EP2912469B1 - Verfahren zur detektion von endotoxinen und/oder 1,3-beta-d-glucanen in einer probe - Google Patents

Verfahren zur detektion von endotoxinen und/oder 1,3-beta-d-glucanen in einer probe Download PDF

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EP2912469B1
EP2912469B1 EP13780171.8A EP13780171A EP2912469B1 EP 2912469 B1 EP2912469 B1 EP 2912469B1 EP 13780171 A EP13780171 A EP 13780171A EP 2912469 B1 EP2912469 B1 EP 2912469B1
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EP
European Patent Office
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particles
sample
endotoxins
concentration
detection
Prior art date
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EP13780171.8A
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EP2912469A1 (de
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Melanie KUCKI
Annette Kraegeloh
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Leibniz Institut fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
Original Assignee
Leibniz Institut fuer Neue Materialien Gemeinnuetzige GmbH
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of endotoxins and / or 1,3- ⁇ -D-glucans, a kit for carrying out the method and the use of particles in such a method.
  • Microbiological contaminants in products can cause serious illnesses in humans.
  • Gram-negative bacteria play an important role. Testing for such bacteria or their decay products is mandatory for many products, such as medical devices.
  • the readout of the coagulation cascade can be done in different ways.
  • the gelation of the sample can be determined ( gel clot test or gelation test).
  • Other methods are based on turbidity measurements or kinetic turbidity measurements.
  • Other methods use fluorescent substrates for coagulation cascade enzymes.
  • the simplest method is the gelation test. It is versatile and feasible without much equipment. In addition, he is classified as the most reliable evidence after the European Pharmacopoeia. The detection limit for most of the available tests is 0.03 EU / ml (endotoxin units / ml).
  • a sample In order not to fall short of the sensitivity required for a sample, a sample must not exceed the maximum permitted Dilution (MVD). This is calculated from the sensitivity of the detection and the limit value for endotoxins specified for the sample to be examined. As a result, some samples can not be measured because they can not be diluted sufficiently to avoid interference.
  • MMD maximum permitted Dilution
  • the gelation test requires a large amount of reagent, which must be obtained from live animals.
  • the coagulation cascade can also be triggered by other substrates.
  • the described detection also 1,3- ⁇ -D-glucans (1,3-beta-D-glucans) can be detected.
  • the object of the invention is to provide a method which improves the sensitivity of the detection of endotoxins and / or 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • the invention relates to the detection of endotoxins and / or 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • an endotoxin is understood to mean a pyrogenic component of the cell membrane of Gram-negative bacteria.
  • LPS lipopolysaccharides
  • a 1,3- ⁇ -D-glucan is meant any water-soluble polysaccharide or derivative thereof which can initiate the coagulation cascade in natural LAL and has at least two glucose molecules which are ⁇ -1,3-glycosidically linked.
  • the polysaccharide may also have other glycosides, which may also be linked together in other ways.
  • the sample is contacted with an amebocyte lysate and at least one type of particle.
  • the amebocyte lysate is a lysate which is reconstituted before contacting or during contacting. Reconstitution may be required if the lysate For example, it is stored freeze-dried.
  • the contacting preferably consists of producing a mixture of all the components used.
  • the order of addition of the components is not critical. It is possible to first introduce the nanoparticles into the sample and only then to add the lysate. Preferably, the lysate is added as the last ingredient. The particles can also first be added to the lysate. The process may also include the addition of other components.
  • amebocyte lysate is understood to mean any lysate or part thereof which has been obtained from horseshoe crabs and / or has been produced therefrom in vitro .
  • the lysate may also comprise, or only additionally, one or more isolated or recombinantly produced components of the horseshoe crab coagulation cascade.
  • the amebocyte lysate was preferably obtained from horseshoe crabs and / or consists of isolated or recombinant constituents of the horseshoe crab coagulation cascade. These are preferably the enzymes FIG. 1 ,
  • amebocyte lysate is preferably a lysate prepared from the hemolymph of horseshoe crabs ( Limulidae ), more preferably Limulus polyphemus, Tachypleus gigas, Tachypleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda.
  • Limulidae horseshoe crabs
  • TAL Tachypleus tridentatus
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the coagulation cascade in the detection of endotoxins or 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • An endotoxin 101 first activates factor C 102 to 103. This affects a factor B (104 ⁇ 105: activated factor B). This activated factor B105 activates the "proclotting enzyme” 106 to produce the clotting enzyme 107 ( “clotting enzyme "). This enzyme hydrolyzes specific positions of coagulogen 108 to produce coagulin 109. This leads to gelation or turbidity of the sample. This activation is also called "Factor C Path".
  • the coagulation cascade can also be triggered in another way by 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • a reactive glucan (110) activates a factor G (111 ⁇ 112).
  • the lysate according to the invention may also comprise only parts of the coagulation cascade.
  • the activity of the corresponding reaction path can be reduced. This can also be influenced by the preparation of the lysate.
  • the lysate may also comprise recombinantly produced enzymes of the coagulation cascade, eg enzymes FIG. 5 , So can
  • recombinant factor C can be used.
  • the change to be detected by a specific substrate of the activated factor C can be achieved.
  • the sample is contacted with at least one type of particle having a primary particle size of less than 300 nm.
  • a type of particle is understood to mean particles which resemble each other in their composition, size and morphology.
  • the particles can have any shapes. They may be platy, fibrous, rod-shaped or spherical. They can be amorphous, porous or crystalline.
  • the particles have a surface of at least one metal or semimetal. This means that at least part of their surface consists of at least one metal or semimetal oxide.
  • the particles may consist entirely of a metal or semimetal oxide.
  • the at least one metal or semimetal oxide is preferably selected from the group comprising the oxides of Mg, Ca, Se, Ba, Al, Si, Sn, Pb, Bi, Ti, Zr, V, Mn, Nb, Ta, Cr, Mo. , W, Fe, Co, Fu, Cu, Zn, Ce and Y.
  • the at least one is the metal or semimetal oxide selected from the group consisting of silica, titania or zirconia. It is preferably silicon dioxide or titanium dioxide, particularly preferably silicon dioxide. In a preferred embodiment, it is amorphous silica.
  • the particles may also comprise other materials, preferably inorganic substances such as oxides. It may be For example, be carrier materials which are at least partially coated with the at least one metal or Halbmetalloxid. As support materials different materials can be used. It may be organic or inorganic materials.
  • organic materials they may be particles or platelets of an organic polymer.
  • support materials may be particles or platelets of oxides, sulfides, selenides, tellurides and / or phosphides.
  • oxides of metals and semimetals such.
  • It may also be particles containing multiple oxides.
  • it is iron oxide particles.
  • the support materials are particularly preferably iron oxide particles having a primary particle size of less than 10 nm.
  • the carrier materials are completely coated with the metal or semimetal oxide, preferably with silicon dioxide.
  • the coating of the carrier materials and production of the particles is preferably carried out by the sol-gel process.
  • This method is based on the acidic or alkaline hydrolysis of matrix formers.
  • the matrix formers are hydrolyzable precursor compounds of the at least one metal or semimetal oxide. These can be for example halides or Be alkoxides.
  • Preferred matrix formers are compounds of the formula I. SiX 4 (I) used, wherein X may be the same or different and represents a hydrolyzable group selected from the group of halides (Cl, Br, I) or alkoxides (C 1 -C 8 alkoxides). Examples of such compounds are tetramethoxysilane or tetraethoxysilane.
  • a condensation of a metal or semimetal oxide layer, preferably a silicon dioxide layer, on the surface of the carrier material occurs.
  • the particles according to the invention have no surface modification on the metal or semimetal oxide surface.
  • the lysate must be able to interact with the metal or semimetal oxide.
  • a surface modification reduces the interaction between the proteins of the Detection and the surface of metal or Halbmetalloxid. The surface modification therefore leads to a smaller increase in the sensitivity of the detection than by unmodified particles. This can be easily determined by comparative experiments.
  • the particles have a specific surface area of more than 10 m 2 / g, based on the metal or semimetal oxide.
  • the particles have a primary particle size (measured by TEM / SEM) of less than 300 nm, particularly preferably less than 250 nm.
  • the primary particle size is preferably between 2 nm and 200 nm.
  • nanoparticles are particles which have a primary particle size or primary particle size (measured with TEM / SEM) of below 100 nm. Preference is given to particles having a primary particle size of less than 50 nm, preferably less than 10 nm.
