FR2822955A1 - Methode de diagnostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique ainsi que l'utilisation de composés, tels qu'un anticorps, ligand ou sonde nucléique capable de reconnaître spécifiquemment les produits d'expression du gène PPARgamma pour la préparation de composition ou de kit de diagnostic de ces maladies.

Description

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La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vi tro de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ainsi que l'utilisation de composés, tels qu'un anticorps, ligand ou sonde nucléique capable de reconnaître spécifiquemment les produits d'expression du gène PPARy pour la préparation de composition ou de kit de diagnostic de ces maladies.

La maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) sont des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) frappant avec prédilection l'adulte jeune, évoluant par poussées entrecoupées de périodes de rémission. Elles constituent un des problèmes majeurs de l'hépato-gastro-entérologie. En effet, ces maladies frappent des sujets jeunes et sont d'évolution chronique ou prolongée, potentiellement sur toute la vie. Ces maladies peuvent toucher tout le tube digestif, de la bouche à l'anus. Ces maladies retentissent également fréquemment sur la vie personnelle et professionnelle par la fréquence des poussées, les complications et le recours parfois nécessaire à la chirurgie. Leur cause n'étant pas connue, ces maladies n'ont pas de traitement curatif. Même s'il est efficace dans l'immédiat, le traitement médical n'a qu'un effet suspensif. De plus, le coût d'un tel traitement médical suspensif, déjà élevé, va croissant avec les nouveaux médicaments.

La prévalence des MICI augmente en raison d'une incidence croissante jusque dans les années 70 et stable depuis. Sur la base des chiffres d'incidence de 1991 et de la médiane de survie estimée, on a ainsi estimé qu'en l'année 2005, parmi 232 millions d'américains de race blanche, 580 000 seront atteints de MC et 742 000 de RCH.

En France, les données du registre EPIMAD du NordOuest du pays, montrent une incidence stable depuis 1988 des MICI : 5,6 pour la MC et 3,5 pour la RCH. En utilisant les mêmes règles de calcul qu'aux Etats-Unis, on aboutit à

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un chiffre attendu en France de 120 000 MC et de 80 000 RCH en 2005.

Le diagnostic des MICI repose sur un ensemble de critères cliniques, morphologiques et histologiques. Les lésions au cours de la MC peuvent atteindre tous les segments du tube digestif alors que la RCH touche uniquement le côlon. L'existence de lésions coliques isolées représente donc une situation délicate pour poser le diagnostic de MC ou de RCH ou pour différencier une MICI d'autres pathologies associée à une inflammation intestinale telle que par exemple les infections bactériennes, virales ou par des parasites, ou encore les pathologies vasculaires, pathologies secondaires à la prise de médicaments, diverticulite, etc..

Face à la difficulté d'établir le diagnostic de MC ou de RCH, le développement de nouveaux marqueurs de diagnostic présente un intérêt fondamental qui permettra d'améliorer la prise en charge des patients.

Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de pouvoir disposer d'un marqueur efficace et fiable des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, un tel marqueur devant être de préférence d'utilisation aisée et peu coûteuse.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

Par des techniques de Western blot et d'immunohistochimie, les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante un déficit de l'expression du récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARy dans la muqueuse colique de patients atteints de RCH.

Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence de manière surprenante que le taux d'expression du gène codant pour le récepteur PPARy (PPARy pour Peroxysome Proliferator-Activated Receptor gamma) à la surface cellulaire de cellules de l'épithélium et/ou de cellules de la lamina propria du tissu intestinal était corrélé au

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diagnostic ou au pronostic de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Les inventeurs ont également, et de manière tout aussi surprenante, mis en évidence que ce taux d'expression de PPARy ajouté à sa répartition suivant le type cellulaire, cellules de l'épithélium et/ou cellules de la lamina propria, permettait non seulement d'affiner ce diagnostic ou pronostic, mais également de diagnostiquer ou pronostiquer avec précision le type de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin du patient testé.

Le récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARy est un récepteur qui contrôle l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans les métabolismes (Schoonjans, et al., 1997). Des études in vitro ont déjà montré que des activateurs de PPARy limitent la production de médiateurs inflammatoires tels que les cytokines inflammatoires produites par les macrophagesmonocytes humains (Ricote, et al., 1998 ; Jiang, et al., 1998) et par les cellules épithéliales intestinales (Lefebvre, et al., 1999). L'utilité in vivo des agonistes de PPARy a également été décrite pour le traitement de colites induites chez les souris par l'administration de sulfate de dextran sodique (Su, et al., 1999), ou d'acide 2,4, 6-trinitrobenzène sulfonique (Dubuquoy, et al., 2000).

