EP3445846A1 - IN-VITRO VOLLHAUTMODELL, ENTHALTEND DREIDIMENSIONALE ZELLKULTURMODELLE DER SCHWEIßDRÜSE - Google Patents

IN-VITRO VOLLHAUTMODELL, ENTHALTEND DREIDIMENSIONALE ZELLKULTURMODELLE DER SCHWEIßDRÜSE

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Publication number
EP3445846A1
EP3445846A1 EP17713202.4A EP17713202A EP3445846A1 EP 3445846 A1 EP3445846 A1 EP 3445846A1 EP 17713202 A EP17713202 A EP 17713202A EP 3445846 A1 EP3445846 A1 EP 3445846A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sweat gland
equivalent
medium
equivalents
skin
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17713202.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Patricia Klaka
Sabine GRÜDL
Melanie Giesen
Thomas Welss
Bernhard Banowski
Lars VIERKOTTEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP3445846A1 publication Critical patent/EP3445846A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C12N5/063—Kereatinocyte stem cells; Keratinocyte progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0633—Cells of secretory glands, e.g. parotid gland, salivary glands, sweat glands, lacrymal glands
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to an in-vitro full-skin model with a dermis and an epidermis equivalent, wherein in the dermis and / or Epidermisäquivalent 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalency with 500 to 500,000 sweat gland cells and a diameter of 100 to 6000 ⁇ , are included.
  • the sweat gland equivalents into the in vitro full-skin models according to the invention, the in-vivo situation in the human skin can be adjusted very well.
  • the cell-cell interactions present in vivo between the different cell types can be very well mapped since the three-dimensional sweat gland equivalents retain their function even after incorporation into the full-thickness model.
  • the present invention relates to a method for producing an in vitro full-skin model, in which first a dermis equivalent is provided on a carrier layer. Subsequently, an epidermis equivalent is applied to this dermis equivalent.
  • the introduction of the three-dimensional sweat gland equivalents in the in vitro full skin model takes place during the provision of dermis and / or Epidermisäquivalents.
  • the present invention relates to the use of an in vitro full-skin model according to the invention in cosmetics and personal care, in particular for testing, identifying and testing cosmetic active ingredients, preferably with regard to their effectiveness in inhibiting sweat secretion and / or body odor, and also Evaluation of the influence of cosmetic agents on the inhibition and / or reduction of sweat secretion and / or body odor.
  • the present invention relates to a system, in particular test system, which comprises an in vitro full-skin model according to the invention.
  • washing, cleansing and caring for one's own body is a basic human need, and modern industry is constantly trying to meet these needs of man in a variety of ways.
  • Especially important for daily hygiene is the permanent elimination or at least reduction of body odor and underarm wetness.
  • Underarm wetness and body odor are caused by the secretion of eccrine and apocrine sweat glands in the human axilla. While the eccrine glands serve to thermoregulate the body and cause the onset of underarm wetness, the apocrine glands secrete viscous secretions in response to stress, resulting in unpleasant body odor due to bacterial decomposition.
  • Sweat glands can then be divided into apocrine and eccrine sweat glands and a mixed form of apocrine and eccrine sweat glands (also referred to as apoekkrine sweat gland).
  • the aforementioned forms can be distinguished by morphological and characteristic features.
  • the eccrine sweat gland in particular the human eccrine sweat gland, is one of the unbranched tubular tubular glands and can be in the secretory tail (also referred to as a coil), the dermal Ausfgang (also referred to as a duct) and the epidermal output (also known as Acrosyringium) divide.
  • the cells present in these glandular sections have different functions and functions, such as, for example, secretion in the coil, reabsorption of ions in the duct and release of the secretion, in particular of sweat, to the surrounding skin by the acrosyringium.
  • the eccrine sweat glands are stimulated by the neurotransmitter acetylcholine (ACh).
  • cosmetic compositions which are able to reliably prevent underarm wetness and / or body odor and which contain neither antibacterial agents nor the aluminum and / or aluminum-zirconium salts used in the prior art.
  • One way to provide such agents is to use substances that effectively inhibit the stimulation of the sweat glands and thus reduce or prevent sweat secretion.
  • in-vivo tests can be carried out with test participants.
  • such assays are expensive and do not allow high throughput screening methods.
  • sweat gland cell models can be used to study the influence of test substances on sweat gland stimulation. Such models must simulate the in-vivo situation as accurately as possible, be standardized and cost-effective and enable screening methods with high throughput rates.
  • a three-dimensional sweat gland model known in the art is exemplified by Li (Li et al., "Matrigel the Membrane Matrix Induces eccrine Sweat Gland Cells to Reconstitute Sweat Gland-like Structures in Nude Mice”; Experimental Cell Research, 2015, 332, pages 67 to 77)
  • primary sweat gland cells are cultured with growth factors in a gel-like substance (Matrigel®) and then implanted into the back of living mice. After implantation, spheroid structures are formed which express sweat gland specific marker proteins. Since the use of mice is required to form the differentiated structures, this model can not be used in cosmetic and pharmaceutical research where the use of experimental animals is prohibited.
  • full-skin models which in addition to a dermis and an epidermis also contain sweat glands known.
  • models By punching out samples of native adult human skin, models are obtained which contain all the skin appendages in this area of the skin, including sweat glands.
  • Such models are also referred to as ex-vivo full-skin models.
  • a disadvantage of these models is their low standardizability, since control of the exact number of sweat glands is not possible and also the characteristics of the model depend on the particular donor.
  • in vitro full-skin models which have similar, preferably identical, histological architecture to human skin and which can be prepared using only in vitro methods. Furthermore, it is desirable if these in-vitro full-skin models can be standardized and produced inexpensively and are suitable for use in high-throughput screening methods.
  • the present invention therefore an object of the invention to provide an in vitro full skin model (hereinafter referred to as skin equivalent) whose cell structure and cell-cell interactions have a high similarity to the cell structure and cell-cell interactions of native skin and which can only be produced by in-vitro methods. Furthermore, this model should be inexpensive to produce, be standardized and are suitable for use in screening methods with high throughput.
  • models can be obtained by introducing three-dimensional sweat gland equivalents into a dermis and / or epidermis equivalent of a skin equivalent, in which the cell-cell interactions between the different cell types almost correspond to those in the native skin.
  • the production takes place exclusively by in-vitro methods and allows a high standardizability as well as an economical production of the skin equivalents. Therefore, these skin equivalents are particularly suitable for use in high throughput screening methods for testing antiperspirant substances for use in cosmetics and pharmacy.
  • a first subject of the present invention is thus an in vitro full-skin model comprising a) at least one carrier layer comprising at least one collagen matrix
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells and having a diameter of 100 to 6,000 ⁇ each.
  • the introduction of the three-dimensional sweat gland equivalents replaces the cell-cell interactions present in human skin. Therefore, these models map the in-vivo situation very well, so the results obtained with these models are more relevant than the results obtained from full-skin models without sweat gland equivalents.
  • the eccrine sweat gland cells contained in the three-dimensional sweat gland equivalents have a potential stem cell activity in wound healing, so that further processes occurring in the skin can be investigated with the skin equivalent according to the invention.
  • cultured cells to prepare the skin equivalent high standardization can be achieved since a variety of skin equivalents having the same property can be produced from the cultured cells.
  • the introduction of a precisely determinable number of three-dimensional sweat gland equivalents also ensures a high degree of standardizability.
  • an in-vitro full-skin model (hereinafter also referred to as skin equivalent) is a model of the skin which was produced exclusively using in vitro methods and has both a stratified epidermis and a dermis, a basal membrane interposed between the skin Dermis and the epidermis is located.
  • carrier layer is understood as meaning a self-supporting layer which serves as a substrate for the dermal equivalent of the dermal equivalent of the invention this layer is a collagen matrix, whereby a collagen matrix is understood as meaning a spatial network of collagen, which preferably has pores, but does not include a matrix which is formed by the collagen produced by the fibroblasts of the dermis.
  • a dermis equivalent in the context of the present invention is understood to mean a fibroblast fibrous-like layer which largely corresponds to the native dermis.
  • an epidermis equivalent in the context of the present invention is understood to mean a preferably multilayered layer of keratinocytes in the form of a stratified epidermis which largely corresponds to the native epidermis.
  • the cohesion between the collagen braid and the laminin network is preferably ensured by Perlecan (a proteoglycan formed from heparin sulfate) and entactin (also referred to as nidogen).
  • a three-dimensional sweat gland equivalent is understood to mean a cell model of sweat gland cells which has an extension in all three spatial directions and in which the cells exhibit a similar function, in particular an identical function, as cells of a native sweat gland.
  • the in vitro full-skin model according to the invention comprises a carrier layer which contains a collagen matrix.
  • the skin equivalent as the carrier layer preferably has a matrix of specific collagen compounds.
  • the collagen matrix comprises a sparingly soluble collagen, in particular a sparingly soluble collagen from tendons of horses, pigs or cattle.
  • sparingly soluble collagen is understood to mean coarse-fiber collagen which has no visible or only slight swelling or no or only slight gel formation, in particular no gel formation, in the aqueous medium for at least 5 hours.
  • Such collagen is preferably obtained from the tendons of animals, in particular mammals, preferably horses, pigs or cattle, most preferably from the Achilles tendon or the skin of wrestlers, in particular from the Achilles tendon of cattle.
  • the matrix used as a carrier layer is formed from lyophilized sparingly soluble collagen.
  • the collagen matrix comprises a lyophilized sparingly soluble collagen, in particular a lyophilized sparingly soluble collagen from tendons of horses, pigs or cattle.
  • lyophilized sparingly soluble collagen is understood to mean a sparingly soluble collagen which has been obtained by freeze-drying a homogeneous suspension of this sparingly soluble collagen in a solvent, preferably water.
  • Freeze-drying is also referred to as sublimation drying and stands for the drying of a deep-frozen material in a high vacuum by freezing the solvent, preferably in the form of water, which then evaporates in the frozen state.
  • This collagen matrix of lyophilized sparingly soluble collagen particularly preferably has a skin with pores on the surface. These pores lead to a Particularly good colonization of the carrier material with fibroblasts during the formation of the dermis equivalent, so that a disturbance during differentiation of the fibroblasts required to form the Dermisäquivalents is avoided.
  • the collagen matrix of the carrier layer contains a specific total amount of collagen.
  • Preferred embodiments of the present invention are therefore characterized in that the collagen matrix has a total amount of collagen, in particular lyophilized sparingly soluble collagen, of from 0.5 to 5.0% by weight, preferably from 0.8 to 3.5% by weight. , preferably from 0.8 to 2.5 wt .-%, in particular from 0.8 to 1, 2 wt .-%, based on the total weight of the collagen matrix contains.
  • Carrier layers which contain the aforementioned total amount of collagen, in particular lyophilized sparingly soluble collagen lead to an effective stabilization of the skin equivalent according to the invention and in this way allow a good handling of the equivalents.
  • the use of crosslinked collagen matrices has proven itself.
  • the avoidance of shrinkage ensures a high degree of standardizability, since the application of the test substances can always take place on an equally large surface. As a result, concentration fluctuations are avoided after application of the test substances.
  • the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix.
  • the crosslinking of the collagen matrix can be carried out, for example, by means of chemical or physical methods.
  • chemical crosslinking in particular chemical crosslinking agents are used, the physical crosslinking can be done for example by means of UV irradiation or dehydrothermal crosslinking (also referred to as DHT).
  • the crosslinking of the collagen matrix is effected by means of chemical crosslinking agents. It is therefore preferred in the context of the present invention if the crosslinking of the collagen matrix by means of a chemical crosslinking agent from the group of glutaraldehyde, p-benzoquinone, dimehtyladipimidate, dimethylpimelinidate, dimethylsuberimidate, 1, 4-phenylenediisothiocyanate, polyoxyethylene bis (imidazolyl carbonyl), bis [polyoxyethylene bis (imidazolyl carbonyl)] and suberic acid bis (N-hydroxysuccinimide ester), 1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide, enzymes and mixtures thereof, in particular glutaraldehyde.
  • a chemical crosslinking agent from the group of glutaraldehyde, p-benzoquinone, dimehtyladipimidate, dimethylpimelinidate, dimethylsuberimidate
  • the in vitro full-skin model according to the invention comprises a dermis equivalent.
  • This dermis equivalent is preferably formed from dermal fibroblasts.
  • Preferred embodiments of the present invention are therefore characterized in that the dermis equivalent is formed from primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts.
  • Primary fibroblasts are understood to be naturally occurring fibroblasts, in particular occurring in the human dermis, genetically modified fibroblasts, fibroblasts resulting from spontaneous mutation or their precursors.
  • Precultured human primary fibroblasts are particularly preferably used to form the dermis equivalent.
  • Precultivated human primary fibroblasts can be obtained by cultivating the human primary fibroblasts, wherein the cultivation preferably takes place in vitro with the proliferation of the cells.
  • a DMEM medium Dulbecco 's Modified Eagle Medium
  • the dermis equivalent contains a specific total number of primary fibroblasts. It is therefore preferred in the context of the present invention, when the dermis primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts in a total cell count of 5x10 5 to 6x10 6, preferably 6x10 5 to 5x10 6, more preferably 7x10 5 to 4x10 6, contains.
  • Dermis equivalents containing the aforementioned total cell numbers of primary fibroblasts have a differentiation that is very similar to the differentiation in the dermis of the human skin. This ensures that the in-vitro full-skin models according to the invention simulate the in-vivo situation as accurately as possible.
  • the in vitro full-skin model according to the invention contains at least one epidermis equivalent.
  • This epidermis equivalent is preferably formed from primary keratinocytes.
  • keratinocytes are understood as meaning cells of the epidermis which form a keratinized squamous epithelium, genetically modified keratinocytes, keratinocytes resulting from spontaneous mutation and their precursors. Since the formation of a well-differentiated epidermis equivalent with intact keratinization depends on the proportion of basal stem cells in the keratinocytes used to form the epidermis equivalent, it is preferred to use largely undifferentiated keratinocyte stem cells from untreated biopsy tissue.
  • the epidermis equivalent is formed from primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes.
  • the epidermis equivalent is preferably formed from precultured keratinocytes, which are obtained by culturing primary keratinocytes, preferably by increasing these cells.
  • precultured keratinocytes which are obtained by culturing primary keratinocytes, preferably by increasing these cells.
  • the epidermis equivalent has several mutually different cell layers.
