EP2344656A1 - Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure - Google Patents

Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure

Info

Publication number
EP2344656A1
EP2344656A1 EP09748218A EP09748218A EP2344656A1 EP 2344656 A1 EP2344656 A1 EP 2344656A1 EP 09748218 A EP09748218 A EP 09748218A EP 09748218 A EP09748218 A EP 09748218A EP 2344656 A1 EP2344656 A1 EP 2344656A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
genes
microorganism
gene
promoter
deleted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09748218A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christine Lang
Andreas Raab
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes Berlin GmbH
Original Assignee
OrganoBalance GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OrganoBalance GmbH filed Critical OrganoBalance GmbH
Publication of EP2344656A1 publication Critical patent/EP2344656A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01042—Isocitrate dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.42)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/05—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with a quinone or related compound as acceptor (1.3.5)
    • C12Y103/05001—Succinate dehydrogenase (ubiquinone) (1.3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03009—Malate synthase (2.3.3.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03001—Isocitrate lyase (4.1.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01001—Acetate-CoA ligase (6.2.1.1)

Definitions

  • the invention relates to a microorganism which is genetically modified with respect to the wild type and is suitable for the production of organic acids, in particular succinic acid, uses of such a microorganism and process for its preparation.
  • Dicarboxylic acids have great economic potential because they can be used as precursors for many chemicals.
  • succinic acid serves as a precursor for the production of plastics based on 1,4-butanediol, tetrahydrofuran and gamma-butyrolactone.
  • Succinic acid is today produced chemically by catalytic hydrogenation of maleic anhydride to form succinic anhydride and subsequent addition of water, or by direct catalytic hydrogenation of maleic acid.
  • Succinic acid is also produced by many microorganisms starting from sugars or amino acids under physiological environmental conditions. Under anaerobic conditions, in addition to succinic acid, further fermentation end products such as ethanol, lactic acid, acetic acid and formic acid are generally formed. The biosynthesis of succinic acid with its high oxygen content requires a reductive CO 2 fixation.
  • Succinic acid is a metabolite that is normally enriched by anaerobic fermentation processes. While the yield and enrichment of the product under anaerobic conditions is often better than under aerobic conditions, the disadvantage lies in an exclusively anaerobic process in a technical limitation of biomass production and a low productivity of the microbial producer. Thus, a relatively low biomass / product Efficiency the result. In addition, it is difficult to handle strictly anaerobic microorganisms technically.
  • Reference US 7,063,968 describes a microbial isolate from bovine rumen, Mannheimia sp. 55E which is capable of synthesizing organic acids under both aerobic and anaerobic conditions. However, this is not a specific enrichment of succinic acid, but a mixture of various organic acids, such as formic acid, acetic acid, lactic acid and succinic acid. Disadvantage of this producer is that an economic use of the strain is difficult, if not impossible, since consuming enrichment and purification processes would have to be used to recover succinic acid.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a microorganism with which an improved yield of organic acids, in particular succinic acid, can be achieved in microbiological production processes.
  • the invention teaches an isolated genetically modified microorganism, wherein the wild type a) the genes idhl and idpl are deleted or inactivated, and / or b) the genes sdh2 and sdhl are deleted or inactivated, and / or c) the gene PDC2 is deleted or inactivated or under the
  • the foreign gene which replaces or supplements the ICL1 gene may have at least 75% homology to Sequence No. 1.
  • the foreign gene that replaces or supplements the ACS1 gene may have at least 75% homology to Sequence # 2.
  • the Foreign gene which replaces or supplements the MLS1 gene may have at least 75% homology to Sequence No. 3.
  • the foreign gene that replaces or supplements the gene MDH3 may have at least 75% homology to sequence # 4.
  • the homology is greater than 80%, more preferably greater than 90%, most preferably greater than 95%. Of course, it can also be identical herewith.
  • the invention provides an optimized process for the production of succinic acid and other organic acids of respiratory central metabolism by means of a yeast strain, in particular a Saccharomyces cerevisiae yeast strain.
  • This method allows more efficient production of organic carboxylic acids, especially dicarboxylic acids and hydroxy fatty acids, of the respiratory central metabolism of yeast, such as succinic acid, in terms of production time and yields.
  • it allows a two-step production process by separating growth and production phases without the use of an antibiotic-dependent promoter system.
  • the invention makes possible a process in which biomass is first enriched in a first growth phase and succinic acid is efficiently produced in a second phase and is to be released into the culture medium.
  • the separation of growth and production phase contributes significantly to the efficiency of the entire production process of organic acids in yeast, since growth of the cells and production of the desired metabolite are otherwise always competing factors.
  • the formation of biomass is undesirable because it consumes carbon or substrate used, which ultimately results in a reduction in the yield of the metabolite to be produced, for example succinic acid.
  • the separation of growth and production phase is by means of a genetically modified or mutated by genetic mutation microorganism and an associated fermentation process in which initially during a first phase, an optimal biomass increase of the microbial producer is guaranteed and Subsequently, in a second phase (production phase), the enrichment of carboxylic acids, such as succinic acid, from primary carbon sources (eg glucose) and CO 2 (anaplerotische Auf spallretress, CO 2 fixation) is connected, feasible.
  • primary carbon sources eg glucose
  • CO 2 anaplerotische Auf spallretress, CO 2 fixation
  • the invention provides a further, optimized possibility of separating growth and production phase, which makes possible the use of Antibiotics are not required, as well as an optimized process for the production of succinic acid or other organic acids in yeast.
  • Feature (a) is the following.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae despite the deletions of the sdh2 and idhl genes, which result in an interruption of the citrate cycle, a growth rate comparable to unmodified wild-type yeast can be measured.
  • a growth of a yeast strain with an idhl deletion is possible only because this deletion does not lead to a complete disappearance of isocitrate dehydrogenase activity.
  • the reason for this are three other isoenzymes of isocitrate dehydrogenase, which can compensate for the elimination of the main dimeric enzyme encoded by the IDH1 and IDH2 genes with respect to the formation of ⁇ -ketoglutarate.
  • ⁇ -ketoglutarate is essential for growth of the yeast cell on minimal media, since this intermediate forms the amino acid glutamate, without which no growth is possible.
  • the effective separation of growth and production phase is thus only possible by the complete suppression of isocitrate dehydrogenase activity in the production strain, because it ensures a glutamate auxotrophy, with the result that the yeast has no growth in medium without supplemented glutamate.
  • This can be used to control the fermentation process via the supplementation of glutamate to the culture medium.
  • the amount of glutamate added to the culture medium can effectively control the duration of the growth phase as well as the desired cell density in this phase. As the amount increases, so does duration and cell density.
  • Another advantage of the complete suppression of isocitrate dehydrogenase activity is that all of the carbon in the respiratory system of the yeast is diverted into the glyoxylate cycle in the direction of succinic acid and can not flow to ⁇ -ketoglutarate, which would lead to yield losses.
  • succinic acid should be enriched as end product and not further metabolized by the yeast cell. This can not be achieved by the unique deletion of the sdh2 gene.
  • a further subunit of the heterotetrameric enzyme succinate dehydrogenase, encoded by the sdhl gene is deleted. (Kubo et al., 2000) detected a residual activity of succinate dehydrogenase in a yeast strain with an sdh2 deletion that was suppressed by additional deletion of the sdhl gene.
  • Yield losses can also result from the further metabolism of the succinate formed via the enzyme succinate-semialdehyde dehydrogenase.
  • This enzyme is part of the glutamate degradation pathway and catalyzes the conversion of succinate to succinate semialdehyde.
  • This intermediate is then metabolized via gamma-amino butyric acid to glutamate. In this way not only yield losses can be incurred, but also ⁇ -ketoglutarate and glutamate can be synthesized, which makes it impossible to control the fermentation process via glutamate supplementation.
  • the additional deletion of the gene uga2, which codes for the succinate semialdehyde dehydrogenase, in an optimized production process for the production of succinic acid advantageous, glyoxylate, which is necessary for the circulation of Glyoxylatzyklus, not only from that by the isocitrate lyase catalyzed reaction whereby isocitrate is cleaved into succinate and glyoxylate, but also by the reaction of alanine glyoxylate aminotransferase.
  • This enzyme catalyzes the formation of glyoxylate and alanine from pyruvate and glycine.
  • the circulation of the glyoxylate cycle may also be affected by the reaction of the Alanine-glyoxylate aminotransferase reaction which provides glyoxylate.
  • the isocitrate lyase activity which produces the desired product succinate, is not necessary for the circulation of the glyoxylate cycle, with the result that the yeast partially reverses the alanine glyoxylate aminotransferase-catalyzed alternative reaction to the glyoxylate Synthesis uses.
  • succinate which leads to yield losses. Therefore, the additional deletion of the gene agx ] , which codes for the alanine glyoxylate aminotransferase, is advantageous in the context of an optimized production process for the production of succinic acid.
  • the released energy of this controlled oxyhydrogen reaction is used to transport protons against a gradient into the intermembrane space of the mitochondria, which then drive back into the mitochondria through the complex V of the respiratory chain, the so-called "proton pump", generating energy in the form of ATP .
  • the yeast produces mainly ethanol in addition to glycerine and generates only 2 energy equivalents in the form of ATP per molecule of glucose, compared to respiration, in which 38 ATP can be generated per molecule of glucose.
  • NADH is reoxidized to NAD by the synthesis of ethanol or glycerol and not by oxygen, as it is by respiration, because oxygen is not available as an ultimate electron acceptor under anaerobic conditions.
  • the yeast Saccharomyces cerevisiae is "Crabtree" positive. This means that the yeast on primary carbon sources, such as for example, glucose, even under aerobic conditions, and does not breathe. This fermentation activity can already be observed from a glucose concentration of about 100 mg / l glucose in the culture medium, since from this concentration the limit of the respiratory capacity of the yeast cell has been reached. The reason for this is that, in the presence of glucose, a large number of the respiratory central metabolism genes, ie the citrate and glyoxylate cycles (see FIGS. 1 a.) And b.)) And the respiratory chain, are strongly repressed by transcription (Gancedo 1998). This phenomenon is also referred to as glucose or catabolite repression.
  • Fermentation is another aspect which may be detrimental to the biotechnological production of succinic acid because it leads to the formation of undesirable by-products.
  • especially the formation of glycerol, acetate and ethanol is problematic because it leads to serious yield losses.
  • All organisms which have the crabtree effect such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, ferment even under aerobic conditions.
  • the formation of fermentation end products, especially of ethanol is not undesirable and should be avoided. Under aerobic conditions, this can be achieved in part by making a continuous addition of a small amount of glucose to the culture medium, which prevents or reduces the glucose repression and thus the fermentation under aerobic conditions.
