EP2021509A2 - Procédé et méthodes de détection de la maladie d'alzheimer - Google Patents

Procédé et méthodes de détection de la maladie d'alzheimer

Info

Publication number
EP2021509A2
EP2021509A2 EP07766039A EP07766039A EP2021509A2 EP 2021509 A2 EP2021509 A2 EP 2021509A2 EP 07766039 A EP07766039 A EP 07766039A EP 07766039 A EP07766039 A EP 07766039A EP 2021509 A2 EP2021509 A2 EP 2021509A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alteration
genes
disease
alzheimer
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07766039A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabien Schweighoffer
Laurent Bracco
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diaxonhit SA
Original Assignee
ExonHit Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ExonHit Therapeutics SA filed Critical ExonHit Therapeutics SA
Publication of EP2021509A2 publication Critical patent/EP2021509A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present application relates to methods and compositions useful for detecting Alzheimer's disease in mammals, particularly humans. She notably described serum markers of Alzheimer's disease and their uses in Alzheimer's disease. diagnostic methods. It also relates to tools and / or kits that can be used to implement these methods (reagents, probes, primers, antibodies, chips, cells, etc.), their preparation and their uses.
  • the invention is useful for detecting the presence or progression of Alzheimer's disease in mammals, including in the early phase.
  • Alzheimer's disease is the leading cause of dementia and the most common neurodegenerative disease. This progressive disease is characterized by memory loss and a deterioration of language, orientation and judgment skills. The nature of the symptoms, often confused with the physiological inconvenience related to old age, their severity as well as the age of their appearances, varies according to the individuals. This contributes to the difficulty of establishing a diagnosis at the early stages of the disease.
  • Intracellular neurofibrillary aggregations of tau protein appear to correlate well with the severity of dementia.
  • Senile plaques formed by intra and extracellular aggregation of beta-amyloid peptide characterize regions of neuronal and glial cell alterations. It is noteworthy, however, that these aggregation zones do not correspond to sites of synaptic depletion characteristic of the decline of cognitive functions.
  • APP amyloid precursor protein, precursor of beta amyloid peptide
  • PS1 and PS2 presenilins 1 and 2
  • oxidative stress which can be induced in particular by the amyloid beta peptide and modulated by the metabolism of cholesterol; - changes in calcium flux and excitotoxicity.
  • Alzheimer's disease would be characterized by an alteration of different integration systems regulating homeostasis, the involvement of certain neurons resulting in both an inflammatory reaction involving the immune system and changes in endocrine regulation. The latter in turn have an impact on the activity and viability of other neurons and on immune functions, these cascade reactions highlighting the role not only of neurodegeneration but also of hormonal regulation and immune response in the progression of Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease there is currently no robust and specific signature of Alzheimer's disease, likely to establish a diagnosis of this pathology, including different stages of the evolution of the disease.
  • the provision of a diagnostic test effective, particularly early, would allow patients to be managed early in the disease, and thus benefit from a more effective and more appropriate treatment, including acetylcholinesterase inhibitors such as tacrine, donepezil and rivastigmine under optimal conditions.
  • the present invention provides an answer to this need.
  • the invention notably describes the identification of serum markers of Alzheimer's disease, allowing the development of effective diagnoses and predictive of the presence, stage or risk of developing this disease.
  • the invention thus describes the identification of molecular signatures specifically or preferentially expressed in the blood of patients suffering from Alzheimer's disease, resulting in particular from alternative splicing.
  • the present application demonstrates the existence, at the blood cell level of patients suffering from Alzheimer's disease, of a deregulation of the internal clock and of molecular signaling pathways involved in phagocytosis and / or oxidative stress.
  • the invention can therefore propose, for the first time, tools and methods for diagnosing, predicting and / or monitoring the progression of Alzheimer's disease, based on a measurement, in the blood of subjects, of the patient. expression of one or more genes selected from circadian rhythm regulated genes and genes involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress. The presence of deregulation in the expression of such genes makes it possible to establish the risk or predisposition to Alzheimer's disease, or to confirm the presence of this pathology in a subject.
  • An object of the invention thus lies in a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or the risk of developing Alzheimer's disease in a mammal, comprising determining the presence, in a biological sample of the mammal, of preferably in a sample (derived) of blood, an alteration in one or more genes or RNAs selected from circadian-regulated genes and genes involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress, the presence of such alteration being indicative of the presence or risk of developing Alzheimer's disease in this mammal.
  • Another subject of the invention relates to a method for evaluating or monitoring the efficacy of a treatment of Alzheimer's disease, comprising a step of measuring the expression of one or, preferably, several genes chosen from circadian-regulated genes and genes involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress, during treatment, and a comparison of the expression thus measured with that measured at an earlier stage of treatment.
  • Another subject of the invention relates to an improvement in the methods of treating Alzheimer's disease, the improvement of measuring the expression of one or, preferably, several genes chosen from the circadian rhythm regulated genes. and genes involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress in a subject before and / or during treatment.
  • the measure of the expression makes it possible to adapt the treatment according to the evolution of the pathology.
  • the treatment is typically treatment with acetylcholinesterase inhibitors, such as tacrine, donepezil and rivastigmine.
  • Another object of the invention is the use of an acetylcholinesterase inhibitor, such as tacrine, donepezil and rivastigmine, for the preparation of a medicament for treating Alzheimer's disease in a patient with deregulation the expression of a gene (at least) as defined above.
  • an acetylcholinesterase inhibitor such as tacrine, donepezil and rivastigmine
  • the alteration in a gene or RNA for the purposes of the invention means (i) any alteration of the expression, namely in particular a deregulation in the levels of expression (eg, transcription or translation), a deregulation of splicing, leading, for example, to the appearance of particular spliced forms or to a change in the (relative) amount or ratio between the different forms of splicing, as well as (ii) any alteration in the structure of the protein produced (appearance or disappearance of truncated, elongated, mutated forms, etc.).
  • the present application describes the identification of splicing deregulations of the actors of the signaling cascades involved in the circadian rhythm and in the regulation of phagocytosis or oxidative stress in the blood of patients. with Alzheimer's disease.
  • Any molecule or technique making it possible to measure the expression of these genes in the blood may be used in the context of the present invention, such as nucleotide primers, nucleotide probes or specific antibodies, which may be in suspension or under form immobilized, as will be described in detail in the following text.
  • another object of the present application relates to a product comprising a support on which are immobilized nucleic acids comprising a complementary sequence and / or specific to one or, preferably, several genes or RNA as defined above.
  • the product comprises separate nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more genes or RNA as defined above.
  • Another object of the present application relates to a product comprising a support on which is immobilized at least one ligand of a polypeptide encoded by a gene or an RNA as defined above.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different polypeptide ligands selected from the polypeptides mentioned above.
  • kits comprising a compartment or container comprising at least one, preferably several, nucleic acids comprising a sequence complementary to and / or specific to one or more genes or RNAs as defined previously and / or a , preferably several ligands of one or more polypeptides as defined above.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more nucleic acids and / or different ligands selected from the nucleic acids and ligands mentioned above.
  • the kit may also include reagents for a hybridization or immunological reaction, as well as, if appropriate, controls and / or instructions.
