JP2001017184A - 癌転移能検査方法、および癌転移抑制薬のスクリーニング方法 - Google Patents
癌転移能検査方法、および癌転移抑制薬のスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌転移能の指標を見出し、この指標に基づく
癌転移能の検査方法と、癌転移抑制薬のスクリーニング
方法を提供する。 【解決手段】 コネキシン２６の発現レベルを指標とす
る癌転移能の検査方法が提供される。また、コネキシン
２６に対する結合活性に基づく、癌転移抑制薬のスクリ
ーニング方法を提供する。コネキシン２６(connexin 2
6)の発現レベルは、癌の転移能の高さに応じて高まる新
規なマーカーである。
癌転移能の検査方法と、癌転移抑制薬のスクリーニング
方法を提供する。 【解決手段】 コネキシン２６の発現レベルを指標とす
る癌転移能の検査方法が提供される。また、コネキシン
２６に対する結合活性に基づく、癌転移抑制薬のスクリ
ーニング方法を提供する。コネキシン２６(connexin 2
6)の発現レベルは、癌の転移能の高さに応じて高まる新
規なマーカーである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌の転移能の試験
方法、ならびに癌の転移を抑制する活性を持つ化合物の
スクリーニング方法に関する。
方法、ならびに癌の転移を抑制する活性を持つ化合物の
スクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌の進行にともなって、癌の転移が起き
る。癌の転移は、ある組織で増殖した癌が、その組織を
離れて他の部位に浸潤し増殖を開始する現象を言う。転
移した癌を治療しえない場合には、いずれ何らかの形で
患者の命を奪う原因につながる。癌が転移する能力を持
つことは、一般に癌の悪性化と呼ばれている。癌の悪性
化の程度を把握し、その転移を防ぐことは、癌の早期発
見を可能とする診断方法や、発見された癌を取り除く治
療方法と並んで、癌を克服するための重要な研究テーマ
である。
る。癌の転移は、ある組織で増殖した癌が、その組織を
離れて他の部位に浸潤し増殖を開始する現象を言う。転
移した癌を治療しえない場合には、いずれ何らかの形で
患者の命を奪う原因につながる。癌が転移する能力を持
つことは、一般に癌の悪性化と呼ばれている。癌の悪性
化の程度を把握し、その転移を防ぐことは、癌の早期発
見を可能とする診断方法や、発見された癌を取り除く治
療方法と並んで、癌を克服するための重要な研究テーマ
である。
【０００３】癌の転移は、原発巣からの離脱、癌細胞の
組織間の移動、そして再増殖という複数のステップから
なっている。実際には、この一連の過程には複雑な機構
が関与しているとされており、その全体像は未だに解明
されていない。たとえば、マトリクスメタロプロテアー
ゼ(MMP)と呼ばれる一群のプロテアーゼの活性化は、癌
の発生や悪性化と密接に関連しているといわれている。
原発巣から離脱して血管内に侵入するとき、そして転移
先に浸潤していくとき、細胞外基質(Extracellular mat
rix; ECM)の分解活性は重要な要素である。MMPは、この
ECMの分解に深く関与しているとされている。そのためM
MP阻害剤には、抗癌剤として開発を進められているもの
もある。また細胞接着分子であるインテグリンは、癌の
転移において、転移活性と転移先の臓器特異性に関与す
るとする報告がある。しかし先に述べたように、癌の転
移には未解明の部分が多く残されており、上記のような
これまでに明らかにされた機構のみでは、その全体像の
説明は不可能である。また、癌の転移を防ぐ治療薬の開
発においても、更に詳細な転移のメカニズムの解明が必
要である。癌の転移をいくつかの異なったステップの積
み重ねの結果とするなら、各ステップの達成に必要な因
子を明らかにし、それらの活性を総合的に把握すること
が癌の転移能を正確に評価することにつながる。また転
移の予防においては、各ステップを構成する主要な因子
を個別に阻害することにより、確実な転移の防止が達成
されることになる。特に、一般に転移の危険が大きいと
されているメラノーマや、肺小細胞癌において、その転
移能を支えている因子を解明することができれば、診断
や治療におおいに貢献するものと思われる。
組織間の移動、そして再増殖という複数のステップから
なっている。実際には、この一連の過程には複雑な機構
が関与しているとされており、その全体像は未だに解明
されていない。たとえば、マトリクスメタロプロテアー
ゼ(MMP)と呼ばれる一群のプロテアーゼの活性化は、癌
の発生や悪性化と密接に関連しているといわれている。
原発巣から離脱して血管内に侵入するとき、そして転移
先に浸潤していくとき、細胞外基質(Extracellular mat
rix; ECM)の分解活性は重要な要素である。MMPは、この
ECMの分解に深く関与しているとされている。そのためM
MP阻害剤には、抗癌剤として開発を進められているもの
もある。また細胞接着分子であるインテグリンは、癌の
転移において、転移活性と転移先の臓器特異性に関与す
るとする報告がある。しかし先に述べたように、癌の転
移には未解明の部分が多く残されており、上記のような
これまでに明らかにされた機構のみでは、その全体像の
説明は不可能である。また、癌の転移を防ぐ治療薬の開
発においても、更に詳細な転移のメカニズムの解明が必
要である。癌の転移をいくつかの異なったステップの積
み重ねの結果とするなら、各ステップの達成に必要な因
子を明らかにし、それらの活性を総合的に把握すること
が癌の転移能を正確に評価することにつながる。また転
移の予防においては、各ステップを構成する主要な因子
を個別に阻害することにより、確実な転移の防止が達成
されることになる。特に、一般に転移の危険が大きいと
されているメラノーマや、肺小細胞癌において、その転
移能を支えている因子を解明することができれば、診断
や治療におおいに貢献するものと思われる。
【０００４】現在までに報告されている癌転移関連因子
のほとんどはディファレンシャル・ディスプレー法(dif
ferential display)によって発見されている。本発明の
実施例において用いたF10細胞とBL6細胞を利用し、ディ
ファレンシャル・ディスプレー法によって癌の転移に関
連する遺伝子の単離を試みた報告もある(Cancer Res.5
6, 875-879, 1996)。しかし単離された遺伝子の多く
は、いわゆるハウスキーピング遺伝子であり、ディファ
レンシャル・ディスプレー法の弱点である効率の低さを
表している。
のほとんどはディファレンシャル・ディスプレー法(dif
ferential display)によって発見されている。本発明の
実施例において用いたF10細胞とBL6細胞を利用し、ディ
ファレンシャル・ディスプレー法によって癌の転移に関
連する遺伝子の単離を試みた報告もある(Cancer Res.5
6, 875-879, 1996)。しかし単離された遺伝子の多く
は、いわゆるハウスキーピング遺伝子であり、ディファ
レンシャル・ディスプレー法の弱点である効率の低さを
表している。
【０００５】一方、細胞間の結合様式の一つとして、ギ
ャップ結合(Gap junction)が知られている。ギャップ結
合は、動物の組織の多くで見られる細胞間の結合様式で
ある。ギャップ結合では、隣接する細胞が互いに隙間を
維持して結合し、結合部分にはコネクソンによって構成
された細胞間を連絡する通路が形成されている。例えば
cAMPのような分子量が1000Da以下の低分子量の物質は、
この連絡通路を介して細胞間での移動が可能となってい
る。一方、通常のタンパク質や核酸は通過することはで
きない。この現象を利用して、ギャップ結合アッセイと
呼ばれる分析方法が開発されている。すなわち、一方の
細胞に分子量1000-1500程度の蛍光色素を保持させ、他
の細胞と接触させる。両者の間でギャップ結合が形成さ
れた場合には、蛍光色素が他方の細胞に移動する（これ
を共役と言う）現象が観察される。ギャップ結合アッセ
イの中でも、マーカーとして蛍光色素を用いる場合に
は、特に色素トランスファーアッセイと呼ばれることも
ある。
ャップ結合(Gap junction)が知られている。ギャップ結
合は、動物の組織の多くで見られる細胞間の結合様式で
ある。ギャップ結合では、隣接する細胞が互いに隙間を
維持して結合し、結合部分にはコネクソンによって構成
された細胞間を連絡する通路が形成されている。例えば
cAMPのような分子量が1000Da以下の低分子量の物質は、
この連絡通路を介して細胞間での移動が可能となってい
る。一方、通常のタンパク質や核酸は通過することはで
きない。この現象を利用して、ギャップ結合アッセイと
呼ばれる分析方法が開発されている。すなわち、一方の
細胞に分子量1000-1500程度の蛍光色素を保持させ、他
の細胞と接触させる。両者の間でギャップ結合が形成さ
れた場合には、蛍光色素が他方の細胞に移動する（これ
を共役と言う）現象が観察される。ギャップ結合アッセ
イの中でも、マーカーとして蛍光色素を用いる場合に
は、特に色素トランスファーアッセイと呼ばれることも
ある。
【０００６】コネクソンは、コネキシン(connexin)と呼
ばれる互いに構造が類似したタンパク質群で構成されて
いる。現在までに１２種のコネキシンが同定されてお
り、αタイプとβタイプとに分類されている。特定の細
胞には特定のコネキシンが発現していることが知られて
いる一方、コネキシン自体は多くの異なる種類の細胞で
発現しており、進化的にも良く保存されていることか
ら、細胞社会の成立に重要な機能を担っていると考えら
れている。近年の分子遺伝学の進歩により、いくつかの
遺伝性疾患とコネキシンの関係が明らかになった。たと
えば、β1コネキシン/ コネキシン32 (Cx32) は遺伝性
神経変性疾患であるX-linked Charcot-Marie-Tooth dis
ease (CMTX) の原因遺伝子である(Science 1993 Dec 2
4; 262 (5142): 2039-2042)。またα1コネキシン/ コネ
キシン43 (Cx43) は、心臓の逆位などの症候を呈する遺
伝性疾患であるvisceroatrial heterotaxia syndrome
(VAH)の原因遺伝子とされている (N Engl J Med 1995 M
ay 18; 332 (20): 1323-1329)。そしてβ2コネキシン/
コネキシン２６ (Cx26) は、遺伝性難聴疾患である aut
osomal recessive non-syndromic deafness (DFNB1) (N
ature 1997 May 1; 387(6628): 80-83)とautosomal dom
inant non-syndromic deafness (DFNA) (Nature 1998 M
ay 28; 393 (6683): 319-320) の原因遺伝子であること
が明らかになった。
ばれる互いに構造が類似したタンパク質群で構成されて
いる。現在までに１２種のコネキシンが同定されてお
り、αタイプとβタイプとに分類されている。特定の細
胞には特定のコネキシンが発現していることが知られて
いる一方、コネキシン自体は多くの異なる種類の細胞で
発現しており、進化的にも良く保存されていることか
ら、細胞社会の成立に重要な機能を担っていると考えら
れている。近年の分子遺伝学の進歩により、いくつかの
遺伝性疾患とコネキシンの関係が明らかになった。たと
えば、β1コネキシン/ コネキシン32 (Cx32) は遺伝性
神経変性疾患であるX-linked Charcot-Marie-Tooth dis
ease (CMTX) の原因遺伝子である(Science 1993 Dec 2
4; 262 (5142): 2039-2042)。またα1コネキシン/ コネ
キシン43 (Cx43) は、心臓の逆位などの症候を呈する遺
伝性疾患であるvisceroatrial heterotaxia syndrome
(VAH)の原因遺伝子とされている (N Engl J Med 1995 M
ay 18; 332 (20): 1323-1329)。そしてβ2コネキシン/
コネキシン２６ (Cx26) は、遺伝性難聴疾患である aut
osomal recessive non-syndromic deafness (DFNB1) (N
ature 1997 May 1; 387(6628): 80-83)とautosomal dom
inant non-syndromic deafness (DFNA) (Nature 1998 M
ay 28; 393 (6683): 319-320) の原因遺伝子であること
が明らかになった。
【０００７】ところで細胞増殖の抑制シグナルは、ギャ
ップ結合を通って直接隣あった細胞に伝えられるいう仮
説が提唱されてきた。この仮説を裏付けるように正常乳
腺細胞と乳癌細胞とのサブトラクション法により、正常
乳腺細胞には発現しているが乳癌細胞には発現していな
い遺伝子として、コネキシン２６（以下、Cx26と省略す
る場合もある）が単離された(Proc Natl Acad Sci USA
1991 Apr 1; 88 (7):2825-2829)。実際、実験的に Cx26
を乳癌細胞株に強発現させることにより増殖は抑制さ
れ、ヌードマウスにおいての造腫瘍活性も顕著に低下
し、Cx26は乳癌において癌抑制遺伝子としての機能があ
ることが報告された。さらにHeLa 細胞においてもCx26
は細胞増殖を抑制すると同時に、癌の遺伝子治療時に遺
伝子が導入された細胞のみならず、周辺の細胞も殺すと
いうバイスタンダー効果を増強することが報告された
(Cancer Res 1997 Jul 15; 57 (14): 2929-2932)。しか