  • ethanol Under anaerobic conditions, oxygen is not available as a final electron acceptor, so the yeast must ferment in any case to reoxidize NADH and thus remain metabolically active.
  • the pyruvate decarboxylase activity can be switched off, which is catalysed in the yeast Saccharomyces cerevisiae by 3 pyruvate decarboxylase isoenzymes, encoded by the genes PDC1, PDC5 and PDC6.
  • PDC6 is only weakly expressed in both glucose and ethanol growth. (Velmurugan et al., 1997).
  • the gene PDC2 encodes a transcriptional inducer, which is mainly responsible for the expression of the genes PDC1 and PDC5.
  • the PDC2 gene thus offers the possibility with only a single deletion of the major part of the pyruvate decarboxylase activity, which of 3 Genes is encoded to abolish in the cell.
  • one or more of the genes PDC1, PDC5 and / or PDC6 may be deleted. This has the great advantage that thus the problematic ethanol formation can be avoided with only a single modification in the metabolism of the yeast. In order to minimize or reduce the yield losses in the biotechnical production of succinic acid in yeast, byproduct formation, especially of ethanol should be avoided or greatly reduced.
  • the PDC2 gene may be preceded by a repressible promoter or an inducible promoter.
  • the repressible promoter ensures sufficient transcription of the downstream gene in the growth phase and stops transcription in the production phase by adding an additive to the culture medium.
  • the inducible promoter is induced during the growth phase by adding an inducer to the culture medium, whereby the downstream gene PDC2 is sufficiently transcribed and growth of the yeast culture becomes possible. Once the inductor is exhausted no further growth is possible and the production phase is initiated. Without pyruvate decarboxylase activity, no growth of the yeast cell is possible because insufficient acetyl-CoA, formed via acetaldehyde and acetate, is available for fatty acid biosynthesis.
  • This enzyme which is essential for the efficient production of organic acids, undergoes inactivation by phosphorylation and in the presence of glucose enhanced proteolytic degradation (Lopez-Boado et al 1988, Ordiz et al., 1996).
  • glucose enhanced proteolytic degradation Lipez-Boado et al 1988, Ordiz et al., 1996.
  • glucose-induced negative regulatory effects at the protein level can also be assumed. This mainly concerns acetyl-CoA synthetase (Acslp), malate synthase (MIs Ip) and malate dehydrogenase (Mdh3p).
  • the glucose-induced protetolytic degradation or inactivation of these enzymes can be prevented by expressing heterologous isoenzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • These enzymes are derived from a microorganism which naturally has a glyoxylate cycle and "crabtree" is negative, since enzymes of the glyoxylate cycle from such an organism are not subject to glucose-induced negative regulation or proteolytic degradation at the protein level.
  • An active glycolysis cycle is essential for the efficient production of organic acids with high yields on primary carbon sources.
  • suitable "crabtree" donor organisms are Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia or Corynebacterium.
  • deletion of a gene refers to the complete removal of the gene from the genome of the microorganism and / or the removal of the thereby encoded active enzyme from the microorganism.
  • Inactivation of a gene refers to the reduction or complete elimination of the activity of the enzyme or protein encoded by the gene. This can be checked by measuring the relevant enzymatic activity with standard tests or by determining the relevant enzyme or protein by means of, for example, immunological detection reactions. Inactivation can be carried out, for example, by reducing or inhibiting gene expression (transcription and / or translation).
  • the introduction of antisense nucleic acids by addition or incorporation of nucleic acid sequences into the genome which are transcribable to the antisense nucleic acid
  • the introduction of mutations into the endogen which reduce or completely eliminate the activity of the gene product
  • the introduction of gene specific DNA binding factors, such as zinc finger transcription factors, that reduce gene expression cause the replacement of the Endogens by a foreign gene which encodes u r f a corresponding, but inactivated or reduced active enzyme or protein.
  • a promoter under the control of which endogenous is concerned, be deleted or mutated, so that a transcription is reduced or inhibited.
  • microorganisms such as yeast cells
  • transformation of microorganisms can be carried out in a customary manner, and reference is made to the references Schiestl RH, et al., Curr Genet. Dec, 16 (5-6): 339-346 (1989), or Manivasakam P., et al., Nucleic Acids Res. Sep 11, 21 (18): 4414-4415 (1993), or Morgan AJ, Experientia Suppl., 46: 155-166 (1983).
  • Vehicles suitable for transformation, in particular plasmids are known for example from the references Naumovski L., et al., J Bacteriol, 152 (1): 323-331 (1982), Broach JR, et al., Gene, 8 (1): 121-133 (1979), Sikorski RS, et al., Genetics, 122 (1) 19-27 (1989).
  • These vectors are Yep24, Yepl3, pRS vector series, as well as YCp 19 or pYEXBX.
  • suitable in the context of the invention expression cassettes is typically carried out by fusion of Promo sector with the coding for the gene nucleic acid sequence and optionally a terminator by conventional recombination and cloning techniques, such as in the references Maniatis T., et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY, USA 5 1989, or Sihlavy TJ, et al., Experiments with Gene Fusion, Co.D. Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY, USA, 1984, or Ausubel FM, et al. 5 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, 1987.
  • the invention further relates to the use of a microorganism according to the invention for producing an organic carboxylic acid of the glyoxylate and / or citrate cycle, in particular an organic dicarboxylic acid, preferably succinic acid, as well as its use in a process for the preparation of an organic carboxylic acid of the glyoxylate and / or Citrate cycle, especially of an organic dicarboxylic acid, preferably of succinic acid, with the following process steps: A) in a growth process step, the microorganism is cultured and propagated under preferably aerobic conditions, optionally with addition of an inducer substance for inducing the inducible promoter and / or glutamate, B) then the microorganism is cultured in a production phase under preferably anaerobic conditions, optionally with the addition of an inducer substance Repression of the repressible promoter, C) subsequent to step B) or during step B), the carboxylic acid is separated from the culture supernatant and optionally purified.
  • step A) is carried out up to a cell density of at least 100 g of dry biomass / l, preferably at least 120 g / l, most preferably at least 140 g / l.
  • Step b) may be carried out to a carboxylic acid concentration of at least 0.4 mol / l, preferably at least 0.8 mol / l, most preferably at least 1.0 mol / l.
  • a pH in the range of 4 to 9, preferably 6 to 8, and a
  • step B) a pH in the range of 4 to 9, preferably 6 to 8, and a salt concentration in the range of 0.01 to 0.5 mol / l, preferably from 0.05 to 0.2 mol / l, most preferably from 0.05 to 0.1 mol / l.
  • the step A) is preferably carried out at a temperature of 20 to 35 ° C, preferably 28 to 30 0 C, and for a period of 1 to 1000 h, preferably from 2 to 500 h, most preferably 2 to 200 h performed.
  • step B) is conducted at a temperature of 15 to 40 0 C, preferably from 20 to 35 0 C, most preferably 28 to 30 0 C, and for a duration of 1 to 1,000 hours, preferably from 2 to 500 h, most preferably 2 to 200 hours, preferably.
  • WMVIII medium Liang C, Looman AC, Appl Microbiol Biotechnol. 44 (1-2): 147-156 (1995)
  • the amount of tetracycline in the culture medium is preferably below 20 mg / l, preferably below 10 mg / l, most preferably below 1 mg / l, up to values below the detection limit and / or the CuSO 4 concentration in the Culture medium, if used, preferably above 1 ⁇ M, most preferably above 5 ⁇ M. Examples of suitable ranges are 1 to 3 ⁇ M or 3 to 15 ⁇ M.
  • WMVIU medium is suitable, and a conventional molasses medium can also be used.
  • the amount of tetracycline, if used, is preferably above 1 mg / l, most preferably above 3 mg / l. Examples of suitable ranges are 1 to 3 mg / l or 3 to 15 mg / l.
  • the CuSO 4 concentration used in the culture medium is preferably below 20 ⁇ M, preferably below 10 ⁇ M, most preferably below 1 ⁇ M, up to values which are below the detection limit
  • Stage C) can then be carried out on stage B). Then the culture supernatant is separated from the microorganisms, for example by filtration or centrifugation. However, stage C) can also be carried out during stage B), continuously or discontinuously. In the latter case, at least part of the culture supernatant is removed and replaced by new culture medium and this process may be repeated several times.
  • the succinic acid is obtained from the removed culture supernatant. Continuous separation may be via suitable membranes or by passing a stream of culture medium through a succinic acid separation device.
  • the invention further relates to a method for producing a microorganism according to the invention, wherein a) the genes idhl and idpl are deleted or inactivated, and / or b) the genes sdh2 and sdhl are deleted or inactivated, and / or c) the
  • Gene PDC2 is deleted or inactivated or under the control of a repressible or inducible by exposure of the microorganism to an inducer substance
  • Promoter is provided, and / or d) one or more genes from the group consisting of ICLl, MLSl, ACSl and MDH3 replaced or supplemented by a corresponding foreign gene or corresponding foreign genes from a crabtree negative organism.
  • Fig. 1 a representation of the citrate and Glyoxylatzyklus with the genes involved, metabolites and enzymes or proteins, and
  • Fig. 2 metabolism of succinate to glutamate in the wild type.
  • Example 1 Preparation of a microorganism having a glyoxylate cycle which is transcriptional and at the protein level not subject to glucose repression for the production of organic acids of the respiratory central metabolism, in particular of succinic acid
  • the glucose-induced proteolytic degradation or inactivation of the enzymes of the glyoxylate cycle can be prevented by expressing heterologous isoenzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • These enzymes are derived from a microorganism which naturally has a glyoxylate cycle and "crabtree" is negative, since enzymes of the glyoxylate cycle from such an organism do not undergo the glucose-induced negative regulation, or the proteolytic Subject to degradation at the protein level.
  • Spenderorganisrniis come here for example Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia and Corynebacterium in question.
  • the transcriptional deregulation of these enzymes is achieved by placing the genes under the control of a constitutive promoter.
  • the genes acs acetyl-CoA synthetase
  • aceA isocitrate lyase
  • aceB malate synthase A
  • mdh malate dehydrogenase
  • the constitutive ADHI promoter is used, which by modification of the natural sequence leads to a constitutive, glucose and ethanol independent expression over a very long period of time (Lang and Looman 1995).
  • the coding nucleic acid sequence for the expression cassette from ADHlprom - acs (aceA, aceB, mdh) - TRPlterm. was amplified by PCR using standard methods from the vector pFlatl-acs (aceA, aceB, mdh). The DNA fragment obtained was cloned after a Klenow treatment in the vector pUG6 in the EcoRV interface blunt-end and gave the vector pUG6 acs (aceA, aceB, MDH).
  • an extended fragment from the vector pUG6-acs (aceA, aceB, mdh) was amplified by PCR, so that the resulting fragment consists of the following components: loxP-kanMX-loxP-ADHlprom-acs (aceA, aceB, mdh) - tryptophan terminator.
  • primer oligonucleotide sequences were selected which contain on the 5 'and 3' overhangs each 5 'or 3' sequence of the acs (aceA, aceB, mdh) gene and in the annealing region the sequences 5 'of the loxP regions and 3 'of the tryptophan terminator.
  • the selection marker used is in each case the resistance to G418.
  • the respective yeast strain is transformed with the cre recombinase vector pSH47 (Guldener et al., 1996).
  • This vector expresses the cre recombinase in the yeast, with the result that the sequence region within the two loxP sequences recombines out.
  • only one of the two loxP sequences and the respective expression cassette remains in the original corresponding gene locus.
  • the yeast strain loses the G418 resistance again and thus is suitable for integrating or removing further genes into the yeast strain by means of this cre-lox system.
  • the vector pSH47 can then be removed by counterselection on YNB agar plates supplemented with uracil (20 mg / L) and FOA (5-fluoroorotic acid) (1 g / L).