  • the primary particle size of the nanoparticles may also be between 2 nm and 50 nm.
  • the particles can also be characterized by their hydrodynamic diameter (measured in water with DLS).
  • the hydrodynamic diameter is preferably below 500 nm, more preferably below 200 nm, including 200 nm.
  • the hydrodynamic diameter is preferably between 10 nm and 200 nm.
  • the particles are preferably redispersible to the primary particle size. They are not available as aggregates.
  • Only one type of particle can be used. Alternatively, however, two, three, four or more types of particles may be used. Preferably, all types of particles used in the detection meet the requirements of the invention.
  • the particles have a zeta potential in water of less than -30 mV, preferably less than -40 mV. Particularly preferred is a zeta potential between -40 mV and -45 mV.
  • the zeta potential has a special influence on the interaction of the particles with the lysate.
  • the concentration of the particles in the contacted sample is below 500 mg / ml. But it can also be chosen significantly lower.
  • the concentration of the particles can have an influence on the sensitivity of the detection. Thus, higher concentrations increase the sensitivity of the detection. Excessive concentrations may also prove negative influence.
  • the permissible concentrations can be determined by the person skilled in the art for the particles used by simple comparative experiments.
  • the concentration of the particles is preferably below 250 ⁇ g / ml, below 125 ⁇ g / ml or below 62.5 ⁇ g / ml. In the case of particles having a primary particle size of less than 10 nm, the concentration is preferably below 100 ⁇ g / ml.
  • the detection is usually carried out at a pH between 6 and 8.
  • the sample After contacting the sample, the sample is checked for a change. This change may affect different properties of the sample. This may change the consistency of the sample (gelation). Also, the turbidity or the color of the sample may change.
  • the change in the sample can be measured by any suitable method. These can be optical methods such as inspection after inversion of the sample, turbidity, transmission, absorption or fluorescence. The measurement can be done at a specific time or continuously. Thus, the kinetics of the change of the sample can be determined and evaluated. It is also possible to measure the fluorescence of fluorescence probes used which indicate the activation of the coagulation cascade.
  • these can be substrates for individual in FIG. 1 be shown enzymes of the coagulation cascade.
  • Such substrates may be short peptide chains modified with detectable probes or precursors thereof.
  • These can be, for example, nitroanilines, which can be converted into dyes.
  • the presence of a change in the sample indicates the presence of endotoxins and / or 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • control experiments e.g. Addition of glucan blockers, dilution series, positive controls and negative controls to verify the result. This can also distinguish between endotoxins and 1,3- ⁇ -D-glucans.
  • Endotoxins and / or 1,3- ⁇ -D-glucans within the meaning of the invention also comprise only one type of endotoxin and / or a type of 1,3- ⁇ -D-glucan.
  • the particles are spherical silica particles having a primary particle size between 30 nm and 150 nm. It is also possible to use mixtures of at least two particles having different particle sizes.
  • the particles are spherical metal oxide-silicon dioxide core-shell particles, preferably iron oxide-silicon dioxide core-shell particles, having a primary particle size between 2 and 100 nm. Such particles may exhibit an increase in sensitivity to 0.000875 EU / ml. This corresponds to factor 34 compared to the standard proof.
  • the particles of the invention increase the sensitivity of gel clot detection for endotoxins preferably to below 0.015 EU / ml, 0.007 EU / ml, 0.0035 EU / ml or 0.00175 EU / ml.
  • FIG. 4 shows that the sensitivity increases depending on the available surface.
  • the available calculated surface area of the particles in the detection above 0.02 m 2 / ml, preferably above 0.04 m 2 / ml.
  • the method may include further steps. So it may still be necessary to adjust the pH of the sample.
  • the method may also include the addition of further additives.
  • these may be flocculants, detection probes (eg fluorescence-labeled substrates for enzymes of the lysate) or buffers. This may be a substrate for the activated factor C, proclotting enzyme or gelling enzyme .
  • the method may also include the performance of control samples to verify the results. These can be positive samples, negative samples and / or dilution series.
  • the method may also include the implementation of IEC.
  • the invention further relates to a kit for the detection of endotoxins.
  • a kit for the detection of endotoxins.
  • Such a kit comprises an amebocyte lysate and at least one type of particle having a surface of at least one metal or semimetal oxide, the particles having no surface modification, having a zeta potential in water of below -30 mV, in the contacted sample in present at a concentration of less than 500 ug / ml and have a primary particle size of less than 300 nm.
  • the particles may be in suspension or in dry form.
  • the amebocyte lysate may be reconstituted or in reconstitutable form.
  • the kit may contain other ingredients such as buffers or standards.
  • the invention further relates to the use of particles having a surface of at least one metal or semimetal oxide for improving the sensitivity of detection of endotoxins with an amebocyte lysate, which particles have no surface modification, a zeta potential in water of below -30 mV present in the contacted sample in a concentration of less than 500 ug / ml and have a primary particle size of less than 300 nm.
  • area information always includes all - not mentioned - intermediate values and all imaginable subintervals.
  • the silica particles were prepared by a modified Stöber method (Stoeber et al., 1968) or by L-arginine catalyzed hydrolysis of tetraethoxysilane (TEOS) in a two-phase water / cyclohexane system (Hartlen et al., 2008).
  • the iron oxide cores for the silica-coated particles were purchased from Nanogate AG (Quier Kunststoff-Göttelborn, Germany) and coated with silica using a modified Stöber method.
  • One of the nanoparticles used contained a fluorescent label (f) with the deep red fluorescent dye Atto647N-NHS.
  • a silane linker was coupled to the dye.
  • the dye modified in this way was added to the water / cyclohexane system during the synthesis of the particles and in this way integrated into the silica matrix of the particles. Modification with PEG was achieved by condensation of a mPEG750-modified silane linker on the surface of the particles. All chemicals for particle synthesis were purchased from Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Germany). Atto647N NHS ester (NHS: N-hydroxysuccinimide ester) was purchased from Atto-Tec (Siegen, Germany).
  • Endorem® a composition of dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles used as a contrast agent for magnetic resonance imaging (MRI magneto-imaging), was purchased from Guerbet GmbH (Sulzbach, Germany) and used as a reference material. After preparation, all particles were purified by dialysis against endotoxin-free Milli-Q water, followed by sterile filtration on a sterile Working surface with cellulosic membranes with 0.2 ⁇ m pore size. The particles were stored at 4-8 ° C until used. The particles and their properties are given in Table 1.
  • UV-vis spectra in the wavelength range of 350-800 nm were recorded on a Cary 5000 spectrometer (Varian Inc., Germany). The pH of all samples was measured and was in the range prescribed for the assay (pH 6-8). An adjustment of the pH was therefore not necessary.
  • Endotoxin assays were performed with the LAL Gel Clot Assay Lonza (Pyrogent TM Plus N294-03, Lonza Walkersville Inc., Walkersville, MD, USA). All materials used were sterile and pyrogen-free according to the manufacturer's instructions.
  • Lyophilized LAL was reconstituted in endotoxin-free water and vortexed for at least 30 seconds (not shaken). The reconstituted LAL was used as soon as possible.
  • the sensitivity of the assay was tested according to the above procedure for different concentrations of the nanoparticles.
  • a two-fold dilution series was prepared from a 1 EU / ml endotoxin solution (2 ⁇ , 1 ⁇ , 0.5 ⁇ , 0.25 ⁇ ).
  • no endotoxin-free water was used, but the suspension of the nanoparticles.
  • the sensitivity was examined as described under point 4.3.
  • IEC is also mandatory in the usual procedure to minimize spurious measurements due to inhibition or enhancement effects. According to the SOP, the test is considered unaffected if the measured sensitivity is in the range of 0.5 ⁇ and 2 ⁇ (IEC criteria). IEC were performed at MVD and at least one more particle concentration.
  • a sample of the nanoparticles with double test concentration was prepared.
  • 1: 1 ⁇ -G blocker (Lonza) was added.
  • the sample was examined as indicated above.
  • samples of nanoparticles without ⁇ -G blocker, ⁇ -G blocker in endotoxin-free water, positive sample with endotoxin (2 ⁇ ) and ⁇ -G blocker were used.
  • Table 1 shows the investigated nanoparticle suspensions.
  • Table 2 shows the results of the investigation of these suspensions on nanoparticles.