  • the epidermis equivalent comprises a plurality of mutually different cell layers, in particular at least two differently differentiated cell layers and at least one keratinized cell layer.
  • the term "multiple cell layers” is understood to mean at least two mutually different cell layers, in particular 2 to 20 mutually different cell layers.
  • the presence of different cell layers in the epidermis can be determined by means of a light microscope 2 to 10 different cell layers, wherein at least one of these cell layers is selected from stratum corneum, stratum spinosum and stratum granulosum.
  • the epidermis equivalent contains a specific total cell number of primary keratinocytes. It is therefore preferred within the scope of the present invention for the epidermis equivalent to contain primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, in a total cell number of 4x10 5 to 5 ⁇ 10 6 , preferably of 5.5 ⁇ 10 5 to 4 ⁇ 10 6 , in particular of 6.5 ⁇ 10 5 to 3, 5x10 6 , contains.
  • Epidermis equivalents containing the aforementioned total cell numbers of primary keratinocytes have a differentiation which is very similar to the differentiation in the epidermis of the human skin. This ensures that the in-vitro full-skin models according to the invention simulate the in-vivo situation as accurately as possible.
  • the full-skin model according to the invention comprises a basal membrane, which is located between the dermis and the epidermis equivalent.
  • the basal membrane of the full-skin model comprises certain proteins.
  • Preferred embodiments of the present invention are therefore characterized in that the basal membrane comprises proteins from the group of laminin, collagen type IV and their mixture. Basal membranes containing the previously mentioned proteins lead to a particularly effective connection between the dermis and the epidermis equivalent and in this way ensure good stability and handling of the full-skin models according to the invention.
  • the full-skin models according to the invention preferably contain 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents.
  • the incorporation of the three-dimensional sweat gland equivalents allows an improved representation of the in vivo situation in human skin compared to full-skin models containing no sweat glands or sweat gland equivalents.
  • the incorporation of an equal number of discrete sweat gland equivalents also allows the production of standardizable full-skin models compared to the use of punch biopsies with a varying number of sweat glands in each of these biopsies.
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 2 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents, preferably 5 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents, preferably 20 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents, in particular 50 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents.
  • the discrete three-dimensional sweat gland equivalents contained in the full-skin model according to the invention can be prepared for example by means of the hanging drop method from primary sweat gland cells using only in vitro methods.
  • sweat glands from skin biopsies in particular native eccrine and / or apocrine sweat glands from skin biopsies, are first isolated.
  • the isolation can be carried out by enzymatic digestion of the human skin using a mixture of 2 to 3 mg / ml collagenase II and 0.1 to 0.2 mg / ml thermolysin for 3 to 6 hours at 35 to 40 ° C, especially at 37 ° C, done.
  • primary sweat gland cells can be obtained.
  • the three-dimensional sweat gland equivalents are preferably contained in the dermis equivalent.
  • the incorporation of these sweat gland equivalents into the dermis equivalent allows a better readjustment of the in vivo situation. It is therefore advantageous according to the invention if the dermis equivalent b) comprises the three-dimensional sweat gland equivalents.
  • the dermis equivalent b) comprises the three-dimensional sweat gland equivalents.
  • Three-dimensional sweat gland equivalents which have specific diameters, are preferably contained in the full-thickness skin model according to the invention. It is therefore advantageous according to the invention if the three-dimensional sweat gland equivalents each have a Diameter of 100 to 4,000 ⁇ , preferably from 100 to 3,000 ⁇ , in particular from 200 to 2,500 ⁇ have.
  • the indication of the diameter here refers to the diameter of a single three-dimensional sweat gland equivalent.
  • the diameter of the spherical sweat gland equivalents according to the invention can be carried out for example by means of microscopic measurement using the software "CellSens".
  • the sweat gland equivalents contained in the full-skin model according to the invention are free of matrix compounds and / or carriers.
  • matrix compounds are meant compounds which are capable of forming spatial networks. However, this does not include the substances produced and excreted by the cells themselves, which are capable of forming spatial networks.
  • carriers within the meaning of the present invention are understood as meaning self-supporting substances which can serve as a support or framework for the sweat gland cells.
  • the three-dimensional sweat gland equivalents are each free of matrix compounds and / or carriers, in particular free of matrix compounds and carriers.
  • the term "free of” is understood in accordance with the invention to mean that the three-dimensional sweat gland equivalents contain less than 1% by weight, based on the total weight of the three-dimensional sweat gland equivalent, of matrix compounds and / or carriers It is therefore advantageous for the purposes of the present invention the three-dimensional sweat gland equivalent 0 to 1 wt .-%, preferably 0 to 0.5 wt .-%, preferably 0 to 0.2 wt .-%, in particular 0 wt .-%, based on the total weight of the three-dimensional sweat gland equivalent, of matrix compounds and carriers.
  • the three-dimensional sweat gland equivalents are free of certain matrix compounds and carriers. It is therefore preferred if the three-dimensional sweat gland equivalent contains no matrix compounds and / or carriers which are selected from the group of collagens, in particular collagen type I and / or type III and / or type IV, scleroproteins, gelatins, chitosans, glucosamines, glucosaminoglucans (GAG), heparin sulfate proteoglucans, sulfated glycated proteins, growth factors, cross-linked polysaccharides, cross-linked polypeptides and mixtures thereof.
  • collagens in particular collagen type I and / or type III and / or type IV, scleroproteins, gelatins, chitosans, glucosamines, glucosaminoglucans (GAG), heparin sulfate proteoglucans, sulfated glycated proteins, growth factors, cross-linked polysacc
  • the three-dimensional sweat gland equivalents contained in the skin equivalent according to the invention are equivalents of the eccrine and / or apocrine human sweat gland.
  • Preferred embodiments of the present invention are therefore characterized in that the three-dimensional sweat gland equivalents are each three-dimensional sweat gland equivalents of the eccrine and / or apocrine human sweat gland.
  • Full-skin models containing such sweat gland equivalents are particularly suitable for the identification of antiperspirant active ingredients for in vivo use in humans.
  • At least one carrier layer comprising at least one collagen matrix, the collagen matrix containing a total amount of lyophilized sparingly soluble collagen of from 0.8 to 1.2% by weight based on the total weight of the collagen matrix, and wherein the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix .
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells and having a diameter of 100 to 6,000 ⁇ each.
  • a particularly preferred embodiment of this subject of the invention is thus an in vitro full-skin model comprising
  • At least one carrier layer comprising at least one collagen matrix, the collagen matrix containing a total amount of lyophilized sparingly soluble collagen of from 0.8 to 1.2% by weight based on the total weight of the collagen matrix, and wherein the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix .
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells and having a diameter of 100 to 6,000 ⁇ each.
  • a particularly preferred embodiment of this subject of the invention is an in vitro full-skin model comprising a) at least one carrier layer comprising at least one collagen matrix, the collagen matrix containing a total amount of lyophilized sparingly soluble collagen of from 0.8 to 1.2% by weight based on the total weight of the collagen matrix, and wherein the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix .
  • the epidermis equivalent is formed from human primary keratinocytes and wherein the epidermis equivalent comprises at least two differently differentiated cell layers and at least one keratinized cell layer
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells and having a diameter of 100 to 6,000 ⁇ each.
  • a particularly preferred embodiment of this subject of the invention is an in vitro full-skin model comprising
  • At least one carrier layer comprising at least one collagen matrix, the collagen matrix containing a total amount of lyophilized sparingly soluble collagen of from 0.8 to 1.2% by weight based on the total weight of the collagen matrix, and wherein the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix .
  • the epidermis equivalent is formed from human primary keratinocytes and wherein the epidermis equivalent comprises at least two differently differentiated cell layers and at least one keratinized cell layer
  • this basement membrane being between the dermis equivalent and the epidermis equivalent and the basal membrane comprising proteins from the group of laminin, collagen type IV and their mixture,
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells and having a diameter of 100 to 6,000 ⁇ each.
  • a particularly preferred embodiment of this subject of the invention is an in vitro skin model comprising a) at least one carrier layer comprising at least one collagen matrix, the collagen matrix containing a total amount of lyophilized sparingly soluble collagen of from 0.8 to 1.2% by weight based on the total weight of the collagen matrix, and wherein the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix .
  • the epidermis equivalent is formed from human primary keratinocytes and wherein the epidermis equivalent comprises at least two differently differentiated cell layers and at least one keratinized cell layer
  • this basement membrane being between the dermis equivalent and the epidermis equivalent and the basal membrane comprising proteins from the group of laminin, collagen type IV and their mixture,
  • the dermis equivalent b) comprises 50 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents, the three-dimensional sweat gland equivalents each comprising 500 to 500,000 sweat gland cells having a diameter of 200 to 2,500 ⁇ each and wherein the three-dimensional sweat gland equivalents are each three-dimensional sweat gland equivalents of the eccrine and / or apocrine human sweat gland.
  • the in vitro full-skin models according to the invention have a higher standardizability and availability than the punch biopsies currently used and have a greater proximity to the in-vivo situation than full-skin models which contain no sweat glands and / or sweat gland equivalents. Furthermore, these skin equivalents represent a cost-effective alternative to in vivo studies in humans, since these skin models, the antiperspirant effect of test substances can be examined, for example by comparing gene expression or protein expression in a stimulation with acetylcholine (ACh) in the presence and absence a specific test substance.
  • the full-skin models of the invention simulate human skin in vivo both in their structure and in their histological composition, so that the information obtained with these models is readily transferable to humans and can also be compared with data for compounds already tested in vivo.
  • a second aspect of the present invention is a method for producing an in vitro full-skin model, the method comprising the following steps in the order given:
  • step b) preparation of the carrier layer by lyophilization of the collagen suspension provided in step a), c) production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivation of these fibroblasts over a period of 7 to 28 days,
  • step d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days,
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • the term "suspension of sparingly soluble collagen” is understood as meaning a homogeneous mixture of solid collagen in a solvent, preferably water.
  • a solvent preferably water.
  • devices known to the person skilled in the art such as static mixers or Ultra Turrex mixers, can be used.
  • the term “culturing” means maintaining, preferably in vitro, the vital functions of cells, in particular of fibroblasts and keratinocytes, in a suitable environment, for example by adding and removing metabolic factors and products, in particular also by increasing the number of cells.
  • the suspension provided in process step a) contains a specific total amount of collagen.
  • Preferred embodiments of the method according to the invention are therefore characterized in that the suspension of sparingly soluble collagen in step a) a total amount of collagen from 0.2 to 4.0 wt .-%, preferably from 0.3 to 3.0 parts by weight. %, preferably from 0.4 to 2.0 wt .-%, in particular from 0.5 to 1, 5 wt .-%, based on the total weight of the suspension contains.
  • the use of suspensions with the above-mentioned total amounts of collagen leads to the formation of particularly stable carrier layers, so that a high stability and good handling of the full-skin models resulting from the process according to the invention is ensured.
  • the suspension of sparingly soluble collagen in step a) has a pH of from pH 0.1 to pH 6.9, preferably from pH 2.0 to pH 5, 0, preferably from pH 3.0 to pH 4.5, in particular from pH 3.5 to pH 4.0.
  • the use of suspensions with the abovementioned pH values leads to the formation of particularly stable carrier layers.
  • the collagen suspension is preferably added to containers whose dimensions correspond to those of the desired carrier layer.
  • Suitable containers are, for example, wells of microtiter plates.
  • suitable agents are, for example, gelatin, polylysine, fibrin or fibrinogen / thrombin or fibronectin.
  • the inner vessel walls are first wetted with the abovementioned agents and then dried, so that a layer of the agents adheres to the inner vessel surface. Subsequently, the collagen suspension is filled.
  • the lyophilization carried out in process step b) preferably takes place in these vessels. Furthermore, it is preferred according to the invention if the lyophilization takes place at a certain cooling rate. It is therefore preferred in the context of the present invention if the lyophilization of the collagen suspension in step b) at a cooling rate of 5 ° C to 40 ° C per hour, preferably from 10 ° C to 30 ° C per hour, preferably from 18 ° C. to 23 ° C per hour, in particular from 20 ° C to 22 ° C per hour, takes place.
  • the slow cooling rate results in the formation of a pellicle on the surface of the lyophilized carrier layer, the pellicle having pores on the surface.
  • a crosslinked collagen matrix is to be used as the carrier, the crosslinking of this matrix takes place after the lyophilization described in process step c).
  • the crosslinking agents described above in connection with the first subject of the invention are suitable for this purpose.
  • Glutaraldehyde is particularly preferably used for crosslinking. Due to the cross-linking, a shrinkage process of the full-skin models during production is avoided, so that a high reproducibility can be ensured due to the uniform size and nature.
  • fibroblasts of a suitable passage are pre-cultured in a cell culture flask and detached from the soil by trypsinization immediately prior to their use.
  • a nutrient medium for culturing the fibroblasts for example DMEM, which contains 10 wt .-% FCS can be used. It has been found to be advantageous according to the invention when certain total concentrations of fibroblasts are used to produce the dermis equivalent.
  • Preferred embodiments of the present invention are therefore characterized in that for the preparation of the dermis equivalent in step c) primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1x10 6 cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5 ⁇ 10 5 to 5, 5 ⁇ 10 5 cells per ml of medium.
  • the medium used is preferably a DMEM medium which contains 10% by weight of FCS.
  • human fibronection and / or laminin may additionally be added to the culture medium.
  • Fibronection is a structural or adhesion protein produced in fibroblasts, whose function in vivo consists in the binding of other macromolecules, for example collagen, and in the attachment of cells to neighboring cells.
  • Laminin is a protein of the basement membrane to which cells can adhere.
  • the addition of fibronection and / or laminin to the culture medium enhances the binding of the fibroblasts to the support layer as well as to one another.
  • the use of the aforementioned total concentrations ensures sufficient colonization of the carrier layer with the fibroblasts.
  • the cell count of the primary fibroblasts can be determined using a classical counting chamber and trypan blue.
  • the suspension of cultured primary fibroblasts is added undiluted with a trypan blue solution and determines the number of cells in the corresponding corner squares. From these values, the arithmetic mean is formed. Taking into account the volume of the counting chamber, the dilution factor and the chamber factor, the cell count per ml or ⁇ is determined from this mean value.
  • the cell number used in method step c) here refers to the number of living cells (live number).