  • Another subject of the invention relates to the use of a product or kit as defined above for the detection of Alzheimer's disease in a mammalian subject, preferably a human subject.
  • the present invention is based on the demonstration and characterization of serum biological events characteristic of Alzheimer's disease in a human patient. These events constitute biomarkers, the detection of which in a patient makes it possible, preferably in combination, to determine, even at an early stage, the risk of developing such a disease, the presence of such a disease, or the stage of development. of this disease.
  • the markers according to the invention can also be used to measure the effectiveness of a treatment, and / or to select candidate drugs.
  • the marker combinations of the invention can make it possible to distinguish Alzheimer's disease from other neurodegenerative pathologies.
  • the identified biological events typically correspond to changes in the regulation of gene expression. It may be a partial or total inhibition of the expression of genes or RNA, or certain forms of genes or RNA, an increase in the expression of genes or certain forms of genes or RNA, the appearance or disappearance of gene splicing forms, etc.
  • the term "gene regulated according to a circadian rhythm” means any gene whose expression is regulated by the internal biological clock. It is in particular any RNA or protein whose expression or activity is regulated according to a chronological rhythm, for example a periodicity of 24 hours.
  • the circadian rhythm is controlled by a "biological clock” (the suprachiasmic nucleus) located in hypothalamus. She is dependent on other biological clocks, controlling among other things the body's thermal rhythm or the synthesis of hormones.
  • a circadian rhythm for the implementation of the invention, mention may be made in particular of all the genes mentioned in Table 1.
  • a particular object of the invention thus resides in a method for detecting (in vitro or ex vivo) the presence or the risk of developing Alzheimer's disease in a mammal, including determining the presence in a sample. mammalian biology, preferably in a sample (derivative) of blood, an alteration in one or more genes shown in Table 1, or in the corresponding RNAs, in particular an alteration of the splicing of such a gene or RNA, the presence of such alteration being indicative of the presence or risk of developing Alzheimer's disease in this mammal.
  • the method of the invention comprises at least the determination of the presence, in a biological sample of the mammal, preferably in a sample (derived) of blood, of an alteration in the BMAL1 gene. or CLOCK, or in a corresponding RNA, in particular an alteration of the splicing of such a gene or RNA.
  • the term "gene involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress” is intended to mean any gene whose expression product participates in the mechanism of phagocytosis or oxidative stress in blood cells.
  • Phagocytosis is the mechanism by which certain living cells encompass and digest certain foreign particles.
  • Another particular object of the invention thus lies in a method for detecting
  • the presence or risk of developing, Alzheimer's disease in a mammal including determining the presence, in a biological sample of mammal, preferably in a sample (derived) from blood, an alteration in one or more genes indicated in Table 2, or in the corresponding RNAs, in particular an alteration of the splicing of such gene or RNA, the presence of such alteration being indicative of the presence or risk of developing Alzheimer's disease in this mammal.
  • the method of the invention comprises at least the determination of the presence, in a biological sample of the mammal, preferably in a sample (derived) of blood, of an alteration in the gene of L-Plastin or Calnexin, or in a corresponding RNA, in particular an alteration of the splicing of such a gene or RNA.
  • the invention is based on the combined detection of an alteration in several genes chosen from the genes mentioned above.
  • the term "combined" detection indicates that the alteration of several genes is determined to arrive at an evaluation, this determination being able to be performed simultaneously or not.
  • a particular embodiment of the invention involves the combined detection of an alteration in at least one gene regulated by the circadian rhythm and in at least one gene involved in the regulation of phagocytosis or oxidative stress.
  • the invention is therefore based on the detection, in a sample, of one or more target molecules advantageously chosen from: a) the genes indicated in Tables 1 and 2, or the corresponding RNAs, or a distinctive fragment thereof having at least 15, preferably at least 16, 17, 18, 19, 20, 25 or 30 consecutive bases, b) nucleic acids having a sequence complementary to a sequence according to a), c) functional analogues of nucleic acids according to a) or b), or d) the polypeptides encoded by the nucleic acids according to a) to c).
  • the target molecule may be the complete sequence of the gene or of the RNA or of the corresponding protein, or a distinctive fragment thereof, that is to say a fragment whose sequence is specific for said gene or RNA, or of said protein, and / or comprises a domain of variability (splicing, deletion, polymorphism, etc.) representative of the biological event to be detected.
  • the term "functional analog” refers to an analogue from another mammalian species.
  • the genes indicated in Tables 1 and 2 are human genes, and these sequences constitute effective and adapted markers for the detection of Alzheimer's disease in human patients. Nevertheless, for an application of the methods of the invention to other mammalian species, it is generally preferable to use functional analogues of these sequences, characterized in the species under consideration.
  • These analogs can be identified by any technique known to those skilled in the art, in particular in view of the sequences provided in the application and the names of the corresponding genes.
  • the method comprises determining the presence of at least one nucleic acid according to a) to c).
  • the method is used to detect Alzheimer's disease in a human subject and comprises determining the presence of at least one nucleic acid according to a) or b).
  • an alteration in a gene or RNA for the purposes of the invention means (i) any alteration of the expression, namely in particular a deregulation in the levels of expression (eg, transcription or translation), a deregulation of the splicing, leading for example to the appearance of particular spliced forms or to a modification of the (relative) amount of or ratio between different forms of splicing, as well as (ii) any alteration in the structure of the protein produced (appearance or disappearance of truncated, elongated, mutated forms, etc.).
  • RNA samples are useful in the present invention, such as, for example, Northern blotting, selective hybridization, the use of probed oligonucleotide-coated supports, the amplification of nucleic acid, nucleic acid such as, for example, by RT-PCR, quantitative PCR or ligation-PCR, etc.
  • a nucleic probe eg an oligonucleotide
  • a nucleic probe capable of selectively or specifically detecting the target nucleic acid in the sample.
  • the amplification may be carried out according to various methods known per se to those skilled in the art, such as PCR, CSF, transcription-mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA), NASBA, the use of allele-specific oligonucleotides (ASO), allele-specific amplification, Southern blotting, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • a reference value for example a median or mean value observed in patients who are not suffering from Alzheimer's disease, or at a value measured in parallel in a control sample.
  • a reference value for example a median or mean value observed in patients who are not suffering from Alzheimer's disease, or at a value measured in parallel in a control sample.
  • the method comprises the detection of the presence or absence or the (relative) amount of a nucleic acid according to a) to c) by selective hybridization or selective amplification.
  • nucleic probes preferably immobilized on a support, such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • a support such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, etc.
  • Nucleic probes can be any acid nucleic acid (DNA, RNA, PNA, etc.), preferably single-strand, comprising a specific sequence of a target molecule as defined in a) to c) above.
  • the probes typically comprise from 5 to 400 bases, preferably from 8 to 200, more preferably less than 100, and even more preferentially less than 75, 60, 50, 40 or even 30 bases.
  • the probes may be synthetic oligonucleotides, produced on the basis of the target molecule sequences of the invention according to conventional synthesis techniques. Such oligonucleotides typically have from 10 to 50 bases, preferably from 20 to 40, for example about 25 bases. In a particularly advantageous mode, several different oligonucleotides (or probes) are used to detect the same target molecule. They may be oligonucleotides specific for different regions of the same target molecule, or centered differently on the same region.
  • probes can be designed to hybridize to a region of an exon or intron, or to an exon-exon, exon-intron or intron-intron junction region.