  • uracil (20 mg / L)
  • FOA 5-fluoroorotic acid
  • the cells carrying this plasmid must first be cultured under non-selective conditions and then be grown on FOA-containing selective plates. Under these conditions, only cells can grow that are unable to synthesize uracil itself. In this case, these are cells that no longer contain a plasmid (pSH47).
  • Example 2 Preparation of a microorganism for the biotechnological production of succinic acid and other organic acids, which is a more efficient manufacturing process by reducing
  • succinic acid must be enriched as a final product and must not be further metabolized by the yeast cell.
  • Yield losses can also result from the further metabolism of the succinate formed via the enzyme succinate-semialdehyde dehydrogenase.
  • This enzyme is part of the glutamate degradation pathway and catalyzes the conversion of succinate to succinate semialdehyde.
  • This intermediate is then metabolized via gamma-amino butyric acid to glutamate.
  • not only yield losses can be incurred, but also ⁇ -ketoglutarate and glutamate can be synthesized, which makes it impossible to control the fermentation process via glutamate supplementation. Therefore, the additional deletion of the gene uga2, which codes for the succinate-semialdehyde dehydrogenase, in an optimized production process for the production of succinic acid is advantageous.
  • Glyoxylate which is necessary for the circulation of the Glyoxylatzyklus, can be formed not only from the reaction catalyzed by the isocitrate lyase, wherein isocitrate is cleaved in succinate and glyoxylate, but also by the reaction of alanine glyoxylate aminotransferase.
  • This enzyme catalyzes the formation of glyoxylate and alanine from pyruvate and glycine.
  • glyoxylate need not necessarily be provided from the isocitrate-lyase reaction
  • circulation of the glyoxylate cycle can also be ensured by the reaction of the alanine-glyoxylate-aminotransferase reaction which provides glyoxylate.
  • the isocitrate-lyase activity by which the desired product succinate is formed is not necessary for the circulation of the glyoxylate cycle, with the result that the yeast partially reverses the alanine-glyoxylate aminotransferase-catalyzed alternative reaction to the glyoxylate Synthesis uses. There is no succinate, which leads to yield losses.
  • the additional deletion of the gene agxl, which codes for the alanine glyoxylate aminotransferase, in an optimized production process for the production of succinic acid is advantageous.
  • the idhl deletion does not lead to a complete disappearance of isocitrate dehydrogenase activity.
  • the reason for this are 3 other isoenzymes of isocitrate dehydrogenase, which can compensate for the elimination of the main dimeric enzyme encoded by the IDH1 and IDH2 genes with respect to the formation of ⁇ -ketoglutarate.
  • the gene idhl which codes for an isoenzyme of isocitrate dehydrogenase, must be deleted in order to completely suppress the isocitrate dehydrogenase activity on glucose.
  • the complete suppression of isocitrate dehydrogenase activity has the advantage that all the carbon in the respiratory system of the yeast is diverted into the glyoxylate cycle in the direction of succinic acid and can not flow to ⁇ -ketoglutarate, which would lead to yield losses.
  • yield losses in the biotechnical production of succinic acid in yeast can be minimized or reduced by deleting the genes sdhl, agxl, uga2 and idpl in addition to the genes sdh2 and idh.
  • the coding nucleic acid sequence for the deletion cassette loxP-kanMX-loxP was amplified by PCR using standard methods from the vector pUG6 (Guldener et al., 1996), so that the resulting fragment consists of the following components: loxP-kanMX-loxP.
  • primer oligonucleotide sequences were selected which contain at the 5 'and 3' overhangs each 5 'or 3' sequence at the beginning and at the end of the native locus of the genes to be deleted ⁇ sdhl, agxl, uga2, idpl) and in annealing region sequences 5 'of the loxP region and 3' of the second loxP region.
  • the selection marker is resistance to G418 (encoded by kanMX).
  • the resulting yeast strain is cre Recombinase vector pSH47 (Guldener et al., 1996). This vector expresses the cre recombinase in the yeast, with the result that the sequence region recombines out within the two loxP sequences. As a result, only one of the two loxP sequences remains at the deleted gene locus (sdhl, agxl, uga2, idpl).
  • the consequence is that the yeast strain loses the G418 resistance again and thus is suitable for integrating or removing further genes into the yeast strain by means of this cre-lox system.
  • the vector pSH47 can then be removed by counterselection on YNB agar plates supplemented with uracil (20 mg / L) and FOA (5-fluoroorotic acid) (1 g / L).
  • the cells carrying this plasmid must first be cultivated under non-selective conditions and then be grown on FOA-containing selective plates. Under these conditions, only cells can grow that are unable to synthesize uracil itself. In this case, these are cells that no longer contain a plasmid (pSH47).
  • all genes to be deleted (sdhl, agxl, uga2, idpl) were iteratively deleted.
  • Table 1 shows by way of example the yield increases by deletions described above after culturing the strains indicated in the table for 72 hours in WM8 medium (Lang and Looman, 1995) with 3.52 g / l ammonium sulfate and 0.05 M Na 2 HPO 4 and 0.05 M NaH 2 PO 4 as a buffer, and with histidine 100 mg / l, leucine 400 mg / l, uracil 100 mg / l.
  • the C source was 5% glucose. It was inoculated l% from a 48h preculture. Cultivation was carried out in 100 ml shake flasks on a shaking incubator at 30 ° C. and 150 rpm.
  • strain 5 and 6 did not grow in medium without glutamate, biomass was first generated with these strains in 75 ml of standard WM8 medium with NaGlutamat and glucose 5% in 250 ml baffled flasks. The cells were washed and resuspended in the above-mentioned medium for further cultivation.
  • Table 1 Succinate titer after 72 hours cultivation of the indicated strains in WM8 medium under the conditions described above
  • Example 3 Preparation of a microorganism for the biotechnological production of succinic acid and other organic acids, which allows a more efficient production process by reducing by-product formation, in particular of ethanol and acetate.
  • Fermentation is another important aspect, which is detrimental in the biotechnological production of succinic acid, since it leads to the formation of unwanted by-products. In this context, especially the formation of acetate and ethanol is problematic because it leads to serious losses in yield.
  • One way to prevent alcoholic fermentation, ie the formation of ethanol, is to turn off ethanol biosynthesis starting from pyruvate. This also prevents acetate formation via acetaldehyde.
  • the pyruvate decarboxylase activity which is in the yeast Saccharomyces cerevisiae by 3 pyruvate decarboxylase isoenzymes encoded by the genes PdCl 1 PDC5 and PDC6, catalyzed.
  • the gene PDC2 encodes a transcriptional inducer, which is mainly responsible for the expression of the genes PDC1 and PDC5.
  • the PDC2 gene offers the possibility of eliminating in the cell the major part of the pyruvate decarboxylase activity, which is encoded by 3 genes, with only a single deletion. This has the great advantage that thus the problematic ethanol production can be avoided with only a single modification in the metabolism of the yeast.
  • the PDC2 gene can be preceded by an inducible promoter.
  • the inducible promoter is added during the growth phase by adding a
  • the CUP1 promoter was chosen and integrated chromosomally in front of the "open reading frame" of the PDC2 gene so that it is under the control of the copper-inducible CUP1 promoter.
  • the coding nucleic acid sequence for the CUPI promoter cassette was amplified by PCR using standard methods, so that the resulting fragment consists of the following components: loxP-kanMX-loxP-CUPlpr.
  • primer oligonucleotide sequences were selected which contain on the 5 'and 3' overhangs each 5 'or 3' sequence of the native promoter of the PDC2 gene and in the annealenden the sequences 5 'of the loxP region and 3' of CUPlprom.
  • the selection marker is resistance to G418.
  • the resulting strain contains a copy of the PDC2 gene under the control of the copper-regulated CUPI
  • the resulting yeast strain is transformed with the cre recombinase vector pSH47 (Guldener et al., 1996).
  • This vector expresses the cre recombinase in the yeast, with the result that the sequence region recombines out within the two loxP sequences.
  • only one of the two loxP sequences and the CUPI promoter cassette remains in front of the coding sequence of the PDC2 gene.
  • the consequence is that the yeast strain loses G418 resistance again and is thus able to integrate or remove further genes into the yeast strain by means of this cre-lox system.
  • the vector pSH47 can then be removed by counterselection on YNB agar plates supplemented with uracil (20 mg / L) and FOA (5-fluoroorotic acid) (1 g / L).
  • uracil (20 mg / L)
  • FOA 5-fluoroorotic acid
  • the cells carrying this plasmid must first be cultivated under non-selective conditions and then be grown on FOA-containing selective plates. Under these conditions, only cells can grow that are unable to synthesize uracil itself. In this case, these are cells that no longer contain a plasmid (pSH47).
  • Example 4 Preparation of a microorganism for the biotechnological production of succinic acid and other organic acids, which involves a separation of growth and production phase via glutamate
  • Another advantage of the complete suppression of isocitrate dehydrogenase activity is that all the carbon in the respiratory system of the yeast is diverted into the glyoxylate cycle in the direction of succinic acid and can not flow off to ⁇ -ketoglutarate, which would lead to yield losses (see FIG e.)).
  • the coding nucleic acid sequence for the deletion cassette loxP-kanMX-loxP was amplified by PCR using standard methods from the vector pUG6 (Guldener et al., 1996), so that the resulting fragment consists of the following components: loxP-kanMX-loxP.
  • primer oligonucleotide sequences were selected which contain at the 5 'and 3' overhangs each 5 'or 3' sequence at the beginning and at the end of the native locus of the gene to be deleted idpl and in the annealenden the sequences 5 'of loxP Region and 3 'of the second loxP region.
  • the selection marker is resistance to G418 (encoded by kanMX).
  • the resulting yeast strain is transformed with the cre recombinase vector pSH47 (Guldener et al., 1996).
  • This vector expresses the cre recombinase in the yeast, with the result that the sequence region recombines out within the two loxP sequences.
  • only one of the two loxP sequences remains at the deleted gene locus idpl.
  • the consequence is that the yeast strain loses the G418 resistance again and thus is suitable for integrating or removing further genes into the yeast strain by means of this cre-lox system.
  • the vector pSH47 can then be removed by counterselection on YNB agar plates supplemented with uracil (20 mg / L) and FOA (5-fluoroorotic acid) (1 g / L).
  • uracil (20 mg / L)
  • FOA 5-fluoroorotic acid
  • the cells carrying this plasmid must first be cultured under non-selective conditions and then be grown on FOA-containing selective plates. Under these conditions, only cells can grow that are unable to synthesize uracil itself. In this case, these are cells that no longer contain a plasmid (pSH47).
  • the production strain AH22ura3AsdhJAsdh2AidhlAidpl was evaluated on its growth characteristics with and without supplemented glutamate.
  • the reference strain was AH22um3Asdhl Asdh2Aidhl, ie the strain without additional deletion of idpl.
  • the two strains were dissolved in 20 ml of WM8 medium in 100 ml flasks once with 3.52 g / l ammonium sulfate (as nitrogen source) and 0.05 M K2HPO4, and 0.05 M KH2PO4 as buffer and in standard WM8 medium (Lang and Looman 1995) containing 10 g of NaGlutamate as a nitrogen source. After 64 h, the optical density of the 4 cultures was determined. The results are shown in Table 2.
  • Table 2 Optical density of the indicated strains after 64 hours cultivation in WM8 medium with and without glutamate. In the medium without glutamate, NH3SO4 was used as nitrogen source.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft einen isolierten genetisch veränderten Mikroorganismus, wobei gegenüber dem wild-Typ a) die Gene idh1 und idp1 deletiert oder inaktiviert sind, und/oder b) die Gene sdh2 und sdh1 deletiert oder inaktiviert sind, und/oder c) das Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert ist oder unter der Kontrolle eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimierbaren oder induzierbaren Promotors steht, und/oder d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICL1, MLS1, ACS1 und MDH3 ersetzt oder ergänzt ist durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem Crabtree negativen Organismus, sowie dessen Verwendungen.