  • the cultivation of the fibroblasts applied to the carrier layer in process step c) is preferably carried out in a submerged culture. This is understood to mean the cultivation of nutrient-solution-covered fibroblasts. By altering the cultivation conditions or by adding chemical substances, such as ceramides and vitamin C, to the medium, a barrier function can additionally be produced. It is preferred according to the invention if the cultivation of the primary fibroblasts, in particular the human primary fibroblasts, in step c) over a period of 8 to 25 days, preferably from 10 to 22 days, preferably from 1 1 to 20 days, in particular from 12 to 18 days, at a temperature of 30 to 40 ° C.
  • Keratinocytes used for the production of the epidermis equivalent is carried out by the methods known to the person skilled in the art. Keratinocytes of the first and / or second passage in a cell culture flask are preferably detached from the bottom by trypsinization immediately prior to their use.
  • a nutrient medium for cultivating the fibroblasts for example, a mixture of DMEM and Ham 's F12, which contains 1 to 30 wt .-% FCS and other serum products and additives can be used.
  • method step d) the application of keratinocytes to the dermis equivalent produced in method step c) takes place.
  • the use of the aforementioned total concentrations ensures sufficient colonization of the dermis equivalent with the keratinocytes.
  • the cell number can be determined as previously described in connection with the cell count of the fibroblasts.
  • the keratinocytes applied in method step d) are preferably cultured for a certain time in a submersed culture. It is therefore preferred in the context of the present invention if the cultivation of the primary keratinocytes, in particular of the human primary keratinocytes, in step d) in a submersed culture over a period of 1 to 8 days, preferably 1 to 6 days, preferably 1 to 4 days, in particular from 1 to 2 days, at a temperature of 30 to 40 ° C.
  • the keratinocytes are preferably seeded onto the carrier layer in a cell culture medium, particularly preferably DMEM / F12 medium, which contains about 1 to 30% by weight, based on the total weight of the medium, fetal calf serum (FCS), NCS, defined serum or Contains serum replacement products and various additives that promote the proliferation and differentiation of the cells.
  • a cell culture medium particularly preferably DMEM / F12 medium, which contains about 1 to 30% by weight, based on the total weight of the medium, fetal calf serum (FCS), NCS, defined serum or Contains serum replacement products and various additives that promote the proliferation and differentiation of the cells.
  • FCS fetal calf serum
  • NCS defined serum
  • the carrier layer with DMEM medium containing in particular EGF from the mouse or comparable preparations from other animals epidermal growth factor (hEGF) (eg in a concentration of 0.2 igl ⁇
  • Complete differentiation of the keratinocyte layers is achieved by culturing the keratinocytes at the medium-air interface. This type of cultivation is also referred to as an airlift culture, using DMEM without hEGF and BPE (bovine pituitary extract) as the culture medium.
  • an “airlift culture” is understood as meaning a culture in which the level of the nutrient medium level is precisely matched to the level of the dermis equivalent, while the cell layers formed by the keratinocytes lie above the nutrient medium level and are not covered by the nutrient medium, ie the cultivation takes place
  • the models are lifted from the wells of the microtiter plate and placed on filter papers which rest on metal spacers in Petri dishes, the medium is filled so high in the Petri dishes that it does not completely cover the filter paper, but that a liquid collar is present around the base of the skin models (also referred to as air-liquid interface)
  • a typical skin epidermis equivalent is formed s method is therefore characterized characterized in that the cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium limit over a period of 8 to 35 days, preferably from 9 to 30 days, preferably from 10 to 20 days, in particular from 10 to 13 days, at a temperature of 30 to 40 ° C.
  • the three-dimensional sweat gland equivalents are introduced in the process according to the invention in process step c) and / or d).
  • the incorporation of the sweat gland equivalents in process step c) during the production of the dermis equivalent is preferred according to the invention, since this allows the in vivo situation to be adjusted very well. It is therefore preferred according to the invention, if the introduction of the three-dimensional sweat gland equivalents in step c), wherein the primary fibroblasts, in particular the human primary fibroblasts, mixed with the three-dimensional sweat gland equivalents and then applied to the carrier layer produced in step b).
  • step d) it can also be provided according to the invention to introduce the three-dimensional sweat gland equivalents during step d) of the method according to the invention. It is therefore also preferred according to the invention if the introduction of the three-dimensional sweat gland equivalents takes place in step d), wherein the three-dimensional sweat gland equivalents are seeded 1 to 3 hours before application of the primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes.
  • the term "sewn" here is to be understood as meaning the application of the three-dimensional sweat gland equivalents to the surface of the dermis equivalent.
  • the introduction of 1 to 100 discrete sweat gland equivalents, each having a cell number of 500 to 500,000 cells and a diameter of 100 to 6,000 ⁇ m, is carried out in the aforementioned method steps c) and / or d).
  • a larger number of sweat gland equivalents with a small diameter is introduced into the full-skin models. It is therefore within the scope of the present invention preferred if in step c) and / or in step d), in particular in step c), 50 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents with a cell count of 500 to 500,000 sweat gland cells and a diameter of 500 to 2,500 ⁇ be introduced.
  • a particularly preferred embodiment of this subject matter is accordingly a process for the production of an in vitro full-skin model, the process comprising the following steps in the order given: a) providing a suspension of sparingly soluble collagen, wherein the suspension of poorly soluble collagen in step a) a total amount of collagen from 0.2 to 4.0 wt .-%, preferably from 0.3 to 3.0 parts by weight.
  • % preferably from 0.4 to 2.0 wt .-%, in particular from 0.5 to 1, 5 wt .-%, based on the total weight of the suspension, and wherein the suspension of sparingly soluble collagen in step a) a pH of from pH 0.1 to pH 6.9, preferably from pH 2.0 to pH 5.0, preferably from pH 3.0 to pH 4.5, especially from pH 3.5 to pH 4.0 , having,
  • step c) production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivation of these fibroblasts over a period of 7 to 28 days,
  • step d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days,
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • a further particularly preferred embodiment of this subject matter of the invention is accordingly a process for the preparation of an in vitro full-skin model, the process comprising the following steps in the order given:
  • step b) preparation of the carrier layer by lyophilization of the collagen suspension provided in step a), wherein the lyophilization of the collagen suspension in step b) at a cooling rate of 5 ° C to 40 ° C per hour, preferably from 10 ° C to 30 ° C per hour, preferably from 18 ° C. to 23 ° C. per hour, in particular from 20 ° C. to 22 ° C.
  • step c) Production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and culturing these fibroblasts over a period of 7 to 28 days, d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days,
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • a further particularly preferred embodiment of this subject matter of the invention is accordingly a process for the preparation of an in vitro full-skin model, the process comprising the following steps in the order given:
  • step b) preparation of the carrier layer by lyophilization of the collagen suspension provided in step a), wherein the lyophilization of the collagen suspension in step b) at a cooling rate of 5 ° C to 40 ° C per hour, preferably from 10 ° C to 30 ° C per hour, preferably from 18 ° C. to 23 ° C. per hour, in particular from 20 ° C. to 22 ° C.
  • step c) Production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivating these fibroblasts over a period of 7 to 28 days, wherein for the production of the dermis equivalent in step c) primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1 x10 6 cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5 ⁇ 10 5 to 5.5 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, be used,
  • step d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days,
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • a further particularly preferred embodiment of this subject matter is accordingly a process for the production of an in vitro full-skin model, the process comprising the following steps in the order given:
  • step b) preparation of the carrier layer by lyophilization of the collagen suspension provided in step a), wherein the lyophilization of the collagen suspension in step b) at a cooling rate of 5 ° C to 40 ° C per hour, preferably from 10 ° C to 30 ° C per hour, preferably from 18 ° C. to 23 ° C. per hour, in particular from 20 ° C. to 22 ° C.
  • step c) Production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivating these fibroblasts over a period of 7 to 28 days, wherein for the production of the dermis equivalent in step c) primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1 x10 6 cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5 ⁇ 10 5 to 5.5 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, be used,
  • step d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days, wherein in step d) primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, in a total concentration of 1, 5 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells per ml of medium, preferably from 2.5 ⁇ 10 5 to 9 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, preferably from 3.5 ⁇ 10 5 to 7 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, in particular from 4x10 5 to 5 ⁇ 10 5 cells per ml Medium, to be used
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • a further particularly preferred embodiment of this subject matter is accordingly a method for producing an in-vitro full-skin model, the method comprising the following steps in the order given:
  • the suspension of sparingly soluble collagen in step a) comprises a total amount of collagen from 0.2 to 4.0% by weight, preferably from 0.3 to 3.0 wt .-%, preferably from 0.4 to 2.0 wt .-%, in particular from 0.5 to 1, 5 wt .-%, based on the total weight of the suspension contains and wherein the sparingly soluble collagen suspension in step a) has a pH of from pH 0.1 to pH 6.9, preferably from pH 2.0 to pH 5.0, preferably from pH 3.0 to pH 4.5 , in particular from pH 3.5 to pH 4.0,
  • step b) preparation of the carrier layer by lyophilization of the collagen suspension provided in step a), wherein the lyophilization of the collagen suspension in step b) at a cooling rate of 5 ° C to 40 ° C per hour, preferably from 10 ° C to 30 ° C per hour, preferably from 18 ° C. to 23 ° C. per hour, in particular from 20 ° C. to 22 ° C.
  • step c) Production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivating these fibroblasts over a period of 7 to 28 days, wherein for the production of the dermis equivalent in step c) primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1 x10 6 cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7x10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5x10 5 to 5,5x10 5 cells per ml of medium, be used,
  • step d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, to the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days, wherein in step d) primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, in a total concentration of 1, 5 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells per ml of medium, preferably from 2.5 ⁇ 10 5 to 9 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, preferably from 3.5 ⁇ 10 5 to 7 ⁇ 10 5 cells per ml of medium, in particular from 4x10 5 to 5 ⁇ 10 5 cells per ml Medium, to be used
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • step c wherein the introduction of 50 to 100 three-dimensional sweat gland equivalents with a cell count of 500 to 500,000 sweat gland cells and a diameter of 100 to 6,000 ⁇ by addition of these equivalents in step c).
  • Three-dimensional sweat gland equivalents of the eccrine and / or apocrine human sweat gland are preferably introduced into the previously described methods for producing in-vitro full-thickness skin models.
  • the processes according to the invention have the advantage that no use of in-vivo methods is required for the preparation of in-vitro full-skin models. Consequently, these models can also be used to test substances intended for cosmetic use. Furthermore, the method according to the invention allows a cost-effective production of standardized models which can be used in screening methods with high throughput rates. In addition, this Herste II method results in full-skin models, which have differentiated different cell layers and sweat gland specific markers Thus, a good transferability of the in vitro data generated with these models to the in vivo situation is made possible.
  • a third aspect of the present invention is the use of the in vitro full-skin model according to the invention in cosmetics and personal care, in particular for testing, identifying and testing cosmetic active ingredients, preferably with regard to their effectiveness in inhibiting and / or reducing body sweat and / or or body odor.
  • this full-skin model can be used as an in vitro model for determining the influence of test substances on the sweat glands in the field of cosmetics and in particular personal care. Due to the high standardizability and the good simulation of the in-vivo situation, the full-skin models of the invention can be used in particular for the discovery of new antiperspirant active ingredients.
  • the full-skin model according to the invention is particularly suitable for product testing, for example with regard to the efficacy, unwanted side effects, for example irritation, toxicity and inflammatory effects, allergenic effects or tolerability of substances.
  • the full-skin model according to the invention can also be used for studies on the absorption, transport and / or penetration of substances and for wound healing.
  • the effects on the skin of external environmental influences such as radiation, heat, radioactivity, electric fields or the like can be examined.
  • the effect of such influences can be determined, for example, by evaluating the gene expression, the metabolism, the proliferation, the differentiation and the reorganization of the cells. It can also be provided to colonize the in-vitro full-skin model according to the invention with microorganisms, in particular pathogenic microorganisms, such as fungi, bacteria and viruses, in order to study infection processes and their healing.
  • Another object of the present invention is the use of an in vitro full-skin model according to the invention in preferably automated screening methods, in particular for testing, identification and testing of cosmetic active ingredients, preferably with respect to their effectiveness in inhibiting and / or reducing body sweat and / or body odor.
  • Another object of the present invention is the use of an in vitro full-skin model according to the invention for the in-vitro evaluation of the influence of cosmetic agents on the inhibition and / or reduction of sweat secretion and / or body odor.
  • a further subject of the present invention is a system, in particular test system, comprising an in vitro full-skin model according to the invention.
  • the present invention is characterized in particular by the following points:
  • At least one carrier layer comprising at least one collagen matrix
  • the dermis equivalent b) and / or the epidermis equivalent c) comprises from 1 to 100 three-dimensional sweat gland equivalent (s), the three-dimensional sweat gland equivalent (s)
  • Sweat gland equivalents each comprise 500 to 500,000 sweat gland cells and have a diameter of 100 to 6,000 ⁇ .
  • the collagen matrix comprises a sparingly soluble collagen, in particular a poorly soluble collagen from tendons of horses, pigs or cattle.
  • the collagen matrix comprises a lyophilized sparingly soluble collagen, in particular a lyophilized sparingly soluble collagen from tendons of horses, pigs or cattle.
  • in vitro full skin model characterized in that the collagen matrix, a total amount of collagen, in particular lyophilized poorly soluble collagen, from 0.5 to 5.0 wt .-%, preferably from 0.8 to 3, 5 wt .-%, preferably from 0.8 to 2.5 wt .-%, in particular from 0.8 to 1, 2 wt .-%, based on the total weight of the collagen matrix contains.
  • the collagen matrix is a crosslinked collagen matrix.
  • the dermis equivalent is formed from primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts.
  • the dermis equivalent primary fibroblasts in particular human primary fibroblasts, in a total cell number of 5x10 5 to 6x10 6 , preferably from 6x10 5 to 5x10 6 , in particular from 7x10 5 to 4x10 6 , contains.
  • the epidermis equivalent is formed from primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes.
  • the epidermis equivalent comprises a plurality of mutually different cell layers, in particular at least two differently differentiated cell layers and at least one keratinized cell layer.
  • the epidermis equivalent primary keratinocytes in particular human primary keratinocytes, in a total cell count of 4x10 5 to 5x10 6, preferably from 5,5x10 5 to 4x10 6, more preferably from 6,5x10 5 to 3.5x10 6 , contains.
  • the basal membrane comprises proteins from the group of laminin, collagen type IV and their mixture.
  • In-vitro full-skin model according to one of the preceding points characterized in that the dermis equivalent b) comprises the three-dimensional sweat gland equivalents.
