EP2403830A2 - Derives indoliques pour le traitement de maladies neurodegeneratives - Google Patents

Derives indoliques pour le traitement de maladies neurodegeneratives

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Publication number
EP2403830A2
EP2403830A2 EP10705616A EP10705616A EP2403830A2 EP 2403830 A2 EP2403830 A2 EP 2403830A2 EP 10705616 A EP10705616 A EP 10705616A EP 10705616 A EP10705616 A EP 10705616A EP 2403830 A2 EP2403830 A2 EP 2403830A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
formula
group
alkyl
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10705616A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fanny Schmidt
Bruno Figadere
Rita Raisman-Vozari
Pierre Champy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2403830A2 publication Critical patent/EP2403830A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/14—Radicals substituted by nitrogen atoms, not forming part of a nitro radical
    • C07D209/16—Tryptamines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to compounds having an aliphatic chain-substituted indole unit useful for the treatment of neurodegenerative diseases, as well as to a process for their preparation and their use.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease.
  • a neurodegenerative disease is characterized by a progressive apoptotic death of particular neuronal subpopulations, related to a functional deficit of the affected transmission axes.
  • This type of disease affects the functioning of the central nervous system, especially the brain, in a progressive manner, the disease can evolve more or less rapidly (a few weeks to several years), and often irreversibly.
  • different functions may be affected such as motor skills, language, memory, perception or cognition.
  • Alzheimer's disease mention may in particular be made of Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • Alzheimer's disease which affects approximately 24 million people worldwide, is a disease of brain tissue that results in the gradual and irreversible loss of mental function.
  • the first symptom is the loss of memory of recent events (amnesia), then the cognitive deficits extend to the domains of language (aphasia), movement organization (apraxia), visual recognition (agnosia) and functions. executives (such as decision making and planning).
  • Parkinson's disease affects the central nervous system and causes progressive motor disorders, including body tremors.
  • the therapeutic use of neurotrophins, described in the maintenance of various neuronal populations, has been proposed for curative purposes.
  • the administration of recombinant neurotrophins in injured animal models has shown a beneficial effect on neuronal survival, their initially encouraging use in humans has been rapidly limited. Indeed, the very high hydrophilicity of these compounds, prohibiting the passage of the blood-brain barrier and their rapid enzymatic degradation require repeated intracranial administration, generating dramatic side effects.
  • the indole nucleus is a motif found in many natural or non-natural compounds exhibiting various biological activities, antimicrobial, antiparasitic, antioxidant, neurotrophic, and anti-inflammatory activities having been reported.
  • X 2 represents a linear hydrocarbon chain, saturated or unsaturated, containing from 1 to 24, preferably from 8 to 22, carbon atoms, - R 1 represents a hydrogen atom or an OH or (C 1 -C 6) alkoxy group, such than methoxy, and
  • R 2 represents a group CH 3 or CH 2 OR 3 , with R 3 representing a hydrogen atom or a group (C 1 -C 6 ) alkyl, CO- (C 1 -C 6 ) alkyl or NH- (C 1 -C 6) ) alkyl.
  • R 3 representing a hydrogen atom or a group (C 1 -C 6 ) alkyl, CO- (C 1 -C 6 ) alkyl or NH- (C 1 -C 6) ) alkyl.
  • (C 1 -C 6) alkyl group is meant, in the sense of the present invention, a saturated hydrocarbon chain, linear or branched, having from 1 to 6 carbon atoms, in particular the methyl, ethyl, n-propyl groups. isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl. Preferably, it is a methyl group.
  • (C 1 -C 6) alkoxy group is meant, in the sense of the present invention, a (C 1 -C 6) alkyl group as defined above bonded to the molecule via an oxygen atom .
  • These are in particular methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, iso-butoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-pentoxy.
  • it is a methoxy group.
  • CO- (C 1 -C 6) alkyl is meant, within the meaning of the present invention, a (C 1 -C 6) alkyl group as defined above bonded to the molecule through a grouping CO.
  • NH- (C 1 -C 6) alkyl means a (C 1 -C 6) alkyl group as defined above bonded to the molecule via a grouping. NH.
  • unsaturated is meant, in the sense of the present invention, that the hydrocarbon chain may comprise one or more unsaturation (s).
  • unsaturation is meant, in the sense of the present invention, a double or triple bond and preferably a double bond.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means that which is useful in the preparation of a pharmaceutical composition which is generally safe, non-toxic and neither bio-logical nor otherwise undesirable and which is acceptable for veterinary use as well as human pharmaceutical.
  • salts which are pharmaceutically acceptable, as defined herein, and which possess the desired pharmacological activity of the parent compound.
  • Such salts include: (1) hydrates and solvates,
  • Acceptable organic bases include diethanolamine, ethanolamine, N-methylglucamine, triethanolamine, tromethamine and the like.
  • Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate and sodium hydroxide.
  • stereoisomers denotes diastereoisomers or enantiomers. It is therefore optical isomers. Stereoisomers that are not mirror images of each other are thus referred to as “diastereoisomers”, and stereoisomers that are non-superimposable mirror images are referred to as "enantiomers”.
  • a carbon atom bonded to four nonidentical substituents is called a "chiral center”.
  • racemic mixture An equimolar mixture of two enantiomers is called a racemic mixture.
  • a compound according to the invention may meet the following formula (Ia):
  • R 1, R 2 and X 1 are as defined above, q represents an integer between 1 and 24, preferably between 8 and 22, and - m, n and p are as defined above.
  • R 1 represents a substituent of the indole ring, located on any of the carbon atoms of the indole unit. It will advantageously be a hydrogen atom.
  • R 2 will advantageously represent a CH 3 or CH 2 OH group.
  • Xi represents a CH 2 group.
  • the compounds of the invention may be chosen in particular from:
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (I) as defined above for the manufacture of a medicament, in particular a neurotrophic or neuroprotective drug, advantageously intended for the treatment or the prevention of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis or stroke.
  • a neurotrophic or neuroprotective drug advantageously intended for the treatment or the prevention of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis or stroke.
  • the present invention also relates to a method of treating or preventing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis or stroke, including administering to a patient in need of an effective amount of a compound of formula (I) as defined above.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis or stroke
  • the present invention also relates to a compound of formula (I) below:
  • X 2 represents a linear hydrocarbon chain, saturated or unsaturated, containing from 1 to 24, preferably from 8 to 22 carbon atoms,
  • R 1 represents a hydrogen atom or an OH or (C 1 -C 6) alkoxy group, such as methoxy, and
  • R 2 represents a CH 3 or CH 2 OR 3 group , with R 3 representing a hydrogen atom or a (C 1 -C 6 ) alkyl, CO- (C 1 -C 6) alkyl or NH- (C 1 -C 6 ) alkyl group; . excluding compounds of formula
  • a compound according to the invention may meet the following formula (Ia):
  • X 1, R 1 and R 2 are as defined above, and m represents an integer greater than or equal to 1, and n and p represent, independently of one of the other, an integer greater than or equal to 0 with m + n + p + 4 ⁇ 24 and preferably 8 ⁇ m + n + p + 4 ⁇ 22.
  • the compound of the invention may meet one of the following formulas (Ib) and (Ic):
  • R 1, R 2 and X 1 are as defined above, q represents an integer between 1 and 24, preferably between 8 and
  • R 1 will advantageously represent a hydrogen atom.
  • R 2 will advantageously represent a CH 3 or CH 2 OH group.
  • Xi represents a CH 2 group.
  • the compounds of the invention may be chosen in particular from:
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one compound of formula (I) as described above and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the compounds according to the invention can be administered orally, sublingually, parenterally, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, transdermally, locally or rectally, and preferably orally.
  • the active ingredient may be administered in unit dosage forms, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, animals or humans.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual and oral forms of administration, parenteral forms of administration, - cutaneous, intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular and forms of rectal administration.
  • the main active ingredient is mixed with a pharmaceutical carrier such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • the tablets can be coated with sucrose or other suitable materials or they can be treated in such a way that they have prolonged or delayed activity and continuously release a predetermined amount of active ingredient.
  • a preparation in capsules is obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • a syrup or elixir preparation may contain the active ingredient together with a sweetener, an antiseptic, as well as a flavoring agent and a suitable colorant.
  • Water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersants or wetting agents, or suspending agents, as well as with taste correctors or sweeteners.
  • suppositories are used which are prepared with binders melting at the rectal temperature, for example cocoa butter or polyethylene glycols.
  • aqueous suspensions for parenteral, intranasal or intraocular administration, aqueous suspensions, isotonic saline solutions or sterile and injectable solutions containing dispersing agents and / or pharmacologically compatible wetting agents are used.
  • the active ingredient may also be formulated as microcapsules, optionally with one or more additive carriers.
  • the compounds of the invention can be used at doses of between 0.01 mg and 1000 mg per day, given in a single dose once a day or administered in several doses throughout the day, for example twice per day. day in equal doses.
  • the dose administered per day is advantageously between 5 mg and 500 mg, more advantageously between 10 mg and 200 mg. It may be necessary to use doses out of these ranges which the skilled person can realize himself.
  • the pharmaceutical composition as defined above may also comprise another active ingredient, useful in particular in the treatment or prevention of neurodegenerative diseases, and advantageously chosen from acetylcholinesterase inhibitors such as the azeptile , galanthamine, rivastigmine, memantine and tacrine; monoamine oxidase inhibitors such as selegiline; catecholamine O-methyltransferase inhibitors such as entacapone; glutamatergic inhibitors such as amantadine and baclofen; cholinergic agonists such as sabcomelin; dopaminergic agonists such as pergolide, cabergoline, ropirinole and pramipexole; neurotransmitter analogs or precursors such as L-3,4-dihydroxyphenylalanine; and anticholinergics such as trihexyphenidyl and tropatepine.
  • acetylcholinesterase inhibitors such as the azeptile , galanthamine,
  • the subject of the present invention is also a pharmaceutical composition as defined above, for its use as a medicament, especially as a neurotrophic or neuroprotective medicament, advantageously intended for the treatment or the prevention of neurodegenerative diseases such as diabetic disease. Alzheimer's, Parkinson's disease, multiple sclerosis or stroke.
  • the present invention also relates to a method for preparing a compound of formula (I) as described above, characterized in that it comprises the following steps:
  • Step a By "carboxylic acid function in free form” means, within the meaning of the present invention, a CO 2 H group.
  • the term "carboxylic acid function in activated form” means a carboxylic acid function modified so as to render it more active with respect to a nucleophile.
  • activated forms are well known to those skilled in the art and may in particular be an acid chloride (COCl).
  • COCl acid chloride
  • Z will advantageously represent a CO 2 H or COCl group.
  • the compound of formula (II) may be obtained easily from corresponding carboxylic acid, commercially available by activation of the carboxylic acid function by techniques well known to those skilled in the art.
  • an acid chloride may be obtained in particular by reaction of the corresponding carboxylic acid with oxalyl chloride in the presence of a few drops of dimethylformamide (DMF). This reaction can be carried out in a solvent such as dichloromethane, especially at room temperature.
  • DMF dimethylformamide
  • the coupling reaction will be carried out in the presence of a coupling agent, such as diisopropylcarbodiimide (DIC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), hydrochloride of 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide (EDC), carbonyldiimidazole (CDI), 2-H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU),
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • EDC hydrochloride of 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • HBTU 2-H-benzotriazol-1
  • a coupling aid such as N-hydroxy succinimide (NHS), N-hydroxy benzotriazole (HOBt), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2, 3-benzotriazole (HOOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole
  • the compound of formula (II) used comprises a group Z in the form of an activated carboxylic acid function, and more particularly in the form of an acid chloride.
  • the coupling reaction will advantageously be carried out in the presence of a base such as triethylamine.
  • This reaction may be carried out in a solvent such as dichloromethane, especially at room temperature.
  • Step b
  • LiAlH 4 It may be implemented in a solvent such as tetrahydrofuran.
  • hydride is meant, in the sense of the present invention, a chemical compound capable of releasing hydride ions H " , making it possible to carry out a reduction reaction.
  • the separation of the final product from the reaction medium may be carried out by techniques well known to those skilled in the art, for example by extraction, evaporation of the solvent or by precipitation and filtration.
