WO2014122290A1 - Marqueur dyrk1a pour la maladie d'alzheimer - Google Patents

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WO2014122290A1
WO2014122290A1 PCT/EP2014/052485 EP2014052485W WO2014122290A1 WO 2014122290 A1 WO2014122290 A1 WO 2014122290A1 EP 2014052485 W EP2014052485 W EP 2014052485W WO 2014122290 A1 WO2014122290 A1 WO 2014122290A1
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WO
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marker
level
expression
disease
alzheimer
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/052485
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Maurice DELABAR
Nathalie JANEL
Marie SARAZIN
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite Paris Diderot Paris 7
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
Assistance Publique - Hopitaux De Paris
Institut Du Cerveau Et De La Moelle Epiniere
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs), Universite Paris Diderot Paris 7, Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6), Assistance Publique - Hopitaux De Paris, Institut Du Cerveau Et De La Moelle Epiniere, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Publication of WO2014122290A1 publication Critical patent/WO2014122290A1/fr

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the invention relates to the field of in vitro diagnostic methods for Alzheimer's disease in human subjects.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease (progressive loss of neurons) incurable brain tissue that leads to the progressive and irreversible loss of mental functions including memory. It is the most common form of dementia in humans. It is the main cause of heavy dependence of the elderly subject and the main reason for entering a specialized institution. The evolution is done over several years with the appearance of a progressive dependence with repercussions on the activities of the daily life. Alzheimer's disease affected about 26 million people worldwide in 2005 and could reach four times more in 2050, which would be equivalent to 1 in 85 people. In developed countries, Alzheimer's disease is one of the most the most expensive pathologies for society.
  • Alzheimer's disease The majority of cases of Alzheimer's disease are said to be sporadic, they are not hereditary, although the presence of certain genes is a risk factor. Anemia, diabetes, disorders of the thyroid gland, deficiencies of B12 vitamins and folates, are known to be aggravating factors of the disease.
  • Alzheimer's disease is essentially based on the association of clinical signs, neuropsychological test results and radiological signs. It is believed that the clinical diagnosis of Alzheimer's disease is only formal after anatomopatho logical examination of the post-mortem brain.
  • MMSE Mini Mental State Examination
  • This review provides an initial assessment of the memory of recent events, language, and complex tasks, but is still insufficient to establish a differential diagnosis or to determine aggravating factors for Alzheimer's disease. It is thus necessary to complete it by biological examinations of the blood and urine of the subject as well as by imaging, in particular magnetic resonance imaging (MRI) and possibly cerebral emission tomography scintigraphy. single photon.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the imaging reveals a possible atrophy of the internal temporal lobe and in particular of the hippocampus, criterion of early diagnosis of Alzheimer's, and possibly to detect sequelae of vascular accidents, which can be at the origin of the cognitive difficulties.
  • APOE apo lipoprotein E
  • Tau proteins total, hyperphosphorylated Tau proteins, and ⁇ 1-42 peptide are good markers of Alzheimer's disease.
  • these markers are present only in the cerebrospinal fluid and their dosage can obviously be achieved in clinical, in delicate and expensive terms.
  • FIG 1 DYRK 1 protein levels in the plasma of healthy subjects ("CTRL” controls) and subjects with Alzheimer's disease (AD).
  • the Slot-blot technique was used to detect the relative expression of plasma A) DYR.K.1A in control subjects and plasma AD, B) DYRK.1 B subjects in control subjects and AD subjects; C) plasma DYRK1A according to the MMSE level of the subjects tested: MMSE> 27, MMSE ⁇ 27; D) Level of plasma DYR1A according to the level of GDP of the tested subjects GDP: ⁇ 1.4, GDP> 1 .4.
  • the correlation was evaluated according to the Spearman correlation test. The graphs show the regression ranges with a 95% confidence interval; to: arbitrary units; Figure 3: Quantification of biomarkers associated with the plasma expression of DYRKIA.
  • Figure 4 Level of DYRKIA protein in lymphoblastoid lines.
  • White spots controls; light gray dots: subjects with Alzheimer's disease and with mild cognitive impairment (MCI-AD); dark gray dots: subjects with Alzheimer's disease and with signs of dementia (AD).
  • MCI-AD mild cognitive impairment
  • AD Alzheimer's disease and with signs of dementia
  • the inventors have unexpectedly demonstrated a biological marker which is modified in subjects suffering from Alzheimer's disease, and established that this marker is present in the blood, plasma and serum of human subjects.
  • the inventors have thus discovered that it is possible to evaluate whether a human subject presents a risk of developing Alzheimer's disease, in a simple, rapid and inexpensive way, by the analysis of the DYRKIA marker, in particular by determining the level of expression of the DYRKIA marker, for example in its protein form or in its nucleotide form, in a sample of blood and / or plasma and / or serum of said subject.
  • the expression of the DYRKIA gene in humans involves alternative splicing steps, and the messenger RNA of this gene therefore exists in the form of several transcripts that differ mainly in their regulatory 5 'UTR and 3' coding regions.
  • the DYRKIA gene codes for the protein DYRKIA, and at least 5 isoforms are known.
  • DYRKIA protein is a kinase enzyme that is thought to be involved in the regulation of cell proliferation and brain development.
  • DYRKIA protein is overexpressed in subjects with Down Syndrome, also known as trisomy 21, and is thought to be involved in the pathogenic mechanisms that underlie the mental and physical symptoms of this syndrome.
  • the DYRKIA marker has never been described as a serum marker useful in the diagnosis of Alzheimer's disease.
  • this invention is all the more surprising that it was not known or envisaged that DYRKIA can be found, particularly in its peptide form, in the blood, plasma or serum of human subjects.
  • One of the advantages of the method of the invention is therefore the possibility of using a non-tissue sample from the subject, which allows a simple and non-invasive diagnosis.
  • the method of the invention can be implemented according to inexpensive techniques and which do not require hospitalization.
  • the invention firstly relates to a method for the in vitro diagnosis of Alzheimer's disease in a human subject characterized in that it comprises the analysis of DYRKIA in a sample of blood and / or plasma and / or serum said subject.
  • the invention also relates to the use of this method in the early diagnosis, screening, therapeutic monitoring, prognosis, as well as for the selection of subjects likely to benefit from a treatment, or to participate in clinical trials on Alzheimer's disease.
  • the method of the invention may advantageously be used in addition to currently known tests.
  • blood sample and / or plasma and / or serum is meant within the meaning of the invention any sample comprising blood and / or plasma and / or serum, and any sample derived from these products.
  • sample derived from blood and / or plasma and / or serum is meant for example a sample of blood and / or plasma and / or serum previously treated before use in the diagnostic method of the invention.
  • An example of prior treatment of the sample consists in passing it on an immunocapture support, comprising one of the binding partners of the marker or markers sought in the method of the invention, for example an antibody directed against the marker or markers. sought in the method of the invention.
  • Another An example of pre-treatment of the sample may be the pre-fractionation of the biological sample in order to separate the proteins from the sample. In techniques well known to those skilled in the art, it is possible, for example, first of all to deplete certain proteins of the sample, in particular albumin.
  • DYRKIA analysis is meant within the meaning of the invention the analysis of the modifications of the DYRKIA marker.
  • modifications of a biological marker can be analyzed at several levels, and include, for example, the analysis of the marker gene or products thereof.
  • the analysis of DYRKIA comprises the analysis of the DYRKIA gene, and / or transcripts of the DYRKIA gene and / or the different isoforms of the proteins derived from said transcripts.
  • the modifications of a biological marker may correspond, inter alia, to genetic or epigenetic modifications that are likely to have an impact on the sequence or on the level of expression of the products of this gene.
  • the analysis of DYRKIA comprises the analysis of the sequence, and / or the regulation, and / or the level of expression of the DYRKIA gene.
  • the analysis of DYRKIA comprises the analysis of the expression level of DYRKIA.
  • expression level of DYRKIA is meant within the meaning of the invention the amount of DYRKIA marker in its peptide form and / or in its nucleotide form.
  • DYRKIA marker in its peptide form means according to the invention a peptide whose peptide sequence comprises the peptide sequence of the protein DYRKIA (reference NCBI: NP_001387.2), its isoforms, and / or its variants.
  • variants of the protein DYRKIA is meant according to the invention peptides whose peptide sequence preferably has at least 90% identity, more preferably at least 95%, still more preferably at least 98% identity, with the sequence peptide of the protein DYRKIA.
  • DYRKIA marker in its nucleotide form is meant according to the invention at least one polynucleotide whose sequence comprises the sequence of one of the transcripts of the DYRKIA gene (reference NCBI: NG 009366.1), their fragments and / or their variants.
  • the transcripts of the gene DYRK1A include transcript 1 (reference NCBI: ⁇ 001396.3), transcript 2 (reference NCBI: NM_130436.2), transcript 3 (reference NCBI: NMJ01395.2), transcript 4 (reference NCBI: NM_130438.2).
  • transcripts of the gene DYR 1A are meant according to the invention polynucleotides whose sequence has at least 85% identity, preferably at least 90%>, more preferably at least 95% identity with the nucleotide sequence of transcripts of the DYR 1A gene, in particular the transcripts 1 to 4 mentioned above.
  • sequence identity refers to the identity between the sequences of two polypeptides or two polynucleotides. The identity between the sequences can be determined by comparing the position of each of the sequences, which can be aligned for purposes of this comparison. When a position in the compared sequences is occupied by the same nucleotide residue or amino acid residue, then the sequences are identical at this position.
  • a degree of sequence identity between nucleotide sequences is a function of the number of identical nucleotide residues at positions common to these two sequences.
  • a degree of identity between peptide sequences is a function of the number of identical amino acid residues that are shared between these sequences at positions common to these two sequences.
  • Two polypeptides may each (i) comprise a sequence (i.e., a portion of the complete sequence of said polypeptide) that is similar between the two polypeptides, and (ii) further comprise a sequence that is divergent between two polypeptides.
  • two polynucleotides may each (i) comprise a sequence (i.e., a portion of the complete sequence of said polynucleotide) that is similar between the two polynucleotides, and (ii) further comprise a sequence that is divergent between two polynucleotides.
  • the sequences are aligned to allow for optimal comparison. For example, deviations may be introduced virtually into the sequence of a first polypeptide or a first polynucleotide to allow optimal alignment with the sequence of a second polypeptide or a second polynucleotide.
  • the amino acid or nucleotide residues are then compared between the aligned sequences. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid or nucleotide residue as the second sequence at the corresponding position, the molecules are identical at this position.
  • the sequences can be of the same length or of different lengths.
  • the optimal alignment of the sequences to determine a comparison window can be performed by the Smith and Waterman local homology algorithm (J. Theor Biol, 91 (2): 370-380, 1981), by the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol Biol, 48 (3): 443-453, 1972), by the search for similarity by the method of Pearson and Lipman (Proc Natl Acad Sci USA, 85 (5): ... 2444-2448, 1988), by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in Wisconsin Genetics Software 7.0 Press Pack, Genetic Computer Group, 575 , Science Drive, Madison, Wisconsin). The best alignment (for example, the one that results in the highest percentage of identity during the comparison window) generated by different methods is selected.
  • the level of expression of DYRK1 A can be determined according to any method for detecting and / or quantifying a peptide and / or a polynucleotide in a biological sample known to those skilled in the art, for example any method based on conventional techniques for analyzing biochemistry, microbiology, molecular biology and recombinant DNA techniques, including those described below and in the examples. Such techniques are explained in detail in the literature (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Malke, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the blood and / or the serum and / or the plasma of the subject may also undergo a treatment prior to its analysis, for example grinding and / or dissolution, or extraction of the nucleic acid, preferably mRNA, included in the sample.
  • the extracted nucleic acid may advantageously be amplified prior to determining the level of expression of DYRK1 A.
  • Such treatments are well known to those skilled in the art.
  • the techniques for determining the level of expression of a polypeptide include, for example, mass spectrometry, biochemical tests, including immunological tests, such as, for example, standard detection immunoassays, such as ELISA tests and ELISPOTS tests, or else for example immunological tests using supported protein transfer techniques, such as the slot blot (also called dot blot) or the western blot.
  • the determination of the level of expression of a polypeptide may further comprise a preliminary step of separating the total polypeptides included in the sample of the subject, for example by electrophoresis or chromatography.
  • the determination of the level of expression of DYRK1A in its peptide form comprises at least one immunological test, preferably an ELISA test, a slot blot or a western blot. According to a preferred embodiment of the invention, the determination of the level of expression of DYRK1 A in its peptide form comprises at least one ELISA test.
  • Immunological tests rely on the use of molecules capable of recognizing an antigen with high specificity and sensitivity. Most commonly, antibodies specific for the antigen are used for this purpose.
