé en équivalents d'acide gallique à l'aide d'une courbe standard d'acide gallique.
La quantification des ARN de bas poids moléculaires au moyen d'un Bioanalyseur® (Agilent) qui permet de réaliser des électrophorèses miniaturisées grâce à des puces électroniques spécifiques de l'analyse des acides nucléiques telle que celle des ARN de petit poids moléculaire. Il permet de déterminer la taille et la concentration contenues dans un extrait à partir de quelques microlitres. Le résultat se présente sous forme d'un graphique avec une unité arbitraire de fluorescence en ordonnée (FU) et en abscisse le nombre de nucléotides (nt) . Un marqueur interne est ajouté à chaque analyse (pic à 25 nt sur la figure 1), et sert de contrôle interne pour valider le bon déroulement de l'analyse. Exemple 3 : Etude de l'influence du pH final dans la préparation d'extraits d' aneth (Anethum graveolens) afin d'obtenir un extrait d' aneth dépourvu de petits ARN
Le procédé d'extraction est réalisé dans les mêmes conditions opératoires que l' exemple 1, pour enrichir un extrait en ARN de petit poids moléculaire, hormis l'étape finale d'ajustement du pH.
Ce procédé d'extraction est réalisé avec une étape de traitement par EDTA tétrasodique, mais avec un ajustement final de l'extrait à un pH acide compris entre 4 et 4,5 au lieu d'un pH compris entre 6 et 8.
Ceci entraine la précipitation des ARN de petit poids moléculaire, résultats confirmés par l'analyse au Bioanalyseur® qui donne une concentration nulle en ARN de petit poids moléculaire (tel qu'illustré à la Figure 2) .
Exemple 4 : Réalisation d'un extrait conventionnel obtenu par macération d' aneth (Anethum graveolens. Mise en évidence du rôle d'une étape de traitement par EDTA pour la mise en œuyre d'un procédé d'extraction de petits ARN.
Dans le but de mettre en évidence le rôle d'une étape de traitement par EDTA lors de l'extraction des ARN de petit poids moléculaire, un extrait d' aneth (Anethum graveolens) a également été obtenu, en modifiant certaines étapes essentielles du procédé selon l'invention, ne permettant pas d'enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.
Dans une première étape, 5% d' aneth sont broyés puis de l'eau est ajoutée, soit 50 g d'aneth dans 950 g d'eau distillée.
Le pH est mesuré et est de 5,5, le mélange est mis sous agitation pendant lh à 55°C.
Ensuite, l'extrait est centrifugé 10 min à 4000 g pour ôter la matière solide. Des filtrations séquentielles sont alors réalisées sur des filtres de porosité décroissante de taille comprise entre 50 et 20 ym puis jusqu'à une porosité de 0,4 à 0,3 ym.
On obtient alors un extrait aqueux de couleur vert clair titrant à 13 g/kg d'extrait de poids sec, contenant 3,3 g/kg de fragments protéiques, 2,2 g/kg de sucres, 380 mg/kg d'acides aminés, et 410 mg/kg de composés phénoliques.
L'extrait est alors dilué pour être à 8 g/Kg en poids sec, par seul ajout d'eau.
L'analyse physico-chimique montre qu'après dilution l'extrait végétal présente une concentration en fragments protéiques de 2,8 g/kg, et en sucres de 1,7 g/kg, en acides aminés de 240 mg/kg, et en composés phénoliques de 280 mg/kg. Dans ces conditions d'extraction dite conventionnelle (absence de traitement par EDTA) , l'analyse au Bioanalyseur® indique que la concentration en ARN de petit poids moléculaire est nulle pour cet extrait (tel qu'illustré à la Figure 3) . Ce résultat confirme qu'un extrait obtenu à partir d'un procédé d'extraction en l'absence de traitement par EDTA (à pH basique) ne contient pas d'ARN de petit poids moléculaire. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour obtenir un extrait riche en ARN de petit poids moléculaire selon l'invention.