  • endotoxins> 0.03 EU / ml were found in some samples, the IEC for MVD showed an increase in the sensitivity of detection in almost all samples.
  • the positive samples it could be shown that no ⁇ -glucan interference was present. Contamination of the samples with endotoxins could be excluded due to the production of the nanoparticles and the control experiments.
  • silica 1-25 When samples were measured at a concentration of 62.5 ⁇ g / ml (corresponding to MVD for nanoparticles), only endorem and silica 1-25 showed no change in the sensitivity of the detection. However, the silica 1-25 particles also had a significantly altered zeta potential of -24.2 mV.
  • silica-2, Silica-3-80, Silica-5 f , Silica-6 + PEG f showed an increase in sensitivity but within the limits of IEC.
  • silica-4-130 see also Fig. 2
  • a suspension of monodisperse silica particles having a primary particle size of 130 nm exhibited a higher gain than allowed by IEC when tested within the allowable dilution range (up to MVD).
  • Table 3 shows concentration-dependent IEC for silica-2 ( Fig. 3 ). Where + stands for a positive proof and - for a negative proof. A reduction in the concentration of the particles in this case also led to a deterioration in the sensitivity of the detection.
  • silica-5 f and silica-6 + PEG f were similar in size. It was found that at a high particle concentration (500 ⁇ g / ml SiO 2 ) the amplification of the sensitivity was different. PEG-modified particles Silica-6 + PEG f showed less enhancement within the IEC acceptance criteria. The gain in the case of the silica 5 f , however, was outside the acceptance criteria. This indicates that the reinforcement is reduced by surface modification of the particles with organic groups.
  • the iron oxide-silica core-shell particles Fe x O y @SiO 2 -1, Fe x O y @ SiO 2 -2 f and Fe x O y @ SiO 2 -3 f were prepared by the same method. In the case of fluorescently labeled particles, only one fluorescent dye was incorporated into the particles as already described. All particle suspensions showed similar behavior in the LAL gel clot assay. There were no differences due to fluorescent labeling.
  • Table 4 shows concentration-dependent IEC for Fe x O y @SiO 2 -1. The results show a significant increase in sensitivity as a function of the concentration of the particles. At a concentration of 62.5 ⁇ g / ml, it was still possible to detect 0.000875 EU / ml. This corresponds to an increase by a factor of 34.
  • the larger particles Fe x O y @SiO 2 -4 f were also investigated. They also showed a significant increase in the sensitivity of detection to MVD. However, complete inhibition of the assay at 500 ⁇ g / ml could not be observed.
  • Endorem ® is a composition of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) with a primary particle size of 5 nm. It is approved as a contrast agent for the study of liver metastases. The particles are surface-modified with dextran.
  • SPION superparamagnetic iron oxide nanoparticles
  • Endorem® showed no interaction with the LAL gel clot assay at the lowest concentration used (62.5 ⁇ g / ml). Even when used neat (11.2 mg / ml), no complete inhibition of detection was observed. Also a precipitation of the particles was not observed.
  • Concentration dependent IEC for Fe x O y @SiO 2 -1 Particle concentration in ⁇ g / ml IEC endotoxin value in EU / ml 0.03 0,015 0,007 0.0035 0.00175 0.000875 62.5 + + + + + + + + + + + + + + + 50 + + + + + + + - ND 40 + + + + - - ND 31.25 + + - - - - 15.625 + - - ND ND ND ND ND not measured

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen, ein Kit zur Durchführung des Verfahrens und die Verwendung von Partikeln in einem solchem Verfahren.
    • Stand der Technik
  • Mikrobiologische Verunreinigungen in Produkten können beim Menschen schwere Krankheiten auslösen. Dabei spielen insbesondere gramnegative Bakterien eine wichtige Rolle. Die Prüfung auf solche Bakterien, bzw. ihrer Zerfallsprodukte, ist für viele Produkte, beispielsweise für Medizinprodukte, vorgeschrieben.
  • Eine wichtige Rolle für die Toxizität dieser Bakterien spielen die Endotoxine. Dies sind Bestandteile der Zellmembran gramnegativer Bakterien. Sie werden insbesondere beim Zerfall der Bakterien freigesetzt.
  • Es wurden unterschiedliche Verfahren entwickelt, diese Endotoxine nachzuweisen. Viele der Methoden beruhen auf der Auslösung der Gerinnungskaskade in dem Blut von Pfeilschwanzkrebsen (Limulidae), insbesondere Limulus polyphemus und Tachypleus tridentatus durch die Endotoxine. Dazu werden Lysate von Blutzellen (Amöbozyten) verwendet. Der Test wird entsprechend als Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test (LAL, bzw. TAL bei Verwendung von Tachypleus tridentatus) bezeichnet.
  • Die Auslesung der Gerinnungskaskade kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen. So kann die Gelierung der Probe festgestellt werden (gel clot Test oder Gelierungstest). Andere Verfahren basieren auf Trübungsmessungen oder kinetischen Trübungsmessungen. Andere Verfahren verwenden fluoreszierende Substrate für Enzyme der Gerinnungskaskade.
  • Das einfachste Verfahren ist der Gelierungstest. Er ist vielseitig anwendbar und ohne großen apparativen Aufwand durchführbar. Außerdem wird er nach der European Pharmacopoeia als der zuverlässigste Nachweis eingestuft. Die Nachweisgrenze liegt für die meisten erhältlichen Tests bei 0,03 EU/ml (Endotoxin Units/ml).
  • Ein Problem dieses Nachweises ist aber die Interferenz mit vielen unterschiedlichen Substanzen in der Probe. Daher ist es oft notwendig die Proben zu verdünnen, um mögliche Interferenzen zu reduzieren. Allerdings werden damit auch die in der Probe vorhandenen Endotoxine verdünnt. Daher ist die Empfindlichkeit des Nachweises häufig nicht ausreichend.
  • Um die für eine Probe geforderte Empfindlichkeit nicht zu unterschreiten, darf eine Probe nicht über die maximale zugelassene Verdünnung (MVD) hinaus verdünnt werden. Diese errechnet sich aus der Empfindlichkeit des Nachweises und dem für die zu untersuchende Probe vorgegebenen Grenzwert für Endotoxine. Dies führt dazu, dass für manche Proben keine Messung möglich ist, da sie nicht ausreichend verdünnt werden können, um Interferenzen zu vermeiden.
  • Außerdem benötigt gerade der Gelierungstest eine große Menge an Reagenz, welches aus lebenden Tieren gewonnen werden muss.
  • Die Gerinnungskaskade kann auch durch andere Substrate ausgelöst werden. So können durch den beschriebenen Nachweis auch 1,3-β-D-Glucane (1,3-beta-D-Glucane) nachgewiesen werden.
    • Aufgabe
  • Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das die Empfindlichkeit des Nachweises für Endotoxine und/oder 1,3-β-D-Glucane verbessert.
    • Lösung
  • Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Die Erfindungen umfassen auch alle sinnvollen und insbesondere alle erwähnten Kombinationen von unabhängigen und/oder abhängigen Ansprüchen.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen in einer Probe umfassend folgende Schritte:
    1. a) Kontaktierung der Probe mit einem Amöbozyten-Lysat und mindestens einer Art von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen;
    2. b) Überprüfen der Probe auf eine Veränderung durch optische Verfahren, wobei das Eintreten einer Veränderung die Anwesenheit von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen des Endotoxins nachweist.
    Im Folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.
  • Die Erfindung betrifft die Detektion von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen. Im Sinne der Erfindung wird unter einem Endotoxin ein pyrogener Bestandteil der Zellmembran von gramnegativen Bakterien verstanden. Es handelt sich um Lipopolysaccharide (LPS).
    Unter einem 1,3-β-D-Glucan wird jedes wasserlösliche Polysaccharid oder Derivat davon verstanden, welches die Gerinnungskaskade in natürlichem LAL auslösen kann und mindestens zwei Glucose-Moleküle, welche β-1,3-glycosidisch verbunden sind, aufweist. Das Polysaccharid kann auch noch weitere Glycoside aufweisen, welche auch auf andere Weise miteinander verknüpft sein können. In einem ersten Schritt wird die Probe mit einem Amöbozyten-Lysat und mindestens einer Art Partikel kontaktiert. Bei dem Amöbozyten-Lysat handelt es sich um ein Lysat, welches vor der Kontaktierung oder während der Kontaktierung rekonstituiert wird. Die Rekonstitution kann erforderlich sein, wenn das Lysat zum Beispiel gefriergetrocknet gelagert wird. Die Kontaktierung besteht dabei vorzugsweise aus der Herstellung einer Mischung aus allen eingesetzten Komponenten.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Zugabe der Partikel die Empfindlichkeit des Nachweises deutlich steigern kann. Dies bietet nicht nur den Vorteil, dass eine Probe stärker verdünnt werden kann, sondern es reduziert auch den Verbrauch an Reagenz. Gleichzeitig könnte es auch zu einer Beschleunigung des Nachweises kommen. Im Falle des Gelierungstest benötigt der Nachweis üblicherweise 1 Stunde.