し原発性の脳腫瘍ではCx26とCx43 が発現しており (Neu
rosurgery 1999 Feb; 44 (2): 361-369)、正常乳腺では
Cx26 の発現は非常に低い一方、非定形型の乳癌の56%で
はCx26 の発現が増強していた (J Pathol 1998 Jan; 18
4 (1): 37-43) という報告があるなど、人為的な実験か
ら得られた結果と臨床サンプルを用いた結果とは必ずし
も一致していないのが現状である。
ップ結合を通って直接隣あった細胞に伝えられるいう仮
説が提唱されてきた。この仮説を裏付けるように正常乳
腺細胞と乳癌細胞とのサブトラクション法により、正常
乳腺細胞には発現しているが乳癌細胞には発現していな
い遺伝子として、コネキシン２６（以下、Cx26と省略す
る場合もある）が単離された(Proc Natl Acad Sci USA
1991 Apr 1; 88 (7):2825-2829)。実際、実験的に Cx26
を乳癌細胞株に強発現させることにより増殖は抑制さ
れ、ヌードマウスにおいての造腫瘍活性も顕著に低下
し、Cx26は乳癌において癌抑制遺伝子としての機能があ
ることが報告された。さらにHeLa 細胞においてもCx26
は細胞増殖を抑制すると同時に、癌の遺伝子治療時に遺
伝子が導入された細胞のみならず、周辺の細胞も殺すと
いうバイスタンダー効果を増強することが報告された
(Cancer Res 1997 Jul 15; 57 (14): 2929-2932)。しか
し原発性の脳腫瘍ではCx26とCx43 が発現しており (Neu
rosurgery 1999 Feb; 44 (2): 361-369)、正常乳腺では
Cx26 の発現は非常に低い一方、非定形型の乳癌の56%で
はCx26 の発現が増強していた (J Pathol 1998 Jan; 18
4 (1): 37-43) という報告があるなど、人為的な実験か
ら得られた結果と臨床サンプルを用いた結果とは必ずし
も一致していないのが現状である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、癌の
転移能を反映する新たな指標を提供することである。そ
して本発明は、この指標を利用して、癌の転移能の検査
方法、並びに癌の転移を抑制するための薬剤をスクリー
ニングする方法の提供を課題とする。
転移能を反映する新たな指標を提供することである。そ
して本発明は、この指標を利用して、癌の転移能の検査
方法、並びに癌の転移を抑制するための薬剤をスクリー
ニングする方法の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、転移能決
定因子を同定するため、マウス由来のBL6 細胞（自然高
転移性）と F10 細胞（自然低転移性）との間で cDNA
ライブラリーのサブトラクションを行い、BL6 細胞にお
いて高発現する２０数種の遺伝子を単離した。サブトラ
クション法には、転写標的遺伝子群の包括的、かつ能率
的なクローニングが可能な、厳密な方法を採用した。こ
の方法は本発明者らが開発した (KoboriM, Ikeda Y, Na
ra H, Kumegawa M, Nojima H and Kawashima H: Large
scale preparation of a subtracted cDNA library. Ge
nes Cells 3, 459-475, 1998)もので、高品質なcDNAラ
イブラリーを同じドライバーmRNAに対して繰り返し差分
化を行う。この方法によって癌転移に関連する遺伝子は
濃縮され、単離効率が著しく向上する。マウス・メラノ
ーマ細胞株 B16 の亜株には、実験的転移能（静脈注
射）と自然転移能（皮下注射）のいずれをも有する BL6
細胞と、実験的転移能は有するが自然転移能は有しな
い F10 細胞とがある。実験的転移能に比べて自然転移
能はヒトの悪性癌により近い性質を持っていると考えら
れ、本発明のサブトラクションには好適な組み合わせで
ある。そして、単離された遺伝子のうち、コネキシン２
６をはじめとするいくつかの遺伝子と転移性の間に一定
の関係があることを発見した。更に、これらの遺伝子の
全長cDNAをクローニングしF10細胞に導入してその自然
転移能を検定したところ、コネキシン２６を導入した細
胞においてのみ、BL6細胞相当の高い転移性が確認され
た。また、この効果が本当に コネキシン２６の過剰発
現によるものかどうかを確認するためコネキシン２６の
ドミナント・ネガティブ・フォームを BL6 細胞に導入
してBL6 細胞が本来持っている自然転移能を阻害するか
否かについて調査した。その結果、ドミナント・ネガテ
ィブ・フォームの発現量が、もともと BL6 細胞に存在
する内在性のコネキシン２６量を凌駕するにつれて自然
転移能を阻害した。
定因子を同定するため、マウス由来のBL6 細胞（自然高
転移性）と F10 細胞（自然低転移性）との間で cDNA
ライブラリーのサブトラクションを行い、BL6 細胞にお
いて高発現する２０数種の遺伝子を単離した。サブトラ
クション法には、転写標的遺伝子群の包括的、かつ能率
的なクローニングが可能な、厳密な方法を採用した。こ
の方法は本発明者らが開発した (KoboriM, Ikeda Y, Na
ra H, Kumegawa M, Nojima H and Kawashima H: Large
scale preparation of a subtracted cDNA library. Ge
nes Cells 3, 459-475, 1998)もので、高品質なcDNAラ
イブラリーを同じドライバーmRNAに対して繰り返し差分
化を行う。この方法によって癌転移に関連する遺伝子は
濃縮され、単離効率が著しく向上する。マウス・メラノ
ーマ細胞株 B16 の亜株には、実験的転移能（静脈注
射）と自然転移能（皮下注射）のいずれをも有する BL6
細胞と、実験的転移能は有するが自然転移能は有しな
い F10 細胞とがある。実験的転移能に比べて自然転移
能はヒトの悪性癌により近い性質を持っていると考えら
れ、本発明のサブトラクションには好適な組み合わせで
ある。そして、単離された遺伝子のうち、コネキシン２
６をはじめとするいくつかの遺伝子と転移性の間に一定
の関係があることを発見した。更に、これらの遺伝子の
全長cDNAをクローニングしF10細胞に導入してその自然
転移能を検定したところ、コネキシン２６を導入した細
胞においてのみ、BL6細胞相当の高い転移性が確認され
た。また、この効果が本当に コネキシン２６の過剰発
現によるものかどうかを確認するためコネキシン２６の
ドミナント・ネガティブ・フォームを BL6 細胞に導入
してBL6 細胞が本来持っている自然転移能を阻害するか
否かについて調査した。その結果、ドミナント・ネガテ
ィブ・フォームの発現量が、もともと BL6 細胞に存在
する内在性のコネキシン２６量を凌駕するにつれて自然
転移能を阻害した。
【００１０】本発明者らは、これらの知見に基づいて本
発明を完成した。すなわち本発明は、以下の癌転移能検
査方法と、癌転移抑制薬のスクリーニング方法に関す
る。 〔１〕癌細胞におけるコネキシン２６遺伝子の発現レベ
ルを正常細胞のコネキシン２６遺伝子の発現レベルと比
較する工程を含む、癌転移能の検査方法。 〔２〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシ
ン２６をコードするmRNAの定量によって評価する〔１〕
に記載の検査方法。 〔３〕mRNAにおける、少なくともコネキシン２６のギャ
ップ結合活性を示す領域をコードしている領域を定量す
る〔２〕に記載の検査方法。 〔４〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、癌細胞に
含まれるコネキシン２６タンパク質の定量によって評価
する〔１〕に記載の検査方法。 〔５〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシ
ン２６タンパク質を特異的に認識する抗体による免疫学
的な定量方法によって評価する〔４〕に記載の検査方
法。 〔６〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、体液中の
コネキシン２６タンパク質を指標として評価する工程を
含む癌転移能の検査方法。 〔７〕配列番号：１に示す塩基配列を持つDNAと特異的
にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも１５ヌ
クレオチドの鎖長を持つDNAを含む、癌転移能の検査用
試薬。 〔８〕配列番号：２に示すアミノ酸配列を持つタンパク
質と特異的に結合する抗体を含む、癌転移能の検査用試
薬。
発明を完成した。すなわち本発明は、以下の癌転移能検
査方法と、癌転移抑制薬のスクリーニング方法に関す
る。 〔１〕癌細胞におけるコネキシン２６遺伝子の発現レベ
ルを正常細胞のコネキシン２６遺伝子の発現レベルと比
較する工程を含む、癌転移能の検査方法。 〔２〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシ
ン２６をコードするmRNAの定量によって評価する〔１〕
に記載の検査方法。 〔３〕mRNAにおける、少なくともコネキシン２６のギャ
ップ結合活性を示す領域をコードしている領域を定量す
る〔２〕に記載の検査方法。 〔４〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、癌細胞に
含まれるコネキシン２６タンパク質の定量によって評価
する〔１〕に記載の検査方法。 〔５〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コネキシ
ン２６タンパク質を特異的に認識する抗体による免疫学
的な定量方法によって評価する〔４〕に記載の検査方
法。 〔６〕コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、体液中の
コネキシン２６タンパク質を指標として評価する工程を
含む癌転移能の検査方法。 〔７〕配列番号：１に示す塩基配列を持つDNAと特異的
にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも１５ヌ
クレオチドの鎖長を持つDNAを含む、癌転移能の検査用
試薬。 〔８〕配列番号：２に示すアミノ酸配列を持つタンパク
質と特異的に結合する抗体を含む、癌転移能の検査用試
薬。
〔９〕次の工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニン
グ方法。 ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示
す領域を含むタンパク質を提供する工程 ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、
および ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する
工程 〔１０〕候補化合物がランダムな塩基配列からなるRNA
ライブラリーである
グ方法。 ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示
す領域を含むタンパク質を提供する工程 ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、
および ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する
工程 〔１０〕候補化合物がランダムな塩基配列からなるRNA
ライブラリーである
〔９〕に記載のスクリーニング方
法。 〔１１〕
法。 〔１１〕
〔９〕または〔１０〕に記載の方法により単離
しうる化合物を主成分として含有する癌の転移抑制薬。
しうる化合物を主成分として含有する癌の転移抑制薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、癌細胞におけるコネキ
シン２６遺伝子の発現レベルを正常細胞のコネキシン２
６遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む、癌転移能
の検査方法である。本発明において、癌転移能の検査方
法とは、具体的には以下のような検査を意味する。第一
に、ある癌がどの程度の転移能を有するか、定量的な評
価を与える。第二に、癌の転移が起きている可能性を知
るための指標を与える。第三に、コネキシン２６を標的
とする癌の転移の防止が可能かどうかの指標を与える。
本発明の癌の転移能の検査方法とは、これらの検査方法
のいずれをも含むものである。コネキシン２６とは、ヒ
トにおいては配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる
タンパク質である。ヒト・コネキシン２６は、配列番
号：１に示す塩基配列を持つ遺伝子によってコードされ
ていることが明らかされている(J. Cell Biol. 118, 12
13-1221, 1992)。なお、コネキシン２６のような真核生
物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、し
ばしば多型現象が認められることがある。多型現象は遺
伝子の塩基配列に見出される小規模な塩基の置換で、通
常、塩基の置換がタンパク質の活性に与える影響は小さ
い。このような多型等によって塩基配列やアミノ酸に小
規模な変異を生じたコネキシン２６も、それが癌の転移
能に相関している限り、本発明におけるコネキシン２６
に含まれる。本発明において、コネキシン２６はヒト由
来のものに限定されない。ヒト以外では、マウス(Eur.