  • In-vitro full skin model according to one of the preceding points characterized in that the three-dimensional sweat gland equivalents each have a diameter of 100 to 4000 ⁇ , preferably from 100 to 3,000 ⁇ , in particular from 200 to 2,500 ⁇ have.
  • In-vitro full skin model according to one of the preceding points, characterized in that the three-dimensional sweat gland equivalents are each free of matrix compounds and / or carriers, in particular free of matrix compounds and carriers.
  • the matrix compounds and / or carriers are selected from the group of collagens, in particular collagen type I and / or type III and / or type IV, scleroproteins, gelatins, chitosans, glucosamines, glucosaminoglucans (GAG), heparin sulfate proteoglucans, sulfated glycated proteins, growth factors, cross-linked polysaccharides, cross-linked polypeptides and mixtures thereof.
  • In-vitro full-skin model according to one of the preceding points, characterized in that the three-dimensional sweat gland equivalents are each three-dimensional sweat gland equivalents of the eccrine and / or apocrine human sweat gland.
  • a method of making an in vitro full-skin model comprising the following steps in the order given:
  • step c) production of the dermis equivalent by application of primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, to the carrier layer produced in step b) and cultivation of these fibroblasts over a period of 7 to 28 days; d) application of primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes the dermis equivalent produced in step c) and cultivation of these keratinocytes over a period of 1 to 10 days,
  • step d) cultivation of the model obtained according to step d) at the air-medium boundary over a period of 7 to 42 days,
  • the suspension of sparingly soluble collagen in step a) contains a total amount of collagen of from 0.2 to 4.0% by weight, preferably from 0.3 to 3.0% by weight, preferably from 0.4 to 2.0 wt .-%, in particular from 0.5 to 1, 5 wt .-%, based on the total weight of the suspension contains.
  • Step c) primary fibroblasts, in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1x10 6 Cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7x10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5 ⁇ 10 5 to 5, 5 ⁇ 10 5 cells per ml of medium.
  • primary fibroblasts in particular human primary fibroblasts, in a total concentration of 2x10 5 to 2x10 6 cells per ml of medium, preferably from 3x10 5 to 1x10 6 Cells per ml of medium, preferably from 4x10 5 to 7x10 5 cells per ml of medium, in particular from 4.5 ⁇ 10 5 to 5, 5 ⁇ 10 5 cells per ml of medium.
  • a method according to any one of items 19 to 24, characterized in that primary in step d), keratinocytes, in particular human primary keratinocytes, in a total concentration of 1, 5x10 5 to 1x10 6 cells per ml of medium, preferably from 2.5x10 5 to 9x10 5 cells per ml of medium, preferably from 3.5x10 5 to 7x10 5 cells per ml of medium, in particular from 4x10 5 to 5x10 5 cells per ml to medium used.
  • Method characterized in that the cultivation of the primary keratinocytes, in particular of the human primary keratinocytes, in step d) in a submersed culture over a period of 1 to 8 days, preferably 1 to 6 days, preferably from 1 to 4 days, in particular from 1 to 2 days, at a temperature of 30 to 40 ° C.
  • Step d Method according to one of the items 19 to 27, characterized in that the introduction of the three-dimensional sweat gland equivalents takes place in step d), wherein the three-dimensional sweat gland equivalents are seeded 1 to 3 hours before application of the primary keratinocytes, in particular human primary keratinocytes.
  • System in particular test system, comprising an in-vitro full-skin model according to one of items 1 to 18.
  • the native sweat glands were obtained from human tissue samples, called biopsies, obtained from plastic surgery of patients who have consented to the use of the material for research purposes.
  • the tissue used was removed for upper arm tightening and facial tautening. From this, the eccrine and apocrine sweat glands were isolated from the underarm area.
  • the respective biopsy was cut into small pieces and then cut into pieces of a maximum of about 1 cm x 1 cm.
  • the skin was digested with a mixture of equal parts Collagenase II (5 mg / ml) and Thermolysin (0.25 mg / ml) at 37 ° C in the incubator for about 3.5 to 5 hours until the connective tissue almost was completely digested.
  • This mixture was then centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes and the supernatant discarded to remove the enzyme solution and the excess fat.
  • the resulting pellet was taken up in DMEM solution and the solution transferred to a Petri dish. Using a microcapillary intact sweat glands were isolated under a binocular and transferred into fresh DMEM medium.
  • the sweat glands isolated in step 1.1 were placed in collagen-I coated culture bottles and then added to 25 ml of nutrient medium. After cultivation for 7 to 21 days in the Incubator at 37 ° C and 5% CO2, the growing sweat gland cells were peeled off and re-cultivated on Collagen-I coated culture bottles to confluency (monolayer culture of primary sweat gland cells).
  • composition of the nutrient medium used is as follows:
  • the SD sweat gland equivalents are harvested by adding 50 to 200 [iL of nutrient medium and transferred to a "GravityTRAP®” plate (Insphero AG, Switzerland) before harvesting the "GravityTRAP®” plate moistened with 60 to 100 [iL of keratinocyte medium using a multichannel pipette to minimize the formation of air bubbles and avoid the loss of three-dimensional sweat gland equivalents. After harvesting, plate is centrifuged for 1 to 5 minutes at 100 to 300 xg to remove air bubbles.
  • the preparation of the carrier layer which comprises a crosslinked collagen matrix, is carried out analogously to the method described in Examples 1 and 2 on pages 22 and 23 of the published patent application WO 2006/019147 A1.
  • 1 ml of a mixture of precultured fibroblasts (6 ⁇ 10 5 fibroblasts per ml of medium, DMEM containing 10% by weight of FCS, 100 U / ml of penicillin G, 25 ⁇ g / ml gentamicin) is applied to this carrier layer in microtiter plates and 1 mM ascorbyl-2-phosphate) were added with 60 to 100 of the three-dimensional sweat gland equivalents prepared under point 1.3 (cell count per equivalent of about 25,000 sweat gland cells).
  • the fibroblasts of the third or fourth passage precultured in culture flasks are dissolved by adding a trypsin solution from the bottom of the culture flasks, washed with medium and centrifuged off. After determining the number of cells, the cell suspension is adjusted to the previously mentioned concentration and the aforementioned number of discrete sweat gland equivalents added. After applying the mixture of fibroblasts and sweat gland equivalents to the carrier layer, place the plate lid on and incubate the plate for 16 days at 37 ° C and 5% v / v CO2 submerged, changing medium every 3 days. After 16 days, a dermis equivalent has formed in which the three-dimensional sweat gland equivalents are incorporated.
  • Keratinocytes are then seeded on this dermis equivalent.
  • keratinocytes of the first or second passage are pre-cultured in cell culture bottles with nutrient medium mentioned under 1.2 and then detached from the bottom by addition of a trypsin solution. After washing with nutrient medium and centrifuging, the cell count of the keratinocyte suspension is adjusted to 1 -6 ⁇ 10 5 keratinocytes per ml of medium. From the wells of the microtiter plate, which contain the dermis equivalents, the medium is aspirated so far that the surface of dermis equivalents remains moist. Subsequently, 1 ml of the previously prepared keratinocyte suspension is added and placed on the slab ceilings.
  • Cultivation in Submers culture is for 2 days at 37 ° C and 5% v / v CO2.
  • the skin models are retrieved from the wells and placed on filter papers lying on metal spacers in a Petri dish.
  • the Petri dish is now filled with the nutrient medium mentioned under point 1.2 so far that the medium reaches the upper edge of the filter paper and distributed around the base of the skin models.
  • the surface of the models is not covered by medium (airlift culture).
  • the in vitro full-skin models according to the invention are obtained, which have a multilayered epidermis and a keratinized tissue surface.
  • the preparation of the carrier layer which carries a dermis equivalent, is carried out analogously to Examples 1 to 3 described in the publication WO 2006/018147 A1 on pages 22 to 24, wherein the cultivation of the fibroblasts is carried out for 16 days.
  • the three-dimensional sweat gland equivalents prepared under point 1.3 are added to this dermis equivalent by suspending them in the nutrient medium described under point 1.2 and then applying this suspension to the dermis equivalent.
  • the keratinocytes are sown, as described under point 1 .4.
  • the models are converted to the culture format of the Air-Liquid interface and cultured for a further 11 days under these conditions.
  • the in vitro full-skin models produced in this way have a complex epidermis and a keratinized tissue surface.
  • Immunofluorescent staining was performed on histological sections to demonstrate protein expression of sweat gland-specific marker proteins.
  • the in vitro full-skin models prepared under items 1 .4 and 1.5 were cut into 1 x 0.5 cm pieces and placed in paraffin or frozen with embedding medium. Subsequently, the objects were cut and stained according to a standard fluorescence protocol for histological sections (e.g., from Abcam, Cambridge, UK). The stained samples can then be analyzed under a fluorescence microscope or a confocal laser scanning microscope.
  • sweat gland-specific marker proteins could be detected: carcinoembryonic antigen (CEA), alpha smooth muscle actin (alpha-SMA), muscarinic acetylcholine receptor M3 (M-ACh-R3), sodium-potassium chloride cotransporter 1 (NKCC1), Galanin receptor 2 (GalR2).
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • alpha-SMA alpha smooth muscle actin
  • M-ACh-R3 muscarinic acetylcholine receptor M3
  • NKCC1 sodium-potassium chloride cotransporter 1
  • GalR2 Galanin receptor 2

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Vollhautmodell, welches auf einer Trägerschicht ein Dermis- und Epidermisäquivalent sowie 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη, umfasst. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung des Vollhautmodells sowie die Verwendung dieses Modells als in-vitro Modell, in Screening-Verfahren sowie zur in-vitro Bewertung von des Einflusses kosmetischer Wirkstoffe auf die Hemmung der Schweißsekretion sowie den Körpergeruch.

Description

"In-vitro Vollhautmodell, enthaltend dreidimensionale Zellkulturmodelle der Schweißdrüse "
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Vollhautmodell mit einem Dermis- und einem Epidermisäquivalent, wobei in dem Dermis- und/oder Epidermisäquivalent 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 μιη, enthalten sind. Durch die Inkorporation der Schweißdrüsenäquivalente in die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle kann die in-vivo Situation in der Humanhaut sehr gut nachgestellt werden. Insbesondere können die in-vivo vorhanden Zell-Zell-Interaktionen zwischen den verschiedenen Zelltypen sehr gut abgebildet werden, da die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente auch nach der Inkorporation in das Vollhautmodell ihre Funktion beibehalten.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, bei welchem zunächst ein Dermisäquivalent auf einer Trägerschicht bereitgestellt wird. Anschließend wird auf dieses Dermisäquivalent ein Epidermisäquivalent aufgebracht. Die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in das in-vitro-Vollhautmodell erfolgt hierbei während der Bereitstellung des Dermis- und/oder Epidermisäquivalents.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs sowie zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, welches ein erfindungsgemäßes in-vitro Vollhautmodell umfasst.
Das Waschen, Reinigen und Pflegen des eigenen Körpers stellt ein menschliches Grundbedürfnis dar und die moderne Industrie versucht fortlaufend, diesen Bedürfnissen des Menschen in vielfältiger Weise gerecht zu werden. Besonders wichtig für die tägliche Hygiene ist die anhaltende Beseitigung oder zumindest Reduzierung des Körpergeruchs und der Achselnässe. Achselnässe und Körpergeruch entstehen durch die Sekretion aus ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen in der humanen Achselhöhle. Während die ekkrinen Drüsen der Thermoregulation des Körpers dienen und für die Entstehung der Achselnässe verantwortlich sind, scheiden die apokrinen Drüsen ein viskoses Sekret in Reaktion auf Stress ab, aus welchem durch bakterielle Zersetzung unangenehmer Körpergeruch entsteht. Erste Forschungsarbeiten an nativen ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen wurden bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt, um diese zur Gruppe der exokrinen Drüsen gehörenden Hautanhangsgebilde zu klassifizieren. Schweißdrüsen lassen sich hiernach in apokrine und ekkrine Schweißdrüsen sowie eine Mischform aus apokrinen und ekkrinen Schweißdrüsen (auch als apoekkrine Schweißdrüse bezeichnet) einteilen. Die zuvor genannten Formen können anhand morphologischer und charakteristischer Merkmale unterschieden werden.
Die ekkrine Schweißdrüse, insbesondere die humane ekkrine Schweißdrüse, gehört zu den unverzweigten gewunden tubulären Drüsen und lässt sich in das sekretorische Endstück (auch als Coil bezeichnet), den dermalen Ausführgang (auch als Dukt bezeichnet) sowie den epidermalen Ausführgang (auch als Acrosyringium bezeichnet) unterteilen. Die in diesen Drüsenabschnitten vorhanden Zellen weisen unterschiedliche Aufgaben und Funktionen auf, wie beispielsweise die Sekretion im Coil, Rückresorption von Ionen im Dukt sowie Abgabe des Sekrets, insbesondere des Schweißes, an die umliegende Haut durch das Acrosyringium. Die ekkrinen Schweißdrüsen werden durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) stimuliert.
Im Hinblick auf die Vermeidung von Achselnässe und/oder Körpergeruch ist es daher wünschenswert, die Sekretion aus ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen zu vermindern und/oder zu vermeiden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Ausführungsgänge der ekkrinen Schweißdrüsen mittels sogenannter Plugs verstopft werden. Hierzu werden im Stand der Technik schweißhemmende Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze eingesetzt, welche jedoch vom Verbraucher als kritisch empfunden werden. Weiterhin werden im Stand der Technik antibakterielle Mittel eingesetzt, welche den bakteriellen Abbau des Schweißes verhindern. Derartige Mittel können jedoch die natürliche Mikroflora der Haut unter der Achselhöhle negativ beeinflussen. Es ist daher wünschenswert, kosmetische Mittel bereitzustellen, welche in der Lage sind, die Achselnässe und/oder den Körpergeruch zuverlässig zu verhindern und welche weder die im Stand der Technik eingesetzten Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze noch antibakteriellen Mittel enthalten. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung derartiger Mittel besteht in dem Einsatz von Substanzen, welche die Stimulierung der Schweißdrüsen effektiv hemmen und somit die Schweißsekretion vermindern bzw. vermeiden. Um derartige Substanzen identifizieren zu können, können in-vivo Tests mit Versuchsteilnehmern durchgeführt werden. Solche Tests sind jedoch aufwändig und erlauben keine Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten.