  • Die Reihenfolge der Zugabe der Komponenten ist nicht entscheidend. Es ist möglich zunächst die Nanopartikel in die Probe zu geben und erst danach das Lysat hinzuzufügen. Bevorzugt wird das Lysat als letzter Bestandteil zugegeben. Die Partikel können auch zunächst in das Lysat gegeben werden. Das Verfahren kann auch noch die Zugabe weiterer Komponenten umfassen.
  • Unter Amöbozyten-Lysat wird im Sinne der Erfindung jedes Lysat oder Teil davon verstanden, welches aus Pfeilschwanzkrebsen gewonnen und/oder danach in vitro daraus hergestellt wurde. Das Lysat kann auch nur oder zusätzlich ein oder mehrere isolierte oder rekombinant hergestellte Komponenten der Gerinnungskaskade des Pfeilschwanzkrebses umfassen. Das Amöbozyten-Lysat wurde bevorzugt aus Pfeilschwanzkrebsen gewonnen und/oder besteht aus isolierten oder rekombinanten Bestandteilen der Gerinnungskaskade des Pfeilschwanzkrebses. Dies sind bevorzugt die Enzyme aus Figur 1.
  • Das Amöbozyten-Lysat (AL) ist bevorzugt ein Lysat, hergestellt aus der Hämolymphe von Pfeilschwanzkrebsen (Limulidae), besonders bevorzugt Limulus polyphemus, Tachypleus gigas, Tachypleus tridentatus und Carcinoscorpius rotundicauda. Bevorzugt ist das Lysat von Limulus polyphemus (LAL) und Tachypleus tridentatus (TAL).
  • Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Gerinnungskaskade bei der Detektion von Endotoxinen oder 1,3-β-D-Glucanen. Ein Endotoxin 101 aktiviert zunächst Faktor C 102 zu 103. Dieser wirkt auf einen Faktor B ein (104 → 105: aktivierter Faktor B). Dieser aktivierte Faktor B 105 aktiviert das "proclotting enzyme" 106, das Gelierungsenzym 107 ("clotting enzyme") zu produzieren. Dieses Enzym hydrolysiert spezifische Positionen von Coagulogen 108, um Coagulin 109 zu erzeugen. Dies führt zur Gelierung oder Trübung der Probe. Diese Aktivierung wird auch als "Faktor C Pfad" bezeichnet.
  • Die Gerinnungskaskade kann auch auf einem anderen Weg durch 1,3-β-D-Glucane ausgelöst werden. Ein solches reaktives Glucan (110) aktiviert dabei einen Faktor G (111 → 112). Dieser aktiviert das "proclotting enzyme" 106 und führt so zur Gelierung der Probe. Diese Aktivierung wird auch als "Faktor G Pfad" bezeichnet.
  • Das Lysat gemäß der Erfindung kann auch nur Teile der Gerinnungskaskade aufweisen. So ist es beispielsweise möglich, einen der beiden Reaktionspfade ausgehend von Endotoxinen oder 1,3-β-D-Glucanen zu unterdrücken oder die entsprechenden Enzyme zu entfernen, z.B. Faktor G, um eine Interferenz mit 1,3-β-D-Glucanen zu vermeiden. Ebenso kann die Aktivität des entsprechenden Reaktionspfads reduziert sein. Dies kann auch durch die Herstellung des Lysats beeinflusst werden.
  • Das Lysat kann auch rekombinant hergestellte Enzyme der Gerinnungskaskade umfassen, z.B. der Enzyme aus Figur 5. So kann beispielsweise rekombinanter Faktor C eingesetzt werden. In diesem Fall kann die zu erkennende Veränderung durch ein spezifisches Substrat des aktivierten Faktor C erreicht werden.
  • Die Probe wird mit mindestens einer Art von Partikeln mit einer primären Partikelgröße von unter 300 nm kontaktiert.
  • Unter einer Art von Partikeln werden Partikel verstanden, welche sich in ihrer Zusammensetzung, Größe und Morphologie gleichen.
  • Die Partikel können beliebige Formen haben. Sie können plättchenförmig, faserförmig, stabförmig oder sphärisch sein. Sie können amorph, porös oder kristallin sein.
  • Die Partikel weisen eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetall auf. Dies bedeutet, dass mindestens ein Teil ihrer Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid besteht. Die Partikel können vollständig aus einem Metall- oder Halbmetalloxid bestehen.
  • Das mindestens eine Metall- oder Halbmetalloxid ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Oxide von Mg, Ca, Se, Ba, Al, Si, Sn, Pb, Bi, Ti, Zr, V, Mn, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Fe, Co, Fu, Cu, Zn, Ce und Y. Bevorzugt ist das mindestens eine das Metall- oder Halbmetalloxid ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Siliziumdioxid, Titandioxid oder Zirkoniumdioxid. Bevorzugt ist es Siliziumdioxid oder Titandioxid, besonders bevorzugt Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um amorphes Siliziumdioxid.
  • Die Partikel können auch noch andere Materialien, vorzugsweise anorganische Stoffe wie Oxide, umfassen. Es kann sich beispielsweise um Trägermaterialien handeln, welche mindestens teilweise mit dem mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid beschichtet sind. Als Trägermaterialien können unterschiedliche Materialien verwendet werden. Es kann sich um organische oder anorganische Materialien handeln.
  • Im Falle von organischen Materialien kann es sich um Partikel oder Plättchen aus einem organischen Polymer handeln.
  • Im Falle von anorganischen Materialien als Trägermaterialien kann es sich um Partikel oder Plättchen aus Oxiden, Sulfiden, Seleniden, Telluriden und/oder Phosphiden handeln. Bevorzugt sind Oxide von Metallen- und Halbmetallen wie z. B. Mg, Ca, Se, Ba, Al, Si, Sn, Pb, Bi, Ti, Zr, V, Mn, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Fe, Co, Fu, Cu, Zn, Ce und Y. Es kann sich auch um Partikel handeln, welche mehrere Oxide enthalten. Bevorzugt handelt es sich um Eisenoxid-Partikel. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Trägermaterialien um Eisenoxidpartikel mit einer primären Partikelgröße von unter 10 nm.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Trägermaterialien vollständig mit dem Metall- oder Halbmetalloxid, bevorzugt mit Siliziumdioxid beschichtet. Es handelt sich um Kern-Schale-Partikel, deren Schale aus dem Metall- oder Halbmetalloxid besteht.
  • Die Beschichtung der Trägermaterialien und Herstellung der Partikel erfolgt bevorzugt nach dem Sol-Gel-Verfahren. Dieses Verfahren beruht auf der sauren oder alkalischen Hydrolyse von Matrixbildnern. Bei den Matrixbildnern handelt es sich um hydrolysierbare Vorläuferverbindungen des mindestens einen Metall- oder Halbmetalloxids. Dies können zum Beispiel Halogenide oder Alkoxide sein. Als Matrixbildner werden bevorzugt Verbindungen der Formel I

            SiX4     (I)

    verwendet, wobei X gleich oder verschieden sein können und eine hydrolysierbare Gruppe darstellt, ausgewählt aus der Gruppe der Halogenide (Cl, Br, I) oder Alkoxide (C1-C8-Alkoxide). Beispiele für solche Verbindungen sind Tetramethoxysilan oder Tetraethoxysilan.
