EP1373906A1 - Methode de diagnostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin - Google Patents

Methode de diagnostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin

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Publication number
EP1373906A1
EP1373906A1 EP02753742A EP02753742A EP1373906A1 EP 1373906 A1 EP1373906 A1 EP 1373906A1 EP 02753742 A EP02753742 A EP 02753742A EP 02753742 A EP02753742 A EP 02753742A EP 1373906 A1 EP1373906 A1 EP 1373906A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pparγ
sample
patient
appropriate
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02753742A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Desreumaux
Jean-Frédéric COLOMBEL
Laurent Dubuquoy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre Hospitalier Universitaire de Lille CHU
Original Assignee
Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU filed Critical Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU
Publication of EP1373906A1 publication Critical patent/EP1373906A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the in vitro diagnosis of inflammatory bowel disease, such as Crohn's disease or ulcerative colitis, as well as the use of compounds, such as an antibody, ligand or nucleic probe capable of specifically recognize gene expression products
  • PPAR ⁇ for the preparation of a composition or a diagnostic kit for these diseases.
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • the diagnosis of IBD is based on a set of clinical, morphological and histological criteria. Lesions during CD can reach all segments of the digestive tract while UC affects only the colon. The existence of isolated colonic lesions therefore represents a delicate situation for diagnosing CD or UC or to differentiate IBD from other pathologies associated with intestinal inflammation such as, for example, bacterial, viral or parasite infections, or even vascular pathologies, pathologies secondary to taking medication, diverticulitis, etc.
  • Proliferator-Activated Receptor gamma on the cell surface of cells of the epithelium and / or cells of the lamina intestinal tissue was correlated with the diagnosis or prognosis of chronic inflammatory diseases of the intestine.
  • the inventors have also, and just as surprisingly, demonstrated that this rate of expression of PPAR ⁇ added to its distribution according to the cell type, epithelium cells and / or cells of the lamina intestinal, not only makes it possible to '' refine this diagnosis or prognosis, but also to diagnose or predict with precision the type of chronic inflammatory diseases of the intestine of the patient tested.
  • the receptor activated by PPAR ⁇ peroxisome proliferators is a receptor which controls the expression of a large number of genes involved in metabolism (Schoonjans, et al., Curr. Opin. Lipidol., 8: 159-166, 1997 1997 ).
  • activators of PPAR ⁇ limit the production of inflammatory mediators such as inflammatory cytokines produced by human macrophages-monocytes (Ricote, et al., Nature, 391: 79-82, 1998; Jiang, and al. Nature, 391: 82-86, 1998) and by intestinal epithelial cells (Lefebvre, et al., Endocrinology, 162: 331-340, 1999).
  • the present invention therefore relates to an in vitro method for the diagnosis or for the prognosis of an inflammatory bowel disease in a patient, characterized in that it implements a step of comparison of the quantity of product d expression of the gene coding for PPAR ⁇ in a sample of intestinal tissue, said sample comprising at least cells of the epithelium and / or of the intestinal lamina basement, relative to a control sample.
  • the present invention also relates to a method according to the invention, characterized in that said sample of intestinal tissue comprises at least cells of the epithelium and of the intestinal laminalitis and in that it further implements a step of comparing the distribution of the expression product of said PPAR ⁇ gene between said intestinal epithelium and laminalitis cells on the patient's sample.
  • the above diagnostic methods according to the invention are preferably characterized in that they comprise the steps of the methods defined below.
  • the present invention thus relates to an in vitro method for determining the quantity of expression product of the gene coding for PPAR ⁇ (PPAR ⁇ gene) on a sample of intestinal tissue, said sample comprising at least cells of the epithelium and / or intestinal lamina basement, characterized in that it comprises the following stages: a) the taking of a sample of intestinal tissue from a patient likely to have or progress to an inflammatory disease of the intestine, said sample comprising at least cells from the intestinal epithelium and / or laminalitis; b) bringing the expression product of the PPAR ⁇ gene into contact with a compound capable of binding specifically to said expression product of the PPAR ⁇ gene, under conditions allowing the formation of a complex between said compound and said expression product , said compound being labeled or capable of being labeled in order to obtain a signal representative of the quantity of said expression product present in the sample and, if necessary, making it possible to locate said expression product; and c) the quantification or display of the signal obtained in step b).
  • the present invention also comprises a method according to the invention, characterized in that said sample of intestinal tissue comprises at least cells of the intestinal epithelium and of the intestinal lamina basement, and in that it further implements a step for comparing the distribution of the expression product of said PPAR ⁇ gene between said intestinal epithelium and lamina propria cells on the patient's sample.
  • said sample is a biopsy of intestinal tissue removed from the patient's colon or small intestine, especially intestinal tissue removed from the patient's colon.
  • any conventional procedure or test can be used to result in step b) of said methods in obtaining a detectable and / or quantifiable signal representative of the quantity of said expression product.
  • the polypeptide corresponding to the translation product of said PPAR ⁇ gene in particular by the so-called “Western blot” method or by immunohistochemistry well known to man of the art, or its transcription product (mRNA) encoding said PPAR ⁇ receptor, in particular by the so-called in situ hybridization method also well known to those skilled in the art, methods which will not be developed in the present description.
  • the method according to the invention is characterized in that said expression product of said PPAR ⁇ gene is the translation product of said PPAR ⁇ gene, and in that the compound capable of specifically binding to said product d expression of the PPAR ⁇ gene in step b) is chosen from the following compounds: - a monoclonal or polyclonal antibody, if appropriate labeled, directed against the PPAR ⁇ receptor, or one of its fragments; and
  • PPAR ⁇ receptor a natural or synthetic agonist or antagonist ligand, if appropriate labeled, of the PPAR ⁇ receptor.
  • translation product of said PPAR ⁇ gene is meant in particular the polypeptide corresponding to the PPAR ⁇ receptor expressed by the intestinal mucosa, in particular on the surface of the cells of the intestinal epithelium and lamina propria.
  • the amino acid sequence of the human PPAR ⁇ receptor is in particular described in the document US Pat. No. 5,861,274 (SEQ LD No. 2).
  • SEQ LD No. 2 The amino acid sequence of the human PPAR ⁇ receptor is in particular described in the document US Pat. No. 5,861,274 (SEQ LD No. 2).
  • SEQ LD No. 2 The amino acid sequence of the human PPAR ⁇ receptor is in particular described in the document US Pat. No. 5,861,274 (SEQ LD No. 2).
  • SEQ LD No. 2 amino acid sequence of the human PPAR ⁇ receptor
  • the monoclonal or polyclonal antibodies which can be used in the methods according to the invention can be obtained for example from the cell of an animal immunized against the PPAR ⁇ protein, or one of its fragments comprising the specific epitope (determinant of the protein responsible for the specific interaction with the antibody).
  • Said PPAR ⁇ receptor protein, or a fragment thereof may in particular be produced, according to the usual procedures, by genetic recombination from a nucleic acid sequence contained in the cDNA sequence coding for the PPAR ⁇ receptor protein, or by peptide synthesis from an amino acid sequence included in the peptide sequence of the OZF protein.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments according to the invention comprise any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to the epitope of the PPAR ⁇ protein on which the monoclonal or polyclonal antibody from which said fragment is derived is attached.
  • fragments include in particular monoclonal or polyclonal single chain antibodies or monovalent fragments Fab or Fab 'and divalent fragments such as F (ab') 2, which have the same binding specificity as the monoclonal antibody of which they are from.
  • a fragment according to the invention may also be a single chain Fv fragment produced by methods known to those skilled in the art and as described for example by Skerra, et al., Science, 240: 1038-1041, 1988 and King et al., Biochemical J., 290: 723-729, 1991.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments of the invention can be obtained from the monoclonal or polyclonal antibodies as described above by methods such as digestion with enzymes, such as pepsin or papain and / or by cleavage of the bridges disulfides by chemical reduction.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments can be synthesized by automatic peptide synthesizers such as those supplied by the company Applied Biosystems, etc., or can be prepared manually using techniques known to man. of art and as described for example by Geysen, et al., J. rmmunol. Methods, 102: 259-274, 1978.