  • the compound of formula (I) thus obtained may also be purified if necessary by methods well known to those skilled in the art, such as by recrystallization if the compound is crystalline, by distillation, by column chromatography on silica gel or by high performance liquid chromatography
  • FIGURE
  • FIG. 1 represents photographs of fluorescent neurons obtained under the conditions of the DHR-123 test without treatment (control) or after treatment with
  • Figure 2 shows the 3-part brain section made in Example 2.3.
  • Figures 3 and 4 show the chromatograms (abscissa: time in minutes; ordinates: relative intensity in percent) obtained by HPLC-MS / MS from mouse brain extracts used in the experiments of Example 2.3. highlighting the presence or absence of the compound according to the invention 2c.
  • Figure 4 corresponds to the chromatograms obtained in the context of the oral treatment while Figure 5 corresponds to the chromatograms obtained in the context of intraperitoneal treatment.
  • IR cm- 1 608, 671, 719, 739, 801, 847, 913, 1009, 1068, 1094, 1130, 1222, 1246, 1271, 1294, 1340, 1377, 1424, 1456, 1470, 1554, 1629, 1650. , 2851, 2918, 2955, 3089, 3264, 3387.
  • IR cm- 1 608, 718, 739, 801, 1011, 1094, 1225, 1293, 1340, 1377, 1456, 1553, 1630,
  • IR cm- 1 717, 739, 800, 1010, 1067, 1094, 1225, 1300, 1339, 1377, 1423, 1456, 1471, 1552, 1629, 1649, 2850, 2918, 3267, 3393.
  • IR cm- 1 609, 718, 739, 800, 1013, 1094, 1224, 1298, 1339, 1377, 1424, 1456, 1553, 1629, 1649, 2850, 2918, 3267, 3392.
  • IR cm. 1 669, 718, 739, 799, 913, 1012, 1066, 1095, 1222, 1299, 1339, 1377, 1424,
  • IR cm -1 560, 580, 608, 719, 739, 801, 931, 1011, 1069, 1094, 1126, 1225, 1269, 1299, 1340, 1377, 1425, 1456, 1555, 1629, 1650, 2851, 2920. , 3010, 3264, 3386.
  • IR cm. 1 606, 704, 727, 741, 758, 974, 1012, 1026, 1057, 1109, 1166, 1224, 1267, 1357, 1375, 1457, 1556, 1629, 1669, 1982, 2037, 2849, 2917. , 3275, 3394.
  • the mixture is filtered on celite, washed with ethyl acetate and then dried over anhydrous MgSO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • IR cm- 1 565, 592, 611, 722, 739, 804, 842, 886, 914, 1010, 1078, 1104, 1221, 1309, 1341, 1358, 1376, 1453, 1467, 1504, 1553, 1622, 2849. , 2916, 3063, 3139, 3275, 3387.
  • IR cm- 1 592, 611, 721, 739, 805, 874, 1011, 1104, 1222, 1341, 1454, 1630, 2649,
  • IR cm- 1 565, 592, 611, 721, 739, 784, 803, 842, 886, 910, 1011, 1105, 1222, 1341,
  • IR cm- 1 563, 577, 600, 735, 805, 1010, 1125, 1223, 1339, 1455, 1619, 2848, 2916,
  • IR cm- 1 562, 572, 592, 609, 720, 740, 806, 868, 1011, 1104, 1221, 1341, 1455, 1626,
  • IR cm- 1 587, 669, 727, 740, 760, 974, 1010, 1024, 1044, 1108, 1149, 1216, 1355, 1374, 1457, 1466, 1668, 2848, 2923, 3299, 3425.
  • neurotrophic activity of neuronal growth factors is characterized by their capacity on the one hand to promote neuronal survival and on the other hand to stimulate their maturation.
  • neuritogenesis is a morphological criterion representative of the state of neuronal maturation.
  • antioxidant compounds also have a neuroprotective capacity. This is why it is also interesting to evaluate the antioxidant capacity of the compounds of the invention.
  • the dissection consists in extracting embryos from the uterus of a rat at fifteen days of gestation. The brain of each embryo is then dissected under a binocular microscope to extract the ventral mesencephalon.
  • the mesencephales are grouped in a falcon containing 2 ml of L15 medium and then dissociated mechanically (30 round trips), 5 ml of L15 medium are added. The suspension is allowed to stand for 8 minutes. The 5 ml of supernatant are recovered in a new falcon and the cells are dissociated again (30 round trips). 5 mL of L15 is added again and the suspension is left rest for 8 minutes. The 5 ml of supernatant are added to the previous ones. The cells thus extracted are then centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm- 1 The cell pellet is taken up in Neurobasal medium supplemented with 1% B27, 1% glutamine and 1% penicillin / streptomycin mixture.
  • the cells are then seeded at the appropriate dilution (0.6 embryo per 24 well plate well and 0.4 per well of 48 well plate) .
  • the cultures are incubated at 37 ° C in a humid atmosphere enriched with 5% CO 2 in 24-well plate or 48 wells.
  • Immunohistochemistry At 8 days of culture, the cells are fixed with a 4% formaldehyde solution and then washed three times with PBS. The cells are then subjected to immunohistochemistry anti-tyrosine hydroxylase (TH) revealed by a secondary antibody coupled to a fluorochrome emitting in the red (Cy3). Analyzes. Neuroprotection is assessed by counting 10 field positive TH neurons per well directly under an inverted fluorescence microscope, reported as a percentage of the untreated control. The experiments are carried out at the rate of three wells per condition. Three independent experiments are performed under these conditions. The total neuritic length per cell is calculated by the Neurite Outgrowth software by Explora Nova on 60 to 100 neurons photographed independently by condition. • Results
  • ventral mesencephalon contains dopaminergic neurons from the substantia nigra which degenerate in Parkinson's disease, as well as those present in the ventral tegmental area.
  • Primary cultures of embryonic ventral mesencephalon can be performed after extraction and dissection of embryos, collection and dissociation of ventral mesencephalons and seeding of the cell suspension in multiwell plates.
  • GABAergic ⁇ 94%)
  • dopaminergic ⁇ 3%
  • serotonergic ⁇ 3%
  • Glia is essentially astrocytic, we also find oligodendrocytes and microglia ( ⁇ 3%) in smaller proportions.
  • Other non-neural cell types are also present in very small proportions such as erythrocytes, fibroblasts and endothelial cells.
  • the different cell populations can be identified by immunocytochemistry of specific markers.
  • Dopaminergic neurons are identified by labeling tyrosine hydroxylase.
  • TH + neurons dopaminergic neurons
  • This observation has been exploited as an in vitro model of neuronal death in Parkinson's disease for the search for neuroprotective compounds. Under these same conditions, the fibers of the remaining neurons are not altered and neuritogenesis can be observed and quantified.
  • This model is therefore particularly interesting in our study since it makes it possible in the same experiment to obtain the two expected results, namely the quantification of neuroprotection and neuritogenesis.
  • the neurotrophic potential of our compounds could be evaluated by carrying out a double screening including the estimation of the neuroprotective potential and the capacity to stimulate the neuritic growth.
  • the neuroprotective potential of each compound is then estimated by counting the number of remaining neurons (TH + neurons) under a fluorescence microscope. The results for the different treatments are expressed as a percentage of the number of neurons remaining relative to the untreated cultures (Control). Neuritogenesis is quantified by measuring the total neuritic length reported by dopaminergic neuron (neuritic length / TH + neuron) using an image analyzer on at least sixty conditionally photographed neurons (10-30% of dopaminergic neurons). total). All experiments were performed by comparison with a positive control, dibutyryl-AMPcyclic (db-cAMP) (Mourlevat S. et al Mol Pharmacol 2003, 64 (3), 578-586).
  • db-cAMP dibutyryl-AMPcyclic
  • Ic C O (CH 2 ) 14 CH 3 121.3 ⁇ 3.2 ** 168.6 ⁇ 11.5 **
  • ABTS 2,2'-azino- ⁇ - (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfomic acid)
  • ABTS is a colored indicator of the presence of hydroxyl radicals in solution. Indeed, the attack of a hydroxyl radical on the ABTS generates the formation of an ATBS + 'cation radical (Equation 1). This colored entity gives the solution an absorbance (Abs) at 450 nm.
  • the antioxidant capacity of a compound can then be expressed as IC 50, reflecting the concentration at which 50% of the hydroxyl radicals were reduced by the test compound.
  • test compounds and the Trolox ® were dissolved in ethanol to obtain solutions of 1 mM.
  • concentrations ranging from 1 mM to 10 nM.
  • 90 ⁇ l of a 1-1 ethanol-water mixture was added on a 96-well ELISA plate, followed by 15 ⁇ l of a 1 mM aqueous ABTS solution, 15 ⁇ l of an aqueous Fe 2 solution.
  • the ABTS test was therefore performed by comparison with Trolox ® .
  • the same ranges from 10 nm to 1 mM indoles Ic, Ic, Ig, Ii, 2a, 4c, 2g, 2h, and 2i were tested.
  • the results are shown in Table 2 below.
  • the amine compounds of the invention tested 2a, 2c, 2g, 2h and 2i have IC50 close to that of Trolox ® highlighting the interest of the amine function in the antioxidant activity of these compounds.
  • the presence of intrachain double bonds improves the antioxidant activity leading to a lower IC50 than Trolox ® (see 2h).
  • Dihydrorhodamine 123 or DHR123 is used as an indicator of reactive oxygen species (ROS). Unloaded and non-fluorescent, it passively crosses the cell membrane before being oxidized, on contact with free radicals, rhodamine 123 emitting a green fluorescence. Free radicals
  • the cells When the cells are treated with an antioxidant, the amount of intracellular ROS is decreased. This decrease is reflected, in the presence of DHR123, by a quantifiable decrease in the fluorescence emitted.
  • the cultures were placed strictly under the same conditions as for the neuroprotection / neuritogenesis test. Thus the cultures were maintained for eight days in the presence of a concentration of 10 nM each of the tryptamine derivatives tested. The 8 th day in vitro (DIV 8), 50 .mu.m DHR-123 (Sigma) were added and the cells were incubated 30 minutes at 37 ° C.
  • FIG. 1 illustrates the decrease of the intensity of fluorescence emitted in neurons after treatment with the compound Ih at 10 nM, the compound showing the highest antioxidant activity, as compared to Trolox ® and the untreated control.
  • BBB blood-brain barrier
  • the purpose of this study is to verify by HPLC coupled to mass spectrometry, the presence of the molecule 2c according to the invention in the cerebral parenchyma after a sub-chronic treatment of the hydrochloride of the molecule 2c (2c / HCl) by Oral or intraperitoneal (IP).
  • mice During the acclimation and study period, mice have free access to food and drink. All the experiments were carried out in accordance with the conditions of the decree n ° 2001-464 of May 29th, 2001 relating to the experiments practiced on the animals.
  • Treatments Two sub-chronic (oral or intraperitoneal) treatments of
  • IP Intraperitoneal
  • mice R1, R2 and R3 received the same treatments as the previous mice except for the Thursday when they did not receive the second treatment:
  • the solution of 2c hydrochloride to be administered is prepared in the vehicle (0.5% Tween80 + 99.5% carboxymethyl cellulose 1%, in NaCl 0.9% in water) at a concentration of 15, 0 g / L. Three groups were formed:
  • mice All mice are treated twice a day for 4 days. The 5 th day they receive final treatment and were euthanized between 3:00 ET 7:30 after the last treatment according to the following scheme: between 13:30 and 18:00
  • mice are anesthetized with an injection of 0.1 ml of a 6% sodium pentobarbital solution and the mice are then infused to remove traces of blood from the brain with 0.9% NaCl solution.
  • % which contains heparin (200 ⁇ l of heparin choay at 5000 IU / ml in a liter of 0.9% NaCl).
  • Each animal is infused with at least 50 mL of this solution.
  • the mouse is decerebrated. The cerebellum, brain stem and olfactory bulbs are eliminated.
  • the brain is dissected into 3 parts according to the scheme shown in FIG. 2.
  • the 3 parts of the brain are frozen in isopentane at -30 ° C. for one minute and then stored separately at -80 ° C.
  • Positive and Negative Controls The brains of vehicle mice are used for positive and negative controls.