  • the probes make it possible to highlight and distinguish different forms of splicing of a gene.
  • the probes may be synthesized beforehand and then deposited on the support, or synthesized directly in situ, on the support, according to methods known per se to those skilled in the art.
  • the probes can also be manufactured by genetic techniques, for example by amplification, recombination, ligation, etc.
  • the probes thus defined constitute another object of the present application, as well as their uses (essentially in vitro) for the detection of Alzheimer's disease in a subject.
  • Hybridization can be carried out under standard conditions, known to those skilled in the art and adjustable by it (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning,
  • the hybridization can be carried out under conditions of high, medium or low stringency, depending on the level of sensitivity searched, the quantity of material available, etc.
  • suitable hybridization conditions include a temperature of 55 to 63 ° C for 2 to 18 hours.
  • Other hybridization conditions, adapted to high density substrates, are for example a hybridization temperature between 45 and 55 ° C.
  • different washes can be performed to remove unhybridized molecules, typically in SSC buffers comprising SDS, such as a buffer comprising 0.1 to 10 X SSC and 0.5-0.01% SDS.
  • Other wash buffers containing SSPE, MES, NaCl or EDTA may also be used.
  • the nucleic acids are prehybrid in hybridization buffer (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) typically containing 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA. 65 ° C for 30 min.
  • the nucleic acids of the sample are then brought into contact with the probes (typically applied on the support or the chip) at 65 ° C. for 2 to 18 hours.
  • the nucleic acids of the sample are marked beforehand with any known labeling (radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent, etc.).
  • the supports are then washed in 5 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS at 65 ° C.
  • hybridization profile is analyzed according to conventional techniques, for example by measuring the marking on the support by means of a suitable instrument (for example Instantlmager, Packard Instruments).
  • Hybridization conditions can naturally be adjusted by those skilled in the art, for example by modifying the hybridization temperature and / or the saline concentration of the buffer, as well as by adding auxiliary substances such as formamide or simple DNA. strand.
  • a particular object of the invention thus lies in a method for detecting the presence or risk of developing Alzheimer's disease in a mammal, or for evaluating the efficacy of a treatment against Alzheimer's disease, including contacting , under conditions allowing hybridization between complementary sequences, nucleic acids derived from a mammalian blood sample and a set of probes specific for the target molecules identified previously to obtain a profile hybridization profile is characteristic of the presence or risk of developing Alzheimer's disease in this mammal, or the effectiveness of treatment.
  • the selective amplification is preferably performed using a primer or pair of primers for amplifying all or part of one of the target nucleic acids in the sample, when present therein.
  • the primer may be specific for a target sequence as defined above, or a region flanking the target sequence in a nucleic acid of the sample.
  • the primer typically comprises a single-stranded nucleic acid, preferably between 5 and 50 bases in length, preferably between 5 and 30.
  • Such a primer constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in in vitro) for the detection of Alzheimer's disease in a subject.
  • the primers may be designed to hybridize to a region of an exon or intron, or to an exon-exon, exon-intron or intron-intron junction region. Thus, the primers make it possible to highlight and distinguish different forms of splicing of a gene.
  • another subject of the invention lies in the use of a nucleotide primer or a set of nucleotide primers allowing the amplification of all or part of one or, preferably, several genes mentioned in the Tables 1 and 2, or corresponding RNAs, to detect the presence or risk of developing Alzheimer's disease in a mammal, or to evaluate the efficacy of a treatment for Alzheimer's disease in a mammal, while especially in a human being.
  • the method comprises determining the presence or the (relative) amount of a polypeptide encoded by a gene as defined above.
  • the detection or the assay of a polypeptide in a sample can be carried out by any technique known per se, such as in particular by means of a specific ligand, by an antibody or an antibody fragment or derivative.
  • the ligand is an antibody specific for the polypeptide, or a fragment of such an antibody (for example an Fab, Fab ', CDR, etc.), or a derivative of such an antibody (for example a single antibody). chain, ScFv).
  • the ligand is typically immobilized on a support, such as a slide, ball, column, plate, etc.
  • the presence or amount of the target polypeptide in the sample can be detected by demonstrating a complex between the target and the ligand, for example using a labeled ligand, using a second labeled revealing ligand, etc. Immunological techniques that can be used and are well known are ELISA, RIA, etc. If necessary, the amount of detected polypeptide can be compared to a reference value, for example a median or mean value observed in patients who are not suffering from Alzheimer's disease, or to a value measured in parallel in a sample witness. Thus, it is possible to highlight a variation of expression levels.
  • Antibodies specific for the target polypeptides may be produced by conventional techniques, including immunizing a non-human animal with an immunogen comprising the polypeptide (or an immunogenic fragment thereof), and recovering antibodies (polyclonal) or producing cells (to produce monoclonals). Techniques for producing poly- or monoclonal antibodies, ScFv fragments, human or humanized antibodies are described for example in Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989) 544; Bird et al., Science 242 (1988) 423; WO94 / 02602; US5,223,409; US5,877,293; WO93 / 01288.
  • the immunogen may be synthetically manufactured, or by expression, in a suitable host, of a target nucleic acid as defined above.
  • a suitable host of a target nucleic acid as defined above.
  • Such an antibody, monoclonal or polyclonal, as well as its derivatives having the same antigenic specificity, are also an object of the present application, as well as their use for detecting cancer.
  • Changes in the expression and / or structure of the proteins may also be detected using techniques known per se to those skilled in the art and involving the mass spectroscopy, more generally grouped under the name of proteomic analysis, to detect specific blood signatures of patients with Alzheimer's disease.
  • the method of the invention is applicable to any biological sample of the mammal under test, in particular any sample comprising nucleic acids or polypeptides.
  • a sample of blood, plasma, platelet, saliva, urine, stool, etc. may be advantageously mentioned, more generally any tissue, organ or, advantageously, biological fluid comprising nucleic acids or polypeptides.
  • the sample is a sample derived from blood, for example a sample of blood, serum or plasma.
  • the invention results indeed from the identification of blood markers of Alzheimer's disease, and thus allows detection of this pathology without tissue biopsy, but only from blood samples.
  • the sample can be obtained by any technique known per se, for example by sampling, by non-invasive techniques, from collections or sample banks, etc.
  • the sample may also be pre-processed to facilitate the accessibility of the target molecules, for example by lysis (mechanical, chemical, enzymatic, etc.), purification, centrifugation, separation, etc.
  • the sample can also be labeled, to facilitate the determination of the presence of the target molecules (fluorescent, radioactive, luminescent, chemical, enzymatic labeling, etc.).
  • the biological sample is a whole blood sample, that is to say having not undergone a separation step, which may optionally be diluted.
  • the method comprises the combined determination of the presence, absence or quantity of 5, 10, 20, 30, 40, 50 or 60 target molecules as defined above.
  • Another particular object of the present application relates to a method for detecting the presence, evolution or risk of developing Alzheimer's disease in a human subject, comprising contacting a biological sample of the subject containing nucleic acids. with a product comprising a support on which are immobilized nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of one or, preferably, several genes or RNA as defined above and the determination of the hybridization profile, the profile indicating the presence, stage or risk of developing Alzheimer's disease in said human subject.
  • the product comprises distinct nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different genes or RNAs as mentioned above.
  • Another object of the present application relates to a product comprising a support on which are immobilized nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of one or, preferably, several genes or RNA as defined above.