Weiterhin können Zellmodelle von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann. Derartige Modelle müssen die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden, standardisierbar und kostengünstig sein sowie Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten ermöglichen. Ein im Stand der Technik bekanntes dreidimensionales Schweißdrüsenmodell ist beispielsweise durch Li (Li et. al.;„Matrigel basement membrane matrix induces eccrine sweat gland cells to reconstitute sweat gland-like structures in nude mice"; Experimental Cell Research, 2015, 332, Seiten 67 bis 77) beschrieben. Zur Herstellung dieses Schweißdrüsenmodells werden zunächst primären Schweißdrüsenzellen mit Wachstumsfaktoren in einer gelartigen Substanz (Matrigel®) kultiviert und anschließend in den Rücken von lebenden Mäusen implantiert. Nach Implantierung bilden sich Sphäroid-Strukturen aus, welche Schweißdrüsenspezifische Markerproteine exprimieren. Da zur Ausbildung der differenzierten Strukturen der Einsatz von Mäusen erforderlich ist, kann dieses Modell nicht in der kosmetischen und pharmazeutischen Forschung, wo der Einsatz von Versuchstieren verboten ist, verwendet werden.
Schließlich ist auch der Einsatz von Vollhautmodellen, welche neben einer Dermis und einer Epidermis auch Schweißdrüsen enthalten, bekannt. Durch Ausstanzen von Proben aus nativer adulter Humanhaut werden Modelle erhalten, welche alle in diesem Hautbereich befindlichen Hautanhangsgebilde, worunter auch Schweißdrüsen fallen, enthalten. Derartige Modelle werden auch als ex-vivo Vollhautmodelle bezeichnet. Ein Nachteil dieser Modelle ist deren geringe Standardisierbarkeit, da eine Steuerung der genauen Anzahl an Schweißdrüsen nicht möglich ist und zudem die Eigenschaften des Modells von dem jeweiligen Spender abhängen.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an in-vitro Vollhautmodellen, welche eine ähnliche, vorzugsweise identische, histologische Architektur wie humane Haut aufweisen und welche ausschließlich unter Einsatz von in-vitro Methoden herstellbar sind. Weiterhin ist es wünschenswert, wenn diese in-vitro Vollhautmodelle standardisierbar und kostengünstig herstellbar sind und sich für den Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen eignen.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein in-vitro Vollhautmodell (im Folgenden als Hautäquivalent bezeichnet) bereitzustellen, dessen Zellstruktur und Zell-Zell- Wechselwirkungen eine hohe Ähnlichkeit zu der Zellstruktur und den Zell-Zell-Wechselwirkungen von nativen Haut aufweisen und welches ausschließlich durch in-vitro Methoden herstellbar ist. Weiterhin soll dieses Modell kostengünstig herstellbar sein, standardisierbar sein und sich für den Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzzahlen eignen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass durch Einbringung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in ein Dermis- und/oder Epidermisäquivalent eines Hautäquivalents Modelle erhalten werden können, in welchen die Zell-Zell-Interkationen zwischen den verschiedenen Zelltypen denen in der nativen Haut nahezu entsprechen. Die Herstellung erfolgt ausschließlich durch in-vitro Methoden und erlaubt eine hohe Standardisierbarkeit sowie eine kostengünstige Herstellung der Hautäquivalente. Daher eignen sich diese Hautäquivalente insbesondere zum Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen zur Testung von schweißhemmenden Substanzen zum Einsatz in der Kosmetik und der Pharmazie.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix
b) mindestens ein Dermisäquivalent c) mindestens ein Epidermisäquivalent
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
In den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen werden durch Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente die in humaner Haut vorliegenden Zell-Zell- Interaktionen nachgestellt. Diese Modelle bilden daher die in-vivo-Situation sehr gut ab, so dass die mit diesen Modellen gewonnen Ergebnisse relevanter sind als die Ergebnisse, welche von Vollhautmodellen ohne Schweißdrüsenäquivalente erhalten werden. Zudem weisen die in den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten enthaltenen ekkrinen Schweißdrüsenzellen eine potentielle Stammzell-Aktivität bei der Wundheilung auf, so dass mit dem erfindungsgemäßen Hautäquivalent weitere in der Haut ablaufende Prozesse untersucht werden können. Durch Verwendung von kultivierten Zellen zur Herstellung des Hautäquivalents kann eine hohe Standardisierung erreicht werden, da aus den kultivierten Zellen eine Vielzahl von Hautäquivalenten mit gleichen Eigenschaft erzeugt werden können. Weiterhin wird durch die Einbringung einer genau bestimmbaren Anzahl an dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten ebenfalls eine hohe Standardisierbarkeit sicherstellt.
Unter einem in-vitro Vollhautmodell (im nachfolgenden auch als Hautäquivalent bezeichnet) wird erfindungsgemäß ein Modell der Haut verstanden, welches ausschließlich unter Verwendung von in- vitro Methoden hergestellt wurde und sowohl eine stratifizierte Epidermis als auch eine Dermis aufweist, wobei sich eine Basalmembran zwischen der Dermis und der Epidermis befindet.
Weiterhin wird unter dem Begriff „Trägerschicht" im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine selbsttragende Schicht verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für das Dermisäquivalent des erfindungsgemäßen Hautäquivalents dient. Bevorzugt befindet sich diese Schicht in den Kavitäten der zur Herstellung der Hautäquivalente eingesetzten Mikrotiterplatten. Erfindungsgemäß umfasst diese Schicht eine Kollagenmatrix, wobei unter einer Kollagenmatrix ein räumliches Netzwerk aus Kollagen verstanden wird, welches bevorzugt Poren aufweist. Hierunter fällt jedoch keine Matrix, welche durch das von den Fibroblasten der Dermis produzierte Collagen gebildet wird.
Zudem wird unter einem Dermisäquivalent im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Bindegewebe-artige Schicht aus Fibroblasten verstanden, welche weitgehend der nativen Dermis entspricht. Darüber hinaus wird unter einem Epidermisäquivalent im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine bevorzugt mehrschichtige Schicht aus Keratinozyten in Form einer stratifizierten Epidermis verstanden, welche weitgehend der nativen Epidermis entspricht.
Weiterhin wird unter einer Basalmembran eine Schicht aus einem bevorzugt mehrschichtigen Geflecht aus Collagen, insbesondere Collagen IV, welches mit einem zweidimensionalen Netzwerk aus Laminin verwoben ist. Der Zusammenhalt zwischen dem Collagengeflecht und dem Lamininnetzwerk wird bevorzugt durch Perlecan (einem aus Heparinsulfat gebildeten Proteoglycan) sowie Entactin (auch als Nidogen bezeichnet) gewährleistet.
Schließlich wird unter einem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent erfindungsgemäß ein Zellmodell aus Schweißdrüsenzellen verstanden, welches eine Ausdehnung in alle drei Raumrichtungen aufweist und in welchem die Zellen eine ähnliche Funktion, insbesondere eine identische Funktion, wie Zellen einer nativen Schweißdrüse zeigen.
Als ersten wesentlichen Bestandteil a) umfasst das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell eine Trägerschicht, welche eine Collagenmatrix enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung weist das Hautäquivalent als Trägerschicht bevorzugt eine Matrix aus bestimmten Collagenverbindungen auf. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn die Collagenmatrix ein schwer lösliches Collagen, insbesondere ein schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst. Unter schwer löslichem Collagen wird erfindungsgemäß grobfasriges Collagen verstanden, welches im wässrigen Medium über mindestens 5 Stunden hinweg keine sichtbare oder nur geringe Quellung bzw. keine oder nur geringe Gelbildung, insbesondere keine Gelbildung, aufweist. Derartiges Collagen wird bevorzugt aus den Sehnen von Tieren, insbesondere Säugetieren, bevorzugt von Pferden, Schweinen oder Rindern, ganz besonders bevorzugt aus den Achillessehnen oder der Haut von Ringern, insbesondere aus den Achillessehnen von Rindern, gewonnen.
Es hat sich erfindungsgemäß als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die als Trägerschicht eingesetzte Matrix aus lyophilisiertem schwer löslichem Collagen gebildet ist. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen, insbesondere ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst. Unter lyophilisiertem schwerlöslichen Collagen wird erfindungsgemäß ein schwer lösliches Collagen verstanden, welches durch Gefriertrocknung einer homogenen Suspension dieses schwer löslichen Collagens in einem Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, erhalten wurde. Gefriertrocknung wird auch als Sublimationstrocknung bezeichnet und steht hierbei für das Trocknen eines tiefgefroren Materials im Hochvakuum durch Ausfrieren des Lösungsmittels, bevorzugt in Form von Wasser, welches dann in gefrorenem Zustand verdampft. Besonders bevorzugt weist diese Collagenmatrix aus lyophilisiertem schwer löslichen Collagen an der Oberfläche eine Haut mit Poren auf. Diese Poren führen zu einer besonders guten Besiedelung des Trägermaterials mit Fibroblasten während der Ausbildung des Dermisäquivalents, so dass eine Störung während zur Bildung des Dermisäquivalents erforderlichen Differenzierung der Fibroblasten vermieden wird.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, wenn die Collagenmatrix der Trägerschicht eine bestimmte Gesamtmenge an Collagen enthält. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichem Collagen, von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,8 bis 3,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält. Trägerschichten, welche die zuvor angeführte Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichen Collagen, enthalten, führen zu einer effektiven Stabilisierung des erfindungsgemäßen Hautäquivalents und erlauben auf diese Weise eine gute Handhabung der Äquivalente.
Um eine Schrumpfung des erfindungsgemäßen Hautäquivalents zu vermeiden, hat es sich der Einsatz von vernetzten Collagenmatrices bewährt. Das Vermeiden der Schrumpfung stellt eine hohe Standardisierbarkeit sicher, da die Auftragung der Testsubstanzen immer auf eine gleich große Oberfläche erfolgen kann. Hierdurch werden Konzentrationsschwankungen nach dem Auftragen der Testsubstanzen vermieden. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist. Die Vernetzung der Collagenmatrix kann beispielsweise mittels chemischer oder physikalischer Methoden erfolgen. Zur chemischen Vernetzung werden insbesondere chemische Vernetzungsmittel eingesetzt, die physikalische Vernetzung kann beispielsweise mittels UV-Bestrahlung oder dehydrothermaler Vernetzung (auch als DHT bezeichnet) erfolgen.
In diesem Zusammenhang hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die Vernetzung der Collagenmatrix mittels chemischer Vernetzungsmittel erfolgt. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Vernetzung der Collagenmatrix mittels eines chemischen Vernetzungsmittels aus der Gruppe von Glutaraldehyd, p-Benzochinon, Dimehtyladipimidat, Dimethylpimelinidat, Dimethylsuberimidat, 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat, Polyoxyethylen-bis-(imidazolyl carbonyl), bis[Polyoxyethylen-bis(imidazolyl carbonyl)] und Suberinsäure-bis(N-hydroxysuccinimidester), 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimid, Enzymen sowie deren Mischungen, insbesondere Glutaraldehyd, erfolgt. Die Anmelderin hat überraschenderweise festgestellt, dass die Vernetzung der Collagenmatrix mittels des chemischen Vernetzungsmittels Glutaraldehyd zu einer hervorragenden Stabilisierung der Hautäquivalente führt, ohne dass die cytotoxischen und apoptotischen Eigenschaften des Glutaraldehyds zu einem negativen Einfluss auf das in-vitro Vollhautmodell führen. Als zweiten wesentlichen Bestandteil umfasst das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell ein Dermisäquivalent.
Dieses Dermisäquivalent wird bevorzugt aus dermalen Fibroblasten gebildet. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent aus primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, gebildet ist. Unter primären Fibroblasten werden bevorzugt natürlich vorkommende, insbesondere in der humanen Dermis vorkommende, Fibroblasten, gentechnisch veränderte Fibroblasten, aus Spontanmutation hervorgegangene Fibroblasten oder deren Vorläufer verstanden. Besonders bevorzugt werden vorkultivierte humane primäre Fibroblasten zur Bildung des Dermisäquivalents eingesetzt. Vorkultivierte humane primäre Fibroblasten können durch Kultivierung der humanen primären Fibroblasten erhalten werden, wobei die Kultivierung bevorzugt in-vitro unter Vermehrung der Zellen stattfindet. Zur Vorkultivierung der Fibroblasten wird vorzugsweise ein DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) verwendet.
Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn das Dermisäquivalent eine bestimmte Gesamtzellzahl an primären Fibroblasten enthält. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Dermisäquivalent primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtzellzahl von 5x105 bis 6x106, vorzugsweise von 6x105 bis 5x106, insbesondere von 7x105 bis 4x106, enthält. Dermisäquivalente, welche die zuvor genannten Gesamtzellzahlen an primären Fibroblasten enthalten, weisen eine Differenzierung auf, welche der Differenzierung in der Dermis der humanen Haut sehr ähnlich ist. Hierdurch wird gewährleistet, dass die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden.
Als dritten wesentlichen Bestandteil c) enthält das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell mindestens ein Epidermisäquivalent.
Dieses Epidermisäquivalent wird bevorzugt aus primären Keratinozyten gebildet. Unter Keratinozyten werden erfindungsgemäß Zellen der Epidermis, welche ein verhorntes Plattenepithel bilden, gentechnisch veränderte Keratinozyten, aus Spontanmutation hervorgegangene Keratinozyten sowie deren Vorläufer verstanden. Da die Ausbildung eines gut differenzierten Epidermisäquivalents mit intakter Verhornung vom Anteil basaler Stammzellen in den zur Bildung des Epidermisäquivalents eingesetzten Keratinozyten abhängt, ist es bevorzugt, weitgehend undifferenzierte Keratinozyten-Stammzellen aus unbehandeltem Biopsie-Gewebe zu verwenden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent aus primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, gebildet ist. Bevorzugt ist das Epidermisäquivalent aus vorkultivierten Keratinozyten, welche durch Kultivierung von primären Keratinozyten, bevorzugt unter Vermehrung dieser Zellen, erhalten werden, gebildet. Zur Vorkultivierung der Keratinozyten wird bevorzugt eine Mischung aus DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) und Ham's F12-Medium verwendet. Besonders bevorzugt weist das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten auf. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht, umfasst. Unter dem Begriff „mehrere Zellschichten" werden erfindungsgemäß mindestens zwei voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere 2 bis 20 voneinander verschiedene Zellschichten, verstanden. Das Vorliegen von verschiedenen Zellschichten in der Epidermis kann beispielsweise mit Hilfe eines Lichtmikroskops ermittelt werden. Es ist insbesondere bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent 2 bis 10 voneinander verschiedene Zellschichten aufweist, wobei mindestens eine dieser Zellschichten ausgewählt ist aus Stratum corneum, Stratum spinosum sowie Stratum granulosum.
Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen, wenn das Epidermisäquivalent eine bestimmte Gesamtzellzahl an primären Keratinozyten enthält. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn das Epidermisäquivalent primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtzellzahl von 4x105 bis 5x106, vorzugsweise von 5,5x105 bis 4x106, insbesondere von 6,5x105 bis 3,5x106, enthält. Epidermisäquivalente, welche die zuvor genannten Gesamtzellzahlen an primären Keratinozyten enthalten, weisen eine Differenzierung auf, welche der Differenzierung in der Epidermis der humanen Haut sehr ähnlich ist. Hierdurch wird gewährleistet, dass die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden.
Als vierten wesentlichen Bestandteil umfasst das erfindungsgemäße Vollhautmodell eine Basalmembran, welche sich zwischen dem Dermis- und dem Epidermisäquivalent befindet.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Basalmembran des Vollhautmodells bestimmte Proteine umfasst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst. Basalmembranen, welche die zuvor angeführten Proteine enthalten, führen zu einer besonders effektiven Verbindung zwischen dem Dermis- und dem Epidermisäquivalent und gewährleisten auf diese Weise eine gute Stabilität und Handhabbarkeit der erfindungsgemäßen Vollhautmodelle.
Die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle enthalten bevorzugt 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente. Die Inkorporation der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente erlaubt eine verbesserte Wiedergabe der in-vivo Situation in der Humanhaut im Vergleich zu Vollhautmodellen, welche keine Schweißdrüsen oder Schweißdrüsenäquivalente enthalten. Die Inkorporation einer gleichen Anzahl an diskreten Schweißdrüsenäquivalenten erlaubt zudem die Herstellung von standardisierbaren Vollhautmodellen im Vergleich zu der Verwendung von Stanzbiopsien mit einer jeweils variierenden Anzahl an Schweißdrüsen in diesen Biopsien. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 2 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, vorzugsweise 5 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, bevorzugt 20 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, insbesondere 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, umfasst.
Die in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen diskreten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente können beispielsweise mittels der Hanging-Drop-Methode aus primären Schweißdrüsenzellen unter ausschließlicher Verwendung von in-vitro Methoden hergestellt werden. Hierzu werden zunächst Schweißdrüsen aus Hautbiopsien, insbesondere native ekkrine und/oder apokrine Schweißdrüsen aus Hautbiopsien, isoliert. Die Isolierung kann mittels enzymatischem Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgen. Durch Kultivierung der isolierten Schweißdrüsen können primäre Schweißdrüsenzellen gewonnen werden. Nach schonender Trypsinierung zur Ablösung der primären Schweißdrüsenzellen werden diese für 7 bis 28 Tage in Monolayer-Kulturen kultiviert und anschließend in einem Nährmedium aus DMEM und Ham's F12 im Gewichtsverhältnis 3:1 , welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, suspendiert. Nach Einstellung einer Konzentration von 50 bis 250.000, insbesondere 400 bis 600 Zellen pro μΙ Medium werden 10 bis 100 μΙ, insbesondere 40 bis 60 μΙ dieser Suspension in hängendem Zustand in einer Hanging-Drop Multiwellplatte für 2 bis 7 Tage bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem C02-Gehalt 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, kultiviert, wodurch sich dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente ausbilden. Diese Äquivalente können sofort nach deren Ernte oder nach weiterer Kultivierung für 1 bis 6 Tage in das Vollhautmodell integriert werden. Die Ernte kann durch Zugabe von 70 bis 100 μΙ des zuvor beschriebenen Nährmediums erfolgen. Die Herstellung der in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ist in der deutschen Patentanmeldung DE 10 2015 222 279.9, eingereicht am 12. November 2015, beschrieben, deren gesamter Offenbarungsgehalt hiermit eingeschlossen ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in dem Dermisäquivalent enthalten. Die Inkorporation dieser Schweißdrüsenäquivalente in das Dermisäquivalent erlaubt eine bessere Nachstellung der in-vivo Situation. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn das Dermisäquivalent b) die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente umfasst. Durch Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in das Dermisäquivalent werden Zell-Zell-Interaktionen ermöglicht, welche auch in-vivo vorliegen und welche beispielsweise an Wundheilungsprozessen beteiligt sind.
In dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell sind bevorzugt dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente enthalten, welche bestimmte Durchmesser aufweisen. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils einen Durchmesser von 100 bis 4.000 μιη, vorzugsweise von 100 bis 3.000 μιη, insbesondere von 200 bis 2.500 μιη, aufweisen. Die Angabe des Durchmessers bezieht sich hierbei auf den Durchmesser eines einzelnen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents. Der Durchmesser der kugelförmigen erfindungsgemäßen Schweißdrüsenäquivalente kann beispielsweise mittels mikroskopischer Vermessung unter Verwendung der Software„CellSens" durchgeführt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die in dem erfindungsgemäßen Vollhautmodell enthaltenen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von Matrixverbindungen und/oder Trägern. Unter Matrixverbindungen sind hierbei Verbindungen zu verstehen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Hierunter fallen jedoch nicht die von den Zellen selbst produzierten und ausgeschiedenen Substanzen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Weiterhin werden unter Trägern im Sinne der vorliegenden Erfindung selbsttragende Stoffe verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für die Schweißdrüsenzellen dienen können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern, sind.
Unter dem Begriff „frei von" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weniger als 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und/oder Trägern enthalten. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0 bis 0,2 Gew.-%, insbesondere 0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthält.
In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von bestimmten Matrixverbindungen und Träger. Es ist daher bevorzugt, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent keine Matrixverbindungen und/oder Träger enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den in dem erfindungsgemäßen Hautäquivalent enthaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten um Äquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind. Vollhautmodelle, welche derartige Schweißdrüsenäquivalente enthalten, sind besonders gut zur Identifizierung von schweißhemmenden Wirkstoffen für die in-vivo Anwendung beim Menschen geeignet.
Im Folgenden sind besonders bevorzugte erfindungsgemäße Vollhautmodelle beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein in- vitro Vollhautmodell, umfassend
a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,
b) mindestens ein Dermisäquivalent
c) mindestens ein Epidermisäquivalent
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
Weiterhin ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend
a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,
b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,
c) mindestens ein Epidermisäquivalent
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
Darüber hinaus ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,
b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,
c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
Zudem ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in-vitro Vollhautmodell, umfassend
a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,
b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,
c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet und wobei die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
Schließlich ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ein in- vitro Vollhautmodell, umfassend a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix, wobei die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an lyophilisiertem schwer löslichem Collagen von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält und wobei die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist,
b) mindestens ein Dermisäquivalent, wobei das Dermisäquivalent aus humanen primären Fibroblasten gebildet ist,
c) mindestens ein Epidermisäquivalent, wobei das Epidermisäquivalent aus humanen primären Keratinozyten gebildet ist und wobei das Epidermisäquivalent mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht umfasst
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet und wobei die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Kollagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 200 bis 2.500 μιη aufweisen und wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind.
Die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle weisen eine höhere Standardisierbarkeit und Verfügbarkeit auf wie die derzeit verwendeten Stanzbiopsien und besitzen eine größere Nähe zur in-vivo Situation als Vollhautmodelle, welche keine Schweißdrüsen und/oder Schweißdrüsenäquivalente enthalten. Weiterhin stellen diese Hautäquivalente eine kostengünstige Alternative zu in-vivo Studien am Menschen dar, da mittels dieser Vollhautmodelle die schweißhemmende Wirkung von Testsubstanzen untersucht werden kann, beispielsweise durch Vergleich der Genexpression bzw. Proteinexpression bei einer Stimulierung mit Acetylcholin (ACh) in An- und Abwesenheit einer bestimmten Testsubstanz. Die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle simulieren die menschliche Haut in-vivo sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer histologischen Zusammensetzung, so dass die mit diesen Modellen erhaltenen Informationen gut auf den Menschen übertragbar sind und sich auch mit Daten für bereits in-vivo getestete Verbindungen vergleichen lassen.
Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage,
d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.
Unter dem Begriff „Suspension von schwer löslichem Collagen" wird erfindungsgemäß eine homogene Mischung von festem Collagen in einem Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, verstanden. Zur Herstellung der homogenen Suspension können dem Fachmann bekannte Vorrichtungen, wie statische Mischer oder Ultra Turrex-Mischer, verwendet werden.
Weiterhin bedeutet der Begriff„Kultivieren" ein vorzugsweise in-vitro stattfindendes Aufrechterhalten der Lebensfunktionen von Zellen, insbesondere von Fibroblasten und Keratinozyten, in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwechseledukten und - Produkten, insbesondere auch unter Vermehrung der Zellen.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die in Verfahrensschritt a) bereitgestellte Suspension eine bestimmte Gesamtmenge an Collagen enthält. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält. Der Einsatz von Suspensionen mit den zuvor angeführten Gesamtmengen an Collagen führt zur Ausbildung von besonders stabilen Trägerschichten, so dass eine hohe Stabilität und gute Handhabbarkeit der aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden Vollhautmodelle gewährleistet ist.
Darüber hinaus hat es sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0, 1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist. Der Einsatz von Suspensionen mit den zuvor genannten pH-Werten führt zu der Ausbildung von besonders stabilen Trägerschichten.
Vor der Lyophilisierung in Verfahrensschritt b) wird die Collagensuspension bevorzugt in Behältnisse gegeben, deren Dimensionen denen der gewünschten Trägerschicht entsprechen. Im Rahmen des Verfahrens geeignete Behältnisse sind beispielsweise Kavitäten von Mikrotiterplatten. Zusätzlich ist es möglich, diese Behältnisse vor Zugabe der Collagensuspension mit geeigneten Agentien zu beschichten, um die Haftung der Trägerschicht an der Gefäßwand zu verbessern. Geeignete Agentien sind beispielsweise Gelatine, Polylysin, Fibrin bzw. Fibrinogen/Thrombin oder Fibronectin. Hierzu werden zunächst die inneren Gefäßwände mit den zuvor genannten Agentien benetzt und anschließend getrocknet, so dass eine Schicht der Agentien auf der inneren Gefäßfläche haften bleibt. Anschließend wird die Collagensuspension eingefüllt. Die in Verfahrensschritt b) durchgeführte Lyophilisierung erfolgt bevorzugt in diesen Gefäßen. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Lyophilisierung mit einer bestimmten Kühlrate erfolgt. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt. Die langsame Abkühlrate führt zur Ausbildung eines Häutchens an der Oberfläche der lyophilisierten Trägerschicht, wobei das Häutchen an der Oberfläche Poren aufweist. Diese Poren bilden für die nachfolgende Besiedlung mit Fibroblasten besonders gute Bedingungen, da sie ein langsames Einwandern der Fibroblasten in die Trägerschicht fördern. Höhere Abkühlraten als die zuvor genannten führen hingegen zu einer Trägerschicht mit größeren Poren, welche die Fibroblasten in der gegebenen Kultivierungszeit nicht vollständig mit neusynthetisierter extrazellulärer Matrix ausfüllen können. Ausgesäte Fibroblasten können daher in diesen großen Poren aggregieren und ausdifferenzieren, wodurch die Schichtung und damit die Differenzierung der Dermis empfindlich gestört werden kann. Die zuvor angeführte Abkühlrate gewährleistet daher die Bereitstellung einer Trägerschicht, welche durch die Fibroblasten optimal besiedelt werden kann. Hierdurch wird eine ungestörte Differenzierung erreicht, welche auch derjenigen in der menschlichen Haut entspricht.
Falls als Trägersubstanz eine vernetzte Collagenmatrix verwendet werden soll, erfolgt die Vernetzung dieser Matrix nach der in Verfahrensschritt c) beschriebenen Lyophilisierung. Hierzu eignen sich insbesondere die zuvor im Zusammenhang mit dem ersten Erfindungsgegenstand beschriebenen Vernetzungsmittel. Besonders bevorzugt wird Glutaraldehyd zur Vernetzung eingesetzt. Durch die Vernetzung wird ein Schrumpfungsprozess der Vollhautmodelle während der Herstellung vermieden, so dass aufgrund der einheitlichen Größe und Beschaffenheit eine hohe Reproduzierbarkeit gewährleistet werden kann.
Die Gewinnung und Kultivierung der zur Herstellung des Dermisäquivalents eingesetzten Fibroblasten erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Bevorzugt werden Fibroblasten einer geeigneten Passage, insbesondere der dritten oder vierten Passage, in einer Zellkulturflasche vorkultiviert und unmittelbar vor deren Einsatz durch Trypsinierung vom Boden abgelöst. Als Nährmedium zur Kultivierung der Fibroblasten kann beispielsweise DMEM, welches 10 Gew.-% FCS enthält, eingesetzt werden. Es hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft herausgestellt, wenn zur Herstellung des Dermisäquivalents bestimmte Gesamtkonzentrationen an Fibroblasten verwendet werden. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5, 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Als Medium wird bevorzugt ein DMEM-Medium, welches 10 Gew.-% FCS enthält, eingesetzt. Zur weiteren Stabilisierung kann dem Kulturmedium zusätzlich humanes Fibronection und/oder Laminin zugegeben werden. Bei Fibronection handelt es sich um in Fibroblasten produzierte Struktur- bzw. Adhäsionsproteine, deren Funktion in-vivo in der Bindung anderer Makromoleküle, beispielsweise Collagen, und in der Anheftung von Zellen an Nachbarzellen besteht. Laminin ist ein Protein der Basalmembran, an das Zellen adhärieren können. Durch die Zugabe von Fibronection und/oder Laminin zum Kulturmedium wird die Bindung der Fibroblasten an die Trägerschicht sowie untereinander verstärkt. Der Einsatz der zuvor genannten Gesamtkonzentrationen stellt eine ausreichende Besiedelung der Trägerschicht mit den Fibroblasten sicher. Die Zellzahl der primären Fibroblasten kann beispielsweise unter Verwendung einer klassischen Zählkammer sowie Trypanblau bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von kultivierten primären Fibroblasten unverdünnt mit einer Trypanblau-Lösung versetzt und die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Eckquadraten bestimmt. Aus diesen Werten wird das arithmetische Mittel gebildet. Unter Berücksichtigung des Volumens der Zählkammer, dem Verdünnungsfaktor und dem Kammerfaktor wird aus diesem Mittelwert die Zellzahl pro ml bzw. μΙ bestimmt. Die in Verfahrensschritt c) verwendete Zellzahl bezieht sich hierbei auf die Zahl der lebenden Zellen (Lebendzahl).