  • 10 ⁇ l of a hydrochloride solution of 2c at 1 ⁇ g / ml are added to the supernatant and diluted half in MeOH before transfer into a HPLC vial.
  • Preparation of the daughter of 2c A stock solution of 2c hydrochloride is prepared extemporaneously in MeOH at a concentration of 1.0 mg / ml. All the other solutions are prepared by dilution of this stock solution in MeOH and then stored at -40 ° C.
  • Instrumentation and conditions for the analysis of compound 2c Detection and quantification, based on peak area, are carried out by HPLC-MS / MS, in MRM mode.
  • the HPLC system consists of a Dionex Ultimate 3000 pump equipped with an automatic Dionex WPS-3000PL sample injector.
  • the mass spectrometer used is a Water-Micromass Quattro Ultima equipped with an electrospray ionization source and a triple quadrupole analyzer. Data acquisition and analysis is done via Masslynx 3.5.
  • the liquid chromatography is performed in isocratic mode with an XBridge TM (Waters) C18 column, 150 x 2.1 mm, having a particle size of 3.5 ⁇ m.
  • the mobile phase is composed of a mixture of two phases A and B, in proportions 3/97.
  • Phase B is composed of 0.2% triethylamine in MeOH (v / v).
  • the flow rate is set at 0.2 mL / min and the injection volume is 10 ⁇ L.
  • the mass spectrometer is connected to the HPLC system using an electrospray ionization source.
  • a switching valve is programmed to send the first three minutes of the chromatography to the trash in order to avoid salt accumulation at the capillary of the source.
  • the voltage of the capillary is set at 3000 V and the voltage of the cone at 50 V
  • the temperature of the source is set at 120 0 C
  • the desolvation gas (N 2 ) is set at a flow rate of 463 L / h and the temperature at 35O 0 C.
  • the mass spectra are obtained in positive mode.
  • the parameters are optimized to obtain the maximum molecular ion at m / z 385.66, corresponding to compound 2c.
  • the collision is obtained with an inert gas (argon) and the energy is set at 22eV in MS / MS mode to detect the mass transitions: m / z 385.66 ⁇ 254.23 and 385.66 ⁇ 144.17.
  • the calibration line is made from a standard range of 7 concentrations (0.5 ⁇ g / mL, 0.1 ⁇ g / mL, 20 ng / mL, 4 ng / mL, 0.8 ng / mL; 0.16 ng / mL and 0.08 ng / mL). • Results
  • the area of the HPLC peaks is a function of the concentration of the compound 2c in the range of 0.16 to 500.00 ng / mL with an R 2 of 0.9997.
  • the limit of detection is 0.08 ng / mL with a S / N ratio (signal / noise) of 3: 1.
  • the retention time of compound 2c is 5.3 minutes and the acquisition time is 8 minutes. minutes.
  • Compound 2c is capable of crossing in vivo the BBB after IP administration and per os of 2c / HCl.
  • Oral treatment at 300 mg / kg / day achieves concentrations approximately 1.5 times higher than those obtained after IP treatment at 20 mg / kg / day.

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Abstract

La présente invention concerne un composé de formule (I) suivante : ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, un stéréoisomère ou un mélange de stéréoisomères en toutes proportions, dans laquelle: - X1 représente un groupe CH2 ou C=O, - X2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, saturée ou insaturée, comportant 8 à 24 atomes de carbone, - R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH ou (C1-C6)alcoxy, tel que méthoxy, et - R2 représente un groupe CH3 ou CH2OR3, avec R3 représentant un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6)alkyle, CO-(C1-C6)alkyle ou NH-(C1-C6)alkyle, ainsi que son utilisation en tant que médicament, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives, et son procédé de préparation.

Description

DERIVES INDOLIQUES POUR LE TRAITEMENT DE MALADIES NEURODEGENERATIVES
La présente invention concerne des composés possédant un motif indole substitué par une chaîne aliphatique utiles pour le traitement de maladies neurodégénératives, ainsi que leur procédé de préparation et leur utilisation.
Avec l'allongement de l'espérance de vie, de plus en plus de personnes sont atteintes de maladies neurodégénratives telles que la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson.
Une maladie neurodégénérative est caractérisée par une mort apoptotique progressive de sous populations neuronales particulières, liée à un déficit fonctionnel des axes de transmission atteints. Ce type de maladie affecte le fonctionnement du système nerveux central, et en particulier du cerveau, de façon progressive, la maladie pouvant évoluer plus ou moins rapidement (quelques semaines à plusieurs années), et souvent de manière irréversible. Selon la région du système nerveux central atteint par la maladie, différentes fonctions pourront être affectées comme la motricité, le langage, la mémoire, la perception ou encore la cognition. Parmi les maladies neurodégénératives les plus fréquentes, on peut citer en particulier la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson.
La maladie d'Alzheimer, qui touche environ 24 millions de personnes dans le monde entier, est une maladie du tissu cérébral qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions mentales. Le premier symptôme est la perte du souvenir des événements récents (amnésie), puis les déficits cognitifs s'étendent aux domaines du langage (aphasie), de l'organisation des mouvements (apraxie), de la reconnaissance visuelle (agnosie) et des fonctions executives (telles que la prise de décision et la planification).
La maladie de Parkinson, quant à elle, affecte le système nerveux central et provoque des troubles moteurs d'évolution progressive, notamment des tremblements du corps. L'utilisation thérapeutique de neurotrophines, décrites dans la maintenance de diverses populations neuronales, a été proposée à des fins curatives. Bien que l'administration de neurotrophines recombinantes dans des modèles animaux lésés ait montré un effet bénéfique sur la survie neuronale, leur utilisation chez l'homme, d'abord encourageante, s'est trouvée rapidement limitée. En effet, la très forte hydrophilie de ces composés, leur interdisant le passage de la barrière hématoencéphalique ainsi que leur dégradation enzymatique rapide imposent une administration intracrânienne répétée, génératrice d'effets secondaires dramatiques.
Par ailleurs, les autres médicaments prescrits pour ces différentes maladies neurodégénératives permettent uniquement de retarder l'évolution de la maladie, aucun ne permettant de guérir la maladie, ni même d'arrêter son évolution,
II existe donc actuellement un réel besoin de trouver de nouvelles molécules plus actives et pouvant passer la barrière hématoencéphalique pour le traitement de ces maladies neurodégénératives. Le noyau indole est un motif présent dans de nombreux composés naturels ou non présentant des activités biologiques diverses, des activités antimicrobiennes, antiparasitaires, antioxydantes, neurotrophiques, et anti-inflammatoires ayant été reportées.
Des composés présentant une longue chaine aliphatique greffée sur un indole ont été reportés pour leurs propriétés neurotrophiques (Coowar D. et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 6270). Ces structures déjà décrites présentent une chaine directement couplée au cycle indolique, cependant aucune structure dérivant de la tryptamine n'a été étudiée pour ces propriétés.
Les inventeurs ont alors découverts de manière intéressante que des dérivés naturels de la tryptamine, de type N-acyltryptamine à longue chaine, extraits de certaines plantes de la famille des Annonaceae, notamment Annona atemoya, Annona reticulata et Rollinia mucosa (Wu Y.-C. et al. J. Nat. Prod. 2005, 68(3), 406-408) et d'autres analogues de synthèse dérivant de la tryptamine, possédaient une activité protectrice et différentiatrice des neurones dopaminergiques en culture. La présente invention a donc pour objet un composé de formule (I) suivante :
ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, un stéréoisomère ou un mélange de stéréoiso mères en toutes proportions, en particulier un mélange d'énantiomères, et notamment un mélange racémique, dans laquelle:
Xi représente un groupe CH2 ou C=O,
X2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, saturée ou insaturée, comportant de I à 24, de préférence de 8 à 22, atomes de carbone, - Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH ou (Ci-Ce)alcoxy, tel que méthoxy, et
R2 représente un groupe CH3 ou CH2OR3, avec R3 représentant un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C6)alkyle, CO-(Ci -C6)alkyle ou NH-(Ci- C6)alkyle. pour son utilisation en tant que médicament, notamment en tant que médicament neurotrophique ou neuroprotecteur, destiné avantageusement au traitement ou à la prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux.
Par groupement « (Ci-C6)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée, comportant de 1 à 6 atomes de carbone, en particulier les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, iso- butyle, sec-butyle, tert-butyle, n-pentyle, n-hexyle. De préférence, il s'agit d'un groupe méthyle.
Par groupement « (Ci-Ce)alcoxy », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-C6)alkyle tel que défini ci-dessus lié à la molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. Il s'agit en particulier des groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, iso-butoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, n-pentoxy. De préférence, il s'agit d'un groupe méthoxy. Par groupement « CO-(C i-C6)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-C6)alkyle tel que défini ci-dessus lié à la molécule par l'intermédiaire d'un groupement CO. Il peut s'agir en particulier d'un groupement acyle (-COCH3) ou enbcore éthylcarbonyle (-COCH2CH3). Par groupement « NH-(C i-Ce)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (Ci-Ce)alkyle tel que défini ci-dessus lié à la molécule par l'intermédiaire d'un groupement NH.
Par « insaturée », on entend, au sens de la présente invention, que la chaîne hydrocarbonée peut comportée une ou plusieurs insaturation(s). Par « insaturation », on entend, au sens de la présente invention, une double ou une triple liaison et de préférence une double liaison.
Dans la présente invention, on entend par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement sûr, non toxique et ni bio logiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.
Par « sels pharmaceutiquement acceptables » d'un composé, on entend désigner dans la présente invention des sels qui sont pharmaceutiquement acceptables, comme défini ici, et qui possèdent l'activité pharmaco logique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent : (1) les hydrates et les solvates,
(2) les sels d'addition d'acide formés avec des acides inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2- naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires ; et (3) les sels formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent soit est remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin (Na+, K+ ou Li+ par exemple), un ion de métal alcalino -terreux (comme Ca2+ ou Mg2+) ou un ion d'aluminium ; soit se coordonne avec une base organique ou inorganique. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthano lamine, l'éthano lamine, N- méthylglucamine, la triéthano lamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.
Dans la présente invention, on entend désigner par « stéréoisomères », des diastéréoisomères ou des énantiomères. Il s'agit donc d'isomères optiques. Les stéréoisomères qui ne sont pas des images dans un miroir l'un de l'autre sont ainsi désignés par « diastéréoisomères », et les stéréoisomères qui sont des images dans un miroir non superposables sont désignés par « énantiomères ».
Un atome de carbone lié à quatre substituants non identiques est appelé un « centre chiral ».
Un mélange équimolaire de deux énantiomères est appelé mélange racémique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, un composé selon l'invention pourra répondre à la formule (Ia) suivante :
dans laquelle: représente indépendamment une liaison simple ou double, Xi, Ri et R2 sont tels que définis ci-dessus, et m représente un nombre entier supérieur ou égal à 1, et n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 0 avec m + n + p + 4 < 24 et de préférence 8 < m + n + p + 4 < 22. Plus particulièrement, le composé de l'invention pourra répondre à la formule (Ib) ou (Ic) suivantes :
pour lesquelles :
Ri, R2 et Xi sont tels que définis ci-dessus, q représente un nombre entier compris entre 1 et 24, de préférence entre 8 et 22, et - m, n et p sont tels que définis ci-dessus.
Ri représente un substituant du noyau indole, situé sur l'un quelconque des atomes de carbone du motif indole. Il s'agira avantageusement d'un atome d'hydrogène. R2 représentera avantageusement un groupe CH3 ou CH2OH. Avantageusement, Xi représente un groupe CH2. Les composés de l'invention pourront être choisis en particulier parmi :
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus pour la fabrication d'un médicament, notamment d'un médicament neurotrophique ou neuroprotecteur, destiné avantageusement au traitement ou à la prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux.
La présente invention concerne également une méthode de traitement ou de prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux, comprenant l'administration à un patient en ayant besoin d'une quantité efficace d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un composé de formule (I) suivante :
ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, un stéréoisomère ou un mélange de stéréoiso mères en toutes proportions, en particulier un mélange d'énantiomères, et notamment un mélange racémique, dans laquelle:
Xi représente un groupe CH2 ou C=O,
X2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, saturée ou insaturée, comportant de 1 à 24 de préférence de 8 à 22 atomes de carbone,
Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH ou (Ci-Ce)alcoxy, tel que méthoxy, et
R2 représente un groupe CH3 ou CH2OR3, avec R3 représentant un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-Ce)alkyle, CO-(Ci -C6)alkyle ou NH-(Ci- C6)alkyle. à l'exclusion des composés de formule
, avec u = 14, 16 à 18 ou 20 à 24.