On peut également citer le document brevet US 5,861, 274 publié le 19 Janvier 1999 qui décrit la séquence nucléique et peptidique du récepteur PPARy humain.

La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro pour le diagnostic ou pour le pronostic d'une maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étape de comparaison de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARy dans un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinal, par rapport à un échantillon de contrôle.

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La présente invention est également relative à un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinal et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARY entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient.

Les procédés de diagnostic ci-avant selon l'invention, sont de préférence caractérisés en ce qu'ils comprennent les étapes des procédés ci-après définies.

La présente invention concerne ainsi un procédé in vitro de détermination de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARY (gène PPARy) sur un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon de tissu intestinal chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, ledit prélèvement comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux ; b) la mise en contact du produit d'expression du gène PPARY avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit

produit d'expression du gène PPARY, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit d'expression, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un signal représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit d'expression ; et c) la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b).

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La présente invention comprend également un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaaux, et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARy entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient.

De manière préférée, ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient, notamment de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient.

Dans les procédés selon la présente invention, toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour aboutir à l'étape b) desdits procédés à l'obtention d'un signal détectable et/ou quantifiable représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon, en fonction du produit d'expression recherché, de préférence le polypeptide correspondant au produit de traduction dudit gène PPARy, notamment par la méthode dite de Western blot ou par immunohistochimie bien connue de l'homme de l'art, ou à son produit de transcription (ARNm) codant pour ledit récepteur PPARy, notamment par la méthode dite d'hybridation in si tu également bien connue de l'homme de l'art, méthodes qui ne seront pas développées dans la présente description. On pourra néanmoins se référer aux exemples ci-après pour la méthode dite de Western blot ou par immunohistochimie.

Dans un mode de réalisation particulèrement préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARy est le produit de traduction dudit gène PPARy, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARy à l'étape b) est choisi parmi les composés suivants :

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un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARY, ou un de ses fragments ; et un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy.

Par produit de traduction dudit gène PPARY , on entend désigner en particulier le polypeptide correspondant au récepteur PPARy exprimé par la muqueuse intestinale, notamment à la surface des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux.

La séquence d'acides aminés du récepteur PPARy humain est en particulier décrite dans le document brevet US 5,861, 274 (SEQ ID NO. 2).

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments dirigés contre le récepteur PPARy, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux qui peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine PPARy, ou un de ses fragments comportant l'épitope spécifique (déterminant de la protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps).

Ladite protéine récepteur PPARy, ou un de ses fragments, pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour la protéine récepteur PPARy, ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la protéine OZF.

Les fragments d'anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitope de la protéine

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PPARy sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux ou polyclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab'et des fragments divalents tels que F (ab') 2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991.

Les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al., 1978.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux, ou leurs fragments, ainsi que les ligands spécifiques capables de se fixer spécifiquement audit produit de traduction peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme marquée afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les anticorps, ou leurs fragments, ou lesdits ligands marqués selon l'invention incluent par exemple des anticorps ou ligands dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la ss-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou

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par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps, ou leurs fragments, ou auxdits ligands, et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, l'umbelliférone, etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps, ou leurs fragments, ou lesdits ligands peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate, etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluoréscéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.

Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou polyclonal, ou un de leurs fragments, ou sur lesdits ligands, on peut citer également les marqueurs radioactifs qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations, par autoradiographie, etc..

Dans les procédés selon la présente invention, toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour aboutir à l'étape b) desdits procédés à l'obtention d'un signal détectable et/ou quantifiable représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon, notamment par Western blot ou par immunohistochimie.

Dans ces techniques dites de Western blot ou d'immunohistochimie, le complexe spécifique formé entre le

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produit de traduction du gène PPARy avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit produit de traduction pourra résulter de la mise en contact d'un anticorps, ou l'un de ses fragments, ou d'un ligand spécifique du récepteur PPARy avec ledit produit de traduction.

Dans une telle détection et/ou quantification, ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène ou ligandrécepteur.

L'anticorps, ou l'un de ses fragments, ou le ligand peut être également immobilisé. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. On peut citer notamment les supports solides tels que des billes de polystyrène, les plaques de microtitration, qui sont bien connus dans le domaine des immunodosages et qui ne seront pas développés dans la présente description.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence ou-luminescence, ou radio-immunologique (RIA), marquage à l'or ou équivalent.

Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la mise en évidence, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps ou ligandrécepteur que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, pourront bien entendu être associées, dans le cas où les anticorps ou ligands participant au complexe ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés. Ces réactifs appropriés seront par exemple des anticorps immunoconjugués ou marqués, comme ci-avant décrits, capables de reconnaître spécifiquement les anticorps ou ligands participant audit complexe. Seront également associés à ces techniques ou réactifs les

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substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôle positif, négatif et quantitatif.

Par"ligand agoniste ou antagoniste naturel ou synthétique", du récepteur PPARy, on entend désigner ici tout composé autre qu'un anticorps anti-PPARy capable de se fixer spécifiquement sur le récepteur PPARy.

Parmi ces ligands agonistes ou antagonistes, on préfère ceux choisis parmi les agonistes naturels de type prostaglandine J2, acides gras polyinsaturés et les agonistes synthétiques de type thiazolinédione.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est de type Western blot et est caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) :

les protéines totales sont extraites de l'échantillon prélevé ; puis - séparées et transférées sur membrane (Western blot) ; et en ce que à l'étape c), on quantifie le signal obtenu à l'étape b).

La séparation sera notamment réalisée par éléctrophorèse en gel d'acrylamide (PAGE), le transfert étant réalisé sur des membranes bien connues de l'homme de l'art comme en particulier les membranes de nitrocellulose ou PVDF.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention est de type immunohistochimie et est caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) : - on réalise une coupe histologique de l'échantillon prélevé, ledit échantillon prélevé ayant été, le cas échéant, fixé dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde (à environ 4 %) et inclus dans de la paraffine ; et en ce que à l'étape c), on visualise le signal obtenu à l'étape b).

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Les échantillons prélevés ayant été au préalable fixés dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde et inclus dans de la paraffine, pourront avoir été stockés plusieurs jours ou moins à 4 C ou sous forme congelée.

Sous un autre aspect, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARy est le produit de transcription ARNm dudit gène PPARy et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARy à l'étape b) est choisi parmi les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement (dans des conditions de forte stringence) avec un fragment dudit ARNm.

Parmi les méthodes permettant de détecter (ou localiser) et/ou de quantifier l'ARNm du gène PPARy, on préfère la méthode dite d'hybridation in si tu bien connue de l'homme de l'art.

Les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement (dans des conditions de forte stringence) avec un fragment dudit ARNm seront des sondes, de préférence marquées, ou des amorces oligonucléotidiques.

Lesdites sondes ou amorces pourront être par exemple dessinées à partir de la séquence SEQ ID NO. 1 telle que décrite dans la demande US 5,861, 274 (ADNc codant pour le récepteur PPARy).

Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de forte stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.

A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

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L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65OC, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 lig/ml d'ADN de sperme de saumon.

1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0, 02 % de sérum albumine bovine.

Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65OC, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.

Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.

Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 15 bases et on préférera des fragments d'au moins 20,25, 30 ou 50 bases.

Les techniques permettant de quantifier et/ou de localiser une séquence nucléique et que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et ne seront pas développées de manière exhaustive ici. On peut citer, sans s'y limiter les techniques décrites ci-après.

En général, la détection, localisation (répartition) et/ou le dosage spécifique de l'ARNm du gène PPARy, dans l'échantillon biologique comprendra les étapes suivantes pour l'hybridation in situé (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) : - la mise en contact d'une sonde oligonucléotidique, le cas échéant marquée, avec l'échantillon biologique, l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation

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de la sonde à l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique ; - la détection, localisation et/ou dosage de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique et l'ARNm de l'échantillon biologique.

Dans le cas où l'on réalise la quantification de l'ARNm du gène PPARy à partir d'un exrait d'ARN total de l'échantillon prélevé, le cas échéant enrichi en ARNm, en général, la quantification de l'ARNm du gène PPARy dans l'extrait préparé comprend les étapes suivantes de la méthode dite de RT-PCR quantitative (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) : - l'obtention d'un ADNc à partir de l'ARNm du gène PPARy au moyen d'amorces spécifiques et d'une transcriptase inverse ; - l'amplification spécifique de l'ADNc PPARy obtenu par une méthode dite de PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou PCR apparentée à l'aide d'un couple d'amorces spécifique ; - l'analyse quantitative des produits d'amplification.
On peut également citer une autre méthode pour réaliser la quantification de l'ARNm du gène PPARy à partir d'un exrait d'ARN total de l'échantillon prélevé, le cas échéant enrichi en ARNm, ladite méthode comprenant les étapes suivantes (étapes b) et c) des procédés selon l'invention) : la mise en contact d'une première sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm du gène PPARy ou, le cas échéant, de ses produits d'amplification, immobilisée sur un support avec un extrait de l'ARN total de l'échantillon, ou, le cas échéant, avec les produits PCR de l'ARNm du gène PPARy obtenus à l'aide d'amorces spécifiques, dans des conditions permettant l'hybridation de la première sonde à l'ARN dudit échantillon ou, le cas échéant, auxdits produits PCR ;