  • the product comprises separate nucleic acids comprising a complementary and / or specific sequence of at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more genes or RNA as defined above.
  • Another object of the present application relates to a product comprising a support on which is immobilized at least one ligand of a polypeptide encoded by a gene or an RNA as defined above.
  • the product comprises at least 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 or more different polypeptide ligands selected from the polypeptides mentioned above.
  • the support may be any solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not (that is to say in 2 or 3 dimensions), allowing the immobilization of acids nucleic or polypeptides.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, polystyrene, teflon, etc.
  • the reagents can be immobilized on the surface of the support by known techniques, or, in the case of nucleic acids, synthesized directly in situ on the support. Immobilization techniques include passive adsorption (Inouye et al., J. Clin Microbiol 28 (1990) 1469), the covalent bond.
  • the reagents immobilized on the support can be ordered according to a pre-established scheme, to facilitate the detection and identification of the complexes formed, and in a variable and adaptable density.
  • the product of the invention comprises a plurality of synthetic oligonucleotides, of a length of between 5 and 100 bases, specific for one or more genes or RNAs as defined above.
  • the products of the invention typically comprise control molecules for calibrating and / or normalizing the results.
  • kits comprising a compartment or container comprising at least one, preferably several, nucleic acids comprising a sequence complementary to and / or specific to one or more genes or RNAs as defined previously and / or a , preferably several ligands of one or more polypeptides as defined above.
  • the product comprises at least
  • kits may furthermore comprise reagents for a hybridization or immunological reaction, as well as, if appropriate, controls and / or instructions.
  • Another subject of the invention relates to the use of a product or kit as defined above for the detection of Alzheimer's disease in a mammalian subject, preferably a human subject.
  • Example 1 Identification of serum markers of Alzheimer's disease related to circadian rhythm
  • RNA extracted from Alzheimer's disease patients' blood and showing different levels of disease progression on the one hand, and RNA prepared from the blood of healthy individuals controls, with an average age identical to that of sick individuals, on the other hand.
  • the signatures thus obtained were analyzed by bioinformatic techniques and made it possible to identify the molecular bases of deregulated phenomena in Alzheimer's disease.
  • BMAL1 codes, just like the CLOCK gene, a transcription factor of the "basic helix-loop-helix (bHLH) -PAS domain containing transcription factors" family.
  • bHLH basic helix-loop-helix
  • the products of BMALl and CLOCK form a transcriptional complex involved in the regulation of the internal clock, the regulation of circadian rhythms. Therefore, the present invention describes, for the first time, a deregulation of the circadian rhythm of blood cells in patients with Alzheimer's disease.
  • the circadian system in mammals involves central and peripheral oscillators.
  • RNAs extracted from patients suffering from Alzheimer's disease on the one hand and control patients on the other hand also made it possible to show an alteration of the splicing of genes involved in the phagocytosis phenomenon.
  • This phenomenon regulated by the signaling cascades that control oxidative stress, is representative of macrophages and their contribution to the phenomenon of innate immunity.
  • the DATAS analysis carried out by the inventors made it possible to identify sequences corresponding to the RNAs of L-Plastin and Calnexin. More particularly, the sequence identified for L-Plastin corresponds to nucleotides 3249-3487 of Genbank sequence NM 002298 and the sequence identified for Calnexin corresponds to nucleotides 3764-4007 of sequence Genbank NMJ) 01746. Calnexin is known to those skilled in the art to interact with presenilin 1 (PS1), a protein implicated in Alzheimer's disease and in the production of beta amyloid plaque. Calnexin also interacts with the CD14 receptor and is involved in the phenomenon of phagocytosis. L-Plastin, in the phenomenon of phagocytosis is more particularly involved in the activation of oxidative stress following internalization.
  • PS1 presenilin 1
  • the present invention provides for the first time information on the molecular origin of phagocytosis defects presented by macrophages of patients with Alzheimer's disease.
  • Table 2 gives a list of genes involved in the mechanisms of phagocytosis and oxidative stress, which constitute targets within the meaning of the present invention.
  • CD 14 Homo sapiens CD 14 molecule (CD 14), variant 1 transcript, mRNA. ACCESSION NM 000591
  • CD 14 Homo sapiens CD 14 molecule (CD 14), variant 2 transcript, mRNA. ACCESSION NM_001040021
  • TLR4 Homo sapiens toll-like receptor 4
  • mRNA ACCESSION NM_138554
  • TLR2 Homo sapiens toll-like receptor 2
  • TLR7 Homo sapiens toll-like receptor 7
  • CXCR4 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), variant 2 transcript, mRNA. ACCESSION NM_003467
  • CXCR4 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), variant 1 transcript, mRNA. ACCESSION NM_001008540
  • ACCESSION NM 000619 Homo sapiens chemokine (CXC motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA. ACCESSION NM_002090
  • IRF3 interferon regulatory factor 3
  • ACCESSION NM_001571 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), variant Racle transcript, mRNA.
  • ACCESSION NM_198829 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), variant Racl transcript, mRNA.
  • ACCESSION NM_006908 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), variant Raclb transcript, mRNA.
  • ACCESSION NM_018890 Homo sapiens lipopolysaccharide binding protein (LBP), mRNA.
  • ACCESSION NM_004139 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), variant Raclb transcript, mRNA.
  • ACCESSION NM_018890 Homo sapiens lipopolysaccharide binding protein (LBP), mRNA.
  • ACCESSION NM_004139 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), variant Raclb transcript, mRNA.
  • ILlRL1 interleukin 1 receptor-like 1
  • variant 2 transcript mRNA.
  • ILlRL1 interleukin 1 receptor-like 1
  • variant 1 transcript mRNA.
  • Homo sapiens toll-like receptor 9 TLR9
  • variant B transcript mRNA
  • ACCESSION NM_138688 Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), variant A transcript, mRNA.
  • ACCESSION NM 017442 Homo sapiens NADPH oxidase 4 (NOX4), mRNA.
  • ACCESSION NM_016931 Homo sapiens interleukin 6 (interferon, beta 2) (IL6), mRNA.
  • MIF macrophage migration inhibitory factor
  • mRNA Homo sapiens macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) (MIF), mRNA. ACCESSION NM_002415
  • ACCESSION NM_001664 Homo sapiens nuclear factor of kappa light gene enhancer polypeptide in B-cells 1 (plO5) (NFKB1), mRNA. ACCESSION NM_003998
  • IL1B interleukin 1, beta
  • NM_024013 Homo sapiens interferon, alpha 1 (IFNA1), mRNA.
  • IFNA1 interferon 1
  • NM_024013 Homo sapiens nuclear factor of kappa light gene enhancer polypeptide in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA), mRNA.
  • NFKBIA alpha 1
  • NM_020529 Homo sapiens nuclear factor of kappa light gene enhancer polypeptide in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA), mRNA. ACCESSION NM_020529
  • IL4 interleukin 4
  • variant 2 transcript mRNA.
  • IL4 interleukin 4
  • ACCESSION NM_000589 Homo sapiens PRotein Associated with Tlr4 (MGC40499), mRNA.
  • TLR3 Homo sapiens toll-like receptor 3
  • mRNA ACCESSION NM_003265
  • TLR5 Homo sapiens toll-like receptor 5 (TLR5), mRNA.
  • ACCESSION NM 003268 Homo sapiens interleukin 1 protein receptor protein-like 1
  • TLR1 Homo sapiens toll-like receptor 1 (TLR1), mRNA. ACCESSION NM_003263
  • IL1RL2 interleukin 1 receptor-like 2
  • mRNA ACCESSION NM_003854
  • CXCL10 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL10), mRNA.
  • CXCL10 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL10), mRNA.
  • ACCESSION NM_001565 Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK1), variant 3 transcript, mRNA.
  • IRAK1 interleukin-1 receptor-associated kinase 1
  • variant 3 transcript mRNA.
  • ACCESSION NMJ 01025243
  • IRAK1 interleukin-1 receptor-associated kinase 1
  • IRAK1 interleukin-1 receptor-associated kinase 1
  • variant 1 transcript mRNA.
  • TICAM2 Homo sapiens toll-like receptor adapter molecule 2
  • mRNA ACCESSION NM_021649
  • TLR8 Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), variant 2 transcript, mRNA.
  • TLR8 Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), variant 1 transcript, mRNA. ACCESSION NMJ) 16610
  • IL1RAPL2 interleukin 1 protein receptor protein-like 2
  • IRAK4 interleukin-1 receptor-associated kinase 4
  • TLR6 Homo sapiens toll-like receptor 6
  • mRNA ACCESSION NM_006068
  • TLR10 Homo sapiens toll-like receptor 10
  • TLR10 Homo sapiens toll-like receptor 10
  • ACCESSION NM_001017388 Homo sapiens toll-like receptor (TLR10), variant 1 transcript, mRNA.
  • IRAK2 interleukin-1 receptor-associated kinase 2
  • CD55 Homo sapiens CD55 molecule, decay accelerating factor for complement (Cromer blood group) (CD55), mRNA. ACCESSION NM 000574