Les composés exclus sont décrits dans Wu Y. -C. et al. J. Nat. Prod. 2005, 68(3), 406-408, et Châvez D. et al. J. Nat. Prod. 1999, 62(8), 1119-1122 en tant que nouveaux composés isolés de graines à'Annona atemoya ou de Rollinia mucosa.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, un composé selon l'invention pourra répondre à la formule (Ia) suivante :
dans laquelle: représente indépendamment une liaison simple ou double, Xi, Ri et R2 sont tels que définis ci-dessus, et m représente un nombre entier supérieur ou égal à 1, et n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 0 avec m + n + p + 4 < 24 et de préférence 8 < m + n + p + 4 < 22.
Plus particulièrement, le composé de l'invention pourra répondre à l'une des formules (Ib) et (Ic) suivantes :
ou pour lesquelles :
Ri, R2 et Xi sont tels que définis ci-dessus, q représente un nombre entier compris entre 1 et 24, de préférence entre 8 et
22, et m, n et p sont tels que définis ci-dessus.
Ri représentera avantageusement un atome d'hydrogène. R2 représentera avantageusement un groupe CH3 ou CH2OH. Avantageusement, Xi représente un groupe CH2.
Les composés de l'invention peuvent être choisis en particulier parmi :
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule (I) tel que décrit précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les composés selon l'invention peuvent être administrés par voie orale, sublinguale, parentérale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, et de préférence par voie orale.
Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, parentérale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale ou rectale, l'ingrédient actif peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux ou aux êtres humains. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les formes d'administration parentérale, sous- cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intranasale ou intraoculaire et les formes d'administration rectale. Lorsque l'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.
On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié.
Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, de même qu'avec des correcteurs de goût ou des édulcorants. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylènes glycols.
Pour une administration parentérale, intranasale ou intraoculaire, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des agents mouillants pharmaco logiquement compatibles.
Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs.
Les composés de l'invention peuvent être utilisés à des doses comprises entre 0,01 mg et 1000 mg par jour, donnés en une seule dose une fois par jour ou administrés en plusieurs doses tout au long de la journée, par exemple deux fois par jour en doses égales. La dose administrée par jour est avantageusement comprise entre 5 mg et 500 mg, encore plus avantageusement entre 10 mg et 200 mg. Il peut être nécessaire d'utiliser des doses sortant de ces gammes ce dont l'homme du métier pourra se rendre compte lui-même. Selon un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus pourra comprendre en outre un autre principe actif, utile notamment dans le traitement ou la prévention de maladies neurodégénératives, et avantageusement choisi parmi des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que le donézépil, la galanthamine, la rivastigmine, la mémantine et la tacrine ; des inhibiteurs de monoamines oxydase tels que la sélégiline ; des inhibiteurs de catécho lamines O- méthyltransférase tels que l'entacapone ; des inhibiteurs glutamatergiques tels que l'amantadine et le baclofène ; des agonistes cholinergiques tels que la sabcoméline ; des agonistes dopaminergiques tels que le pergolide, le cabergoline, le ropirinole et le pramipexole ; des analogues ou précurseurs de neuromédiateurs tels que la L-3,4- dihydroxyphénylalanine ; et des anticholinergiques tels que le trihexyphénidyl et la tropatépine.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament, notamment en tant que médicament neurotrophique ou neuroprotecteur, destiné avantageusement au traitement ou à la prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I) tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(a) couplage entre la tryptamine et un composé de formule (II) suivante :
Z-X2-R2 (II) pour laquelle Z représente une fonction acide carboxylique sous forme libre ou sous forme activée et R2 et X2 sont tels que définis ci-dessus, pour donner un composé de formule (I- 1) suivante :
pour laquelle Ri, R2 et X2 sont tels que définis précédemment, (b) éventuellement réduction de la fonction carbonyle du composé de formule (I- 1) obtenu à l'étape (a) précédente pour donner un composé de formule (1-2) suivante :
pour laquelle Ri, R2 et X2 sont tels que définis précédemment, et
(c) séparation du milieu réactionnel du composé (I- 1) ou (1-2) obtenu à l'étape précédente.
Etape a : Par « fonction acide carboxylique sous forme libre », on entend, au sens de la présente invention, un groupe CO2H.
Par « fonction acide carboxylique sous forme activée », on entend, au sens de la présente invention, une fonction acide carboxylique modifiée de manière à la rendre plus active vis-à-vis d'un nucléophile. Ces formes activées sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être en particulier un chlorure d'acide (COCl). Ainsi, Z représentera avantageusement un groupe CO2H ou COCl. Le composé de formule (II) pourra être en particulier un acide gras ou analogue disponible commercialement lorsque Z = CO2H. Dans le cas où Z représente une fonction acide carboxylique activée, le composé de formule (II) pourra être obtenu facilement à partir de l'acide carboxylique correspondant, disponible dans le commerce par activation de la fonction acide carboxylique par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, un chlorure d'acide pourra être obtenu notamment par réaction de l'acide carboxylique correspondant avec du chlorure d'oxalyle en présence de quelques gouttes de diméthylformamide (DMF). Cette réaction peut être réalisée dans un solvant tel que le dichlorométhane, notamment à température ambiante.
Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention, le composé de formule (II) utilisé comporte un groupe Z = CO2H (forme acide libre). Dans ce cas, la réaction de couplage sera réalisée en présence d'un agent de couplage, tel que le diisopropylcarbodiimide (DIC), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), le carbonyldiimidazole (CDI), le 2-H-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU), le
2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetraméthyluronium tetrafluoroborate (TBTU) ou encore le O-(7-azobenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU), éventuellement associé à un auxiliaire de couplage tel que le N-hydroxy succinimide (NHS), le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4- oxo-l,2,3-benzotriazole (HOOBt), le l-hydroxy-7-azabenzotriazole (HAt) ou le N- hydroxysylfosuccinimide (sulfo NHS). De préférence, le couplage sera réalisé en présence du couple EDC/HOBt. Cette réaction peut être réalisée dans un solvant tel que le dichlorométhane, notamment à température ambiante, une base telle que la triéthylamine pouvant être utilisée.
Ce premier mode de réalisation particulier est particulièrement adapté à la préparation de composés de formule (I) pour lesquels R2 = CH2OH. Selon un second mode de réalisation particulier de l'invention, le composé de formule (II) utilisé comporte un groupe Z sous forme d'une fonction acide carboxylique activée, et plus particulièrement sous forme d'un chlorure d'acide. Dans ce cas, la réaction de couplage sera avantageusement réalisée en présence d'une base telle que la triéthylamine. Cette réaction pourra être mise en œuvre dans un solvant tel que le dichlorométhane, notamment à température ambiante.
Ce second mode de réalisation particulier sera avantageusement utilisé lorsque
R2 ≠ CH2OH, et en particulier lorsque R2 = CH3, car les groupements hydroxyles (OH) réagissent avec le chlorure d'oxalyle.
Etape b :
Cette étape de réduction permet de réduire l'amide en aminé pour passer d'un composé de formule (I) pour lequel Xi = C=O à un composé de formule (I) pour lequel
Xi = CH2. Cette étape sera avantageusement réalisée en présence d'un hydrure tel que
LiAlH4. Elle pourra être mise en œuvre dans un solvant tel que le tétrahydrofurane. Par « hydrure », on entend, au sens de la présente invention, un composé chimique capable de libérer des ions hydrures H", permettant d'effectuer une réaction de réduction.
Etape c :
La séparation du produit final du milieu réactionnel pourra être réalisée par des techniques bien connue de l'homme du métier, comme par exemple par extraction, évaporation du solvant ou encore par précipitation et fîltration.
Le composé de formule (I) ainsi obtenu pourra par ailleurs être purifié si nécessaire par des méthodes bien connues de l'homme du métier, comme par recristallisation si le composé est cristallin, par distillation, par chromatographie sur colonne sur gel de silice ou encore par chromatographie liquide haute performance
(HPLC).
La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs qui suivent.
FIGURE :
La Figure 1 représente des photographies de neurones fluorescents obtenus dans les conditions du test à la DHR- 123 sans traitement (contrôle) ou après traitement avec du
Trolox® à 10 μM ou avec le composé Ih à 10 nM.
La Figure 2 représente la coupe du cerveau en 3 parties réalisées dans l'exemple 2.3.
Les Figures 3 et 4 représentent les chromatogrammes (abscisses : temps en minutes ; ordonnées : intensité relative en pourcent) obtenus par HPLC-MS/MS à partir d'extraits de cerveaux des souris utilisées dans les expériences de l'exemple 2.3. mettant en évidence la présence ou non du composé selon l'invention 2c. La Figure 4 correspond aux chromatogrammes obtenus dans le cadre du traitement per os tandis que la Figure 5 correspond aux chromatogrammes obtenus dans le cadre du traitement intra-péritonéal. EXEMPLES :
1. Synthèse des composés de l'invention
1.1. Synthèse des composés de formule (I) pour lesquels Xi = C=O
• Procédure générale de synthèse à partir d'un chlorure d'acide : A une solution d'acide gras (2 mmol) dans le dichlorométhane (10 mL) placée à 00C sous atmosphère inerte sont ajoutés trois gouttes de diméthylformamide sec et du chlorure d'oxalyle (1,04 mL, 12 mmol). Le mélange est agité à 00C pendant Ih. Le dichlorométhane et l'excès de chlorure d'oxalyle sont évaporés sous vide. Le chlorure d'acide ainsi obtenu est dissous dans 5 mL de dichlorométhane sec. A une solution de tryptamine (160 mg, 1 mmol) dans le dichlorométhane (10 mL) à 00C sous atmosphère inerte d'azote, sont ajoutés de la triéthylamine (0,55 mL, 2 mmol) et lentement le chlorure d'acide en solution dans le dichlorométhane (5 mL). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 2h. La réaction est hydrolysée, puis extraite au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgSC>4 anhydre puis concentrée sous vide. Les produits sont purifiés sur colonne de silice dans un mélange de cyclohexane et d'acétate d'éthyle en proportions 8:2.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)tridécanamide (la) Rendement : 95% RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m, 17H); 1.58 (m, 5H); 2.09 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 3.59 (t, J= 6.8 Hz, IH); 3.62 (t, J= 6.8 Hz, IH); 5.48 (s, IH); 7.04 (d, J= 1.6 Hz, IH); 7.13 (t, J= 7.2 Hz, IH); 7.22 (t, J= 7.2 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.61 (d, J= 8.0 Hz, IH,); 8.05 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.5, 25.2, 29.2, 29.3, 29.5, 31.8, 36.8, 39.5, 111.1, 113.1, 118.6, 119.4, 121.8, 122.1, 127.4, 136.4, 173.0. ESI-MS m/z: 379 ( [M+Naf, 100).
IR cm"1: 608, 671, 719, 739, 801, 847, 913, 1009, 1068, 1094, 1130, 1222, 1246, 1271, 1294, 1340, 1377, 1424, 1456, 1470, 1554, 1629, 1650, 2851, 2918, 2955, 3089, 3264, 3387. N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)pentadécanamide (Ib) Rendement : 77%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m, 22H); 1.61 (m, 4H); 2.10 (t, J= 7.0 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 3.58 (t, J= 6.4 Hz, IH); 3.65 (t, J= 6.4 Hz, IH); 5.49 (s, IH); 7.04 (s, IH); 7.12 (t, J= 7.0 Hz, IH); 7.22 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.38 (d, J= 7.6 Hz, IH); 7.61 (d, J= 8.2 Hz, IH); 8.04 (s, IH).
RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.6, 22.9, 23.7, 25.3, 28.9, 29.2, 29.4, 29.6, 31.8, 36.8, 39.6, 111.2, 112.9, 118.6, 119.3, 122.0, 127.3, 128.7, 130.8, 136.4, 173.1. ESI-MS m/z: 407 ([M+Naf, 100). IR cm"1: 607, 718, 739, 801, 931, 1010, 1069, 1094, 1130, 1225, 1297, 1340, 1377, 1425, 1456, 1470, 1555, 1630, 1650, 2850, 2918, 2955, 3267, 3387.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)hexadécanamide (Ic) Rendement : 87% RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 3OH); 1.57 (m,
4H); 2.09 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.9 Hz, 2H); 3.60 (t, J= 6.6 Hz, IH); 3.62 (t, J=
6.6 Hz, IH); 5.56 (s, IH); 7.04 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.13 (t, J= .8 Hz, IH); 7.22 (t, J= 6.9
Hz, IH); 7.37 (d,J= 8.1 Hz, IH); 7.61 (d,J= 7.2 Hz, IH); 8.06 (s, IH).
RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.2, 25.3, 25.7, 26.9, 29.1, 29.3, 29.4, 29.5, 29.6, 29.7, 31.9, 33.4, 36.9, 39.7, 111.2, 113.0, 118.7, 119.4, 122.0, 122.1, 127.4,
136.4, 173.1.
ESI-MS m/z: 421 ([M+Na]+, 100).
IR cm"1: 608, 718, 739, 801, 1011, 1094, 1225, 1293, 1340, 1377, 1456, 1553, 1630,
2850,2918,3267,3387.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)heptadécanamide (Id)
Rendement : 93%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.6 Hz, 3H); 1.25 (m, 26H); 1.57 (m,
2H); 2.09 (t, J= 7.6 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 3.60 (t, J= 6.6 Hz, IH); 3.62 (t, J= 6.6 Hz, IH); 5.49 (s, IH); 7.04 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.13 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.21 (t, J=
7.6 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.61 (d, J= 8 Hz, IH); 8.09 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.4, 25.7, 29.3, 29.4, 29.6, 29.7, 31.9, 36.9, 39.6, 111.2, 113.1, 118.7, 119.5, 121.9, 122.2, 127.3, 136.4, 173.1. ESI-MS m/z: 435 ([M+Na]+, 100).
IR cm"1: 717, 739, 800, 1010, 1067, 1094, 1225, 1300, 1339, 1377, 1423, 1456, 1471, 1552, 1629, 1649, 2850, 2918, 3267, 3393.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)octadécanamide (le) Rendement : 95%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 27H); 1.57 (m, 2H); 2.09 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.6 Hz, 2H); 3.60 (t, J= 6.3 Hz, IH); 3.62 (t, J=
6.3 Hz, IH); 5.45 (s, IH); 7.03 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.13 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.21 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.1 Hz, IH); 7.61 (d, J= 7.2 Hz, IH); 8.07 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.4, 25.7, 29.3, 29.4, 29.5, 29.6, 29.7, 31.9, 36.9, 39.6, 111.2, 113.2, 118.8, 119.5, 121.9, 122.2, 127.4, 136.4, 173.1. ESI-MS m/z: 449 ([M+Naf, 100).
IR cm"1: 609, 718, 739, 800, 1013, 1094, 1224, 1298, 1339, 1377, 1424, 1456, 1553, 1629, 1649, 2850, 2918, 3267, 3392.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)icosanamide (If) Rendement : 50%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m, 3OH); 1.57 (m, 2H); 2.09 (t, J= 7.6 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 3.60 (t, J= 6.4 Hz, IH); 3.62 (t, J=
6.4 Hz, IH); 5.05 (s, IH); 7.04 (s, IH); 7.13 (t, J= 8.0 Hz, IH); 7.21 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.61 (d, J= 7.6 Hz, IH); 8.10 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.4, 25.7, 29.3, 29.4, 29.5, 29.7, 31.9,
33.7, 36.9, 39.6, 111.2, 113.1, 118.7, 119.5, 121.9, 122.2, 136.6, 173.1.
ESI-MS m/z: 477 ([M+Naf, 100).
IR cm"1: 669, 718, 739, 799, 913, 1012, 1066, 1095, 1222, 1299, 1339, 1377, 1424,
1456, 1472, 1552, 1629, 1649, 2850, 2917, 3269, 3394. N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)tricosanamide (Ig) Rendement : 88%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.6 Hz, 3H); 1.25 (m, 38H); 1.57 (m, 2H); 2.09 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.98 (t, J= 6.4 Hz, 2H); 3.60 (t, J= 6.4 Hz, IH); 3.62 (t, J= 6.4 Hz, IH); 5.47 (s, IH); 7.04 (d, J= 2,0 Hz, IH); 7.13 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.21 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.4 Hz, IH); 7.61 (d, J= 8,0 Hz, IH); 8.02 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.4, 25.7, 29.3, 29.4, 29.5, 29.7, 31.9, 33.7, 36.9, 39.6, 111.2, 113.1, 118.7, 119.5, 121.9, 122.2, 136.6, 173.1. ESI-MS m/z: 497 ([M+Naf, 100). IR cm"1: 560, 580, 612, 719, 738, 800, 983, 1093, 1225, 1342, 1377, 1462, 1472, 1564, 1628, 2848, 2917, 2959, 3258, 3396.
(8Z, UZ)-N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)heptadéca-8, 11-diènamide (Ih)
Rendement : 81% RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 0.90 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m, 14H); 1.59 (t, J=
6.8 Hz, 2H); 2.06 (m, 4H); 2.10 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.79 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 2.98 (t, J=
6.4 Hz, 2H); 3.59 (t, J= 6.4 Hz, IH); 3.62 (t, J= 6.4 Hz, IH); 5.37 (m, 4H), 5.63 (s, IH);
7.00 (d, J= 1.6 Hz, IH); 7.12 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.21 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.37 (d, J= 8.0
Hz, IH); 7.60 (d, J= 7.6 Hz, IH); 8.47 (s, IH). RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 14.0, 22.5, 25.3, 25.6, 25.7, 27.1, 29.1, 29.2, 29.3,
29.4, 29.6, 31.5, 36.8, 39.7, 111.3, 112.8, 118.6, 119.3, 122.0, 127.3, 127.8, 128.0,
130.0, 130.2, 136.4, 173.2.
ESI-MS m/z: 445 ([M+Na]+, 100).
IR cm"1: 560, 580, 608, 719, 739, 801, 931, 1011, 1069, 1094, 1126, 1225, 1269, 1299, 1340, 1377, 1425, 1456, 1555, 1629, 1650, 2851, 2920, 3010, 3264, 3386.
• Procédure générale de synthèse à partir d'un acide carboxylique libre : A une solution de tryptamine (320 mg, 2 mmol) et d'acide carboxylique (518 mg, 2 mmol) dans le dichlorométhane (40 mL) sont ajoutés de la triéthylamine (0,83 mL, 6 mmol), de l'EDC (768 mg, 4 mmol) et de l'HOBt (405 mg, 3 mmol). Le mélange est agité une nuit à température ambiante sous atmosphère inerte d'azote. La réaction est hydrolysée, puis extraite au dichlorométhane et lavée avec une solution aqueuse saturée en NH4Cl. La phase organique est séchée sur MgSC^ anhydre et concentrée sous vide. Le produit est purifié sur colonne de silice dans un mélange de dichlorométhane et de méthanol en proportions 95 : 5.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)-15-hydroxypentadécanamide (Ii) Rendement : 60%
RMN1H (400MHz, CDCl3) δ ppm: 1.25 (m, 22H); 1.57 (m, 4H); 2.09 (t, J= 7.2 Hz,
2H); 2.98 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 3.59-3.65 (m, 4H); 5.48 (s, IH); 7.04 (d, J= 1.6 Hz, IH);
7.13 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.22 (t, J= 8.0 Hz, IH); 7.38 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.61 (d, J= 8.0 Hz, IH); 8.06 (s, IH).
RMN13C (100MHz, CDCl3) δ ppm: 24.8, 25.4, 25.7, 26.3, 29.3, 29.4, 29.5, 30.4, 39.6,
63.1, 105.1, 111.2, 118.5, 118.8, 119.5, 121.9, 122.3, 127.4, 183.4.
ESI-MS m/z: 423 ([M+Na]+, 100).
IR cm"1: 606, 704, 727, 741, 758, 974, 1012, 1026, 1057, 1109, 1166, 1224, 1267, 1357, 1375, 1457, 1556, 1629, 1669, 1982, 2037, 2849, 2917, 3275, 3394.
1.2. Synthèse des composés de formule (T) pour lesquels X = CH2
Procédure générale :
A une solution d'amide (tel que préparé précédemment) (1 mmol) dans le THF (10 mL) placée à O0C sous atmosphère inerte d'azote est ajouté lentement du LiAlH4 (304 mg, 8 mmol) par petites portions. Le mélange est ensuite chauffé au reflux pendant 2h. Après refroidissement, la réaction est hydrolysée doucement par 1 mL d'eau, puis une solution de NaOH IM est ajoutée goutte à goutte jusqu'à obtention d'un précipité blanc.
Le mélange est filtré sur célite, lavé à l'acétate d'éthyle puis séché sur MgSθ4 anhydre et concentrée sous pression réduite.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)tridécan-l-amine (2a)
Rendement : 84%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 21H); 1.46 (m,
2H); 2.62 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 7.04 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.12 (td, J= 0.9 Hz, J= 7.8 Hz, IH); 7.20 (td, J= 1.2 Hz, J= 7.2 Hz, IH); 7.36 (d, J= 7.8 Hz, IH); 7.64 (d, J=
7.8 Hz, IH); 8.10 (s, IH). RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.8, 27.4, 29.3, 29.6, 29.7, 30.1, 32.0, 50.0, 111.1, 114.2, 118.9, 119.2, 121.8, 122.0, 127.5, 136.4. ESI-MS m/z: 343 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 565, 592, 611, 722, 739, 804, 842, 886, 914, 1010, 1078, 1104, 1221, 1309, 1341, 1358, 1376, 1453, 1467, 1504, 1553, 1622, 2849, 2916, 3063, 3139, 3275, 3387.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)pentadécan-l-amine (2b) Rendement : 83%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.89 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.26 (m, 24H); 1.46 (m, 2H); 2.62 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 7.04 (d, J= 1.8 Hz, IH); 7.12 (td, J= 1.2 Hz,
J= 7.8 Hz, IH); 7.20 (td, J= 1.2 Hz, J= 8.1 Hz, IH); 7.36 (d, J= 7.8 Hz, IH); 7.64 (d, J=
7.5 Hz, IH); 8.18 (s, IH).
RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.8, 27.4, 27.5, 29.4, 29.6, 29.7, 30.1,
31.9, 50.0, 111.1, 114.1, 117.4, 118.9, 119.2, 121.8, 122.0, 128.4, 133.4. ESI-MS m/z: 371 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 592, 611, 721, 739, 805, 874, 1011, 1104, 1222, 1341, 1454, 1630, 2649,
2916,3387.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)hexadécan-l-amine (2c) Rendement : 50%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 26H); 1.47 (m,
2H); 2.61 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 7.04 (d, J= 1.8 Hz, IH); 7.11 (td, J= 1.2 Hz,
J= 8.1 Hz, IH); 7.19 (td, J= 1.2 Hz, J= 8.1 Hz, IH); 7.36 (d, J= 8.1 Hz, IH); 7.62 (d, J=
7.8 Hz, IH); 8.21 (s, IH). RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.6, 27.3, 29.3, 29.5, 29.6, 29.7, 29.8,
30.0, 31.9, 50.0, 111.1, 113.8, 118.8, 119.2, 122.0, 127.4, 136.4.
ESI-MS m/z: 385 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 565, 592, 611, 721, 739, 784, 803, 842, 886, 910, 1011, 1105, 1222, 1341,
1376, 1454, 1467, 1621, 2849, 2916, 3053, 3139. N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)heptadécan-l-amine (2d) Rendement : 90%
RMN1H (200MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 28H); 1.46 (m, 2H); 2.61 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 7.05 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.12 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.20 (t, J= 7.5 Hz, IH); 7.37 (d, J= 8.1 Hz, IH); 7.64 (d, J= 7.8 Hz, IH); 8.05 (s, IH).