  • Bei Verwendung der Trägermaterialien kommt es dabei zu einer Aufkondensation einer Metall- oder Halbmetalloxidschicht, bevorzugt einer Siliziumdioxidschicht, auf der Oberfläche des Trägermaterials. Die erfindungsgemäßen Partikel weisen auf der Metall- oder Halbmetalloxid-Oberfläche keine Oberflächenmodifizierung auf. Das Lysat muss mit dem Metall- oder Halbmetalloxid interagieren können. Eine Oberflächenmodifikation vermindert die Interaktion zwischen den Proteinen des Nachweises und der Oberfläche aus Metall- oder Halbmetalloxid. Die Oberflächenmodifikation führt daher zu einer geringeren Erhöhung der Empfindlichkeit des Nachweises als durch unmodifizierte Partikel. Dies ist durch Vergleichsversuche einfach zu ermitteln.
  • In einer Weiterbildung der Erfindung weisen die Partikel eine spezifische Oberfläche von über 10 m2/g, bezogen auf das Metall- oder Halbmetalloxid, auf.
  • In einer Weiterbildung der Erfindung weisen die Partikel eine primäre Partikelgröße (gemessen mit TEM/SEM) von unter 300 nm, besonders bevorzugt von unter 250 nm. Die primäre Partikelgröße liegt dabei bevorzugt zwischen 2 nm und 200 nm.
  • In einer Weiterbildung der Erfindung handelt es sich um Nanopartikel. Dies sind Partikel, welche eine primäre Partikelgröße oder Primärteilchengröße (gemessen mit TEM/SEM) von unter 100 nm aufweisen. Bevorzugt sind Partikel mit einer primären Partikelgröße von unter 50 nm, bevorzugt unter 10 nm. Die primäre Partikelgröße der Nanopartikel kann auch zwischen 2 nm und 50 nm liegen.
  • Die Partikel können auch anhand ihres hydrodynamischen Durchmessers (gemessen in Wasser mit DLS) charakterisiert werden. Der hydrodynamische Durchmesser liegt bevorzugt unter 500 nm, besonders bevorzugt unter 200 nm, inklusive 200 nm. Der hydrodynamische Durchmesser liegt bevorzugt zwischen 10 nm und 200 nm.
  • Die Partikel sind bevorzugt auf die primäre Teilchengröße redispergierbar. Sie liegen nicht als Aggregate vor.
  • Es kann nur eine Art von Partikeln verwendet werden. Alternativ können aber auch zwei, drei, vier oder mehr Arten von Partikeln verwendet werden. Bevorzugt erfüllen alle im Nachweis verwendeten Arten von Partikeln die erfindungsgemäßen Anforderungen.
  • Die Partikel weisen ein Zetapotential in Wasser von unter - 30 mV auf, bevorzugt unter -40 mV auf. Besonders bevorzugt ist ein Zetapotential zwischen -40 mV und -45 mV. Das Zetapotential hat einen besonderen Einfluss auf die Interaktion der Partikel mit dem Lysat.
  • Die Konzentration der Partikel in der kontaktierten Probe liegt unter 500 mg/ml. Sie kann aber auch deutlich geringer gewählt werden. Die Konzentration der Partikel kann einen Einfluss auf die Empfindlichkeit des Nachweises haben. So erhöhen höhere Konzentrationen die Empfindlichkeit des Nachweises. Zu hohe Konzentrationen können den Nachweis auch negativ beeinflussen. Die zulässigen Konzentrationen können vom Fachmann für die verwendeten Partikel durch einfache Vergleichsversuche festgestellt werden. Bevorzugt liegt die Konzentration der Partikel unter 250 µg/ml, unter 125 µg/ml oder unter 62,5 µg/ml. Im Falle von Partikeln mit einer primären Partikelgröße von unter 10 nm liegt die Konzentration bevorzugt unter 100 µg/ml.
  • Der Nachweis wird üblicherweise bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 durchgeführt.
  • Nach der Kontaktierung der Probe wird die Probe auf eine Veränderung überprüft. Diese Veränderung kann unterschiedliche Eigenschaften der Probe betreffen. So kann sich die Konsistenz der Probe verändern (Gelierung). Auch kann sich die Trübung oder die Farbe der Probe verändern.
  • Die Veränderung der Probe kann mit beliebigen geeigneten Methoden gemessen werden. Dies können optische Methoden sein wie Inaugenscheinnahme nach Umdrehen der Probe, Trübung, Transmission, Absorption oder Fluoreszenz. Die Messung kann zu einem bestimmten Zeitpunkt oder kontinuierlich erfolgen. So kann auch die Kinetik der Veränderung der Probe bestimmt und ausgewertet werden. Es kann auch die Fluoreszenz von eingesetzten Fluoreszenzsonden gemessen werden, welche die Aktivierung der Gerinnungskaskade anzeigen.
  • Dies können beispielsweise Substrate für einzelne in Figur 1 gezeigte Enzyme der Gerinnungskaskade sein. Solche Substrate können kurze Peptidketten sein, welche mit detektierbaren Sonden oder Vorstufen davon modifiziert sind. Dies können beispielsweise Nitroaniline sein, welche zu Farbstoffen umgesetzt werden können.
  • Das Vorliegen einer Veränderung der Probe zeigt dabei die Anwesenheit von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen an. Dabei kann es abhängig von dem verwendeten Lysat nötig sein, durch Kontrollexperimente, z.B. Zugabe von Glucanblockern, Verdünnungsreihen, Positivkontrollen und Negativkontrollen, das Ergebnis zu verifizieren. Damit kann auch zwischen Endotoxinen und 1,3-β-D-Glucanen unterschieden werden. Endotoxine und/oder 1,3-β-D-Glucane im Sinne der Erfindung umfassen auch nur eine Art von Endotoxin und/oder eine Art von 1,3-β-D-Glucan.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Partikel sphärische Siliziumdioxidpartikel mit einer primären Partikelgröße zwischen 30 nm und 150 nm. Es können auch Mischungen aus mindestens zwei Partikeln mit unterschiedlicher Teilchengröße eingesetzt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Partikel sphärische Metalloxid-Siliziumdioxid-Kern-Schale-Partikel, bevorzugt Eisenoxid-Siliziumdioxid-Kern-Schale-Partikel, mit einer primären Partikelgröße zwischen 2 und 100 nm. Bei solchen Partikeln kann eine Erhöhung der Empfindlichkeit auf 0,000875 EU/ml erreicht werden. Dies entspricht Faktor 34 im Vergleich zum Standardnachweis.
  • Die Partikel der Erfindung erhöhen die Empfindlichkeit des gel clot Nachweises für Endotoxine bevorzugt auf unter 0,015 EU/ml, 0,007 EU/ml, 0.0035 EU/ml oder 0.00175 EU/ml.
  • Figur 4 zeigt, dass die Empfindlichkeit in Abhängigkeit von der zur Verfügung stehenden Oberfläche zunimmt. In einer Ausführungsform der Erfindung beträgt die zur Verfügung stehende berechnete Oberfläche der Partikel in dem Nachweis über 0,02 m2/ml, bevorzugt über 0,04 m2/ml.
  • Das Verfahren kann noch weitere Schritte umfassen. So kann noch die Einstellung des pH-Werts der Probe erforderlich sein.
  • Außerdem können eine Verdünnung der Probe und Positivkontrollen zur Vermeidung von Interferenzen erforderlich sein. Diese Vorgehensweisen sind dem Fachmann von der üblichen Durchführung des Lysat-Nachweises bekannt.
  • Das Verfahren kann auch die Zugabe weiterer Additive umfassen. Dies können in Abhängigkeit von der verwendeten Detektionsmethode Flockungsmittel, Detektionssonden (z.B. fluoreszenzmarkierte Substrate für Enzyme des Lysats) oder Puffer sein. Dies kann ein Substrat für den aktivierten Faktor C, "proclotting enzyme" oder Gelierungsenzym sein.
  • Das Verfahren kann auch die Durchführung von Kontrollproben zur Verifizierung der Ergebnisse enthalten. Dies können Positivproben, Negativproben und/oder Verdünnungsreihen sein. Das Verfahren kann auch die Durchführung von IEC umfassen.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Kit zur Detektion von Endotoxinen. Ein solches Kit umfasst ein Amöbozyten-Lysat und mindestens eine Art von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen.
  • Es handelt sich bevorzugt um ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Die Partikel können dabei in Suspension oder in trockener Form vorliegen. Das Amöbozyten-Lysat kann rekonstituiert oder in rekonstituierbarer Form vorliegen.
  • Das Kit kann noch weitere Bestandteile wie Puffer oder Standards enthalten.
  • Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, zur Verbesserung der Empfindlichkeit eines Nachweises von Endotoxinen mit einem Amöbozyten-Lysat, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen.
