EP1692310A2 - Identification de marqueurs diagnostic pour les encephalopathies subaigu s spongiformes transmissibles - Google Patents

Identification de marqueurs diagnostic pour les encephalopathies subaigu s spongiformes transmissibles

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EP1692310A2
EP1692310A2 EP04805435A EP04805435A EP1692310A2 EP 1692310 A2 EP1692310 A2 EP 1692310A2 EP 04805435 A EP04805435 A EP 04805435A EP 04805435 A EP04805435 A EP 04805435A EP 1692310 A2 EP1692310 A2 EP 1692310A2
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
sequence
seq
chosen
fragment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04805435A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Annelies Resink
Magali Rouquette
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ExonHit Therapeutics SA
Original Assignee
ExonHit Therapeutics SA
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Publication date
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Priority claimed from FR0314486A external-priority patent/FR2867485B1/fr
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Publication of EP1692310A2 publication Critical patent/EP1692310A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present application relates to biological markers of transmissible spongiform encephalopathies and their uses in diagnostic methods. It also relates to tools and / or kits which can be used for the implementation of these methods (reagents, probes, primers, antibodies, chips, cells, etc.), their preparation and their uses.
  • the invention can be used to detect the presence of an infection in mammals, including in the early phase.
  • Prion diseases also called transmissible spongiform subacute encephalopathies or diseases with unconventional transmissible agents (CNTA) are diseases of the central nervous system encountered in certain mammals, including humans.
  • the infectious agent is not yet definitively determined, but the most accepted hypothesis is that these diseases are associated with the accumulation in the brain of a prion protein (PrP) of abnormal conformation compared to the conformation observed in healthy individuals.
  • PrP prion protein
  • DATAS identifies qualitative differences in gene expression and provides a systematic analysis of spliced RNA between two conditions: healthy / infected. DATAS leads to the identification of functionally distinct RNA variants.
  • the DATAS technique comprises three distinct stages: the collection of tissue, the isolation of RNAs and the construction of a repertoire containing qualitative differences and identifying new gene fragments, which cannot be isolated by other genetic techniques.
  • the markers contained in these directories were selected and validated according to two approaches:
  • the different clones of the two DATAS experiments were deposited on glass slides.
  • the slides were hybridized with probes produced from biological material from cows infected naturally or experimentally and from healthy cows used as control.
  • SAM Signal Analysis of Microarray
  • PAM Prediction analysis of Microarray
  • the present application thus provides a set of biological markers which can be used, alone or in combination (s), to detect, characterize or follow a transmissible spongiform encephalopathy in a mammal.
  • the invention is useful in particular for detecting the presence of prion diseases in mammalian subjects, in particular sheep, cattle or humans. It is particularly advantageous insofar as it can be carried out on living mammals, from biological fluids such as blood, plasma, platelets, etc.
  • An object of the present application relates to a method for detecting the presence or the risk of developing encephalopathy in a mammal, comprising determining the presence (or absence), in a biological sample of the mammal, of a target molecule chosen from: a) a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1 to 26 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b) an acid nucleic acid having a sequence complementary to a sequence according to a), c) a functional analog of a nucleic acid according to a) or b), or d) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) to c), the presence ( or the absence) of such a target molecule in the sample being an indication of the presence or risk of developing encephalopathy in this mammal.
  • a target molecule chosen from: a) a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NOs: 1 to 26 or
  • the method comprises the determination (simultaneous) of the presence or absence of at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more of the target molecules such as defined above.
  • the invention indeed makes it possible to establish and determine a hybridization profile on a set of markers, in order to assess the presence or the risk of developing encephalopathy in a mammal.
  • the hybridization profile is typically carried out using a combination of several markers chosen by the targets indicated above, for example containing all of these targets.
  • the target molecule may be the complete sequence of the gene or of the RNA or of the protein corresponding to the sequences SEQ ID NOs: 1-26, or a fragment thereof, for example a fragment comprising a domain of variability (splicing, deletion, polymorphism, etc.).
  • a functional analogue more particularly designates an analogue originating from another species (for example man, sheep, etc.), or a natural variant resulting for example from polymorphism, splicing, etc.
  • the method comprises determining the presence of at least one nucleic acid according to a) to c).