Selon un autre aspect de l'invention, les extraits aqueux enrichis en petits ARN obtenus selon l'invention sont avantageusement utilisés dans la préparation de compositions cosmétiques comprenant, à titre d'agent actif, un tel extrait de petits ARN selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable .
Par quantité efficace, on désigne la quantité minimum d'extrait selon l'invention qui est nécessaire pour obtenir l'activité de l'extrait, en particulier cosmétique et plus particulièrement pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou pour l'amélioration de l'hydratation de la peau, sans que cette quantité soit toxique.
Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est utilisé, de préférence dilué dans un solvant cosmétique, à un poids sec compris entre 5 à 15 g/kg.
Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est présent dans la composition à une concentration de 0,1 à 5 %en poids par rapport au poids total de la composition.
Un milieu physiologiquement acceptable désigne un véhicule adapté pour une mise en contact avec les couches externes de la peau ou des muqueuses, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire ou réaction d'intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable.
La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.
Préférentiellement , les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, sans risque d' inconfort lors de leur application et couvrent toutes les formes cosmétiques adaptées.
Par application topique, on désigne le fait d'appliquer ou d'étaler l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention, et plus particulièrement une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse.
« Peau » désigne la peau du visage, notamment le contour des yeux et la bouche, le nez, le front, le cou, les mains, mais aussi la peau de l'ensemble du corps.
Les compositions pour la mise en œuvre de l'invention pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydro-alcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile- dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.
Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir également l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol.
A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20% du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80% en poids et de préférence de 5 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre nanocapsule ou microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.
Avantageusement, la composition selon l'invention peut comprendre, outre l'agent actif selon l'invention, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention. Selon l'invention, cet agent actif est défini comme un « agent actif additionnel ».
Par exemple, le ou les agents actifs additionnels peuvent être choisis parmi : les agents anti-âge, raffermissants, éclaircissants, hydratants, drainants, favorisant la microcirculation, exfoliants, desquamants, stimulant la matrice extracellulaire, activant le métabolisme énergétique, antibactériens, antifongiques, apaisants, anti-radicalaires , anti-UV, anti-acné, anti-inflammatoires, anesthésiques , procurant une sensation de chaleur, procurant une sensation de fraîcheur, amincissants.
De tels agents actifs additionnels peuvent être choisis dans les groupes comprenant :
- la vitamine A et notamment l'acide rétinoïque, le rétinol, le rétinol proprionate, le rétinol palmitate ;
- la vitamine B3 et plus particulièrement le niacinamide, le nicotinate de tocophérol ;
- la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, le panthénol ;
- la vitamine C, notamment l'acide ascorbique, l'ascorbyl glucoside, l'ascorbyl tétrapalmitate, magnésium et sodium ascorbyl phosphate ;
- les vitamines E, F, H, K, PP, le coenzyme Q10 ;
- les inhibiteurs de métalloprotéinase, ou un activateur des TIMP ;
- la DHEA, ses précurseurs et dérivés ;
les acides aminés tels que l'arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, méthionine et ses dérivés, composés acides aminés N-acylés ;
- les peptides naturels ou de synthèse, incluant les di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés lipophiles, isomères et complexés avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (par exemple cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres) . A titre d'exemples, on peut citer les peptides commercialement connus sous le nom de MATRIXYL®, ARGIRELINE®, CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™, COLLAXYL ™ (brevet FR2827170, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 01™ (brevet FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02™ (brevet FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide™ (brevet FR2846883, ASHLAND®) ou encore le peptide de synthèse de séquence Arg-Gly-Ser-NH2 , commercialisé sous le nom ATPeptide™ par ASHLAND® ;