Description

Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, welcher gentechnisch gegenüber dem Wildtyp modifiziert und zur Herstellung von organischen Säuren, insbesondere Bernsteinsäure, geeignet ist, Verwendungen eines solchen Mikroorganismus sowie Verfahren zu dessen Herstellung.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
Dicarbonsäuren haben ein großes ökonomisches Potential, weil sie als Vorläufersubstanzen für zahlreiche Chemikalien verwendet werden können. Zum Beispiel dient Bernsteinsäure als Vorstufe für die Herstellung von Kunststoffen auf der Basis von 1,4-Butanediol, Tetrahydrofuran und Gamma-Butyrolacton. Bernsteinsäure wird heute chemisch durch katalytische Hydrierung von Maleinsäureanhydrid zu Bersteinsäureanhydrid und nachfolgender Wasseranlagerung, bzw. durch direkte katalytische Hydrierung von Maleinsäure hergestellt.
Bernsteinsäure wird auch von vielen Mikroorganismen ausgehend von Zuckern oder Aminosäuren unter physiologischen Umgebungsbedingungen gebildet. Unter anaeroben Bedingungen werden in der Regel neben Bernsteinsäure weitere Gärendprodukte wie Ethanol, Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure gebildet. Die Biosynthese von Bernsteinsäure mit ihrem hohen Sauerstoffanteil erfordert eine reduktive CO2-Fixierung.
Bernsteinsäure ist ein Metabolit, der normalerweise durch anaerobe Fermentationsprozesse angereichert wird. Während die Ausbeute und Anreicherung des Produktes unter anaeroben Bedingungen vielfach besser ist als unter aeroben Bedingungen, liegt der Nachteil in einem ausschließlich anaeroben Prozess in einer technischen Begrenzung der Biomassen-Herstellung und einer geringen Produktivität des mikrobiellen Produzenten. Somit ist ein relativ geringer Biomassen/Produkt Wirkungsgrad die Folge. Zudem ist es schwierig, strikt anaerobe Mikroorganismen technisch zu handhaben.
Verschiedene Mikroorganismen, die in Lage sind unter anaeroben Bedingungen Bernsteinsäure zu synthetisieren, sind bekannt. Die Literaturstelle US 5,143,834 beschreibt eine Variante von A. succiniciproducens. Es handelt sich dabei um einen obligat anaeroben Mikroorganismus, der nur moderate Mengen an Bernsteinsäure herstellen kann und zudem nicht in der Lage ist, hohe osmotische Drücke und Salzkonzentrationen zu tolerieren.
Die Literaturstelle US 7,063,968 beschreibt ein mikrobielles Isolat aus Rinder-Pansen, Mannheimia sp. 55E, welches in der Lage ist, sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen organische Säuren zu synthetisieren. Dabei handelt es sich allerdings nicht um eine spezifische Anreicherung von Bernsteinsäure, sondern um ein Gemisch aus verschiedenen organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure und Bernsteinsäure. Nachteil dieses Produzenten ist, dass eine ökonomische Verwendung des Stammes nur schwer möglich, wenn nicht unmöglich ist, da zur Gewinnung von Bernsteinsäure aufwendige Anreicherungs- und Aufreinigungsverfahren angewendet werden müssten.
Die Literaturstelle US 5,869,301 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren in einem zweistufigen Fermentationsprozesses mit E. coli AFP-111, wobei in einer ersten Phase mikrobielle Biomasse unter aeroben Bedingungen hergestellt und in einer zweiten Phase die Produktion von Bernsteinsäure anaerob durchgeführt wird. Die erste Phase der Biomassengewinnung ist in diesem Prozess limitiert, da die Glukose-Konzentration im Fed-Batch Prozess auf 1 g/L beschränkt sein muss, um eine Acetat- Anreicherung zu vermeiden, die sowohl den Biomassengewinnungsprozess, als auch die Bernsteinsäureproduktion stört. Somit ist die Biomassengewinnung mit diesem Prozess nur begrenzt möglich. Des weiteren unterliegt der Biosyntheseweg für die Bernsteinsäure in diesem Prozess einer starken Katabolit-Repression, da Gene der Glykolyse, des Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweges durch Glukose stark reprimiert sind, wie aus der Literaturstelle (DeRisi et al. 1997) bekannt. Das hat zur Folge, dass die Synthese von Bernsteinsäure in Gegenwart von Glukose weitestgehend reprimiert und damit stark begrenzt ist.
Aus der Literaturstelle US 6,190,914 sind Mikroorganismen bekannt, bei welchen durch Modulation von geeigneten Transkriptionsfaktoren und Kinasen die Glucose-Repression diverser Gene vermindert wird. Die Herstellung von organischen Säuren mittels solcher Mikroorganismen, insbesondere aber auch weitergehend für die Produktion organischer Säuren optimierte Mikroorganismen, sind nicht entnehmbar.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, einen Mikroorganismus anzugeben, mit welchem eine verbesserte Ausbeute an organischen Säuren, insbesondere Bernsteinsäure, in mikrobiologischen Herstellungsverfahren erzielbar ist.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung einen isolierten genetisch veränderten Mikroorganismus, wobei gegenüber dem wild-Typ a) die Gene idhl und idpl deletiert oder inaktiert sind, und/oder b) die Gene sdh2 und sdhl deletiert oder inaktiviert sind, und/oder c) das Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert ist oder unter der
Kontrolle eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimi erbaren oder induzierbaren Promotors steht, und/oder d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICLl, MLSl, ACSl und MDH3 ersetzt oder ergänzt ist durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem
Crabtree negativen Organismus.
Das fremde Gen, welches das Gen ICLl ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie zu Sequenz Nr. 1 aufweisen. Das fremde Gen, welches das Gen ACSl ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie zu Sequenz Nr. 2 aufweisen. Das fremde Gen, welches das Gen MLSl ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie zu Sequenz Nr. 3 aufweisen. Das fremde Gen, welches das Gen MDH3 ersetzt oder ergänzt, kann mindestens 75% Homologie zu Sequenz Nr. 4 aufweist. Vorzugsweise liegt die Homologie bei mehr als 80%, insbesondere mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%. Es kann jeweils natürlich auch hiermit identisch sein.
Mit der Erfindung wird ein optimiertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren des respirativen Zentralmetabolismus mittels eines Hefestammes, insbesondere eines Saccharomyces cerevisiae Hefestammes, erhalten. Dieses Verfahren ermöglicht eine effizientere Produktion organischer Carbonsäuren, insbesondere Dicarbonsäuren und Hydroxyfettsäuren des respirativen Zentralmetabolismus der Hefe, wie zum Beispiel Bernsteinsäure, hinsichtlich der Produktionsdauer und -ausbeuten. Außerdem ermöglicht es einen 2-stufigen Produktionsprozess durch Trennung von Wachstum- und Produktionsphase ohne den Einsatz eines Antibiotikum-abhängigen Promotorsystems.
Mit der Erfindung wird ein Prozess ermöglicht, bei dem zunächst in einer ersten Wachstumsphase Biomasse angereichert und in einer zweiten Phase effizient Bernsteinsäure produziert und in das Kulturmedium abgegeben werden soll. Die Trennung von Wachstum und Produktionsphase trägt in erheblichem Maße zur Effizienz des gesamten Produktionsprozesses von organischen Säuren in Hefe bei, da Wachstum der Zellen und Produktion des gewünschten Metaboliten sonst immer konkurrierende Faktoren darstellen.
Während der Produktionsphase ist die Bildung von Biomasse unerwünscht, da hierfür eingesetzter Kohlenstoff bzw. Substrat verbraucht wird, was letztendlich eine Verminderung der Ausbeute des zu produzierenden Metaboliten, zum Beispiel Bernsteinsäure, zur Folge hat. Die Trennung von Wachstums und Produktionsphase ist mittels eines gentechnisch veränderten oder durch genetische Mutation veränderten Mikroorganismus und ein dazugehöriges Fermentationsverfahren, bei dem zunächst während einer ersten Phase ein optimaler Biomasse-Zuwachs des mikrobiellen Produzenten gewährleistet ist und anschließend, in einer zweiten Phase (Produktionsphase) die Anreicherung von Carbonsäuren, beispielsweise Bernsteinsäure, aus primären Kohlenstoff-Quellen (z.B. Glukose) und CO2 (anaplerotische Auffüllreaktion, CO2 Fixierung), angeschlossen wird, realisierbar.
Während der Produktionsphase ist durch genetische Veränderung eines Mikroorganismus, welcher in der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DE 2008/000670 „Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure" beschrieben ist, der Citratzyklus (dort Figur 1 a.)) nach den Intermediaten Isocitrat und Succinat unterbrochen (in der dortigen Figur 1 durch schwarze Kreuze gekennzeichnet), während er in der Wachstumsphase nicht unterbrochen ist und die Konfiguration des Wildtyps aufweist. Diese Unterbrechungen führen dazu, dass Succinat nicht weiter verstoffwechselt werden kann und sich als Endprodukt anreichert und der Kohlenstofffluss in den Glyoxylatzyklus (dort, Figur 1 b.)) umgeleitet wird. Bei der Produktion organischer Säuren über den Glyoxylatzyklus ergibt sich der Vorteil, dass die beiden oxidativen Decarboxylierungsschritte von Isocitrat zu Succinyl-CoA im Citratzyklus, und somit der Verlust von Kohlenstoff in Form von zweimal CO2 (siehe dort Figur 1 c.)), umgangen werden. Die beschriebenen Unterbrechungen nach den Intermediaten Isocitrat und Succinat während der Produktionsphase werden durch ein exogen regulierbares Promotorsystem realisiert, welches den in der Produktionsphase zu reprimierenden Genen vorgeschaltet wird. Die Repression der entsprechenden Gene während der Produktionsphase erfolgt dann durch Zugabe eines tetracyclischen Antibiotikums, zum Beispiel Tetracyclin, zum Kulturmedium. Die Anwendung von Antibiotika in der Fermentation kann jedoch problembehaftet sein, da diese einen zusätzlichen Kostenfaktor darstellen. Außerdem müssen Antibiotika gegebenenfalls aus dem Produkt oder der Kulturbrühe wieder entfernt werden, was das "downstream processing" erheblich aufwendiger und kostenintensiver gestaltet.
Demgegenüber wird mit der Erfindung eine weitere, optimierte Möglichkeit der Trennung von Wachstums- und Produktionsphase geschaffen, welche den Einsatz von Antibiotika nicht erforderlich macht, sowie ein optimiertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure oder anderen organischen Säuren in Hefe.
Zum Merkmal a) ist folgendes auszufuhren. Beispielsweise in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist trotz der Deletionen der Gene sdh2 und idhl, welche zu einer Unterbrechung des Citratzyklus führen, eine Wachstumsrate, derer einer unmodifizierten Wildtyphefe vergleichbar, zu messen. Ein Wachstum eines Hefestammes mit einer idhl Deletion ist nur deshalb möglich, weil diese Deletion nicht zu einem vollständigen Verschwinden der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität führt. Der Grund hierfür sind drei weitere Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase, welche den Wegfall des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene IDHl und IDH2, bezüglich der Bildung von α- Ketoglutarat kompensieren können. Die Synthese von α-Ketoglutarat ist für ein Wachstum der Hefezelle auf Minimalmedien zwingend erforderlich, da aus diesem Intermediat die Aminosäure Glutamat gebildet wird, ohne die kein Wachstum möglich ist. In einem 2-stufigen Fermentationsprozess zur Herstellung von Bernsteinsäure mit Hefe ist die effektive Trennung von Wachstums- und Produktionsphase also nur durch die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität im Produktionsstamm möglich, weil dadurch eine Glutamat-Auxotrophie gewährleistet ist, was zur Folge hat, dass die Hefe in Medium ohne supplementiertem Glutamat kein Wachstum aufweist. Dies kann genutzt werden, um über die Supplementierung von Glutamat zum Kulturmedium den Fermentationsprozess zu steuern. Über die Menge des zugegeben Glutamats zum Kulturmedium kann die Dauer der Wachstumsphase, sowie die angestrebte Zelldichte in dieser Phase effektiv gesteuert werden. Mit zunehmender Menge nehmen auch Dauer und Zelldichte zu. Ist das Glutamat im Kulturmedium verbraucht, ist kein weiters Wachstum möglich und sämtlicher Kohlenstoff kann effektiv zur Synthese von Bernsteinsäure genutzt werden, deren Bildung dann nicht in Konkurrenz zur Bildung von Biomasse steht. Diese Trennung von Wachtums- und Produktionsphase im Fermentationsprozess über die Supplementierung von Glutamat wird realisiert, wenn zusätzlich zur Deletion des Gens idhl mindestens noch das Gen idpl (Contreras-Shannon et al. 2005), vorzugsweise auch die Gene idp2 und idp3, welche für Isoenzyme der Isocitrat-Dehydrogenase kodieren, deletiert werden. Eine praktisch vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität gewährleistet die dafür nötige Glutamat-Auxotrophie. Ein weiterer Vorteil der vollständigen Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität liegt darin begründet, dass so sämtlicher Kohlenstoff im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus in Richtung Bernsteinsäure umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat abfließen kann, was zu Ausbeuteverlusten führen würde.