  • Es handelt sich bevorzugt um die für das Verfahren beschriebenen Partikel.
  • Weitere Einzelheiten und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die Möglichkeiten, die Aufgabe zu lösen, sind nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt. So umfassen beispielsweise Bereichsangaben stets alle - nicht genannten - Zwischenwerte und alle denkbaren Teilintervalle.
    • Materialien und Methoden
  • Abkürzungen:
    • EU
    Endotoxin Unit
    IEC
    inhibition/enhancement control
    λ
    Empfindlichkeit des Assays/Nachweises
    MVD
    Maximale erlaubte Verdünnung einer Probe, deren Endotoxingehalt noch zuverlässig bestimmt werden kann.
    LAL
    Limulus-Amöbozyten-Lysat
    LPS
    Lipopolysaccharide
    1. Herstellung der Nanopartikel
  • Die Siliziumdioxid-Partikel wurden mit einem modifiziertem Stöber-Verfahren (Stoeber et al., 1968) oder durch L-Argininkatalysierte Hydrolyse von Tetraethoxysilan (TEOS) in einem zweiphasigem Wasser/Cyclohexan-System hergestellt (nach Hartlen et al. 2008). Die Eisenoxid-Kerne für die mit Siliziumdioxid-beschichteten Partikel wurden von Nanogate AG (Quierschied-Göttelborn, Germany) bezogen und mit einem modifiziertem Stöber-Verfahren mit Siliziumdioxid beschichtet. Eine der verwendeten Nanopartikel enthielten ein Fluoreszenzlabel (f) mit dem tiefrotem Fluoreszenzfarbstoff Atto647N-NHS. Dazu wurde an den Farbstoff ein Silanlinker gekoppelt. Der so modifizierte Farbstoff wurde bei der Synthese der Partikel in das Wasser/Cyclohexan-System gegeben und auf diese Weise in die Siliziumdioxid-Matrix der Partikel integriert. Die Modifizierung mit PEG wurde durch Aufkondensation eines mit mPEG750 modifiziertem Silanlinker auf der Oberfläche der Partikel erreicht. Alle Chemikalien für die Synthese der Partikel wurden von Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Deutschland) bezogen. Atto647N-NHS Ester (NHS: N-Hydroxysuccinimid-Ester) wurde von Atto-Tec (Siegen, Deutschland) bezogen. Endorem®, eine Zusammensetzung von mit Dextran beschichteten, superparamagnetischen EisenoxidNanopartikeln, welche als Kontrastmittel für Magnetresonanztomographie (MRI magnet resonance imaging) verwendet wird, wurde von Guerbet GmbH (Sulzbach, Germany) bezogen und als Referenzmaterial verwendet. Nach der Herstellung wurden alle Partikel mit Hilfe von Dialyse gegen endotoxinfreies Milli-Q-Wasser gereinigt, gefolgt von einer sterilen Filtration auf einer sterilen Arbeitsfläche mit Zellulosemembranen mit 0,2 µm Porengröße. Die Partikel wurden bei 4-8 °C bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt. Die Partikel und ihre Eigenschaften sind in Tabelle 1 angegeben.
    • 2. Charakterisierung der Partikel
  • Zur Charakterisierung der Partikel wurden Aliquoten von Suspensionen der steril filtrierten Partikel eingesetzt. Die Teilchengröße und Morphologie wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM; SEM scanning electron microscopy) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ermittelt. Für SEM wurden unverdünnte Proben der Suspensionen auf Siliziumoberflächen aufgebracht und im Vakuum getrocknet. Der hydrodynamische Durchmesser der Partikel wurde mit dynamischer Lichtstreuung (DLS, dynamic light scattering, Dyna Pro Titan, Wyatt Technology Europe GmbH) bestimmt. Das Zeta-(ζ)-Potential der Partikel wurde in Proben von 1 ml in Einwegküvetten bei 25 °C mit einem Zetasizer Nano (Malvern, Deutschland) gemessen. UV-vis-Spektren in dem Wellenlängenbereich von 350 - 800 nm wurden mit einem Cary 5000 Spektrometer (Varian Inc., Deutschland) aufgenommen. Der pH-Werte aller Proben wurde gemessen und lag in dem für den Assay vorgeschriebenen Bereich (pH 6-8). Eine Einstellung des pH-Werts war daher nicht nötig.
    • 3. Bestimmung der Endotoxine
  • Endotoxintests wurden mit dem LAL Gel Clot Assay Lonza durchgeführt (Pyrogent™ Plus N294-03, Lonza Walkersville Inc., Walkersville, MD, USA). Alle verwendeten Materialien waren steril und gemäß Herstellerangaben pyrogenfrei. Die Tests wurden gemäß dem Protokoll "Nanokon SOP 2.2.2: Detection and semi-Quantification of Endotoxin Contaminations in Nanoparticle Suspensions - Limulus amebocyte lysate (LAL) Gel Clot Assay" veröffentlicht auf der the DaNa homepage www.nanopartikel.info (http://nanopartikel.info/files/content/dana/Dokumente/Projekte /SOPs/Nanokon%20SOP%202%202%202 gesch%C3%BCtzt.pdf Kucki, 2012) durchgeführt. Dieses Protokoll basiert auf den Informationen aus European Pharmacopoeia, Monograph 2.6.14. Bacterial Endotoxins (European Pharmacopoeia, 2005), ISO 29701 (ISO 29701, 2010) und (Dobrovolskaia and Neun, 2011).
  • Die vom Hersteller angegebene Empfindlichkeit des LAL gel clot Assays (0,03 EU/ml; Endotoxin unit pro Milliliter) wurde gemäß den Herstellerangaben kontrolliert und für alle eingesetzten Chargen bestätigt.
  • Für Suspensionen von Nanopartikeln wurde als Endotoxin Grenzwert ein Wert von 0,5 EU/ml angenommen. Aus einer Empfindlichkeit des Nachweises (λ) von 0,03 EU/ml und einer Probenkonzentration von 1 mg/ml ergibt sich eine maximal zulässige Verdünnung (MVD) von 16 (MVD = Probenkonzentration * Endotoxin Grenzwert / Empfindlichkeit des Nachweises (λ)).
  • Verdünnungen und Kontrollen wurde mit endotoxinfreiem Wasser (LAL reagent water W50, Lonza Walkersville Inc., USA) durchgeführt. Falls in den Proben Endotoxine nachgewiesen wurden, wurden die Proben noch auf eine mögliche Störung des Nachweises durch (1,3)-β-D-Glucan untersucht. Dazu wurde β-Glucan-Blocker zugegeben (Beta-G-Blocker Kit N190, Lonza Walkersville Inc., USA).
  • Der Einfluss der Nanopartikel auf die Sensitivität des Assays wurde außerdem durch IEC (inhibition/enhancement controls) überprüft. Diese wurde nach der vorstehend genannten SOP und den Herstellerangaben durchgeführt. Als endotoxinfrei getestete Partikelsuspensionen wurden mit einem Referenzstandard versetzt (certified reference standard endotoxin CSE Escherichia coli 055:B5 Lonza Walkersville Inc., USA) und die Proben untersucht.
  • Alle Messungen wurden mit unabhängigen Verdünnungsreihen wiederholt.
    • 4. Beispielhafte Durchführung des Verfahrens 4.1 Rekonstitution des LAL
  • Lyophilisiertes LAL wurde in endotoxinfreiem Wasser rekonstituiert und für mindestens 30 Sekunden aufgewirbelt (nicht geschüttelt). Das rekonstituierte LAL wurde möglichst bald verwendet.
    • 4.2 Nachweis der Endotoxine (Testprozedur)
  • Alle Proben, Standards oder Kontrollen wurden 1:1 (Vol:Vol) mit rekonstituiertem LAL gemischt (je 100 µl) und für 1 Stunde bei 37 °C in einem nicht zirkulierendem Wasserbad erwärmt. Die Proben wurden dabei nicht bewegt. Danach wurden die Proben vorsichtig um 180° umgedreht. Eine feste geronnene Masse nach dem Umdrehen zeigt ein positives Testergebnis an. Bei einer negativen Reaktion ist keine geronnene Masse vorhanden, sondern nur eine Flüssigkeit.