- l'extrait d' Artémia salina, commercialisé sous le nom
GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®) ;
- les extraits peptidiques végétaux tels que les extraits de lin (Lipigénine™, brevet FR2956818, ASHLAND®), les extraits de soja, d'épeautre, de vigne, de colza, de lin, de riz, de maïs, de pois ;
- les extraits de levures, par exemple le Dynagen™, (brevet FR2951946, ASHLAND®) ou 1 ' Actopontine™ (brevet FR2944526, ASHLAND®) ;
- l'acide déhydroacétique (DHA) ;
- les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle ;
- l'acide salicylique et ses dérivés, les alpha- et bêta- hydroxyacides , les silanols ;
- les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acetyl galactosamine ;
- les extraits de polyphénols, isoflavones, flavonoïdes, tels que les extraits de raisin, les extraits de pin, les extraits d'olive ; - les lipides tels que les céramides ou les phospholipides, les huiles d'origine animale, telles que le squalène ou le squalane ; les huiles végétales, telles que l'huile d'amande douce, de coprah, de ricin, de jojoba, d'olive, de colza, d'arachide, de tournesol, de germes de blé, de germes de maïs, de soja, de coton, de luzerne, de pavot, de potiron, d'onagre, de millet, d'orge, de seigle, de carthame, de passiflore, de noisette, de palme, de noyau d'abricot, d'avocat, de calendula ; les huiles végétales éthoxylées, le beurre de karité ;
- tous écrans UV et filtres solaires ;
- l'AMP cyclique et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase , l'extrait de Centella asiatica, 1 ' asiaticoside et l'acide asiatique, les méthyls xanthines, la théine, la caféine et ses dérivés, la théophylline, la théobromine, la forskoline, l'esculine et l' esculoside, les inhibiteurs d'ACE, le peptide Val-Trp, 1 ' inhibiteurs du neuropeptide Y, 1 ' enkephaline , l'extrait de Ginkgo biloba, l'extrait de dioscorea, la rutine, l'extrait de yerba mate, l'extrait de guarana, les oligosaccharides , les polysaccharides , la carnitine, l'extrait de lierre, l'extrait de fucus, l'extrait hydrolysé de Prunella vulgaris, l'extrait hydrolysé de Celosia cristata, l'extrait d' Anogeissus leiocarpus, l'extrait de feuilles de Manihot utilissima, la palmitoylcarnitine, la carnosine, la taurine, l'extrait de sureau, les extraits d'algue tel que l'extrait de Palmaria Palmata.
A titre d'illustration, il est mentionné ci-après des exemples de formulations d'une composition cosmétique contenant un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu selon l'invention : Exemple 5 : Baume pour le contour des yeux
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Procédé de préparation:
1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal jusqu'à ce qu'elle soit claire ;
2. A 25°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser pendant 10 minutes jusqu'à homogénéité ;
3. A 25°C, préparer la phase C dans un bêcher à part, mélanger jusqu'à homogénéité. Saupoudrer dans la phase D et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
4. A 25°C, ajouter la phase C + D dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
5. À 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
6. A 25°C, Prémélanger la phase F, l'ajouter dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
7. Arrêter à 25°C. La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème nacré violet, avec un pH compris entre 5,70 et 6,20 et une viscosité (D0) de 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 6 : Crème riche
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau purifiée Aqua Qsp 100
Optiphen™ Plus Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol 1, 50 preservative (and) Sorbic Acid
Phase B
Stabileze™ QM polymer PVM/MA Decadiene Crosspolymer 0,15
Phase C
Glyceryl Stéarate (and) Behenyl Alcohol
(and) Palmitic Acid (and) Stearic Acid
ProLipid™ 141 lamellar gel (and) Lecithin (and) Lauryl Alcohol (and) 5, 00
Myristyl Alcohol (and) Cetyl Alcohol
Ceraphyl™ 494 ester Isocetyl Stéarate 4, 00
Ceraphyl™ SLK ester Isodecyl Neopentanoate 4, 00
DC 580 Wax Stearoxytrimethylsilane (and) Stearyl 2, 00
Alcohol