  • Different techniques which can be used to detect a species of nucleic acid in a sample can be used in the present invention, such as, for example, Northern Blot, selective hybridization, the use of supports coated with probe oligonucleotides, the amplification of nucleic acid such as for example by RT-PCR, quantitative PCR and ligation-PCR, etc.
  • These methods may include the use of a nucleic probe (eg, an oligonucleotide) capable of selectively or specifically detecting the target nucleic acid in the sample.
  • Amplification can be carried out according to various methods known per se to those skilled in the art, such as PCR, LCR, transcription-mediated amplification (TMA), strand displacement amplification (SDA), NASBA, use of allele specific oligonucleotides (ASO), allele specific amplification, Southern blot, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • TMA transcription-mediated amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • NASBA use of allele specific oligonucleotides (ASO), allele specific amplification, Southern blot, SSCA conformational analysis, in situ hybridization (eg, FISH), gel migration, heteroduplex analysis, etc.
  • the method comprises the detection of the presence or absence of a nucleic acid according to a) to c) by selective hybridization or selective amplification.
  • nucleic acid probes preferably immobilized on a support, such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic probes.
  • a support such as a solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, etc.
  • the nucleic acid probes can be any nucleic acid (DNA, RNA, PNA, etc.), preferably single-stranded, comprising a specific sequence of a target molecule as defined in a) to c) above.
  • the probes typically comprise from 5 to 400 bases, preferably from 8 to 200, more preferably less than 100.
  • the probes can be synthetic oligonucleotides, produced on the basis of the sequences of target molecules of the invention according to conventional synthesis techniques .
  • the probes can also be synthesized directly in situ, on the support, according to methods known per se to those skilled in the art.
  • the probes can also be manufactured by genetic techniques, for example by amplification, recombination, ligation, etc.
  • Such a probe constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in vitro) for the detection of encephalopathy in a subject.
  • we uses a set of nucleic probes comprising all or a fragment of at least 5 consecutive bases of each of the sequences SEQ ID NO: 1-26, or of a strand complementary to these, advantageously immobilized on a support.
  • Hybridization can be carried out under conventional conditions, known to those skilled in the art and adjustable by the latter (Sambrook et al). In particular, hybridization can be carried out under conditions of high, medium or low stringency, depending on the level of sensitivity sought, the amount of material available, etc. For example, suitable hybridization conditions include a temperature between 62 and 67 ° C for 2 to 18 hours. After hybridization, various washes can be carried out to remove the non-hybridized molecules, typically in SSC buffers comprising SDS, such as a buffer comprising 0.1 to 10 ⁇ SSC and 0.1% SDS.
  • the nucleic acids are pre-hybridized in a hybridization buffer (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) typically containing 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA to 65 ° C for 30 min.
  • a hybridization buffer typically containing 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA to 65 ° C for 30 min.
  • the nucleic acids in the sample are then brought into contact with the probes
  • the nucleic acids of the sample are labeled beforehand, by any known labeling (radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent, etc.).
  • the supports are then washed in a 5X SSC buffer, 0.1% SDS at 65 ° C for 30 min, then in a 0.2X SSC buffer, 0.1% SDS.
  • the hybridization profile is analyzed according to conventional techniques, such as for example by measuring the marking on the support by means of a suitable instrument (for example Instantlmager, Packard Instruments).
  • the hybridization conditions can naturally be adjusted by a person skilled in the art, for example by modifying the hybridization temperature and / or the salt concentration of the buffer.
  • the selective amplification is preferably carried out using a primer or a pair of primers allowing the amplification of all or part of one of the target nucleic acids in the sample, when the latter is present there.
  • the primer can be specific for a target sequence according to SEQ ID NO: 1-26, or for a region flanking the target sequence in a nucleic acid of the sample.
  • the primer typically includes a nucleic acid single-stranded, of a length advantageously between 5 and 50 bases, preferably between 5 and 30.
  • Such a primer constitutes another object of the present application, as well as its use (essentially in vitro) for the detection of a encephalopathy in a subject.
  • the method comprises determining the presence of a polypeptide according to d).
  • the demonstration of a polypeptide in a sample can be carried out by any technique known per se, such as in particular by means of a specific ligand, for example an antibody or a fragment or derivative of antibody.