    • 4.3 Kontrolle der Empfindlichkeit des Nachweises
  • Zunächst wurde eine Lösung mit 1 EU/ml Endotoxin verwendet, um eine zweifache Verdünnungsreihe gemäß der vom Hersteller angegebenen LAL-Empfindlichkeit (λ) herzustellen (2λ, 1λ, 0,5λ, 0,25λ). Zusätzlich wurde eine Negativkontrolle mit Wasser (LAL reagent water) angefertigt.
  • Die Proben wurden entsprechend der Testprozedur untersucht. Aus den Ergebnissen wurde das geometrische Mittel der Empfind-lichkeit gebildet. ( log x geom = 1 n ∑ i = 1 n x i
    Figure imgb0001
     mit xi : Empfindlichkeit; n: Anzahl der Replikate des Nachweises). Das errechnete geometrische Mittel sollte der vom Hersteller angegebenen Empfindlichkeit entsprechen.
    • 4.4 Untersuchung der Nanopartikelsuspensionen
  • Aus der zu testenden Suspension (1 mg/ml) wurde eine zweifache Verdünnungsreihe (1/2, 1/4, 1/8, 1/16) hergestellt. Aus der 1 EU/ml Endotoxinlösung wurde eine Positivkontrolle mit 2λ (0,06 EU/ml) hergestellt. Als Negativkontrolle wurde endotoxinfreies Wasser (LAL reagent water) verwendet. Die Proben wurden entsprechend der Testprozedur untersucht.
  • Aus der positiven Probe mit dem höchsten Verdünnungsfaktor wurde die Konzentration der Endotoxine in der Probe berechnet (Konzentration = Probe * λ).
  • Wenn keine Probe positiv war, wurde angenommen, dass die Endotoxin-Konzentration unter der Empfindlichkeit des Assays lag.
    • 4.5 Untersuchung des Einflusses der Nanopartikel auf den Assay (IEC)
  • Um den Einfluss der Nanopartikel auf den Assay zu untersuchen, wurde die Empfindlichkeit des Assays gemäß der vorstehenden Prozedur für unterschiedliche Konzentrationen der Nanopartikel untersucht. Dafür wurde aus einer 1 EU/ml Endotoxinlösung eine zweifache Verdünnungsreihe hergestellt (2λ, 1λ, 0,5λ, 0,25λ). Dabei wurde zur Verdünnung kein endotoxinfreies Wasser sondern die Suspension der Nanopartikel verwendet. Danach wurde die Empfindlichkeit wie unter Punkt 4.3 beschrieben untersucht.
  • IEC ist auch bei dem üblichen Verfahren vorgeschrieben, um Fehlmessungen aufgrund von Inhibition oder Verstärkungseffekten zu minimieren. Gemäß der SOP wird der Test als unbeeinflusst gewertet, wenn die gemessene Empfindlichkeit im Bereich von 0,5λ und 2λ liegt (IEC Kriterien). IEC wurden bei MVD und mindestens einer weiteren Partikelkonzentration durchgeführt.
    • 4.6 1,3-β-D-Glucan Interferenztest
  • Wenn Endotoxine festgestellt wurden, wurde ein 1,3-β-D-Glucan Interferenztest durchgeführt, um eine Interferenz mit 1,3-β-D-Glucan auszuschließen.
  • Dazu wurde eine Probe der Nanopartikel mit doppelter Testkonzentration hergestellt. Dazu wurde im Verhältnis 1:1 β-G-Blocker (Lonza) zugegeben. Die Probe wurde wie vorstehend angegeben untersucht. Als Kontrollen wurden Proben der Nanopartikel ohne β-G-Blocker, β-G-Blocker in endotoxinfreiem Wasser, Positivprobe mit Endotoxin (2λ) und β-G-Blocker verwendet.
    • 5. Experimente
    • Fig. 2
    REM Abbildung von monodispersen Siliziumdioxidpartikeln (Silica-4-130);
    Fig. 3
    TEM Abbildung von Silica-2; Mischung von Partikeln mit zwei Größen: kleine Nanopartikel mit 42 nm primärer Partikelgröße (72%) und große Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 108 nm (28%);
    Fig. 4
    Empfindlichkeit des LAL gel clot Assays in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration der EisenoxidSiliziumdioxid-Partikel FexOy@SiO2-1 und der berechneten Oberfläche in m2/ml. Die vom Hersteller angegebene Empfindlichkeit des Assays liegt bei 0,03 EU/ml.
    Fig. 5
    Berechnete Oberfläche der Partikel als Funktion der primären Partikelgröße.
  • Tabelle 1 zeigt die untersuchten Nanopartikelsuspensionen. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Untersuchung dieser Suspensionen auf Nanopartikel angegeben. Zwar wurden bei einigen Proben Endotoxine mit einem Gehalt von > 0,03 EU/ml festgestellt, aber die IEC bei MVD zeigten bei fast allen Proben eine Verstärkung der Empfindlichkeit des Nachweises. Bei den positiven Proben konnte nachgewiesen werden, dass keine β-Glucan-Interferenz vorlag. Eine Verunreinigung der Proben mit Endotoxinen konnte aufgrund der Herstellung der Nanopartikel und der Kontrollexperimente ausgeschlossen werden.
  • Die in Tabelle 1 in eckigen Klammern angegebenen Werte sind im Vergleich zu einem Nachweis ohne Nanopartikel keine zulässigen Messwerte, da für sie die IEC nicht die angegebenen Akzeptanzkriterien erfüllte. Dies zeigt, dass die Empfindlichkeit des Nachweises durch die Zugabe dieser Nanopartikel besonders stark erhöht wurde.
    • 5.1 Siliziumdioxid-Partikel
  • Wenn Proben mit einer Konzentration von 62,5 µg/ml (dies entspricht MVD für Nanopartikel) gemessen wurde, zeigten nur Endorem und Silica-1-25 keine Veränderung der Empfindlichkeit des Nachweises. Allerdings hatten die Silica-1-25-Partikel auch ein deutlich verändertes Zeta-Potential von -24,2 mV. Vier der getesteten Siliziumdioxid-Partikel (Silica-2, Silica-3-80, Silica-5f, Silica-6+PEGf) zeigten eine Verstärkung der Empfindlichkeit, aber innerhalb der Grenzen der IEC. Nur Silica-4-130 (siehe auch Fig. 2), eine Suspension mit monodispersen Siliziumdioxid-Teilchen mit einer primären Teilchengröße von 130 nm, zeigte eine höhere Verstärkung als gemäß IEC zulässig, wenn es innerhalb des zulässigen Verdünnungsbereichs (bis zu MVD) untersucht wurde.
  • Mit Silica-3-80 wurden konzentrationsabhängige IEC durchgeführt. Diese ergaben eine Verbesserung der Empfindlichkeit des Nachweises auf 0,015 EU/ml für alle untersuchten Partikelkonzentrationen (500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µm/ml, 62,5 µg/ml). Allerdings wurde keine Veränderung der Empfindlichkeit in Bezug auf die eingesetzte Menge der Partikel festgestellt.
  • Tabelle 3 zeigt konzentrationsabhängige IEC für Silica-2 (Fig. 3). Dabei steht + für einen positiven Nachweis und - für einen negativen Nachweis. Eine Verringerung der Konzentration der Partikel führte in diesem Fall auch zu einer Verschlechterung der Empfindlichkeit des Nachweises.
  • Um den Einfluss von Oberflächenmodifikation zu untersuchen, wurden IEC mit Silica-5f und Silica-6+PEGf durchgeführt. Diese Partikel haben eine ähnliche Größe. Es zeigte sich, dass bei einer hohen Partikelkonzentration (500 µg/ml SiO2) die Verstärkung der Empfindlichkeit unterschiedlich war. Mit PEG modifizierte Partikel Silica-6+PEGf zeigten eine geringere Verstärkung innerhalb der IEC Akzeptanzkriterien. Die Verstärkung im Falle der Silica-5f lag dagegen außerhalb der Akzeptanzkriterien. Dies deutet darauf hin, dass die Verstärkung durch Oberflächenmodifizierung der Partikel mit organischen Gruppen reduziert wird.
    • 5.2 Eisenoxid-Siliziumdioxid-Kern-Schale-Partikel
  • Die Eisenoxid-Siliziumdioxid-Kern-Schale-Partikel FexOy@SiO2-1, FexOy@SiO2-2f und FexOy@SiO2-3f wurden mit dem gleichen Verfahren hergestellt. Im Falle der fluoreszenzmarkierten Partikel wurde lediglich ein Fluoreszenzfarbstoff wie bereits beschrieben in die Partikel eingebaut. Alle Partikelsuspensionen zeigten ähnliches Verhalten im LAL gel clot Assay. Es wurden keine Unterschiede aufgrund der Fluoreszenzmarkierung festgestellt.
