FR3002044A1 - Marqueur dyrk1a pour la maladie d'alzheimer - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le domaine des méthodes de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez le sujet humain. L'invention a pour premier objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. Préférentiellement, l'analyse de DYRK1A comprend la détermination du niveau d'expression de DYRK1A. Selon un mode de réalisation, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur à un niveau d'expression de DYRK1A de référence. Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprend en outre la détermination du niveau d'expression d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.

Description

L'invention concerne le domaine des méthodes de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez le sujet humain.

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative (perte progressive de neurones) incurable du tissu cérébral qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions mentales et notamment de la mémoire. C'est la forme la plus fréquente de démence chez l'Homme. Elle est la cause principale de dépendance lourde du sujet âgé et le motif principal d'entrée en institution spécialisée. L'évolution se fait sur plusieurs années avec l'apparition d'une dépendance progressive avec retentissement sur les activités de la vie quotidienne. La maladie d'Alzheimer touchait environ 26 millions de personnes dans le monde en 2005 et pourrait en toucher quatre fois plus en 2050, ce qui équivaudrait alors à 1 personne sur 85. Dans les pays développés, la maladie d'Alzheimer est l'une des pathologies les plus coûteuses pour la société. La majorité des cas de maladie d'Alzheimer sont dits sporadiques, ils ne sont pas héréditaires, bien que la présence de certains gènes soit un facteur de risque. L'anémie, le diabète, des troubles de la glande thyroïde, les carences en vitamines B12 et folates, sont connus pour être des facteurs aggravants de la maladie. Actuellement, le diagnostic de la maladie d'Alzheimer repose essentiellement sur l'association de signes cliniques, de résultats de tests neuropsychologiques et de signes radiologiques. On estime que le diagnostic clinique de la maladie d'Alzheimer n'est formel qu'après examen anatomopathologique du cerveau post-mortem. Les tests neuropsychologiques permettent de préciser l'origine et la nature des troubles. Ils sont nécessairement réalisés au cours d'une consultation. En premier lieu est pratiqué le « Mini Mental State Examination » (MMSE), de Folstein. Ce test, conçu pour un dépistage rapide des déficits cognitifs, explore les fonctions cognitives du sujet.

Cet examen permet une première évaluation de la mémoire des faits récents, du langage, et des tâches complexes, mais reste cependant insuffisant pour établir un diagnostic différentiel ou déterminer des facteurs aggravants de la maladie d'Alzheimer. Il est ainsi nécessaire de le compléter par des examens biologiques du sang et des urines du sujet ainsi que par l'imagerie, en particulier l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et éventuellement la scintigraphie cérébrale par tomographie d'émission monophotonique. L'imagerie permet de révéler une éventuelle atrophie du lobe temporal interne et notamment de l'hippocampe, critère de diagnostic précoce d'Alzheimer, et éventuellement de déceler des séquelles d'accidents vasculaires, qui peuvent être à l'origine des difficultés cognitives. Actuellement, il n'existe donc pas de test unique permettant de déterminer si une personne est atteinte de la maladie d'Alzheimer. Devant le besoin de tests discriminants, des marqueurs biologiques de la maladie ont été recherchés.

Un des facteurs de risques génétiques les mieux décrits est la possession de l'allèle c4 du gène de l'apolipoprotéine E (APOE). Entre 40 et 80% des personnes touchées par la maladie d'Alzheimer possède au moins un allèle APOEc4. Le déclenchement de la maladie ne peut cependant être uniquement expliqué par la génétique. En effet, certaines populations ne présentent aucune relation entre la présence de l'APOEc4 et l'incidence ou l'âge de déclenchement de la maladie d'Alzheimer. L'utilisation d'APOE comme marqueur biologique pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer paraît donc insuffisant. Il est envisageable que de nombreux autres gènes puissent également être des facteurs de risque ou au contraire avoir un effet protecteur, et ainsi influencer le déclenchement de la maladie d'Alzheimer. Néanmoins, bien que des études aient testé l'influence de plus de 400 gènes différents, la plupart n'ont pas donné de résultats utilisables et concluent à une très forte influence de l'environnement. Il paraît difficile dans cette perspective d'envisager des tests basés sur des analyses génomiques, quand bien même ceux-ci comprendraient l'analyse d'un 30 grand nombre de gènes. En France, la Haute Autorité de Santé, une autorité publique indépendante à caractère scientifique, ne recommande d'ailleurs à l'heure actuelle d'étude génétique que chez les patients ayant des antécédents familiaux de démence évocateurs d'une transmission autosomique dominante. Ces formes génétiques familiales à transmission autosomale, connues sous le nom de maladie d'Alzheimer familiale précoce (Early onset familial Alzheimer's Disease), restent cependant très minoritaires. On estime qu'elles représentent seulement 0,1% des cas de maladie d'Alzheimer. Par ailleurs, les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes biologiques de la maladie ont permis d'identifier en particulier que les protéines Tau totales, les protéines Tau hyperphosphorylées, et le peptide Af3 1-42, sont de 10 bons marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Cependant, ces marqueurs ne sont présents que dans le liquide céphalo-rachidien et leur dosage ne peut bien évidement être réalisé qu'en clinique, selon des modalités délicates et coûteuses. Le diagnostic clinique des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pose donc aujourd'hui de nombreuses difficultés. Il y a un réel besoin d'une méthode 15 simple et peu couteuse permettant de déterminer le risque de développer la maladie d'Alzheimer afin de faciliter le diagnostic et le suivi de cette pathologie, et qui pourrait être intégrée aux tests cognitifs actuellement utilisés. De plus, il existe une forte demande pour des marqueurs biologiques fiables, valides et économiques, en particulier de la part des groupes pharmaceutiques qui pourraient 20 ainsi améliorer la sélection des patients pouvant participer aux essais cliniques sur la maladie d'Alzheimer. Figure 1: Niveau sérique de la protéine DYRK1A chez des individus 25 contrôles (CTR ; n= 12) et chez des patients Alzheimer (AD ; n=13) p =0.0007 (Slot blot, anticorps monoclonal de souris, Abnova). (ua : unités arbitraires) Figure 2: Niveau relatif de DYRK1a dans des lignées de lymphoblastoides d'individus contrôles âgés et de patients atteints de la maladie d'Alzheimer p= 0.04. (Slot blot, anticorps monoclonal de souris, Abnova). (ua : 30 unités arbitraires) Figure 3: Homocystéine sérique chez des contrôles âgés non déments (CTRL) et des patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) p= 0.1. (HPLC) Figure 4: Niveau de BDNF sérique chez des individus contrôles (CTRL) et atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) p= 0.0068 (test ELISA). Figure 5: Niveau d'APOD sérique chez des individus contrôles (CTRL) et atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) p= 0.0068 (test ELISA) p=0.038.

Les Inventeurs ont mis en évidence, de façon inattendue, un marqueur biologique qui est modifié chez les sujets atteints de la maladie d'Alzheimer, et ont établi que ce marqueur est présent dans le sang, le plasma et le sérum des sujets humains. Les Inventeurs ont ainsi découvert qu'il est possible d'évaluer si un sujet humain présente un risque de développer la maladie d'Alzheimer, d'une façon simple, rapide et peu coûteuse, par l'analyse du marqueur DYRK1A, en particulier par la détermination du niveau d'expression du marqueur DYRK1A, par exemple sous sa forme protéique ou sous sa forme nucléotidique, dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.