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, en particulier les humains. Elle décrit notamment des marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en oeuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence ou l'évolution de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, y compris en phase précoce.

Description

Procédé et Méthodes de détection de la maladie d'Alzheimer
La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la détectioi de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, en particulier les humains. Elle décri notamment des marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer et leurs utilisations dans de; méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour h mise en œuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.) leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence o\ l'évolution de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, y compris en phase précoce.
La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la maladii neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive, est caractérisé' par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à l'orientation e au jugement. La nature des symptômes, souvent confondus avec les désagrément physiologiques liés à la vieillesse, leur sévérité ainsi que l'âge de leurs apparitions, varien selon les individus. Ceci contribue à la difficulté d'établir un diagnostic aux stades précoce de la maladie.
L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de neurones dι l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué dans L raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont particulièremeπ affectés par cette déplétion.
Une autre anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de la maladi d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires de protéines Des agrégats neurofibrillaires intracellulaires de la protéine tau semblent bien corrélés avei la gravité de la démence. Des plaques séniles formées par agrégation intra et extracellulain de peptide beta-amyloïde caractérisent des régions d'altérations de neurones et de cellule gliales. II est cependant remarquable de noter que ces zones d'agrégation ne correspondent pas aux sites de la déplétion en synapses caractéristique du déclin des fonctions cognitives.
Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes sont associés au développement de la maladie. L'APP (Amyloid Precursor Protein ; précurseur du peptide beta amyloide), les présénilines 1 et 2 (PSl et PS2) et l'apolipoprotéine E
(ApoE). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes aboutissent à une production accrue de peptide beta amyloïde, les mécanismes qui président aux pertes synaptiques et neuronales restent mal connus. A cet égard, plusieurs hypothèses et mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent différents phénomènes:
1 Des phénomènes purement cérébraux impliquant les neurones et les cellules gliales:
- le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide beta amyloïde et modulé par le métabolisme du cholestérol; - des modifications de flux calciques et l'excitotoxicité.
2 Des phénomènes inflammatoires et immunitaires réactionnels ;
3 Une altération des hormones sexuelles ;
4 L'hypothyroïdisme et des défauts dans la régulation des signaux insuliniques.
Par conséquent, la maladie d'Alzheimer serait caractérisée par une altération de différents systèmes d'intégration régulant l'homéostasie, l'atteinte de certains neurones entraînant à la fois une réaction inflammatoire impliquant le système immunitaire et des modifications des régulations endocriniennes. Ces dernières ont en retour un impact sur l'activité et la viabilité d'autres neurones et sur les fonctions immunitaires, ces réactions en cascade soulignant le rôle non seulement de la neurodégénérescence mais aussi des régulations hormonales et de la réponse immunitaire dans la progression de la maladie d'Alzheimer.
Il n'existe actuellement aucune signature robuste et spécifique de la maladie dAlzheimer, susceptible de permettre d'établir un diagnostic de cette pathologie, notamment des différents stades de l'évolution de la maladie. La mise à disposition d'un test de diagnostic efficace, notamment précoce, permettrait aux patients d'être pris en charge dès le début de la maladie, et de bénéficier ainsi d'un traitement plus efficace et plus adapté, notamment par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, dans des conditions optimales.
La présente invention apporte une réponse à ce besoin. L'invention décrit notamment l'identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer, permettant la mise au point de diagnostics efficaces et prédictifs de la présence, du stade ou du risque de développer cette maladie. L'invention décrit ainsi l'identification de signatures moléculaires spécifiquement ou préférentiellement exprimées dans le sang de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, résultant notamment d'épissages alternatifs. De manière particulièrement inattendue, la présente demande démontre l'existence, au niveau des cellules sanguines de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, d'une dérégulation de l'horloge interne et de voies de signalisation moléculaire impliquées dans la phagocytose et/ou le stress oxydatif. L'invention peut donc proposer, pour la première fois, des outils et méthodes de diagnostic, de prédiction et/ou de suivi de l'évolution de la maladie d'Alzheimer, basés sur une mesure, dans le sang de sujets, de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif. La présence d'une dérégulation dans l'expression de tels gènes permet d'établir le risque ou la prédisposition à la maladie d'Alzheimer, ou de confirmer la présence de cette pathologie chez un sujet.
Un objet de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes ou ARN choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère. Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour évaluer ou suivre l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de mesure de l'expression d'un ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, au cours du traitement, et une comparaison de l'expression ainsi mesurée à celle mesurée à un stade antérieur du traitement.
Un autre objet de l'invention concerne une amélioration aux méthodes de traitement de la maladie d'Alzheimer, l'amélioration consistant à mesurer l'expression d'un ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, chez un sujet, avant et/ou pendant le traitement. La mesure de l'expression permet d'adapter le traitement en fonction de l'évolution de la pathologie. Le traitement est typiquement un traitement par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase, tels que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur d'acétylcholinestérase, tel que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, pour la préparation d'un médicament pour traiter la maladie d'Alzheimer chez un patient présentant une dérégulation de l'expression d'un gène (au moins) tel que défini précédemment.
L'altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention (i) toute altération de l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans les niveaux d'expression (e.g., de transcription ou de traduction), une dérégulation de l'épissage, conduisant par exemple à l'apparition de formes épissées particulières ou à une modification de la quantité (relative) ou du rapport entre les différentes formes d'épissage, de même que (ii) toute altération dans la structure de la protéine produite (apparition ou disparition de formes tronquées, allongées, mutées, etc.). Comme il sera décrit dans la suite du texte, la présente demande décrit l'identification de dérégulations de l'épissage des acteurs des cascades de signalisation impliquées dans le rythme circadien et dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif dans le sang de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Toute molécule ou technique permettant de mesurer l'expression de ces gènes dans le sang peut être mise en œuvre dans le cadre de la présente invention, telles que des amorces nucléotidiques, des sondes nucléotidiques ou des anticorps spécifiques, qui peuvent être en suspension ou sous forme immobilisée, comme il sera décrit en détails dans la suite du texte.
Ainsi, un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou un ARN tel que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci- dessus.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou plusieurs polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain.
Marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer
La présente invention repose sur la mise en évidence et la caractérisation d'événements biologiques sériques caractéristiques de la maladie d'Alzheimer chez un patient humain. Ces événements constituent des biomarqueurs, dont la détection chez un patient permet, de préférence en combinaison, de déterminer, même à un stade précoce, le risque de développer une telle maladie, la présence d'une telle maladie, ou le stade d'évolution de cette maladie. En outre, les marqueurs selon l'invention sont également utilisables pour mesurer l'efficacité d'un traitement, et/ou pour sélectionner des médicaments candidats. Les combinaisons de marqueurs de l'invention peuvent permettre de distinguer la maladie d'Alzheimer des autres pathologies neurodégénératives.
Les événements biologiques identifiés correspondent typiquement à des modifications dans la régulation de l'expression de gènes. Il peut s'agir d'une inhibition partielle ou totale de l'expression de gènes ou d'ARN, ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, d'une augmentation de l'expression de gènes ou de certaines formes de gènes ou d'ARN, de l'apparition ou de la disparition de formes d'épissages de gènes, etc.
Au sens de l'invention, on entend par le terme « gène régulé selon un rythme circadien » tout gène dont l'expression est régulée par l'horloge biologique interne. Il s'agit en particulier de tout ARN ou toute protéine dont l'expression ou l'activité est régulée selon un rythme chronologique, par exemple une périodicité de 24h. Chez l'homme, le rythme circadien est contrôlé par une "horloge biologique" (le noyau suprachiasmique) située dans l'hypothalamus. Elle tient sous sa dépendance d'autres horloges biologiques, contrôlant entre autres le rythme thermique du corps ou la synthèse d'hormones. A titre d'exemples illustratifs de gènes régulés selon un rythme circadien pour la mise en œuvre de l'invention, on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau 1.
Ainsi, un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter (in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 1, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend au moins la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène BMALl ou CLOCK, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
Au sens de l'invention, on entend par le terme « gène impliqué dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif » tout gène dont le produit d'expression participe au mécanisme de la phagocytose ou du stress oxydatif dans les cellules sanguines. La phagocytose est le mécanisme par lequel certaines cellules vivantes englobent et digèrent certaines particules étrangères. A titre d'exemples illustratifs de tels gènes au sens de l'invention, on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau 2.
Ainsi, un autre objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter
(in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 2, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie dAlzheimer chez ce mammifère.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la méthode de l'invention comprend au moins la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène de la L- Plastin ou de la Calnexin, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
De manière préférée, l'invention repose sur la détection combinée d'une altération dans plusieurs gènes choisis parmi les gènes mentionnés ci-dessus. Le terme détection « combinée » indique que l'altération de plusieurs gènes est déterminée pour aboutir à un évaluation, cette détermination pouvant être réalisée de manière simultanée ou non. Ainsi, un mode de mise en œuvre particulier de l'invention implique la détection combinée d'une altération dans au moins un gène régulé par le rythme circadien et dans au moins un gène impliqué dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif.
L'invention repose donc sur la détection, dans un échantillon, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies avantageusement parmi : a) les gènes indiqués dans les Tableaux 1 et 2, ou les ARN correspondants, ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c). La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la protéine correspondante, ou un fragment distinctif de celle-ci, c'est-à-dire un fragment dont la séquence est spécifique dudit gène ou ARN, ou de la dite protéine, et/ou comporte un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.) représentatif de l'événement biologique à détecter.
Le terme « analogue fonctionnel » désigne un analogue provenant d'une autre espèce de mammifère. En effet, les gènes indiqués dans les tableaux 1 et 2 sont des gènes humains, et ces séquences constituent des marqueurs efficaces et adaptés à la détection de la maladie dAlzheimer chez les patients humains. Néanmoins, pour une application des méthodes de l'invention à d'autres espèces de mammifères, il est généralement préférable d'utiliser des analogues fonctionnels de ces séquences, caractérisés dans l'espèce considérée. Ces analogues peuvent être identifiés par toute technique connue de l'homme du métier, notamment en considération des séquences fournies dans la demande et des noms des gènes correspondants.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c).
Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode est utilisée pour détecter la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain et comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) ou b).
Méthodes de détection d'une altération dans un gène
Comme indiqué précédemment, une altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention (i) toute altération de l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans les niveaux d'expression (e.g., de transcription ou de traduction), une dérégulation de l'épissage, conduisant par exemple à l'apparition de formes épissées particulières ou à une modification de la quantité (relative) de ou du rapport entre différentes formes d' épissage, de même que (ii) toute altération dans la structure de la protéine produite (apparition ou disparition de formes tronquées, allongées, mutées, etc.).
Différentes techniques permettant la détection d'une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative ou ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Si nécessaire, la quantité d'acide nucléique détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la maladie d' Alzheimer, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin. Ainsi, il est possible de mettre en évidence une variation de niveaux d'expression.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence ou de la quantité (relative) d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective.