  • telomere binding proteins bind selectively and reversibly to DYRK1 A in its peptide form.
  • selectively binds is meant in the sense of the invention the ability of antibodies to bind preferentially to an antigen.
  • binding affinity The selective nature of such binding is conventionally referred to as binding affinity, commonly expressed as the association equilibrium constant. Binding affinity can be measured using a variety of methods known to those skilled in the art including immunoblots, immunoprecipitation assays, radioimmunoassays, enzyme immunoassays (e.g., ELISA), assays for antibodies by immunofluorescence and microscopy.
  • affinity of a DYRKIA-specific antibody in its peptide form has an affinity constant of between about 10 3 M -1 and about 10 12 M -1 for said form.
  • polyclonal or monoclonal antibodies specific for a polypeptide knowing the sequence of this polypeptide, are well known to those skilled in the art and do not need to be described in detail here.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunization, possibly multiple, of an animal with the polypeptide in question, then recovery of the serum of said animal and purification of the desired antibodies, in particular by affinity chromatography using the polypeptide used for the immunization.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma method described in Ko hier et al. Nature, 1975, 256 (5517): 495-497).
  • rabbit ab65220 produced by Abcam the rabbit polyclonal anti-DYRKIA antibody PAB19417 produced by Abnova Corporation, the sheep polyclonal anti-DYRKIA antibody PAB9862 produced by Abnova Corporation, the rabbit polyclonal anti-DYRKIA antibody orb38099 produced by Byorbit , NBP1-84031 rabbit polyclonal anti-DYRKIA antibody produced by Novus, LS-B5890 rabbit polyclonal anti-DYRKIA antibody produced by LSBio, the 70R-1962 polyclonal rabbit anti-DYRKIA antibody produced by Fitzgerald, Ab54944 mouse monoclonal anti-DYRKIA antibody produced by Abcam, Abcam rabbit polyclonal anti-DYRKIA antibody produced by Abcam, the sc-12568 goat anti-DYRKIA polyclonal antibody produced by SantaCruz, the rabbit polyclonal rabbit anti-DYRKIA antibody sc-28899 produced by SantaCruz, the rabbit D30C10 monoclonal anti
  • an antibody specific for a protein is not necessarily usable in all existing immunological techniques. This is often explained by the physicochemical conditions of the techniques used, which allow or not good access of the antibody to the antigen to which it binds. Since these conditions are by their nature multimodal, it is particularly difficult to determine a priori what are the techniques in which a given antibody will be usable, and will make it possible, for example, to determine the level of expression of a biological marker with sufficient precision.
  • the inventors have discovered that certain antibodies specific for DYRK1A make it possible to obtain easily interpretable results, and are particularly indicated when the determination of the level of expression of DYRK1A in its peptide form comprises at least one slot blot or a western blot.
  • the immunoassay comprises the use of at least one specific antibody of DYRK1A in its peptide form, said antibody being chosen from among 1 monoclonal anti-DYRKIA antibody from clone 7D10 produced by Abnova Corporation, rabbit D30C10 monoclonal anti-DYRKIA antibody produced by Cell Signaling Technologies.
  • determining the level of expression of a polynucleotide include, but are not limited to, nucleic acid sequencing, hybridization and / or amplification, particularly mRNA.
  • those skilled in the art may choose to sequence, hybridize or amplify the nucleic acid present in the sample of blood and / or serum or plasma with the reference nucleic sequence of the DYRK1 A gene, or with the complementary sequence of one of the transcripts of the DYRK1A gene, in particular the transcripts mentioned above. This determination can be made from all or part of the mRNA included in the sample of blood and / or plasma and / or serum of the subject.
  • hybridization is meant the process in which, under appropriate conditions, two polynucleotides, for example a polynucleotide and an olygonucleotide, bind with stable and specific hydrogen bonds to form a double-stranded complex.
  • Hybridization of two polynucleotides can be complete (the double-stranded complex obtained during this hybridization comprises only AT bonds and CG bonds), or partial (the double-stranded complex obtained also comprises bases that are not bound to a base complementary).
  • Hybridization between two polynucleotides depends on the operating conditions. All these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art.
  • the hybridization temperature is between about 20 and 70 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in a saline solution at a concentration of about 0, 5 to 1 M.
  • hybridization probe is intended to mean a polynucleotide, in particular an oligonucleotide, comprising from 5 to 100 nucleic acids, in particular from 10 to 35 nucleic acids, having a hybridization specificity under conditions determined to form a hybridization complex with DYRK1A in its nucleotide form.
  • the hybridization probe may comprise a marker for its detection.
  • nucleic acid amplification such as for example the polymerase chain reaction (PCR), simple, competitive, in real time, the branched DNA-based signal amplification assays (bDNA) amplification method, or the nucleic acid amplification technology ("nucleic acid sequence based amplification assays", NASBA and “Transcription Mediated Amplification”) ", TMA), so it is not necessary to describe here.
  • PCR polymerase chain reaction
  • bDNA branched DNA-based signal amplification assays
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • amplification primer means a polynucleotide, in particular an oligonucleotide, comprising from 5 to 100 nucleic acids, preferably from 15 to 30 nucleic acids, allowing the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular an enzymatic amplification reaction.
  • enzymatic amplification reaction we mean a process generating multiple copies of a target polynucleotide by the action of at least one enzyme.
  • the analysis of DYR 1A comprises the analysis of the sequence and / or the regulation of the DYRK1A gene in a sample of blood and / or plasma and / or serum of said subject .
  • the analysis of the sequence and / or regulation of the DYR 1A gene may be carried out according to any technique well known to those skilled in the art for analyzing the sequence and / or regulation of a gene.
  • those skilled in the art will choose techniques to demonstrate modifications or alterations of the DNA at the level of the DYR 1A gene (reference NCBI: NG 009366.1), such as, for example, the direct detection of mutations, the implementation of evidence of alterations in the methylation profile of the loci of interest, or any other method of determining alterations of the DNA in a sample.
  • Mutations may include point substitutions of one nucleotide with another, deletions of one or more nucleotides, and insertions of one or more nucleotides.
  • the mutations may be located in the coding part of the DYRK1A gene, or in the 5 'and 3' non-coding parts, such as, for example, the promoter region or the transcription terminator region.
  • Mutational demonstration strategies rely on molecular biology techniques and include DNA extraction, PCR amplification or other amplification, hybridization and / or sequencing techniques.
  • the mutations can then be identified by the difference in size between the expected reference fragment and the mutated fragment, for example in the case of deletions or additions, or by highlighting the modification of the sequence of the amplified fragment relative to to a reference sequence in the case of substitutions.
  • the alterations in the DNA may also correspond to a modification of the methylation profile of the DYRKIA gene.
  • the modification of the methylation profile may correspond to hypomethylation (decrease in the number of methylations) or to hypermethylation (increase in the number of methylations).
  • the altered motifs may be located in the coding portion of the DYRKIA gene, or in the 5 'and 3' non-coding portions, such as the promoter region or the transcription terminator region.
  • MSP methylation-specific PCR
  • COBRA combined bisulfite restriction analysis
  • Ms-SNuPE methylation-sensitive single nucleotide primer extension
  • the inventors have furthermore discovered that the level of expression of DYRKIA in the serum of subjects suffering from Alzheimer's disease is significantly lower than that of unaffected subjects, matched in age. It is thus possible for a person skilled in the art to simply evaluate, for example using a reference level of DYRKIA expression, the risk for the test subject of developing Alzheimer's disease. Thus, according to the invention, the subject will be said to be at risk of developing Alzheimer's disease when the level of DYRKIA expression of said subject will be lower than the level of expression of reference DYRKIA.
  • level of expression of reference DYRKIA is meant in the sense of the present invention the level of expression of DYRKIA representing the average value of the level of expression of said marker in one or more healthy subjects.
  • level of expression of reference DYRKIA from, for example, levels of expression of DYRKIA in the serum of one or more human subjects not suffering from Alzheimer's disease, preferentially matched in age to the test subject, preferably using the same technique for determining said expression level as that used for the tested subject, in order to limit the statistical bias.
  • age-matched is meant for the purposes of the invention human subjects whose age is equal to the age of the subject tested to plus or minus 5 years, the birthday of the subject being used as a reference.
  • the level Reference DYRKIA expression according to the invention is established from the expression levels of DYRKIA in the blood and / or plasma and / or serum sample of at least 5, 10 or 20 non-human subjects. with Alzheimer's disease. Even more preferentially, the level of expression of reference DYRKIA according to the invention is established from the expression levels of DYRKIA in the sample of blood and / or plasma and / or serum of at least 20 human subjects. not suffering from Alzheimer's disease.
  • the method of the invention is characterized in that said subject has Alzheimer's disease if said level of DYRKIA expression is lower than a reference level of DYRKIA expression.
  • the method of the invention is characterized in that said subject has Alzheimer's disease if said level of expression of DYRKIA is less than 35%, 40%, 50%>, 55% at a level of expression. of DYRKIA reference.
  • said level of DYRKIA expression is 35% less than a reference DYRKIA expression level
  • the subject of the invention is also a method for the in vitro diagnosis of Alzheimer's disease in a human subject, characterized in that it comprises the following steps:
  • the inventors have furthermore established reference values which can prove very useful in the implementation of the invention.
  • the inventors have been able to establish reference levels of DYRKIA expression, in particular with regard to the level of expression of DYRKIA in its peptide form, below which the risk for the subject of developing Alzheimer's disease is important
  • the method of the invention is characterized in that said subject has Alzheimer's disease if said level of expression of DYRKIA, in particular the level of expression of DYRKIA in its peptide form, is 35% less than DYRKIA expression level of reference.
  • the method of the invention is characterized in that said subject has Alzheimer's disease if said level of expression of DYRKIA, in particular the level of expression of DYRKIA in its peptide form, is 35% lower.
  • said reference DYRKIA expression level being established from the expression levels of DYRKIA in the blood and / or plasma and / or serum sample of at least 20 human subjects not suffering from Alzheimer's disease.
  • the method of the invention may further be improved by the detection of an additional biological marker other than DYRKIA.
  • an additional biological marker other than DYRKIA improves the specificity and / or sensitivity of the diagnostic method of Alzheimer's disease.
  • the sensitivity of a test measures its ability to give a positive result when a hypothesis is true, while the specificity measures the ability of a test to give a negative result when the assumption is false.
  • a biological marker is a feature that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological responses to a therapeutic intervention.
  • a marker thus designates a whole range of substances and various parameters.
  • a marker may be a substance whose detection indicates a particular disease state (e.g., the presence of activated protein C as a marker of infection).
  • a marker is a polypeptide or polynucleotide whose expression changes, in particular level of expression, or state, correlate with the risk or progression of a disease.
  • homocysteine is a nonproteinogenic sulfur amino acid resulting from the catabolism of methionine. This molecule is a pro-inflammatory substance whose plasma level is abnormally high in the case of cerebral atrophy, one of the symptoms of Alzheimer's disease (Smith et al, PLoS One, 2010 Sep 8; 5 (9): el2244 ).
  • homocysteine in the blood and / or plasma and / or serum of human subjects is commonly used clinically and well known to those skilled in the art, and does not need to be described here. If he wishes, he can refer to Fortin et al. ⁇ Clin Biochem. ; 1995; (2): 155-62) for a full description of the methods that can be used.
  • the BDNF marker is part of the family of neurotrophic growth factors that are linked to NGF ("Nerve Growth Factor”). Neurotrophic factors are present in the brain and the periphery.
  • the BDNF gene (reference NCBI: NG_011794.1, also known as ANON2 and BULN2), codes for the BDNF protein.
  • the BDNF protein acts on certain neurons of the central nervous system and the peripheral nervous system, contributing to the survival of existing neurons, and stimulating the growth and differentiation of new neurons and synapses.
  • Post-mortem analyzes have shown low levels of expression of the gene encoding BDNF in the brain tissue of Alzheimer's disease patients.
  • the BDNF protein is found in the blood, serum and plasma of human subjects. The determination, in particular serum, of the BDNF protein can easily be carried out according to the technique described in Undine et al. (Neuropsychopharmacology, 2005; 30, 1148-1153).
  • the APOD marker (reference Set: ENSG00000189058) is encoded by a gene located on chromosome 3 in humans. This gene codes for a transcript (reference NCBI: ⁇ 001647.3), itself translated into a so-called precursor peptide of the Apo D protein (reference NCBI: ⁇ 001638.1).
  • Apo D is a high density lipoprotein component whose sequence has little identity with the sequences of other apolipoproteins (including ⁇ apo lipoprotein E). Apo D is closely associated with lecithin-cholesterol acyltransferase, an enzyme involved in lipoprotein metabolism.