Emulsynt™ GDL ester Glyceryl Dilaurate 3, 00
Phase D
Gransil DM-5 Dimethicone (and) Polysilicone-11 3, 00
Phase E
Hydroxyde de sodium Sodium Hydroxide 0, 04
Eau purifiée Aqua 0, 50
Phase F
PF Bois Précieux Parfum/Fragrance 0, 30
CI 77491 (Iron oxides) (and) Isopropyl
Titanium Triisostearate (and) Bis-
Unipure* Red LC 381 ADT-C Hydroxyethoxypropyl Dimethicone (and) 0, 03
PEG-2-Soyamine (and) Isophorone
Diisocyanate
Phase G
Extrait selon l'exemple 1 Water/Aqua (and) Glycerin (and) 3, 00
Peucedanum Graveolens (Dill) extract
Ronaflair Balance Gold CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 0, 30
(and) Tin Oxide
Covabead Velvet 10 Polymethyl Methacrylate 1, 00
Ronaflair Balance Red CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 1,20
(and) Tin Oxide
Phase H
Eau purifiée Aqua 15,00
Natrosol™ Plus 330 CS Cetyl Hydroxyethylcellulose 0, 50 Procédé de préparation:
1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal et commencer à chauffer à 75-80°C ;
2. A 30°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser tout en chauffant ;
3. Dans un bêcher à part, préparer la phase C, chauffer à 75- 80°C jusqu'à homogénéité ;
4. A 75°C, ajouter la phase C dans le récipient principal et homogénéiser pendant 10 minutes ;
5. Laisser refroidir la température et ajouter la phase D à 65°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;
6. Prémélanger la phase E avant de l'ajouter dans le récipient principal ;
7. Ajouter la phase E à 60°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;
8. A 35°C, prémélanger la phase F avant de l'ajouter et de bien mélanger ;
9. Prémélanger la phase G avant de l'ajouter dans le récipient principal ;
10. Ajouter la phase G à 35°C. Bien mélanger pour homogénéiser ;
11. Dans un bêcher à part, préparer la phase H: saupoudrer Natrosol™ dans l'eau à température ambiante et homogénéiser tout en chauffant à 60°C ;
12. Ajouter la phase H à 30°C. Bien mélanger pour homogénéiser ; 13. Arrêter à 25°C.
La composition se présente ainsi sous forme d'une crème beurre rose, avec un pH compris entre 4,90 et 5,40 et une viscosité (D0) de 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT/Spindle D/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 7: Sérum visage
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau purifiée Aqua Qsp 100 Propylène Glycol Propylène Glycol 35, 10
SD Alcohol 40B Absolute Alcohol 10, 00
Butylène Glycol Butylène Glycol 5,00
EDTA disodique Disodium EDTA 0,10
Phase B
Flexithix™ polymer PVP 2,00
Phase C
Gomme xanthane Xanthan Gum 0,25
Phase D
Sodium Polyacrylate (and) Hydrogenated
Rapithix™ A-60 polymer 1,00
Polydecene (and) Trideceth-6
Rokonsal™/LiquaPar™ MEP Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and)
0,70 préservâtive Ethylparaben (and) Propylparaben
Phase E
Extrait selon l'exemple 1 Water/Aqua (and) Glycerin (and) 5,00
Peucedanum Graveolens (Dil) extract
Phase F
Cyclopentasiloxane Cyclopentasiloxane 6,00
DM 350 Dimethicone 3,00
Dimethicone (and) Cyclopentasiloxane
Gransil* DMCM-5 1,50
(and) Polysilicone-11
Vinyl Dimethicone/Methicone
KSP* 100 1,00
Silsesquioxane Crosspolymer
Phase G
Unicert* Yellow 08006-J Water/Aqua (and) CI 15985 (Yellow 6) 0, 60
Procédé de préparation :
1. Dans un bêcher à température ambiante, peser les ingrédients de la phase A et mélanger. Saupoudrer la phase B et homogénéiser ;
2. A température ambiante, saupoudrer dans la phase C et continuer à homogénéiser l'ensemble ;
3. A température ambiante, ajouter la phase D à la phase ABC et continuer à homogénéiser ;
4. A température ambiante, ajouter la phase E et homogénéiser ;
5. A température ambiante, ajouter la phase F et homogénéiser l'ensemble ;
6. A température ambiante, ajouter la phase G et mélanger jusqu'à homogénéité ;
7. Arrêter à 25°C. La composition se présente ainsi sous forme d'un gel lisse, translucide, jaune crème, avec un pH compris entre 6,30 et 7,10 et une viscosité (DO) de 10000 - 15000 cps (Brookfield RVT/Spindle B/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 8 : Masque anti-âge
Procédé de préparation:
1. A 25°C, homogénéiser la phase A dans le récipient principal ; 2. A 25°C, saupoudrer dans la phase B et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
3. A 25°C, ajouter la phase C et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
4. Prémélanger la phase D dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal à 25°C ; 5. A 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et bien mélanger ;