J. Cell Biol. 58, 81-89, 1992)、あるいはラット(J.
CellBiol. 109 (6 Pt 2), 3391-3401, 1989)におけるホ
モログが公知である。これら、コネキシン２６のホモロ
グは、それぞれの種において癌の悪性度の指標とするこ
とができる。
シン２６遺伝子の発現レベルを正常細胞のコネキシン２
６遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む、癌転移能
の検査方法である。本発明において、癌転移能の検査方
法とは、具体的には以下のような検査を意味する。第一
に、ある癌がどの程度の転移能を有するか、定量的な評
価を与える。第二に、癌の転移が起きている可能性を知
るための指標を与える。第三に、コネキシン２６を標的
とする癌の転移の防止が可能かどうかの指標を与える。
本発明の癌の転移能の検査方法とは、これらの検査方法
のいずれをも含むものである。コネキシン２６とは、ヒ
トにおいては配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる
タンパク質である。ヒト・コネキシン２６は、配列番
号：１に示す塩基配列を持つ遺伝子によってコードされ
ていることが明らかされている(J. Cell Biol. 118, 12
13-1221, 1992)。なお、コネキシン２６のような真核生
物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、し
ばしば多型現象が認められることがある。多型現象は遺
伝子の塩基配列に見出される小規模な塩基の置換で、通
常、塩基の置換がタンパク質の活性に与える影響は小さ
い。このような多型等によって塩基配列やアミノ酸に小
規模な変異を生じたコネキシン２６も、それが癌の転移
能に相関している限り、本発明におけるコネキシン２６
に含まれる。本発明において、コネキシン２６はヒト由
来のものに限定されない。ヒト以外では、マウス(Eur.
J. Cell Biol. 58, 81-89, 1992)、あるいはラット(J.
CellBiol. 109 (6 Pt 2), 3391-3401, 1989)におけるホ
モログが公知である。これら、コネキシン２６のホモロ
グは、それぞれの種において癌の悪性度の指標とするこ
とができる。
【００１２】本発明において、コネキシン２６遺伝子の
発現レベルは、mRNAの転写量、タンパク質量、あるいは
コネキシン２６の生物学的な活性などに基づいて評価す
ることができる。これらの手法は、いずれも公知の方法
にしたがって実施することができる。たとえばmRNA量
は、RT-PCR、FISH法、あるいはノーザンブロッティング
によって定量することができる。これらの手法に必要な
プライマーやプローブは、たとえば配列番号：１に示す
塩基配列（ヒトの場合）に基づいて、当業者に公知の方
法で設計することができる。以下にRT-PCRに用いること
ができるコネキシン２６をコードする遺伝子を増幅する
ためのプライマーを例示する。 センス側プライマー: 5'-GCGAATTCAGGTGTAAATTTACCAAAAATA-3'（配列番号：３） アンチセンス側プライマー： 5'-GCGCTCGAGCACCCAAGCTTTCCATCCTGG-3'（配列番号：４） 試料が癌細胞である場合には、細胞からmRNAを抽出し、
RT-PCRを実施することができる。あるいは、インサイチ
ュ RT-PCRやFISH法により、細胞内のmRNAレベルを直接
的に評価することもできる。
発現レベルは、mRNAの転写量、タンパク質量、あるいは
コネキシン２６の生物学的な活性などに基づいて評価す
ることができる。これらの手法は、いずれも公知の方法
にしたがって実施することができる。たとえばmRNA量
は、RT-PCR、FISH法、あるいはノーザンブロッティング
によって定量することができる。これらの手法に必要な
プライマーやプローブは、たとえば配列番号：１に示す
塩基配列（ヒトの場合）に基づいて、当業者に公知の方
法で設計することができる。以下にRT-PCRに用いること
ができるコネキシン２６をコードする遺伝子を増幅する
ためのプライマーを例示する。 センス側プライマー: 5'-GCGAATTCAGGTGTAAATTTACCAAAAATA-3'（配列番号：３） アンチセンス側プライマー： 5'-GCGCTCGAGCACCCAAGCTTTCCATCCTGG-3'（配列番号：４） 試料が癌細胞である場合には、細胞からmRNAを抽出し、
RT-PCRを実施することができる。あるいは、インサイチ
ュ RT-PCRやFISH法により、細胞内のmRNAレベルを直接
的に評価することもできる。
【００１３】次に、タンパク質量は、コネキシン２６に
特異的な抗体を利用したイムノアッセイによって知るこ
とができる。コネキシン２６に特異的な抗体は、たとえ
ばZymed社などから商業的に供給されている。あるいは
配列番号：２のアミノ酸配列を持つタンパク質を免疫原
として、公知の方法によりポリクローナル抗体やモノク
ローナル抗体を得ることもできる。免疫原として、配列
番号：２のアミノ酸配列から選択した、コネキシン２６
に特異的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを用いるこ
ともできる。イムノアッセイには様々なバリエーション
が知られているが、抗原性物質のイムノアッセイであれ
ば操作性、必要な感度、あるいは試料の特徴等を考慮し
て任意の方法を採用することができる。たとえば癌細胞
を直接試料として用いる場合、固定した細胞標本に対し
て免疫染色を施すことにより、コネキシン２６の発現レ
ベルの比較が可能である。あるいは、癌細胞の細胞ライ
ゼートを試料としてELISA法やウエスタンブロッティン
グ法を行い、コネキシン２６の発現レベルを把握するこ
とができる。
特異的な抗体を利用したイムノアッセイによって知るこ
とができる。コネキシン２６に特異的な抗体は、たとえ
ばZymed社などから商業的に供給されている。あるいは
配列番号：２のアミノ酸配列を持つタンパク質を免疫原
として、公知の方法によりポリクローナル抗体やモノク
ローナル抗体を得ることもできる。免疫原として、配列
番号：２のアミノ酸配列から選択した、コネキシン２６
に特異的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを用いるこ
ともできる。イムノアッセイには様々なバリエーション
が知られているが、抗原性物質のイムノアッセイであれ
ば操作性、必要な感度、あるいは試料の特徴等を考慮し
て任意の方法を採用することができる。たとえば癌細胞
を直接試料として用いる場合、固定した細胞標本に対し
て免疫染色を施すことにより、コネキシン２６の発現レ
ベルの比較が可能である。あるいは、癌細胞の細胞ライ
ゼートを試料としてELISA法やウエスタンブロッティン
グ法を行い、コネキシン２６の発現レベルを把握するこ
とができる。
【００１４】コネキシン２６の発現レベルは、癌細胞の
みならず、体液中においても比較することが可能であ
る。すなわち、たとえば血中におけるコネキシン２６の
mRNAやタンパク質レベルを測定することにより、コネキ
シン２６の発現レベルを知ることができる。癌の転移に
おいて、血流中への癌細胞の離脱は重要なステップとな
っている。この離脱した癌細胞に由来するコネキシン２
６を血中において比較することは、癌の転移の検査にお
いて重要な情報を与える。血中のmRNAの量は、RT-PCRに
より知ることができる。またタンパク質レベルについて
は、ELISAのようなイムノアッセイにより測定すること
ができる。得られたコネキシン２６のmRNA（またはタン
パク質）量は、健常者の測定値と比較することにより、
癌の転移能が評価される。
みならず、体液中においても比較することが可能であ
る。すなわち、たとえば血中におけるコネキシン２６の
mRNAやタンパク質レベルを測定することにより、コネキ
シン２６の発現レベルを知ることができる。癌の転移に
おいて、血流中への癌細胞の離脱は重要なステップとな
っている。この離脱した癌細胞に由来するコネキシン２
６を血中において比較することは、癌の転移の検査にお
いて重要な情報を与える。血中のmRNAの量は、RT-PCRに
より知ることができる。またタンパク質レベルについて
は、ELISAのようなイムノアッセイにより測定すること
ができる。得られたコネキシン２６のmRNA（またはタン
パク質）量は、健常者の測定値と比較することにより、
癌の転移能が評価される。
【００１５】以上のような、コネキシン２６の発現レベ
ルを知るために必要な成分は、癌の転移能検査用試薬と
して有用である。すなわち、配列番号：１に示す塩基配
列を持つDNAと特異的にハイブリダイズするDNAであっ
て、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を持つDNAは、
ヒトのコネキシン２６のmRNA量を測定するためのプライ
マーやプローブとして利用することができる。オリゴヌ
クレオチドは、検出を容易にするために予め標識してお
くことができる。オリゴヌクレオチドを、フルオレセイ
ンイソチオシアネートのような蛍光色素、32P等の放射
性同位元素、あるいはジゴキシンのような間接標識によ
って標識する方法は公知である。あるいは配列番号：２
に示したアミノ酸配列を持つタンパク質と特異的に結合
することができる抗体は、ヒト・コネキシン２６タンパ
ク質の免疫学的な検出に利用することができる。この抗
体についても、検出を容易とするために予め標識してお
くことができる。抗体を、ぺルオキシダーゼのような酵
素、フルオレセインイソチオシアネートのような蛍光色
素、125I等の放射性同位元素、あるいはビオチンのよう
な間接標識によって標識する方法は公知である。本発明
による癌転移能の検査用試薬には、コネキシン２６を既
知濃度で含む標準試料、試料の希釈や洗浄に用いる反応
用緩衝液、標識成分の検出のために必要な付加的な試薬
等を組み合わせてキットとすることができる。
ルを知るために必要な成分は、癌の転移能検査用試薬と
して有用である。すなわち、配列番号：１に示す塩基配
列を持つDNAと特異的にハイブリダイズするDNAであっ
て、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を持つDNAは、
ヒトのコネキシン２６のmRNA量を測定するためのプライ
マーやプローブとして利用することができる。オリゴヌ
クレオチドは、検出を容易にするために予め標識してお
くことができる。オリゴヌクレオチドを、フルオレセイ
ンイソチオシアネートのような蛍光色素、32P等の放射
性同位元素、あるいはジゴキシンのような間接標識によ
って標識する方法は公知である。あるいは配列番号：２
に示したアミノ酸配列を持つタンパク質と特異的に結合
することができる抗体は、ヒト・コネキシン２６タンパ
ク質の免疫学的な検出に利用することができる。この抗
体についても、検出を容易とするために予め標識してお
くことができる。抗体を、ぺルオキシダーゼのような酵
素、フルオレセインイソチオシアネートのような蛍光色
素、125I等の放射性同位元素、あるいはビオチンのよう
な間接標識によって標識する方法は公知である。本発明
による癌転移能の検査用試薬には、コネキシン２６を既
知濃度で含む標準試料、試料の希釈や洗浄に用いる反応
用緩衝液、標識成分の検出のために必要な付加的な試薬
等を組み合わせてキットとすることができる。
【００１６】本発明は、癌の転移能の検査方法に加え
て、コネキシン２６を標的とする癌の転移抑制薬のスク
リーニング方法をも提供する。すなわち本発明は、次の
工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニング方法であ
る。 ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示
す領域を含むタンパク質を提供する工程 ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、
および ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する
工程 本発明において、コネキシンとは配列番号：２のアミノ
酸配列を持つヒト由来のコネキシン２６の他、マウスや
ラット等のような他の主に由来するものであることもで
きる。しかし、ヒト由来のものを用いることにより、ヒ
トにおけるより高度な有効性を持つ化合物のスクリーニ
ングが期待できる。コネキシン２６は、完全な分子のみ
ならず、そのギャップ結合形成領域のみを用いることも
できる。ヒト・コネキシン２６においては、細胞外ルー
プE1（N末端から数えて４１−６７位のアミノ酸配列）
とE2（N末端から数えて１５９−１８９位のアミノ酸配
列）がコネクソンどうしの結合に必要である(Cell 1996
Feb 9; 84 (3): 381-388)。
て、コネキシン２６を標的とする癌の転移抑制薬のスク
リーニング方法をも提供する。すなわち本発明は、次の
工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリーニング方法であ
る。 ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示