RMN13C (50MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.9, 27.4, 29.3, 29.6, 29.7, 30.2, 31.9, 50.0, 111.1, 114.2, 118.9, 119.2, 121.8, 122.0, 127.5, 136.4. ESI-MS m/z: 399 ([M+H]+, 100). IR cm"1: 565, 592, 612, 721, 739, 805, 841, 871, 891, 1011, 1074, 1105, 1223, 1342, 1358, 1376, 1454, 1466, 1505, 1622, 2849, 2916, 3064, 3141.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)octadécan-l-amine (2e)
Rendement : 52% RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 30H); 1.46 (m,
2H); 2.62 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.98 (m, 4H); 7.04 (d, J= 1.8 Hz, IH); 7.12 (t, J= 7.8 Hz,
IH); 7.20 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.36 (d, J= 8.1 Hz, IH); 7.63 (d, J= 7.8 Hz, IH); 8.11 (s,
IH).
RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.4, 27.4, 29.4, 29.7, 30.0, 32.0, 49.9, 111.1, 114.0, 118.9, 119.2, 121.8, 121.9, 122.0, 136.4.
ESI-MS m/z: 413 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 563, 577, 600, 735, 805, 1010, 1125, 1223, 1339, 1455, 1619, 2848, 2916,
3417.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)icosan-l-amine (2f) Rendement : 74%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.9 Hz, 3H); 1.25 (m, 34H); 1.54 (m, 2H); 2.62 (t, J= 7.2 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 7.04 (d, J= 2.1 Hz, IH); 7.11 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.19 (t, J= 7.8 Hz, IH); 7.36 (d, J= 7.8 Hz, IH); 7.63 (d, J= 8.1 Hz, IH); 7.98 (s, IH).
RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.8, 27.4, 29.4, 29.7, 30.1, 31.9, 49.9, 111.1, 114.1, 119.1, 119.6, 121.8, 122.0, 127.4, 136.4. ESI-MS m/z: 441 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 562, 572, 592, 609, 720, 740, 806, 868, 1011, 1104, 1221, 1341, 1455, 1626,
2849, 2916, 3244.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)tricosan-l-amine (2g) Rendement : 52%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.88 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m, 40H); 1.47 (m, 2H); 2.63 (t, J= 7.6 Hz, 2H); 2.99 (m, 4H); 7.06 (s, IH); 7.12 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.20 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.36 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.62 (d, J= 8,0 Hz, IH); 8.03 (s, IH). RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.7, 25.6, 27.3, 29.2, 29.3, 29.4, 29.5, 29.7, 31.9, 49.8, 111.1, 113.9, 118.9, 119.3, 122.0, 127.4, 136.4. ESI-MS m/z: 483 ([M+H]+, 100). IR cm"1: 577, 668, 720, 735, 746, 805, 1091, 1215, 1463, 1619, 2849, 2916, 3418.
(8Z, HZ)-N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)heptadéca-8, 11-diènamine (2h) Rendement : 52%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 0.89 (t, J= 6.8 Hz, 3H); 1.25 (m,14H); 1.49 (m, 2H); 2.04(m, 4H); 2.64 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 6.4 Hz, 2H), 3.00 (m, 4H); 5.34 (m, 4H); 7.04 (s, IH); 7.11 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.19 (t, J= 7.2 Hz, IH); 7.36 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.63 (d, J= 7.6 Hz, IH); 8.10 (s, IH).
RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 14.1, 22.6, 25.5, 25.6, 27.2, 27.3, 29.2, 29.3, 29.5, 29.6, 29.7, 31.5, 49.8, 111.1, 113.8, 118.9, 119.3, 121.9, 122.0, 127.4, 127.9, 128.0, 130.1, 130.2, 136.4. ESI-MS m/z: 409 ([M+H]+, 100). IR cm"1: 625, 738, 803, 1010, 1108, 1231, 1354, 1456, 1620, 2853, 2923, 3009, 3415.
N-(2-(lH-indol-3-yl)éthyl)-15-hydroxypentadécanamine (2i) Rendement : 71%
RMN1H (300MHz, CDCl3) δ ppm: 1.24 (m, 24H); 1.47 (m, 4H); 2.62 (t, J= 7.6 Hz, 2H); 2.97 (m, 4H); 3.64 (t, J= 6.8 Hz, 2H); 7.04 (d, J= 1.6 Hz, IH); 7.11 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.20 (t, J= 7.6 Hz, IH); 7.36 (d, J= 8.0 Hz, IH); 7.63 (d, J= 8.0 Hz, IH); 8.03 (s, IH). RMN13C (75MHz, CDCl3) δ ppm: 25.7, 25.8, 27.4, 29.4, 29.5, 30.1, 32.8, 50.0, 63.0, 111.1, 114.2, 118.9, 119.3, 121.8, 122.0, 124.5, 136.4. ESI-MS m/z: 387 ([M+H]+, 100).
IR cm"1: 587, 669, 727, 740, 760, 974, 1010, 1024, 1044, 1108, 1149, 1216, 1355, 1374, 1457, 1466, 1668, 2848, 2923, 3299, 3425.
2. Résultats biologiques
Comme indiqué dans le préambule, il existe un réel besoin de trouver de nouvelles molécules petites et peu hydrophiles pour pouvoir passer la barrière hématoencéphalique, et capables de mimer l'effet des neurotrophines.
In vitro, l'activité neurotrophique des facteurs de croissance neuronaux est caractérisée par leur capacité d'une part à promouvoir la survie neuronale et d'autre part à stimuler leur maturation.
Dans le cadre de la recherche de petites molécules mimant des activités neurotrophiques, une approche originale consiste à étudier séparément les propriétés neuroprotectrices et neuritogéniques des composés étudiés, les composés d'intérêt devant présenter les deux activités. La mesure de la neuritogénèse constitue un critère morphologique représentatif de l'état de maturation neuronale.
Par ailleurs, des composés antioxydants possèdent également une capacité neuroprotectrice. C'est pourquoi il est également intéressant d'évaluer la capacité antioxydante des composés de l'invention.
2.1. Activités neuroprotectrice et neuritogénique des composés de l'invention
• Mode opératoire Dissection. La dissection consiste à extraire les embryons de l'utérus d'une ratte à quinze jours de gestation. Le cerveau de chaque embryon est ensuite disséqué sous une loupe binoculaire afin d'en extraire le mésencéphale ventral.
Ensemencement. Les mésencéphales sont regroupés dans un falcon contenant 2 mL de milieu L15 puis dissociés mécaniquement (30 aller-retours), 5 mL de milieu L15 sont ajoutés. La suspension est laissée reposer 8 minutes. Les 5 mL de surnageant sont récupérés dans un nouveau falcon et les cellules sont dissociées à nouveau (30 aller- retours). 5 mL de L15 sont de nouveau ajoutés et la suspension est laissée à reposer 8 minutes. Les 5 mL de surnageant sont ajoutés aux précédents. Les cellules ainsi extraites sont alors centrifugées 5 minutes à 1000 tr.min"1. Le culot cellulaire est repris dans du milieu Neurobasal supplémenté de 1% de B27, 1% de glutamine et 1% d'un mélange de pénicilline/ streptomycine. Les cellules sont ensuite ensemencées à la dilution appropriée (0,6 embryon par puit de plaque 24 puits et 0,4 par puits de plaque de 48 puits). Les cultures sont incubées à 37°C dans une atmosphère humide enrichie de 5% en CO2 en plaque 24 puits ou 48 puits.
Traitement. Après 24 heures les deux tiers du milieu de chaque puits sont remplacés par du milieu neuf enrichi en produit à tester à la dilution appropriée. Le milieu est remplacé de la même façon après 4 jours de culture.
Immunohistochimie. A 8 jours de culture, les cellules sont fixées par une solution de formaldéhyde à 4% puis lavées trois fois au PBS. Les cellules sont ensuite soumises à F immunohistochimie anti-tyrosine hydroxylase (TH) révélée par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome émettant dans le rouge (Cy3). Analyses. La neuroprotection est évaluée par comptage des neurones TH positifs de 10 champs par puits directement sous microscope à fluorescence inversée, rapporté en pourcentage du contrôle non traité. Les expériences sont réalisées à raison de trois puits par condition. Trois expériences indépendantes sont réalisées dans ces conditions. La longueur neuritique totale par cellule est calculée par le logiciel Neurite Outgrowth par Explora Nova sur 60 à 100 neurones photographiés indépendamment par condition. • Résultats
Le mésencéphale ventral contient les neurones dopaminergiques provenant de la substance noire qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson, ainsi que ceux présents dans l'aire tegmentale ventrale. Des cultures primaires de mésencéphale ventral embryonnaire peuvent être réalisées après extraction et dissection des embryons, collection et dissociation des mésencéphales ventraux et ensemencement de la suspension cellulaire dans des plaques multi-puits.
Les cultures primaires de mésencéphale ventral sont des cultures mixtes. Deux populations neurales y sont représentées, les neurones et la glie. Les neurones présents en culture sont essentiellement GABAergiques (≈94%), accompagnés de neurones dopaminergiques (≈3%) et sérotoninergiques (≈3%). La glie est essentiellement astrocytaire, on trouve également des oligodendrocytes et des microglies (≈3%) en proportions plus faibles. D'autres types cellulaires non neuraux sont également présents en très faibles proportions comme des érythrocytes, fibroblastes et cellules endothéliales. Les différentes populations cellulaires peuvent être identifiées par immunocytochimie de marqueurs spécifiques. Les neurones dopaminergiques sont identifiés par marquage de la tyrosine hydroxylase.
Des études antérieures décrivent une dégénérescence spontanée, progressive et spécifique des neurones dopaminergiques dans les cultures primaires de mésencéphale ventral (Guerreiro S. et al. Mol. Pharmacol. 2008, 74, 980-989).
Au cours du temps, le nombre de neurones dopaminergiques (Neurones TH+) diminue progressivement tandis que le nombre total de neurones n'est pas affecté. Cette observation a pu être exploitée comme modèle in vitro de la mort neuronale dans la maladie de Parkinson pour la recherche de composés neuroprotecteurs. Dans ces mêmes conditions, les fibres des neurones restant ne sont pas altérées et la neuritogénèse peut être observée et quantifiée. Ce modèle est donc particulièrement intéressant dans notre étude puisqu'il permet en une même expérience d'obtenir les deux résultats attendus à savoir la quantification de la neuroprotection et de la neuritogénèse. Le potentiel neurotrophique de nos composés a pu être évalué par la réalisation d'un double criblage incluant l'estimation du potentiel neuroprotecteur et la capacité à stimuler la croissance neuritique.
Les cultures primaires de mésencéphale ventral d'embryons de rattes à 15,5 jours de gestation, dans des conditions occasionnant la mort spontanée des neurones dopaminergiques, sont maintenues en présence ou en absence des composés à tester pendant 8 jours. Après fixation, les cultures sont soumises à Pimmunocytochimie dirigée contre la tyrosine hydroxylase, un marqueur spécifique des neurones dopaminergiques.
Le potentiel neuroprotecteur de chaque composé est ensuite estimé par comptage du nombre de neurones restant (Neurones TH+) sous microscope à fluorescence. Les résultats pour les différents traitements sont exprimés en pourcentage du nombre de neurones restant par rapport aux cultures non traitées (Contrôle). La neuritogénèse est quantifiée par mesure de la longueur neuritique totale rapportée par neurone dopaminergique (Longueur neuritique/neurone TH+) à l'aide d'un analyseur d'images sur au minimum soixante neurones photographiés par condition (10- 30% des neurones dopaminergiques totaux). Toutes les expériences ont été réalisées par comparaison à un témoin positif, la dibutyryl-AMPcyclique (db-AMPc) (Mourlevat S. et al. Mol. Pharmacol. 2003, 64(3), 578-586).
Des tests de signifïcativité ont été effectués pour comparer les données entre elles, afin de différencier les probabilités obtenues pour les deux types d'activités, nous utiliserons les notations Pp et PN respectivement pour les probabilités concernant l'activité protectrice et l'activité neuritogénique. PP/N sera utilisé lorsque la probabilité donnée concerne les deux activités.
Les composés de l'invention ont été testés à 1, 10, 100 et 1000 nM, avec un effet observé à 10 nM, les composés de cette série étant respectivement inactif ou toxiques aux concentrations inférieures et supérieures. Les résultats obtenus sont présentés sur la Tableau 1 qui suit.