Die Kultivierung der in Verfahrensschritt c) auf die Trägerschicht aufgebrachte Fibroblasten erfolgt bevorzugt in einer Submers-Kultur. Hierunter wird die Kultivierung von mit Nährlösung bedeckten Fibroblasten verstanden. Durch Veränderung der Kultivierungsbedingungen oder durch Zugabe von chemischen Substanzen, wie Ceramiden und Vitamin C, zum Medium kann zusätzlich eine Barrierefunktion erzeugt werden. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Kultivierung der primären Fibroblasten, insbesondere der humanen primären Fibroblasten, in Schritt c) über einen Zeitraum von 8 bis 25 Tagen, vorzugsweise von 10 bis 22 Tagen, bevorzugt von 1 1 bis 20 Tagen, insbesondere von 12 bis 18 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.
Die Gewinnung und Kultivierung der zur Herstellung des Epidermisäquivalents eingesetzten Keratinozyten erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Bevorzugt werden Keratinozyten der ersten und/oder zweiten Passage in einer Zellkulturflasche unmittelbar vor deren Einsatz durch Trypsinierung vom Boden abgelöst. Als Nährmedium zur Kultivierung der Fibroblasten kann beispielsweise eine Mischung aus DMEM und Ham's F12, welche 1 bis 30 Gew.-% FCS sowie weitere Serumprodukte und Additive enthält, eingesetzt werden. In Verfahrensschritt d) erfolgt die Aufbringung von Keratinozyten auf das in Verfahrensschritt c) herstellte Dermisäquivalent. Auch hier hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Keratinozyten in einer bestimmten Gesamtkonzentration eingesetzt werden. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x105 bis 9x105 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x105 bis 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Der Einsatz der zuvor genannten Gesamtkonzentrationen stellt eine ausreichende Besiedelung des Dermisäquivalent mit den Keratinozyten sicher. Die Zellzahl kann dabei wie zuvor im Zusammenhang mit der Zellzahl der Fibroblasten beschrieben ermittelt werden.
Die in Verfahrensschritt d) aufgebrachten Keratinozyten werden bevorzugt für eine bestimmte Zeit in einer Submers-Kultur kultiviert. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Kultivierung der primären Keratinozyten, insbesondere der humanen primären Keratinozyten, in Schritt d) in einer Submers-Kultur über einen Zeitraum von 1 bis 8 Tagen, vorzugsweise von 1 bis 6 Tagen, bevorzugt von 1 bis 4 Tagen, insbesondere von 1 bis 2 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt. Besonders bevorzugt erfolgt die Aussaat der Keratinozyten auf die Trägerschicht in einem Zellkulturmedium, besonders bevorzugt DMEM/F12- Medium, welches etwa 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums, fötales Kälberserum (FCS), NCS, definiertes Serum oder Serumersatzprodukte und verschiedene Additive enthält, welche die Proliferation und Differenzierung der Zellen fördern. Anschließend wird die Trägerschicht mit DMEM-Medium, enthaltend insbesondere EGF aus der Maus oder auch vergleichbare Präparate aus anderen Tieren, epidermalen Wachstumsfaktor (hEGF) (z.B. in einer Konzentration von 0,2 igl\ Medium), und beispielsweise 0,8 mM CaCb, überschichtet und einer vorzugsweise 1 - bis 8-tägigen Submers-Kultur unterworfen.
Eine vollständige Differenzierung der Keratinozytenschichten wird durch Kultivierung der Keratinozyten an der Medium-Luft-Grenze erreicht. Diese Art der Kultivierung wird auch als Airlift- Kultur bezeichnet, wobei als Kulturmedium DMEM ohne hEGF und BPE (bovine pituitary extract) eingesetzt wird. Unter einer„Airlift-Kultur" wird eine Kultur verstanden, bei welcher die Höhe des Nährmediumspiegels genau auf die Höhe des Dermisäquivalents abgestimmt ist, während die durch die Keratinozyten ausgebildeten Zellschichten über dem Nährmediumspiegel liegen und vom Nährmedium nicht bedeckt werden, d. h. die Kultivierung erfolgt an der Grenzschicht Luft- Nährmedium, wobei die Versorgung der Kulturen von unten her erfolgt. Dazu werden die Modelle aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte gehoben und auf Filterpapiere gesetzt, welche auf metallenen Abstandshaltern in Petrischalen ruhen. Das Medium wird in den Petrischalen so hoch eingefüllt, dass es das Filterpapier nicht vollständig bedeckt, dass aber ein Flüssigkeitskragen um die Basis der Hautmodelle vorhanden ist (auch als Air-Liquid-Interface bezeichnet). Während der Kultivierung an der Luft-Nährmediumgrenze bildet sich ein hauttypisches Epidermisäquivalent aus. Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium- Grenze über einen Zeitraum von 8 bis 35 Tagen, vorzugsweise von 9 bis 30 Tagen, bevorzugt von 10 bis 20 Tagen, insbesondere von 10 bis 13 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.
Die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Verfahrensschritt c) und/oder d) eingebracht. Die Einbringung der Schweißdrüsenäquivalente in Verfahrensschritt c) während der Herstellung des Dermisäquivalents ist erfindungsgemäß bevorzugt, da hierdurch die in-vivo Situation sehr gut nachgestellt werden kann. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt c) erfolgt, wobei die primären Fibroblasten, insbesondere die humanen primären Fibroblasten, mit den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten vermischt und anschließend auf die in Schritt b) herstellte Trägerschicht aufgebracht werden.
Es kann erfindungsgemäß jedoch auch vorgesehen sein, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente während Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens einzubringen. Es ist daher erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, wenn die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt d) erfolgt, wobei 1 bis 3 Stunden vor Aufbringung der primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ausgesät werden. Unter dem Begriff „Aussähen" ist hierbei die Aufbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente auf die Oberfläche des Dermisäquivalents zu verstehen.
Erfindungsgemäß erfolgt in den zuvor genannten Verfahrensschritten c) und/oder d) die Einbringung von 1 bis 100 diskreten Schweißdrüsenäquivalenten mit jeweils einer Zellzahl von 500 bis 500.000 Zellen sowie einem Durchmesser von 100 bis 6.000 μιη. Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn eine größere Anzahl an Schweißdrüsenäquivalenten mit einem geringen Durchmesser in die Vollhautmodelle eingebracht wird. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn in Schritt c) und/oder in Schritt d), insbesondere in Schritt c), 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 500 bis 2.500 μιη eingebracht werden.
Im Folgenden sind besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von in-vitro Vollhautmodellen beschrieben. Bei diesen Verfahren handelt es sich bevorzugt um Verfahren, bei welchen alle Verfahrensschritte ausschließlich unter Verwendung von in-vitro Methoden durchgeführt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst: a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension,
c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage,
d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1 x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5,5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden,
d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt. Darüber hinaus ist eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1 x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5,5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden,
d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen, wobei in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x105 bis 9x105 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x105 bis 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.
Schließlich ist eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands demnach ein Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen, wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält und wobei die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0,1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension, wobei die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt, c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, wobei zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1 x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5,5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden,
d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen, wobei in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x105 bis 9x105 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x105 bis 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 50 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) erfolgt.
In den zuvor beschriebenen Verfahren zur Herstellung von in-vitro Vollhautmodellen werden bevorzugt dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse eingebracht.
Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen den Vorteil auf, dass zur Herstellung der in-vitro Vollhautmodelle keinerlei Verwendung von in-vivo Methoden erforderlich sind. Folglich können diese Modelle auch zur Testung von Substanzen verwendet werden, welche zur kosmetischen Anwendung vorgesehen sind. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine kostengünstige Herstellung von standardisierten Modellen, welche in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten eingesetzt werden können. Zudem resultiert dieses Herste II verfahren in Vollhautmodellen, welche unterschiedlich differenzierte Zellenschichten aufweisen und Schweißdrüsenspezifische Marker exprimieren, so dass eine gute Übertragbarkeit der mit diesen Modellen generierten in-vitro Daten auf die in-vivo-Situation ermöglicht wird.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen Gesagte.
Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen in- vitro Vollhautmodells in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch. Wie bereits zuvor ausgeführt, kann dieses Vollhautmodell als in-vitro Modell zur Ermittlung des Einflusses von Testsubstanzen auf die Schweißdrüsen im Bereich der Kosmetik und insbesondere der Körperpflege eingesetzt werden. Aufgrund der hohen Standardisierbarkeit sowie der guten Simulation der in-vivo-Situation können die erfindungsgemäßen Vollhautmodelle insbesondere zur Auffindung neuer schweißhemmender Wirkstoffe verwendet werden. Das erfindungsgemäße Vollhautmodell eignet sich insbesondere zur Produktprüfung, beispielsweise im Hinblick auf die Wirksamkeit, unerwünschte Nebenwirkungen, beispielsweise Reiz-, Toxizitäts- und Entzündungswirkungen, allergieauslösende Wirkungen oder Verträglichkeit von Substanzen. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Vollhautmodell auch für Studien zur Resorption, zum Transport und/oder zur Penetration von Substanzen sowie zur Wundheilung verwendet werden. Weiterhin können an diesem Modell die Auswirkungen von äußeren Umwelteinflüssen, wie Strahlung, Wärme, Radioaktivität, elektrische Felder oder dergleichen, auf die Haut untersucht werden. Die Wirkung derartiger Einflüsse kann beispielsweise durch Auswertung der Genexpression, des Stoffwechsels, der Proliferation, der Differenzierung sowie der Reorganisation der Zellen ermittelt werden. Auch kann es vorgesehen sein, das erfindungsgemäße in-vitro Vollhautmodell mit Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Mikroorganismen, wie Pilzen, Bakterien und Viren, zu besiedeln, um Infektionsprozesse und deren Heilung zu studieren.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodells zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein System, insbesondere Testsystem, umfassend ein erfindungsgemäßes in-vitro Vollhautmodell.
Bezüglich weiterer bevorzugter Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten sowie zu dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesagte.
Zusammenfassend wird die vorliegende Erfindung insbesondere durch nachfolgende Punkte charakterisiert:
1. In-vitro Vollhautmodell, umfassend
a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix
b) mindestens ein Dermisäquivalent
c) mindestens ein Epidermisäquivalent
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen
Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
2. In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein schwer lösliches Collagen, insbesondere ein schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst.
3. In-vitro Vollhautmodell nach einem der Punkte 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen, insbesondere ein lyophilisiertes schwer lösliches Collagen aus Sehnen von Pferden, Schweinen oder Rindern, umfasst.
4. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine Gesamtmenge an Collagen, insbesondere lyophilisiertem schwer löslichem Collagen, von 0,5 bis 5,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,8 bis 3,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere von 0,8 bis 1 ,2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Collagenmatrix, enthält. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Collagenmatrix eine vernetzte Collagenmatrix ist.
In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet dass die Vernetzung der Collagenmatrix mittels eines chemischen Vernetzungsmittels aus der Gruppe von Glutaraldehyd, p-Benzochinon, Dimehtyladipimidat, Dimethylpimelinidat, Dimethylsuberimidat, 1 ,4-Phenylendiisothiocyanat, Polyoxyethylen-bis-(imidazolyl carbonyl), bis[Polyoxyethylen- bis(imidazolyl carbonyl)] und Suberinsäure-bis(N-hydroxysuccinimidester), 1-Ethyl-3-(3- dimethyl aminopropyl)-carbodiimid, Enzymen sowie deren Mischungen, insbesondere Glutaraldehyd, erfolgt.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent aus primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, gebildet ist.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtzellzahl von 5x105 bis 6x106, vorzugsweise von 6x105 bis 5x106, insbesondere von 7x105 bis 4x106, enthält.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent aus primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, gebildet ist.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht, umfasst.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtzellzahl von 4x105 bis 5x106, vorzugsweise von 5,5x105 bis 4x106, insbesondere von 6,5x105 bis 3,5x106, enthält.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die Basalmembran Proteine aus der Gruppe von Laminin, Collagen Typ IV sowie deren Mischung umfasst.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 2 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, vorzugsweise 5 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, bevorzugt 20 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, insbesondere 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, umfasst.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente umfasst. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils einen Durchmesser von 100 bis 4.000 μιη, vorzugsweise von 100 bis 3.000 μιη, insbesondere von 200 bis 2.500 μιη, aufweisen. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern, sind.
In-vitro Vollhautmodell nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrixverbindungen und/oder Träger ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.
In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse sind. Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension,
c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen,
e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt. Verfahren nach Punkt 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) eine Gesamtmenge an Collagen von 0,2 bis 4,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,3 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 1 ,5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Suspension, enthält.
Verfahren nach einem der Punkte 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von schwer löslichem Collagen in Schritt a) einen pH-Wert von pH 0, 1 bis pH 6,9, vorzugsweise von pH 2,0 bis pH 5,0, bevorzugt von pH 3,0 bis pH 4,5, insbesondere von pH 3,5 bis pH 4,0, aufweist. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lyophilisierung der Collagensuspension in Schritt b) mit einer Kühlrate von 5 °C bis 40 °C pro Stunde, vorzugsweise von 10 °C bis 30 °C pro Stunde, bevorzugt von 18 °C bis 23 °C pro Stunde, insbesondere von 20 °C bis 22 °C pro Stunde, erfolgt.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5, 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der primären Fibroblasten, insbesondere der humanen primären Fibroblasten, in Schritt c) über einen Zeitraum von 8 bis 25 Tagen, vorzugsweise von 10 bis 22 Tagen, bevorzugt von 1 1 bis 20 Tagen, insbesondere von 12 bis 18 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt. Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x105 bis 9x105 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x105 bis 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der primären Keratinozyten, insbesondere der humanen primären Keratinozyten, in Schritt d) in einer Submers-Kultur über einen Zeitraum von 1 bis 8 Tagen, vorzugsweise von 1 bis 6 Tagen, bevorzugt von 1 bis 4 Tagen, insbesondere von 1 bis 2 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen Zeitraum von 8 bis 35 Tagen, vorzugsweise von 9 bis 30 Tagen, bevorzugt von 10 bis 20 Tagen, insbesondere von 10 bis 13 Tagen, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C erfolgt.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt c) erfolgt, wobei die primären Fibroblasten, insbesondere die humanen primären Fibroblasten, mit den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten vermischt und anschließend auf die in Schritt b) herstellte Trägerschicht aufgebracht werden.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt d) erfolgt, wobei 1 bis 3 Stunden vor Aufbringung der primären Keratinozyten, insbesondere humanen primären Keratinozyten, die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente ausgesät werden.