  • the APOD marker has been correlated with androgen insensitivity syndrome.
  • the inventors have furthermore shown that a decrease in the level of expression of the APOD marker, in particular in the plasma and serum of a human subject, correlates with the risk of developing Alzheimer's disease.
  • Apo D in particular is found in the serum and plasma of human subjects and can easily be assayed by any immunological technique, in particular by ELISA.
  • ELISA tests are available, such as, for example, the "Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD)" test marketed by ShangHai BlueGene Biotech CO.
  • the method of the invention further comprises the analysis of at least one of the markers chosen from Homocysteine, BDNF and APOD in a sample of blood and / or plasma and / or serum of said subject .
  • the method of the invention consists of the analysis
  • the analysis of one or more markers other than DYRKIA comprises the analysis of the sequence, and / or the regulation, and / or the level of expression of the gene of said marker (s).
  • the assay comprises homocysteine marker level analysis.
  • the analysis of the BDNF and / or APOD marker comprises the analysis of the level of expression of the BDNF and / or APOD marker.
  • level of expression of the marker BDNF and / or APOD is meant within the meaning of the invention the amount of said marker or said markers in its peptide form and / or in its nucleotide form.
  • BDNF and / or APOD marker Those skilled in the art will be able to choose the most appropriate method for determining the levels and levels of expression of the BDNF and / or APOD marker. In particular, it will be obvious to those skilled in the art that it is possible to determine the level of expression of the BDNF and / or APOD marker in its peptide form, or in its nucleotide form.
  • BDNF marker in peptide form is intended to mean a peptide whose peptide sequence comprises the peptide sequence of the reference BDNF protein, proBDNF (swissprot reference: P23560.1), its fragments and / or its variants.
  • variants of the BDNF protein is meant according to the invention peptides whose peptide sequence advantageously has at least 90% identity, more preferably at least 95%, even more preferably at least 98% identity, with the sequence Peptide of the BDNF protein.
  • BDNF marker in its nucleotide form is meant according to the invention at least one polynucleotide whose sequence comprises the sequence of one of the transcripts of the BDNF gene (reference NCBI of the BDNF gene: NG_011794.1), their fragments and / or of their variants.
  • the transcripts of the BDNF gene comprise transcript 1 (reference NCBI: NM_007540.4), transcript 2 (reference NCBI: NM_001048139.1), 1 (reference NCBI: NM_001048141.1).
  • the term peptide marker APOD in its peptide form is understood to mean a peptide whose peptide sequence comprises the peptide sequence of the precursor of the Apo D protein (reference NCBI: NP_001638.1), its fragments and / or its variants.
  • variants of the precursor of the Apo D protein is meant according to the invention peptides whose peptide sequence advantageously has at least 90%> identity, more preferably at least 95%>, even more preferably at least 98%> d identity, with the peptide sequence of the precursor of the protein Apo D.
  • APOD marker in its nucleotide form is meant according to the invention at least one polynucleotide whose sequence comprises the transcript sequence of the APOD gene, its fragments and / or its variants.
  • the transcript of the APOD gene is the reference polynucleotide NCBI: ⁇ 001647.3.
  • the level of the marker is determined.
  • the level of expression of the BDNF and / or APOD marker in its peptide form is determined.
  • the skilled person may, for example, use any antibody specific for BDNF.
  • a number of antibodies specific for this protein are known, such as those used in the EMax, Immunoassay (ELISA E-Max, Promega, Madison, WI) methods.
  • the skilled person may for example use any antibody specific for APOD.
  • a number of antibodies specific for this protein are known, such as for example those used in the kit "Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD)" marketed by ShangHai BlueGene Biotech CO.
  • the invention may for example be implemented to select subjects who can benefit from treatment of Alzheimer's disease, and / or may benefit from medical supervision.
  • the invention also relates to a method for selecting a human subject that can benefit from treatment of Alzheimer's disease and / or medical surveillance and / or can participate in a clinical study on a therapeutic treatment of Alzheimer's disease, comprising:
  • the invention is also particularly useful for monitoring the evolution of subjects, in particular suffering from Alzheimer's disease or at risk of developing it.
  • the rapid evolution of Alzheimer's disease is a sign of its seriousness, and the invention can therefore be used by the practitioner to choose the best treatment to be administered to the subject, according to these parameters.
  • the invention also relates to a method for determining the progression of Alzheimer's disease in a human subject, comprising the steps of:
  • step c) finding that Alzheimer's disease has progressed in said subject if said second level of DYRK1A expression of step b) is lower than said second level of DYR expression 1A of step a).
  • the invention may also be used during the treatment of Alzheimer's disease in a human subject, in order to evaluate the effectiveness of the drugs administered, thus making it possible to adapt them if necessary.
  • the invention also relates to a method for monitoring the efficacy of a treatment of Alzheimer's disease in a human subject, comprising the steps of:
  • step b) determining a second level of expression of DYRK1A in a sample of blood and / or plasma and / or serum of said subject after a time T following the first administration of said treatment; c) concluding that said treatment is effective in said subject if said level of DYR 1A expression of step b) is greater than said level of DYR 1A expression of step a).
  • the person skilled in the art will again determine the time T separating step a) from step b), in view of his knowledge of Alzheimer's disease, as well as the age of the patient, possibly other parameters. that it will consider relevant.
  • the subject of the invention is also a kit for implementing one of the methods of the invention, comprising at least one means necessary for determining the level of expression of DYRK1A, preferentially the expression level of DYR. 1A in its peptide form, in a sample of blood and / or plasma and / or serum of a human subject, and preferably a user manual.
  • DYRK1A-specific antibodies for example, DYRK1A-specific antibodies, nucleic acid probes and / or amplification primers capable of binding to DYRK1A in its nucleotide form, as described. previously.
  • the kit of the invention also comprises at least one means necessary for determining the level of Homocysteine marker, the level of expression of the BDNF marker and / or the level of expression of the APOD marker.
  • the means necessary for determining the level of the homocysteine marker are, for example, tri-N-butylphosphine and the ammonium salt of 7-fluorobenzoflurazone-4-sulphonic acid.
  • the means necessary for determining the level of expression of the BDNF marker are, for example, the antibodies specific for the BDNF marker, the nucleic probes and / or the amplification primers capable of binding to the BDNF marker in its nucleotide form, as previously described.
  • the means necessary for determining the expression level of the APOD marker are, for example, antibodies specific for the APOD marker, nucleic probes and / or amplification primers capable of binding to the APOD marker in its nucleotide form, such as than previously described.
  • kits of the invention comprise at least two oligonucleotide primers flanking the target marker in its nucleotide form, and hybridizing with opposite strands of the target marker in its nucleotide form.
  • AD mild cognitive impairment
  • AD CDR> 1
  • CSF AD cerebral spastic syndrome
  • the "CSF AD” biomarker profile was defined as the P-Tau / AB42 ratio greater than 0.21 because it distinguishes AD from controls with high sensitivity and specificity of 19.
  • Plasma is composed of a set of highly informative proteins from a medical point of view. Indeed, the majority of the cells communicate with the plasma directly or through the extracellular or cerebrospinal fluid. These proteins can therefore have a diagnostic potential.
  • Plasma purification consists of removing a very dominant protein in this tissue: albumin.
  • the aurum kit gel-gel blue mini kits and columns (Bio-rad) is used. In order not to dilute too much the plasma in the buffer solution, it is passed directly into the columns without adding the latter.
  • the Bradford method This method consists of a colorimetric assay based on the variation of the absorbance. It is based on the color change of the initially blue Bradford reagent (blue of coomasia) measured from a spectrophotometer.
  • Coomassie blue is an intercalator of aromatic amino acids
  • the absorbance is proportional to the amount of protein.
  • the more amino acids linked to the intercalator the more proteins are present in the sample and the more the blue staining density increases, ie the absorbance.
  • This method remains the least sensitive to the interference of agents present in the samples, unlike other protein assay techniques such as the biuret method, that of Kjeldahl, or U.V spectroscopy.
  • DYRKIB is determined by the Slot Blot technique. This technique is used for the quantification of proteins in a biological mixture.
  • the Slot Blot detection by The principle of chemiluminescence is to transfer proteins from a biological fluid to a nitrocellulose membrane, in order to test their reactivity to antibodies to specific proteins. They will then be revealed by means of a detector coupled to the secondary antibody which may be a fluorochrome or an enzyme, after incubation with a primary antibody directed against the protein of interest and then with a secondary antibody recognizing an epitope of the primary antibody.
  • the marking which is then a substrate-sensitive element, will emit light rendered in digital image by a camera after exposure.
  • This technique is a simplification of the Western Blot method. Indeed, the mixture containing the protein to be analyzed is applied directly to the membrane and therefore the part of the Western blot comprising the electrophoresis is not performed. For this, it requires a very specific primary antibody.
  • TS 150 ⁇ m NaCl, 10 ⁇ m Tris
  • Laemmli 2X without blue
  • the samples are then deposited on a nitrocellulose membrane (Whatman® Protrano® Nitrocellulose Transfer Membrane) using a Slot Blot: Whatman paper impregnated with TS buffer is deposited on the membrane support, which is covered with the nitrocellulose membrane. also soaked with TS buffer. The upper support of the Slot Blot is then attached to the membrane support which is connected to a vacuum pump. After a first washing of all the wells placed on the upper support with 200 ⁇ l of TS, the samples can be deposited (50 ⁇ per deposit). A second wash with 200 ⁇ TS is then performed.
  • the membrane is recovered and saturated for 1 hour at room temperature in 10% TST-Milk (TST: 150 mM NaCl, 10 ⁇ m Tris, 0.1% Tween), with stirring. It follows a nightly incubation at 4 ° C, with stirring, with the primary Anti-DYRKIA antibody (anti-DYRKIA antibody abnova Corporation ref H00001859-M01) diluted 250th, still in TST containing 10% > milk.
  • TST-Milk TST: 150 mM NaCl, 10 ⁇ m Tris, 0.1% Tween
  • the level of expression of the DYRK1A protein is then measured by densitometric analysis, which consists of evaluating the intensity of the Luminol incubated deposit with the UnScan-it software compared to the Ponceau red stained proteins which makes it possible to quantify the total proteins present on the membrane.
  • the blot method described above was applied to the assay of DYR 1 A in the serum of control individuals (CTRL) and patients with Alzheimer's disease (AD). There is a significant decrease in the level of DYR 1A in the patients' serum ( Figure 1).
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the total plasma homocysteine assay is performed from a venous blood tube taken from sodium citrate, stored in ice between the time of collection and plasma centrifugation, at 3000 rpm at 4 ° C.
  • High performance liquid chromatographic (HPLC) technique using detection is used fiuorimetric: adaptation of the technique previously published by Araki et al. (J Chromatogr 1987 Nov 27; 422: 43-52) and modified by Ubbink et al. (J Chromatogr, 1991, 565: 441-446) and Fortin et al (J Chromatogr, 1991, 565: 441-446).
  • the thiolated plasma compounds are reduced or released from the plasma proteins with tri-n-butylphosphine.
  • 100 ⁇ l of supernatant are mixed with 20 ⁇ l of NaOH (1.55 M), 250 ⁇ l of potassium tetraborate (0.125 M), pH 9.5, containing 4 mM of EDTA, and 100 ⁇ l of SBD-F (1 g / l in potassium tetraborate). They are incubated at + 60 ° C for 1h. After cooling, 20 ⁇ of sample is injected into the HPLC system, either directly or via an autosampler. Homocysteine is quantified by fluorimetry.
  • the HPLC system used includes a "Programmable Solvent Module 126, System Gold” programmer (Beckman) controlling a “Programmable Solvent Module 116, System Gold” pump (Beckman).
  • the samples are introduced into the HPLC chain, either directly through a Rheodyne injection valve adapted to a 20 ⁇ injection loop, or via a "717 plus autosampler” automatic sample changer (Waters).
  • the separation is carried out at ambient temperature by means of a Lichrosorb reverse phase analytical column (RP18, 250 ⁇ 4 mm, 7 ⁇ particle size) marketed by Merck.
  • the fluorescence intensities are measured with excitation and emission wavelengths of 385 and 515 nm respectively, using a fluorescence spectrophotometer "Waters 474 scanning fluorescence detector” (Waters).
  • the detection system is connected to a “Waters 746 data module” integrator (Waters) to quantify the area of the peaks.
  • the HPLC assay shows an increase in the level of homocysteine in patients with Alzheimer's disease ( Figure 3).
  • the determination of the BDNF is carried out by ELISA with the "ELISA E-Max kit" (Promega) on 100 of plasma diluted half in the buffer provided in the kit.