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- la mise en contact de l'hybride formé entre ladite première sonde immobilisée sur un support et lesdits ARNs ou, le cas échéant, lesdits produits PCR, le cas échéant après élimination des acides nucléiques n'ayant pas hybridé avec la première sonde, avec une deuxième sonde oligonucléotidique, notamment marquée capable de s'hybrider à l'ARNm du gène PPARy ou, le cas échéant, à ses produits PCR, puis élimination des deuxièmes sondes n'ayant pas hybridé ; et - l'analyse quantitative des triplex ainsi formés.

Par PCR apparentée on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général, il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification , TAS Transcription based Amplification System , LCR Ligase Chain Reaction , Endo Run Amplification (ERA), Cycling Probe Reaction (CPR), et SDA Strand Displacement Amplification bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible.

L'invention comprend en outre un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que l'on compare la quantification ou la visualisation (l'image) du signal obtenu à l'étape b), et le cas échéant, la distribution du produit d'expression dudit gène PPARy entre lesdites

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cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient avec celles obtenues pour un échantillon témoin (ou contrôle).

Dans un mode de réalisation préféré, ledit échantillon témoin est un échantillon de tissu intestinal prélevé sur un patient sain ou atteint d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin connue, de préférence choisie parmi la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).

Sous un autre aspect, l'invention concerne une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy.

L'invention concerne en outre une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy, lesdits ligands étant choisis de préférence parmi ceux cités ci-avant.

L'invention concerne en outre une composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour le récepteur PPARy, de préférence comportant au moins 15,20, 25,30, 50 ou 75 bases.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé choisi parmi : un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy ;

un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy ; ou - une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour le récepteur PPARy, pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient.

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De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie chronique, notamment la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).

De manière également préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie aigüe de l'intestin chez un patient.

Les kits ou nécessaires pour le diagnostic de maladie inflammatoire de l'intestin, notamment chronique telle que la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH) font avantageusement partie de l'invention.

La présente invention concerne ainsi sous un dernier aspect un kit ou nécessaire pour le diagnostic ou le pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants : un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy ;

un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARY ; ou - une séquence nucléique, le cas échéant marquée,

capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARy ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARy ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARy ; d) le cas échéant, un échantillon témoin, de préférence un extrait de protéines totales d'un échantillon de tissu intestinal ou une coupe de tissu intestinal prélevé chez

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un patient sain et/ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu.

Les kits ou nécessaires pour le diagnostic de maladie inflammatoire de l'intestin selon la présente invention, pourront également comprendre une notice explicative indiquant à l'utilisateur les taux et/ou répartition des produits d'expression du gène PPARY attendus pour des prélèvements d'échantillons issus de patient sain, atteint de maladie inflammatoire de l'intestin, notamment chronique telle que la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH), comme indiqués dans les figures 1A, 1B, 2A et 2B ci-après.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.

Légende des Figures Figures 1A et 1B
La figure 1A représente un Western blot réalisé pour un extrait de protéine obtenue à partir de biopsie de patient sain (contrôle, trois patients représentatifs), de patient atteint de maladie de Crohn (noté CD ou MC, trois patients représentatifs) ou atteint de rectocolite hémorragique (noté UC ou RHC, trois patients représentatifs). Ce Western blot met en évidence une diminution de l'intensité de la bande correspondant à la protéine PPARy (d'environ 53 kDa) pour les malades atteints de maladie de Crohn par rapport au témoin sain, diminution qui est encore plus accentuée pour les malades atteints de rectocolite hémorragique.

La figure 1B représente pour chaque échantillon testé (18 pour les échantillons de patient sain (contrôle), 18 pour les échantillons de patient atteint de CD et 15 pour les échantillons de patient atteint de UC), la quantité de

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protéine PPARy exprimée, quantité exprimée en densité optique pour 50 zu de protéine totale.

Figures 2A, 2B et 2C
Les figures 2A à 2C représentent une coupe histologique issue de biopsie intestinale réalisée au niveau du côlon dans laquelle les récepteurs PPARy ont été immunomarqués.