Verfahren nach einem der Punkte 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) und/oder in Schritt d), insbesondere in Schritt c), 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit einer Zellzahl von jeweils 50 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 500 bis 2.500 μιη eingebracht werden.
31. Verwendung des in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
32. Verwendung eines in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 in vorzugsweise automatisierten Screeningverfahren, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung kosmetischer Wirkstoffe, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
33. Verwendung eines in-vitro Vollhautmodells nach einem der Punkte 1 bis 18 zur in-vitro Bewertung des Einflusses von kosmetischen Wirkstoffen auf die Hemmung und/oder Verminderung der Schweißsekretion und/oder des Körpergeruchs.
34. System, insbesondere Testsystem, umfassend ein in-vitro Vollhautmodell nach einem der Punkte 1 bis 18.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken: Beispiele:
1.1 Isolation der Schweißdrüsen
Die nativen Schweißdrüsen wurden aus humanen Gewebeproben, sogenannten Biopsien gewonnen, welche aus plastischen Operationen von Patienten stammen, die der Verwendung des Materials zu Forschungszwecken zugestimmt haben. Das verwendete Gewebe wurde bei Oberarmstraffungen und Gesichtsstraffungen entnommen. Hieraus wurden die ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen aus dem Achselbereich isoliert.
Hierzu wurde die jeweilige Biopsie in kleine Stücke zerteilt und danach in Stücke von maximal ca. 1 cm x 1 cm geschnitten wurde. Anschließend erfolgte der Verdau der Haut mit einem Gemisch aus gleichen Teilen Collagenase II (5 mg/ml) und Thermolysin (0,25 mg/ml) bei 37 °C im Brutschrank für ca. 3,5 bis 5 Stunden, bis das Bindegewebe fast vollständig verdaut war. Diese Mischung wurde anschließend bei 1200 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen, um die Enzymlösung sowie das überschüssige Fett zu entfernen. Das entstandene Pellet wurde in DMEM- Lösung aufgenommen und die Lösung in eine Petrischale überführt. Anhand einer Mikrokapillare wurden intakte Schweißdrüsen unter einem Binokular isoliert und in frisches DMEM-Medium überführt.
1.2 Kultivieren der isolierten nativen Schweißdrüsen
Die in Schritt 1.1 isolierten Schweißdrüsen wurden in Collagen-I beschichtete Kulturflaschen gegeben und anschließend 25 ml Nährmedium hinzugefügt. Nach Kultivierung für 7 bis 21 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die auswachsenden Schweißdrüsenzellen abgelöst und auf Collagen-I beschichteten Kulturflaschen erneut bis zur Konfluenz kultiviert (Monolayer-Kultur der primären Schweißdrüsenzellen).
Die Zusammensetzung des eingesetzten Nährmediums ist wie folgt:
1 .3 Herstellung der Zellpräparation und der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente
Nach Bestimmung der genauen Zellzahlen der obigen Monolayer-Kulturen der primären Schweißdrüsenzellen wurden diese unter Verwendung des obigen Nährmediums auf eine Zellzahl von 10 bis 5.000 Zellen pro μΙ eingestellt und anschließend je 50 μΙ dieser Zellsuspension mittels des„SureDrop® Inlef'-Einführsystems in Wells einer„GravityPLUS®"-Einsaatplatte (jeweils Firma Inshpero AG, Schweiz) überführt. Die Kultivierung erfolgt bei 36 bis 38 °C und einem C02-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre. Nach 1 bis 3 Tagen werden jeweils 40 Vol.-% des Mediums in den Wells der„GravityPLUS®"- Einsaatplatte durch frisches Nährmedium ersetzt. Nach 3 bis 5 Tagen Kultivierung werden die SD- Schweißdrüsenäquivalente durch Zugabe von 50 bis 200 [iL Nährmedium geerntet und in eine „GravityTRAP®"-Platte (Firma Insphero AG, Schweiz) überführt. Vor der Ernte wird die „GravityTRAP®"-Platte mit 60 bis 100 [iL Keratinozyten-Medium mithilfe einer Multikanalpipette angefeuchtet, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren und den Verlust der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente zu vermeiden. Nach der Ernte wird die Platte für 1 bis 5 Minuten bei 100 bis 300 xg zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen.
1 .4 Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells mit dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in dem Dermisäquivalent
Die Herstellung der Trägerschicht, welche eine vernetzte Collagenmatrix umfasst, erfolgt analog dem in den Beispielen 1 und 2 auf den Seiten 22 und 23 der Offenlegungsschrift WO 2006/019147 A1 beschriebenen Verfahren. Nach Absaugen des Mediums wird auf diese in Mikrotiterplatten befindliche Trägerschicht 1 ml einer Mischung vorkultivierten Fibroblasten (6x105 Fibroblasten pro ml Medium, als Medium wird DMEM mit 10 Gew.-% FCS, 100 U/ml Penicillin G, 25 μg/ml Gentamicin sowie 1 mM Ascorbyl-2-phosphat verwendet) mit 60 bis 100 der unter Punkt 1.3 herstellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente (Zellzahl pro Äquivalent ca. 25.000 Schweißdrüsenzellen) gegeben. Hierzu werden die in Kulturflaschen vorkultivierten Fibroblasten der dritten oder vierten Passage durch Zugabe eine Trypsinlösung vom Boden der Kulturflaschen gelöst, mit Medium gewaschen und abzentrifugiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wird die Zellsuspension auf die zuvor angeführte Konzentration eingestellt und die zuvor genannte Anzahl an diskreten Schweißdrüsenäquivalenten zugegeben. Nach Aufbringung der Mischung aus Fibroblasten und Schweißdrüsenäquivalenten auf die Trägerschicht wird der Plattendeckel aufgelegt und die Platte für 16 Tage bei 37 °C und 5 % v/v CO2 submers inkubiert, wobei alle 3 Tage ein Mediumwechsel erfolgt. Nach 16 Tagen hat sich ein Dermisäquivalent ausgebildet, in welches die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente inkorporiert sind. Auf dieses Dermisäquivalent werden anschließend Keratinozyten ausgesät. Hierzu werden Keratinozyten der ersten oder zweiten Passage in Zellkulturflaschen mit unter Punkt 1.2 angeführten Nährmedium vorkultiviert und anschließend durch Zugabe einer Trypsinlösung vom Boden abgelöst. Nach Waschen mit Nährmedium und Abzentrifugieren wird die Zellzahl der Keratinozytensuspension auf 1 -6x105 Keratinozyten pro ml Medium eingestellt. Aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, welche die Dermisäquivalente enthalten, wird das Medium so weit abgesaugt, dass die Oberfläche der Dermisäquivalente feucht bleibt. Anschließend wird 1 ml der zuvor herstellten Keratinozytensuspension zugegeben und der Plattendecken aufgelegt. Die Kultivierung in Submers-Kultur erfolgt für 2 Tage bei 37 °C und 5 % v/v CO2. Nach Ablauf der zwei Tage werden die Hautmodelle aus den Vertiefungen geholt und auf Filterpapiere gesetzt, welche auf metallenen Abstandshaltern in einer Petrischale liegen. Die Petrischale wird nun mit dem unter Punkt 1.2 angeführten Nährmedium soweit gefüllt, dass das Medium den oberen Rand des Filterpapiers erreicht und sich um die Basis der Hautmodelle verteilt. Die Oberfläche der Modelle ist hingegen nicht von Medium bedeckt (Airlift-Kultur). Nach Kultivierung für weitere 1 1 Tage als Airlift-Kultur werden die erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodelle erhalten, welche eine vielschichtige Epidermis sowie eine verhornte Gewebeoberfläche ausgebildet haben.
1.5 Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells mit dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in dem Epidermisäquivalent
Die Herstellung der Trägerschicht, welche ein Dermisäquivalent trägt, erfolgt analog dem in der Offenlegungsschrift WO 2006/018147 A1 auf den Seiten 22 bis 24 beschriebenen Beispielen 1 bis 3, wobei die Kultivierung der Fibroblasten für 16 Tage erfolgt ist. Auf dieses Dermisäquivalent werden die unter Punkt 1.3 hergestellten dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente gegeben, in dem diese in dem unter Punkt 1.2 beschriebenen Nährmedium suspendiert und diese Suspension anschließend auf das Dermisäquivalent aufgebracht wird. Nach 1 bis 2 Stunden erfolgt die Aussaat der Keratinozyten, wie unter Punkt 1 .4 beschrieben. Nach 1 Tag unter Submers-Bedingungen werden die Modelle in das Kulturformat des Air-Liquid-Interface umgesetzt und für weitere 1 1 Tage unter diesen Bedingungen kultiviert. Die auf diese Weise hergestellten in-vitro Vollhautmodelle weisen eine vielschichtige Epidermis sowie eine verhornte Gewebeoberfläche auf. 1.6 Analyse der in-vitro Vollhautmodelle
Zum Nachweis der Proteinexpression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen wurden Immunfluoreszenzfärbungen an histologischen Schnitten durchgeführt. Hierzu wurden die unter den Punkten 1 .4 und 1.5 hergestellten in-vitro Vollhautmodelle in 1 x 0.5 cm große Stücke zerschnitten und in Paraffin eingelegt oder mit Einbettmedium eingefroren. Anschließend wurden die Objekte nach einem Standard-Fluoreszenz Protokoll für histologische Schnitte (z.B. vom Hersteller Abcam, Cambridge/UK) geschnitten und angefärbt. Die angefärbten Proben können dann unter einem Fluoreszenz-Mikroskop oder einem Konfokalen Laser Scanning Mikroskop analysiert werden. Es konnten die folgenden, Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteine nachgewiesen werden: Carcinoembryonales Antigen (CEA), Alpha smooth muscle Actin (alpha-SMA), Muskarinischer Acetylcholinrezeptor M3 (M-ACh-R3), Natrium-Kalium-Chlorid Kotransporter 1 (NKCC1 ), Galanin Rezeptor 2 (GalR2). Die Expression von Schweißdrüsen-spezifischen Markerproteinen in den erfindungsgemäßen in-vitro Vollhautmodellen zeigt, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in diesen Modellen ihre natürliche Funktion beibehalten haben. Daher können diese Modelle zur Untersuchung des Einflusses von Wirkstoffen auf die Schweißhemmung verwendet werden.

Claims

Patentansprüche:
1. In-vitro Vollhautmodell, umfassend
a) mindestens eine Trägerschicht, umfassend mindestens eine Collagenmatrix
b) mindestens ein Dermisäquivalent
c) mindestens ein Epidermisäquivalent
d) mindestens eine Basalmembran, wobei sich diese Basalmembran zwischen dem Dermisäquivalent und dem Epidermisäquivalent befindet,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 1 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent(e) umfasst, wobei die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen umfassen und einen Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη aufweisen.
2. In-vitro Vollhautmodell nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtzellzahl von 5x105 bis 6x106, vorzugsweise von 6x105 bis 5x106, insbesondere von 7x105 bis 4x106, enthält.
3. In-vitro Vollhautmodell nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Epidermisäquivalent mehrere voneinander verschiedene Zellschichten, insbesondere mindestens zwei unterschiedlich differenzierte Zellschichten sowie mindestens eine verhornte Zellschicht, umfasst.
4. In-vitro Vollhautmodell nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Dermisäquivalent b) und/oder das Epidermisäquivalent c) 2 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, vorzugsweise 5 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, bevorzugt 20 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, insbesondere 50 bis 100 dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente, umfasst.
5. Verfahren zur Herstellung eines in-vitro Vollhautmodells, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfasst:
a) Bereitstellung einer Suspension von schwer löslichem Collagen,
b) Herstellung der Trägerschicht durch Lyophilisierung der in Schritt a) bereitgestellten Collagensuspension,
c) Herstellung des Dermisäquivalents durch Aufbringung von primären Fibroblasten, insbesondere humanen primären Fibroblasten, auf die in Schritt b) hergestellte Trägerschicht und Kultivierung dieser Fibroblasten über einen Zeitraum von 7 bis 28 Tage, d) Aufbringung von primären Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, auf das in Schritt c) hergestellte Dermisäquivalent und Kultivierung dieser Keratinozyten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Tagen, e) Kultivierung des nach Schritt d) erhaltenen Modells an der Luft-Medium-Grenze über einen
Zeitraum von 7 bis 42 Tagen,
wobei die Einbringung von 1 bis 100 dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten mit einer Zellzahl von jeweils 500 bis 500.000 Schweißdrüsenzellen und einem Durchmesser von jeweils 100 bis 6.000 μιη durch Zugabe dieser Äquivalente in Schritt c) und/oder Schritt d) erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des Dermisäquivalents in Schritt c) primäre Fibroblasten, insbesondere humane primäre Fibroblasten, in einer Gesamtkonzentration von 2x105 bis 2x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 3x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 4x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4,5x105 bis 5, 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt d) primäre Keratinozyten, insbesondere humane primäre Keratinozyten, in einer Gesamtkonzentration von 1 ,5x105 bis 1x106 Zellen pro ml Medium, vorzugsweise von 2,5x105 bis 9x105 Zellen pro ml Medium, bevorzugt von 3,5x105 bis 7x105 Zellen pro ml Medium, insbesondere von 4x105 bis 5x105 Zellen pro ml Medium, verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Einbringung der dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente in Schritt c) erfolgt, wobei die primären Fibroblasten, insbesondere die humanen primären Fibroblasten, mit den dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten vermischt und anschließend auf die in Schritt b) herstellte Trägerschicht aufgebracht werden.
9. Verwendung des in-vitro Vollhautmodells nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in der Kosmetik und der Körperpflege, insbesondere zur Testung, Identifizierung und Untersuchung von kosmetischen Wirkstoffen, bevorzugt bezüglich deren Wirksamkeit in Bezug auf die Hemmung und/oder Verminderung von Körperschweiß und/oder Körpergeruch.
10. System, insbesondere Testsystem, umfassend ein in-vitro Vollhautmodell nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
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