L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple -brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de 75, 60, 50, 40 ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. De tels oligonucléotides comportent typiquement de 10 à 50 bases, de préférence de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Dans un mode particulièrement avantageux, on utilise plusieurs oligonucléotides (ou sondes) différents pour détecter la même molécule cible. Il peut s'agir d' oligonucléotides spécifiques de régions différentes de la même molécule cible, ou centrés différemment sur un même région. On peut également utiliser des couples de sondes, dont un membre est parfaitement apparié à la molécule cible, et un autre présente un mésappariement, permettant ainsi d'estimer le bruit de fond. Les sondes peuvent être conçues pour s'hybrider à une région d'un exon ou d'un intron, ou à une région de jonction de type exon-exon, exon-intron ou intron-intron. Ainsi, les sondes permettent de mettre en évidence et de distinguer différentes formes d'épissage d'un gène.
Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le support, ou synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.
Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande, ainsi que leurs utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection de la maladie dAlzheimer chez un sujet.
L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) Molecular Cloning,
CoId Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63°C pendant 2 à 18 heures. D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité, sont par exemple une température d'hybridation entre 45 et 55°C. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCl ou du EDTA peuvent également être utilisés.
Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré -hybrides dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C pendant 30 min. Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes (typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65°C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléiques de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65°C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon ainsi que par ajout de substances auxiliaires comme le formamide ou de l'ADN simple brin.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer la maladie dAlzheimer chez un mammifère, ou pour évaluer l'efficacité d'un traitement contre la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise en contact, dans des conditions permettant une hybridation entre séquences complémentaires, des acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble de sondes spécifique des molécules cibles identifiées précédemment pour obtenir un profil d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère, ou de l'efficacité du traitement.
L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible telle que définie précédemment, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple -brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet. Les amorces peuvent être conçues pour s'hybrider à une région d'un exon ou d'un intron, ou à une région de jonction de type exon-exon, exon-intron ou intron-intron. Ainsi, les amorces permettent de mettre en évidence et de distinguer différentes formes d'épissage d'un gène.
A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une amorce nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant l'amplification de tout ou partie d'un ou, de préférence plusieurs gènes mentionnés dans les Tableaux 1 et 2, ou des ARNs correspondants, pour détecter la présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, ou pour évaluer l'efficacité d'un traitement contre de la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, tout particulièrement chez un être humain.
Détection d'une altération dans un polypeptide
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence ou de la quantité (relative) d'un polypeptide codé par un gène tel que défini précédemment. La mise en évidence ou le dosage d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence ou la quantité du polypeptide cible dans l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la maladie d'Alzheimer, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin. Ainsi, il est possible de mettre en évidence une variation de niveaux d'expression.
Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al, Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al, Nature 341 (1989) 544 ; Bird et al, Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ; WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter un cancer.
Des modifications de l'expression et/ou de la structure des protéines peuvent aussi être détectées au moyen des techniques connues en soi de l'homme du métier et impliquant la spectroscopie de masse, plus généralement regroupées sous le nom d'analyse protéomique, afin de détecter des signatures spécifiques du sang des patients atteints de la maladie d'Alzheimer.
Mise en œuyre du procédé
La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides.
Dans un mode de mise en œuvre préféré et particulièrement avantageux, l'échantillon est un échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de plasma. L'invention découle en effet de l'identification de marqueurs sanguins de la maladie d'Alzheimer, et permet donc une détection de cette pathologie sans biopsie tissulaire, mais uniquement à partir de prélèvements sanguins.
L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré -traité pour faciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.).
Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon biologique est un échantillon de sang total, c'est-à-dire n'ayant pas subi d'étape de séparation, qui peut être éventuellement dilué. De préférence, la méthode comprend la détermination combinée de la présence, absence ou quantité de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 molécules cibles telles que définies ci-dessus.
Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence, l'évolution ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du sujet contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence, le stade ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ledit sujet humain. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARNs différents tels que mentionnés ci- dessus.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou un ARN tel que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci- dessus.
Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403. Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable.
Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment.
Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou plusieurs polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend au moins
5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Exemple 1; Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer liés au rythme circadien
Une analyse génétique a été réalisée à partir d'ARN extraits de sang de patients atteints de la maladie dAlzheimer et présentant différents degrés d'évolution de la maladie, d'une part, et d'ARN préparés à partir de sang d'individus sains contrôles, présentant une moyenne d'âge identique à celle des individus malades, d'autre part.
Les signatures ainsi obtenues ont été analysées par des techniques bioinformatiques et ont permis d'identifier les bases moléculaires de phénomènes dérégulés dans la maladie d'Alzheimer.
Ainsi il a été identifié une signature qui dérive de l'ARNm codant pour BMALl et qui correspond aux nucléotides 128 à 247 de la séquence Genbank AB000816. BMALl code , tout comme le gène CLOCK, un facteur de transcription de la famille « basic helix-loop- helix (bHLH) -PAS domain containing transcription factors ». Les produits de BMALl et de CLOCK forment un complexe transcriptionnel impliqué dans la régulation de l'horloge interne, de la régulation des rythmes circadiens. Par conséquent, la présente invention décrit, pour la première fois une dérégulation du rythme circadien des cellules sanguines chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le système circadien chez les mammifères implique des oscillateurs centraux et périphériques. Il a été montré une dominance hiérarchique entre le système circadien du système nerveux central et celui des tissus périphériques. Ainsi, le système central assure le synchronisme périphérique. La zone du cerveau qui contrôle cette horloge interne centrale est altérée au cours de la maladie d'Alzheimer et la présente invention documente pour la première fois une répercussion au niveau des cellules sanguines d'une dérégulation de l'horloge interne. Le Tableau 1 ci- dessous donne une liste de gènes régulés selon le rythme circadien, qui constituent des cibles au sens de la présente invention.
Tableau 1
Exemple 2: Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer impliqués dans le phénomène de phagocytose
Une analyse DATAS entre des ARN extraits de patients atteints de la maladie d'Alzheimer d'une part et des patients contrôles d'autre part a également permis de montrer une altération de l'épissage de gènes impliqués dans le phénomène de phagocytose. Ce phénomène, régulé par les cascades de signalisation qui contrôlent de stress oxydatif, est représentatif des macrophages et de leur contribution au phénomène d'immunité innée.
Une diminution des propriétés de phagocytose des macrophages a été rapportée chez certains patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Cependant, aucune base moléculaire n'a pu être identifiée pour expliquer ce phénomène.
L'analyse DATAS réalisée par les inventeurs a permis d'identifier des séquences correspondant aux ARN de la L-Plastin et de la Calnexin. Plus particulièrement, la séquence identifiée pour la L-Plastin correspond aux nucléotides 3249-3487 de la séquence Genbank NM 002298 et la séquence identifiée pour la Calnexin correspond aux nucléotides 3764-4007 de la séquence Genbank NMJ)01746. La Calnexin est connue par l'homme de métier pour interagir avec la préséniline 1 (PSl), protéine impliquée dans la maladie d'Alzheimer et dans la production de la plaque bêta amyloïde. La Calnexin interagit également avec le récepteur CD 14 et est impliqué dans le phénomène de phagocytose. La L-Plastin, dans le phénomène de phagocytose est plus particulièrement impliquée dans l'activation du stress oxydatif consécutif à l'internalisation.
Par conséquent, la présente invention fournit pour la première fois des informations sur l'origine moléculaire des défauts de phacocytose que présentent les macrophages de patients atteints de la maladie d'Alzheimer.
Le Tableau 2 ci-dessous donne une liste de gènes impliqués dans les mécanismes de la phagocytose et du stress oxydatif, qui constituent des cibles au sens de la présente invention.
Tableau 2
L-Plastin - Genbank NM_002298
Calnexin - Genbank NMJ)01746
Homo sapiens CD 14 molécule (CD 14), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM 000591
Homo sapiens CD 14 molécule (CD 14), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_001040021
Homo sapiens toll-like receptor 4 (TLR4), mRNA. ACCESSION NM_138554
Homo sapiens toll-like receptor 2 (TLR2), mRNA. ACCESSION NM_003264 Homo sapiens toll-like receptor 7 (TLR7), mRNA. ACCESSION NM_016562
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_003467
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM_001008540
Homo sapiens interferon, gamma (IFNG), mRNA. ACCESSION NM 000619 Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA. ACCESSION NM_002090
Homo sapiens interferon, beta 1, fibroblast (IFNBl), mRNA. ACCESSION NM_002176
Homo sapiens interferon regulatory factor 3 (IRF3), mRNA. ACCESSION NM_001571 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Racle, mRNA. ACCESSION NM_198829 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Racl, mRNA. ACCESSION NM_006908 Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Racl) (RACl), transcript variant Raclb, mRNA. ACCESSION NM_018890 Homo sapiens lipopolysaccharide binding protein (LBP), mRNA. ACCESSION NM_004139
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1 (ILlRLl), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_003856
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1 (ILlRLl), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM_016232
Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant B, mRNA. ACCESSION NM_138688 Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant A, mRNA. ACCESSION NM 017442 Homo sapiens NADPH oxidase 4 (NOX4), mRNA. ACCESSION NM_016931 Homo sapiens interleukin 6 (interferon, beta 2) (IL6), mRNA. ACCESSION NM_000600
Homo sapiens macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor) (MIF), mRNA. ACCESSION NM_002415
Homo sapiens ras homolog gène family, member A (RHOA), mRNA. ACCESSION NM_001664 Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gène enhancer in B-cells 1 (plO5) (NFKBl), mRNA. ACCESSION NM_003998
Homo sapiens interleukin 1, beta (ILlB), mRNA. ACCESSION NM_000576
Homo sapiens interferon, alpha 1 (IFNAl), mRNA. ACCESSION NM_024013 Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gène enhancer in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA), mRNA. ACCESSION NM_020529
Homo sapiens interleukin 4 (IL4), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_172348
Homo sapiens interleukin 4 (IL4), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM_000589 Homo sapiens PRotein Associated with Tlr4 (MGC40499), mRNA. ACCESSION NM_152755
Homo sapiens toll-like receptor 3 (TLR3), mRNA. ACCESSION NM_003265
Homo sapiens toll-like receptor 5 (TLR5), mRNA. ACCESSION NM 003268 Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 1
(ILlRAPLl), mRNA. ACCESSION NM_014271
Homo sapiens toll-like receptor 1 (TLRl), mRNA. ACCESSION NM_003263
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 2 (IL1RL2), mRNA. ACCESSION NM_003854
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCLlO), mRNA. ACCESSION NM_001565 Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 3, mRNA. ACCESSION NMJ)01025243
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 2, mRNA.
ACCESSION NMJ)01025242
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1 (IRAKl), transcript variant 1 , mRNA. ACCESSION NM 001569
Homo sapiens toll-like receptor adaptor molécule 2 (TICAM2), mRNA. ACCESSION NM_021649
Homo sapiens toll interacting protein (TOLLIP), mRNA. ACCESSION NMJ) 19009
Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 2, mRNA.
ACCESSION NM_138636
Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NMJ) 16610
Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 2 (IL1RAPL2), mRNA. ACCESSION NM_017416
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4), mRNA.
ACCESSION NM_016123
Homo sapiens toll-like receptor 6 (TLR6), mRNA. ACCESSION NM_006068
Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLRlO), transcript variant 2, mRNA. ACCESSION NM_001017388 Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLRlO), transcript variant 1, mRNA. ACCESSION NM_030956
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2), mRNA.
ACCESSION NM_001570
Homo sapiens myeloid differentiation primary response gène (88)
(MYD88), mRNA. ACCESSION NM_002468
Homo sapiens CD55 molécule, decay accelerating factor for complément (Cromer blood group) (CD55), mRNA. ACCESSION NM 000574