L'expression du gène DYRK1A chez l'Homme implique des étapes d'épissage alternatif, et l'ARN messager de ce gène existe donc sous la forme de plusieurs transcrits qui diffèrent principalement dans leurs régions régulatrices 5' UTR et 3' codante. Le gène DYRK1A code pour la protéine DYRK1A, et au moins 5 isoformes sont connus. La protéine DYRK1A est une enzyme kinase qui serait impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et le développement cérébral. La protéine DYRK1A est surexprimée chez les sujets atteints du syndrome de Down, aussi appelée trisomie 21, et est suspectée de participer aux mécanismes pathogéniques qui sous-tendent les symptômes mentaux et physiques de ce syndrome. Le marqueur DYRK1A n'a jamais été décrit comme pouvant être un marqueur sérique utile dans le diagnostic de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, cette invention est d'autant plus surprenante qu'il n'était pas connu ni envisagé que DYRK1A puisse être retrouvé, en particulier sous sa forme peptidique, dans le sang, le plasma ou dans le sérum des sujets humains.

Un des avantages de la méthode de l'invention est donc la possibilité d'utiliser un échantillon non tissulaire provenant du sujet, ce qui permet un diagnostic simple et non invasif. De plus, la méthode de l'invention peut être mise en oeuvre selon des techniques peu coûteuses et qui ne nécessitent pas d' hospitalisation. L'invention a pour premier objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. L'invention concerne aussi l'utilisation de cette méthode dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic, ainsi que pour la sélection des sujets susceptibles de bénéficier d'un traitement, ou encore devant participer à des essais cliniques sur la maladie d'Alzheimer. La méthode de l'invention peut avantageusement être utilisée en complément des tests actuellement connus. Par échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum, on entend au sens de l'invention tout échantillon comprenant du sang et/ou du plasma et/ou du sérum, ainsi que tout échantillon dérivé de ces produits. Par échantillon dérivé de sang et/ou de plasma et/ou de sérum, on entend par exemple un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum préalablement traité avant son utilisation dans la méthode de diagnostic de l'invention. Un exemple de traitement préalable de l'échantillon consiste à le faire passer sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison du ou des marqueurs recherchés dans la méthode de l'invention, par exemple un anticorps dirigé contre le ou les marqueurs recherchés dans la méthode de l'invention. Un autre exemple de traitement préalable de l'échantillon peut être le pré-fractionnement de l'échantillon biologique, afin de séparer entre elles les protéines de l'échantillon. Dans des techniques bien connues de l'homme du métier, on peut par exemple tout d'abord dépléter certaines protéines de l'échantillon, en particulier l'albumine. Par analyse de DYRK1A on entend au sens de l'invention l'analyse des modifications du marqueur DYRK1A. L'homme du métier comprendra aisément que les modifications d'un marqueur biologique peuvent être analysées à plusieurs niveaux, et comprendre par exemple l'analyse du gène du marqueur ou bien des produits de ce gène. Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse de DYRK1A comprend l'analyse du gène DYRK1A, et/ou des transcrits du gène DYRK1A et/ou des différents isoformes des protéines issus desdits transcrits. L'homme du métier sait que les modifications d'un marqueur biologique peuvent correspondre, entre autres, à des modifications génétiques ou épigénétiques qui sont susceptibles d'avoir un impact sur la séquence ou encore sur le niveau d'expression des produits de ce gène. Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse de DYRK1A comprend l'analyse de la séquence, et/ou de la régulation, et/ou du niveau d'expression du gène DYRK1A.

Préférentiellement, l'analyse de DYRK1A comprend l'analyse du niveau d'expression de DYRK1A. Par « niveau d'expression de DYRK1A », on entend au sens de l'invention la quantité de marqueur DYRK1A sous sa forme peptidique et/ou sous sa forme nucléotidique.

Par marqueur DYRK1A sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique de la protéine DYRK1A (référence NCBI : NP 001387.2), ses isoformes, et/ou ses variants. Par variants de la protéine DYRK1A, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente préférentiellement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95%, encore plus préférentiellement au moins 98% d'identité, avec la séquence peptidique de la protéine DYRK1A. Par marqueur DYRK1A sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence d'un des transcrits du gène DYRK1A (référence NCBI : NG 009366.1), de leurs fragments et/ou de leurs variants. Au sens de la présente invention, les transcrits du gène DYRK1A comprennent le transcrit 1 (référence NCBI : NM 001396.3), le transcrit 2 (référence NCBI : NM 130436.2), le transcrit 3 (référence NCBI : NM 101395.2), le transcrit 4 (référence NCBI : NM 130438.2).

Par variants des transcrits du gène DYRK1A, on entend selon l'invention des polynucléotides dont la séquence présente au moins 85% d'identité, préférentiellement au moins 90%, plus préférentiellement au moins 95% d'identité avec la séquence nucléotidique des transcrits du gène DYRK1A, en particulier les transcrits 1 à 4 susmentionnés. Les termes "identité de séquence" se réfèrent à l'identité entre les séquences de deux polypeptides ou de deux polynucléotides. L'identité entre les séquences peut être déterminée en comparant la position de chacune des séquences, qui peuvent être alignées aux fins de cette comparaison. Lorsqu'une position dans les séquences comparées est occupée par le même résidu de nucléotide ou le même résidu d'acide aminé, alors les séquences sont identiques à cette position. Un degré d'identité de séquence entre des séquences nucléotidiques est une fonction du nombre de résidus de nucléotide identiques à des positions communes à ces deux séquences. Un degré d'identité entre des séquences peptidiques est une fonction du nombre de résidus d'acide aminé identiques qui sont partagés entre ces séquences à des positions communes à ces deux séquences.