す領域を含むタンパク質を提供する工程 ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、
および ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する
工程 本発明において、コネキシンとは配列番号：２のアミノ
酸配列を持つヒト由来のコネキシン２６の他、マウスや
ラット等のような他の主に由来するものであることもで
きる。しかし、ヒト由来のものを用いることにより、ヒ
トにおけるより高度な有効性を持つ化合物のスクリーニ
ングが期待できる。コネキシン２６は、完全な分子のみ
ならず、そのギャップ結合形成領域のみを用いることも
できる。ヒト・コネキシン２６においては、細胞外ルー
プE1（N末端から数えて４１−６７位のアミノ酸配列）
とE2（N末端から数えて１５９−１８９位のアミノ酸配
列）がコネクソンどうしの結合に必要である(Cell 1996
Feb 9; 84 (3): 381-388)。
【００１７】本発明のスクリーニング方法において、コ
ネキシン２６または候補化合物のいずれかを固相に固定
化し、他方を標識することにより、スクリーニングを効
率的に行うことができる。すなわち、たとえばコネキシ
ン２６（またはギャップ結合ドメイン）を固定化した担
体に、標識した候補化合物を接触させ、担体への標識の
結合に基づいて両者の結合を検出することができる。あ
るいは、たとえばコンビナトリアルケミストリーによっ
て固相上に合成された候補化合物ライブラリーに対し
て、標識したコネキシン２６（またはギャップ結合ドメ
イン）を接触させることによって、コネキシン２６に結
合する化合物をスクリーニングすることができる。
ネキシン２６または候補化合物のいずれかを固相に固定
化し、他方を標識することにより、スクリーニングを効
率的に行うことができる。すなわち、たとえばコネキシ
ン２６（またはギャップ結合ドメイン）を固定化した担
体に、標識した候補化合物を接触させ、担体への標識の
結合に基づいて両者の結合を検出することができる。あ
るいは、たとえばコンビナトリアルケミストリーによっ
て固相上に合成された候補化合物ライブラリーに対し
て、標識したコネキシン２６（またはギャップ結合ドメ
イン）を接触させることによって、コネキシン２６に結
合する化合物をスクリーニングすることができる。
【００１８】本発明のスクリーニング方法において利用
することができる候補化合物には、精製タンパク質（抗
体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプ
チドのライブラリー、RNAライブラリー、細胞抽出液、
細胞培養上清、あるいは合成低分子化合物のライブラリ
ーなどが挙げられるが、これらに制限されない。これら
の候補化合物の中でも、RNAライブラリーは、きわめて
多様性に富むライブラリーを比較的簡単な操作で合成す
ることができるので、候補化合物として望ましい。RNA
ライブラリーの合成と、このライブラリーのスクリーニ
ングは、一般に次のように行われる。 (1)まずDNA合成機を用いT7RNAポリメラーゼのプライマ
ー配列(34塩基)と任意の18塩基に挟まれたランダムな配
列を持つオリゴヌクレオチドを合成する。25塩基を挟め
ば425≒1015 程度のランダム性を持つオリゴヌクレオ
チドの集団を容易に合成できる。 (2)これを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼを働かせ、ラン
ダムな塩基配列を持つRNA分子集団を合成する。 (3)これを標的蛋白質を結合させたカラムを塩濃度を高
めた状態で通過させ、次に吸着したRNA画分を低塩濃度
の条件下で溶出させる。 (4)溶出したRNAを鋳型にし、18塩基部分をプライマーと
して逆転写酵素を働かせてDNAに転換する。 (5)このDNAをPCR法により再び増幅する。 (6)増幅されたDNAを用い(1)-(5)のプロセスを何回も繰
り返して特異的に結合するRNA分子を純化してゆく。
することができる候補化合物には、精製タンパク質（抗
体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプ
チドのライブラリー、RNAライブラリー、細胞抽出液、
細胞培養上清、あるいは合成低分子化合物のライブラリ
ーなどが挙げられるが、これらに制限されない。これら
の候補化合物の中でも、RNAライブラリーは、きわめて
多様性に富むライブラリーを比較的簡単な操作で合成す
ることができるので、候補化合物として望ましい。RNA
ライブラリーの合成と、このライブラリーのスクリーニ
ングは、一般に次のように行われる。 (1)まずDNA合成機を用いT7RNAポリメラーゼのプライマ
ー配列(34塩基)と任意の18塩基に挟まれたランダムな配
列を持つオリゴヌクレオチドを合成する。25塩基を挟め
ば425≒1015 程度のランダム性を持つオリゴヌクレオ
チドの集団を容易に合成できる。 (2)これを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼを働かせ、ラン
ダムな塩基配列を持つRNA分子集団を合成する。 (3)これを標的蛋白質を結合させたカラムを塩濃度を高
めた状態で通過させ、次に吸着したRNA画分を低塩濃度
の条件下で溶出させる。 (4)溶出したRNAを鋳型にし、18塩基部分をプライマーと
して逆転写酵素を働かせてDNAに転換する。 (5)このDNAをPCR法により再び増幅する。 (6)増幅されたDNAを用い(1)-(5)のプロセスを何回も繰
り返して特異的に結合するRNA分子を純化してゆく。
【００１９】このような工程を経てRNAライブラリーか
ら選択された、コネキシン２６に結合することができる
RNA分子は、アプタマーとして機能する。アプタマーと
は、標的蛋白質に特異的に結合して作用する機能性 RNA
を意味する用語である。ラテン語で適合(fit)するとい
う意味を持つ語(aptus)に因んでアプタマーと呼ばれ
る。実際に色素、蛋白質(T4DNAポリメラーゼ)などを標
的にしたアプタマーが単離されてきた。RNAに転換せずD
NAのままこの過程を繰り返してもよいが多様な立体構造
を取りうるRNAのほうが遥かに高い確率でアプタマー分
子が採取できる。本発明によってスクリーニングされた
コネキシン２６に結合する化合物は、コネキシン２６に
結合してそのギャップ結合を阻害する機能を有すること
から、この化合物を主成分として含有する癌の転移抑制
薬とすることができる。
ら選択された、コネキシン２６に結合することができる
RNA分子は、アプタマーとして機能する。アプタマーと
は、標的蛋白質に特異的に結合して作用する機能性 RNA
を意味する用語である。ラテン語で適合(fit)するとい
う意味を持つ語(aptus)に因んでアプタマーと呼ばれ
る。実際に色素、蛋白質(T4DNAポリメラーゼ)などを標
的にしたアプタマーが単離されてきた。RNAに転換せずD
NAのままこの過程を繰り返してもよいが多様な立体構造
を取りうるRNAのほうが遥かに高い確率でアプタマー分
子が採取できる。本発明によってスクリーニングされた
コネキシン２６に結合する化合物は、コネキシン２６に
結合してそのギャップ結合を阻害する機能を有すること
から、この化合物を主成分として含有する癌の転移抑制
薬とすることができる。
【００２０】本発明のスクリーニング法により単離され
る化合物を、薬剤として用いる場合には、公知の製剤学
的製造法により製剤化して用いることも可能である。例
えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩
水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）ととも
に患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、
経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、また
は経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症
状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適
宜適当な投与量を選択することが可能である。
る化合物を、薬剤として用いる場合には、公知の製剤学
的製造法により製剤化して用いることも可能である。例
えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩
水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）ととも
に患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、
経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、また
は経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症
状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適
宜適当な投与量を選択することが可能である。
【００２１】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。 〔実施例１〕差分化cDNAライブラリーからのクローンの
単離 自然高転移性のマウス由来メラノーマ細胞株BL6と、自
然低転移性のF10細胞株を用い、サブトラクション法に
よる転移関連遺伝子の単離を行った。操作は次のとおり
である。F10 とBL6 細胞株からグアニジンチオシアネイ
ト/CsTFA法を用いて全RNA を抽出し、その後オリゴdT
セルロースを用いてpoly (A)+ RNA を精製した。 リン
カー- プライマー法を用いてcDNA ライブラリーを作製
し、プラスミドベクター pAP3 neoに挿入した。公知の
方法 (M. Kobori et al. Genes Cells Vol.3, 459-475,
1998) に従って、 BL6 細胞株から得られたcDNA ライ
ブラリーから、F10細胞株から得られたcDNA ライブラリ
ーを差し引いた差分化cDNA ライブラリーを構築した。
４回、差分化の工程を繰り返した後、約1500 クローン
を単離した。これらのクローンの中からBL6 細胞株にお
いてF10細胞株と比較して転写が亢進しているクローン
をノーザンブロット法により選別し、塩基配列を決定し
た。得られたcDNAの塩基配列はBLASTN アルゴリズムを
用いて、htgs データベースを検索した。その結果、BL6
で特に高度な発現が確認された遺伝子はCx26であること
が確認された。
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。 〔実施例１〕差分化cDNAライブラリーからのクローンの
単離 自然高転移性のマウス由来メラノーマ細胞株BL6と、自
然低転移性のF10細胞株を用い、サブトラクション法に
よる転移関連遺伝子の単離を行った。操作は次のとおり
である。F10 とBL6 細胞株からグアニジンチオシアネイ
ト/CsTFA法を用いて全RNA を抽出し、その後オリゴdT
セルロースを用いてpoly (A)+ RNA を精製した。 リン
カー- プライマー法を用いてcDNA ライブラリーを作製
し、プラスミドベクター pAP3 neoに挿入した。公知の
方法 (M. Kobori et al. Genes Cells Vol.3, 459-475,
1998) に従って、 BL6 細胞株から得られたcDNA ライ
ブラリーから、F10細胞株から得られたcDNA ライブラリ
ーを差し引いた差分化cDNA ライブラリーを構築した。
４回、差分化の工程を繰り返した後、約1500 クローン
を単離した。これらのクローンの中からBL6 細胞株にお
いてF10細胞株と比較して転写が亢進しているクローン
をノーザンブロット法により選別し、塩基配列を決定し
た。得られたcDNAの塩基配列はBLASTN アルゴリズムを
用いて、htgs データベースを検索した。その結果、BL6
で特に高度な発現が確認された遺伝子はCx26であること
が確認された。
【００２２】〔実施例２〕コロニーハイブリダイゼーシ
ョン 2 x 106 コロニーをナイロンメンブレンにトランスファ
ーし、Cx26、PP2AB’alpha、ファキニン、TIB23 の［α
-32P］dCTP 標識したそれぞれの3’ 端部分塩基配列を
含む cDNAをプローブとして用いてスクリーニングを行
なった。陽性コロニーからプラスミドを精製し翻訳領域
に突然変異がないことを塩基配列を決定して確認した。
ョン 2 x 106 コロニーをナイロンメンブレンにトランスファ
ーし、Cx26、PP2AB’alpha、ファキニン、TIB23 の［α
-32P］dCTP 標識したそれぞれの3’ 端部分塩基配列を
含む cDNAをプローブとして用いてスクリーニングを行
なった。陽性コロニーからプラスミドを精製し翻訳領域
に突然変異がないことを塩基配列を決定して確認した。
【００２３】〔実施例３〕ウエスタンブロット解析 細胞抽出にあたっては、Hertzberg とSkibbents (E. L.