6. Prémélanger la phase F et l'ajouter lentement. Bien mélanger bien jusqu'à homogénéité ;
7. Prémélanger la phase G dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal jusqu'à homogénéité ;
8. Arrêter à 25°C.
La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème avec des effets vert scintillant, avec un pH compris entre 5,30 et 5, 80 et une viscosité (D0) de 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 9 : Sérum
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Procédé de préparation :
1. Ajouter de l'eau dans le récipient principal et de commencer le mélange avec une pale d'hélice hi-lo ;
2. Ajouter le reste des ingrédients, un après l'autre tout en mélangeant entre chaque addition. La composition se présente ainsi sous forme d'un sérum lisse, semi-opaque, avec un pH compris entre 5,75 et 6,25 et une viscosité (DO) de 1,100 - 1,400 cps (Brookfield RVT/spindle 3/20 rpm/25° C/l minute) .
Les compositions cosmétiques décrites ci-dessus peuvent être utilisées pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou améliorer l'hydratation cutanée.
On entend par « améliorer l'aspect de la peau » que le grain de la peau apparaît plus fin, la luminosité plus intense et le teint plus homogène.
Par « signes du vieillissement cutané » on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, les crevasses, les poches sous les yeux, les cernes, le flétrissement, la perte d'élasticité, de fermeté et/ou de tonus de la peau, mais également toutes modifications internes de la peau qui ne se traduisent pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement de la peau, ou toutes dégradations internes de la peau consécutives à des stress environnementaux tels que la pollution et les rayonnements UV.
On entend par « amélioration de l'hydratation cutanée », toutes améliorations des modifications de l'aspect extérieur de la peau dues à la déshydratation comme, par exemple, la sécheresse, les tiraillements et l' inconfort.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'un extrait aqueux des parties aériennes d' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir d'une matière végétale comprenant les étapes suivantes :
a) on met en présence des parties aériennes d' Anethum graveolens avec de l'eau ;
b) on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) à un pH compris entre 10,5 et 11 ;
c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;
d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale solide résiduelle et obtenir un extrait brut aqueux purifié ; et
e) on contrôle le pH et on le réajuste si nécessaire à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que dans l'étape a) on met en présence la matière végétale, préalablement séchée puis broyée, avec de l'eau dans un rapport matière végétale / eau compris entre 4 et 20% (poids/poids) .
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l'étape b) de traitement par l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique est réalisée sous agitation pendant un temps d'au moins lh et à une température comprise entre 20 et 80°C.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'à l'étape d) on centrifuge le mélange obtenu en c) .
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'étape e) est précédée par au moins une filtration de l'extrait brut aqueux obtenu en d) et préférentiellement par des filtrations successives de l'extrait brut aqueux en abaissant le seuil de filtration de 20-50 μηι à 0,1-0,30 μπι.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en EDTA tétrasodique est comprise entre 2 et 15 mM, préférentiellement 10 mM.
7. Extrait aqueux de partie aérienne d' aneth enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et dépourvu d'ADN, obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en poids du poids total de l'extrait, 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,2 à 3 g/kg d'acides aminés, 100 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et ne comprend pas d'ADN.
8. Extrait selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est dilué dans un solvant et comprend en poids du poids total de l'extrait, 5-15 g/kg d'extrait sec, de 50 à 1000 mg/kg de polyphénols 0,5-10 g/kg de fragments protéiques, 0,5-10 g/kg de sucres, de 0,1 à 1 g/kg d'acides aminés et 10-100 mg/kg de petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
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