Deux polypeptides peuvent chacun (i) comprendre une séquence (c'est à dire une partie de la séquence complète dudit polypeptide) qui est similaire entre les deux polypeptides, et (ii) comprendre en outre une séquence qui est divergente entre deux polypeptides. De façon similaire, deux polynucléotides peuvent chacun (i) comprendre une séquence (c'est à dire une partie de la séquence complète dudit polynucléotide) qui est similaire entre les deux polynucléotides, et (ii) comprendre en outre une séquence qui est divergente entre deux polynucléotides. Afin de déterminer le pourcentage d'identité de séquence de deux polypeptides ou de deux polynucléotides, les séquences sont alignées afin de permettre une comparaison optimale. Par exemple, des écarts peuvent être introduits virtuellement dans la séquence d'un premier polypeptide ou d'un premier polynucléotide pour permettre un alignement optimal avec la séquence d'un second polypeptide ou d'un second polynucléotide. Les résidus d'acide aminé ou de nucléotide sont ensuite comparés entre les séquences alignées. Quand une position dans la première séquence est occupée par le même résidu d'acide aminé ou de nucléotide que la seconde séquence à la position correspondante, les molécules sont identiques à cette position. Le pourcentage d'identité entre les deux séquences est une fonction du nombre de positions identiques partagées par les séquences. D'où la formule générale suivante : % d'identité = nombre de positions identiques / nombre total de chevauchement des positions X 100. Dans cette comparaison, les séquences peuvent être de même longueur ou de longueurs différentes. L'alignement optimal des séquences pour déterminer une fenêtre de comparaison peut être effectuée par l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (J. Theor Biol, 91 (2):.. 370-380, 1981), par l'algorithme d'alignement d'homologie de Needleman et Wunsch (J. Mol Biol, 48 (3):. 443453, 1972), par la recherche de similitude par la méthode de Pearson et Lipman (Proc. Natl Acad Sci USA, 85 (5):... 2444-2448, 1988), par des mises en oeuvre informatisées de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software 7.0 Paquet de presse, le groupe d'ordinateurs génétique, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin). Le meilleur alignement (par exemple celui dont résulte le plus fort pourcentage d'identité au cours de la fenêtre de comparaison) généré par différentes méthodes est sélectionné. Le niveau d'expression de DYRK1A pourra être déterminé selon toute méthode de détection et/ou de quantification d'un peptide et/ou d'un polynucléotide dans un échantillon biologique connue de l'homme du métier, par exemple toute méthode basée sur des techniques classiques d'analyse de biochimie, microbiologie, biologie moléculaire et des techniques d'ADN recombinant, notamment celles décrites ci-après et dans les exemples. De telles techniques sont expliquées en détail dans la littérature (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Malke, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover; Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les méthodes décrites ci-après sont présentées à titre indicatif et ne constituent en aucune manière une liste exhaustive des approches techniques pouvant être utilisées pour la mise en oeuvre de l'invention. L'homme du métier saura identifier selon l'état d'évolution et d'optimisation des techniques, à tout moment, quelles sont les méthodes les mieux adaptées pour mettre en oeuvre l'invention.

En fonction de la méthode de détection et/ou de quantification employée, le sang et/ou le sérum et/ou le plasma du sujet pourra en outre subir un traitement préalable à son analyse, par exemple de broyage et/ou de dissolution, ou d'extraction de l'acide nucléique, préférentiellement de l'ARNm, compris dans l'échantillon. L'acide nucléique extrait peut avantageusement peut être amplifié avant la détermination du niveau d'expression de DYRK1A. De tels traitements sont bien connus de l'homme du métier. Les techniques pour déterminer le niveau d'expression d'un polypeptide sont connues de l'homme du métier et incluent par exemple la spectrométrie de masse, les tests biochimiques, y compris les tests immunologiques, comme par exemple les tests immunologiques de détection classiques, tels que les tests ELISA et les tests ELISPOTS, ou encore comme par exemple des tests immunologiques employant des techniques de transfert des protéines sur support, tels que le slot blot (aussi appelé dot blot) ou le western blot. La détermination du niveau d'expression d'un polypeptide peut comprendre en outre une étape préalable de séparation des polypeptides totaux compris dans l'échantillon du sujet, par exemple par électrophorèse ou chromatographie. Selon un mode de réalisation de l'invention, la détermination du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique comprend au moins un test immunologique, préférentiellement un slot blot ou un western blot. Les tests immunologiques reposent sur l'utilisation de molécules capables de reconnaitre un antigène avec une grande spécificité et une grande sensibilité. Le plus couramment, on utilise à cette fin des anticorps spécifiques de l'antigène. Par « anticorps spécifiques», on entend au sens de l'invention toute molécule protéique, préférentiellement toute molécule d'immunoglobine, qui se lie sélectivement et de manière réversible à un antigène avec la sélectivité requise. Le terme désigne à la fois les molécules d'immunoglobuline intactes telles que les anticorps monoclonaux et polyclonaux, et aussi les bi-anticorps spécifiques, les anticorps humanisés, les anticorps chimériques, les anticorps anti-idiotypiques (anti-ID), les anticorps simple chaîne, les fragments Fab, les fragments F (ab'), les protéines de fusion, dès lors qu'ils se lient sélectivement et de manière réversible à DYRK1A sous sa forme peptidique. Par « se lie sélectivement », on entend au sens de l'invention la capacité des anticorps à se lier préférentiellement à un antigène. Le caractère sélectif d'une telle liaison est classiquement appelé l'affinité de liaison, communément exprimé par la constante d'équilibre d'association. L'affinité de liaison peut être mesurée en utilisant une variété de méthodes connues de l'homme du métier y compris les immunoblots, les analyses d'immunoprécipitation, les tests radioimmunologiques, les tests immunoenzymatiques (par exemple, ELISA), des titrages d'anticorps par immunofluorescence et la microscopie. Préférentiellement, l'affinité d'un anticorps spécifique de DYRK1A sous sa forme peptidique présente une constante d'affinité comprise entre environ 103 M-1 et environ 1012M-1 pour ladite forme. Les techniques pour produire des anticorps polyclonaux ou monoclonaux spécifiques d'un polypeptide, en connaissant la séquence de ce polypeptide, sont bien connues de l'homme du métier et ne nécessitent pas d'être décrites en détail ici. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation, éventuellement multiple, d'un animal avec le polypeptide en question, puis récupération du sérum dudit animal et purification des anticorps recherchés, notamment par chromatographie d'affinité à l'aide du polypeptide utilisé pour l'immunisation. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la méthode des hybridomes décrite dans Kiihler et al. (Nature, 1975, 256 (5517): 495-497). Un grand nombre d'anticorps spécifiques de la protéine DYRK1A, en particulier de la protéine DYRK1A humaine existent actuellement sur le marché. On peut citer en particulier l'anticorps anti-DYRK1A monoclonal de souris issu du clone 7D10 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin H-143 sc-28899 produit par Santa Cruz, l'anticorps antiDYRK1A polyclonal de lapin ab65220 produit par Abcam, l'anticorps antiDYRK1A polyclonal de lapin PAB19417 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de mouton PAB9862 produit par Abnova Corporation, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin orb38099 produit par Byorbit, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin NBP1-84031 produit par Novus, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin LS-B5890 produit par LSBio, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin 70R-1962 produit par Fitzgerald, l'anticorps anti-DYRK1A monoclonal de souris ab54944 produit par Abcam, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin ab53231 produit par Abcam, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de chèvre sc-12568 produit par SantaCruz, l'anticorps anti-DYRK1A polyclonal de lapin sc-28899 produit par SantaCruz, l'anticorps anti-DYRK1A monoclonal de lapin D30C10 produit par Cell Signaling Technologies. Il est bien connu de l'homme du métier qu'un anticorps spécifique d'une protéine n'est pas nécessairement utilisable dans toutes les techniques immunologiques existantes. Ceci s'explique souvent par les conditions physico-chimiques des techniques utilisées, qui permettent ou non un bon accès de l'anticorps à l'antigène auquel il se lie. Ces conditions étant par nature multimodales, il est particulièrement délicat de déterminer a priori quelles sont les techniques dans lesquelles un anticorps donné sera utilisable, et permettra par exemple de déterminer le taux d'expression d'un marqueur biologique avec une précision suffisante. Les Inventeurs ont découvert que certains anticorps spécifiques de DYRK1A permettent d'obtenir des résultats facilement interprétables, et sont particulièrement indiqués lorsque la détermination du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique comprend au moins un slot blot ou un western blot. Selon un mode de réalisation encore préféré de l'invention, le test immunologique, préférentiellement le slot blot ou le western blot, comprend l'utilisation d'au moins un anticorps spécifique de DYRK1A sous sa forme peptidique, ledit anticorps étant choisi parmi l'anticorps anti-DYRK1A monoclonal issu du clone 7D10 produit par Abnova Corporation, l'anticorps antiDYRK1A monoclonal de lapin D30C10 produit par Cell Signaling Technologies. Les techniques pour déterminer le niveau d'expression d'un 30 polynucléotide sont bien connues de l'homme du métier et incluent notamment et de manière non-exhaustive le séquençage, l'hybridation et/ou l'amplification d'acide nucléique, en particulier d'ARNm. Par exemple, l'homme du métier pourra choisir de séquencer, d'hybrider ou d'amplifier l'acide nucléique présent dans l'échantillon de sang et/ou de sérum ou de plasma avec la séquence nucléique de référence du gène DYRK1A, ou avec la séquence complémentaire d'un des transcrits du gène DYRK1A, en particulier les transcrits mentionnés plus haut. Cette détermination peut se faire à partir de la totalité ou une partie de l'ARNm compris dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum du suj et. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux polynucléotides, par exemple un polynucléotide et un olygonucléotide, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. L'hybridation de deux polynucléotides peut être totale (le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G), ou partielle (le complexe double brin obtenu comprend en outre des bases non liées à une base complémentaire). L'hybridation entre deux polynucléotides dépend des conditions opératoires. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des polynucléotides que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Par sonde d'hybridation, on entend au sens de l'invention un polynucléotide, en particulier un oligonucléotide, comprenant de 5 à 100 acides nucléiques, notamment de 10 à 35 acides nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec DYRK1A sous sa forme nucléotidique. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. L'homme du métier connaît aussi très bien les différentes méthodes d'amplification d'acides nucléiques, telles que par exemple les méthodes de 30 Réaction de Polymérisation en Chaîne (« Polymerase Chain Reaction », PCR), simple, compétitive, en temps réel, la méthode d'amplification du signal bDNA («branched DNA-based signal amplification assays »), ou encore par la technologie d'amplification isotherme de l'acide nucléique (« nucleic acid sequence based amplification assays », NASBA et « Transcription Mediated Amplification », TMA ), qu'il n'est donc pas nécessaire de décrire ici.

Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification un polynucléotide, en particulier un oligonucléotide, comprenant de 5 à 100 acides nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 acides nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction enzymatique d'amplification. Par réaction enzymatique d'amplification, on entend un processus générant de multiples copies d'un polynucléotide cible par l'action d'au moins une enzyme. Il est bien connu de l'homme du métier que ces méthodes peuvent permettre un résultat qualitatif ou un résultat quantitatif selon leur mise en oeuvre. Dans l'optique d'une utilisation quantitative de ces tests, l'homme du métier pourra, le cas échéant, utiliser des dilutions sérielles de l'échantillon et d'un ou plusieurs contrôles appropriés, et pourra déterminer le niveau d'expression du polypeptide ou du polynucléotide à l'aide d'une courbe d'étalonnage. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'analyse de DYRK1A comprend l'analyse de la séquence et/ou de la régulation du gène DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. L'analyse de la séquence et/ou de la régulation du gène DYRK1A pourra être réalisée selon toute technique bien connue de l'homme du métier permettant l'analyse de la séquence et/ou de la régulation d'un gène. De préférence, l'homme du métier choisira des techniques visant à mettre en évidence des modifications ou altérations de l'ADN au niveau du gène DYRK1A (référence NCBI : NG 009366.1), comme par exemple la détection directe de mutations, la mise en évidence d'altérations dans le profil de méthylation des loci d'intérêt, ou tout autre procédé de détermination d'altérations de l'ADN dans un échantillon. Les mutations peuvent inclure des substitutions ponctuelles d'un nucléotide par un autre, des délétions de un ou plusieurs nucléotides et des insertions de un ou plusieurs nucléotides. Les mutations peuvent être situées dans la partie codante du gène DYRK1A, ou dans les parties 5' et 3' non codantes, comme par exemple la région promotrice ou la région terminatrice de transcription. Les stratégies de mise en évidence de mutations s'appuient sur les techniques de la biologie moléculaire et comprennent des étapes d'extraction d'ADN, d'amplification par PCR ou autre technique d'amplification, d'hybridation et/ou de séquençage. Les mutations peuvent ensuite être identifiées par la différence de taille entre le fragment de référence attendu et le fragment muté, par exemple dans le cas de délétions ou d'additions, ou par la mise en évidence de modification de la séquence du fragment amplifié par rapport à une séquence de référence dans le cas de substitutions. Comme indiqué précédemment, les altérations de l'ADN peuvent aussi correspondre à une modification du profil de méthylation du gène DYRK1A. La modification du profil de méthylation peut correspondre à une hypométhylation (diminution du nombre de méthylations) ou à une hyperméthylation (augmentation du nombre de méthylations). Les motifs altérés peuvent être situés dans la partie codant du gène DYRK1A, ou dans les parties 5' et 3' non codantes, comme la région promotrice ou la région terminatrice de transcription. L'analyse de la méthylation de l'ADN peut être effectuée en utilisant des techniques basées sur la PCR qualitative et/ou quantitative comme la MSP (methylation-specific PCR), le séquençage bisulfite, la digestion par une enzyme de restriction sensible aux méthylations couplée avec la PCR, COBRA (combined bisulfite restriction analysis) et Ms-SNuPE (methylation-sensitive single nucleotide primer extension).