  • the samples are incubated for 2 h on a 96-well plate previously lined with the anti-BDNF monoclonal antibody which captures the mature and soluble BDNF present in the plasmas.
  • TBST 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.05% Tween®20, pH 7.6
  • the plate is incubated for 2 h in the presence of the anti-human BDNF polyclonal antibody.
  • the unfixed antibody is removed by washing the wells.
  • the amount of human BDNF is detected using a peroxidase conjugated antibody directed against the human polyclonal antibody.
  • Peroxidase activity is measured by the addition of a chromogenic substrate. After 20 minutes of incubation, the reaction is stopped by acidification and the absorbance is measured at 450 nm, which is proportional to the amount of BDNF present in the samples. The amount of BDNF is calculated from the results of a standard range made on a standard BDNF solution whose initial concentration is known.
  • BDNF Brain derived neurotrophic factor
  • the APOD assay is performed by ELISA with the "Bluegene ELISA Kit” on 50 of plasma diluted half in buffer provided in the kit. The samples are incubated for 1 h on a 96-well plate pre-coated with an APOD monoclonal antibody in the presence of the APOD-HRP conjugated antibody. After 5 washings with TBST (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.05% Tween®20, pH 7.6, the peroxidase activity is measured by the addition of a chromogenic substrate.
  • TBST 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.05% Tween®20, pH 7.6
  • the lymphoblastoid lines are derived from primary cultures of B lymphocytes and immortalized by the EBV virus. They were maintained in complete medium OptiMEM®-GlutaMAX® (GIBCO Invitrogen TM), supplemented with 5% fetal calf serum and 1% of a mixture of antibiotics (Penicillin 100 U.mL-1 and Streptomycin 100 ⁇ g. ml-l). Cell lysis is performed in lysis buffer containing 50 mM Tris pH8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL (SIGMA), 0.1% SDS and protease inhibitors (E64 5 ⁇ g.mL-1; Leuleptin 2 5 ⁇ g.mL-1; Pefabloc ImM; SIGMA). After centrifugation at 15000 g, the supernatant containing the proteins is recovered and the amount of proteins is determined by the Bradford technique. The amount of DYRKIA protein is measured by the slot blot technique described above. Results

Abstract

L'invention concerne le domaine des méthodes de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez le sujet humain. L'invention a pour premier objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. Préférentiellement, l'analyse de DYRK1A comprend la détermination du niveau d'expression de DYRK1A. Selon un mode de réalisation, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur à un niveau d'expression de DYRK1A de référence. Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprend en outre la détermination du niveau d'expression d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.

Description

MARQUEUR DYRK1A POUR LA MALADIE D'ALZHEIMER
L'invention concerne le domaine des méthodes de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez le sujet humain.
La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative (perte progressive de neurones) incurable du tissu cérébral qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions mentales et notamment de la mémoire. C'est la forme la plus fréquente de démence chez l'Homme. Elle est la cause principale de dépendance lourde du sujet âgé et le motif principal d'entrée en institution spécialisée. L'évolution se fait sur plusieurs années avec l'apparition d'une dépendance progressive avec retentissement sur les activités de la vie quotidienne. La maladie d'Alzheimer touchait environ 26 millions de personnes dans le monde en 2005 et pourrait en toucher quatre fois plus en 2050, ce qui équivaudrait alors à 1 personne sur 85. Dans les pays développés, la maladie d'Alzheimer est l'une des pathologies les plus coûteuses pour la société.
La majorité des cas de maladie d'Alzheimer sont dits sporadiques, ils ne sont pas héréditaires, bien que la présence de certains gènes soit un facteur de risque. L'anémie, le diabète, des troubles de la glande thyroïde, les carences en vitamines B12 et folates, sont connus pour être des facteurs aggravants de la maladie.
Actuellement, le diagnostic de la maladie d'Alzheimer repose essentiellement sur l'association de signes cliniques, de résultats de tests neuropsychologiques et de signes radiologiques. On estime que le diagnostic clinique de la maladie d'Alzheimer n'est formel qu'après examen anatomopatho logique du cerveau post-mortem.
Les tests neuropsychologiques permettent de préciser l'origine et la nature des troubles. Ils sont nécessairement réalisés au cours d'une consultation. En premier lieu est pratiqué le « Mini Mental State Examination » (MMSE), de Folstein. Ce test, conçu pour un dépistage rapide des déficits cognitifs, explore les fonctions cognitives du sujet.
Cet examen permet une première évaluation de la mémoire des faits récents, du langage, et des tâches complexes, mais reste cependant insuffisant pour établir un diagnostic différentiel ou déterminer des facteurs aggravants de la maladie d'Alzheimer. II est ainsi nécessaire de le compléter par des examens biologiques du sang et des urines du sujet ainsi que par l'imagerie, en particulier l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et éventuellement la scintigraphie cérébrale par tomographie d'émission monophotonique. L'imagerie permet de révéler une éventuelle atrophie du lobe temporal interne et notamment de l'hippocampe, critère de diagnostic précoce d'Alzheimer, et éventuellement de déceler des séquelles d'accidents vasculaires, qui peuvent être à l'origine des difficultés cognitives.
Actuellement, il n'existe donc pas de test unique permettant de déterminer si une personne est atteinte de la maladie d'Alzheimer. Devant le besoin de tests discriminants, des marqueurs biologiques de la maladie ont été recherchés.
Un des facteurs de risques génétiques les mieux décrits est la possession de l'allèle ε4 du gène de l'apo lipoprotéine E (APOE). Entre 40 et 80% des personnes touchées par la maladie d'Alzheimer possède au moins un allèle ΑΡΟΕε4. Le déclenchement de la maladie ne peut cependant être uniquement expliqué par la génétique. En effet, certaines populations ne présentent aucune relation entre la présence de ΓΑΡΟΕε4 et l'incidence ou l'âge de déclenchement de la maladie d'Alzheimer. L'utilisation d'APOE comme marqueur biologique pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer paraît donc insuffisant.
Il est envisageable que de nombreux autres gènes puissent également être des facteurs de risque ou au contraire avoir un effet protecteur, et ainsi influencer le déclenchement de la maladie d'Alzheimer. Néanmoins, bien que des études aient testé l'influence de plus de 400 gènes différents, la plupart n'ont pas donné de résultats utilisables et concluent à une très forte influence de l'environnement.
Il paraît difficile dans cette perspective d'envisager des tests basés sur des analyses génomiques, quand bien même ceux-ci comprendraient l'analyse d'un grand nombre de gènes. En France, la Haute Autorité de Santé, une autorité publique indépendante à caractère scientifique, ne recommande d'ailleurs à l'heure actuelle d'étude génétique que chez les patients ayant des antécédents familiaux de démence évocateurs d'une transmission autosomique dominante. Ces formes génétiques familiales à transmission autosomale, connues sous le nom de maladie d'Alzheimer familiale précoce (Early onset familial Alzheimer's Disease), restent cependant très minoritaires. On estime qu'elles représentent seulement 0,1% des cas de maladie d'Alzheimer.
Par ailleurs, les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes biologiques de la maladie ont permis d'identifier en particulier que les protéines Tau totales, les protéines Tau hyperphosphorylées, et le peptide Αβ 1-42, sont de bons marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Cependant, ces marqueurs ne sont présents que dans le liquide céphalo-rachidien et leur dosage ne peut bien évidement être réalisé qu'en clinique, selon des modalités délicates et coûteuses.
Le diagnostic clinique des patients atteints de la maladie dAlzheimer pose donc aujourd'hui de nombreuses difficultés. Il y a un réel besoin d'une méthode simple et peu coûteuse permettant de déterminer le risque de développer la maladie d'Alzheimer afin de faciliter le diagnostic et le suivi de cette pathologie, et qui pourrait être intégrée aux tests cognitifs actuellement utilisés. De plus, il existe une forte demande pour des marqueurs biologiques fiables, valides et économiques, en particulier de la part des groupes pharmaceutiques qui pourraient ainsi améliorer la sélection des patients pouvant participer aux essais cliniques sur la maladie dAlzheimer.
Légendes des figures
Figure 1 : taux de protéines DYRK 1 dans le plasma de sujets sains (contrôles « CTRL ») et de sujets atteints de la maladie dAlzheimer (AD).
La technique du Slot- blot a été utilisée pour détecter l'expression relative de A) DYR.K.1 A plasmatique chez les sujets contrôles et sujets AD, B) DYRK.1 B plasmatique chez les sujets contrôles et sujets AD; C) DYRK1A plasmatique selon le niveau MMSE des sujets testés : MMSE > 27, MMSE < 27 ; D) Niveau de DYR 1 A plasmatique selon le niveau PIB des sujets testés PIB : < 1.4 , PIB > 1 .4.
Points blancs : contrôles ; points gris clair: sujets atteints de la maladie d'Alzheimer et présentant des signes de déficience cognitive légère (MCI -AD); points gris foncé : sujets atteints de la maladie d'Alzheimer et présentant des signes de démence (AD). Les barres indiquent moyenne ± erreur type ; **** p < 0,0001 ; ** * p < 0,001 ; au : unités arbitraires. Figure 2: Corrélation entre le niveau des marqueurs du LCR ( liquide céphalo-rachidien) et le niveau de DYRK1 A plasmatique.
A) Niveau de protéine Abêta ( > 500 ) de et DYR 1 A , B ) Niveau de protéine Tau ( < 450 ) et de DYRK.1 A ; C ) Niveau de protéine Tau phosphorylée p- Tau ( < 60 ) et de DYRK I A. La corrélation a été évaluée selon le test de corrélation de Spearman. Les graphiques indiquent les combes de régression avec un intervalle de confiance de 95 % ; au: unités arbitraire ; Figure 3: Quantification de biomarqueurs associés à l'expression plasmatique de DYRKIA.
A) Homocystéine (HCY , μΜ ), B) Brain- derived neurotrophic factor (BDNF , ng / ml. ), C) Apoiipoprotéine D (ApoD , ug / ml ). Points blancs : contrôles ; points gris clair: sujets atteints de la maladie dAlzheimer et présentant des signes de déficience cognitive légère (MCI -AD); points gris foncé : sujets atteints de la maladie dAlzheimer et présentant des signes de démence (AD). Les barres indiquent moyenne ± erreur type * P < 0.05 ; ** p <0,01, *** p < 0,001.
Figure 4: Niveau de protéine DYRKIA dans des lignées de lymphoblastoides.
Points blancs : contrôles ; points gris clair: sujets atteints de la maladie dAlzheimer et présentant des signes de déficience cognitive légère (MCI -AD); points gris foncé : sujets atteints de la maladie dAlzheimer et présentant des signes de démence (AD). Les barres indiquent moyenne ± erreur type; * p < 0.05.
Les Inventeurs ont mis en évidence, de façon inattendue, un marqueur biologique qui est modifié chez les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer, et ont établi que ce marqueur est présent dans le sang, le plasma et le sérum des sujets humains. Les Inventeurs ont ainsi découvert qu'il est possible d'évaluer si un sujet humain présente un risque de développer la maladie d'Alzheimer, d'une façon simple, rapide et peu coûteuse, par l'analyse du marqueur DYRKIA, en particulier par la détermination du niveau d'expression du marqueur DYRKIA, par exemple sous sa forme protéique ou sous sa forme nucléotidique, dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
L'expression du gène DYRKIA chez l'Homme implique des étapes d'épissage alternatif, et l'ARN messager de ce gène existe donc sous la forme de plusieurs transcrits qui diffèrent principalement dans leurs régions régulatrices 5' UTR et 3' codante. Le gène DYRKIA code pour la protéine DYRKIA, et au moins 5 isoformes sont connus. La protéine DYRKIA est une enzyme kinase qui serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et le développement cérébral. La protéine DYRKIA est surexprimée chez les sujets atteints du syndrome de Down, aussi appelée trisomie 21, et est suspectée de participer aux mécanismes pathogéniques qui sous- tendent les symptômes mentaux et physiques de ce syndrome. Le marqueur DYRKIA n'a jamais été décrit comme pouvant être un marqueur sérique utile dans le diagnostic de la maladie d'Alzheimer.
Ainsi, cette invention est d'autant plus surprenante qu'il n'était pas connu ni envisagé que DYRKIA puisse être retrouvé, en particulier sous sa forme peptidique, dans le sang, le plasma ou dans le sérum des sujets humains.
Un des avantages de la méthode de l'invention est donc la possibilité d'utiliser un échantillon non tissulaire provenant du sujet, ce qui permet un diagnostic simple et non invasif. De plus, la méthode de l'invention peut être mise en œuvre selon des techniques peu coûteuses et qui ne nécessitent pas d'hospitalisation.