  • the monoclonal or polyclonal antibodies, or their fragments, as well as the specific ligands capable of binding specifically to said translation product can also, according to the invention, be in marked form in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the antibodies, or their fragments, or said labeled ligands according to the invention include for example antibodies or ligands called immunoconjugates which can be conjugated for example with enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetyl cholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 phosphate dehydrogenase or by a molecule such as biotin, digoxigenin or 5-bromo-deoxyuridine.
  • enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetyl cholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 phosphate dehydrogenase or
  • Fluorescent markers can also be conjugated to antibodies, or their fragments, or to said ligands, and include in particular fluorescein and its derivatives, fluorochrome, rhodamine and its derivatives, GFP (GFP for "Green Fluorescent Protein”), dansyl , umbelliferone, etc.
  • fluorescein and its derivatives fluorochrome, rhodamine and its derivatives
  • GFP GFP for "Green Fluorescent Protein”
  • dansyl dansyl
  • umbelliferone etc.
  • the antibodies, or their fragments, or the said ligands can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • conjugates comprising markers of fluorescein type can be prepared by reaction with an isothiocyanate.
  • conjugates can also include chemiluminescent markers such as luminol and dioxetanes or bioluminescent markers such as luciferase and luciferin.
  • any conventional procedure or test can be implemented to result in step b) of said methods in obtaining a detectable and / or quantifiable signal representative of the quantity of said product of expression present in the sample, in particular by “Western blot” or by immunohistochemistry.
  • the specific complex formed between the translation product of the PPAR ⁇ gene with a compound capable of binding specifically to said translation product may result from the contacting of an antibody, or one of its fragments, or of a ligand specific for the PPAR ⁇ receptor with said translation product.
  • said test can be a competition or sandwich test, or any test known to those skilled in the art dependent on the formation of an antibody-antigen or ligand-receptor immune complex.
  • the antibody, or one of its fragments, or the ligand can also be immobilized.
  • This immobilization can be carried out on numerous supports known to those skilled in the art. These supports may in particular include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, or natural or modified celluloses. These supports can be either soluble or insoluble. Mention may in particular be made of solid supports such as polystyrene beads, microtiter plates, which are well known in the field of immunoassays and which will not be developed in the present description.
  • a preferred method involves immunoenzymatic processes according to the ELISA technique, by immunofluorescence or immunoluminescence, or radioimmunological (RIA), gold labeling or equivalent.
  • the specific techniques and reagents enabling the detection, identification, localization and / or assay of the antigen-antibody or ligand-receptor complexes which can be used in the methods of the invention, may of course be associated, in the case where the antibodies or ligands participating in the complex are not already immunoconjugated or labeled, with the appropriate reagents.
  • These suitable reagents will be, for example, immunoconjugated or labeled antibodies, as described above, capable of specifically recognizing the antibodies or ligands participating in said complex.
  • the chromogenic substrates specific for the conjugated enzymes and the control reagents with positive, negative and quantitative control will also be associated with these techniques or reagents.
  • natural or synthetic agonist or antagonist ligand" of the PPAR ⁇ receptor is meant herein any compound other than an anti-PPAR ⁇ antibody capable of binding specifically to the PPAR ⁇ receptor.
  • agonist or antagonist ligands those chosen from natural agonists of the prostaglandin J2 type, polyunsaturated fatty acids and synthetic agonists of the thiazolinedione type are preferred.
  • the method according to the invention is of the “Western blot” type and is characterized in that, before step b):
  • step b) the total proteins are extracted from the sample taken; then - separated and transferred to membrane (Western blot); and in that in step c), the signal obtained in step b) is quantified.
  • the separation will be carried out in particular by electrophoresis in acrylamide gel (PAGE), the transfer being carried out on membranes well known to those skilled in the art such as, in particular, nitrocellulose or PNDF membranes.
  • PAGE acrylamide gel
  • the method according to the invention is of the “immunohistochemistry” type and is characterized in that prior to step b):
  • a histological section is made of the sample taken, said sample having been, if necessary, fixed in a solution of paraformaldehyde or formaldehyde (at about 4%) and included in paraffin; and in that in step c), the signal obtained in step b) is displayed.
  • the samples taken having been previously fixed in a solution of paraformaldehyde or formaldehyde and included in paraffin, may have been stored for several days or less at 4 ° C or in frozen form.
  • the method according to the invention is characterized in that said expression product of said PPAR ⁇ gene is the AR ⁇ m transcription product of said PPAR ⁇ gene and in that the compound capable of binding specifically to said expression product of PPAR ⁇ gene in step b) is chosen from nucleic acid sequences, where appropriate labeled, capable of hybridizing specifically (under conditions of high stringency) with a fragment of said AR ⁇ m.
  • the so-called in situ hybridization method well known to those skilled in the art is preferred.
  • nucleic acid sequences capable of hybridizing specifically (under conditions of high stringency) with a fragment of said mRNA will be probes, preferably labeled, or oligonucleotide primers.
  • Said probes or primers can for example be drawn from the sequence SEQ ID No. 1 as described in application US 5,861,274 (cDNA coding for the PPAR ⁇ receptor).
  • Specific hybridization means that the hybridization is carried out under conditions of high stringency, in particular under conditions of temperature and ionic strength such that they allow hybridization to be maintained between two globally complementary DNA fragments.
  • Hybridization is carried out at a preferred temperature of 65 ° C., in the presence of a 6 ⁇ SSC buffer, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of DNA from salmon sperm.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05 M sodium citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin.
  • the washing steps can, for example, be carried out for 5 to 30 min. at 65 ° C, in 2 x SSC or 1 x SSC buffer and 0.1% SDS.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size will be adapted by those skilled in the art for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook, J., et al., Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
  • the oligonucleotide probes or primers, and in general the nucleic acid sequences according to the invention will have a minimum size of 15 bases and fragments of at least minus 20, 25, 30 or 50 bases.
  • the detection, localization (distribution) and / or specific assay of the mRNA of the PPAR ⁇ gene in the biological sample will include the following steps for in situ hybridization (steps b) and c) of the methods according to the invention. 'invention):
  • the quantification of the mRNA of the PPAR ⁇ gene in the prepared extract comprises the following steps of the so-called quantitative RT-PCR method (steps b) and c) of the methods according to the invention):
  • PCR polymerase chain reaction
  • Another method can also be cited for carrying out the quantification of the mRNA of the PPAR ⁇ gene from a total RNA extract from the sample taken, optionally enriched in mRNA, said method comprising the following steps (steps b ) and c) methods according to the invention):
  • a first oligonucleotide probe specific for the mRNA of the PPAR ⁇ gene or, where appropriate, its amplification products immobilized on a support with an extract of the total RNA from the sample, into contact, or , if necessary, with the PCR products of the mRNA of the PPAR ⁇ gene obtained using primers specific, under conditions allowing hybridization of the first probe to the RNA of said sample or, where appropriate, to said PCR products;
  • a second oligonucleotide probe in particular labeled capable of hybridizing to the mRNA of the PPAR ⁇ gene or, where appropriate, to its PCR products, then elimination of the second probes which have not hybridized;
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • TAS Transcription based Amplification System
  • LCR Low Density based Amplification System
  • ERA Long Term Evolution based Amplification System
  • CPR Cycling Probe Reaction
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • the nucleic acid quantification techniques in which, for example, the nucleic acid to be quantified is amplified by a PCR type method and in the presence of a standard nucleic acid of the same size and quantity. known and capable of hybridizing to the same primers as the target nucleic acid.
  • the invention also comprises a method according to the invention, characterized in that the quantification or visualization (the image) of the signal obtained in step b) is compared, and where appropriate, the distribution of the product.
  • said control sample is a sample of intestinal tissue taken from a healthy patient or suffering from an inflammatory disease known bowel disease, preferably chosen from Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC).