Zum Merkmal b) ist folgendes auszuführen. Um weitere Ausbeuteverluste zu vermeiden bzw. zu verringern, sollte Bernsteinsäure als Endprodukt angereichert werden und nicht durch die Hefezelle weiter verstoffwechselt werden. Dies kann durch die singuläre Deletion des Gens sdh2, nicht erreicht werden. Zusätzlich wird erfindungsgemäß eine weitere Untereinheit des heterotetrameren Enzyms Succinat-Dehydrogenase, kodiert durch das Gen sdhl, deletiert. (Kubo et al. 2000) detektierten eine Restaktivität der Succinat-Dehydrogenase in einem Hefestamm mit einer sdh2 Deletion, welche durch zusätzliche Deletion des Gens sdhl unterbunden wurde. Ausbeuteverluste können sich auch durch die Weiterverstoffwechselung des gebildeten Succinats über das Enzym Succinat-semialdehyd Dehydrogenase ergeben. Dieses Enzym ist Teil des Glutamat- Degradationsweges und katalysiert die Umsetzung von Succinat zu Succinat- semialdehyd. Dieses Intermediat wird dann über Gamma-amino Buttersäure zu Glutamat verstoffwechselt. Auf diesem Wege können nicht nur Ausbeuteverluste entstehen, sondern auch α-Ketoglutarat und Glutamat synthetisiert werden, was eine Steuerung des Fermentationsprozesses über Glutamatsupplementierung unmöglich macht. Deshalb ist die zusätzliche Deletion des Gens uga2, welches für die Succinat-semialdehyd Dehydrogenase kodiert, im Rahmen eines optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure vorteilhaft, Glyoxylat, welches für den Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig ist, kann nicht nur aus der durch die Isocitrat-Lyase katalysierten Reaktion, wobei Isocitrat in Succinat und Glyoxylat gespalten wird, entstehen, sondern auch durch die Reaktion der Alanin-Glyoxylat-Aminotransferase. Dieses Enzym katalysiert die Entstehung von Glyoxylat und Alanin ausgehend von Pyruvat und Glycin. Wenn Glyoxylat nicht zwingend aus der Isocitrat-Lyase Reaktion zur Verfügung gestellt werden muss, kann der Umlauf des Glyoxylat-Zyklus auch durch die Reaktion der Alanin-Glyoxylat-aminotransferase Reaktion, durch welche Glyoxylat bereitgestellt wird, gewährleistet werden. In diesem Fall ist die Isocitrat-Lyase Aktivität, durch welche das angestrebte Produkt Succinat entsteht, nicht für den Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig, was zur Folge hat, dass die Hefe zum Teil die durch die Alanin-Glyoxylat- aminotransferase katalysierte Alternativ-Reaktion zur Glyoxylat-Synthese nutzt. Dabei entsteht kein Succinat, was zu Ausbeuteverlusten führt. Deshalb ist die zusätzliche Deletion des Gens agx], welches für die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase kodiert, im Rahmen eines optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure vorteilhaft.
Zum Merkmal c) ist folgendes auszuführen. Bei der Zellatmung wird Kohlenstoff ausgehend vom Substrat, z.B. Glucose, nicht wie bei der Gärung in Ethanol oder Glycerin umgewandelt, sondern tritt in den respirativen Zentralmetabolismus, also in den Citratzyklus bzw. den Glyoxylatzyklus ein. Beim Durchlaufen des Kohlenstoffes durch diese beiden Zyklen werden Redoxequivalente in Form von NADH bzw. NADPH gebildet, deren Elektronen auf den ersten Proteinkomplex der Atmungskette, welche in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert ist, übertragen werden. Diese Elektronen werden dann schrittweise über weitere Proteinkomplexe der Atmungskette auf den finalen Elektronenakzeptor Sauerstoff übertragen, welcher dabei zu Wasser reduziert wird. Die freiwerdende Energie dieser kontrollierten Knallgasreaktion wird genutzt, um Protonen gegen einen Gradienten in den Intermembranraum der Mitochondrien zu befördern, welche dann beim Zurückfließen in das Mitochondrium durch den Komplex V der Atmungskette die sogenannte "Protonenpumpe" antreiben, wobei Energie in Form von ATP generiert wird. Unter Gärungsbedingungen produziert die Hefe neben Glycerin vor allem Ethanol und generiert pro Molekül Glucose nur 2 Energieequivalente in Form von ATP, im Vergleich zur Atmung, bei der pro Molekül Glucose 38 ATP generiert werden können. Bei der Gärung wird NADH zu NAD durch die Synthese von Ethanol bzw. Glycerin reoxidiert und nicht wie bei der Atmung durch Abgabe der Elektronen auf Sauerstoff, da unter anaeroben Bedingungen Sauerstoff nicht als finaler Elektronenakzeptor zur Verfügung steht. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist "Crabtree" positiv. Das bedeutet, dass die Hefe auf primären Kohlenstoffquellen, wie zum Beispiel Glucose, selbst unter aeroben Bedingungen gärt und nicht atmet. Diese Gäraktivität ist schon ab einer Glucosekonzentration von etwa 100 mg/1 Glucose im Kulturmedium zu beobachten, da ab dieser Konzentration die Grenze der respiratorischen Kapazität der Hefezelle erreicht ist. Der Grund hierfür ist, dass in Anwesenheit von Glucose eine Vielzahl der Gene des respirativen Zentralmetabolismus, also des Citrat- und Glyolxylatzyklus (siehe Figur 1 a.) und b.)) und der Atmungskette trankriptionell stark reprimiert sind (Gancedo 1998). Dieses Phänomen wird auch als Glucose- oder Katabolit-Repression bezeichnet. Die Gärung ist weiterer Aspekt, welcher sich bei der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure nachteilig auswirken kann, da sie zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte führt. In diesem Zusammenhang ist vor allem die Bildung von Glycerin, Acetat und Ethanol problematisch, da sie zu gravierenden Ausbeuteverlusten führt. Sämtliche Organismen, welche den Crabtree Effekt aufweisen, wie zum Beispiel die Hefe Saccharomyces cerevisiae, gären selbst unter aeroben Bedingungen. Bei der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure in Hefe ist grundsätzlich die Bildung von Gärendprodukten, vor allem von Ethanol, nicht unerwünscht und zu vermeiden. Unter aeroben Bedingungen kann dies zum Teil dadurch erreicht werden, dass eine kontinuierliche Zudosierung einer geringen Glucosemenge zum Kulturmedium vorgenommen wird, was die Glucose-Repression und somit die Gärung unter aeroben Bedingungen verhindert bzw. reduziert. Unter anaeroben Bedingungen steht Sauerstoff nicht als finaler Elektronenakzeptor zur Verfügung, weshalb die Hefe in jedem Fall gären muss, um NADH zu reoxidieren und somit metabolisch aktiv zu bleiben. Eine Möglichkeit die alkoholische Gärung, also die Bildung von Ethanol zu vermeiden, ist das Ausschalten der Ethanol Biosynthese ausgehend von Pyruvat. Hierzu kann die Pyruvat-Decarboxylase Aktivität abgeschaltet werden, welche in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch 3 Pyruvat-Decarboxylase Isoenzyme, kodiert von den Genen PDCl, PDC5 und PDC6, katalysiert wird. PDC6 wird sowohl beim Wachstum auf Glucose, als auch auf Ethanol nur sehr schwach exprimiert. (Velmurugan et al. 1997). Das Gen PDC2 kodiert für einen transkriptionellen Induktor, welcher vor allem für die Expression der Gene PDCl und PDC5 verantwortlich ist. Das Gen PDC2 bietet also die Möglichkeit mit nur einer einzelnen Deletion den Hauptanteil der Pyruvat-Decarboxylase Aktivität, welche von 3 Genen kodiert wird, in der Zelle abzuschaffen. Natürlich kann alternativ oder zusätzlich auch eines oder mehrere der Gene PDCl, PDC5 und/oder PDC6 deletiert sein. Dies hat den großen Vorteil, dass somit die problematische Ethanolbildung mit nur einer einzelnen Modifikation im Metabolismus der Hefe vermieden werden kann. Um die Ausbeuteverluste bei der biotechnischen Herstellung von Bernsteinsäure in Hefe zu minimieren bzw. zu reduzieren, sollte die Nebenproduktbildung, vor allem von Ethanol vermieden werden bzw. stark reduziert werden. Dies kann durch Deletion des Gens PDC 2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erreicht werden. Da diese Deletion zu einem stark eingeschränkten Wachstum auf Glucose führt, kann dem Gen PDC2 ein reprimierbarer Promotor oder ein induzierbarer Promotor vorgeschaltet werden. Der reprimierbare Promotor gewährleistet eine ausreichende Transkription des nachgeschalteten Gens in der Wachstumsphase und stoppt die Transkription in der Produktionsphase durch Zugabe eines Zusatzes zum Kulturmedium. Der induzierbare Promotor wird während der Wachstumsphase durch Zugabe eines Induktors zum Kulturmedium induziert, wodurch das nachgeschaltete Gen PDC2 ausreichend transkribiert wird und ein Wachstum der Hefekultur möglich wird. Ist der Induktor aufgebraucht ist kein weiteres Wachstum möglich und die Produktionsphase wird eingeleitet. Ohne Pyruvat-Decarboxylase Aktivität ist kein Wachstum der Hefezelle möglich, da nicht ausreichend Acetyl-CoA, gebildet über Acetaldehyd und Acetat, für die Fettsäurebiosynthese zur Verfügung steht.
Zum Merkmal d) ist folgendes auszuführen. Verschiedene Enzyme des Citrat- und Glyoxylatzyklus, deren Gene transkriptioneil durch Glucose reprimiert sind, unterliegen auch auf Proteinebene der Regulation bzw. Inaktivierung durch Glucose. Eine transkriptionelle Deregulation dieser Gene alleine reicht also nicht aus, um in vollem Umfang ein aktives Genprodukt zu erhalten. Für ein hinsichtlich der Produktionsdauer und -ausbeuten optimiertes Verfahren zur Herstellung von Bemsteinsäure müssen also auch Inaktivierungseffekte auf Proteinebene umgangen werden. Ein Beispiel ist eines der Hauptenzyme des Glyoxylatzyklus, die Isocitrat-Lyase. Dieses Enzym, welches für die effiziente Produktion von organischen Säuren essentiell ist, unterliegt in Anwesenheit von Glucose der Inaktivierung durch Phosphorylierung und einem verstärkten proteolytischen Abbau (Lopez-Boado et al. 1988; Ordiz et al. 1996). Für weitere Enzyme des respirativen Systems, insbesondere des Glyoxylatzyklus, ist auch von Glucose-induzierten negativen regulatorischen Effekten auf Proteinebene auszugehen. Dies betrifft vor allem die Acetyl-CoA Synthetase (Acslp), die Malat- Synthase (MIs Ip) und die Malat-Dehydrogenase (Mdh3p). Die Glucose-induzierte protetolytische Degradation bzw. Inaktivierung dieser Enzyme kann verhindert werden, indem heterologe Isoenzyme in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Diese Enzyme stammen aus einem Mikroorganismus, welcher natürlicherweise einen Glyoxylatzyklus aufweist und "Crabtree" negativ ist, da Enzyme des Glyoxylatzyklus aus einem solchen Organismus nicht der durch Glucose-induzierten negativen Regulation, bzw. der proteolytischen Degradation auf Proteinebene unterliegen. Ein aktiver Glyolylatzyklus ist für eine effiziente Produktion von organischen Säuren mit hohen Ausbeuten auf primären Kohlenstoffquellen essentiell. Als „Crabtree" negative Spenderorganismen kommen beispielsweise in Frage Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia oder Corynebacterium.
Der Begriff der Deletion eines Gens bezeichnet die vollständige Entfernung des Gens aus dem Genom des Mikroorganismus und/oder die Entfernung des dadurch codierten aktiven Enzyms aus dem Mikroorganismus. Eine Inaktivierung eines Gens bezeichnet die Reduktion oder das vollständige Ausschalten der Aktivität des durch das Gen codierten Enzyms bzw. Proteins. Dies lässt sich überprüfen durch eine Messung der betreffenden enzymatischen Aktivität mit üblichen Standardtests oder durch eine Bestimmung des betreffenden Enzyms bzw. Proteins mittels beispielsweise immunologischen Nachweisreaktionen. Eine Inaktivierung kann beispielsweise durch Reduktion oder Inhibierung der Genexpression (Transkription und/oder Translation) erfolgen. Hierzu ist beispielsweise die Einführung von antisense Nukleinsäuren (durch Zugabe oder durch Einbringen von Nukleinsäuresequenzen in das Genom, welch zur antisense Nukleinsäure transkribierbar sind), die Einführung von Mutationen in das Endogen, welche die Aktivität des Genproduktes reduzieren oder vollständig ausschalten, die Einführung von Gen-spezifischen DNA-bindenden Faktoren, beispielsweise Zinkfingertranskriptionsfaktoren, die eine Reduktion der Genexpression bewirken, der Ersatz des Endogens durch ein fremdes Gen, welches für ein entsprechendes, jedoch inaktiviertes oder reduziert aktives Enzym bzw. Protein codiert.
Auch kann ein Promotor, unter dessen Kontrolle das betreffende Endogen steht, deletiert oder mutiert werden, so dass eine Transkription reduziert oder inhibiert ist.
Die Sequenzen (Nukleinsäuresequenzen und/oder Aminosäuresequenzen) der im
Rahmen der Erfindung inaktivierten Gene bzw. Enzyme bzw. der angesprochenen
Promotor sind unter den folgenden Gendatenbanknummern erhältlich bzw. in den folgenden Literaturstellen beschrieben.
SDHl: NCJ)01143.7
PDC2: NCJ)01136.8
IDPl: NCJX) 1136.8
IDP2: NCJ)Ol 144.4 IDP 3: NCJ)01146.6
AGXl: NCJ)Ol 138.4
UGA2: NCJ)01134.7
MLSl: X64407 S50520
ICLl: X65554 MDH3: M98763
ACSl: AY723758 aceA: NC_000913.2 acs : NC_004431.1 aceB: NCJ) 10473.1 mdh: NC_000913.2
ADHl : Lang C, Looman A.C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1-2):147-156 (1995) tetO und tTA: Gari E. et al., Yeast 13:837-848 (1997).
Die Transformation von Mikroorganismen, wie Hefezellen, kann in fachüblicher Weise erfolgen und hierzu wird auf die Literaturstellen Schiestl R.H., et al., Curr Genet. Dec, 16(5-6):339-346 (1989), oder Manivasakam P., et al., Nucleic Acids Res. Sep 11, 21(18):4414-4415 (1993), oder Morgan A.J., Experientia Suppl., 46:155-166 (1983) verwiesen.
Zur Transformation geeignete Vehikel, insbesondere Plasmide, sind beispielsweise aus den Literaturstellen Naumovski L., et al., J Bacteriol, 152(1):323-331 (1982), Broach J.R., eta al., Gene, 8(1):121-133 (1979), Sikorski R.S., et al., Genetics, 122(l)_19-27 (1989). Bei diesen vectoren handelt es sich um Yep24, Yepl3, pRS -Vektorserie, sowie um YCp 19 oder pYEXBX.
Die Herstellung von im Rahmen der Erfindung geeigneten Expressionskassetten erfolgt typischerweise durch Fusion des Promo tors mit der für das Gen kodierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. einem Terminator nach üblichen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie beispielsweise in den Literaturstellen Maniatis T., et al., Molecular Cloning: A Laboratiry Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY, USA5 1989, oder Sihlavy T.J., et al., Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY, USA, 1984, oder Ausubel F.M., et al.5 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience, 1987, beschrieben.
Die Erfindung betrifft desweiteren die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Herstellung einer organischen Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus, insbesondere einer organischen Dicarbonsäure, vorzugsweise von Bernsteinsäure, sowie dessen Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung einer organischen Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus, insbesondere einer organischen Dicarbonsäure, vorzugsweise von Bernsteinsäure, mit den folgenden Verfahrenstufen: A) in einer Wachstumsverfahrenstufe wird der Mikroorganismus unter vorzugsweise aeroben Bedingungen kultiviert und vermehrt, optional unter Zugabe einer Induktorsubstanz zur Induktion des induzierbaren Promotors und/oder von Glutamat, B) anschließend wird der Mikroorganismus in einer Produktionsphase unter vorzugsweise anaeroben Bedingungen kultiviert, optional unter Zugabe einer Induktorsubstanz zur Repression des reprimierbaren Promotors, C) anschließend an die Stufe B) oder während der Stufe B) wird die Carbonsäure aus dem Kulturüberstand abgetrennt und optional aufgereinigt.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, wenn die Stufe A) bis zu einer Zelldichte von zumindest 100 g Biotrockenmasse/l, vorzugsweise zumindest 120 g/l, höchstvorzugsweise zumindest 140 g/l, durchgeführt wird. Die Stufe b) kann bis zu einer Carbonsäurekonzentration von zumindest 0,4 Mol/l, vorzugsweise zumindest 0,8 Mol/l, höchstvorzugsweise zumindest 1,0 Mol/l, durchgeführt werden. In Stufe A) kann ein pH im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, und eine