L'invention a pour premier objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYRKIA dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
L'invention concerne aussi l'utilisation de cette méthode dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic, ainsi que pour la sélection des sujets susceptibles de bénéficier d'un traitement, ou encore devant participer à des essais cliniques sur la maladie d'Alzheimer. La méthode de l'invention peut avantageusement être utilisée en complément des tests actuellement connus.
Par échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum, on entend au sens de l'invention tout échantillon comprenant du sang et/ou de plasma et/ou de sérum, ainsi que tout échantillon dérivé de ces produits. Par échantillon dérivé de sang et/ou de plasma et/ou de sérum, on entend par exemple un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum préalablement traité avant son utilisation dans la méthode de diagnostic de l'invention. Un exemple de traitement préalable de l'échantillon consiste à le faire passer sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison du ou des marqueurs recherchés dans la méthode de l'invention, par exemple un anticorps dirigé contre le ou les marqueurs recherchés dans la méthode de l'invention. Un autre exemple de traitement préalable de l'échantillon peut être le pré- fractionnement de l'échantillon biologique, afin de séparer entre elles les protéines de l'échantillon. Dans des techniques bien connues de l'homme du métier, on peut par exemple tout d'abord dépléter certaines protéines de l'échantillon, en particulier l'albumine.
Par analyse de DYRKIA on entend au sens de l'invention l'analyse des modifications du marqueur DYRKIA. L'homme du métier comprendra aisément que les modifications d'un marqueur biologique peuvent être analysées à plusieurs niveaux, et comprendre par exemple l'analyse du gène du marqueur ou bien des produits de ce gène. Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse de DYRKIA comprend l'analyse du gène DYRKIA, et/ou des transcrits du gène DYRKIA et/ou des différents isoformes des protéines issus desdits transcrits. L'homme du métier sait que les modifications d'un marqueur biologique peuvent correspondre, entre autres, à des modifications génétiques ou épigénétiques qui sont susceptibles d'avoir un impact sur la séquence ou encore sur le niveau d'expression des produits de ce gène. Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse de DYRKIA comprend l'analyse de la séquence, et/ou de la régulation, et/ou du niveau d'expression du gène DYRKIA.
Préférentiellement, l'analyse de DYRKIA comprend l'analyse du niveau d'expression de DYRKIA.
Par « niveau d'expression de DYRKIA », on entend au sens de l'invention la quantité de marqueur DYRKIA sous sa forme peptidique et/ou sous sa forme nucléotidique.
Par marqueur DYRKIA sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique de la protéine DYRKIA (référence NCBI : NP_001387.2), ses isoformes, et/ou ses variants. Par variants de la protéine DYRKIA, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente préférentiellement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95%, encore plus préférentiellement au moins 98% d'identité, avec la séquence peptidique de la protéine DYRKIA.
Par marqueur DYRKIA sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence d'un des transcrits du gène DYRKIA (référence NCBI : NG 009366.1), de leurs fragments et/ou de leurs variants. Au sens de la présente invention, les transcrits du gène DYRK1A comprennent le transcrit 1 (référence NCBI : ΝΜ 001396.3), le transcrit 2 (référence NCBI : NM_130436.2), le transcrit 3 (référence NCBI : NMJ01395.2), le transcrit 4 (référence NCBI : NM_130438.2).
Par variants des transcrits du gène DYR 1A, on entend selon l'invention des polynucléotides dont la séquence présente au moins 85% d'identité, préférentiellement au moins 90%>, plus préférentiellement au moins 95% d'identité avec la séquence nucléotidique des transcrits du gène DYR 1A, en particulier les transcrits 1 à 4 susmentionnés.
Les termes "identité de séquence" se réfèrent à l'identité entre les séquences de deux polypeptides ou de deux polynucléotides. L'identité entre les séquences peut être déterminée en comparant la position de chacune des séquences, qui peuvent être alignées aux fins de cette comparaison. Lorsqu'une position dans les séquences comparées est occupée par le même résidu de nucléotide ou le même résidu d'acide aminé, alors les séquences sont identiques à cette position. Un degré d'identité de séquence entre des séquences nucléotidiques est une fonction du nombre de résidus de nucléotide identiques à des positions communes à ces deux séquences. Un degré d'identité entre des séquences peptidiques est une fonction du nombre de résidus d'acide aminé identiques qui sont partagés entre ces séquences à des positions communes à ces deux séquences. Deux polypeptides peuvent chacun (i) comprendre une séquence (c'est à dire une partie de la séquence complète dudit polypeptide) qui est similaire entre les deux polypeptides, et (ii) comprendre en outre une séquence qui est divergente entre deux polypeptides. De façon similaire, deux polynucléotides peuvent chacun (i) comprendre une séquence (c'est à dire une partie de la séquence complète dudit polynucléotide) qui est similaire entre les deux polynucléotides, et (ii) comprendre en outre une séquence qui est divergente entre deux polynucléotides.
Afin de déterminer le pourcentage d'identité de séquence de deux polypeptides ou de deux polynucléotides, les séquences sont alignées afin de permettre une comparaison optimale. Par exemple, des écarts peuvent être introduits virtuellement dans la séquence d'un premier polypeptide ou d'un premier polynucléotide pour permettre un alignement optimal avec la séquence d'un second polypeptide ou d'un second polynucléotide. Les résidus d'acide aminé ou de nucléotide sont ensuite comparés entre les séquences alignées. Quand une position dans la première séquence est occupée par le même résidu d'acide aminé ou de nucléotide que la seconde séquence à la position correspondante, les molécules sont identiques à cette position. Le pourcentage d'identité entre les deux séquences est une fonction du nombre de positions identiques partagées par les séquences. D'où la formule générale suivante : % d'identité = nombre de positions identiques / nombre total de chevauchement des positions X 100.
Dans cette comparaison, les séquences peuvent être de même longueur ou de longueurs différentes. L'alignement optimal des séquences pour déterminer une fenêtre de comparaison peut être effectuée par l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (J. Theor Biol, 91 (2):.. 370-380, 1981), par l'algorithme d'alignement d'homologie de Needleman et Wunsch (J. Mol Biol, 48 (3):. 443-453, 1972), par la recherche de similitude par la méthode de Pearson et Lipman (Proc. Natl Acad Sci USA, 85 (5):... 2444-2448, 1988), par des mises en œuvre informatisées de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software 7.0 Paquet de presse, le groupe d'ordinateurs génétique, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin). Le meilleur alignement (par exemple celui dont résulte le plus fort pourcentage d'identité au cours de la fenêtre de comparaison) généré par différentes méthodes est sélectionné.
Le niveau d'expression de DYRK1 A pourra être déterminé selon toute méthode de détection et/ou de quantification d'un peptide et/ou d'un polynucléotide dans un échantillon biologique connue de l'homme du métier, par exemple toute méthode basée sur des techniques classiques d'analyse de biochimie, microbiologie, biologie moléculaire et des techniques d'ADN recombinant, notamment celles décrites ci-après et dans les exemples. De telles techniques sont expliquées en détail dans la littérature (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Malke, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover; Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les méthodes décrites ci-après sont présentées à titre indicatif et ne constituent en aucune manière une liste exhaustive des approches techniques pouvant être utilisées pour la mise en œuvre de l'invention. L'homme du métier saura identifier selon l'état d'évolution et d'optimisation des techniques, à tout moment, quelles sont les méthodes les mieux adaptées pour mettre en œuvre l'invention. En fonction de la méthode de détection et/ou de quantification employée, le sang et/ou le sérum et/ou le plasma du sujet pourra en outre subir un traitement préalable à son analyse, par exemple de broyage et/ou de dissolution, ou d'extraction de l'acide nucléique, préférentiellement de l'ARNm, compris dans l'échantillon. L'acide nucléique extrait peut avantageusement peut être amplifié avant la détermination du niveau d'expression de DYRK1 A. De tels traitements sont bien connus de l'homme du métier.
Les techniques pour déterminer le niveau d'expression d'un polypeptide sont connues de l'homme du métier et incluent par exemple la spectrométrie de masse, les tests biochimiques, y compris les tests immunologiques, comme par exemple les tests immunologiques de détection classiques, tels que les tests ELISA et les tests ELISPOTS, ou encore comme par exemple des tests immunologiques employant des techniques de transfert des protéines sur support, tels que le slot blot (aussi appelé dot blot) ou le western blot. La détermination du niveau d'expression d'un polypeptide peut comprendre en outre une étape préalable de séparation des polypeptides totaux compris dans l'échantillon du sujet, par exemple par électrophorèse ou chromatographie.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique comprend au moins un test immunologique, préférentiellement un test ELISA, un slot blot ou un western blot. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la détermination du niveau d'expression de DYRK1 A sous sa forme peptidique comprend au moins un test ELISA.
Les tests immunologiques reposent sur l'utilisation de molécules capables de reconnaître un antigène avec une grande spécificité et une grande sensibilité. Le plus couramment, on utilise à cette fin des anticorps spécifiques de l'antigène.
Par « anticorps spécifiques», on entend au sens de l'invention toute molécule protéique, préférentiellement toute molécule d'immunoglobine, qui se lie sélectivement et de manière réversible à un antigène avec la sélectivité requise. Le terme désigne à la fois les molécules d'immunoglobuline intactes telles que les anticorps monoclonaux et polyclonaux, et aussi les bi-anticorps spécifiques, les anticorps humanisés, les anticorps chimériques, les anticorps anti-idiotypiques (anti-ID), les anticorps simple chaîne, les fragments Fab, les fragments F (ab'), les protéines de fusion, dès lors qu'ils se lient sélectivement et de manière réversible à DYRK1 A sous sa forme peptidique. Par « se lie sélectivement », on entend au sens de l'invention la capacité des anticorps à se lier préférentiellement à un antigène. Le caractère sélectif d'une telle liaison est classiquement appelé l'affinité de liaison, communément exprimé par la constante d'équilibre d'association. L'affinité de liaison peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes connues de l'homme du métier y compris les immunoblots, les analyses d'immunoprécipitation, les tests radioimmunologiques, les tests immunoenzymatiques (par exemple, ELISA), des titrages d'anticorps par immuno fluorescence et la microscopie. Préférentiellement, l'affinité d'un anticorps spécifique de DYRKIA sous sa forme peptidique présente une constante d'affinité comprise entre environ 103 M"1 et environ 1012 M_1 pour ladite forme.
Les techniques pour produire des anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques d'un polypeptide, en connaissant la séquence de ce polypeptide, sont bien connues de l'homme du métier et ne nécessitent pas d'être décrites en détail ici. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation, éventuellement multiple, d'un animal avec le polypeptide en question, puis récupération du sérum dudit animal et purification des anticorps recherchés, notamment par chromatographie d'affinité à l'aide du polypeptide utilisé pour l'immunisation. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la méthode des hybridomes décrite dans Ko hier et al. {Nature, 1975, 256 (5517): 495-497).
Un grand nombre d'anticorps spécifiques de la protéine DYRKIA, en particulier de la protéine DYRKIA humaine existent actuellement sur le marché. On peut citer en particulier l'anticorps anti-DYRKIA monoclonal de souris issu du clone 7D10 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin H- 143 sc-28899 produit par Santa Cruz, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin ab65220 produit par Abcam, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin PAB19417 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de mouton PAB9862 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin orb38099 produit par Byorbit, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin NBP1- 84031 produit par Novus, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin LS-B5890 produit par LSBio, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin 70R-1962 produit par Fitzgerald, l'anticorps anti-DYRKIA monoclonal de souris ab54944 produit par Abcam, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin ab53231 produit par Abcam, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de chèvre sc-12568 produit par SantaCruz, l'anticorps anti-DYRKIA polyclonal de lapin sc-28899 produit par SantaCruz, l'anticorps anti-DYRKIA monoclonal de lapin D30C10 produit par Cell Signaling Technologies.
II est bien connu de l'homme du métier qu'un anticorps spécifique d'une protéine n'est pas nécessairement utilisable dans toutes les techniques immuno logiques existantes. Ceci s'explique souvent par les conditions physico-chimiques des techniques utilisées, qui permettent ou non un bon accès de l'anticorps à l'antigène auquel il se lie. Ces conditions étant par nature multimodales, il est particulièrement délicat de déterminer a priori quelles sont les techniques dans lesquelles un anticorps donné sera utilisable, et permettra par exemple de déterminer le taux d'expression d'un marqueur biologique avec une précision suffisante.
Les Inventeurs ont découvert que certains anticorps spécifiques de DYRK1A permettent d'obtenir des résultats facilement interprétables, et sont particulièrement indiqués lorsque la détermination du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique comprend au moins un slot blot ou un western blot.