Tableau 1
% relatif au contrôle ± SEMa
Produit Longueur neuritique/
Xi X2 R2 Neurones TH+ (1O nM) neurone TH+
Contrôle - - - 100 ± 1,9 100 ± 2,9 db-
- - - 149,9 ± 3,6 333,1 ± 8,7** AMPc
Ic C=O (CH2)14 CH3 121,3 ± 3,2** 168,6 ± 11,5**
If C=O (CH2)I8 CH3 121,8 ± 2,0** 147,4 ± 7,0**
2c CH2 (CH2)H CH3 131,9 ± 4,7** 197,0 ± 14,0**
2e CH2 (CH2)16 CH3 129,9 ± 3,5** 157,3 ± 10,3**
2f CH2 (CH2)! g CH3 128,9 ± 3,4** 132,6 ± 6,2*
2g CH2 (CHz)21 CH3 129,6 ± 3,5** 141,2 ± 5,0**
2h CH2 Δb CH3 137,5 ± 8,0** 156,7 ± 6,7**
2i CH2 (CH2)13 CH2OH 129,4 ± 5,0** 160,8 ± 13,8** a SEM = Ecart standard à la moyenne obtenu sur trois expériences indépendantes dont les conditions sont répliquées trois fois b Δ= [CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)4-CH3]
* P<0,05 vs contrôle, One-way ANOVA, analyse post-hoc de Dunnett ou £-test **P<0,001 vs contrôle, One-way ANOVA, analyse post-hoc de Bonferroni.
Tous les composés de cette série possèdent une capacité à induire une neuritogénèse à des concentrations de l'ordre du nanomolaire. Le potentiel neuroprotecteur de ces composés semble meilleur pour les composés ayant une fonction aminé au lieu d'une fonction amide (voir Ic vs 2c), les meilleures activités étant observées pour le composé 2c. Les variations en fonction de la longueur de la chaîne sont minimes, on observe toutefois que les composés les plus courts sont un peu moins actifs. Concernant la présence d'insaturations, aucune variation pour les deux activités n'a été observée (voir 2h vs 2e). La fonction hydroxyle terminale quant à elle améliore les deux activités uniquement en série aminé.
Ces résultats montrent un rôle important de l'aminé intrachaîne qui confère à cette série la double activité recherchée. Néanmoins les meilleurs potentiels neuroprotecteurs sont observés pour des longueurs de chaîne après l'atome d'azote (c'est-à-dire X1-X2-R2) supérieures ou égales à 15 atomes de carbone (soit une longueur de chaîne X2 supérieure ou égale à 13 atomes de carbone), porteuses éventuellement d'un hydroxyle terminal. Les meilleures activités combinées ont été obtenues avec les composés 2c et 2i.
2.2. Capacité antioxydante des composés de l'invention Deux tests ont été utilisés afin d'évaluer la capacité antioxydante des composés de l'invention, c'est-à-dire leur capacité à neutraliser des radicaux libres.
• Test à VABTS
L'ABTS, ou acide 2,2'-azino-ôώ-(3-éthylbenzthiazoline-6-sulfomque), est un indicateur coloré de la présence de radicaux hydroxyles en solution. En effet, l'attaque d'un radical hydroxyle sur l'ABTS génère la formation d'un radical cation ATBS+' (Équation 1). Cette entité colorée confère à la solution une absorbance (Abs) à 450 nm. ABTS + HO* *~ ABTS+ * + HO
Équation 1
Au cours du test, les radicaux hydroxyles sont générés par la réaction de Fenton en présence de fer et de peroxyde d'hydrogène (Équation 2).
H2O2 + Fe2+ ^ HO* + HO ~ + Fe3+
Équation 2
Lorsqu'un piégeur de radicaux ou antioxydant est présent en solution, une compétition avec l'ABTS s'installe pour la réduction des radicaux hydroxyles, ce qui se traduit par une diminution de l'absorbance (Abs) à 450 nm.
Le pourcentage de radicaux hydroxyles converti en ions hydroxyles (% conversion) par le composé d'intérêt peut être calculé selon la Formule 1 :
At>SABTS - AbS(ABJ8 + prodmt)
% conversion = x 100
AbsABTS
Formule 1
La capacité antioxydante d'un composé peut alors être exprimée sous forme d'ICso, reflétant la concentration à laquelle 50% des radicaux hydroxyles ont été réduits par le composé testé.
Ainsi, les composés à tester, ainsi que le Trolox®, ont été solubilisés dans l'éthanol de manière à obtenir des solutions à 1 mM. Par des dilutions en cascades, nous avons obtenu une gamme de concentrations allant de 1 mM à 10 nM. Ensuite, 90 μL d'un mélange eau-éthanol 1-1 ont été ajoutés sur une plaque ELISA 96 puits, suivis de 15 μL d'une solution aqueuse d'ABTS à 1 mM, 15 μL d'une solution aqueuse de Fe2S(M à 0,5 mM, 15 μL de chaque composé à tester à des concentrations différentes puis 15 μL d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 100 mM. Les mélanges ainsi obtenus ont été agités à température ambiante, à l'abri de l'air pendant 30 minutes, puis la valeur de l'absorbance à 405 nm a été mesurée. La capacité à réduire les radicaux hydroxyles de chacun des composés est déterminée par la diminution de l'absorbance à 450 nm, la solution contrôle étant composée d'éthanol pur.
Le test à l'ABTS a donc été effectué par comparaison avec le Trolox®. Les mêmes gammes de 10 nm à 1 mM des indoles la, Ic, Ig, Ii, 2a, 4c, 2g, 2h, et 2i ont été testées. Les résultats sont présentés sur le Tableau 2 suivant.
Tableau 2
Composé IC50 ± SEMa (mM)
Trolox 0,55 ± 0,02
a SEM : Ecart standard à la moyenne obtenu sur trois expériences indépendantes.
De façon intéressante, les composés aminés de l'invention testés 2a, 2c, 2g, 2h et 2i, possèdent des IC50 proches de celle du Trolox® mettant en évidence l'intérêt de la fonction aminé dans l'activité antioxydante de ces composés. La présence de doubles liaisons intrachaîne améliore l'activité antioxydante conduisant à une IC50 inférieure à celle du Trolox® (voir 2h).
• Test cellulaire à la Dihydrorhodamine 123
La dihydrorhodamine 123 ou DHR123 est utilisée comme indicateur d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Non chargée et non fluorescente, elle traverse passivement la membrane cellulaire avant d'être oxydée, au contact de radicaux libres, en rhodamine 123 émettant une fluorescence verte. Radicaux libres
Dihydrorhodamine 123 Rhodamine 123
Lorsque les cellules sont traitées par un antioxydant, la quantité de ROS intracellulaire se voit diminuée. Cette diminution se traduit, en présence de DHR123, par une décroissance quantifîable de la fluorescence émise. Afin de pouvoir conclure quant au rôle de la capacité antioxydante des composés de l'invention dans l'activité neuroprotectrice observée, les cultures ont été placées strictement dans les mêmes conditions que pour le test de neuroprotection/neuritogénèse. Ainsi les cultures ont été maintenues pendant huit jours en présence d'une concentration de 10 nM de chacun des dérivés tryptaminiques testés. Au 8eme jour in vitro (DIV 8), 50μM de DHR-123 (Sigma) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées 30 minutes à 37°C. Elles ont ensuite été lavées trois fois, traitées à nouveau par les composés de l'invention et placées dans un milieu dépourvu de rouge phénol. L'observation de neurones fluorescents vivants aussitôt photographiés peut ainsi être réalisée, la densité de fluorescence par neurone étant quantifiée sous microscope à fluorescence inversée par logiciel d'analyse d'images. Les résultats obtenus sont présentés sur le Tableau 3 suivant.
Tableau 3
Composé IF/ neurone (%
Contrôle 100,0 ± 3,3 Trolox® 44,0 ± 2,8**
a Ecart standard à la moyenne obtenu sur trois expériences indépendantes. **P<0,001 TO contrôle, One-way ANOVA, analyse post-hoc de Bonferronni
Les neurones des cultures traitées par les dérivés tryptaminiques à 10 nM possèdent une quantité cytoplasmique de ROS signifîcativement diminuée par comparaison aux cultures non traitées, traduite par une diminution de 40-60% de la fluorescence émise. Ces composés ont donc une activité antioxydante importante, de l'ordre de celle observée pour le composé de référence, avec toujours une meilleure activité des dérivés aminés comparativement aux dérivés amides (voir Ii vs 2i, et Ih vs 2h). Par ailleurs, la Figure 1 illustre la diminution de l'intensité de fluorescence émise dans les neurones après traitement par le composé Ih à 10 nM, composé montrant la meilleure activité antioxydante, par comparaison au Trolox® et au contrôle non traité.
La forte capacité antioxydante observée pour les dérivés tryptaminiques dans les conditions et aux concentrations permettant d'observer leur activité neuroprotectrice, pourrait être un élément de réponse quant au mécanisme d'action de ces composés dans la composante neuroprotectrice.
Ces composés sont donc très intéressants puisqu'ils combinent à la fois un effet protecteur et régénératif, applicable dans le traitement de maladies neurodégénératives. 2.3. Etude du passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE)
Cette étude a été réalisée en utilisant le composé 2c comme composé selon l'invention.
Le but de cette étude est de vérifier par HPLC couplée à une spectrométrie de masse, la présence de la molécule 2c selon l'invention dans le parenchyme cérébral après un traitement sub-chronique du chlorhydrate de la molécule 2c (2c/HCl) par voie orale ou intra-péritonéale (IP).
• Matériels et méthodes Animaux : Des souris mâles RjOrl:SWISS, âgées approximativement de 5 semaines et pesant entre 20 et 24 g à leur arrivée (Centre d'élevage R Janvier, France) sont maintenues dans l'animalerie, à température constante (22 ± 1°C) et sous hygrométrie contrôlée (55 ± 20%), avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures (8h00-20h00).
Durant la période d'acclimatation et de l'étude, les souris ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Toutes les expérimentations se sont déroulées en accord avec les conditions du décret n° 2001-464 du 29 mai 2001 relatif aux expériences pratiquées sur les animaux.
Traitements : Deux traitements (par voie orale ou intra-péritonéale) sub-chroniques de
5 jours ont été réalisés : - Traitement par voie intra-péritonéale (IP) :
La solution de chlorhydrate de 2c/HCl à injecter est préparée dans le véhicule (10 %
Tween20 + 20 % DMSO + 70 % NaCl à 0,9% dans l'eau) à la concentration de 2,0 g/L.
Trois groupes ont été constitués :
(1) des souris qui ont reçu le véhicule par voie IP, à lOmL/kg (groupe N, n=4), (2) des souris traitées avec le 2c/HCl par voie IP, à 20mg/kg et à lOmL/kg (groupe R, n=6), et
(3) des souris contrôles qui n'ont reçu aucun traitement (n=2).
Les souris traitées R4, R5 et R6 ainsi que les souris véhicules Nl , N2, N3 et N4 ont reçu les traitements suivants : Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi 07/12/09 08/12/09 09/12/09 10/12/09 11/12/09
15h20 12hlO 13h45 12h45 17h30 l lh20 Euthanasie entre 15h20 et 17h40
Les souris traitées Rl, R2 et R3 ont reçu les mêmes traitements que les souris précédentes sauf pour le jeudi où elles n'ont pas reçu le deuxième traitement :
Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi 07/12/09 08/12/09 09/12/09 10/12/09 11/12/09
15h20 12hlO 13h45 12h45 l lh20 Euthanasie entre 13h25 et 14h55
- Traitement par voie orale (per os) :
La solution de chlorhydrate de 2c à administrer est préparée dans le véhicule (0,5 % Tween80 + 99,5 % carboxy-methyl cellulose à 1%, dans NaCl à 0,9% dans l'eau) à la concentration de 15,0 g/L. Trois groupes ont été constitués :
(1) des souris qui ont reçu par voie orale le véhicule à lOmL/kg (Groupe V, n=4),
(2) des souris traitées avec le 2c/HCl par voie orale à 150mg/kg et à lOmL/kg (Groupe B, n=6), et
(3) des souris contrôles qui n'ont reçu aucun traitement (n=2).