Salzkonzentration im Bereich von 0,01 bis 0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 Mol/l, höchstvorzugsweise von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt werden. In Stufe B) kann ein pH im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 8, und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,01 bis 0,5 Mol/l, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2 Mol/l, höchstvorzugsweise von 0,05 bis 0,1 Mol/l, eingestellt werden. Die Stufe A) wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 35 °C, vorzugsweise von 28 bis 30 0C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt. In Stufe B) ist eine Durchführung bei einer Temperatur von 15 bis 40 0C, vorzugsweise von 20 bis 35 0C, höchstvorzugsweise 28 bis 30 0C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise von 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, bevorzugt.
Als Kulturmedien für die Stufe A) kommt beispielsweise WMVIII-Medium (Lang C, Looman A.C., Appl Microbiol Biotechnol. 44(1 -2): 147- 156 (1995)) in Frage. Dabei liegt die Tetracyclin-Menge im Kulturmedium vorzugsweise unterhalb von 20 mg/1, bevorzugt unterhalb von 10 mg/1, höchstvorzugsweise unterhalb von 1 mg/1, bis hin zu Werten, die unterhalb der Nachweisgrenze liegen und/oder die CuSO4 Konzentration im Kulturmedium, sofern eingesetzt, bevorzugt oberhalb von 1 μM, höchstvorzugsweise oberhalb von 5 μM. Als Bereiche kommen beispielsweise 1 bis 3 μM oder 3 bis 15 μM in Frage. Als Kulturmedium für die Stufe B) kommt beispielsweise WMVIU-Medium in Frage, auch ist ein übliches Melasse-Medium einsetzbar. Dabei liegt die Tetracyclin-Menge, sofern eingesetzt, bevorzugt oberhalb von 1 mg/1, höchstvorzugsweise oberhalb von 3 mg/1. Als Bereiche kommen beispielsweise 1 bis 3 mg/1 oder 3 bis 15 mg/1 in Frage. Die eingesetzte CuSO4 Konzentration im Kulturmedium liegt dabei vorzugsweise unterhalb von 20 μM, bevorzugt unterhalb von 10 μM, höchstvorzugsweise unterhalb von 1 μM, bis hin zu Werten, die unterhalb der Nachweisgrenze liegen
Die Stufe C) kann anschließend an die Stufe B) durchgeführt werden. Dann wird der Kulturüberstand von den Mikroorganismen abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Die Stufe C) kann aber auch während der Stufe B) durchgeführt werden, und zwar kontinuierlich oder diskontinuierlich. In letzterem Falle wird zumindest ein Teil des Kulturüberstandes entnommen und durch neues Kulturmedium ersetzt und dieser Vorgang ggf. mehrfach wiederholt. Aus dem entnommenen Kulturüberstand wird die Bernsteinsäure gewonnen. Eine kontinuierliche Abtrennung kann über geeignete Membranen oder durch Leiten eines Stromes des Kulturmediums über eine Vorrichtung zur Abtrennung der Bernsteinsäure erfolgen.
Die Erfindung betrifft desweiteren ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäß Mikroorganismus, wobei a) die Gene idhl und idpl deletiert oder inaktiert werden, und/oder b) die Gene sdh2 und sdhl deletiert oder inaktiviert werden, und/oder c) das
Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert wird oder unter die Kontrolle eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimierbaren oder induzierbaren
Promotors gestellt wird, und/oder d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICLl, MLSl, ACSl und MDH3 ersetzt oder ergänzt werden durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem Crabtree negativen Organismus.
Grundsätzlich gelten alle im Zusammenhang mit erfϊndungsgemäßen Mikroorganismen angebrachten Erläuterungen analog auch für die erfmdungsgemäßen Verwendungen und Verfahren. Die Bibliographieangaben zu den vorstehend und nachfolgend als Kurzzitat genannten
Literaturstellen sind wie folgt.
Contreras-Shannon, V., A. P. Lin, M. T. McCammon and L. McAIi ster-Henn (2005). "Kinetic properties and metabolic contributions of yeast mitochondrial and cytosolic
NADP+-specific isocitrate dehydrogenases." J Biol Chem 280(6): 4469-75.
DeRisi, J. L., V. R. Iyer and P. O. Brown (1997). "Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale." Science 278(5338): 680-6.
Gancedo, J. M. (1998). "Yeast carbon catabolite repression." Microbiol Mol Biol Rev 62(2): 334-61.
Guldener, U., S. Heck, T. Fielder, J. Beinhauer and J. H. Hegemann (1996). "A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast." Nucleic Acids Res
24(13): 2519-24.
Kubo, Y., H." Takagi and S. Nakamori (2000). "Effect of gene disruption of succinate dehydro genäse on succinate production in a sake yeast strain." J Biosci Bioeng 90(6):
619-24.
Lang, C. and A. C. Looman (1995). "Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae." Appl Microbiol
Biotechnol 44(1-2): 147-56. Lopez-Boado, Y. S., P. Herrero, T. Fernandez, R. Fernandez and F. Moreno (1988).
"Glucose-stimulated phosphorylation of yeast isocitrate lyase in vivo." J Gen Microbiol
134(9): 2499-505.
Ordiz, I., P. Herrero, R. Rodicio and F. Moreno (1996). "Glucose-induced inactivation of isocitrate lyase in Saccharomyces cerevisiae is mediated by the cAMP-dependent protein kinase catalytic subunits Tpkl and Tpk2." FEBS Lett 385(1-2): 43-6.
Velmurugan, S., Z. Lobo and P. K. Maitra (1997). "Suppression of pdc2 regulating pyruvate decarboxylase synthesis in yeast." Genetics 145(3): 587-94.
Zur Erläuterung der verschiedenen vorstehend beschriebenen Synthesewege und deren Modifikation durch gentechnische Maßnahmen der Erfindung dienen die Figuren. Es zeigen Fig. 1 : eine Darstellung des Zitrat- und Glyoxylatzyklus mit den beteiligten Genen, Metaboliten und Enzymen bzw. Proteinen, und
Fig. 2: Verstoffwechselung von Succinat zu Glutamat im wild Typ.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von verschiedenen Beispielen näher erläutert. Dabei werden einzelne erfindungsgemäße Merkmale anhand von lediglich beispielhaften Mikroorganismen näher beschrieben. Die beschriebenen gentechnischen sind natürlich auch auf andere Mikroorganismen, insbesondere Hefen, übertragbar. Ebenso können die verschiedenen gentechnischen Maßnahmen auch in anderen Kombinationen vorgesehen sein.
Beispiel 1 : Herstellung eines Mikroorganismus mit einem Glyoxylatzyklus, welcher transkriptionell und auf Proteinebene nicht der Glucose- Repression unterliegt zur Herstellung von organischen Säuren des respirativen Zentralmetabolismus, insbesondere von Bernsteinsäure
Verschiedene Enzyme des Citrat- und Glyoxylatzyklus, deren Gene transkriptionell durch Glucose reprimiert sind, unterliegen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae auch auf Proteinebene der Regulation bzw. Inaktivierung durch Glucose. Eine transkriptionelle Deregulation dieser Gene reicht also nicht aus, um ein aktives Genprodukt zu erhalten. Für ein hinsichtlich der Produktionsdauer und -ausbeuten optimiertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure müssen also auch Inaktivierungseffekte auf Proteinebene umgangen werden.
Die Glucose-induzierte proteolytische Degradation bzw. Inaktivierung der Enzyme des Glyoxylatzyklus kann verhindert werden, indem heterologe Isoenzyme in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Diese Enzyme stammen aus einem Mikroorganismus, welcher natürlicherweise einen Glyoxylatzyklus aufweist und "Crabtree" negativ ist, da Enzyme des Glyoxylatzyklus aus einem solchen Organismus nicht der durch Glucose-induzierten negativen Regulation, bzw. der proteolytischen Degradation auf Proteinebene unterliegen. Als Spenderorganisrniis kommen hier zum Beispiel Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia und Corynebacterium in Frage. Die transkriptionelle Deregulation dieser Enzyme wird erreicht, indem die entsprechenden Gene unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt werden.
Dazu werden die Gene acs (Acetyl-CoA Synthetase), aceA (Isocitrat-Lyase), aceB (Malat-Synthase A), mdh (Malat-Dehydrogenase) aus bakterieller DNA des Stammes E.coli JMl 09 mittels PCR amplifiziert und mit Restriktionslinkern versehen und anschließend in das Hefe Chromosom unter der Kontrolle des konstitutiven ADHl Promotors integriert. Für die deregulierte Expression dieses Gens in der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird der konstitutive ADHl Promotor verwendet, der durch Modifizierung der natürlichen Sequenz über einen sehr langen Zeitraum zu einer konstitutiven, von Glucose und Ethanol unabhängigen, Expression führt (Lang and Looman 1995).
Die kodierenden Nukleinsäuresequenz für die Expressionskassette aus ADHlprom - acs (aceA, aceB, mdh) - TRPlterm. wurde durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden aus dem Vektor pFlatl- acs (aceA, aceB, mdh) amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde nach einer Klenow-Behandlung in den Vekor pUG6 in die EcoRV-Schnittstelle Blunt-end einkloniert und ergab den Vektor pUG6- acs (aceA, aceB, mdh). Nach Plasmidisolation wurde ein erweitertes Fragment aus dem Vektor pUG6- acs (aceA, aceB, mdh) mittels PCR amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-ADHlprom- acs (aceA, aceB, mdh) -Tryptophan-Terminator. Als Primer wurden Oligonukleotid- Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des acs (aceA, aceB, mdh) -Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Regionen und 3' des Tryptophan-Terminators. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive KanR und acs (aceA, aceB, mdh) amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den entsprechenden Genlocus der Hefe integriert.
Als Selektionsmarker dient jeweils die Resistenz gegen G418. Um die Resistenz gegen G418 anschließend jeweils wieder zu entfernen, wird der jeweils entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener et al. 1996) transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz-Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die jeweilige Expressions-Kassette in dem ursprünglichen entsprechenden Genlocus enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5- Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektivien Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
Beispiel 2: Herstellung eines Mikroorganismus zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren, welcher einen effizienteren Herstellungsprozess durch Reduzierung von
Ausbeuteverlusten ermöglicht.
Um Ausbeuteverluste bei der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure in der
Hefe Saccharomyces cerevisiae zu reduzieren, muss Bernsteinsäure als Endprodukt angereichert werden und darf nicht durch die Hefezelle weiter verstoffwechselt werden.
Dies kann in vollem Maße durch die singuläre Deletion des Gens sdh2 nicht erreicht werden. Zusätzlich muss eine weitere Untereinheit des heterotetrameren Enzyms Succinat-Dehydro genäse, kodiert durch das Gen sdhl, deletiert Werden.
Ausbeuteverluste können sich auch durch die Weiterverstoffwechselung des gebildeten Succinats über das Enzym Succinat-semialdehyd Dehydrogenase ergeben. Dieses Enzym ist Teil des Glutamat-Degradationsweges und katalysiert die Umsetzung von Succinat zu Succinat-semialdehyd. Dieses Intermediat wird dann über Gamma-amino Buttersäure zu Glutamat verstoffwechselt . Auf diesem Wege können nicht nur Ausbeuteverluste entstehen, sondern auch α-Ketoglutarat und Glutamat synthetisiert werden, was eine Steuerung des Fermentationsprozesses über Glutamatsupplementierung unmöglich macht. Deshalb ist die zusätzliche Deletion des Gens uga2, welches für die Succinat-semialdehyd Dehydrogenase kodiert, im Rahmen eines optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure vorteilhaft.
Glyoxylat, welches für den Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig ist, kann nicht nur aus der durch die Isocitrat-Lyase katalysierten Reaktion, wobei Isocitrat in Succinat und Glyoxylat gespalten wird, entstehen, sondern auch durch die Reaktion der Alanin- Glyoxylat-Aminotransferase. Dieses Enzym katalysiert die Entstehung von Glyoxylat und Alanin ausgehend von Pyruvat und Glycin. Wenn Glyoxylat nicht zwingend aus der Isocitrat-Lyase Reaktion zur Verfügung gestellt werden muss, kann der Umlauf des Glyoxylat-Zyklus auch durch die Reaktion der Alanin-Glyoxylat-aminotransferase Reaktion, durch welche Glyoxylat bereitgestellt wird, gewährleistet werden. In diesem Fall ist die Isocitrat-Lyase Aktivität, durch welche das angestrebte Produkt Succinat entsteht, nicht für den Umlauf des Glyoxylatzyklus nötig, was zur Folge hat, dass die Hefe zum Teil die durch die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase katalysierte Alternativ- Reaktion zur Glyoxylat-Synthese nutzt. Dabei entsteht kein Succinat, was zu Ausbeuteverlusten führt. Deshalb ist die zusätzliche Deletion des Gens agxl, welches für die Alanin-Glyoxylat-aminotransferase kodiert, im Rahmen eines optimierten Produktionsprozesses zur Herstellung von Bernsteinsäure vorteilhaft. Die idhl Deletion führt nicht zu einem vollständigen Verschwinden der Isocitrat- Dehydrogenase Aktivität. Der Grund hierfür sind 3 weitere Isoenzyme der Isocitrat- Dehydrogenase, welche den Wegfall des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene IDHl und IDH2, bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat kompensieren können. Zusätzlich zur Deletion des Gens idhl muss mindestens noch das Gen idpl, welches für ein Isoenzym der Isocitrat-Dehydrogenase kodiert, deletiert werden, um die Isocitrat- Dehydrogenase Aktivität auf Glucose vollständig zu unterbinden. Die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität hat den Vorteil, dass sämtlicher Kohlenstoff im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus in Richtung Bernsteinsäure umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat abfließen kann, was zu Ausbeuteverlusten führen würde.