Selon un mode de réalisation encore préféré de l'invention, le test immuno logique, préférentiellement le slot blot ou le western blot, comprend l'utilisation d'au moins un anticorps spécifique de DYRK1A sous sa forme peptidique, ledit anticorps étant choisi parmi l'anticorps anti-DYRKIA monoclonal issu du clone 7D10 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRKIA monoclonal de lapin D30C10 produit par Cell Signaling Technologies.
Les techniques pour déterminer le niveau d'expression d'un polynucléotide sont bien connues de l'homme du métier et incluent notamment et de manière non-exhaustive le séquençage, l'hybridation et/ou l'amplification d'acide nucléique, en particulier d'ARNm. Par exemple, l'homme du métier pourra choisir de séquencer, d'hybrider ou d'amplifier l'acide nucléique présent dans l'échantillon de sang et/ou de sérum ou de plasma avec la séquence nucléique de référence du gène DYRK1 A, ou avec la séquence complémentaire d'un des transcrits du gène DYRK1A, en particulier les transcrits mentionnés plus haut. Cette détermination peut se faire à partir de la totalité ou une partie de l'ARNm compris dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum du sujet. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux polynucléotides, par exemple un polynucléotide et un olygonucléotide, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. L'hybridation de deux polynucléotides peut être totale (le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G), ou partielle (le complexe double brin obtenu comprend en outre des bases non liées à une base complémentaire). L'hybridation entre deux polynucléotides dépend des conditions opératoires. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des polynucléotides que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M.
Par sonde d'hybridation, on entend au sens de l'invention un polynucléotide, en particulier un oligonucléotide, comprenant de 5 à 100 acides nucléiques, notamment de 10 à 35 acides nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec DYRK1A sous sa forme nucléotidique. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection.
L'homme du métier connaît aussi très bien les différentes méthodes d'amplification d'acides nucléiques, telles que par exemple les méthodes de Réaction de Polymérisation en Chaîne (« Polymerase Chain Reaction », PCR), simple, compétitive, en temps réel, la méthode d'amplification du signal bDNA (« branched DNA-based signal amplification assays »), ou encore par la technologie d'amplification isotherme de l'acide nucléique (« nucleic acid séquence based amplification assays », NASBA et « Transcription Mediated Amplification », TMA ), qu'il n'est donc pas nécessaire de décrire ici.
Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification un polynucléotide, en particulier un oligonucléotide, comprenant de 5 à 100 acides nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 acides nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction enzymatique d'amplification. Par réaction enzymatique d'amplification, on entend un processus générant de multiples copies d'un polynucléotide cible par l'action d'au moins une enzyme.
Il est bien connu de l'homme du métier que ces méthodes peuvent permettre un résultat qualitatif ou un résultat quantitatif selon leur mise en œuvre. Dans l'optique d'une utilisation quantitative de ces tests, l'homme du métier pourra, le cas échéant, utiliser des dilutions sérielles de l'échantillon et d'un ou plusieurs contrôles appropriés, et pourra déterminer le niveau d'expression du polypeptide ou du polynucléotide à l'aide d'une courbe d'étalonnage.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'analyse de DYR 1A comprend l'analyse de la séquence et/ou de la régulation du gène DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
L'analyse de la séquence et/ou de la régulation du gène DYR 1A pourra être réalisée selon toute technique bien connue de l'homme du métier permettant l'analyse de la séquence et/ou de la régulation d'un gène. De préférence, l'homme du métier choisira des techniques visant à mettre en évidence des modifications ou altérations de l'ADN au niveau du gène DYR 1A (référence NCBI : NG 009366.1), comme par exemple la détection directe de mutations, la mise en évidence d'altérations dans le profil de méthylation des loci d'intérêt, ou tout autre procédé de détermination d'altérations de l'ADN dans un échantillon.
Les mutations peuvent inclure des substitutions ponctuelles d'un nucléotide par un autre, des délétions de un ou plusieurs nucléotides et des insertions de un ou plusieurs nucléotides. Les mutations peuvent être situées dans la partie codante du gène DYRK1A, ou dans les parties 5' et 3' non codantes, comme par exemple la région promotrice ou la région terminatrice de transcription.
Les stratégies de mise en évidence de mutations s'appuient sur les techniques de la biologie moléculaire et comprennent des étapes d'extraction d'ADN, d'amplification par PCR ou autre technique d'amplification, d'hybridation et/ou de séquençage. Les mutations peuvent ensuite être identifiées par la différence de taille entre le fragment de référence attendu et le fragment muté, par exemple dans le cas de délétions ou d'additions, ou par la mise en évidence de modification de la séquence du fragment amplifié par rapport à une séquence de référence dans le cas de substitutions. Comme indiqué précédemment, les altérations de l'ADN peuvent aussi correspondre à une modification du profil de méthylation du gène DYRKIA. La modification du profil de méthylation peut correspondre à une hypométhylation (diminution du nombre de méthylations) ou à une hyperméthylation (augmentation du nombre de méthylations). Les motifs altérés peuvent être situés dans la partie codant du gène DYRKIA, ou dans les parties 5' et 3' non codantes, comme la région promotrice ou la région terminatrice de transcription.
L'analyse de la méthylation de 1ADN peut être effectuée en utilisant des techniques basées sur la PCR qualitative et/ou quantitative comme la MSP {methylation-specific PCR), le séquençage bisulfite, la digestion par une enzyme de restriction sensible aux méthylations couplée avec la PCR, COBRA (combined bisulfite restriction analysis) et Ms-SNuPE (méthylation- sensitive single nucleotide primer extension).
Les Inventeurs ont en outre découvert que le niveau d'expression de DYRKIA dans le sérum des sujets atteints de la maladie d'Alzheimer est signifîcativement plus faible que celui des sujets non atteints, appariés en âge. Il est ainsi possible à l'homme du métier d'évaluer simplement, en utilisant par exemple un niveau d'expression de DYRKIA de référence, le risque pour le sujet testé de développer la maladie d'Alzheimer. Ainsi, selon l'invention, le sujet sera dit à risque de développer la maladie d'Alzheimer lorsque le niveau d'expression de DYRKIA dudit sujet sera inférieur au niveau d'expression de DYRKIA de référence.
Par niveau d'expression de DYRKIA de référence, on entend au sens de la présente invention le niveau d'expression de DYRKIA représentant la valeur moyenne du niveau d'expression dudit marqueur chez un ou plusieurs sujets sains. L'homme du métier pourra sans difficultés établir un tel niveau d'expression de DYRKIA de référence à partir par exemple des niveaux d'expression de DYRKIA dans le sérum d'un ou plusieurs sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer, préférentiellement appariés en âge au sujet testé, en utilisant de préférence la même technique de détermination dudit taux d'expression que celle utilisée pour le sujet testé, afin de limiter les biais statistiques. Par apparié en âge, on entend au sens de l'invention des sujets humains dont l'âge est égal au à l'âge du sujet testé à plus ou moins 5 ans, la date anniversaire du sujet servant de référence. Préférentiellement, le niveau d'expression de DYRKIA de référence selon l'invention est établi à partir des niveaux d'expression de DYRKIA dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 5, 10 ou 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer. Encore préférentiellement, le niveau d'expression de DYRKIA de référence selon l'invention est établi à partir des niveaux d'expression de DYRKIA dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer.
Par « inférieur à », on entend au sens de la présente invention « strictement inférieur à ».
Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRKIA est inférieur à un niveau d'expression de DYRKIA de référence. Préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRKIA est inférieur de 35%, 40%, 50%>, 55% à un niveau d'expression de DYRKIA de référence. Par « ledit niveau d'expression de DYRKIA est inférieur de 35% à un niveau d'expression de DYRKIA de référence », on entend que le ratio entre : i) la valeur du niveau d'expression de DYRKIA de référence moins la valeur du niveau d'expression de DYRKIA, et ii) la valeur du niveau d'expression de DYRKIA de référence, est supérieur ou égal à 35 %.
L'invention a aussi pour objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
a) la détermination du niveau d'expression DYRKIA dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet ; et
b) la conclusion que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRKIA est inférieur à un niveau d'expression de DYRKIA de référence.
Les Inventeurs ont en outre établi des valeurs de références pouvant s'avérer très utiles dans la mise en œuvre de l'invention. Ainsi, les Inventeurs ont pu établir des niveaux d'expression de DYRKIA de référence, en particulier pour ce qui est du niveau d'expression de DYRKIA sous sa forme peptidique, en deçà desquelles le risque pour le sujet de développer la maladie d'Alzheimer est important Préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRKIA, en particulier le niveau d'expression de DYRKIA sous sa forme peptidique, est inférieur de 35% au niveau d'expression de DYRKIA de référence. Plus préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRKIA, en particulier le niveau d'expression de DYRKIA sous sa forme peptidique, est inférieur de 35% au niveau d'expression de DYRKIA de référence, ledit niveau d'expression de DYRKIA de référence étant établi à partir des niveaux d'expression de DYRKIA dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer.
La méthode de l'invention peut en outre être améliorée par la détection d'un marqueur biologique additionnel autre que DYRKIA. La combinaison de plusieurs marqueurs biologiques, dont DYRKIA, permet d'améliorer la spécificité et/ou la sensibilité de la méthode de diagnostic de la maladie d'Alzheimer. De façon générale, la sensibilité d'un test mesure sa capacité à donner un résultat positif lorsqu'une hypothèse est vraie, tandis que la spécificité mesure la capacité d'un test à donner un résultat négatif lorsque l'hypothèse est fausse.
Selon la présente invention, un marqueur biologique (ci-après « marqueur ») est une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmaco logiques à une intervention thérapeutique. Un marqueur désigne donc toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, un marqueur peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C activée en tant que marqueur d'une infection). Selon certains modes de réalisation de la présente invention un marqueur est un polypeptide ou un polynucléotide dont les changements d'expression, en particulier de niveau d'expression, ou d'état, corrèlent avec le risque ou la progression d'une maladie.
Les Inventeurs ont découvert en particulier que les marqueurs sériques Homocystéine, BDNF (« Brain-Derived Neurotrophic Factor ») et APOD (« apolipoprotéine D ») corrèlent aussi avec un risque de développer la maladie d'Alzheimer, et peuvent à ce titre être avantageusement utilisés pour augmenter la spécificité et/ou sensibilité de la méthode de l'invention. L'Homocystéine est un acide aminé soufré non protéinogène résultant du catabolisme de la méthionine. Cette molécule est une substance pro -inflammatoire dont le taux plasmatique est anormalement élevé dans le cas d'atrophie cérébrale, un des symptômes de la maladie d'Alzheimer (Smith et al, PLoS One, 2010 Sep 8;5(9):el2244). Le dosage de l'Homocystéine dans le sang et/ou plasma et/ou le sérum de sujets humains est couramment utilisé en clinique et bien connu de l'homme du métier, et ne nécessite pas d'être décrit ici L'homme du métier pourra s'il le souhaite se référer à Fortin et al. {Clin Biochem. ; 1995; (2): 155-62) pour une description complète des méthodes utilisables.
Le marqueur BDNF fait partie de la famille des facteurs de croissance neurotrophiques qui sont liés aux NGF ("Nerve Growth Factor"). Les facteurs neurotrophiques sont présents dans le cerveau et la périphérie. Le gène BDNF (référence NCBI: NG_011794.1, aussi connu sous les noms ANON2 et BULN2), code pour la protéine BDNF. La protéine BDNF agit sur certains neurones du système nerveux central et sur le système nerveux périphérique, contribuant à la survie des neurones existants, et stimulant la croissance et la différenciation de nouveaux neurones et de synapses. Des analyses post-mortem ont montré des niveaux d'expression faibles du gène codant pour le BDNF dans les tissus du cerveau des personnes atteintes de la maladie dAlzheimer. La protéine BDNF est retrouvée dans le sang, le sérum et le plasma des sujets humains. Le dosage, en particulier sérique, de la protéine BDNF peut facilement être réalisé selon la technique décrite dans Undine et al. (Neuropsychopharmacology ;2005 ; 30, 1148-1153).
Le marqueur APOD (référence Ensemble : ENSG00000189058) est codé par un gène localisé sur le chromosome 3 chez l'Homme. Ce gène code pour un transcrit (référence NCBI : ΝΜ 001647.3), lui-même traduit en un peptide dit précurseur de la protéine Apo D (référence NCBI : ΝΡ 001638.1). Apo D est un composant de lipoprotéines de haute densité dont la séquence présente peu d'identité avec les séquences d'autres apolipoprotéines (dont Γ apo lipoprotéine E). Apo D est étroitement associée à la lécithine-cholestérol acyltransférase, une enzyme impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. Le marqueur APOD a été corrélé avec le syndrome d'insensibilité aux androgènes. Les Inventeurs ont par ailleurs montré qu'une diminution du taux d'expression du marqueur APOD, en particulier dans le plasma et le sérum d'un sujet humain, corrèle avec le risque de développer la maladie d'Alzheimer. Apo D en particulier est retrouvée dans le sérum et le plasma des sujets humains et peut facilement être dosée par toute technique immunologique, en particulier par ELISA. Des tests ELISA sont disponibles, tel que par exemple le test «Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD) » commercialisé par ShangHai BlueGene Biotech CO.
Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprend en outre l'analyse d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention consiste en l'analyse
- de DYRKIA;
- de DYPvKl A et du marqueur Homocystéine ;
- de DYRKIA et du marqueur BDNF;
- de DYRKIA et du marqueur APOD;
- de DYRKIA, du marqueur Homocystéine et du marqueur BDNF;
- de DYRKIA, du marqueur Homocystéine et du marqueur APOD;
- de DYRKIA, du marqueur BDNF et du marqueur APOD; ou,
- de DYRKIA, du marqueur Homocystéine, du marqueur BDNF et du marqueur APOD ;
dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse d'un ou des marqueurs autres que DYRKIA comprend l'analyse de la séquence, et/ou de la régulation, et/ou du niveau d'expression du gène dudit ou desdits marqueurs. Dans le cas particulier du marqueur Homocystéine, l'analyse comprend l'analyse du taux du marqueur Homocystéine.
Préférentiellement, l'analyse du marqueur BDNF et /ou APOD comprend l'analyse du niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD.
Par « niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD», on entend au sens de l'invention la quantité dudit ou desdits marqueurs sous sa forme peptidique et/ou sous sa forme nucléotidique.
L'homme du métier pourra choisir la méthode la plus appropriée pour déterminer les taux et niveaux d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD . En particulier, il sera évident pour l'homme du métier qu'il est possible de déterminer le niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD sous sa forme peptidique, ou sous sa forme nucléotidique.
Par marqueur BDNF sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique de la protéine BDNF de référence, le proBDNF (référence swissprot: P23560.1), ses fragments et/ou ses variants. Par variants de la protéine BDNF, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente avantageusement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95%, encore plus préférentiellement au moins 98% d'identité, avec la séquence peptidique de la protéine BDNF.
Par marqueur BDNF sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence d'un des transcrits du gène BDNF (référence NCBI du gène BDNF: NG_011794.1), de leurs fragments et/ou de leurs variants. Au sens de la présente invention, les transcrits du gène BDNF comprennent le transcrit 1 (référence NCBI :NM_007540.4), le transcrit 2 (référence NCBI :NM_001048139.1), 1 (référence NCBI :NM_001048141.1).
Par marqueur APOD sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique du précurseur de la protéine Apo D (référence NCBI : NP_001638.1), ses fragments et/ou ses variants. Par variants du précurseur de la protéine Apo D, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente avantageusement au moins 90%> d'identité, plus préférentiellement au moins 95%>, encore plus préférentiellement au moins 98%> d'identité, avec la séquence peptidique du précurseur de la protéine Apo D.
Par marqueur APOD sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence du transcrit du gène APOD, de ses fragments et/ou de ses variants. Au sens de la présente invention, le transcrit du gène APOD est le polynucléotide de référence NCBI : ΝΜ 001647.3.
L'homme du métier comprendra que les techniques décrites plus haut pour la détermination du niveau d'expression des différentes formes, peptidiques ou nucléotidiques, de DYR 1A, s'appliquent tout à fait aux marqueurs BDNF et APOD.
Selon un mode préféré de l'invention, on détermine le taux du marqueur
Homocystéine par HPLC. Selon un mode préféré de l'invention, on détermine le niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD sous sa forme peptidique.
Pour déterminer le niveau d'expression du marqueur BDNF sous sa forme peptidique, l'homme du métier pourra par exemple utiliser tout anticorps spécifique de BDNF. Un certain nombre d'anticorps spécifiques de cette protéine sont connus, tels que ceux utilisés dans les méthodes EMax, Immunoassay (ELISA E-Max, Promega, Madison, WI).
Pour déterminer le niveau d'expression du marqueur APOD sous sa forme peptidique, l'homme du métier pourra par exemple utiliser tout anticorps spécifique de APOD. Un certain nombre d'anticorps spécifiques de cette protéine sont connus, tels que par exemple ceux utilisés dans le kit «Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD) » commercialisé par ShangHai BlueGene Biotech CO.
L'invention peut par exemple être mise en œuvre pour sélectionner les sujets pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer, et/ou pouvant bénéficier d'une surveillance médicale. Par exemple, il est possible d'utiliser l'invention pour sélectionner les sujets humains pouvant participer à une étude clinique, en particulier sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, de préférence les traitements curatifs ou palliatifs.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode pour sélectionner un sujet humain pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, comprenant :
a) le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain selon la méthode de l'invention, et ;
b) si ledit sujet a la maladie d'Alzheimer, la sélection dudit sujet comme étant un sujet pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer.
L'invention est en outre particulièrement utile pour suivre l'évolution des sujets, en particuliers atteints de la maladie d'Alzheimer ou à risque de développer celle-ci. La rapidité de l'évolution de la maladie d'Alzheimer est un signe de sa gravité, et l'invention peut donc être utilisée par le praticien pour choisir au mieux le traitement à administrer au sujet, en fonction de ces paramètres.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode de détermination de la progression de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de :
a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYR 1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet à un temps tl ;
b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet à un temps t2;
c) conclusion que la maladie d'Alzheimer a progressé chez ledit sujet si ledit deuxième niveau d'expression de DYRK1A de l'étape b) est inférieur audit deuxième niveau d'expression de DYR 1A de l'étape a).
Il est bien évident que l'homme du métier pourra au mieux choisir le laps de temps séparant le temps tl et le temps t2, et donc séparant les étapes a) et b), au vu de ses connaissances de la maladie d'Alzheimer, ainsi que de l'âge du patient, éventuellement d'autres paramètres qu'il jugera pertinents.
L'invention pourra aussi être utilisée au cours du traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, afin d'évaluer l'efficacité des médicaments administrés, permettant ainsi d'adapter ceux-ci le cas échéant.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de :
a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYR 1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet avant l'administration dudit traitement ;
b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet après un temps T suivant la première administration dudit traitement ; c) conclusion que ledit traitement est efficace chez ledit sujet si ledit niveau d'expression de DYR 1A de l'étape b) est supérieur audit niveau d'expression de DYR 1A de l'étape a). L'homme du métier déterminera là encore le temps T séparant l'étape a) de l'étape b), au vu de ses connaissances de la maladie d'Alzheimer, ainsi que de l'âge du patient, éventuellement d'autres paramètres qu'il jugera pertinents.
L'invention a aussi pour objet un kit pour la mise en œuvre de l'une des méthodes de l'invention, comprenant au moins un moyen nécessaire à la détermination du niveau d'expression de DYRK1A, préférentiellement du niveau d'expression de DYR 1A sous sa forme peptidique, dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'un sujet humain, et avantageusement une notice d'utilisation.
Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression de DYPv IA on citera par exemple les anticorps spécifiques de DYRK1A, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier à DYRK1A sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit de l'invention comprend en outre au moins un moyen nécessaire à la détermination du taux du marqueur Homocystéine, du niveau d'expression du marqueur BDNF et/ou du niveau d'expression du marqueur APOD.
Parmi les moyens nécessaires à la détermination du taux du marqueur Homocystéine on citera par exemple la tri-N-butylphosphine et le sel d'ammonium de l'acide 7-fluorobenzoflurazone-4-sulfonique.
Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression de du marqueur BDNF on citera par exemple les anticorps spécifiques du marqueur BDNF, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier au marqueur BDNF sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment.
Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression du marqueur APOD on citera par exemple les anticorps spécifiques du marqueur APOD, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier au marqueur APOD sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment.
Selon un mode de réalisation particulier, les kits de l'invention comprennent au moins deux amorces oligonucléotidiques encadrant le marqueur cible sous sa forme nucléotidique, et s'hybridant avec des brins opposés du marqueur cible sous sa forme nucléotidique. Les exemples suivants sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs.
Les participants
Les participants de l'étude dont les résultats sont présentés ci-dessous comprennent 26 patients atteints de la maladie d'Alzheimer (pour lesquels la pathologie a été confirmée bio logiquement), parmi lesquels 1 1 sujets présentaient des signes de déficience cognitive légère (MCI -AD, CDR = 0,5 ), et 15 présentaient des signes de démence (AD, CDR > 1 )
La preuve biologique de la maladie d'Alzheimer consistait en un profil de biomarqueur « CSF AD » et / ou la rétention significative d'amyloïde bêta sur la tomographie par émission de positons [TEP] au Carbonne 11 (nC) - étiqueté Pittsburgh [ nC - PiB ].
Le profil de biomarqueur « CSF AD » a été défini comme le rapport P- Tau/AB42 supérieur à 0,21 , car il distingue AD de contrôles avec une grande sensibilité et une spécificité de 19 .
La rétention significative d'amyloïde a été définie par un indice global supérieur à 1,4 .
21 patients ont eu une ponction lombaire , 17 patients une tomographie par émission de positons PET - PiB ( 12 patients ont eu à la fois ponction lombaire et PET - PiB) .
25 sujets sains ont été sélectionnés selon les critères suivants :
( 1 ) un score à l'examen Mini - Mental State supérieur à 27 points ( MMSE ) > 27) accompagnés de tests neuropsychologiques normaux et
( 2 ) un indice global de rétention nC - PiB inférieur à 1,4 lorsque une tomographie par émission de positons avait été pratiquée et que les données PET - PiB étaient disponibles ( n = 13) .
Les sujets qui ont présenté ce qui suit: ( 1 ) des signes cliniques ou neuro- imagerie de lésions focales, ( 2 ) des lésions vasculaires corticales ou sous-corticales graves, ou ( 3 ) une grave dépression, ont été exclus. Exemple de méthode de dosage de DYR 1 A
Le plasma est composé d'un ensemble de protéines très informatives d'un point de vue médical. En effet, la majorité des cellules communiquent avec le plasma de façon directe ou à travers le fluide extracellulaire ou cérébrospinal. Ces protéines peuvent donc avoir un potentiel diagnostique.
La purification du plasma consiste à enlever une protéine très dominante dans ce tissu : l'albumine. On utilise le kit Aurum affî-gel blue mini kits and columns (Bio-rad). Afin de ne pas trop diluer le plasma dans la solution tampon, on le fait passer directement dans les colonnes sans ajout de ce dernier. Avant toute analyse de la quantité de protéine DYR 1A par Slot Blot, il est nécessaire de déterminer la quantité de protéines dans les échantillons par la méthode de Bradford. Cette méthode consiste en un dosage colorimétrique basé sur la variation de l'absorbance. Il repose sur le changement de couleur du réactif de Bradford (bleu de coomasie) initialement bleu mesurable à partir d'un spectrophotomètre.
Le bleu de coomassie est un intercalant des acides aminés aromatiques
(tryptophane, tyrosine et phénylalanine) présent dans les protéines à doser, l'absorbance est proportionnelle à la quantité de protéines. En effet, plus il y a d'acides aminés liés à l'intercalant, plus il y a de protéines présentes dans l'échantillon et plus la densité de coloration du bleu augmente, soit l'absorbance. Cette méthode reste cependant la moins sensible aux interférences d'agents présents dans les échantillons, contrairement aux autres techniques de dosage de protéines telles que la méthode du biuret, celle de Kjeldahl, ou encore la spectroscopie par U.V.
On introduit Ι μΙ^ de l'extrait de protéines dans 500μΕ de réactif de Bradford (Coomassie (Bradford) Protein Assay) dilué au ½ dans de l'eau. On mesure l'absorbance des échantillons à une longueur d'onde de 595nm contre un « blanc » préalablement préparé à partir de la même solution de Bradford dilué sans ajout de protéines. La quantité en protéines des échantillons est ainsi calculée par rapport à une gamme étalon préalablement réalisée avec de l'Albumine Bovine Sérique (ou BSA) de 1 à 6 μg.
Le niveau d'expression de la protéine DYRK1 A, tout comme celui de la protéine
DYRKIB, est déterminé par la technique de Slot Blot. Cette technique est utilisée pour la quantification de protéines dans un mélange biologique. Le Slot Blot à détection par chimio luminescence a pour principe de transférer sur une membrane de nitrocellulose des protéines d'un liquide biologique, en vue de tester leur réactivité à des anticorps vis- à-vis des protéines spécifiques. Elles seront alors révélées à l'aide d'un détecteur couplé à l'anticorps secondaire qui peut être un fluorochrome ou une enzyme, après incubation avec un anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt puis avec un anticorps secondaire reconnaissant un épitope de l'anticorps primaire. Le marquage, qui est alors un élément sensible à un substrat, émettra de la lumière restituée en image numérique par une caméra après exposition.