  • the present invention very particularly and very preferably relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) in a patient likely to have or progress to an inflammatory bowel disease from a histological section of a sample of intestinal tissue previously taken from this patient, said sample comprising at least cells of the intestinal epithelium, characterized in that it comprises the following step: a) contact of said histological section with a compound capable of specifically binding to the translation product of the PPAR ⁇ gene, under conditions allowing the formation of a complex between said compound and said translation product, said compound being labeled or capable of being labeled in order to obtain a marking or a signal representative of the quantity of said translation product present in the sample and, l e if necessary, making it possible to locate said translation product of the PPAR ⁇ gene; and b) quantifying or visualizing the intensity of the marking or of the signal obtained in step a) at the level of the cells of the intestinal epithelium.
  • UC ulcerative colitis
  • UC ulcerative colitis
  • the inventors have been able to demonstrate for the first time that only the observation of the expression deficit of the translation product of the PPAR ⁇ gene in the cells of the intestinal epithelium made it possible to carry out such a specific and also sensitive diagnosis.
  • Such a diagnostic test carried out by immunohistochemistry can be easily exploited commercially, little expensive, this compared to a test carried out by quantitative PCR or Western Blot where it will be necessary to isolate the cells of the intestinal epithelium from the sample taken to avoid any contamination with neighboring non-epithelial cells in the sample.
  • any presence of non-epithelial cells during the total extraction of the mRNA coding for PPAR ⁇ (for the PCR test) or during the extraction of the total proteins (for the Western Blot test) will likely increase the quantity of a transcripton or translation product of the PPAR ⁇ gene.
  • Such prior isolation of the cells of the intestinal epithelium from the sample taken in an attempt to carry out a test by quantitative PCR or by Western blot making it possible to diagnose ulcerative colitis (UC) in a patient with the sensitivity and specificity that l 'can be obtained by immunohistochemistry is difficult to perform and can be considered commercially.
  • UC ulcerative colitis
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) according to the present invention, characterized in that the quantification or the visualization of the signal intensity obtained at l step a) is compared to that obtained for a histological section obtained from a sample of a healthy patient.
  • UC ulcerative colitis
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) according to the present invention, characterized in that in step b), the case is observed if necessary, a reduction in the intensity of the marking or of the signal obtained in step a) in the cells of the intestinal epithelium originating from the sample of the patient likely to have one or to evolve towards a inflammatory bowel disease compared to those from a healthy patient sample.
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) according to the present invention, characterized in that said sample is a biopsy of intestinal tissue taken from the colon or the patient's small intestine.
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) according to the present invention, characterized in that said sample is a biopsy of intestinal tissue taken from the colon of the patient.
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC according to the present invention, characterized in that said sample of the patient likely to have one or more '' progressing to inflammatory bowel disease is a sample of intestinal tissue taken from the patient's healthy or injured mucosa.
  • the invention relates to an in vitro method of diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis
  • step a) characterized in that said compound capable of binding specifically to said translation product of the PPAR ⁇ gene in step a) is chosen from the following compounds:
  • PPAR ⁇ receptor a natural or synthetic agonist or antagonist ligand, if appropriate labeled, of the PPAR ⁇ receptor.
  • the invention in another aspect, relates to a diagnostic composition, characterized in that it comprises a monoclonal or polyclonal antibody, optionally labeled, directed against the PPAR ⁇ receptor.
  • the invention further relates to a diagnostic composition, characterized in that it comprises a natural or synthetic agonist or antagonist ligand, optionally labeled, of the PPAR ⁇ receptor, said ligands preferably being chosen from those mentioned above.
  • the invention further relates to a diagnostic composition, characterized in that it comprises a nucleic sequence, optionally labeled, capable of hybridizing specifically with a fragment of the mRNA or of the cDNA coding for the PPAR ⁇ receptor, preferably comprising at least 15, 20, 25, 30, 50 or 75 bases.
  • the subject of the present invention is the use of a compound chosen from:
  • a natural or synthetic agonist or antagonist ligand if appropriate labeled, of the PPAR ⁇ receptor; or a nucleic sequence, if appropriate labeled, capable of hybridizing specifically with a fragment of the mRNA or of the cDNA coding for the PPAR ⁇ receptor, for the preparation of a composition intended for the diagnosis or prognosis of inflammatory disease of the gut in a patient.
  • the use according to the invention is characterized in that said inflammatory bowel disease is a chronic disease, in particular Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC).
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • the use according to the invention is characterized in that said inflammatory bowel disease is an acute disease of the intestine in a patient.
  • the present invention relates to the use of a compound chosen from:
  • kits or kits for the diagnosis of inflammatory bowel disease, especially chronic disease such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are advantageously part of the invention.
  • the present invention thus relates in a last aspect to a kit or necessary for the diagnosis or prognosis of inflammatory bowel disease in a patient, characterized in that it comprises: a) at least one of the compounds chosen from following compounds:
  • a nucleic sequence capable of hybridizing specifically with a fragment of the ⁇ RNm coding for the PPAR ⁇ receptor; b) where appropriate, the reagents for constituting the medium conducive to the formation of a complex between said compound as defined in a) and an expression product of the PPAR ⁇ gene; c) where appropriate, the reagents for the quantification or visualization of complexes possibly formed between said compound as defined in a) and an expression product of the PPAR ⁇ gene; d) if appropriate, a control sample, preferably an extract of total proteins from a sample of intestinal tissue or a section of intestinal tissue taken from a healthy patient and / or from a patient suffering from an inflammatory disease of the intestine of known type.
  • the present invention relates preferably to a kit or kit necessary for the diagnosis by immunohistochemistry of ulcerative colitis (UC) in a patient likely to have or progress to an inflammatory bowel disease, characterized in that it comprises: a) at least one of the compounds chosen from the following compounds:
  • a natural or synthetic agonist or antagonist ligand, if appropriate labeled, of the PPAR ⁇ receptor and b) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for the formation of a complex between said compound as defined in a) and the translation product of the PPAR ⁇ gene; c) where appropriate, the reagents allowing the quantification or visualization of complexes possibly formed between said compound as defined in a) and the translation product of the PPAR ⁇ gene; d) where appropriate, a control histological section of intestinal tissue removed from a healthy patient and / or from a patient suffering from an inflammatory bowel disease of known type, on which which histological control sections, if any, the immunohistochemistry labeling of the translation product of the PPAR ⁇ gene has been carried out beforehand; e) if applicable, an explanatory note showing images of histological sections obtained after immunohistochemical labeling of the gene translation product PPAR ⁇ for histological sections of intestinal tissue from samples of healthy patients, patients with ulcerative co
  • kits or kits necessary for the diagnosis of inflammatory bowel disease may also include an explanatory notice indicating to the user the levels and / or distribution of expression products of the PPAR ⁇ gene expected for samples of samples from a healthy patient suffering from inflammatory bowel disease, in particular chronic disease such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC), as indicated in FIGS. 1A, 1B, 2A and 2B below.
  • chronic disease such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC)
  • FIG. 1A represents a Western blot produced for a protein extract obtained from a biopsy of a healthy patient (control, three representative patients), of a patient suffering from Crohn's disease (noted CD or MC, three representative patients) or suffering from ulcerative colitis hemorrhagic (noted UC or RHC, three representative patients).
  • This Western blot highlights a decrease in the intensity of the band corresponding to the PPAR ⁇ protein (by approximately 53 kDa) for patients with Crohn's disease compared to the healthy control, a decrease which is even more accentuated for the patients. with ulcerative colitis.
  • FIG. 1B represents for each sample tested (18 for the samples of healthy patient (control), 18 for the samples of patient suffering from CD and 15 for the samples of patient suffering from UC), the quantity of protein PPAR ⁇ expressed, quantity expressed in optical density for 50 ⁇ g of total protein.
  • Figures 2A. 2B and 2C FIGS. 2A to 2C represent a histological section resulting from an intestinal biopsy performed at the level of the colon in which the PPAR ⁇ receptors have been immunolabeled.
  • FIG. 2A represents the histological section of a healthy patient (control), FIG. 2B, that of a patient suffering from CD and FIG. 2C, that of a patient suffering from UC.