Les Inventeurs ont en outre découvert que le niveau d'expression de DYRK1A dans le sérum des sujets atteints de la maladie d'Alzheimer est significativement plus faible que celui des sujets non atteints, appariés en âge. Il est ainsi possible à l'homme du métier d'évaluer simplement, en utilisant par exemple un niveau d'expression de DYRK1A de référence, le risque pour le sujet testé de développer la maladie d'Alzheimer. Ainsi, selon l'invention, le sujet sera dit à risque de développer la maladie d'Alzheimer lorsque le niveau d'expression de DYRK1A dudit sujet sera inférieur au niveau d'expression de DYRK1A de référence. Par niveau d'expression de DYRK1A de référence, on entend au sens de la présente invention le niveau d'expression de DYRK1A représentant la valeur moyenne du niveau d'expression dudit marqueur chez un ou plusieurs sujets sains. L'homme du métier pourra sans difficultés établir un tel niveau d'expression de DYRK1A de référence à partir par exemple des niveaux d'expression de DYRK1A dans le sérum d'un ou plusieurs sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer, préférentiellement appariés en âge au sujet testé, en utilisant de préférence la même technique de détermination dudit taux d'expression que celle utilisée pour le sujet testé, afin de limiter les biais statistiques. Par apparié en âge, on entend au sens de l'invention des sujets humains dont l'âge est égal au à l'âge du sujet testé à plus ou moins 5 ans, la date anniversaire du sujet servant de référence. Préférentiellement, le niveau d'expression de DYRK1A de référence selon l'invention est établi à partir des niveaux d'expression de DYRK1A dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 5, 10 ou 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer. Encore préférentiellement, le niveau d'expression de DYRK1A de référence selon l'invention est établi à partir des niveaux d'expression de DYRK1A dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer. Par « inférieur à », on entend au sens de la présente invention « strictement inférieur à ». Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur à un niveau d'expression de DYRK1A de référence. Préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur de 35%, 40%, 50%, 55% à un niveau d'expression de DYRK1A de référence. Par « ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur de 35% à un niveau d'expression de DYRK1A de référence », on entend que le ratio entre : i) la valeur du niveau d'expression de DYRK1A de référence moins la valeur du niveau d'expression de DYRK1A, et ii) la valeur du niveau d'expression de DYRK1A de référence, est supérieur ou égal à 35 %. L'invention a aussi pour objet une méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la détermination du niveau d'expression DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet ; et b) la conclusion que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur à un niveau d'expression de DYRK1A de référence. Les Inventeurs ont en outre établi des valeurs de références pouvant s'avérer très utiles dans la mise en oeuvre de l'invention. Ainsi, les Inventeurs ont pu établir des niveaux d'expression de DYRK1A de référence, en particulier pour ce qui est du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique, en deçà desquelles le risque pour le sujet de développer la maladie d'Alzheimer est important Préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A, en particulier le niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique, est inférieur de 35% au niveau d'expression de DYRK1A de référence. Plus préférentiellement, la méthode de l'invention est caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A, en particulier le niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique, est inférieur de 35% au niveau d'expression de DYRK1A de référence, ledit niveau d'expression de DYRK1A de référence étant établi à partir des niveaux d'expression de DYRK1A dans l'échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'au moins 20 sujets humains non atteints de la maladie d'Alzheimer. La méthode de l'invention peut en outre être améliorée par la détection 30 d'un marqueur biologique additionnel autre que DYRK1A. La combinaison de plusieurs marqueurs biologiques, dont DYRK1A, permet d'améliorer la spécificité et/ou la sensibilité de la méthode de diagnostic de la maladie d'Alzheimer. De façon générale, la sensibilité d'un test mesure sa capacité à donner un résultat positif lorsqu'une hypothèse est vraie, tandis que la spécificité mesure la capacité d'un test à donner un résultat négatif lorsque l'hypothèse est fausse. Selon la présente invention, un marqueur biologique (ci-après « marqueur ») est une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. Un marqueur désigne donc toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, un marqueur peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C activée en tant que marqueur d'une infection). Selon certains modes de réalisation de la présente invention un marqueur est un polypeptide ou un polynucléotide dont les changements d'expression, en particulier de niveau d'expression, ou d'état, corrèlent avec le risque ou la progression d'une maladie. Les Inventeurs ont découvert en particulier que les marqueurs sériques Homocystéine, BDNF (« Brain-Derived Neurotrophic Factor ») et APOD (« apolipoprotéine D ») corrèlent aussi avec un risque de développer la maladie d'Alzheimer, et peuvent à ce titre être avantageusement utilisés pour augmenter la spécificité et/ou sensibilité de la méthode de l'invention. L'Homocystéine est un acide aminé soufré non protéinogène résultant du catabolisme de la méthionine. Cette molécule est une substance pro-inflammatoire dont le taux plasmatique est anormalement élevé dans le cas d'atrophie cérébrale, un des symptômes de la maladie d'Alzheimer (Smith et al., PLoS One, 2010 Sep 8;5(9):e12244). Le dosage de l'Homocystéine dans le sang et/ou plasma et/ou le sérum de sujets humains est couramment utilisé en clinique et bien connu de l'homme du métier, et ne nécessite pas d'être décrit ici L'homme du métier pourra s'il le souhaite se référer à Fortin et al. (Clin Biochem. ; 1995; (2):155-62) pour une description complète des méthodes utilisables.

Le marqueur BDNF fait partie de la famille des facteurs de croissance neurotrophiques qui sont liés aux NGF ("Nerve Growth Factor"). Les facteurs neurotrophiques sont présents dans le cerveau et la périphérie. Le gène BDNF (référence NCBI: NG 011794.1, aussi connu sous les noms ANON2 et BULN2), code pour la protéine BDNF. La protéine BDNF agit sur certains neurones du système nerveux central et sur le système nerveux périphérique, contribuant à la survie des neurones existants, et stimulant la croissance et la différenciation de nouveaux neurones et de synapses. Des analyses post-mortem ont montré des niveaux d'expression faibles du gène codant pour le BDNF dans les tissus du cerveau des personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. La protéine BDNF est retrouvée dans le sang, le sérum et le plasma des sujets humains. Le dosage, en particulier sérique, de la protéine BDNF peut facilement être réalisé selon la technique décrite dans Undine et al. (Neuropsychopharmacology ;2005 ; 30, 1148-1153).

Le marqueur APOD (référence Ensemble : ENSG00000189058) est codé par un gène localisé sur le chromosome 3 chez l'Homme. Ce gène code pour un transcrit (référence NCBI : NM 001647.3), lui-même traduit en un peptide dit précurseur de la protéine Apo D (référence NCBI : NP 001638.1). Apo D est un composant de lipoprotéines de haute densité dont la séquence présente peu d'identité avec les séquences d'autres apolipoprotéines (dont l'apolipoprotéine E). Apo D est étroitement associée à la lécithine-cholestérol acyltransférase, une enzyme impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. Le marqueur APOD a été corrélé avec le syndrome d'insensibilité aux androgènes. Les Inventeurs ont par ailleurs montré qu'une diminution du taux d'expression du marqueur APOD, en particulier dans le plasma et le sérum d'un sujet humain, corrèle avec le risque de développer la maladie d'Alzheimer. Apo D en particulier est retrouvée dans le sérum et le plasma des sujets humains et peut facilement être dosée par toute technique immunologique, en particulier par ELISA. Des tests ELISA sont disponibles, tel que par exemple le test «Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD) » commercialisé par ShangHai BlueGene Biotech CO.

Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention comprend en outre l'analyse d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.

Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention consiste en l'analyse de DYRK1A; de DYRK1A et du marqueur Homocystéine ; de DYRK1A et du marqueur BDNF; de DYRK1A et du marqueur APOD; de DYRK1A, du marqueur Homocystéine et du marqueur BDNF; de DYRK1A, du marqueur Homocystéine et du marqueur APOD; de DYRK1A, du marqueur BDNF et du marqueur APOD; ou, de DYRK1A, du marqueur Homocystéine, du marqueur BDNF et du marqueur APOD ; dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. Ainsi, au sens de l'invention, l'analyse d'un ou des marqueurs autres que DYRK1A comprend l'analyse de la séquence, et/ou de la régulation, et/ou du niveau d'expression du gène dudit ou desdits marqueurs. Dans le cas particulier du marqueur Homocystéine, l'analyse comprend l'analyse du taux du marqueur Homocystéine. Préférentiellement, l'analyse du marqueur BDNF et /ou APOD comprend l'analyse du niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD. Par « niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD», on entend au sens de l'invention la quantité dudit ou desdits marqueurs sous sa forme peptidique et/ou sous sa forme nucléotidique. L'homme du métier pourra choisir la méthode la plus appropriée pour déterminer les taux et niveaux d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD . En particulier, il sera évident pour l'homme du métier qu'il est possible de déterminer le niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD sous sa forme peptidique, ou sous sa forme nucléotidique.