  • the ligand is an antibody specific for the polypeptide, or a fragment of such an antibody (for example a Fab, Fab ', CDR, etc.), or a derivative of such an antibody (for example a simple antibody). chain, ScFv).
  • the ligand is typically immobilized on a support, such as a blade, ball, column, plate, etc.
  • the presence of the target polypeptide in the sample can be detected by detecting a complex between the target and the ligand, for example by using a labeled ligand, by using a second labeled revealing ligand, etc.
  • Immunological techniques which can be used and which are well known are ELISA, RIA, etc.
  • Antibodies specific for the target polypeptides can be produced by conventional techniques, in particular by immunization of a non-human animal with an immunogen comprising the polypeptide (or an immunogenic fragment thereof), and recovery of the antibodies (polyclonal) or producer cells (to produce monoclonals). Techniques for producing poly- or monoclonal antibodies, ScFv fragments, human or humanized antibodies are described for example in Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988; Ward et al., Nature 341 (1989)
  • the immunogen can be manufactured by synthesis, or by expression, in an appropriate host, of a target nucleic acid as defined above.
  • a target nucleic acid as defined above.
  • the method of the invention is applicable to any biological sample from the mammal tested, in particular any sample comprising nucleic acids or polypeptides. Mention may advantageously be made of a sample of blood, plasma, platelet, saliva, urine, stool, etc., more generally any tissue, organ or, advantageously, biological fluid comprising nucleic acids or polypeptides.
  • the sample is a blood or plasma sample.
  • the sample can be obtained by any technique known per se, for example by sampling, by non-invasive techniques, from collections or banks of samples, etc.
  • the sample can also be pre-treated to facilitate the accessibility of the target molecules, for example by lysis (mechanical, chemical, enzymatic, etc.), purification, centrifugation, separation, etc.
  • the sample can also be labeled, to facilitate the determination of the presence of the target molecules (fluorescent, radioactive, luminescent, chemical, enzymatic, etc. labeling).
  • the invention is applicable to any mammal, preferably chosen from cattle, sheep and humans.
  • the method of the invention is particularly useful for the detection of scrapie in sheep, Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle, and Creutzfeld-Jakob disease (CJD), kuru and l fatal family insomnia in men.
  • BSE Bovine Spongiform Encephalopathy
  • CJD Creutzfeld-Jakob disease
  • a particular subject of the present application relates to a method for detecting the presence or the risk of developing BSE in a bovine animal, comprising determining the presence (or absence), in a biological sample of the bovine animal, of one or more several target molecules chosen from: a) a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 26 or a fragment thereof having at least 5, preferably 6, 7, 8, 9 or 10 consecutive bases, b ) a nucleic acid having a sequence complementary to a sequence according to a), c) a polypeptide encoded by a nucleic acid according to a) or b).
  • Another particular object of the present application relates to a method for detecting the presence or the risk of developing BSE in a bovine or ovine, comprising bringing a biological sample from bovine or ovine containing nucleic acids into contact with a product comprising a support on which is immobilized at least one nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these, and determining the hybridization profile, the profile indicating the presence or the risk of developing BSE in cattle or sheep.
  • the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different nucleic acids chosen from the nucleic acids mentioned above.
  • the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these this.
  • a product comprising a support on which is immobilized at least one nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, an acid nucleic acid having a sequence complementary thereto or a functional analog thereof.
  • the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different nucleic acids chosen from the nucleic acids mentioned above.
  • the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these this
  • Another subject of the present application relates to a product comprising a support on which is immobilized at least one polypeptide encoded by a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 15 bases consecutive, a nucleic acid having a sequence complementary thereto or a functional analog thereof.
  • the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different polypeptides chosen from the polypeptides mentioned above.
  • the support can be any solid or semi-solid support having at least one surface, flat or not, allowing the immobilization of nucleic acids or polypeptides.
  • Such supports are for example a blade, ball, membrane, filter, column, plate, etc. They can be made of any compatible material, such as in particular glass, silica, plastic, fiber, metal, polymer, polystyrene, teflon, etc.
  • the reagents can be immobilized on the surface of the support by known techniques, or, in the case of nucleic acids, synthesized directly in situ on the support. Immobilization techniques include passive adsorption (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), covalent bonding.