  • control control
  • FIG. 2B that of a patient suffering from CD
  • FIG. 2C that of a patient suffering from UC.
  • - Figure 2A a high density of labeling on epithelial cells for the control sample with a low density of labeling for cells of the lamina propria
  • - Figure 2B a high density of labeling on epithelial cells, with a decrease in the intensity of labeling, as well as a high density of labeling on cells of the lamina propria;
  • Total protein extracts are obtained by homogenization of colon biopsies in a lysis buffer consisting of PBS (phosphate buffer in saline solution) with 1% NP-40 (TM Nonidet P40), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate and a classic cocktail of protease inhibitors (Fajast, L., et al., J. Biol. Chem., 272: 18779-18789, 1997).
  • Example 2 Immunolabelling of PPAR ⁇ in the colon The colon biopsies are fixed in 4% paraformaldehyde, included in the paraffin and cut to 4 micrometers for immunohistochemistry and immunofluorescence.
  • the sections are preincubated for 30 minutes at room temperature in a blocking solution containing Pavidine D and biotin (TM Blocking Kit, SP2001, Nector Laboratories, Burlingame, CA, USA). They are then exposed to a polyclonal rabbit antiserum directed against PPAR ⁇ (dilution 1/50, WAK-CHEMIE, Bad Soden, Germany) for two hours at room temperature.
  • the sections are washed in PBS containing 0.05% of Triton X-100 TM and incubated with a secondary goat anti-rabbit antibody biotinylated (dilution 1 / 500th for 30 minutes, Dako, Trappes, France).
  • the immune complex is detected by avidin-biotin coupled with peroxidase
  • the immunohistochemistry technique highlights a gain in expression of the PPAR ⁇ receptor at the level of the lamina limba cells, while the expression at the level of these cells does not appear or only very weakly for the CHR. or for healthy patients.
  • the detection of PPAR ⁇ in the colonic mucosa is a new marker enabling rapid diagnosis of UC and / or CD. This detection is possible by performing biopsies made in healthy or injured mucosa during an endoscopic examination which can be limited to the exploration of the first 20 cm of the colon at the level of the rectum and sigmoid.
  • - biopsies can be performed both in healthy mucosa and injured mucosa, during periods of quiescence or disease outbreak;
  • the invention also relates to a diagnostic device comprising means suitable for implementing the various steps of the method described above.

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Abstract

la présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladies de Crohn ou la rectocolite hémorragique ainsi que l'utilisation de composés, tels qu'un anticorps, ligand ou sonde nucléique capable de reconaître spécifiquement les produits d'expression du gène PPAR gamma pour la préparation de composition ou de kit de diagnostic de ces maladies.

Description

METHODE DE DIAGNOSTIC DE MALADIES INFLAMMATOIRES CHRONIQUES DE L'INTESTIN
La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ainsi que l'utilisation de composés, tels qu'un anticorps, ligand ou sonde nucléique capable de reconnaître spécifîquemment les produits d'expression du gène
PPARγ pour la préparation de composition ou de kit de diagnostic de ces maladies.
La maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) sont des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) frappant avec prédilection l'adulte jeune, évoluant par poussées entrecoupées de périodes de rémission. Elles constituent un des problèmes majeurs de l iépato-gastro-entérologie. En effet, ces maladies frappent des sujets jeunes et sont d'évolution chronique ou prolongée, potentiellement sur toute la vie. Ces maladies peuvent toucher tout le tube digestif, de la bouche à l'anus. Ces maladies retentissent également fréquemment sur la vie personnelle et professionnelle par la fréquence des poussées, les complications et le recours parfois nécessaire à la chirurgie. Leur cause n'étant pas connue, ces maladies n'ont pas de traitement curatif. Même s'il est efficace dans l'immédiat, le traitement médical n'a qu'un effet suspensif. De plus, le coût d'un tel traitement médical suspensif, déjà élevé, va croissant avec les nouveaux médicaments. La prévalence des MICI augmente en raison d'une incidence croissante jusque dans les années 70 et stable depuis. Sur la base des chiffres d'incidence de 1991 et de la médiane de survie estimée, on a ainsi estimé qu'en l'année 2005, parmi 232 millions d'américains de race blanche, 580 000 seront atteints de MC et 742 000 de RCH.
En France, les données du registre EPIMAD du Nord-Ouest du pays, montrent une incidence stable depuis 1988 des MICI : 5,6 pour la MC et 3,5 pour la RCH. En utilisant les mêmes règles de calcul qu'aux Etats-Unis, on aboutit à un chiffre attendu en France de 120 000 MC et de 80 000 RCH en 2005.
Le diagnostic des MICI repose sur un ensemble de critères cliniques, morphologiques et histologiques. Les lésions au cours de la MC peuvent atteindre tous les segments du tube digestif alors que la RCH touche uniquement le côlon. L'existence de lésions coliques isolées représente donc une situation délicate pour poser le diagnostic de MC ou de RCH ou pour différencier une MICI d'autres pathologies associée à une inflammation intestinale telle que par exemple les infections bactériennes, virales ou par des parasites, ou encore les pathologies vasculaires, pathologies secondaires à la prise de médicaments, diverticulite, etc..
Face à la difficulté d'établir le diagnostic de MC ou de RCH, le développement de nouveaux marqueurs de diagnostic présente un intérêt fondamental qui permettra d'améliorer la prise en charge des patients.
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de pouvoir disposer d'un marqueur efficace et fiable des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, un tel marqueur devant être de préférence d'utilisation aisée et peu coûteuse.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Par des techniques de Western blot et d'immuno-histochimie, les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante un déficit de l'expression du récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARγ dans la muqueuse colique de patients atteints de RCH.
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante que le taux d'expression du gène codant pour le récepteur PPARγ (PPARγ pour « Peroxysome
Proliferator-Activated Receptor gamma) à la surface cellulaire de cellules de l'épithélium et/ou de cellules de la lamina propria du tissu intestinal était corrélé au diagnostic ou au pronostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Les inventeurs ont également, et de manière tout aussi surprenante, mis en évidence que ce taux d'expression de PPARγ ajouté à sa répartition suivant le type cellulaire, cellules de l'épithélium et/ou cellules de la lamina propria, permettait non seulement d'affiner ce diagnostic ou pronostic, mais également de diagnostiquer ou pronostiquer avec précision le type de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin du patient testé.
Le récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARγ est un récepteur qui contrôle l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans les métabolismes (Schoonjans, et al., Curr. Opin. Lipidol., 8:159-166, 1997 1997). Des études in vitro ont déjà montré que des activateurs de PPARγ limitent la production de médiateurs inflammatoires tels que les cytokines inflammatoires produites par les macrophages-monocytes humains (Ricote, et al., Nature, 391:79-82, 1998 ; Jiang, et al., Nature, 391:82-86, 1998) et par les cellules épithéliales intestinales (Lefebvre, et al., Endocrinology, 162:331-340, 1999). L'utilité in vivo des agonistes de PPARγ a également été décrite pour le traitement de colites induites chez les souris par l'administration de sulfate de dextran sodique (Su, et al., J. Clin. Invesi, 104:383-9, 1999), ou d'acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (Dubuquoy et al., Gastroenterol. Clin. Biol., 24:719-24, 2000).