Hertzberg and R. V.Skibbens Cell Vol.39, 61-69, 1
984) の方法に準じて膜タンパク質を濃縮するためにア
ルカリ処理を行った。1 μg の細胞全抽出物を10 %SDS-
PAGE で展開後、イモビロンメンブレン（ミリポア社
製）にトランスファーした。メンブレンを300倍希釈し
た抗Cx26マウスモノクローナル抗体 (Zymed 社製）と２
時間反応させ、PBSで洗浄後、1000希釈したホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG (Cappel 社
製）と反応させた。さらにPBSで洗浄後、メンブレンを
化学発光試薬 Renaissense (NEN 社製) と反応させ、X
線フィルムに露光した。同じ試料を展開した10 %SDS-PA
GEゲルを銀染色試薬 (第一化学社製）の説明書に従って
銀染色を行なった。
Hertzberg and R. V.Skibbens Cell Vol.39, 61-69, 1
984) の方法に準じて膜タンパク質を濃縮するためにア
ルカリ処理を行った。1 μg の細胞全抽出物を10 %SDS-
PAGE で展開後、イモビロンメンブレン（ミリポア社
製）にトランスファーした。メンブレンを300倍希釈し
た抗Cx26マウスモノクローナル抗体 (Zymed 社製）と２
時間反応させ、PBSで洗浄後、1000希釈したホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG (Cappel 社
製）と反応させた。さらにPBSで洗浄後、メンブレンを
化学発光試薬 Renaissense (NEN 社製) と反応させ、X
線フィルムに露光した。同じ試料を展開した10 %SDS-PA
GEゲルを銀染色試薬 (第一化学社製）の説明書に従って
銀染色を行なった。
【００２４】〔実施例４〕F10 とBL6 細胞における様々
なコネキシンの発現 （１）細胞株と細胞培養 マウス・メラノーマ細胞株B16のF10亜株とBL6亜株は、
テキサス大学Fidler I.J. 博士より提供された。NIH/3T
3 細胞株はATCC (American Type Culture Collection )
より購入した。すべての細胞は10 % 仔牛胎児血清含有
ダルベッコ改変イーグル培地（増殖培地）で維持した。
形質転換体は２mg/mlの G-418含有増殖培地で維持し
た。
なコネキシンの発現 （１）細胞株と細胞培養 マウス・メラノーマ細胞株B16のF10亜株とBL6亜株は、
テキサス大学Fidler I.J. 博士より提供された。NIH/3T
3 細胞株はATCC (American Type Culture Collection )
より購入した。すべての細胞は10 % 仔牛胎児血清含有
ダルベッコ改変イーグル培地（増殖培地）で維持した。
形質転換体は２mg/mlの G-418含有増殖培地で維持し
た。
【００２５】（２）ノーザンブロット解析 メラノーマのさまざまなクローン、マウスの組織および
ヒト癌組織から抽出した全RNA 5μgを1% アガロース-ホ
ルムアルデヒド上で展開し、ナイロンメンブレンにトラ
ンスファーした。これをランダムヘキサマー法で［α-
32P］dCTP 標識したDNAプローブとハイブリダイズさせ
た。Cx26のプローブとしては翻訳領域のcDNA断片を用い
た。PCR法によって以下のコネキシンを検出するための
プローブを作製した。コネキシン32 (Dev. Biol., 146,
117-130, 1991、塩基番号50-582)、 コネキシン37 (J.
Cell.Biol., 114, 1049-1057, 1991、塩基番号73-940)
、コネキシン40 (J.Cell.Biol., 117, 1299-1310, 199
2、塩基番号154-826)、コネキシン43 (GenBank accessi
on no. X61576、塩基番号458-1075) 。mRNA量を標準化
するために用いるプローブβ-アクチンとGAPDHは上述と
同様の方法で調製した。ブロッティング膜は最終的に50
℃、0.1ｘ SSC、0.1% SDS で洗浄して露光した。定量化
は BAS 2000 システム（フジフィルム株式会社製）を用
いて行った。図１ａで示すように、F10およびBL6細胞に
おいて、Cx26のmRNAの発現が検出でき、BL6細胞におい
て、発現が５〜１０倍上昇していることが分かった。こ
れに対して、他のコネキシンの発現レベルは検出限界以
下だった。
ヒト癌組織から抽出した全RNA 5μgを1% アガロース-ホ
ルムアルデヒド上で展開し、ナイロンメンブレンにトラ
ンスファーした。これをランダムヘキサマー法で［α-
32P］dCTP 標識したDNAプローブとハイブリダイズさせ
た。Cx26のプローブとしては翻訳領域のcDNA断片を用い
た。PCR法によって以下のコネキシンを検出するための
プローブを作製した。コネキシン32 (Dev. Biol., 146,
117-130, 1991、塩基番号50-582)、 コネキシン37 (J.
Cell.Biol., 114, 1049-1057, 1991、塩基番号73-940)
、コネキシン40 (J.Cell.Biol., 117, 1299-1310, 199
2、塩基番号154-826)、コネキシン43 (GenBank accessi
on no. X61576、塩基番号458-1075) 。mRNA量を標準化
するために用いるプローブβ-アクチンとGAPDHは上述と
同様の方法で調製した。ブロッティング膜は最終的に50
℃、0.1ｘ SSC、0.1% SDS で洗浄して露光した。定量化
は BAS 2000 システム（フジフィルム株式会社製）を用
いて行った。図１ａで示すように、F10およびBL6細胞に
おいて、Cx26のmRNAの発現が検出でき、BL6細胞におい
て、発現が５〜１０倍上昇していることが分かった。こ
れに対して、他のコネキシンの発現レベルは検出限界以
下だった。
【００２６】（３）F10とBL6細胞におけるCx26タンパク
質の発現 抗Cx26抗体を用いて単一な24kDa のCx26タンパク質が検
出された(図１ｂの右のパネルにおいて矢印で表示し
た)。等量のタンパク質が展開されていることはゲルの
銀染色によって確認された(図１ｂの左のパネル)。この
抗Cx26抗体を用いた実験から、F10およびBL6細胞におけ
るCx26タンパク質の発現は、mRNAの発現と相関するとい
える。
質の発現 抗Cx26抗体を用いて単一な24kDa のCx26タンパク質が検
出された(図１ｂの右のパネルにおいて矢印で表示し
た)。等量のタンパク質が展開されていることはゲルの
銀染色によって確認された(図１ｂの左のパネル)。この
抗Cx26抗体を用いた実験から、F10およびBL6細胞におけ
るCx26タンパク質の発現は、mRNAの発現と相関するとい
える。
【００２７】〔実施例５〕下大静脈断片とメラノーマ細
胞により構成される共培養系 （１）メラノーマと血管細胞とのギャップ結合細胞間コ
ミュニケーション（GJIC）活性の差異 新鮮なネズミ下大静脈断片を切開し、カバーガラスに貼
り付け、F10またはBL6細胞をその上に播いて共培養し
た。４時間後、F10 (図２ａの左のパネル)またはBL6(図
２ａの右のパネル)との共培養物を抗Cx26 抗体と反応さ
せ、蛍光顕微鏡により観察した。矢印は細胞膜近くのCx
26の局在を示している。BL6細胞において顕著な免疫染
色像が見られたが、F10細胞では観察されなかった。免
疫染色の大部分はBL6細胞の細胞質に広く分布していた
が、BL6の細胞膜にも観察された。これらの結果から、B
L6と静脈細胞との間の異常なギャップ結合が形成された
ことが示唆された。
胞により構成される共培養系 （１）メラノーマと血管細胞とのギャップ結合細胞間コ
ミュニケーション（GJIC）活性の差異 新鮮なネズミ下大静脈断片を切開し、カバーガラスに貼
り付け、F10またはBL6細胞をその上に播いて共培養し
た。４時間後、F10 (図２ａの左のパネル)またはBL6(図
２ａの右のパネル)との共培養物を抗Cx26 抗体と反応さ
せ、蛍光顕微鏡により観察した。矢印は細胞膜近くのCx
26の局在を示している。BL6細胞において顕著な免疫染
色像が見られたが、F10細胞では観察されなかった。免
疫染色の大部分はBL6細胞の細胞質に広く分布していた
が、BL6の細胞膜にも観察された。これらの結果から、B
L6と静脈細胞との間の異常なギャップ結合が形成された
ことが示唆された。
【００２８】（２）色素−トランスファーアッセイ 色素−トランスファーアッセイは以下の手順で行った。
細胞膜透過性蛍光色素 BCECF acetoxymethyl ester (同
仁社製) を最終濃度 1μMとなるように増殖期のメラノ
ーマ細胞を培養している培地に添加し、３時間培養後、
新鮮な増殖培地に取り換え、さらに１時間培養する。こ
の細胞を集め、３回PBS で洗浄し後、色素−トランスフ
ァーアッセイに用いた。ギャップ結合細胞間コミュニケ
ーション(GJIC)能 はMesnil等の方法(M. Mesnil et al.
Vol.55,629-639, 1995) に従い評価した。メラノーマ
細胞 と静脈片との共培養を行なうために、屠殺直後の
マウスから胸郭部位の下大静脈を摘出した。静脈を縦方
向に切開してその内面を露出させた。液状接着剤（小西
社製)を周囲の組織に滴下することにより、この切開し
た静脈片の内面を上方にしてカバーグラスに接着させ
た。つぎにこのカバーグラスを培養皿の底面に置き、 B
CECF標識した1 x 106個のメラノーマ細胞を含む増殖培
地で満たした。共培養物を一定時間経過後に、4 % パラ
ホルムアルデヒド・0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2 を用いて
固定し、直接、コンフォーカル・レーザー走査型顕微鏡
を用いて、暗視野における蛍光を観察した。組織学的な
観察にはBCECF標識していないメラノーマ細胞を用いて
同様な手順で共培養を行った。BCECFでラベルしたF10お
よびBL6細胞を下大静脈断片上へ播いた上記の色素−ト
ランスファーアッセイにより、BL6と静脈細胞との間の
異常なギャップ結合形成の確認を行った。４時間後、共
培養物を蛍光顕微鏡により観察した。 BCECFの転移は矢
印で示す(図２ｂ)。BL6細胞からは色素が転移し、血管
表面が染色されたが、F10細胞からの色素の転移は見ら
れなかった。２時間後(図２ｃの上のパネル)と４時間後
(図２ｃの下のパネル)の色素の拡がりを共培養上で共焦
点レーザー走査型顕微鏡により観察した。矢印の先は B
CECF標識 F10細胞とBL6細胞を示す。２時間後は、F10ま
たはBL6のいずれからも色素の転移はほとんど見られな
かった。４時間後は、いくつかのBL6細胞は周囲の細胞
へ、色素を転移させていることが分かった(図２ｃの右
下のパネル)。転移したBCECFで染色された細胞は、丸石
状に配置し、BL6細胞から血管内皮細胞への効率的な色
素の転移が起こったことが示された。４時間後500個のB
CECF標識細胞を観察した時、血管内皮細胞と色素の共役
を認める細胞数を計測した。約20の細胞が色素を周囲の
血管内皮細胞に転移させていた(図３)。一方、観察した
すべてのF10細胞は、４時間後でさえもBCECFを、細胞質
中に保持していた(図２ｃ左下のパネル)。
細胞膜透過性蛍光色素 BCECF acetoxymethyl ester (同
仁社製) を最終濃度 1μMとなるように増殖期のメラノ
ーマ細胞を培養している培地に添加し、３時間培養後、
新鮮な増殖培地に取り換え、さらに１時間培養する。こ
の細胞を集め、３回PBS で洗浄し後、色素−トランスフ
ァーアッセイに用いた。ギャップ結合細胞間コミュニケ
ーション(GJIC)能 はMesnil等の方法(M. Mesnil et al.