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour détecter in vitro ou ex vivo la présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes ou ARN choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, la présence d'une telle altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère.
2. Méthode pour évaluer ou suivre l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de mesure de l'expression d'un ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, au cours du traitement, et une comparaison de l'expression ainsi mesurée à celle mesurée à un stade antérieur du traitement.
3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'altération dans le gène ou ARN est une altération de l'expression, de l'épissage et/ou de la structure de la protéine produite.
4. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 1, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
5. Méthode selon la revendication 4, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène BMALl ou CLOCK, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la détermination de Ia présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un ou plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 2, ou dans les ARN correspondants, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
7. Méthode selon la revendication 6, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène de Ia L-PIastin ou de la Calnexin, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant la détermination de la présence d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi : a) les gènes indiqués dans les Tableaux 1 et 2, ou les ARN correspondants, ou un fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives, b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c).
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la présence de l'altération est déterminée par hybridation sélective, amplification sélective, ou liaison avec un ligand spécifique.
10. Produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARN tels que définis dans l'une des revendications 4 à 7.
1 1. Produit comprenant un support sur lequel sont immobilisés au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus ligands de polypeptides différents codés par les gènes ou ARN tels que définis dans l'une des revendications 4 à 7.
12. Kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents choisis parmi les acides nucléiques et ligands définis dans les revendications 10 ou 11.
13. Utilisation d'un produit ou kit selon l'une des revendications 10 à 12 pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifère, de préférence un sujet humain.
14. Utilisation d'un inhibiteur d'acétylcholinestérase, tel que la tacrine, le donepezil ou la rivastigmine, pour la préparation d'un médicament pour traiter la maladie d'Alzheimer chez un patient présentant une dérégulation de l'expression d'un gène choisi parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif.
EP07766039A 2006-05-15 2007-05-14 Procédé et méthodes de détection de la maladie d'alzheimer Withdrawn EP2021509A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0604294A FR2900936B1 (fr) 2006-05-15 2006-05-15 Procede et methodes de detection de la maladie d'alzheimer
PCT/FR2007/051263 WO2007132120A2 (fr) 2006-05-15 2007-05-14 Procede et methodes de detection de la maladie d'alzheimer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2021509A2 true EP2021509A2 (fr) 2009-02-11