On peut également citer :
- le document brevet US 5,861,274 publié le 19 Janvier 1999 qui décrit la séquence nucléique et peptidique du récepteur PPARγ humain ; - la publication de Desreumaux et al., 1999 (Gastroenterology, 117, 1, 73-81, 1999) qui décrit une expression aberrante de PPARγ dans le tissu adipeux mésentérique de patients atteints de MC et d'un défaut de régulation de PPARγ par le TNFα au niveau de l'adipocyte ;
- la publication de Lefebvre et al., 1999 (J. of Endocrinology, 162, 3, 331-340,1999) qui décrit l'expression de PPARγ au niveau du tube digestif chez la souris et l'homme ;
- la publication de Su Chinyu et al., 1999 (J. of Clinical Investigation, 104, 4, 383-389, 1999) qui décrit le rôle anti-inflammatoire des agonistes de PPARγ in vitro et in vivo dans un modèle expérimental de colite chez la souris induit par le dextran sodium sulfate ; - le document brevet 6,166,049 publié le 26 décembre 2000, qui décrit l'utilisation d'agonistes de PPARγ dans le traitement ou la prévention du syndrome X ; et enfin
- les deux documents Hafraoui et al., 1999 ( Gastroenterology, 116, 4, Part. 2, page A689, 1999 et Immunology Letters, 69, 1, 161-162, 1999) qui décrivent une différence d'expression de l'ARNm de PPARγ au cours de la RCH vs la MC et des patients contrôles par PCR quantitative.
La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro pour le diagnostic ou pour le pronostic d'une maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étape de comparaison de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARγ dans un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinal, par rapport à un échantillon de contrôle. La présente invention est également relative à un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinal et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARγ entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient.
Les procédés de diagnostic ci-avant selon l'invention, sont de préférence caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes des procédés ci-après définies.
La présente invention concerne ainsi un procédé in vitro de détermination de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARγ (gène PPARγ) sur un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon de tissu intestinal chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, ledit prélèvement comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux ; b) la mise en contact du produit d'expression du gène PPARγ avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit d'expression, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un signal représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit d'expression ; et c) la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b).
La présente invention comprend également un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux, et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARγ entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient. De manière préférée, ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient, notamment de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient.
Dans les procédés selon la présente invention, toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour aboutir à l'étape b) desdits procédés à l'obtention d'un signal détectable et/ou quantifiable représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon, en fonction du produit d'expression recherché, de préférence le polypeptide correspondant au produit de traduction dudit gène PPARγ, notamment par la méthode dite de « Western blot » ou par immunohistochimie bien connue de l'homme de l'art, ou à son produit de transcription (ARNm) codant pour ledit récepteur PPARγ, notamment par la méthode dite d'hybridation in situ également bien connue de l'homme de l'art, méthodes qui ne seront pas développées dans la présente description. On pourra néanmoins se référer aux exemples ci-après pour la méthode dite de « Western blot » ou par immunohistochimie. Dans un mode de réalisation particulèrement préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARγ est le produit de traduction dudit gène PPARγ, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ à l'étape b) est choisi parmi les composés suivants : - un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ, ou un de ses fragments ; et
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ.
Par «produit de traduction dudit gène PPARγ », on entend désigner en particulier le polypeptide correspondant au récepteur PPARγ exprimé par la muqueuse intestinale, notamment à la surface des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux.
La séquence d'acides aminés du récepteur PPARγ humain est en particulier décrite dans le document brevet US 5,861,274 (SEQ LD No. 2). En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments dirigés contre le récepteur PPARγ, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein, Nature, 256:495- 497, 1975.
Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine PPARγ, ou un de ses fragments comportant l'épitope spécifique (déterminant de la protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps).
Ladite protéine récepteur PPARγ, ou un de ses fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour la protéine récepteur PPARγ, ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine OZF.
Les fragments d'anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitope de la protéine PPARγ sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux ou polyclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra, et al., Science, 240:1038-1041, 1988 et King et al., Biochemical J., 290:723-729, 1991.
Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen, et al., J. rmmunol. Methods, 102:259-274, 1978. Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux, ou leurs fragments, ainsi que les ligands spécifiques capables de se fixer spécifiquement audit produit de traduction peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme marquée afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Les anticorps, ou leurs fragments, ou lesdits ligands marqués selon l'invention incluent par exemple des anticorps ou ligands dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la β-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, Panhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose- 6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps, ou leurs fragments, ou auxdits ligands, et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone, etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps,ou leurs fragments, ou lesdits ligands peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylène-triaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate, etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.
Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou polyclonal, ou un de leurs fragments, ou sur lesdits ligands, on peut citer également les marqueurs radioactifs qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations, par autoradiographie, etc.. Dans les procédés selon la présente invention, toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour aboutir à l'étape b) desdits procédés à l'obtention d'un signal détectable et/ou quantifiable représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon, notamment par « Western blot » ou par immunohistochimie.
Dans ces techniques dites de « Western blot » ou d'immunohistochimie, le complexe spécifique formé entre le produit de traduction du gène PPARγ avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit produit de traduction pourra résulter de la mise en contact d'un anticorps, ou l'un de ses fragments, ou d'un ligand spécifique du récepteur PPARγ avec ledit produit de traduction.
Dans une telle détection et/ou quantification, ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène ou ligand-récepteur.
L'anticorps, ou l'un de ses fragments, ou le ligand peut être également immobilisé. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. On peut citer notamment les supports solides tels que des billes de polystyrène, les plaques de microtitration, qui sont bien connus dans le domaine des immunodosages et qui ne seront pas développés dans la présente description.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence ou immunoluminescence, ou radio-immunologique (RIA), marquage à l'or ou équivalent.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps ou ligand-récepteur que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, pourront bien entendu être associées, dans le cas où les anticorps ou ligands participant au complexe ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés. Ces réactifs appropriés seront par exemple des anticorps immunoconjugués ou marqués, comme ci- avant décrits, capables de reconnaître spécifiquement les anticorps ou ligands participant audit complexe. Seront également associés à ces techniques ou réactifs les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif. Par "ligand agoniste ou antagoniste naturel ou synthétique", du récepteur PPARγ, on entend désigner ici tout composé autre qu'un anticorps anti-PPARγ capable de se fixer spécifiquement sur le récepteur PPARγ.
Parmi ces ligands agonistes ou antagonistes, on préfère ceux choisis parmi les agonistes naturels de type prostaglandine J2, acides gras polyinsaturés et les agonistes synthétiques de type thiazolinédione.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est de type « Western blot » et est caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) :
- les protéines totales sont extraites de l'échantillon prélevé ; puis - séparées et transférées sur membrane (Western blot) ; et en ce que à l'étape c), on quantifie le signal obtenu à l'étape b).
La séparation sera notamment réalisée par éléctrophorèse en gel d'acrylamide (PAGE), le transfert étant réalisé sur des membranes bien connues de l'homme de l'art comme en particulier les membranes de nitrocellulose ou PNDF. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention est de type « immunohistochimie» et est caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) :
- on réalise une coupe histologique de l'échantillon prélevé, ledit échantillon prélevé ayant été, le cas échéant, fixé dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde (à environ 4 %) et inclus dans de la paraffine ; et en ce que à l'étape c), on visualise le signal obtenu à l'étape b). Les échantillons prélevés ayant été au préalable fixés dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde et inclus dans de la paraffine, pourront avoir été stockés plusieurs jours ou moins à 4°C ou sous forme congelée. Sous un autre aspect, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARγ est le produit de transcription ARΝm dudit gène PPARγ et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ à l'étape b) est choisi parmi les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement (dans des conditions de forte stringence) avec un fragment dudit ARΝm. Parmi les méthodes permettant de détecter (ou localiser) et/ou de quantifier l'ARNm du gène PPARγ, on préfère la méthode dite d'hybridation in situ bien connue de l'homme de l'art.
Les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement (dans des conditions de forte stringence) avec un fragment dudit ARNm seront des sondes, de préférence marquées, ou des amorces oligo-nucléotidiques.
Lesdites sondes ou amorces pourront être par exemple dessinées à partir de la séquence SEQ ID No. 1 telle que décrite dans la demande US 5,861,274 (ADNc codant pour le récepteur PPARγ). Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de forte stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon. 1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo- nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook, J., et al., Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 15 bases et on préférera des fragments d'au moins 20, 25, 30 ou 50 bases. Les techniques permettant de quantifier et/ou de localiser une séquence nucléique et que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et ne seront pas développées de manière exhaustive ici. On peut citer, sans s'y limiter les techniques décrites ci-après. En général, la détection, localisation (répartition) et/ou le dosage spécifique de l'ARNm du gène PPARγ, dans l'échantillon biologique comprendra les étapes suivantes pour l'hybridation in situ (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) :
- la mise en contact d'une sonde oligonucléotidique, le cas échéant marquée, avec l'échantillon biologique, l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique ;
- la détection, localisation et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ARNm de l'échantillon biologique.