Vol.55,629-639, 1995) に従い評価した。メラノーマ
細胞 と静脈片との共培養を行なうために、屠殺直後の
マウスから胸郭部位の下大静脈を摘出した。静脈を縦方
向に切開してその内面を露出させた。液状接着剤（小西
社製)を周囲の組織に滴下することにより、この切開し
た静脈片の内面を上方にしてカバーグラスに接着させ
た。つぎにこのカバーグラスを培養皿の底面に置き、 B
CECF標識した1 x 106個のメラノーマ細胞を含む増殖培
地で満たした。共培養物を一定時間経過後に、4 % パラ
ホルムアルデヒド・0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2 を用いて
固定し、直接、コンフォーカル・レーザー走査型顕微鏡
を用いて、暗視野における蛍光を観察した。組織学的な
観察にはBCECF標識していないメラノーマ細胞を用いて
同様な手順で共培養を行った。BCECFでラベルしたF10お
よびBL6細胞を下大静脈断片上へ播いた上記の色素−ト
ランスファーアッセイにより、BL6と静脈細胞との間の
異常なギャップ結合形成の確認を行った。４時間後、共
培養物を蛍光顕微鏡により観察した。 BCECFの転移は矢
印で示す(図２ｂ)。BL6細胞からは色素が転移し、血管
表面が染色されたが、F10細胞からの色素の転移は見ら
れなかった。２時間後(図２ｃの上のパネル)と４時間後
(図２ｃの下のパネル)の色素の拡がりを共培養上で共焦
点レーザー走査型顕微鏡により観察した。矢印の先は B
CECF標識 F10細胞とBL6細胞を示す。２時間後は、F10ま
たはBL6のいずれからも色素の転移はほとんど見られな
かった。４時間後は、いくつかのBL6細胞は周囲の細胞
へ、色素を転移させていることが分かった(図２ｃの右
下のパネル)。転移したBCECFで染色された細胞は、丸石
状に配置し、BL6細胞から血管内皮細胞への効率的な色
素の転移が起こったことが示された。４時間後500個のB
CECF標識細胞を観察した時、血管内皮細胞と色素の共役
を認める細胞数を計測した。約20の細胞が色素を周囲の
血管内皮細胞に転移させていた(図３)。一方、観察した
すべてのF10細胞は、４時間後でさえもBCECFを、細胞質
中に保持していた(図２ｃ左下のパネル)。
【００２９】（３）野生型および変異Cx26、コネキシン
32のトランスフェクションによって得られた変異F10のG
JIC活性の測定 Cx26とGJIC能との関連性を明らかにするために、野生型
Cx26に対しドミナントネガティブの効果を示すことが知
られている(A. Duflot-Dancer et al. Oncogene Vol.1
5, 2151-2158, 1997)、次の変異体を発現するベクター
をF10（あるいはBL6）に形質転換し、G-418 耐性株を選
択して形質転換体を得た。 F10-Cx26C60F （６０位のシステインをフェニルアラニンへ置換） F10-Cx26P87L （８７位のプロリンをロイシンへ置換） F10-Cx26R143W （１４３位のアルギニンをトリプトファンへ置換） 野生型および変異Cx26、コネキシン32のトランスフェク
ションによって得られたF10変異体について、（２）に
記載した方法によりGJIC活性を測定した。野生型Cx26(F
10-Cx26WT-1および-2)でトランスフェクションしたF10
細胞の２つの独立したクローンはBL6と同じく効率的に
色素を血管内皮細胞へ転移させた（図３）。これに対し
てF10-Cx26C60FおよびF10-Cx26R143W細胞は、血管内皮
細胞のGJIC活性を持たないことが確認された。F10-Cx26
P87L細胞はわずかに活性が見られた(図３)。この系にお
けるドミナントネガティブ効果をテストするために、Cx
26R143WのcDNAを、BL6細胞へ導入した(BL6-Cx26R143W-1
および-2)。その結果、予想どおり、血管内皮細胞のGJI
C活性がほとんど見られなかった(図３)。Cx26とコネキ
シン32との間でヘテロ型ギャップ結合能を示すことか
ら、コネキシン32cDNAでトランスフェクションしたF10
クローンは、血管内皮細胞のギャップ結合形成能がある
と思われたが、F10-Cx32WT-1および-2の両クローンとも
ギャップ結合形成能が見られなかった（図３）。このこ
とからCx26が、血管内皮細胞とのギャップ結合能に特別
な役割を果たしていることが確認された。
32のトランスフェクションによって得られた変異F10のG
JIC活性の測定 Cx26とGJIC能との関連性を明らかにするために、野生型
Cx26に対しドミナントネガティブの効果を示すことが知
られている(A. Duflot-Dancer et al. Oncogene Vol.1
5, 2151-2158, 1997)、次の変異体を発現するベクター
をF10（あるいはBL6）に形質転換し、G-418 耐性株を選
択して形質転換体を得た。 F10-Cx26C60F （６０位のシステインをフェニルアラニンへ置換） F10-Cx26P87L （８７位のプロリンをロイシンへ置換） F10-Cx26R143W （１４３位のアルギニンをトリプトファンへ置換） 野生型および変異Cx26、コネキシン32のトランスフェク
ションによって得られたF10変異体について、（２）に
記載した方法によりGJIC活性を測定した。野生型Cx26(F
10-Cx26WT-1および-2)でトランスフェクションしたF10
細胞の２つの独立したクローンはBL6と同じく効率的に
色素を血管内皮細胞へ転移させた（図３）。これに対し
てF10-Cx26C60FおよびF10-Cx26R143W細胞は、血管内皮
細胞のGJIC活性を持たないことが確認された。F10-Cx26
P87L細胞はわずかに活性が見られた(図３)。この系にお
けるドミナントネガティブ効果をテストするために、Cx
26R143WのcDNAを、BL6細胞へ導入した(BL6-Cx26R143W-1
および-2)。その結果、予想どおり、血管内皮細胞のGJI
C活性がほとんど見られなかった(図３)。Cx26とコネキ
シン32との間でヘテロ型ギャップ結合能を示すことか
ら、コネキシン32cDNAでトランスフェクションしたF10
クローンは、血管内皮細胞のギャップ結合形成能がある
と思われたが、F10-Cx32WT-1および-2の両クローンとも
ギャップ結合形成能が見られなかった（図３）。このこ
とからCx26が、血管内皮細胞とのギャップ結合能に特別
な役割を果たしていることが確認された。
【００３０】（４）BCECFで標識した細胞との共培養６
時間経過後の観察結果 共培養を６時間に延長すると、F10細胞の細胞質におけ
る蛍光強度は、４時間時に観察したときと同じであった
ことから、F10細胞は、色素結合能欠損であることが示
唆された(図４ａ)。対照的に、下部大静脈（ＩＶＣ）表
面に接着しているBL6の大部分の蛍光強度は、弱くなっ
たことから、BL6と血管内皮細胞との間の効率的な色素
結合能が示唆された(図４ｂ)。特に、ＩＶＣ表面にある
扁平な形のBL6細胞では、蛍光強度が、大きく減少し
た。いくつかのBL6細胞は血管内皮細胞上に浸入する表
現型を示した。血管内皮細胞の下に浸入したBL6細胞
は、完全に蛍光を失うので、蛍光顕微鏡では検知するこ
とができなかった(図４ｃ)。
時間経過後の観察結果 共培養を６時間に延長すると、F10細胞の細胞質におけ
る蛍光強度は、４時間時に観察したときと同じであった
ことから、F10細胞は、色素結合能欠損であることが示
唆された(図４ａ)。対照的に、下部大静脈（ＩＶＣ）表
面に接着しているBL6の大部分の蛍光強度は、弱くなっ
たことから、BL6と血管内皮細胞との間の効率的な色素
結合能が示唆された(図４ｂ)。特に、ＩＶＣ表面にある
扁平な形のBL6細胞では、蛍光強度が、大きく減少し
た。いくつかのBL6細胞は血管内皮細胞上に浸入する表
現型を示した。血管内皮細胞の下に浸入したBL6細胞
は、完全に蛍光を失うので、蛍光顕微鏡では検知するこ
とができなかった(図４ｃ)。
【００３１】〔実施例６〕形質転換細胞の自然転移の解
析 （１）自然転移アッセイ 2.5 x 105 個の細胞 (F10, BL6 およびそれらのトラン
スフェクタント細胞株)を、４週齡のオスの C57BL/6 マ
ウス( 7匹/ 1 クローン) のフットパッドに皮下注射し
た。腫瘍の大きさは２日ごとに直接直径を計測してモニ
ターした。３週後、（その時腫瘤は直径 8-10 mm に達
している）腫瘤のある方の脚を切断する。その後マウス
を４週間生かしたのち、解剖を行ない、両側の肺に形成
された転移性のコロニー数を計測した。
析 （１）自然転移アッセイ 2.5 x 105 個の細胞 (F10, BL6 およびそれらのトラン
スフェクタント細胞株)を、４週齡のオスの C57BL/6 マ
ウス( 7匹/ 1 クローン) のフットパッドに皮下注射し
た。腫瘍の大きさは２日ごとに直接直径を計測してモニ
ターした。３週後、（その時腫瘤は直径 8-10 mm に達
している）腫瘤のある方の脚を切断する。その後マウス
を４週間生かしたのち、解剖を行ない、両側の肺に形成
された転移性のコロニー数を計測した。
【００３２】（２）解析結果 図３で使用したメラノーマ細胞、およびそのトランスフ
ェクションした細胞を、マウスのフットパッドへ皮下注
射した。二ヶ月後、もとのBL6細胞は高度に転移した
が、もとのF10およびベクターでトランスフェクション
したF10細胞(F10-pAP3neo-1および-2)は、ほとんど転移
していなかった(図５)。色素結合能のあるF10クローン
(F10-Cx26WT-1および-2)は、BL6細胞と同じく高い転移
を示した。２つの転移性F10クローンによって作られた
コロニーは、無色に見え、BL6細胞によって作られた全
てのコロニーが、濃い黒色であったのとは対照的であっ
た(図６)。色素結合能欠損F10クローンであるF10-Cx26
C60F、F10-Cx26P87L、F10-Cx26R14 3W、F10-Cx32WT-1お
よび-2は、ほとんど転移しなかった(図５)。しかし、色
素結合能欠損BL6クローンであるBL6-Cx26R143W-1および
-2は、もとのBL6細胞と同じくらいの転移性のコロニー
を形成した(図５)。
ェクションした細胞を、マウスのフットパッドへ皮下注
射した。二ヶ月後、もとのBL6細胞は高度に転移した
が、もとのF10およびベクターでトランスフェクション
したF10細胞(F10-pAP3neo-1および-2)は、ほとんど転移
していなかった(図５)。色素結合能のあるF10クローン
(F10-Cx26WT-1および-2)は、BL6細胞と同じく高い転移
を示した。２つの転移性F10クローンによって作られた
コロニーは、無色に見え、BL6細胞によって作られた全
てのコロニーが、濃い黒色であったのとは対照的であっ
た(図６)。色素結合能欠損F10クローンであるF10-Cx26
C60F、F10-Cx26P87L、F10-Cx26R14 3W、F10-Cx32WT-1お
よび-2は、ほとんど転移しなかった(図５)。しかし、色
素結合能欠損BL6クローンであるBL6-Cx26R143W-1および
-2は、もとのBL6細胞と同じくらいの転移性のコロニー
を形成した(図５)。
【００３３】〔実施例７〕ヒト肺小細胞癌におけるCx26
のRNA の発現 （１）ヒト肺癌サンプル 兵庫成人病センターにおいて1991年から1997年におい
て、標準的な手術（第一次と第二次リンパ節の完全廓清
手術を含めた）を受けた肺小細胞癌の23人の患者を対象
とした。再切除された標本は慎重にInternational Stag
ing System for Lung Cancer (C. F. Mountain and C.
M. Dresler Chest Vol.111, 1718-1723, 1997) にした
がって癌の進行ステージが決定された。癌組織はRNA 抽
出に用いるまで凍結保存した。 （２）ヒト肺小細胞癌におけるCx26のRNA の発現量の測
定結果 実際にCx26がヒトの癌において転移を促進するかどうか
を調べるために、ヒト肺小細胞癌（ＳＣＣ）でのCx26の
mRNAの発現を調べた。２３人のＳＣＣの患者は、リンパ
節の切開を含む類似の手術を受けた。臨床病理的な段階
では、全ての患者でＭ値は０であった。ＴおよびＮ値に
基づいて、患者を３つの群、低転移群(T2N0; n=11)、中
転移群(T2N1; n=4)、高転移群(T2N2; n=8)に分けた。原
発性の腫瘍から抽出した全ＲＮＡを、ノーザンブロット
によって解析した（図７）。高転移群へ属する８つのケ
ース中２つのケースにおいて、顕著なCx26のmRNAの発現
を検出した。発現量のレベルは、GAPDHの発現を利用し
た濃度補正後、BL6細胞の発現量レベルに匹敵した。対
照的に、低および中転移群に属する全てのケースでは、
Cx26のmRNA発現量は、F10細胞における発現量よりも低
かった。
のRNA の発現 （１）ヒト肺癌サンプル 兵庫成人病センターにおいて1991年から1997年におい
て、標準的な手術（第一次と第二次リンパ節の完全廓清
手術を含めた）を受けた肺小細胞癌の23人の患者を対象
とした。再切除された標本は慎重にInternational Stag
ing System for Lung Cancer (C. F. Mountain and C.