Zusammengefasst können Ausbeuteverluste bei der biotechnischen Herstellung von Bernsteinsäure in Hefe minimiert bzw. reduziert werden, indem die Gene sdhl, agxl, uga2 und idpl zusätzlich zu den Genen sdh2 und idhl deletiert werden.
Dazu wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die Deletionskassette loxP- kanMX-loxP durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden aus dem Vektor pUG6 (Guldener et al. 1996) amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP. Als Primer wurden Oligonukleotid- Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz zu Beginn und am Ende des nativen Locus der zu deletierenden Gene {sdhl, agxl, uga2, idpl) enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' der zweiten loxP Region. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment loxP-kanMX-loxP amplifiziert wird und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den zu deletierenden Genlocus der Hefe integriert.
Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418 (kodiert durch kanMX). Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen und so eine weitere Nutzung des kanMX Markers zu ermöglichen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener et al. 1996)transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz- Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP- Sequenzen am deletierten Genlocus (sdhl, agxl, uga2, idpl) zurückbleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten. So wurden iterativ alle zu deletierenden Gene (sdhl, agxl, uga2, idpl) deletiert.
Tabelle 1 zeigt exemplarisch die Ausbeuteerhöhungen durch oben beschriebene Deletionen nach Kultivierung der in der Tabelle angegebenen Stämme für 72 Stunden in WM8-Medium (Lang und Looman, 1995) mit 3,52 g/l Ammoniumsulfat und 0,05 M Na2HPO4 und 0,05 M NaH2PO4 als Pfuffer, sowie mit Histidin lOOmg/1, Leucin 400mg/l, Uracil lOOmg/1. Die C-Quelle war 5% Glucose. Es wurde l%ig aus einer 48h Vorkultur angeimpft. Kultiviert wurde in 100 ml Schüttelkolben auf einem Schüttelinkubator bei 30°C und 150 rpm.
Da Stamm 5 und 6 nicht in Medium ohne Glutamat wächst wurde mit diesen Stämmen zunächst Biomasse generiert in 75 ml Standard WM8 Medium mit NaGlutamat und Glucose 5% in 250 ml Schikanekolben. Die Zellen wurden gewaschen und in dem oben angegebenen Medium zur Weiterkultivierung resuspendiert.
Tabelle 1 : Succinat Titer nach 72 Stunden Kultivierung der angegebenen Stämme in WM8-Medium unter den oben beschriebenen Bedingungen
In Tabelle 1 ist zu sehen, dass sämtliche vorgenommenen Deletionen zu einer im Vergleich zum Wildtyp höheren Succinatmenge im Kulturüberstand fuhren. Die Quadrupeldeletionsmutante AH22uτa3Δsdh2AsdhlΔidhlΔidp] reichert die höchste Menge an Succinat an. Entsprechende Ergebnisse lassen sich auch mit anderen Mikroorganismen bzw. Hefen erhalten.
Beispiel 3: Herstellung eines Mikroorganismus zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren, welcher einen effizienteren Herstellungsprozess durch Reduzierung von Nebenproduktbildung , insbesondere von Ethanol und Acetat ermöglicht.
Die Gärung ist weiterer wesentlicher Aspekt, welcher sich bei der biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure nachteilig auswirkt, da sie zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte führt. In diesem Zusammenhang ist vor allem die Bildung von Acetat und Ethanol problematisch, da sie zu gravierenden Ausbeuteverlusten führt.
Eine Möglichkeit die alkoholische Gärung, also die Bildung von Ethanol zu vermeiden, ist das Ausschalten der Ethanol Biosynthese ausgehend von Pyruvat. Dadurch wird auch die Acetatbildung über Acetaldehyd vermieden. Hierzu muss die Pyruvat- Decarboxylase Aktivität abgeschaltet werden, welche in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch 3 Pyruvat-Decarboxylase Isoenzyme, kodiert von den Genen PDCl1 PDC5 und PDC6, katalysiert wird. Das Gen PDC2 kodiert für einen transkriptionellen Induktor, welcher vor allem für die Expression der Gene PDCl und PDC5 verantwortlich ist. Das Gen PDC2 bietet also die Möglichkeit mit nur einer einzelnen Deletion den Hauptanteil der Pyruvat-Decarboxylase Aktivität, welche von 3 Genen kodiert wird, in der Zelle abzuschaffen. Dies hat den großen Vorteil, dass somit die problematische Ethanolbildung mit nur einer einzelnen Modifikation im Metabolismus der Hefe vermieden werden kann.
Dies kann durch Deletion des Gens PDC2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erreicht werden. Da diese Deletion zu einem stark eingeschränkten Wachstum auf
Glucose führt, kann dem Gen PDC2 ein induzierbarer Promotor vorgeschaltet werden.
Der induzierbare Promotor wird während der Wachstumsphase durch Zugabe eines
Induktors zum Kulturmedium induziert, wodurch das nachgeschaltete Gen PDC2 ausreichend transkribiert wird und ein Wachstum der Hefekultur gewährleistet ist. Ist der Induktor aufgebraucht ist kein weiteres Wachstum möglich und die Produktionsphase ohne Nebenproduktbildung in Form von Ethanol und Acetat wird eingeleitet.
Als induzierbarer Promotor wurde der CUPl -Promotor gewählt und chromosomal vor den „open reading frame" des Gens PDC2 integriert, so dass dieses unter der Kontrolle des durch Kupfer induzierbaren CUPl -Promotors steht.
Dazu wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die CUPl -Promotorkassette durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP-CUPlpr. Als Primer wurden Oligonukleotid-Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz des nativen Promotors des PDC2-Gens enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP-Region und 3' des CUPlprom. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment inklusive kanMX und CUPl- Promotor amplifiziert werden und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den PDC2-Genlocus der Hefe, vor den codierenden Bereich des Gens PDC2, integriert.
Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418. Der resultierende Stamm enthält eine Kopie des Genes PDC2 unter der Kontrolle des Kupfer-regulierten CUPl-
Promotors und des nativen P/JO-Terminators. Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47(Guldener et al. 1996)transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz- Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen und die CUPl -Promotorkassete vor der codierenden Sequenz des Gens PDC2 enthalten bleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418 -Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5-Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
Beispiel 4: Herstellung eines Mikroorganismus zur biotechnologischen Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren, welcher eine Trennung von Wachstum und Produktionsphase über Glutamat
Supplementierung ermöglicht.
Im Folgenden wird eine Möglichkeit der Trennung von Wachstums- und Produktionsphase, welche nicht den Einsatz von Antibiotika erforderlich macht, beschrieben. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist trotz der Deletionen der Gene sdh2 und idhl, welche zu einer Unterbrechung des Citratzyklus führen (siehe Figur 1 schwarze Kreuze), eine Wachstumsrate, derer einer unmodifizierten Wildtyphefe vergleichbar, zu messen (im 100 ml Schüttelkolben in YPD-Medium hat der Stamm AΑ22\xra3Asdh2Mdhl eine im Vergleich zu Stamm AH22ura3 (Wildtyp) nur um 11% geringere Wachstumsrate, Quelle: eigene Daten). Ein Wachstum eines Hefestammes mit einer idhl Deletion ist nUr möglich, da diese Deletion nicht zu einem vollständigen Verschwinden der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität führt. Der Grund hierfür sind 3 weitere Isoenzyme der Isocitrat- Dehydrogenase, welche den Wegfall des dimeren Hauptenzyms, kodiert durch die Gene IDHl und IDH2, bezüglich der Bildung von α-Ketoglutarat kompensieren können. Die Synthese von α-Ketoglutarat ist für ein Wachstum der Hefezelle auf Minimalmedien zwingend erforderlich, da aus diesem Intermediat die Aminosäure Glutamat gebildet wird, ohne die kein Wachstum möglich ist.
In einem 2-stufigen Fermentationsprozess zur Herstellung von Bernsteinsäure mit Hefe ist die effektive Trennung von Wachtums- und Produktionsphase also nur durch die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität im Produktionsstamm möglich, weil dadurch eine Glutamat-Auxotrophie gewährleistet ist, was zur Folge hat, dass die Hefe in Medium ohne supplementiertem Glutamat kein Wachstum aufweist. Dies kann genutzt werden, um über die Supplementierung von Glutamat zum Kulturmedium den Fermentationsprozess zu steuern. Über die Menge des zugegeben Glutamats zum Kulturmedium kann die Dauer der Wachstumsphase, sowie die angestrebte Zelldichte in dieser Phase effektiv gesteuert werden. Mit zunehmender Menge nehmen auch Dauer und Zelldichte zu.
Ist das Glutamat im Kulturmedium verbraucht ist kein weiteres Wachstum möglich und sämtlicher Kohlenstoff kann effektiv zur Synthese von Bernsteinsäure genutzt werden, deren Bildung dann nicht in Konkurrenz zur Bildung von Biomasse steht. Dies trägt ganz wesentlich zur Ausbeuteerhöhung und zur Steigerung der Effizienz des Produktionsprozesses bei. Diese Trennung von Wachstums- und Produktionsphase im Fermentationsprozess auf Glucose und anderen fermentierbaren Kohlenstoffquellen über die Supplementierung von Glutamat kann nur realisiert werden, wenn zusätzlich zur Deletion des Gens idhl mindestens noch das Gen idpl, welches für ein Isoenzym der Isocitrat-Dehydrogenase kodiert, deletiert wird. Nur die vollständige Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität gewährleistet die dafür nötige Glutamat-Auxotrophie. Ein weiterer Vorteil der vollständigen Unterbindung der Isocitrat-Dehydrogenase Aktivität liegt darin begründet, dass so sämtlicher Kohlenstoff im respirativen System der Hefe in den Glyoxylatzyklus in Richtung Bernsteinsäure umgeleitet wird und nicht zu α-Ketoglutarat abfließen kann, was zu Ausbeuteverlusten führen würde (siehe Figur 1 e.)).
Dazu wurde die kodierende Nukleinsäuresequenz für die Deletionskassette loxP- kanMX-loxP durch PCR unter Verwendung von Standardmethoden aus dem Vektor pUG6 (Guldener et al. 1996) amplifiziert, so dass das resultierende Fragment aus folgenden Komponenten besteht: loxP-kanMX-loxP. Als Primer wurden Oligonukleotid- Sequenzen ausgewählt, die an den 5' und 3' Überhängen je die 5' oder die 3' Sequenz zu Beginn und am Ende des nativen Locus des zu deletierenden Gens idpl enthalten und im annealenden Bereich die Sequenzen 5' der loxP -Region und 3' der zweiten loxP Region. So ist gewährleistet, dass einerseits das gesamte Fragment loxP-kanMX-loxP amplifiziert wird und anderseits dieses Fragment anschließend in Hefe transformiert werden kann und durch homologe Rekombination dieses gesamte Fragment in den zu deletierenden Genlocus der Hefe integriert.
Als Selektionsmarker dient die Resistenz gegen G418 (kodiert durch kanMX). Um die Resistenz gegen G418 anschließend wieder zu entfernen und so eine weitere Nutzung des kanMX Markers zu ermöglichen, wird der entstandene Hefestamm mit dem cre Rekombinase Vektor pSH47 (Guldener et al. 1996)transformiert. Durch diesen Vektor wird die cre Rekombinase in der Hefe exprimiert, was zur Folge hat, dass der Sequenz- Bereich innerhalb der beiden loxP-Sequenzen heraus rekombiniert. Dies hat zur Folge, dass lediglich eine der beiden loxP-Sequenzen am deletierten Genlocus idpl zurückbleibt. Die Folge ist, das der Hefestamm die G418-Resistenz wieder verliert und damit geeignet ist, weitere Gene mittels dieses cre-lox Systems in den Hefestamm zu integrieren bzw. zu entfernen. Der Vektor pSH47 kann daraufhin durch eine Gegenselektion auf YNB-Agarplatten supplimentiert mit Uracil (20 mg/L) und FOA (5- Fluoroorotic acid) (1 g/L) wieder entfernt werden. Dazu müssen die Zellen, die dieses Plasmid tragen, zunächst unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert werden und anschließend auf FOA-haltigen Selektivplatten angezogen werden. Unter diesen Bedingungen können lediglich Zellen wachsen, die nicht in der Lage sind, Uracil selbst zu synthetisieren. Dies sind in diesem Fall Zellen, die kein Plasmid (pSH47) mehr enthalten.
Der Produktionsstamm AH22ura3AsdhJAsdh2AidhlAidpl wurde auf seine Wachstumseigenschaften mit und ohne supplementiertem Glutamat evaluiert. Als Referenzstamm wurde AH22um3Asdhl Asdh2Aidhl , also der Stamm ohne zusätzliche Deletion von idpl, mitgeführt.
Die beiden Stämme wurden in 20 ml WM8-Medium in 100 ml Kolben einmal mit 3,52 g/l Ammoniumsulfat (als Sticksstoffquelle) und 0,05 M K2HPO4, sowie 0,05 M KH2PO4 als Pfuffer und in Standard WM8-Medium (Lang and Looman 1995), welches 10 g NaGlutamat als Stickstoffquelle enthält, kultiviert. Nach 64 h wurde die optische Dichte der 4 Kulturen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Optische Dichte der angegebenen Stämme nach 64 stündiger Kultivierung in WM8 Medium mit und ohne Glutamat. Im Medium ohne Glutamat wurde NH3SO4 als Stickstoff uelle su lementiert.
In Tabelle 2 ist zu sehen, daß die zusätzliche Deletion von idpl in einem idhl Stamm zu einer Glutamat Auxotrophie auf Glucose führt, da der Stamm AH22ma3Asdh2AsdhlAidhlAidpl in Medium ohne Glutamat im Gegensatz zu kein Wachstum mehr aufweist. Die singuläre Deletion von idhl führt nicht zu einer Glutamat Auxotrophie. Die Trennung von Wachstums- und Produktionsphase in einem 2-stufigen Produktionsprozess zur Herstellung von Bernsteinsäure und anderen organischen Säuren auf Glucose über Glutamat- Supplementierung ist nur in einem Stamm mit den deletierten Genen idhl und idpl möglich. Wenn eine weitere Stickstoffquelle, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, zugegeben wird ist ein Wachstum einer AidhlAidpl Mutante in Minimalmedium schon ab sehr geringen Mengen an supplementiertem Glutamat möglich (etwa 20 mg/1).