Dans le cas où l'on réalise la quantification de l'ARNm du gène PPARγ à partir d'un exrait d'ARN total de l'échantillon prélevé, le cas échéant enrichi en ARNm, en général, la quantification de l'ARNm du gène PPARγ dans l'extrait préparé comprend les étapes suivantes de la méthode dite de RT-PCR quantitative (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) :
- l'obtention d'un ADNc à partir de l'ARNm du gène PPARγ au moyen d'amorces spécifiques et d'une transcriptase inverse ;
- l'amplification spécifique de l'ADNc PPARγ obtenu par une méthode dite de PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou PCR apparentée à l'aide d'un couple d'amorces spécifique ;
- l'analyse quantitative des produits d'amplification. On peut également citer une autre méthode pour réaliser la quantification de l'ARNm du gène PPARγ à partir d'un exrait d'ARN total de l'échantillon prélevé, le cas échéant enrichi en ARNm, ladite méthode comprenant les étapes suivantes (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) :
- la mise en contact d'une première sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm du gène PPARγ ou, le cas échéant, de ses produits d'amplification, immobilisée sur un support avec un extrait de l'ARN total de l'échantillon, ou, le cas échéant, avec les produits PCR de l'ARNm du gène PPARγ obtenus à l'aide d'amorces spécifiques, dans des conditions permettant l'hybridation de la première sonde à l'ARN dudit échantillon ou, le cas échéant, auxdits produits PCR ;
- la mise en contact de l'hybride formé entre ladite première sonde immobilisée sur un support et lesdits ARNs ou, le cas échéant, lesdits produits PCR, le cas échéant après élimination des acides nucléiques n'ayant pas hybride avec la première sonde, avec une deuxième sonde oligonucléotidique, notamment marquée capable de s'hybrider à l'ARNm du gène PPARγ ou, le cas échéant, à ses produits PCR, puis élimination des deuxièmes sondes n'ayant pas hybride ; et
- l'analyse quantitative des triplex ainsi formés. Par « PCR apparentée » on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général, il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA « Nucleic Acid Séquence Based Amplification », TAS « Transcription based Amplification System », LCR « Ligase Chain Reaction », « Endo Run Amplification » (ERA), « Cycling Probe Reaction » (CPR), et SDA « Strand Displacement Amplification » bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible. L'invention comprend en outre un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que l'on compare la quantification ou la visualisation (l'image) du signal obtenu à l'étape b), et le cas échéant, la distribution du produit d'expression dudit gène PPARγ entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient avec celles obtenues pour un échantillon témoin (ou contrôle). Dans un mode de réalisation préféré, ledit échantillon témoin est un échantillon de tissu intestinal prélevé sur un patient sain ou atteint d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin connue, de préférence choisie parmi la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
La présente invention est tout particulièrement et de manière très préférée relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin à partir d'une coupe histologique d'un échantillon de tissu intestinal préalablement prélevé chez ce patient, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium intestinal, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) la mise en contact de ladite coupe histologique avec un composé capable de se fixer spécifiquement au produit de traduction du gène PPARγ, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit de traduction, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un marquage ou un signal représentatif de la quantité dudit produit de traduction présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit de traduction du gène PPARγ; et b) la quantification ou la visualisation de l'intensité du marquage ou du signal obtenu à l'étape a) au niveau des cellules de l'épithélium intestinal.
Les inventeurs ont en effet mis en évidence de manière tout à fait surprenante, qu'il était possible de diagnostiquer avec une très haute sensibilité et une spécificité voisine de 100% une rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient par immunohistochimie réalisée à partir d'une coupe histologique d'un échantillon de tissu intestinal prélevé chez ce patient, cette échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium intestinal, ceci par rapport notamment à la sensibilité et/ou la spécificité obtenue par un test de diagnostic réalisé par PCR quantitative sur le produit de transcription du gène PPARγ ou par un test de diagnostic réalisé par Western Blot sur le produit de traduction du gène PPARγ à partir d'un échantillon où les cellules de l'épithélium intestinal n'auraient pas été correctement isolées. En effet les inventeurs ont pu mettre en évidence pour la première fois que seule l'observation du déficit d'expression du produit de traduction du gène PPARγ dans les cellules de l'épithélium intestinal permettait de réaliser un tel diagnostic spécifique et aussi sensible. Un tel test de diagnostic réalisé par immunohistochimie pourra être exploitée commercialement de façon aisée, peu coûteuse, ceci par rapport à un test réalisée par PCR quantitatice ou Western Blot où il devra être nécessaire d'isoler les cellules de l'épithélium intestinal de l'échantillon prélevé pour éviter toute contamination avec des cellules non épithéliales voisines dans l'échantillon. En effet toute présence de cellules non épithéliales lors de l'extraction totale de l'ARNm codant pour PPARγ (pour le test PCR) ou lors de l'extraction des protéines totales (pour le test Western Blot) sera susceptible d'augmenter la quantité de produit de transcripton ou de traduction du gène PPARγ . Un tel isolement préalable des cellules de l'épithélium intestinal de l'échantillon prélevé pour tenter de réaliser un test par PCR quantitative ou par Western blot permettant de de diagnostiquer une rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient avec la sensibilité et la spécificité que l'on peut obtenir par immunohistochimie est difficile à effectuer et peut envisageable sur le plan commercial.
Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la présente invention, caractérisé en ce la quantification ou la visualisation de l'intensité du signal obtenu à l'étape a) est comparée à celle obtenue pour une coupe histologique issue d'un échantillon de patient sain.
Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la présente invention, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on observe, le cas échéant, une diminution de l'intensité du marquage ou du signal obtenu à l'étape a) au niveau des cellules de l'épithélium intestinal issues de l'échantillon du patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin comparée à celles issues d'un échantillon de patient sain. Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient.
Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient. Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit échantillon du patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin est un échantillon de tissu intestinal prélevé au niveau d'une muqueuse saine ou lésée du patient.
Dans un mode de réalisation encore préférée, l'invention est relative à un procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique
(RCH) selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit composé capable de se fixer spécifiquement audit produit de traduction du gène PPARγ à l'étape a) est choisi parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; et
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ.
Sous un autre aspect, l'invention concerne une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ.
L'invention concerne en outre une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ, lesdits ligands étant choisis de préférence parmi ceux cités ci-avant.
L'invention concerne en outre une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour le récepteur PPARγ, de préférence comportant au moins 15, 20, 25, 30, 50 ou 75 bases.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé choisi parmi :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ;
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ ; ou - une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour le récepteur PPARγ, pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient.
De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie chronique, notamment la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
De manière également préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie aiguë de l'intestin chez un patient.
Sous un autre aspect encore plus préférée, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé choisi parmi :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; ou
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ , pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de la rectocolite hémorragique (RCH). Les kits ou nécessaires pour le diagnostic de maladie inflammatoire de l'intestin, notamment chronique telle que la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH) font avantageusement partie de l'invention.
La présente invention concerne ainsi sous un dernier aspect un kit ou nécessaire pour le diagnostic ou le pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ;
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ ; ou
- une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de lΑRNm codant pour le récepteur PPARγ ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARγ ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARγ ; d) le cas échéant, un échantillon témoin, de préférence un extrait de protéines totales d'un échantillon de tissu intestinal ou une coupe de tissu intestinal prélevé chez un patient sain et/ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu.