M. Dresler Chest Vol.111, 1718-1723, 1997) にした
がって癌の進行ステージが決定された。癌組織はRNA 抽
出に用いるまで凍結保存した。 （２）ヒト肺小細胞癌におけるCx26のRNA の発現量の測
定結果 実際にCx26がヒトの癌において転移を促進するかどうか
を調べるために、ヒト肺小細胞癌（ＳＣＣ）でのCx26の
mRNAの発現を調べた。２３人のＳＣＣの患者は、リンパ
節の切開を含む類似の手術を受けた。臨床病理的な段階
では、全ての患者でＭ値は０であった。ＴおよびＮ値に
基づいて、患者を３つの群、低転移群(T2N0; n=11)、中
転移群(T2N1; n=4)、高転移群(T2N2; n=8)に分けた。原
発性の腫瘍から抽出した全ＲＮＡを、ノーザンブロット
によって解析した（図７）。高転移群へ属する８つのケ
ース中２つのケースにおいて、顕著なCx26のmRNAの発現
を検出した。発現量のレベルは、GAPDHの発現を利用し
た濃度補正後、BL6細胞の発現量レベルに匹敵した。対
照的に、低および中転移群に属する全てのケースでは、
Cx26のmRNA発現量は、F10細胞における発現量よりも低
かった。
【００３４】
【発明の効果】本発明により、癌の転移能を評価するた
めの新しい指標が提供される。コネキシン２６が細胞同
士の結合に関与するタンパク質であることから、癌の転
移を構成する複数の段階の中で、特に癌細胞の他組織へ
の付着と浸潤の過程に関与していることが推測される。
したがって、コネキシン２６を指標とすることにより、
転移における重要なステップについて、癌の持つ転移能
を定量的に把握することが可能となる。一方、本発明に
よる癌転移抑制薬のスクリーニング方法においては、癌
にとっては転移のために不可欠なステップを支える重要
な要素の一つと思われるコネキシン２６を標的とするこ
とにより、癌の転移を効果的に抑制することができる化
合物の探索が可能となる。本発明のスクリーニングによ
ってもたらされるコネキシン２６の結合活性を阻害する
化合物は、癌の転移を抑制する薬剤として有用である。
この薬剤は、本発明の癌転移能の検査方法と組み合わせ
て、コネキシン２６の発現レベルの高い癌に対して用い
ることによって、転移の予防を効果的に達成することが
できる。本発明によって、コネキシン２６は癌細胞の中
でも転移能の非常に高いメラノーマの皮下移植モデル
（自然転移系）において直接的に転移に関与しているこ
とが示された。またヒト肺小細胞癌のなかでコネキシン
２６の発現が亢進している例が認められた。以上のこと
より、コネキシン２６は迅速な治療を必要とする高転移
性の癌細胞において静脈内への浸潤に関与していること
を示唆しており、従来癌治療成績がもっとも悪いタイプ
の癌の早期診断や抗転移治療に結びつくと考えられる。
めの新しい指標が提供される。コネキシン２６が細胞同
士の結合に関与するタンパク質であることから、癌の転
移を構成する複数の段階の中で、特に癌細胞の他組織へ
の付着と浸潤の過程に関与していることが推測される。
したがって、コネキシン２６を指標とすることにより、
転移における重要なステップについて、癌の持つ転移能
を定量的に把握することが可能となる。一方、本発明に
よる癌転移抑制薬のスクリーニング方法においては、癌
にとっては転移のために不可欠なステップを支える重要
な要素の一つと思われるコネキシン２６を標的とするこ
とにより、癌の転移を効果的に抑制することができる化
合物の探索が可能となる。本発明のスクリーニングによ
ってもたらされるコネキシン２６の結合活性を阻害する
化合物は、癌の転移を抑制する薬剤として有用である。
この薬剤は、本発明の癌転移能の検査方法と組み合わせ
て、コネキシン２６の発現レベルの高い癌に対して用い
ることによって、転移の予防を効果的に達成することが
できる。本発明によって、コネキシン２６は癌細胞の中
でも転移能の非常に高いメラノーマの皮下移植モデル
（自然転移系）において直接的に転移に関与しているこ
とが示された。またヒト肺小細胞癌のなかでコネキシン
２６の発現が亢進している例が認められた。以上のこと
より、コネキシン２６は迅速な治療を必要とする高転移
性の癌細胞において静脈内への浸潤に関与していること
を示唆しており、従来癌治療成績がもっとも悪いタイプ
の癌の早期診断や抗転移治療に結びつくと考えられる。
【００３５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Medical & Biological Laboratories co., Ltd. <120> Method for Testing Cancer Metastasis Ability, and Screening of Dru g for Inhibiting of Cancer Metastasis. <130> M3-105 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2311 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (199)..(876) <400> 1 gatttaatcc tatgacaaac taagttggtt ctgtcttcac ctgttttggt gaggttgtgt 60 aagagttggt gtttgctcag gaagagattt aagcatgctt gcttacccag actcagagaa 120 gtctccctgt tctgtcctag ctatgttcct gtgttgtgtg cattcgtctt ttccagagca 180 aaccgcccag agtagaag atg gat tgg ggc acg ctg cag acg atc ctg ggg 231 Met Asp Trp Gly Thr Leu Gln Thr Ile Leu Gly 1 5 10 ggt gtg aac aaa cac tcc acc agc att gga aag atc tgg ctc acc gtc 279 Gly Val Asn Lys His Ser Thr Ser Ile Gly Lys Ile Trp Leu Thr Val 15 20 25 ctc ttc att ttt cgc att atg atc ctc gtt gtg gct gca aag gag gtg 327 Leu Phe Ile Phe Arg Ile Met Ile Leu Val Val Ala Ala Lys Glu Val 30 35 40 tgg gga gat gag cag gcc gac ttt gtc tgc aac acc ctg cag cca ggc 375 Trp Gly Asp Glu Gln Ala Asp Phe Val Cys Asn Thr Leu Gln Pro Gly 45 50 55 tgc aag aac gtg tgc tac gat cac tac ttc ccc atc tcc cac atc cgg 423 Cys Lys Asn Val Cys Tyr Asp His Tyr Phe Pro Ile Ser His Ile Arg 60 65 70 75 cta tgg gcc ctg cag ctg atc ttc gtg tcc agc cca gcg ctc cta gtg 471 Leu Trp Ala Leu Gln Leu Ile Phe Val Ser Ser Pro Ala Leu Leu Val 80 85 90 gcc atg cac gtg gcc tac cgg aga cat gag aag aag agg aag ttc atc 519 Ala Met His Val Ala Tyr Arg Arg His Glu Lys Lys Arg Lys Phe Ile 95 100 105 aag ggg gag ata aag agt gaa ttt aag gac atc gag gag atc aaa acc 567 Lys Gly Glu Ile Lys Ser Glu Phe Lys Asp Ile Glu Glu Ile Lys Thr 110 115 120 cag aag gtc cgc atc gaa ggc tcc ctg tgg tgg acc tac aca agc agc 615 Gln Lys Val Arg Ile Glu Gly Ser Leu Trp Trp Thr Tyr Thr Ser Ser 125 130 135 atc ttc ttc cgg gtc atc ttc gaa gcc gcc ttc atg tac gtc ttc tat 663 Ile Phe Phe Arg Val Ile Phe Glu Ala Ala Phe Met Tyr Val Phe Tyr 140 145 150 155 gtc atg tac gac ggc ttc tcc atg cag cgg ctg gtg aag tgc aac gcc 711 Val Met Tyr Asp Gly Phe Ser Met Gln Arg Leu Val Lys Cys Asn Ala 160 165 170 tgg cct tgt ccc aac act gtg gac tgc ttt gtg tcc cgg ccc acg gag 759 Trp Pro Cys Pro Asn Thr Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu 175 180 185 aag act gtc ttc aca gtg ttc atg att gca gtg tct gga att tgc atc 807 Lys Thr Val Phe Thr Val Phe Met Ile Ala Val Ser Gly Ile Cys Ile 190 195 200 ctg ctg aat gtc act gaa ttg tgt tat ttg cta att aga tat tgt tct 855 Leu Leu Asn Val Thr Glu Leu Cys Tyr Leu Leu Ile Arg Tyr Cys Ser 205 210 215 ggg aag tca aaa aag cca gtt taacgcattg cccagttgtt agattaagaa 906 Gly Lys Ser Lys Lys Pro Val 220 225 atagacagca tgagagggat gaggcaaccc gtgctcagct gtcaaggctc agtcgccagc 966 atttcccaac acaaagattc tgaccttaaa tgcaaccatt tgaaacccct gtaggcctca 1026 ggtgaaactc cagatgccac aatgagctct gctcccctaa agcctcaaaa caaaggccta 1086 attctatgcc tgtcttaatt ttctttcact taagttagtt ccactgagac cccaggctgt 1146 taggggttat tggtgtaagg tactttcata ttttaaacag aggatatcgg catttgtttc 1206 tttctctgag gacaagagaa aaaagccagg ttccacagag gacacagaga aggtttgggt 1266 gtcctcctgg ggttcttttt gccaactttc cccacgttaa aggtgaacat tggttctttc 1326 atttgctttg gaagttttaa tctctaacag tggacaaagt taccagtgcc ttaaactctg 1386 ttacactttt tggaagtgaa aactttgtag tatgataggt tattttgatg taaagatgtt 1446 ctggatacca ttatatgttc cccctgtttc agaggctcag attgtaatat gtaaatggta 1506 tgtcattcgc tactatgatt taatttgaaa tatggtcttt tggttatgaa tactttgcag 1566 cacagctgag agaggctgtc tgttgtattc attgtggtca tagcacctaa caacattgta 1626 gcctcaatcg agtgagacag actagaagtt cctagttggc ttatgatagc aaatggcctc 1686 atgtcaaata ttagatgtaa ttttgtgtaa gaaatacaga ctggatgtac caccaactac 1746 tacctgtaat gacaggcctg tccaacacat ctcccttttc catgctgtgg tagccagcat 1806 cggaaagaac gctgatttaa agaggtgagc ttgggaattt tattgacaca gtaccattta 1866 atggggagac aaaaatgggg gccaggggag ggagaagttt ctgtcgttaa aaacgagttt 1926 ggaaagactg gactctaaat tctgttgatt aaagatgagc tttgtctacc ttcaaaagtt 1986 tgtttggctt acccccttca gcctccaatt ttttaagtga aaatataact aataacatgt 2046 gaaaagaata gaagctaagg tttagataaa tattgagcag atctatagga agattgaacc 2106 tgaatattgc cattatgctt gacatggttt ccaaaaaatg gtactccaca tacttcagtg 2166 agggtaagta ttttcctgtt gtcaagaata gcattgtaaa agcattttgt aataataaag 2226 aatagcttta atgatatgct tgtaactaaa ataattttgt aatgtatcaa atacatttaa 2286 aacattaaaa tataatctct ataat 2311 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Trp Gly Thr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Gly Val Asn Lys His 1 5 10 15 Ser Thr Ser Ile Gly Lys Ile Trp Leu Thr Val Leu Phe Ile Phe Arg 20 25 30 Ile Met Ile Leu Val Val Ala Ala Lys Glu Val Trp Gly Asp Glu Gln 35 40 45 Ala Asp Phe Val Cys Asn Thr Leu Gln Pro Gly Cys Lys Asn Val Cys 50 55 60 Tyr Asp His Tyr Phe Pro Ile Ser His Ile Arg Leu Trp Ala Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ile Phe Val Ser Ser Pro Ala Leu Leu Val Ala Met His Val Ala 85 90 95 Tyr Arg Arg His Glu Lys Lys Arg Lys Phe Ile Lys Gly Glu Ile Lys 100 105 110 Ser Glu Phe Lys Asp Ile Glu Glu Ile Lys Thr Gln Lys Val Arg Ile 115 120 125 Glu Gly Ser Leu Trp Trp Thr Tyr Thr Ser Ser Ile Phe Phe Arg Val 130 135 140 Ile Phe Glu Ala Ala Phe Met Tyr Val Phe Tyr Val Met Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Phe Ser Met Gln Arg Leu Val Lys Cys Asn Ala Trp Pro Cys Pro Asn 165 170 175 Thr Val Asp Cys Phe Val Ser Arg Pro Thr Glu Lys Thr Val Phe Thr 180 185 190 Val Phe Met Ile Ala Val Ser Gly Ile Cys Ile Leu Leu Asn Val Thr 195 200 205 Glu Leu Cys Tyr Leu Leu Ile Arg Tyr Cys Ser Gly Lys Ser Lys Lys 210 215 220 Pro Val 225 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 gcgaattcag gtgtaaattt accaaaaata 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 gcgctcgagc acccaagctt tccatcctgg 30