  • Bei hohen Konzentrationen (1 mg/ml und 500 µg/ml) wurde eine vollständige Inhibierung des Nachweises festgestellt (keine Gerinnung). Außerdem konnte ein Ausfallen der Partikel beobachtet werden. Bei mittleren Konzentrationen (250 µg/ml und 125 µg/ml) wurde dies nicht beobachtet. Stattdessen formte sich eine bräunliche geronnene Masse. Bei MVD (62,5 µg/ml) war der Test wie erwartet negativ. Der berechnete Gehalt an Endotoxin mit 0,25 EU/ml lag unter dem Endotoxin-Limit von 0,5 EU/ml. Aber die IEC für alle Partikel zeigte eine deutliche Verstärkung der Empfindlichkeit jenseits der IEC Kriterien.
  • Tabelle 4 zeigt konzentrationsabhängige IEC für FexOy@SiO2-1. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Verstärkung der Empfindlichkeit in Abhängigkeit von der Konzentration der Partikel. Bei einer Konzentration von 62,5 µg/ml konnten noch 0,000875 EU/ml nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Steigerung um den Faktor 34.
  • Auch die größeren Partikel FexOy@SiO2-4f wurden untersucht. Auch sie zeigten eine deutliche Verstärkung der Empfindlichkeit des Nachweises bis zur MVD. Allerdings konnte keine vollständige Inhibierung des Assays bei 500 µg/ml beobachtet werden.
    • 5.3 Endorem ®
  • Endorem ® ist eine Zusammensetzung aus superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln (SPION) mit einer primären Partikelgröße von 5 nm. Es ist als Kontrastmittel zur Untersuchung von Lebermetastasen zugelassen. Die Partikel sind mit Dextran oberflächenmodifiziert.
  • Bei den Untersuchungen konnten keine Endotoxine nachgewiesen werden. Außerdem zeigte Endorem ® keinerlei Wechselwirkung mit dem LAL gel clot Assay bei der geringsten verwendeten Konzentration (62,5 µg/ml). Selbst wenn es unverdünnt verwendet wurde (11,2 mg/ml), wurde keine vollständige Inhibierung des Nachweises beobachtet. Auch ein Ausfallen der Partikel wurde nicht beobachtet.
  • Es sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar. Tabelle 1
    Physikalisch-chemische Eigenschaften der untersuchten Nanopartikelsuspeasionen
    Partikel Synthese Hydrodynamischer Durchmesser in nm (DLS) Primäre Partikelgröße in nm Zeta-potential (mV), 25°C, in Wasser
    Endorem® - 246 5 -35
    FexOy@SiO2-1 Stöber 16,6 ± 5,0 3 -44,7
    FexOy@SiO2-2f Stöber 22,1 ± 6,6 3 -42,9
    FexOy@SiO2-3f Stöber 88,9 ± 49 3 -43,2
    FexOy@SiO2-4f Stöber 71,1 ± 10 75 -41,4
    Silica-1-25 Hartlen 20,8 ± 2,6 24,6 ± 3,4 -24,2
    Silica-2 Hartlen 97,6 ± 39 42 and 108 -42,9
    Silica-3-80 Hartlen 84,2 ± 6,7 80 ± 5 -42,3
    Silica-4-130 Hartlen 141,4 ± 15 128,3 ± 11,0 -40,5
    Silica-5f Stöber 104,0 ± 35 113 ± 14 -43,2
    Silica-6+PEGf Stöber 96,0 ± 34 113 ± 14 -41,2
    f   mit Fluoreszenzfarbstoff
    Tabelle 2
    Ergebnisse der Endotoxintests
    Partikel Endotoxin in EU/ml bei 1 mg/ml Partikel IEC bei MVD IEC Kriterien erfüllt?
    Endorem® < 0,03 Angegebene Empfindlichkeit +
    FexOy@SiO2-1 [0,25] Verstärkung -
    FexOy@SiO2-2f [0,25] Verstärkung -
    FexOy@SiO2-3f [0,25] Verstärkung -
    FexOy@SiO2-4f [0,25] Verstärkung -
    Silica-1-25 < 0,03 Angegebene Empfindlichkeit +
    Silica-2 < 0,03 Verstärkung +
    Silica-3-80 < 0,03 Verstärkung +
    Silica-4-130 [0,06] Verstärkung -
    Silica-5f < 0,03 Verstärkung +
    Silica-6+PEGf < 0,03 Verstärkung +
    [ ] = Messwerte nicht akzeptabel, da IEC Kriterien nicht erfüllt.
    Tabelle 3
    Konzentrationsabhängige IEC für Silica-2
    Partikelkonzentration in µg/ml IEC Endotoxin Wert in EU/ml
    0,03 0,015 0,007 0,0035 NegativKontrolle
    1000 + + + + -
    500 + + + + -
    250 + + + - -
    125 + + - - -
    62,5 + + - - -
    Tabelle 4
    Konzentrationsabhängige IEC für FexOy@SiO2-1
    Partikelkonzentration in µg/ml IEC Endotoxin Wert in EU/ml
    0,03 0,015 0,007 0,0035 0,00175 0,000875
    62,5 + + + + + +
    50 + + + + - ND
    40 + + + - - ND
    31,25 + + - - - -
    15,625 + - - ND ND ND
    ND = nicht gemessen
    • zitierte Literatur
    • STOEBER, W., FINK, A. & BOHN, E. 1968. Controlled Growth of Monodisperse Silica Spheres in the Micron Size Range. Journal of Colloid and Interface Science, 26, 62-69.
    • HARTLEN, K. D., ATHANASOPOULOS, A. P. T. & KITAEV, V. 2008. Facile Preparation of Highly Monodisperse Small Silica Spheres (15 to >200 nm) Suitable for Colloidal Templating and Formation of Ordered Arrays. Langmuir, 24, 1714-1720.
    Bezugszeichen
    • 101
    Endotoxin
    102
    Faktor C
    103
    aktivierter Faktor C
    104
    Faktor B
    105
    aktivierter Faktor B
    106
    "proclotting enzyme"
    107
    Gelierungsenzym
    108
    Coagulogen
    109
    Coagulin
    110
    1,3-b-D-Glucan oder anderes LAL aktivierendes Glucan
    111
    Faktor G
    112
    aktivierter Faktor G

Claims (11)

  1. Verfahren zur Detektion von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen in einer Probe umfassend folgende Schritte:
    a) Kontaktierung der Probe mit einem Amöbozyten-Lysat und mindestens einer Art von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen;
    b) Überprüfen der Probe auf eine Veränderung durch optische Verfahren, wobei das Eintreten einer Veränderung die Anwesenheit von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen anzeigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel eine primäre Partikelgröße von unter 250 nm haben.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 250 µg/ml vorliegen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetalloxid ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Siliziumdioxid, Titandioxid oder Zirkoniumdioxid.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall- oder Halbmetalloxid Siliziumdioxid ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Verfügung stehende berechnete Oberfläche der Partikel in dem Nachweis über 0,02 m2/ml beträgt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Amöbozyten-Lysat aus Pfeilschwanzkrebsen gewonnen wurde und/oder aus isolierten oder rekombinanten Bestandteilen der Gerinnungskaskade des Pfeilschwanzkrebses besteht.
  8. Kit zur Detektion von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Amöbozyten-Lysat und mindestens eine Art von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, umfasst, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen.
  9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Art von Partikeln Partikel nach einem der Ansprüche 2 bis 6 sind.
  10. Verwendung von Partikeln, welche eine Oberfläche aus mindestens einem Metall- oder Halbmetalloxid aufweisen, zur Verbesserung der Empfindlichkeit eines Nachweises von Endotoxinen und/oder 1,3-β-D-Glucanen mit einem Amöbozyten-Lysat, wobei die Partikel keine Oberflächenmodifizierung aufweisen, ein Zetapotential in Wasser von unter -30 mV aufweisen, in der kontaktierten Probe in einer Konzentration von unter 500 µg/ml vorliegen und eine primäre Partikelgröße von unter 300 nm aufweisen.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es Partikel nach einem der Ansprüche 2 bis 6 sind.
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