Enfin, la présente invention est relative de manière préféréeà un kit ou nécessaire pour le diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, caractérisé en ce qu'il comprend: a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; ou
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ ; et b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et le produit de traduction du gène PPARγ ; c) le cas échéant les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et le produit de traduction du gène PPARγ ; d) le cas échéant, une coupe histologique témoin de tissu intestinal prélevé chez un patient sain et/ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu, sur laquelle ou lesquelles coupes histologiques témoins, le cas échéant, le marquage par immunohistochimie du produit de traduction du gène PPARγ a été préalablement réalisé ; e) le cas échéant, une notice explicative montrant des images de coupes histologiques obtenues après marquage immunohistochimiques du produit de traduction du gène PPARγ pour des coupes histologiques témoins de tissu intestinal issu d'échantillons de patient sain, de patient atteint de de rectocolite hémorragique et/ou de patient atteint de maladie de Crohn.
Les kits ou nécessaires pour le diagnostic de maladie inflammatoire de l'intestin selon la présente invention, pourront également comprendre une notice explicative indiquant à l'utilisateur les taux et/ou répartition des produits d'expression du gène PPARγ attendus pour des prélèvements d'échantillons issus de patient sain, atteint de maladie inflammatoire de l'intestin, notamment chronique telle que la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH), comme indiqués dans les figures 1A, 1B, 2A et 2B ci-après.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci- après.
Légende des Figures Figures 1 A et 1B
La figure 1A représente un Western blot réalisé pour un extrait de protéine obtenue à partir de biopsie de patient sain (contrôle, trois patients représentatifs), de patient atteint de maladie de Crohn (noté CD ou MC, trois patients représentatifs) ou atteint de rectocolite hémorragique (noté UC ou RHC, trois patients représentatifs). Ce Western blot met en évidence une diminution de l'intensité de la bande correspondant à la protéine PPARγ (d'environ 53 kDa) pour les malades atteints de maladie de Crohn par rapport au témoin sain, diminution qui est encore plus accentuée pour les malades atteints de rectocolite hémorragique.
La figure 1B représente pour chaque échantillon testé (18 pour les échantillons de patient sain (contrôle), 18 pour les échantillons de patient atteint de CD et 15 pour les échantillons de patient atteint de UC), la quantité de protéine PPARγ exprimée, quantité exprimée en densité optique pour 50 μg de protéine totale. Figures 2A. 2B et 2C Les figures 2A à 2C représentent une coupe histologique issue de biopsie intestinale réalisée au niveau du côlon dans laquelle les récepteurs PPARγ ont été immunomarqués.
La figure 2A représente la coupe histologique d'un patient sain (témoin), la figure 2B, celle d'un patient atteint de MC et la figure 2C, celle d'un patient atteint de RCH. Sur ces figures, on peut observer en particulier :
- figure 2A : une forte densité de marquage sur les cellules épithéliales pour l'échantillon témoin avec une faible densité de marquage pour les cellules de la lamina propria ; - figure 2B : une forte densité de marquage sur les cellules épithéliales, avec néanmoins une diminution de l'intensité du marquage, ainsi qu'une densité importante de marquage sur les cellules de la lamina propria ; et
- figure 2C : une absence de marquage (ou très faible) sur les cellules épithéliales et sur les cellules de la lamina propria.
EXEMPLES Patients
Tous les patients analysés ont donné leur consentement pour cette étude dont les conditions ont été approuvées par les comités éthiques locaux. Le diagnostic de la maladie de Crohn et de la rectocolite hémorragique a été établi suivant les critères habituels (Rutgeerts, P., et al., Gastroenterology, 99:956-963, 1990). Exemple 1 : Quantification de PPARγ dans le côlon par Western-blot
Des extraits de protéines totales sont obtenus par homogénéisation de biopsies de côlon dans un tampon de lyse constitué de PBS (tampon phosphate en solution saline) avec 1 % de NP-40 (™Nonidet P40), 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de sodium dodécyl sulfate et un cocktail classique d'inhibiteurs de protéases (Fajast, L., et al., J. Biol. Chem., 272:18779-18789, 1997).
La séparation des protéines totales (50 μg), le transfert sur membrane de PNDF
(polyvinylidène difluoride) (cf. figure 1A) et l'immunodétection de PPARγ par incubation de la membrane avec un antisérum polyclonal de lapin pendant 12 heures
(dilution l/500e, TEBU, Le Perray en Yvelines, France) ont été effectués comme précédemment décrit (Lefebvre, et al., 1999). Le complexe est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham, UK), comme indiqué dans le protocole du fournisseur. Les résultats sont exprimés en unité de densité optique (DO) pour 50 μg de protéines totales (cf. figure 1B). Exemple 2 : Immunomarquage de PPARγ dans le côlon Les biopsies de côlon sont fixées dans du paraformaldéhyde 4 %, incluses dans la paraffine et coupées à 4 micromètres pour l'immunohistochimie et l'immuno- fluorescence.
Les coupes sont préincubées 30 minutes à température ambiante dans une solution de blocage contenant de Pavidine D et de la biotin (™Blocking Kit, SP2001, Nector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Elles sont ensuite exposées à un antisérum polyclonal de lapin dirigé contre PPARγ (dilution l/50e, WAK-CHEMIE, Bad Soden, Allemagne) deux heures à température ambiante. Les coupes sont lavées en PBS contenant 0,05 % de ™Triton X-100 et incubées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin biotinylé (dilution l/500e pendant 30 minutes, Dako, Trappes, France). Le complexe immun est détecté grâce à l'avidine-biotine couplé à la péroxydase
(™ABCOMPLEX/HRP, Dako, Trappes, France) et révélé à l'aide de 3,3'- diaminobenzidine (DAB, Dako, Trappes, France). Comme contrôle négatif, l'anticorps primaire est remplacé par un sérum de lapin irrelevant. Méthodes statistiques Les comparaisons des moyennes ± ESM des quantités de l'ARNm et de la protéine récepteur PPARγ entre les patients atteints de RCH, de MC et les patients contrôles ont été analysées par le test non-paramétrique ANONA de Kruskal-Wallis. Les différences sont jugées statistiquement différentes pour un p < 0,05. Exemple 3 : Résultats Par des techniques de Western blot (cf. figure 1A) et d'immunohistochimie (cf. figures 2A à 2C), il a été mis en évidence, au niveau des cellules épithéliales intestinales, pour la première fois un déficit de l'expression du récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARγ dans la muqueuse colique saine ou lésée surtout chez des patients atteints de RCH, et dans une moindre mesure chez les patients atteints de MC (visible au niveau de l'intensité du marquage en immunohistochimie). Ce déficit d'expression est ainsi aisément mis en évidence chez les patients atteints de RCH (cf. figures 1B et 2C). Ce déficit pour la MC apparaît également significatif et peut être mis également en évidence en observant l'intensité de l'immunomarquage en immunohistochimie (cf. figure 2B).
Concernant la MC, la technique d'immunohistochimie met en évidence un gain d'expression du récepteur PPARγ au niveau des cellules de la lamina propria, alors que l'expression au niveau de ces cellules n'apparaît pas ou que très faiblement pour la RCH ou pour les patients sains.
Concernant les cellules de la lamina propria, on peut également noter un déficit d'expression pour les patients atteints de RCH par rapport aux témoins sains.
La détection de PPARγ dans la muqueuse colique est un nouveau marqueur permettant de faire le diagnostic rapide de RCH et/ou de MC. Cette détection est possible par la réalisation de biopsies faites en muqueuse saine ou lésée au cours d'un examen endoscopique qui peut se limiter à l'exploration des 20 premiers cm du côlon au niveau du rectum et du sigmoïde.
Les tests réalisés sur l'ensemble des échantillons analysés montrent que la sensibilité et la spécificité est de 100 % dans la MC et RCH.
Les techniques mises en oeuvre sont simples et peuvent être réalisées en routine par tous les laboratoires d'anatomopathologie.
Parmi les autres avantages du procédé selon l'invention, on peut citer en particulier le fait que : - les biopsies peuvent être effectuées aussi bien en muqueuse saine qu'en muqueuse lésée, pendant les périodes de quiescence ou de poussée de la maladie ; et que
- les biopsies rectales nécessitent uniquement une endoscopie courte, sans anesthésie générale, sans préparation colique.