Par marqueur BDNF sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique de la protéine BDNF de référence, le proBDNF (référence swissprot: P23560.1), ses fragments et/ou ses variants. Par variants de la protéine BDNF, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente avantageusement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95%, encore plus préférentiellement au moins 98% d'identité, avec la séquence peptidique de la protéine BDNF. Par marqueur BDNF sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence d'un des transcrits du gène BDNF (référence NCBI du gène BDNF: NG 011794.1), de leurs fragments et/ou de leurs variants. Au sens de la présente invention, les transcrits du gène BDNF comprennent le transcrit 1 (référence NCBI :NM 007540.4), le transcrit 2 (référence NCBI :NM 001048139.1), 1 (référence NCBI :NM 001048141.1). Par marqueur APOD sous sa forme peptidique, on entend selon l'invention un peptide dont la séquence peptidique comprend la séquence peptidique du précurseur de la protéine Apo D (référence NCBI : NP 001638.1), ses fragments et/ou ses variants. Par variants du précurseur de la protéine Apo D, on entend selon l'invention des peptides dont la séquence peptidique présente avantageusement au moins 90% d'identité, plus préférentiellement au moins 95%, encore plus préférentiellement au moins 98% d'identité, avec la séquence peptidique du précurseur de la protéine Apo D. Par marqueur APOD sous sa forme nucléotidique, on entend selon l'invention au moins un polynucléotide dont la séquence comprend la séquence du transcrit du gène APOD, de ses fragments et/ou de ses variants. Au sens de la présente invention, le transcrit du gène APOD est le polynucléotide de référence NCBI : NM 001647.3. L'homme du métier comprendra que les techniques décrites plus haut pour la détermination du niveau d'expression des différentes formes, peptidiques ou nucléotidiques, de DYRK1A, s'appliquent tout à fait aux marqueurs BDNF et APOD. Selon un mode préféré de l'invention, on détermine le taux du marqueur Homocystéine par HPLC.

Selon un mode préféré de l'invention, on détermine le niveau d'expression du marqueur BDNF et /ou APOD sous sa forme peptidique. Pour déterminer le niveau d'expression du marqueur BDNF sous sa forme peptidique, l'homme du métier pourra par exemple utiliser tout anticorps spécifique de BDNF. Un certain nombre d'anticorps spécifiques de cette protéine sont connus, tels que ceux utilisés dans les méthodes EMax, Immunoassay (ELISA E-Max, Promega, Madison, WI). Pour déterminer le niveau d'expression du marqueur APOD sous sa forme peptidique, l'homme du métier pourra par exemple utiliser tout anticorps spécifique de APOD. Un certain nombre d'anticorps spécifiques de cette protéine sont connus, tels que par exemple ceux utilisés dans le kit «Human Apolipoprotein D Elisa Kit (APOD) » commercialisé par ShangHai BlueGene Biotech CO. L'invention peut par exemple être mise en oeuvre pour sélectionner les sujets pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer, et/ou pouvant bénéficier d'une surveillance médicale. Par exemple, il est possible d'utiliser l'invention pour sélectionner les sujets humains pouvant participer à une étude clinique, en particulier sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, de préférence les traitements curatifs ou palliatifs. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode pour sélectionner un sujet humain pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, comprenant : a) le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain selon la méthode de l'invention, et ; b) si ledit sujet a la maladie d'Alzheimer, la sélection dudit sujet comme étant un sujet pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer. L'invention est en outre particulièrement utile pour suivre l'évolution des sujets, en particuliers atteints de la maladie d'Alzheimer ou à risque de développer celle-ci. La rapidité de l'évolution de la maladie d'Alzheimer est un signe de sa gravité, et l'invention peut donc être utilisée par le praticien pour choisir au mieux le traitement à administrer au sujet, en fonction de ces paramètres. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode de détermination de la progression de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de : a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet à un temps tl; b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet à un temps t2; c) conclusion que la maladie d'Alzheimer a progressé chez ledit sujet si ledit deuxième niveau d'expression de DYRK1A de l'étape b) est inférieur audit deuxième niveau d'expression de DYRK1A de l'étape a). Il est bien évident que l'homme du métier pourra au mieux choisir le laps de temps séparant le temps tl et le temps t2, et donc séparant les étapes a) et b), au vu de ses connaissances de la maladie d'Alzheimer, ainsi que de l'âge du patient, éventuellement d'autres paramètres qu'il jugera pertinents. L'invention pourra aussi être utilisée au cours du traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, afin d'évaluer l'efficacité des médicaments administrés, permettant ainsi d'adapter ceux-ci le cas échéant. Ainsi, l'invention a aussi pour objet une méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de : a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet avant l'administration dudit traitement ; b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet après un temps T suivant la première administration dudit traitement ; c) conclusion que ledit traitement est efficace chez ledit sujet si ledit niveau d'expression de DYRK1A de l'étape b) est supérieur audit niveau d'expression de DYRK1A de l'étape a). L'homme du métier déterminera là encore le temps T séparant l'étape a) de l'étape b), au vu de ses connaissances de la maladie d'Alzheimer, ainsi que de l'âge du patient, éventuellement d'autres paramètres qu'il jugera pertinents. L'invention a aussi pour objet un kit pour la mise en oeuvre de l'une des 15 méthodes de l'invention, comprenant au moins un moyen nécessaire à la détermination du niveau d'expression de DYRK1A, préférentiellement du niveau d'expression de DYRK1A sous sa forme peptidique, dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'un sujet humain, et avantageusement une notice d'utilisation. 20 Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression de DYRK1A on citera par exemple les anticorps spécifiques de DYRK1A, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier à DYRK1A sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment. Selon un mode de réalisation particulier, le kit de l'invention comprend en 25 outre au moins un moyen nécessaire à la détermination du taux du marqueur Homocystéine, du niveau d'expression du marqueur BDNF et/ou du niveau d'expression du marqueur APOD. Parmi les moyens nécessaires à la détermination du taux du marqueur Homocystéine on citera par exemple la tri-N-butylphosphine et le sel 30 d'ammonium de l'acide 7-fluorobenzoflurazone-4-sulfonique.

Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression de du marqueur BDNF on citera par exemple les anticorps spécifiques du marqueur BDNF, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier au marqueur BDNF sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment.

Parmi les moyens nécessaires à la détermination du niveau d'expression du marqueur APOD on citera par exemple les anticorps spécifiques du marqueur APOD, les sondes nucléiques et/ou les amorces d'amplification capables de se lier au marqueur APOD sous sa forme nucléotidique, tels que décrits précédemment. Selon un mode de réalisation particulier, les kits de l'invention comprennent au moins deux amorces oligonucléotidiques encadrant le marqueur cible sous sa forme nucléotidique, et s'hybridant avec des brins opposés du marqueur cible sous sa forme nucléotidique. Les exemples suivants sont fournis ici à titre d'illustration et ne sont pas, sauf indication contraire, destinés à être limitatifs. Exemple de méthode de dosage de DYRK1A Le plasma est composé d'un ensemble de protéines très informatives d'un point de vue médical. En effet, la majorité des cellules communiquent avec le plasma de façon directe ou à travers le fluide extracellulaire ou cérébrospinal. Ces protéines peuvent donc avoir un potentiel diagnostique. La purification du plasma consiste à enlever une protéine très dominante dans ce tissu : l'albumine. On utilise le kit Aurum affi-gel blue mini kits and columns (Bio-rad). Afin de ne pas trop diluer le plasma dans la solution tampon, on le fait passer directement dans les colonnes sans ajout de ce dernier. Avant toute analyse de la quantité de protéine DYRK1A par Slot Blot, il est nécessaire de déterminer la quantité de protéines dans les échantillons par la méthode de Bradford. Cette méthode consiste en un dosage colorimétrique basé sur la variation de l'absorbance. Il repose sur le changement de couleur du réactif de Bradford (bleu de coomasie) initialement bleu mesurable à partir d'un spectrophotomètre.