Cette technique est une simplification de la méthode de Western Blot. En effet, le mélange contenant la protéine à analyser est appliqué directement sur la membrane et donc la partie du Western Blot comprenant l'électrophorèse n'est pas effectué. Pour cela, elle nécessite un anticorps primaire très spécifique.
On prépare, d'après le dosage des protéines au Bradford, 2(^g de protéines totales par dépôt d'échantillon dans du TS (150Mm NaCl, lOmM Tris), que l'on dénature 10 minutes à 95°C à l'aide d'un volume égal de Laemmli 2X sans bleu, ajouté aux volumes des préparations finales.
Les échantillons sont alors déposés sur une membrane de nitrocellulose (Whatman® Protrano® Nitrocellulose Transfer Membrane) en utilisant un Slot Blot : On dépose sur le support à membrane un papier Whatman imbibé de tampon TS, que l'on recouvre de la membrane de nitrocellulose imbibée également de tampon TS. On fixe alors le support supérieur du Slot Blot au support de membrane qui est relié à une pompe à vide. Après un premier lavage de tous les puits disposés sur le support supérieur avec 200μ1 de TS, les échantillons peuvent être déposés (50μΕ par dépôt). Un deuxième lavage avec 200μί de TS est ensuite effectué. Puis, la membrane est récupérée et saturée pendant 1 heure à température ambiante, dans du TST-Lait à 10% (TST : 150mM NaCl, lOMm Tris, 0.1% Tween), sous agitation. Il s'en suit une incubation d'une nuit à 4°C, sous agitation, avec l'anticorps primaire Anti- DYRKIA (anti-DYRKIA antibody abnova Corporation réf H00001859-M01) dilué au 250ème, toujours dans du TST contenant 10%> de lait.
Après trois lavages de 5 minutes avec du TST, la membrane est incubée pendant
1 heure à température ambiante sous agitation avec l'anticorps secondaire correspondant : Γ Anti-Souris dilué au 40 OOOème dans du TST-Lait 10%. Enfin, la membrane sera lavée trois fois 5 minutes avec du TST. On révélera à l'aide d'un imageur de chimio luminescence, le LAS-3000, après une incubation de 5 minutes à l'obscurité avec du Luminol. Puis, on colore la membrane au rouge Ponceau afin de mettre en évidence les protéines.
Cette méthode de détection est considérée comme l'une des plus sensibles et spécifiques jusqu'alors établies. La mesure du niveau d'expression de la protéine DYRK1A est alors réalisé par analyse densitométrique, ce qui consiste à évaluer l'intensité du dépôt incubé au Luminol avec le logiciel UnScan-it par rapport aux protéines colorées au rouge Ponceau qui permet de quantifier les protéines totales présentes sur la membrane.
DYRK1 A dans le sérum de patients
La méthode de Slot blot décrite ci-dessus a été appliquée au dosage de DYR 1 A dans le sérum d'individus contrôles (CTRL) et de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA). On observe une diminution significative du niveau de DYR 1A dans le sérum des patients (Figure 1).
Mesure de biomarqueurs dans le liquide céphalo-rachidien (LCR).
Les échantillons de LCR ont été prélevés par ponction lombaire. Les niveaux de protéine tau totale, protéine tau phosphorylée sur la thréonine 181 (p-tau), et protéine Abêta (Αβ42) ont été mesurés par une méthode de dosage immunologique comprenant un double sandwich-enzymatique (Innogenetics, Gand, Belgique) (ELISA) tel que décrit dans de Souza et al. (Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry; 82(3): 240-246; 2011). On observe une corrélation positive entre le niveau de chacun de ces marqueurs dans le LCR et le niveau de DYR 1 A dans le plasma (Figure 2).
Exemple de mesure du niveau de l'Homocystéine
Méthode
Le dosage de l'homocystéine plasmatique totale est réalisé à partir d'un tube de sang veineux prélevé sur citrate de sodium, conservé dans la glace entre le moment du prélèvement et celui de la centrifugation du plasma, à 3000rpm à 4°C. On utilise la technique chromatographique liquide haute performance (HPLC) utilisant une détection fiuorimétrique : adaptation de la technique précédemment publiée par Araki et al. (J Chromatogr. 1987 Nov 27;422:43-52 )et modifiée par Ubbink et al. (J Chromatogr, 1991 ; 565: 441-446) et Fortin et al.(J Chromatogr, 1991; 565 : 441-446) . Les composés plasmatiques thiolés sont réduits ou libérés des protéines plasmatiques avec la tri-n- butylphosphine. Ils sont ensuite dérivés avec un agent fiuorigène spécifique des thiols, le 7-fiuorobenzofurazone-4-sulfonic acid ammonium sait (SBD-F), puis séparés par HPLC en phase inverse. Les échantillons sont incubés à +4°C pendant 30 min, et 300 μΐ d'acide perchlorique (PC A 0.6 M + EDTA 1 mM) sont ajoutés pour précipiter les protéines. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 3000 rpm pendant 15 min à +4°C. 100 μΐ de surnageant sont mélangés avec 20 μΐ de NaOH (1.55 M), 250 μΐ de tétraborate de potassium (0.125 M), pH 9.5, contenant 4 mM d'EDTA, et 100 μΐ de SBD-F (1 g/1 dans le tétraborate de potassium). Ils sont incubés à +60°C pendant lh. Après refroidissement, 20 μΐ d'échantillon sont injectés dans le système HPLC, soit directement, soit via un passeur automatique d'échantillons. L'Homocystéine est quantifiée par fluorimétrie.
Le système HPLC utilisé comprend un programmateur « Programmable Solvent module 126, System Gold » (Beckman) contrôlant une pompe « Programmable Solvent module 116, System Gold » (Beckman). Les échantillons sont introduits dans la chaîne HPLC, soit directement par une valve d'injection Rheodyne adaptée à une boucle d'injection de 20 μΐ, soit via un passeur automatique d'échantillons « 717 plus autosampler » (Waters). La séparation est réalisée à température ambiante grâce à une colonne analytique en phase inverse Lichrosorb (RP18, 250 x 4 mm, granulométrie 7 μιη) commercialisée par Merck. Les intensités de fluorescence sont mesurées avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 385 et 515 nm respectivement, en utilisant un spectrophotomètre de fluorescence « Waters 474 scanning fluorescence detector » (Waters).
Le système de détection est raccordé à un intégrateur «Waters 746 data module » (Waters) permettant de quantifier l'aire des pics.
Résultats
Le dosage par HPLC permet d'observer une augmentation du niveau de l'homocystéine chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Figure 3).
Exemple de mesure du niveau de BDNF Méthode
Le dosage du BDNF est réalisé par ELISA avec le « kit ELISA E-Max » (Promega) sur 100 de plasma dilué au demi dans du tampon fourni dans le kit. Les échantillons sont incubés 2 h sur une plaque 96 puits préalablement tapissée par l'anticorps monoclonal anti-BDNF qui capture le BDNF mature et soluble présent dans les plasmas. Après 5 lavages au TBST (NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, Tween®20 0,05%; pH 7,6), la plaque est incubée 2 h en présence de l'anticorps polyclonal anti- BDNF humain. L'anticorps non fixé est éliminé par lavage des puits. La quantité de BDNF humain est détectée en utilisant un anticorps conjugué à une peroxydase et dirigé contre l'anticorps polyclonal humain.
L'activité peroxydase est mesurée par l'addition d'un substrat chromogénique. Après 20 minutes d'incubation, la réaction est arrêtée par acidification et l'absorbance est mesurée à 450 nm, qui est proportionnelle à la quantité de BDNF présente dans les échantillons. La quantité de BDNF est calculée à partir des résultats d'une gamme étalon réalisée sur une solution BDNF standard dont la concentration initiale est connue.
Résultats
On observe une diminution du niveau de BDNF (Brain derived neurotrophic factor), mesuré par ELISA, chez les patients atteints de la maladie d' Alzheimer (Figure 3).
Exemple de mesure du niveau de APOD
Méthode
Le dosage d'APOD est réalisé par ELISA avec le « kit ELISA Bluegene » sur 50 de plasma dilué au demi dans du tampon fourni dans le kit. Les échantillons sont incubés 1 h sur une plaque 96 puits prétapissée avec un monoclonal anti APOD en présence de l'anticorps conjugué APOD-HRP. Après 5 lavages au TBST (NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM, Tween®20 0,05%>; pH 7,6. l'activité peroxydase est mesurée par l'addition d'un substrat chromogénique. Après 20 minutes d'incubation, la réaction est arrêtée par acidification et l'absorbance est mesurée à 450 nm, Elle est proportionnelle à la quantité d'APOD présente dans les échantillons. La quantité d'APOD est calculée à partir des résultats d'une gamme étalon réalisée sur une solution APOD standard dont la concentration initiale est connue. Résultats
Pour l'apolipoprotein D (protéine APOD) la corrélation avec la quantité de DYRKIA est positive et on observe une diminution de la quantité d'ApoD chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Figure 3).
DYRKIA dans les lignées lymphoblastoïdes de patients
Méthodes
Les lignées lymphoblastoïdes sont issues de cultures primaires de lymphocytes B et immortalisées par le virus EBV. Elles ont été maintenues en milieu complet OptiMEM®-GlutaMAX® (GIBCO InvitrogenTM), additionné de 5 % de sérum de veau foetal et de 1 % d'un mélange d'antibiotiques (Pénicilline 100 U.mL-1 et streptomycine 100 μg.mL-l). La lyse des cellules est réalisée dans un tampon de lyse contenant du Tris 50 mM pH8, NaCl 150 mM, IGEPAL 1 % (SIGMA), SDS 0,1 % et des inhibiteurs de protéases (E64 5 μg.mL-l ; Leuleptine 2,5 μg.mL-l ; Pefabloc ImM ; SIGMA). Après centrifugation à 15000 g, le surnageant contenant les protéines est récupéré et la quantité de protéines est déterminée par la technique de Bradford. La quantité de protéine DYRKIA est mesurée par la technique de slot blot décrite plus haut. Résultats
Des mesures du niveau relatif de la protéine DYRKIA ont été effectuées sur des protéines préparées à partir de lignées de lymphoblastoïdes établies à partir de lymphocytes provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA): on retrouve un abaissement significatif de l'expression de DYRKIA dans les lymphoblastoïdes de patients (Figure 4).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYR 1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'analyse de DYR 1 A comprend la détermination du niveau d'expression de DYR 1 A.
3. Méthode de diagnostic selon la revendication 2, caractérisée en ce que le niveau d'expression de DYR 1A est déterminé par un test immunologique, préférentiellement le test ELISA, le slot blot ou le western blot, où lequel test immunologique comprend l'utilisation d'au moins un anticorps spécifique de DYR 1A sous sa forme peptidique.
4. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYR 1 A est inférieur à un niveau d'expression de DYR 1 A de référence.
5. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre l'analyse d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
6. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle consiste en l'analyse :
- de DYR 1 A;
- de DYR 1 A et du marqueur Homocystéine ;
- de DYR 1A et du marqueur BDNF;
- de DYR 1A et du marqueur APOD;
- de DYR 1 A, du marqueur Homocystéine et du marqueur BDNF;
- de DYR 1 A, du marqueur Homocystéine et du marqueur APOD;
- de DYR 1 A, du marqueur BDNF et du marqueur APOD; ou, - de DYR 1A, du marqueur Homocystéine, du marqueur BDNF et du marqueur APOD ;
dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
7. Méthode pour sélectionner un sujet humain pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, comprenant :
a) le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain selon la méthode de l'une des revendications 1 à 6, et ;
b) si ledit sujet a la maladie d'Alzheimer, la sélection dudit sujet comme étant un sujet pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer.
8. Méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de :
a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYR 1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet avant l'administration dudit traitement ;
b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet après un temps T suivant la première administration dudit traitement ; c) conclusion que ledit traitement est efficace chez ledit sujet si ledit niveau d'expression de DYR 1A de l'étape b) est supérieur audit niveau d'expression de DYR 1A de l'étape a).
9. Kit pour la mise en œuvre de la méthode de l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen nécessaire à la détermination du niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'un sujet humain.
10. Kit selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un moyen nécessaire à la détermination du taux du marqueur Homocystéine, du niveau d'expression du marqueur BDNF et/ou du niveau d'expression du marqueur APOD.
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