  • the reagents immobilized on the support can be ordered according to a pre-established scheme, to facilitate the detection and identification of the complexes formed, and according to a variable and adaptable density.
  • the product of the invention comprises a plurality of synthetic oligonucleotides, of a length between 5 and 100 bases, specific for one or more target nucleic acids defined in a) to c).
  • the products of the invention typically include control molecules, making it possible to calibrate and / or standardize the results.
  • kits comprising a compartment or container comprising at least one nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, a nucleic acid having a sequence complementary to these or a functional analog thereof.
  • the product comprises at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different nucleic acids chosen from the nucleic acids mentioned above.
  • the product each comprises nucleic acids of sequence SEQ ID NO: 1 to 26, a fragment thereof having at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these this.
  • the kit can also include reagents for a hybridization or immunological reaction, as well as, if necessary, controls and / or instructions.
  • Another object of the invention relates to the use of a product or kit as defined above for the detection of encephalopathy in a mammalian subject.
  • Another subject of the invention relates to a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-26, or a fragment thereof comprising at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these , or a functional analog thereof, in particular an analog from another species.
  • the invention also relates to a cloning or expression vector comprising these nucleic acids, as well as any recombinant cell comprising such a vector or nucleic acid.
  • Another subject of the invention relates to the use of a nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID NO: 1-26, or a fragment thereof comprising at least 5 consecutive bases, or a nucleic acid having a sequence complementary to these, or a functional analog thereof, in particular an analog from another species, for the detection (essentially in vitro) of encephalopathy in a mammalian subject.
  • a blood sample from a mammal to be tested is taken.
  • the blood sample is processed to make the nucleic acids more accessible, and these are labeled.
  • the nucleic aids are then applied to a product as defined above and the hybridization profile is determined, making it possible to diagnose the presence or not of an encephalopathy in the subject.
  • the method of the invention is simple, practiced ex vivo, on living animals, and allows the early detection of a prion disease.

Abstract

La présente demande concerne des marqueurs biologiques des encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en oeuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence d'une infection chez les mammifères, y compris en phase précoce.

Description

Identification de marqueurs diagnostic pour les encephalopathies subaiguës spongiformes transmissibles
La présente demande concerne des marqueurs biologiques des encephalopathies subaiguës spongiformes transmissibles et leurs utilisations dans des méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits utilisables pour la mise en œuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces, cellules, etc.), leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour détecter la présence d'une infection chez les mammifères, y compris en phase précoce.
Les maladies à prions, également appelées encephalopathies subaiguës spongiformes transmissibles ou maladies à agents transmissibles non conventionnels (ATNC) sont des maladies du système nerveux central rencontrées chez certains mammifères, dont l'homme.
Les formes les plus connues de ces maladies sont la tremblante du mouton chez les ovins, l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, la maladie de Creutzfeld- Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme.
L'agent infectieux n'est pas encore définitivement déterminé, mais l'hypothèse la plus acceptée est que ces maladies sont associées à l'accumulation dans le cerveau d'une protéine prion (PrP) de conformation anormale par rapport à la conformation observée chez les individus sains.
La découverte d'une nouvelle variante de MJC (vMJC) après l'épidémie bovine de ESB en Angleterre confirme que ces maladies sont transmissibles et vraisemblablement peuvent franchir la barrière des espèces par le biais de l'alimentation. Leur évolution lente et fatale, est associée à des lésions qui affectent exclusivement le système nerveux central.
Avec la découverte de vMCJ, des mesures d'urgences ont été mises en place pour évaluer l'ampleur de l'épidémie de l'ESB et pour protéger la santé publique. L'Union européenne impose désormais le test systématique de toute viande provenant de bovins abattus et âgés de plus de 30 mois. Le temps d'incubation de l'ESB étant autour de cinq années, période durant laquelle l'infection peut se propager latéralement et verticalement, le développement d'un test diagnostic sur des animaux vivants revêt une importance vitale. Un test précoce offrirait un moyen sûr d'exclure les animaux infectés de la chaîne alimentaire. Le test utilisé aujourd'hui détecte uniquement de façon post mortem les animaux infectés à un stade tardif de la maladie.