Le bleu de coomassie est un intercalant des acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) présent dans les protéines à doser, l'absorbance est proportionnelle à la quantité de protéines. En effet, plus il y a d'acides aminés liés à l'intercalant, plus il y a de protéines présentes dans l'échantillon et plus la densité de coloration du bleu augmente, soit l'absorbance. Cette méthode reste cependant la moins sensible aux interférences d'agents présents dans les échantillons, contrairement aux autres techniques de dosage de protéines telles que la méthode du biuret, celle de Kjeldahl, ou encore la spectroscopie par U.V.

On introduit 1µL de l'extrait de protéines dans 5001.11_, de réactif de Bradford (Coomassie (Bradford) Protein Assay) dilué au 1/2 dans de l'eau. On mesure l'absorbance des échantillons à une longueur d'onde de 595nm contre un « blanc » préalablement préparé à partir de la même solution de Bradford dilué sans ajout de protéines. La quantité en protéines des échantillons est ainsi calculée par rapport à une gamme étalon préalablement réalisée avec de l'Albumine Bovine Sérique (ou B SA) de 1 à 6 [tg. Le niveau d'expression de la protéine DYRK1A est déterminé par la technique de Slot Blot. Cette technique est utilisée pour la quantification de protéines dans un mélange biologique. Le Slot Blot à détection par chimioluminescence a pour principe de transférer sur une membrane de nitrocellulose des protéines d'un liquide biologique, en vue de tester leur réactivité à des anticorps vis-à-vis des protéines spécifiques. Elles seront alors révélées à l'aide d'un détecteur couplé à l'anticorps secondaire qui peut être un fluorochrome ou une enzyme, après incubation avec un anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt puis avec un anticorps secondaire reconnaissant un épitope de l'anticorps primaire. Le marquage, qui est alors un élément sensible à un substrat, émettra de la lumière restituée en image numérique par une caméra après exposition. Cette technique est une simplification de la méthode de Western Blot. En effet, le mélange contenant la protéine à analyser est appliqué directement sur la membrane et donc la partie du Western Blot comprenant l'électrophorèse n'est pas effectué. Pour cela, elle nécessite un anticorps primaire très spécifique. On prépare, d'après le dosage des protéines au Bradford, 20pg de protéines totales par dépôt d'échantillon dans du TS (150Mm NaC1, 10mM Tris), 5 que l'on dénature 10 minutes à 95°C à l'aide d'un volume égal de Laemmli 2X sans bleu, ajouté aux volumes des préparations finales. Les échantillons sont alors déposés sur une membrane de nitrocellulose (Whatman® Protrano® Nitrocellulose Transfer Membrane) en utilisant un Slot Blot : On dépose sur le support à membrane un papier Whatman imbibé de 10 tampon TS, que l'on recouvre de la membrane de nitrocellulose imbibée également de tampon TS. On fixe alors le support supérieur du Slot Blot au support de membrane qui est relié à une pompe à vide. Après un premier lavage de tous les puits disposés sur le support supérieur avec 2041 de TS, les échantillons peuvent être déposés (50pL par dépôt). Un deuxième lavage avec 15 200pt de TS est ensuite effectué. Puis, la membrane est récupérée et saturée pendant 1 heure à température ambiante, dans du TST-Lait à 10% (TST : 150mM NaC1, 10Mm Tris, 0.1% Tween), sous agitation. Il s'en suit une incubation d'une nuit à 4°C, sous agitation, avec l'anticorps primaire Anti- DYRKIA (antiDYRK1A antibody abnova Corporation réf H00001859-M01) dilué au 250ème, 20 toujours dans du TST contenant 10% de lait. Après trois lavages de 5 minutes avec du TST, la membrane est incubée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation avec l'anticorps secondaire correspondant : l'Anti-Souris dilué au 40 000ème dans du TST-Lait 10%. Enfin, la membrane sera lavée trois fois 5 minutes avec du TST. On révèlera à l'aide d'un 25 imageur de chimioluminescence, le LAS-3000, après une incubation de 5 minutes à l'obscurité avec du Luminol. Puis, on colore la membrane au rouge Ponceau afin de mettre en évidence les protéines. Cette méthode de détection est considérée comme l'une des plus sensibles et spécifiques jusqu'alors établies. La mesure du niveau d'expression de la 30 protéine DYRKIA est alors réalisé par analyse densitométrique, ce qui consiste à évaluer l'intensité du dépôt incubé au Luminol avec le logiciel UnScan-it par rapport aux protéines colorées au rouge Ponceau qui permet de quantifier les protéines totales présentes sur la membrane. DYRK1A dans le sérum de patients La méthode de Slot blot décrite ci-dessus a été appliquée au dosage de DYRK1A dans le sérum d'individus contrôles (CTRL) et de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA). On observe une diminution significative du niveau de DYRK1A dans le sérum des patients (Figure 1).

DYRK1A dans les lignées lymphoblastoides de patients Méthodes Les lignées lymphoblastoïdes sont issues de cultures primaires de lymphocytes B et immortalisées par le virus EBV. Elles ont été maintenues en milieu complet OptiMEM®-G1utaMAX® (GIBCO InvitrogenTM), additionné de 5 % de sérum de veau foetal et de 1 % d'un mélange d'antibiotiques (Pénicilline 100 U.mL-1 et streptomycine 100 [tg.mL-1). La lyse des cellules est réalisée dans un tampon de lyse contenant du Tris 50 mM pH8, NaC1 150 mM, IGEPAL 1 % (SIGMA), SDS 0,1 % et des inhibiteurs de protéases (E64 5 [tg.mL-1 ; Leuleptine 2,5 [tg.mL-1 ; Pefabloc 1mM ; SIGMA). Après centrifugation à 15000 g, le surnageant contenant les protéines est récupéré et la quantité de protéines est déterminée par la technique de Bradford. La quantité de protéine DYRK1A est mesurée par la technique de slot blot décrite plus haut. Résultats Les mêmes mesures du niveau relatif de la protéine DYRK1A ont été effectuées sur des protéines préparées à partir de lignées de lymphoblastoïdes établies à partir de lymphocytes provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA): on retrouve un abaissement significatif de l'expression de DYRK1A dans les lymphoblastoïdes de patients (Figure 2) Exemple de mesure du niveau de l'Homocystéine Méthode Le dosage de l'homocystéine plasmatique totale est réalisé à partir d'un tube de sang veineux prélevé sur citrate de sodium, conservé dans la glace entre le moment du prélèvement et celui de la centrifugation du plasma, à 3000rpm à 4°C.