Claims

Patentansprüche:
1. Isolierter genetisch veränderter Mikroorganismus, wobei gegenüber dem wild-Typ a) die Gene idhl und idpl deletiert oder inaktiviert sind, und/oder b) die Gene sdh2 und sdhl deletiert oder inaktiviert sind, und/oder c) das Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert ist oder unter der Kontrolle eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimierbaren oder induzierbaren Promotors steht, und/oder d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICLl, MLSl, ACSl und MDH3 ersetzt oder ergänzt ist durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem Crabtree negativen Organismus.
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei zusätzlich zu den Genen idhl und idpl eines der Gene idp2 oder idp3, oder beide Gene, deletiert oder inaktiviert ist/sind.
3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, wobei zusätzlich zu den Genen sdh2 und sdhl eines der Gene uga2 oder agxl, oder beide Gene, deletiert oder inaktiviert ist/sind.
4. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der dem Gen PDC2 vorgeschaltete Promotor ein induzierbarer Promotor, beispielsweise CUPl , ist.
5. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der dem Gen PDC2 vorgeschaltete Promotor ein reprimierbarer Promotor, beispielsweise der Tetracyclin-regulierte tetO-Promotor, ist.
6. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das fremde Gen aus einem Crabtree negativen Organismus aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Anaerobiospirillum, Actinobacillus, Mannheimia, Rhyzopus Corynebacterium, Schizosaccharomyces, Wickerhamia, Debayomyces, Hansenula,
Hanseniaspora, Pichia, Kloeckera, Candida, Ogataea, Kuraishia, Komagataella, Yarrowia, Metschnikowia, Williopsis, Nakazawaea, Kluyveromyces, Cryptococcus, Torulaspora, Bullera, Rhodotorula, Willopsis, Kloeckera, Trichosporon, Yamadazmya und Sporobolomyces stammt.
7. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das fremde Gen unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors, beispielsweise des ADHl -Promotors, steht.
8. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Mikroorganimus eine Hefe, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces, Saccharomycecopsis, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Wickerhamia, Debayomyces, Hansenula, Hanseniaspora,
Pichia, Kloeckera, Candida, Zygosaccharomyces, Ogataea, Kuraishia, Komagataella, Yarrowia, Metschnikowia, Williopsis, Nakazawaea, Kluyveromyces, Cryptococcus, Torulaspora, Bullera, Rhodotorula, Willopsis, Kloeckera und Sporobolomyces, ist.
9. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung einer organischen Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus, insbesondere einer organischen Dicarbonsäure, vorzugsweise von Bernsteinsäure.
10. Verwendung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Verfahren zur Herstellung einer organischen Carbonsäure des Glyoxylat- und/oder Zitrat-Zyklus, insbesondere einer organischen Dicarbonsäure, vorzugsweise von Bemsteinsäure, mit den folgenden Verfahrenstufen:
A) in einer Wachstumsverfahrensstufe wird der Mikroorganismus unter vorzugsweise aeroben Bedingungen kultiviert und vermehrt, optional unter Zugabe einer Induktorsubstanz zur Induktion des induzierbaren Promotors und/oder von Glutamat, B) anschließend wird der Mikroorganismus in einer Produktionsphase unter vorzugsweise anaeroben Bedingungen kultiviert, optional unter Zugabe einer Induktorsubstanz zur Repression des reprimierbaren Promotors, C) anschließend an die Stufe B) oder während der Stufe B) wird die
Carbonsäure aus dem Kulturüberstand abgetrennt und optional aufgereinigt.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Stufe A) bis zu einer Zelldichte von zumindest 100 g Biotrockenmasse/l, vorzugsweise zumindest 120 g Biotrockenmasse/l, höchstvorzugsweise zumindest 140 g Biotrockenmasse/l, durchgeführt wird.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei die Stufe B) bis zu einer Carbonsäurekonzentration von zumindest 0,4 Mol/l, vorzugsweise zumindest 0,8 Mol/l, höchstvorzugsweise zumindest 1,0 Mol/l, durchgeführt wird.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Stufe A) bei einer Temperatur von 20 bis 35 0C, vorzugsweise von 28 bis 30 0C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt wird.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Stufe B) bei einer Temperatur von 15 bis 40 0C, vorzugsweise von 20 bis 35 0C, und für eine Dauer von 1 bis 1000 h, vorzugsweise 2 bis 500 h, höchstvorzugsweise 2 bis 200 h, durchgeführt wird.
15. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei a) die Gene idhl und idpl deletiert oder inaktiviert werden, und/oder b) die Gene sdh2 und sdhl deletiert oder inaktiviert werden, und/oder c) das Gen PDC2 deletiert oder inaktiviert wird oder unter die Kontrolle eines durch Exposition des Mikroorganismus mit einer Induktorsubstanz reprimierbaren oder induzierbaren Promotors gestellt wird, und/oder d) eines oder mehrere Gene aus der Gruppe bestehend aus ICLl, MLSl, ACSl und MDH3 ersetzt oder ergänzt werden durch ein entsprechendes fremdes Gen bzw. entsprechende fremde Gene aus einem Crabtree negativen Organismus.
EP09748218A 2008-10-17 2009-10-07 Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure Withdrawn EP2344656A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008051727A DE102008051727A1 (de) 2008-10-17 2008-10-17 Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure
PCT/DE2009/001386 WO2010043197A1 (de) 2008-10-17 2009-10-07 Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2344656A1 true EP2344656A1 (de) 2011-07-20

Family

ID=41478558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP09748218A Withdrawn EP2344656A1 (de) 2008-10-17 2009-10-07 Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20110300595A1 (de)
EP (1) EP2344656A1 (de)
JP (1) JP2012505638A (de)
KR (1) KR20110071128A (de)
CN (1) CN102257152A (de)
BR (1) BRPI0919826A2 (de)
DE (1) DE102008051727A1 (de)
RU (1) RU2011119763A (de)
WO (1) WO2010043197A1 (de)
ZA (1) ZA201103570B (de)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012103261A2 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Finley Kenneth R Compositions and methods for succinate production
TWI555800B (zh) 2011-04-04 2016-11-01 拜耳材料科學股份有限公司 聚胺基甲酸酯脲分散體
US9850507B2 (en) 2012-07-25 2017-12-26 Cargill, Incorporated Yeast cells having reductive TCA pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous NAD(P)+ transhydrogenase enzyme
US11072807B2 (en) 2012-09-14 2021-07-27 Ptt Global Chemical Public Company Limited Production of organic acids by fermentation of genetically engineered yeast cells at low pH
WO2014179748A2 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for fungal lipid production
ES2716126T3 (es) 2015-03-06 2019-06-10 Covestro Deutschland Ag Dispersión acuosa de poliuretano-urea que contiene grupos ácidos libres
EP3109269B1 (de) 2015-06-25 2018-10-31 Covestro Deutschland AG Harnstofffreie polyurethan-dispersionen
CN107849557B (zh) * 2015-08-06 2021-11-05 花王株式会社 新型启动子
CN105838632B (zh) * 2016-05-19 2019-05-10 江南大学 一种产琥珀酸的酿酒酵母基因工程菌及其应用
KR101954530B1 (ko) * 2017-09-13 2019-05-23 경희대학교 산학협력단 메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도
US10858661B2 (en) 2017-01-10 2020-12-08 University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University Use of Methylomonas sp. DH-1 strain and its transformants
KR20200023451A (ko) 2017-06-30 2020-03-04 피티티 글로벌 케미칼 피씨엘 숙신산 생성이 증가된 유전자 변형 효모
EP3636321A1 (de) 2018-10-10 2020-04-15 Covestro Deutschland AG Zumindest teilweise aus erneuerbaren quellen stammende polyurethanharnstoffdispersionen sowie deren herstellung und verwendung
EP3889196A1 (de) 2020-03-31 2021-10-06 Covestro Deutschland AG Biobasierte polyurethan-dispersionen für sonnenschutz-anwendungen
EP3888627A1 (de) 2020-03-31 2021-10-06 Covestro Deutschland AG Biobasierte polyurethan-dispersionen für dekorative kosmetische anwendungen
FR3137832A1 (fr) 2022-07-13 2024-01-19 L'oreal Emulsion huile-dans-eau comprenant un polyuréthanne et une charge spécifiques
FR3142671A1 (fr) 2022-12-06 2024-06-07 L'oreal Composition présentant une stabilité accrue

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143834A (en) 1986-06-11 1992-09-01 Glassner David A Process for the production and purification of succinic acid
US5869301A (en) 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
AU737640B2 (en) 1996-12-12 2001-08-23 Universiteit Van Amsterdam Methods for modulating metabolic pathways of micro-organisms and micro-organisms obtainable by said methods
JP3942718B2 (ja) * 1997-07-17 2007-07-11 宝ホールディングス株式会社 酒類、食品の製造方法
KR100372218B1 (ko) 2000-06-29 2003-02-14 바이오인포메틱스 주식회사 유기산을 생산하는 균주 및 이를 이용한 유기산의 생산방법
US7262046B2 (en) * 2004-08-09 2007-08-28 Rice University Aerobic succinate production in bacteria
DE102007019184A1 (de) 2007-04-20 2008-10-23 Organo Balance Gmbh Mikroorganismus zur Herstellung von Bernsteinsäure

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; 5 June 1993 (1993-06-05), HASELBECK R J ET AL: "Function and expression of yeast mitochondrial NAD- and NADP-specific isocitrate dehydrogenases.", Database accession no. NLM8099357 *
HASELBECK R J ET AL: "Function and expression of yeast mitochondrial NAD- and NADP-specific isocitrate dehydrogenases.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 5 JUN 1993 LNKD- PUBMED:8099357, vol. 268, no. 16, 5 June 1993 (1993-06-05), pages 12116 - 12122, ISSN: 0021-9258 *
See also references of WO2010043197A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201103570B (en) 2012-01-25
BRPI0919826A2 (pt) 2015-08-18
WO2010043197A1 (de) 2010-04-22
JP2012505638A (ja) 2012-03-08
DE102008051727A1 (de) 2010-04-22
US20110300595A1 (en) 2011-12-08
CN102257152A (zh) 2011-11-23
RU2011119763A (ru) 2012-11-27
KR20110071128A (ko) 2011-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2344656A1 (de) Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure
EP2150619B1 (de) Mikroorganismus zur herstellung von bernsteinsäure
EP3080252B1 (de) Hefestämme und verfahren zur produktion von -hydroxyfettsäuren und dicarbonsäuren
JP4963488B2 (ja) 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
JP2012506716A (ja) グリセロールを化学物質に変換するための微好気性培養
US9328358B2 (en) Method of producing 2, 3-butanediol using recombinant yeast
WO2009046929A2 (de) Biotechnologische fixierung von kohlenstoffdioxid
US20060257983A1 (en) Metabolically engineered micro-organisms having reduced production of undesired metabolic products
WO2009143495A2 (en) Fast-growing yeast
KR20200040585A (ko) 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
KR102078715B1 (ko) 젖산 생산이 향상된 형질전환된 미생물
KR102548752B1 (ko) 마이코스포린 유사 아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법
WO2023168244A1 (en) Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate
CN110997702A (zh) 具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母
KR101773123B1 (ko) 2,3-부탄다이올 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 방법
US20120045803A1 (en) Method for production of substance in candida utilis using xylose as carbon source
DE102021113602A1 (de) Gentechnisch veränderte hefe zur biotechnologischen herstellung von bernsteinsäure aus glycerol
CN112204146B (zh) 具有受抑制的乙醇产生途径的耐酸酵母及使用其生产乳酸的方法
Wang et al. Construction of a Zygosaccharomyces rouxii strain overexpressing the QOR gene for increased HDMF production
KR101763820B1 (ko) 글리세롤의 생성이 억제된 2,3-부탄다이올이 생산방법
WO2023168233A1 (en) Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate
KR20150018227A (ko) 외인성 푸마라아제 유전자를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 c4 디카르복실산의 생산 방법
CN116262929A (zh) 一种工程菌的构建方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20110509

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA RS

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: RAAB, ANDREAS

Inventor name: LANG, CHRISTINE

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20120806

17Q First examination report despatched

Effective date: 20120806

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20130122