Il y a un besoin urgent de mettre sur pied un test diagnostique capable de détecter des encephalopathies à un stade précoce chez des animaux vivants et de façon rapide. Un tel test permettrait de suivre tous les animaux à risque en les testant de multiple fois au cours de leur vie.
La demande WO02/074986, appartenant au demandeur, décrit plusieurs marqueurs génétiques des encephalopathies. Par une recherche extensive utilisant une approche innovante, différents marqueurs supplémentaires de l'ESB ont été identifiés et validés dans des expériences d'hybridation, permettant d'établir un test pré-symptomatique utilisable à partir du sang d'un mammifère vivant.
Les marqueurs identifiés ont été isolés par la technique DATAS (demande de brevet n° WO99/46403). DATAS identifie des différences qualitatives de l'expression de gènes et fournit une analyse systématique de l'ARN épissé entre deux conditions : sains/infecté. DATAS mène à l'identification de variants ARN fonctionnellement distincts. La technique DATAS comprend trois étapes distinctes: la collecte de tissu, l'isolement des ARNs et la construction d'un répertoire contenant des différences qualitatives et identifiant des nouveaux fragments de gènes, qui ne peuvent pas être isolés par d'autres techniques génétiques.
Par comparaison de l'expression qualitative des gènes dans les cellules sanguines de mammifères sains et infectés naturellement ou expérimentalement par l'ESB, différentes signatures de marqueurs génétiques ont été isolées. Les mammifères naturellement infectés étaient au stade final de la maladie, alors que les mammifères infectés par voie orale avec 1 g de cerveaux infectés par l'ESB, représentaient le stade précoce de la maladie. La mise en œuvre de la méthodologie DATAS sur des cellules sanguines de vaches a permis l'identification et l'isolement de plusieurs milliers de marqueurs génétiques, répartis en deux répertoires représentatifs de l'expression qualitative des gènes entre des vaches saines et des vaches infectées naturellement d'une part, et entre des vaches saines et des vaches infectées expérimentalement d'autre part.
Les marqueurs contenus dans ces répertoires ont été sélectionnés et validés selon deux approches:
Dans la première approche, les fragments de gènes communs aux deux répertoires DATAS ainsi produits ont été identifiés. La séquence de ces 11 marqueurs est représentée dans les séquences SEQ ID NO: 16-26.
Dans la seconde approche, les différents clones des deux expériences DATAS ont été déposés sur lames de verre. Les lames ont été hybridées avec des sondes produites à partir de matériel biologique de vaches infectées naturellement ou expérimentalement et de vaches saines utilisées comme contrôle. Au travers de deux types d'analyses statistiques, SAM (Significance Analysis of Microarray) et PAM (Prédiction analysis of Microarray) comparant les animaux sains versus les animaux infectés, 15 clones ont été observés comme présentant une dérégulation dans les conditions sain versus infectés. Les 15 séquences d'acides nucléiques sont décrites ci-dessous comme SEQ ID NO:l-15.
La présente demande fournit ainsi un ensemble de marqueurs biologiques qui peuvent être utilisés, seuls ou en combinaison(s), pour détecter, caractériser ou suivre une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un mammifère. L'invention est utile notamment pour détecter la présence de maladies à prion chez des sujets mammifères, notamment ovins, bovins ou humains. Elle est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle peut être réalisée sur des mammifères vivants, à partir de fluides biologiques tels que le sang, plasma, plaquettes, etc. Un objet de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du mammifère, d'une molécule cible choisie parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NOs: 1 à 26 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un analogue fonctionnel d'un acide nucléique selon a) ou b), ou d) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) à c), la présence (ou l'absence) d'une telle molécule cible dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer une encéphalopathie chez ce mammifère.
Dans une variante particulière de mise en œuvre, la méthode comprend la détermination (simultanée) de la présence ou absence d'au moins, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus des molécules cibles telles que définies ci-dessus. L'invention permet en effet d'établir et de déterminer un profil d'hybridation sur un ensemble de marqueurs, afin d'évaluer la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère. Le profil d'hybridation est typiquement réalisé en utilisant une combinaison de plusieurs marqueurs choisis par les cibles indiquées ci-dessus, par exemple contenant l'ensemble de ces cibles.