On utilise la technique chromatographique liquide haute performance (HPLC) utilisant une détection fluorimétrique : adaptation de la technique précédemment publiée par Araki et al. (J Chromatogr. 1987 Nov 27;422:43-52 )et modifiée par Ubbink et al. (J Chromatogr, 1991; 565: 441-446) et Fortin et al.(J Chromatogr, 1991; 565: 441-446) . Les composés plasmatiques thiolés sont réduits ou libérés des protéines plasmatiques avec la tri-n-butylphosphine. Ils sont ensuite dérivés avec un agent fluorigène spécifique des thiols, le 7-fluorobenzofurazone-4- sulfonic acid ammonium salt (SBD-F), puis séparés par HPLC en phase inverse. Les échantillons sont incubés à +4°C pendant 30 min, et 300 11.1 d'acide perchlorique (PCA 0.6 M + EDTA 1 mM) sont ajoutés pour précipiter les protéines. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 3000 rpm pendant 15 min à +4°C. 100 11.1 de surnageant sont mélangés avec 20 11.1 de NaOH (1.55 M), 250 11.1 de tétraborate de potassium (0.125 M), pH 9.5, contenant 4 mM d'EDTA, et 100 11.1 de SBD-F (1 g/1 dans le tétraborate de potassium). Ils sont incubés à +60°C pendant lh. Après refroidissement, 20 11.1 d'échantillon sont injectés dans le système HPLC, soit directement, soit via un passeur automatique d'échantillons. L'Homocystéine est quantifiée par fluorimétrie. Le système HPLC utilisé comprend un programmateur « Programmable Solvent module 126, System Gold » (Beckman) contrôlant une pompe « Programmable Solvent module 116, System Gold » (Beckman). Les échantillons sont introduits dans la chaine HPLC, soit directement par une valve d'injection Rheodyne adaptée à une boucle d'injection de 20 !al, soit via un passeur automatique d'échantillons « 717 plus autosampler » (Waters). La séparation est réalisée à température ambiante grâce à une colonne analytique en phase inverse Lichrosorb (RP18, 250 x 4 mm, granulométrie 7 p.m) commercialisée par Merck.

Les intensités de fluorescence sont mesurées avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 385 et 515 nm respectivement, en utilisant un spectrophotomètre de fluorescence « Waters 474 scanning fluorescence detector » (Waters). Le système de détection est raccordé à un intégrateur «Waters 746 data module » (Waters) permettant de quantifier l'aire des pics.

Résultats Le dosage par HPLC permet d'observer une augmentation du niveau de l'homocystéine chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Figure 3). Exemple de mesure du niveau de BDNF Méthode Le dosage du BDNF est réalisé par ELISA avec le « kit ELISA E-Max » (Promega) sur 100 1..tL de plasma dilué au demi dans du tampon fourni dans le kit. Les échantillons sont incubés 2 h sur une plaque 96 puits préalablement tapissée par l'anticorps monoclonal anti-BDNF qui capture le BDNF mature et soluble présent dans les plasmas. Après 5 lavages au TBST (NaC1 150 mM, Tris-HC1 20 mM, Tween®20 0,05%; pH 7,6), la plaque est incubée 2 h en présence de l'anticorps polyclonal anti-BDNF humain. L'anticorps non fixé est éliminé par lavage des puits. La quantité de BDNF humain est détectée en utilisant un anticorps conjugué à une peroxydase et dirigé contre l'anticorps polyclonal humain. L'activité peroxydase est mesurée par l'addition d'un substrat chromogénique. Après 20 minutes d'incubation, la réaction est arrêtée par acidification et l'absorbance est mesurée à 450 nm, qui est proportionnelle à la quantité de BDNF présente dans les échantillons. La quantité de BDNF est calculée à partir des résultats d'une gamme étalon réalisée sur une solution BDNF standard dont la concentration initiale est connue. Résultats On observe une diminution du niveau de BDNF (Brain derived neurotrophic factor), mesuré par ELISA, chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Figure 4).

Exemple de mesure du niveau de APOD Méthode Le dosage d'APOD est réalisé par ELISA avec le « kit ELISA Bluegene » sur 50 pL de plasma dilué au demi dans du tampon fourni dans le kit. Les échantillons sont incubés 1 h sur une plaque 96 puits prétapissée avec un monoclonal anti APOD en présence de l'anticorps conjugué APOD-HRP. Après 5 lavages au TBST (NaC1 150 mM, Tris-HC1 20 mM, Tween®20 0,05%; pH 7,6. l'activité peroxydase est mesurée par l'addition d'un substrat chromogénique. Après 20 minutes d'incubation, la réaction est arrêtée par acidification et l'absorbance est mesurée à 450 nm, Elle est proportionnelle à la quantité d'APOD présente dans les échantillons. La quantité d' APOD est calculée à partir des résultats d'une gamme étalon réalisée sur une solution APOD standard dont la concentration initiale est connue. Résultats Pour l'apolipoprotein D (protéine APOD) la corrélation avec la quantité de DYRK1A est positive et on observe une diminution de la quantité d'ApoD chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Figure 5).

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic in vitro de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain caractérisée en ce qu'elle comprend l'analyse de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
2. 2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'analyse de DYRK1A comprend la détermination du niveau d'expression de DYRK1A.
3. 3. Méthode de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit sujet a la maladie d'Alzheimer si ledit niveau d'expression de DYRK1A est inférieur à un niveau d'expression de DYRK1A de référence.
4. 4. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre l'analyse d'au moins un des marqueurs choisi parmi Homocystéine, BDNF et APOD dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet.
5. 5. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle consiste en l'analyse : de DYRK1A; 25 de DYRK1A et du marqueur Homocystéine ; de DYRK1A et du marqueur BDNF; de DYRK1A et du marqueur APOD; de DYRK1A, du marqueur Homocystéine et du marqueur BDNF; de DYRK1A, du marqueur Homocystéine et du marqueur APOD; 30 de DYRK1A, du marqueur BDNF et du marqueur APOD; ou, de DYRK1A, du marqueur Homocystéine, du marqueur BDNF et du marqueur APOD ; dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet. 1. 2. 3. 4. 5.
6. 6. Méthode pour sélectionner un sujet humain pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer, comprenant : a) le diagnostic de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain selon la méthode de l'une des revendications 1 à 5, et ; b) si ledit sujet a la maladie d'Alzheimer, la sélection dudit sujet comme étant un sujet pouvant bénéficier d'un traitement de la maladie d'Alzheimer et/ou d'une surveillance médicale et/ou pouvant participer à une étude clinique sur un traitement thérapeutique de la maladie d'Alzheimer.
7. 7. Méthode de suivi de l'efficacité d'un traitement de la maladie d'Alzheimer chez un sujet humain, comprenant les étapes de : a) détermination d'un premier niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet avant l'administration dudit traitement ; b) détermination d'un deuxième niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum dudit sujet après un temps T suivant la première administration dudit traitement ; c) conclusion que ledit traitement est efficace chez ledit sujet si ledit niveau d'expression de DYRK1A de l'étape b) est supérieur audit niveau d'expression de DYRK1A de l'étape a).
8. 8. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un moyen nécessaire à la détermination du niveau d'expression de DYRK1A dans un échantillon de sang et/ou de plasma et/ou de sérum d'un sujet humain.
9. 9. Kit selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un moyen nécessaire à la détermination du taux du marqueur Homocystéine, du niveau d'expression du marqueur BDNF et/ou du niveau d'expression du marqueur APOD.5