L'invention concerne également un dispositif de diagnostic comprenant des moyens adaptés pour la mise en oeuvre des différentes étapes du procédé précédemment décrit.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro de détermination de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARγ (gène PPARγ) sur un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et ou de la lamina propria intestinaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon de tissu intestinal chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, ledit prélèvement comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux ; b) la mise en contact du produit d'expression du gène PPARγ avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit d'expression, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un signal représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit d'expression ; et c) la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b).
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux, et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARγ entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARγ est le produit de traduction dudit gène PPARγ, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ à l'étape b) est choisi parmi les composés suivants : - un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; et
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) :
- les protéines totales sont extraites de l'échantillon prélevé ; puis
- séparées et transférées sur membrane (Western blot) ; et en ce que à l'étape c), on quantifie le signal obtenu à l'étape b).
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) :
- on réalise une coupe histologique de l'échantillon prélevé, ledit échantillon prélevé ayant été, le cas échéant, fixé dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde et inclus dans de la parafinne ; et en ce que à l'étape c), on visualise le signal obtenu à l'étape b).
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARγ est le produit de transcription ARNm dudit gène PPARγ, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARγ à l'étape b) est choisi parmi les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement avec un fragment dudit ARNm.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on compare la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b), et le cas échéant, la distribution du produit d'expression dudit gène PPARγ entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient avec celles obtenues pour un échantillon témoin.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit échantillon témoin est un échantillon de tissu intestinal prélevé sur un patient sain ou atteint d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, de préférence choisie parmi la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
11. Procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin à partir d'une coupe histologique d'un échantillon de tissu intestinal préalablement prélevé chez ce patient, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium intestinal, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante : a) la mise en contact de ladite coupe histologique avec un composé capable de se fixer spécifiquement au produit de traduction du gène PPARγ, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit de traduction, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un marquage ou un signal représentatif de la quantité dudit produit de traduction présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit de traduction du gène PPARγ; et b) la quantification ou la visualisation de l'intensité du marquage ou du signal obtenu à l'étape a) au niveau des cellules de l'épithélium intestinal.
12. Procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la revendication 11, caractérisé en ce la quantification ou la visualisation de l'intensité du signal obtenu à l'étape a) est comparée à celle obtenue pour une coupe histologique issue d'un échantillon de patient sain.
13. Procédé in vitro de diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'à l'étape b), on observe, le cas échéant, une diminution de l'intensité du marquage ou du signal obtenu à l'étape a) au niveau des cellules de l'épithélium intestinal issues de l'échantillon du patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin comparée à celles issues d'un échantillon de patient sain.
14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient.
16. Procédé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit échantillon du patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin est un échantillon de tissu intestinal prélevé au niveau d'une muqueuse saine ou lésée du patient.
17. Procédé selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que ledit composé capable de se fixer spécifiquement audit produit de traduction du gène PPARγ à l'étape a) est choisi parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; et
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ.
18. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ.
19. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ.
20. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARγ.
21. Utilisation d'un composé choisi parmi :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; - un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ ; ou
- une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARγ, pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient.
22. Utilisation d'un composé selon la revendication 21, caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie chronique.
23. Utilisation d'un composé selon la revendication 22, caractériser en ce que ladite maladie inflammatoire chronique de l'intestin est la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
24. Utilisation d'un composé selon la revendication 21, caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie aiguë de l'intestin chez un patient.
25. Utilisation d'un composé choisi parmi : - un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; ou
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ , pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de la rectocolite hémorragique (RCH). chez un patient.
26. Kit ou nécessaire pour le diagnostic ou le pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ;
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ, ou
- une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARγ ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARγ ; c) le cas échéant les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARγ ; d) le cas échéant, un échantillon témoin, de préférence un extrait de protéines totales d'un échantillon de tissu intestinal ou une coupe de tissu intestinal prélevé chez un patient sain et/ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu.
27. Kit ou nécessaire pour le diagnostic par immunohistochimie de rectocolite hémorragique (RCH) chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants :
- un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARγ ; ou
- un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARγ ; et b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et le produit de traduction du gène PPARγ ; c) le cas échéant les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et le produit de traduction du gène PPARγ ; d) le cas échéant, une coupe histologique témoin de tissu intestinal prélevé chez un patient sain et/ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu, sur laquelle ou lesquelles coupes histologiques témoins, le marquage par immunohistochimie du produit de traduction du gène PPARγ a été préalablement été réalisé ; e) le cas échéant, une notice explicative montrant des images de coupes histologiques obtenues après marquage immunohistochimiques du produit de traduction du gène PPARγ pour des coupes histologiques témoins de tissu intestinal issu d'échantillons de patient sain, de patient atteint de de rectocolite hémorragique et/ou de patient atteint de maladie de Crohn.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9133099B2 (en) 2005-07-22 2015-09-15 Nogra Pharma Limited Compounds and their salts specific to the PPAR receptors and the EGF receptors and their use in the medical field
US9511041B2 (en) 2009-02-16 2016-12-06 Nogra Pharma Limited Alkylamido compounds and uses thereof
US9682050B2 (en) 2012-04-18 2017-06-20 Nogra Pharma Limited Methods of treating lactose intolerance
US9913817B2 (en) 2008-12-05 2018-03-13 Nogra Pharma Limited Methods for preventing or reducing colon carcinogenesis
US11753365B2 (en) 2012-02-09 2023-09-12 Nogra Pharma Limited Methods of treating fibrosis
US11905232B2 (en) 2019-02-08 2024-02-20 Nogra Pharma Limited Process of making 3-(4′-aminophenyl)-2-methoxypropionic acid, and analogs and intermediates thereof

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1844158A4 (fr) * 2004-12-06 2010-09-08 Univ Johns Hopkins Biomarqueurs pour maladie intestinale inflammatoire
ITRM20050390A1 (it) * 2005-07-22 2007-01-23 Giuliani Spa Composti e loro sali specifici per i recettori ppar ed i recettori per l'egf e loro uso in campo medico.
US8858924B2 (en) * 2009-03-26 2014-10-14 Warsaw Orthopedic, Inc. Compositions and methods for treatment of hemorrhage
EP3094973B1 (fr) 2013-11-07 2020-07-29 Diagnodus Limited Biomarqueurs

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5861274A (en) * 1990-03-22 1999-01-19 The Salk Institute For Biological Studies Nucleic acids encoding peroxisome proliferator-activated receptor
GB9600464D0 (en) * 1996-01-09 1996-03-13 Smithkline Beecham Plc Novel method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO02077651A1 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9133099B2 (en) 2005-07-22 2015-09-15 Nogra Pharma Limited Compounds and their salts specific to the PPAR receptors and the EGF receptors and their use in the medical field
US9345680B2 (en) 2005-07-22 2016-05-24 Nogra Pharma Limited Compounds and their salts specific to the PPAR receptors and the EGF receptors and their use in the medical field
US9561202B2 (en) 2005-07-22 2017-02-07 Nogra Pharma Limited Compounds and their salts specific to the PPAR receptors and the EGF receptors and their use in the medical field
US9913817B2 (en) 2008-12-05 2018-03-13 Nogra Pharma Limited Methods for preventing or reducing colon carcinogenesis
US9511041B2 (en) 2009-02-16 2016-12-06 Nogra Pharma Limited Alkylamido compounds and uses thereof
US9901557B2 (en) 2009-02-16 2018-02-27 Nogra Pharma Limited Methods of treating hair related conditions
US10398667B2 (en) 2009-02-16 2019-09-03 Nogra Pharma Limited Methods of treating hair related conditions
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US11753365B2 (en) 2012-02-09 2023-09-12 Nogra Pharma Limited Methods of treating fibrosis
US9682050B2 (en) 2012-04-18 2017-06-20 Nogra Pharma Limited Methods of treating lactose intolerance
US11905232B2 (en) 2019-02-08 2024-02-20 Nogra Pharma Limited Process of making 3-(4′-aminophenyl)-2-methoxypropionic acid, and analogs and intermediates thereof

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