La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la protéine correspondant aux séquences SEQ ID NOs: 1-26, ou un fragment de celles-ci, par exemple un fragment comportant un domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.). Un analogue fonctionnel désigne plus particulièrement un analogue provenant d'une autre espèce (par exemple homme, mouton, etc.), ou un variant naturel résultant par exemple de polymorphisme, épissage, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination de la présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c). Différentes techniques utilisables pour détecter une espèce d'acide nucléique dans un échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple le Northern Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus d'oligonucléotides sondes, l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR quantitative et ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde nucléique (par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou spécifiquement l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être réalisée selon différentes méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR, l'amplification médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA), NASBA, l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification spécifique d'allèle, le Southern blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ (e.g., FISH), la migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective.
L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes nucléiques, de préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes nucléiques. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être tout acide nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une séquence spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les sondes comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus préférentiellement moins de 100. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques, produits sur la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques de synthèse classique. Les sondes peuvent également être synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues en soi de l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des techniques génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc. Une telle sonde constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet. De manière particulièrement préférée, on utilise un ensemble de sondes nucléiques comprenant tout ou un fragment de 5 bases consécutives au moins de chacune des séquences SEQ ID NO : 1-26, ou d'un brin complémentaire de celles-ci, avantageusement immobilisées sur un support.
L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de l'homme du métier et ajustables par celui-ci (Sambrook et al). En particulier, l'hybridation peut être réalisée dans des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de sensibilité recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des conditions appropriées d'hybridation incluent une température comprise entre 62 et 67°C pendant 2 à 18 heures. Après l'hybridation, différents lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées, typiquement dans des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X SSC et 0,1% SDS.
Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou supports) sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) contenant typiquement 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C pendant 30 min.
Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les sondes
(typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65°C pendant 2 à 18 heures. De préférence, les acides nucléique de l'échantillon sont marqués au préalable, par tout marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les supports sont ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65°C pendant 30 min, puis dans un tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des techniques classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen d'un instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon.
L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce ou une paire d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides nucléiques cibles dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être spécifique d'une séquence cible selon SEQ ID NO : 1-26, ou d'une région flanquant la séquence cible dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un acide nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50 bases, de préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la présente demande, ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la présence d'un polypeptide selon d). La mise en évidence d'un polypeptide dans un échantillon peut être réalisée par toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand spécifique, par exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le ligand est un anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par exemple un Fab, Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps simple-chaîne, ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame, bille, colonne, plaque, etc. La présence du polypeptide cible dans l'échantillon peut être détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par exemple en utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation marqué, etc. Des techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques ELISA, RIA, etc.
Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par des techniques conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci), et récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour produire des monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux, de fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple dans Harlow et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al., Nature 341 (1989)
544 ; Bird et al., Science 242 (1988) 423 ; WO94/02602 ; US5,223,409 ; US5,877,293 ;
WO93/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression, dans un hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel anticorps, monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité antigénique, constituent également un objet de la présente demande, de même que leur utilisation pour détecter une encéphalopathie. La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du mammifère testé, en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. On peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive, urine, selles, etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide biologique comportant des acides nucléiques ou des polypeptides. Dans un mode de mise en oeuvre préféré, l'échantillon est un échantillon de sang ou plasma. L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple par prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou banques d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour faciliter l'accessibilité des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique, etc.), purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également être marqué, pour faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage fluorescent, radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.).
L'invention est applicable à tout mammifère, de préférence choisi parmi les bovins, ovins et humains. La méthode de l'invention est particulièrement utile pour la détection de la tremblante du mouton chez les ovins, de l' Encéphalopathie Spongiforme Bovine (ESB) chez les bovins, et de la maladie de Creutzfeld-Jakob (MCJ), le kuru et l'insomnie fatale familiale chez l'homme.
Un objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin, comprenant la détermination de la présence (ou de l'absence), dans un échantillon biologique du bovin, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) ou b).
Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin ou un ovin, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du bovin ou ovin contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence ou le risque de développer une ESB chez le bovin ou ovin. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un polypeptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 15 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 polypeptides différents choisis parmi les polypeptides mentionnés ci- dessus.
Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation d'acides nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère, polystyrène, téflon, etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des techniques connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in situ sur le support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont décrites par exemple dans WO90/03382, WO99/46403). Les réactifs immobilisés sur le support peuvent être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et l'identification des complexes formés, et selon une densité variable et adaptable.
Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un pluralité d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases, spécifiques d'un ou plusieurs acides nucléiques cibles définis en a) à c).
Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle, permettant d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci ou un analogue fonctionnel de celles-ci. De préférence, le produit comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides nucléiques différents choisis parmi les acides nucléiques mentionnés ci-dessus. Dans un mode particulier de mise en oeuvre, le produit comprend chacun des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci. Le kit peut comprendre par ailleurs des réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas échéant, des contrôles et/ou instructions.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel que défini ci- dessus pour la détection d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère. Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1-26, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce. L'invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression comportant ces acides nucléiques, ainsi que toute cellule recombinante comprenant un tel vecteur ou acide nucléique.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1-26, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci, en particulier un analogue provenant d'une autre espèce, pour la détection (essentiellement in vitro) d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère.
Selon un exemple particulier de mise en œuvre de l'invention, on prélève un échantillon de sang d'un mammifère à tester. L'échantillon de sang est traité de manière à rendre les acides nucléiques plus accessibles, et ceux-ci sont marqués. Les aides nucléiques sont ensuite appliqués sur un produit tel que défini ci-avant et le profil d'hybridation est déterminé, permettant de diagnostiquer la présence ou non d'une encéphalopathie chez le sujet. La méthode de l'invention est simple, pratiquée ex vivo, sur des animaux vivants, et permet la détection précoce d'une maladie à prion.
II est entendu que toute technique équivalente peut être utilisée dans le cadre de la présente demande pour déterminer la présence d'une molécule cible. La liste des séquences est donnée ci-après (N désigne toute base).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une encéphalopathie chez un mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère, d'une molécule cible choisie parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un analogue fonctionnel d'un acide nucléique selon a) ou b) provenant d'une autre espèce ou un variant naturel, ou d) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) à c), la présence d'une telle molécule cible dans l'échantillon étant une indication de la présence ou du risque de développer une encéphalopathie chez ce mammifère.
2. Méthode selon la revendication 1, comprenant la détermination (simultanée) de la présence d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus des molécules cibles.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique selon a) à c) par hybridation sélective ou amplification sélective.
4. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la détection de la présence ou de l'absence d'un polypeptide selon d) au moyen d'un anticorps spécifique ou d'un fragment ou dérivé de celui-ci.
5. Méthode selon la revendication 1, pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du bovin, d'une ou plusieurs molécules cibles choisies parmi: a) un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26 ou un fragment de celles-ci ayant au moins 5, de préférence 6, 7, 8, 9 ou 10 bases consécutives, b) un acide nucléique ayant une séquence complémentaire d'une séquence selon a), c) un polypeptide codé par un acide nucléique selon a) ou b).
6. Méthode pour détecter la présence ou le risque de développer une ESB chez un bovin ou un ovin, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du bovin ou ovin contenant des acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26, un fragment de celles-ci ayant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, et la détermination du profil d'hybridation, le profil indiquant la présence ou le risque de développer une ESB chez le bovin ou ovin.
7. Utilisation d'une sonde nucléique spécifique d'un acide nucléique cible tel que défini dans la revendication 1, ladite sonde comprenant de 5 à 400 bases, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet.
8. Utilisation d'une amorce nucléique permettant l'amplification de tout ou partie d'un acide nucléique cible tel que défini dans la revendication 1, ladite amorce étant simple- brin, d'une longueur comprise entre 5 et 50 bases, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet.
9. Produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26.
10. Produit comprenant un support sur lequel est immobilisé au moins un polypeptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26.
11. Kit comprenant un compartiment ou conteneur comprenant au moins un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à 26.
12. Utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1-26, ou un fragment de celles-ci comprenant au moins 5 bases consécutives, ou un acide nucléique ayant une séquence complémentaire de celles-ci, ou un analogue fonctionnel de celles-ci provenant d'une autre espèce ou un variant naturel, pour la détection in vitro d'une encéphalopathie chez un sujet mammifère.
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