Toutes les souris sont traitées 2 fois par jour pendant 4 jours. Le 5eme jour elles reçoivent un dernier traitement et sont euthanasiées entre 3h00 et 7h30 après ce dernier traitement selon le schéma suivant : entre 13h30 et lδhOO
Euthanasie : Les souris sont anesthésiées par une injection de 0,1 mL d'une solution de pentobarbital sodique à 6 % puis les souris sont perfusées, afin d'enlever les traces de sang du cerveau, avec une solution de NaCl à 0,9 % qui contient de l'héparine (200 μL d'héparine choay à 5000 UI/mL dans un litre de NaCl à 0,9 %). Chaque animal est perfusé avec au minimum 50 mL de cette solution. La souris est décérébrée. Le cervelet, le tronc cérébral et les bulbes olfactifs sont éliminés.
Le cerveau est disséqué en 3 parties selon le schéma présenté sur la Figure 2. Les 3 parties du cerveau sont congelées dans l'isopentane à - 3O0C pendant une minute, puis conservées séparément à - 800C.
Méthode d'extraction : Chaque échantillon de cerveau est pesé, homogénéisé dans le MeOH (100 μL de MeOH pour 10 mg de tissu cérébral) puis mélangé par sonication. Les suspensions ainsi obtenues sont centrifugées à 27 000 g pendant 10 minutes, à 4°C. Les surnageants, dilués au demi dans le MeOH, sont transférés dans des vials HPLC pour l'analyse du composé 2c par HPLC-MS/MS.
Cependant, afin de conserver des échantillons pour de futures analyses, seules les parties 1 des cerveaux de souris ont été extraites et analysées. Les 3 parties de cerveaux d'une souris de chaque groupe (IP Qtper os) ont néanmoins été extraites afin de vérifier que le composé 2c ne se distribue pas préférentiellement dans l'une de ces 3 parties. Tous les échantillons sont stockés à - 4°C avant et pendant la durée des analyses. Toutes les analyses de tous les échantillons sont réalisées le même jour, dans les mêmes conditions.
Contrôles positifs et négatifs : Les cerveaux des souris véhicules sont utilisés pour les contrôles positifs et négatifs. Pour le contrôle positif, 10 μl d'une solution de chlorhydrate de 2c à 1 μg/mL sont ajoutés au surnageant et dilués au demi dans le MeOH avant transfert dans un vial HPLC. Préparation de la gamine de composé 2c : Une solution mère de chlorhydrate de 2c est préparée extemporanément dans le MeOH à une concentration de 1,0 mg/mL. Toutes les autres solutions sont préparées par dilution de cette solution mère dans le MeOH puis stockées à - 40C. Instrumentation et conditions pour l'analyse du composé 2c : La détection et la quantification, basée sur l'aire des pics, sont réalisées par HPLC-MS/MS, en mode MRM.
Le système HPLC est composé d'une pompe Dionex Ultimate 3000 équipée d'un injecteur automatique d'échantillon Dionex WPS-3000PL. Le spectromètre de masse utilisé est un Water-Micromass Quattro Ultima équipé d'une source d'ionisation à electrospray et d'un analyseur triple quadrupole. L'acquisition des données et des analyses est effectuée via Masslynx 3.5.
La chromatographie liquide est réalisée en mode isocratique avec une colonne XBridge™ (Waters) C18, 150 x 2,1 mm, possédant une taille de particule de 3,5 μm. La phase mobile est composée d'un mélange de deux phases A et B, en proportions 3/97. La phase A est composée de 0,2 % de triéthylamine dans l'eau (v/v) (pH=l l,5). La phase B est composée de 0,2 % de triéthylamine dans le MeOH (v/v). Le débit est fixé à 0,2 mL/min et le volume d'injection est de 10 μL. Le spectromètre de masse est relié au système HPLC en utilisant une source d'ionisation à electrospray. Une vanne de commutation est programmée pour envoyer les trois premières minutes de la chromatographie à la poubelle dans le but d'éviter l'accumulation de sel au niveau du capillaire de la source. Le voltage du capillaire est réglé à 3000 V et le voltage du cône à 50 V, la température de la source est réglée à 1200C, le gaz de désolvatation (N2) est réglé à un débit de 463 L/h et la température à 35O0C. Les spectres de masses sont obtenus en mode positif. Les paramètres sont optimisés pour obtenir le maximum d'ion moléculaire à m/z 385,66, correspondant au composé 2c. La collision est obtenue avec un gaz inerte (argon) et l'énergie est fixé à 22eV en mode MS/MS pour détecter les transitions de masse : m/z 385,66 → 254,23 et 385,66 → 144,17. La droite d'étalonnage est réalisée à partir d'une gamme de standard comportant 7 concentrations (0,5 μg/mL; 0,1 μg/mL; 20 ng/mL; 4 ng/mL; 0,8 ng/mL; 0,16 ng/mL et 0,08 ng/mL). • Résultats
Validation de la méthode HPLC-MS/MS : L'aire des pics HPLC est fonction de la concentration du composé 2c dans la gamme de 0,16 à 500,00 ng/mL avec un R2 de 0,9997. La limite de détection est de 0,08 ng/mL avec un rapport S/B (signal/bruit) de 3 : 1. Le temps de rétention du composé 2c est de 5,3 minutes et le temps d'acquisition est de 8 minutes. Concentration du composé 2c dans les extraits de cerveaux :
- Voie per os :
Les chromatogrammes obtenus sont représentés dans la Figure 3. Le composé 2c n'est pas détectable dans l'extrait de cerveaux de souris traitées par du véhicule et est quantifié à 20,31 ng/mL dans le contrôle positif. Le composé 2c est quantifié dans les extraits de cerveaux de souris traitées per os à la concentration moyenne de 21,25 ng/mL ± 0,82 SEM (n=8).
- Voie IP : Les chromatogrammes obtenus sont représentés dans la Figure 4. Le composé 2c n'est pas détectable dans l'extrait de cerveaux de souris traitées par du véhicule et est quantifié à 19,48 ng/mL dans le contrôle positif. Le composé 2c est quantifié dans les extraits de cerveaux de souris traitées IP à la concentration moyenne de 14,73 ng/mL ± 0,58 SEM (n=8).
• Discussion et conclusion
Le composé 2c est capable de traverser in vivo la BHE après administration IP et per os de 2c/HCl. Le traitement par voie per os à 300 mg/kg/j permet d'obtenir des concentrations environ 1,5 fois plus élevées que celle obtenues après un traitement IP à 20 mg/kg/j.
ABREVIATIONS UTILISEES :
EDC Chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylcarbodiimide
ESI-MS Spectroscopie de Masse en mode électrospray
GC Chromatographie en phase gazeuse
HOBt N-Hydroxy benzotriazole
HPLC Chromatographie Liquide Haute Performance
HPLC-MS/MS Chromatographie Liquide Haute Performance couplé à un spectromètre de masse en tandem
IR Absorption Infra Rouge
MRM Acquisition de transitions multiples RMN 1H Résonnance Magnétique Nucléaire du proton RMN 13C Résonnance Magnétique Nucléaire du carbone

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule (I) suivante :
ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, un stéréoisomère ou un mélange de stéréoiso mères en toutes proportions, en particulier un mélange d'énantiomères, et notamment un mélange racémique, dans laquelle:
Xi représente un groupe CH2 ou C=O, - X2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, saturée ou insaturée, comportant de 8 à 24 atomes de carbone,
Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH ou (Q-COalcoxy, tel que méthoxy, et
R2 représente un groupe CH3 ou CH2OR3, avec R3 représentant un atome d'hydrogène ou un groupe (C1-C6)alkyle, CO-(Ci -C6)alkyle ou NH-(C1-
C6)alkyle. pour son utilisation en tant que médicament, notamment en tant que médicament neurotrophique ou neuroprotecteur, destiné avantageusement au traitement ou à la prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ia) suivante :
dans laquelle: représente indépendamment une liaison simple ou double, X1, Ri et R2 sont tels que définis à la revendication 1, et m représente un nombre entier supérieur ou égal à 1, et n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 0 avec 8 < m + n + p + 4 < 24.
3. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ib) ou (Ic) suivantes :
pour lesquelles :
Ri, R2 et Xi sont tels que définis à la revendication 1, q représente un nombre entier compris entre 8 et 24, et m, n et p sont tels que définis à la revendication 2.
4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
5. Composé de formule (I) suivante :
ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, un stéréoisomère ou un mélange de stéréoiso mères en toutes proportions, en particulier un mélange d'énantiomères, et notamment un mélange racémique, dans laquelle:
Xi représente un groupe CH2 ou C=O,
X2 représente une chaîne hydrocarbonée linéaire, saturée ou insaturée, comportant de 8 à 24 atomes de carbone, - Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe OH ou (Ci-Ce)alcoxy, tel que méthoxy, et
R2 représente un groupe CH3 ou CH2OR3, avec R3 représentant un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C6)alkyle, CO-(Ci -C6)alkyle ou NH-(Ci- C6)alkyle. à l'exclusion des composés de formule :
, avec u = 14, 16 à 18 ou 20 à 24.
6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ia) suivante :
dans laquelle: représente indépendamment une liaison simple ou double, Xi , Ri et R2 sont tels que définis à la revendication 1 , et m représente un nombre entier supérieur ou égal à 1, et n et p représentent, indépendamment l'un de l'autre, un nombre entier supérieur ou égal à 0 avec 8 < m + n + p + 4 < 24.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ib) ou (Ic) suivantes :
pour lesquelles :
Ri, R2 et Xi sont tels que définis à la revendication 1, q représente un nombre entier compris entre 8 et 24, et m, n et p sont tels que définis à la revendication 2.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
9. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
10. Composition pharmaceutique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend un autre principe actif, utile notamment dans le traitement ou la prévention de maladies neurodégénératives, et avantageusement choisi parmi des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que le donézépil, la galanthamine, la rivastigmine, la mémantine et la tacrine ; des inhibiteurs de monoamines oxydase tels que la sélégiline ; des inhibiteurs de catécho lamines O-méthyltransférase tels que l'entacapone ; des inhibiteurs glutamatergiques tels que l'amantadine et le baclofène ; des agonistes cholinergiques tels que la sabcoméline ; des agonistes dopaminergiques tels que le pergolide, le cabergoline, le ropirinole et le pramipexole ; des analogues ou précurseurs de neuro médiateurs tels que la L-3,4-dihydroxyphénylalanine ; et des anticholinergiques tels que le trihexyphénidyl et la tropatépine.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation en tant que médicament, notamment en tant que médicament neurotrophique ou neuroprotecteur, destiné avantageusement au traitement ou à la prévention de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou les accidents vasculaires cérébraux.
12. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(b) couplage entre la tryptamine et un composé de formule (II) suivante : Z-X2-R2 (II) pour laquelle Z représente une fonction acide carboxylique sous forme libre ou sous forme activée et R2 et X2 sont tels que définis à la revendication 1, pour donner un composé de formule (I- 1) suivante :
pour laquelle Ri, R2 et X2 sont tels que définis à la revendication 1,
(d) éventuellement réduction de la fonction carbonyle du composé de formule (I- 1) obtenu à l'étape (a) précédente pour donner un composé de formule (1-2) suivante :
pour laquelle Ri , R2 et X2 sont tels que définis à la revendication 1 , et (e) séparation du milieu réactionnel du composé (I- 1) ou (1-2) obtenu à l'étape précédente.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée avec un composé de structure (II) pour lequel Z = CO2H en présence d'un agent de couplage, tel que le diisopropylcarbodiimide, le dicyclohexylcarbodiimide, le chlorhydrate de l-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide, le carbonyldiimidazole, le 2-H-benzotriazole-l-yl)-l,l,3,3-tetraméthyluronium hexafluorophosphate, le 2-(lH-benzotriazole- 1 -yl)- 1 , 1 ,3 ,3-tetraméthyluronium tetrafluoroborate ou encore le O-(7-azobenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate, éventuellement associé à un auxiliaire de couplage tel que le N- hydroxy succinimide, le N-hydroxy benzotriazole, le 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo- 1,2,3-benzotriazole, le l-hydroxy-7-azabenzotriazole ou le N-hydroxysylfosuccinimide.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape (a) est réalisée avec un composé de structure (II) pour lequel Z = COCl, éventuellement en présence d'une base telle que la triéthylamine.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'étape (b) est réalisée en présence d'un hydrure tel que LiAlH4.
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