Family

ID=37496633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP07766039A Withdrawn EP2021509A2 (fr) 2006-05-15 2007-05-14 Procédé et méthodes de détection de la maladie d'alzheimer

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20100055682A1 (fr)
EP (1) EP2021509A2 (fr)
JP (1) JP2009537133A (fr)
KR (1) KR20090098941A (fr)
CN (1) CN101490280B (fr)
AU (1) AU2007251408B2 (fr)
CA (1) CA2652258A1 (fr)
FR (2) FR2900936B1 (fr)
IL (1) IL195288A (fr)
NZ (1) NZ573505A (fr)
WO (1) WO2007132120A2 (fr)
ZA (1) ZA200810528B (fr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2929292A1 (fr) 2008-03-28 2009-10-02 Exonhit Therapeutics S A Sa Procede et methodes de diagnostic de la maladie d'alzheimer
ES2628944T3 (es) * 2008-05-23 2017-08-04 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Método para la evaluación de la función de fagocitos
US20100099609A1 (en) * 2008-07-28 2010-04-22 Buck Institute For Age Research eAPP AND DERIVATIVES FOR TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE
KR101295019B1 (ko) * 2011-04-22 2013-08-09 경북대학교 산학협력단 리포칼린 2 수준을 측정하는 것을 포함하는 경도 인지 장애 진단용 조성물, 키트 및 경도인지 장애 진단을 위한 정보 제공방법.
US9541561B2 (en) 2012-06-14 2017-01-10 Electronics And Telecommunications Research Institute Method for diagnosing Alzheimer's disease using biomaterial
EP2728015A1 (fr) * 2012-10-31 2014-05-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Procédé pour le diagnostic du syndrome de Sézary
WO2016024101A1 (fr) * 2014-08-13 2016-02-18 Timmons James Archibald Diagnostic médical
CN104328200B (zh) * 2014-11-18 2016-04-06 宁波大学 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法
WO2019049705A1 (fr) * 2017-09-08 2019-03-14 自然免疫制御技術研究組合 Dispositif et procédé de diagnostic de symptômes de la maladie d'alzheimer
WO2023005959A1 (fr) * 2021-07-27 2023-02-02 The Hong Kong University Of Science And Technology Compositions et méthodes de traitement de la maladie d'alzheimer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046382A2 (fr) * 2002-11-21 2004-06-03 Diagenic As Produit et procede

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0791660A1 (fr) * 1996-02-22 1997-08-27 Smithkline Beecham Corporation Nouveau marqueur diagnostique pour variations d'épissage de gènes en association avec fonctions neurologiques
EP1303537B1 (fr) * 2000-07-25 2006-09-27 The Sir Mortimer B. Davis-Jewish General Hospital Suppresseur de ho-1 utile comme test de diagnostic et de pronostic dans les maladies dementielles
DE60312656T2 (de) * 2002-01-31 2007-11-29 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Arzneimittel zur behandlung von störungen des zirkadianen rhythmus
US20050065082A1 (en) * 2002-03-29 2005-03-24 Hirofumi Doi C-jun phosphorylation inhibitors
US7250496B2 (en) * 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046382A2 (fr) * 2002-11-21 2004-06-03 Diagenic As Produit et procede

Also Published As

Publication number Publication date
FR2980484A1 (fr) 2013-03-29
US20100055682A1 (en) 2010-03-04
CN101490280A (zh) 2009-07-22
AU2007251408B2 (en) 2012-11-29
ZA200810528B (en) 2009-10-28
KR20090098941A (ko) 2009-09-18
WO2007132120A3 (fr) 2008-05-08
JP2009537133A (ja) 2009-10-29
FR2900936A1 (fr) 2007-11-16
CA2652258A1 (fr) 2007-11-22
NZ573505A (en) 2011-04-29
FR2900936B1 (fr) 2013-01-04
CN101490280B (zh) 2012-09-26
WO2007132120A2 (fr) 2007-11-22
AU2007251408A1 (en) 2007-11-22
IL195288A (en) 2013-10-31
IL195288A0 (en) 2009-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2021509A2 (fr) Procédé et méthodes de détection de la maladie d'alzheimer
EP2260113B1 (fr) Procede et methodes de diagnostic de la maladie d'alzheimer
EP1957672A2 (fr) Procede de detection du cancer
FR2892730A1 (fr) Methode pour detecter la presence ou le risque de developper un cancer
AU2008273713B2 (en) CD44 splice variants in neurodegenerative diseases
EP2287336A1 (fr) Procédés et méthodes de diagnostic de la maladie d'Alzheimer
EP1891241B1 (fr) Méthodes faisant appel à des protéines adarb2 cibles pour diagnostiquer et pour pronostiquer des maladies neurodégénératives
WO2014122290A1 (fr) Marqueur dyrk1a pour la maladie d'alzheimer
KR20200028320A (ko) 알츠하이머병 질환 탐지용 바이오마커 및 이를 이용한 알츠하이머병 질환 진단
KR102024576B1 (ko) 퇴행성 신경질환 진단을 위한 ccn3의 단일염기다형성 동정
FR2935712A1 (fr) Methode de detection de l'expression differentielle d'un ensemble de marqueurs moleculaires associee a la maladie de parkinson
KR101509641B1 (ko) 아포지단백질 m을 포함하는 알츠하이머 질환 진단용 마커 조성물
KR101515210B1 (ko) 간 섬유화 진단용 바이오마커 elk3
EP1692310A2 (fr) Identification de marqueurs diagnostic pour les encephalopathies subaigu s spongiformes transmissibles
CN114875132B (zh) 青光眼的诊断生物标志物及其应用
KR20190124469A (ko) 퇴행성 뇌신경 질환 진단용 마커 및 이의 용도
FR2862314A1 (fr) Identification de marqueurs diagnostic pour les encephalopathies subaigues spongiformes transmissibles
FR2867485A1 (fr) Identification de marqueurs diagnostics pour les encephalopathies subaigues spongiformes transmissibles
ITRM20060545A1 (it) Biomarkers per la sclerosi laterale amiotropica sla e loro usi
JP2012085593A (ja) 消化管間質腫瘍の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20081211

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA HR MK RS

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
R17D Deferred search report published (corrected)

Effective date: 20080508

17Q First examination report despatched

Effective date: 20100304

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: EXONHIT SA

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: DIAXONHIT

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20140409