【図１】F10およびBL6細胞におけるCx26の発現レベルを
示すノーザンブロット法の結果を示す図。 （a） Cx26、Cx32、Cx43、Cx37、およびCx40の転写を検
出するノーザンブロット解析の結果を示す。マウスの肝
臓、心臓、それに肺組織から抽出した全RNAも陽性対照
としてブロットした。 （b） F10およびBL6細胞におけるCx26タンパク質の発現
を示す。抗Cx26抗体は、約24kDaのモノマーCx26タンパ
ク質を検出した（右パネルの矢印が示している）。同等
のタンパク質がローディングされていることが、ゲルの
銀染色から確認された（左の写真）。
示すノーザンブロット法の結果を示す図。 （a） Cx26、Cx32、Cx43、Cx37、およびCx40の転写を検
出するノーザンブロット解析の結果を示す。マウスの肝
臓、心臓、それに肺組織から抽出した全RNAも陽性対照
としてブロットした。 （b） F10およびBL6細胞におけるCx26タンパク質の発現
を示す。抗Cx26抗体は、約24kDaのモノマーCx26タンパ
ク質を検出した（右パネルの矢印が示している）。同等
のタンパク質がローディングされていることが、ゲルの
銀染色から確認された（左の写真）。
【図２】血管内皮組織から成る共培養システム、および
血管内皮組織上に蒔いたメラノーマ細胞の顕微鏡観察画
像を示す図。バーは20μmを示す。 （a） ４時間後、F10細胞（左の写真）あるいはBL6細胞
（右の写真）との共培養は、抗Cx26抗体によって免疫反
応が起こり、蛍光顕微鏡で観察された。矢印は細胞膜付
近のCx26を示している。 （b） BCECFで標識したF10細胞（左の写真）あるいはBL
6細胞（右の写真）を血管内皮組織に蒔いた。共培養は4
時間後に打切り、蛍光顕微鏡で観察を行った。BCECFの
共役をくさびで表す。 （c） 共培養の2時間後（上段の写真）と4時間後（下段
の写真）に、染色の広がりを共焦点レーザー走査顕微鏡
により観察した。蛍光強度は色で表示し、赤は青よりも
強いことを示している。くさびは、BCECFで標識されたF
10細胞およびBL6細胞を示す。
血管内皮組織上に蒔いたメラノーマ細胞の顕微鏡観察画
像を示す図。バーは20μmを示す。 （a） ４時間後、F10細胞（左の写真）あるいはBL6細胞
（右の写真）との共培養は、抗Cx26抗体によって免疫反
応が起こり、蛍光顕微鏡で観察された。矢印は細胞膜付
近のCx26を示している。 （b） BCECFで標識したF10細胞（左の写真）あるいはBL
6細胞（右の写真）を血管内皮組織に蒔いた。共培養は4
時間後に打切り、蛍光顕微鏡で観察を行った。BCECFの
共役をくさびで表す。 （c） 共培養の2時間後（上段の写真）と4時間後（下段
の写真）に、染色の広がりを共焦点レーザー走査顕微鏡
により観察した。蛍光強度は色で表示し、赤は青よりも
強いことを示している。くさびは、BCECFで標識されたF
10細胞およびBL6細胞を示す。
【図３】ギャップ結合アッセイの結果をまとめたグラ
フ。共培養開始後4時間でBCECFで標識した細胞500個が
観察され、そのとき内皮細胞に色素の共役を示す細胞数
を計測した。データは３回の独立した試験の平均を示し
た。バーは標準誤差を表す。＊は、F10細胞から得た値
と比較した場合のｔ検定によるp<0.01を示す。
フ。共培養開始後4時間でBCECFで標識した細胞500個が
観察され、そのとき内皮細胞に色素の共役を示す細胞数
を計測した。データは３回の独立した試験の平均を示し
た。バーは標準誤差を表す。＊は、F10細胞から得た値
と比較した場合のｔ検定によるp<0.01を示す。
【図４】共培養開始後6時間目にBCECFで標識した細胞と
の共培養を観察した顕微鏡観察画像を示す図。血管内皮
組織は、蛍光顕微鏡（左の写真）、およびH&E染色後に
光学顕微鏡（右の写真）で直接観察した。バーは20μm
を示す。 （a） BCECFで標識したF10細胞との共培養の結果を示
す。F10細胞のいくつかが血管内皮組織表面に広がって
いるが観察された（くさびで示す）。F10細胞の蛍光強
度は、共培養4時間後でも強く観察された。 （b） BCECF標識したBL6細胞との共培養を示す。BL6細
胞の蛍光強度は4時間の共培養の場合に較べ、段々と弱
くなっていった。これは特に血管内皮組織表面にある扁
平な形のBL6細胞に顕著に現れた（ｂにくさびで示
す）。ｃの右の写真のくさびは、内皮細胞の直ぐ下に侵
入しているBL6細胞を示している（矢印で示す）。しか
し、H&Eで染色する前に蛍光顕微鏡で、同様なBL6細胞を
発見するのは困難である（ｃの左の写真にくさびで示
す）。
の共培養を観察した顕微鏡観察画像を示す図。血管内皮
組織は、蛍光顕微鏡（左の写真）、およびH&E染色後に
光学顕微鏡（右の写真）で直接観察した。バーは20μm
を示す。 （a） BCECFで標識したF10細胞との共培養の結果を示
す。F10細胞のいくつかが血管内皮組織表面に広がって
いるが観察された（くさびで示す）。F10細胞の蛍光強
度は、共培養4時間後でも強く観察された。 （b） BCECF標識したBL6細胞との共培養を示す。BL6細
胞の蛍光強度は4時間の共培養の場合に較べ、段々と弱
くなっていった。これは特に血管内皮組織表面にある扁
平な形のBL6細胞に顕著に現れた（ｂにくさびで示
す）。ｃの右の写真のくさびは、内皮細胞の直ぐ下に侵
入しているBL6細胞を示している（矢印で示す）。しか
し、H&Eで染色する前に蛍光顕微鏡で、同様なBL6細胞を
発見するのは困難である（ｃの左の写真にくさびで示
す）。
【図５】Cx26 形質転換細胞の自然転移の解析結果をま
とめたグラフ。マウスをF10細胞あるいはBL6細胞、また
はそれぞれ異なる形状のCx26やCx32でトランスフェクト
した細胞で処理したときに、肺で作られた転移コロニー
の数を示す。肺の重量も計測した。データは１クローン
あたり７マウスの平均を示している。バーは標準誤差を
表す。＊はF10細胞から得た値と比較した場合のｔ検定
によるp<0.05を示す。
とめたグラフ。マウスをF10細胞あるいはBL6細胞、また
はそれぞれ異なる形状のCx26やCx32でトランスフェクト
した細胞で処理したときに、肺で作られた転移コロニー
の数を示す。肺の重量も計測した。データは１クローン
あたり７マウスの平均を示している。バーは標準誤差を
表す。＊はF10細胞から得た値と比較した場合のｔ検定
によるp<0.05を示す。
【図６】Cx26 形質転換細胞の自然転移病巣を示す顕微
鏡観察画像を示す図。F10細胞（上段の写真）、BL6細胞
（中段の写真）それにF10-Cx26WT-1細胞（下段の写真）
によって、肺に転移したコロニーの例を示す。
鏡観察画像を示す図。F10細胞（上段の写真）、BL6細胞
（中段の写真）それにF10-Cx26WT-1細胞（下段の写真）
によって、肺に転移したコロニーの例を示す。
【図７】ヒト肺小細胞癌におけるコネキシン２６mRNAの
発現を分析したノーザンブロット法の結果を示す図。癌
試料は、ぞれぞれのN値に基づいて3グループに分割し
た。F10細胞およびBL6細胞から得た全RNAもブロットし
た。RNA量は、GAPDHプローブで標準化した。分化の病理
上の程度はW,良好；M、適切；P、不良、と表した。
発現を分析したノーザンブロット法の結果を示す図。癌
試料は、ぞれぞれのN値に基づいて3グループに分割し
た。F10細胞およびBL6細胞から得た全RNAもブロットし
た。RNA量は、GAPDHプローブで標準化した。分化の病理
上の程度はW,良好；M、適切；P、不良、と表した。
Claims (11)
- 【請求項１】癌細胞におけるコネキシン２６遺伝子の発
現レベルを正常細胞のコネキシン２６遺伝子の発現レベ
ルと比較する工程を含む、癌転移能の検査方法。 - 【請求項２】コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コ
ネキシン２６をコードするmRNAの定量によって評価する
請求項１に記載の検査方法。 - 【請求項３】mRNAにおける、少なくともコネキシン２６
のギャップ結合活性を示す領域をコードしている領域を
定量する請求項２に記載の検査方法。 - 【請求項４】コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、癌
細胞に含まれるコネキシン２６タンパク質の定量によっ
て評価する請求項１に記載の検査方法。 - 【請求項５】コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、コ
ネキシン２６タンパク質を特異的に認識する抗体による
免疫学的な定量方法によって評価する請求項４に記載の
検査方法。 - 【請求項６】コネキシン２６遺伝子の発現レベルを、体
液中のコネキシン２６タンパク質を指標として評価する
工程を含む癌転移能の検査方法。 - 【請求項７】配列番号：１に示す塩基配列を持つDNAと
特異的にハイブリダイズするDNAであって、少なくとも
１５ヌクレオチドの鎖長を持つDNAを含む、癌転移能の
検査用試薬。 - 【請求項８】配列番号：２に示すアミノ酸配列を持つタ
ンパク質と特異的に結合する抗体を含む、癌転移能の検
査用試薬。 - 【請求項９】次の工程を含む、癌の転移抑制薬のスクリ
ーニング方法。 ａ）コネキシン２６の少なくともギャップ結合活性を示
す領域を含むタンパク質を提供する工程 ｂ）候補化合物をａ）のタンパク質に接触させる工程、
および ｃ）ａ）のタンパク質に結合する候補化合物を選択する
工程 - 【請求項１０】候補化合物がランダムな塩基配列からな
るRNAライブラリーである請求項９に記載のスクリーニ
ング方法。 - 【請求項１１】請求項９または請求項１０に記載の方法
により単離しうる化合物を主成分として含有する癌の転
移抑制薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19803299A JP4282163B2 (ja) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | 癌転移能検査方法、および癌転移抑制薬のスクリーニング方法 |
| EP00115161A EP1072687A3 (en) | 1999-07-12 | 2000-07-12 | Method for testing metastatic potential and method for screening compounds with metastasis-suppressing activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19803299A JP4282163B2 (ja) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | 癌転移能検査方法、および癌転移抑制薬のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001017184A true JP2001017184A (ja) | 2001-01-23 |
| JP4282163B2 JP4282163B2 (ja) | 2009-06-17 |
Family
ID=16384406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19803299A Expired - Fee Related JP4282163B2 (ja) | 1999-07-12 | 1999-07-12 | 癌転移能検査方法、および癌転移抑制薬のスクリーニング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1072687A3 (ja) |
| JP (1) | JP4282163B2 (ja) |
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| CN113862218A (zh) * | 2021-10-12 | 2021-12-31 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种肿瘤相关性血管周细胞亚群及制备方法与应用 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL1019226C2 (nl) * | 2001-10-25 | 2003-04-28 | Multigen Holding S A | Werkwijze voor het detecteren van een mutatie die verband houdt met plaveiselcelcarcinoom. |
| WO2003081239A2 (en) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Theryte Ltd | Treating cancer |
| US20060058379A1 (en) * | 2002-11-29 | 2006-03-16 | Yasuyuki Kita | Connexin 26 inhibitor and cancer metastasis inhibitors |
| CN105566495B (zh) * | 2016-01-27 | 2019-10-22 | 上海科技大学 | 一种特异性抑制连接蛋白26的全人抗体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9701888D0 (en) * | 1997-01-30 | 1997-03-19 | Ciba Geigy Ag | Novel methods |
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1999
- 1999-07-12 JP JP19803299A patent/JP4282163B2/ja not_active Expired - Fee Related
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2000
- 2000-07-12 EP EP00115161A patent/EP1072687A3/en not_active Withdrawn
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| WO2006049157A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-11 | The New Industry Research Organization | コネキシン２６阻害活性を有する多量体型オレアミド誘導体と、その癌治療等への利用 |
| US7846972B2 (en) | 2004-11-02 | 2010-12-07 | The New Industrial Research Organization | Multimeric oleamide derivative having connexin-26 inhibiting potency and use thereof in cancer therapy, etc |
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