La figure 2A représente la coupe histologique d'un patient sain (témoin), la figure 2B, celle d'un patient atteint de MC et la figure 2C, celle d'un patient atteint de RCH. Sur ces figures, on peut observer en particulier : - figure 2A : une forte densité de marquage sur les cellules épithéliales pour l'échantillon témoin avec une faible densité de marquage pour les cellules de la lamina propria ; - figure 2B : une forte densité de marquage sur les cellules épithéliales, avec néanmoins une diminution de l'intensité du marquage, ainsi qu'une densité importante de marquage sur les cellules de la lamina propria ; et - figure 2C : une absence de marquage (ou très faible) sur les cellules épithéliales et sur les cellules de la lamina propria.

EXEMPLES
Patients
Tous les patients analysés ont donné leur consentement pour cette étude dont les conditions ont été approuvées par les comités éthiques locaux. Le diagnostic de la maladie de Crohn et de la rectocolite hémorragique a été établi suivant les critères habituels (Rutgeerts, et al., 1990). Exemple 1 : Quantification de PPARy dans le côlon par Western-blot
Des extraits de protéines totales sont obtenus par homogénéisation de biopsies de côlon dans un tampon de lyse constitué de PBS (tampon phosphate en solution saline) avec 1 % de NP-40 (TMNonidet P40), 0, 5 % de désoxycholate de

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sodium, 0, 1 % de sodium dodécyl sulfate et un cocktail classique d'inhibiteurs de protéases.

La séparation des protéines totales (50 lag), le transfert sur membrane de PVDF (polyvinylidène difluoride) (cf. figure 1A) et l'immunodétection de PPARY par incubation de la membrane avec un antisérum polyclonal de lapin pendant 12 heures (dilution 1/500e, TEBU, Le Perray en Yvelines, France) ont été effectués comme précédemment décrit (Lefebvre, et al., 1999).

Le complexe est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham, UK), comme indiqué dans le protocole du fournisseur. Les résultats sont exprimés en unité de densité optique (DO) pour 50 gg de protéines totales (cf. figure 1B).

Exemple 2 : Immunomarquage de PPARy dans le côlon
Les biopsies de côlon sont fixées dans du paraformaldéhyde 4 %, incluses dans la paraffine et coupées à 4 micromètres pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence.

Les coupes sont préincubées 30 minutes à température ambiante dans une solution de blocage contenant de l'avidine D et de la biotin blocking Kit, SP2001, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Elles sont ensuite exposées à un antisérum polyclonal de lapin dirigé contre PPARy (dilution 1/50e, WAK-CHEMIE, Bad Soden, Allemagne) deux heures à température ambiante. Les coupes sont lavées en PBS contenant 0,05 % de Triton X-100 et incubées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin biotinylé (dilution 1/500e pendant 30 minutes, Dako, Trappes, France).

Le complexe immun est détecté grâce à l'avidine-

biotine couplé à la péroxydase (TMABCOMPLEX/HRP, Dako, Trappes, France) et révélé à l'aide de 3, 3'- diaminobenzidine (DAB, Dako, Trappes, France). Comme contrôle négatif, l'anticorps primaire est remplacé par un sérum de lapin irrelevant.

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Méthodes statistiques
Les comparaisons des moyennes + ESM des quantités de l'ARNm et de la protéine récepteur PPARy entre les patients atteints de RCH, de MC et les patients contrôles ont été analysées par le test non-paramétrique ANOVA de KruskalWallis. Les différences sont jugées statistiquement différentes pour un p < 0,05.

Exemple 3 : Résultats
Par des techniques de Western blot (cf. figure 1A) et d'immunohistochimie (cf. figures 2A à 2C), il a été mis en évidence, au niveau des cellules épithéliales intestinales, pour la première fois un déficit de l'expression du récepteur activé par les proliférateurs des péroxysomes PPARy dans la muqueuse colique saine ou lésée surtout chez des patients atteints de RCH, et dans une moindre mesure chez les patients atteints de MC (visible au niveau de l'intensité du marquage en immunohistochimie). Ce déficit d'expression est ainsi aisément mis en évidence chez les patients atteints de RCH (cf. figures 1B et 2C). Ce déficit pour la MC apparaît également significatif et peut être mis également en évidence en observant l'intensité de l'immunomarquage en immunohistochimie (cf. figure 2B).

Concernant la MC, la technique d'immunohistochimie met en évidence un gain d'expression du récepteur PPARy au niveau des cellules de la lamina propria, alors que l'expression au niveau de ces cellules n'apparaît pas ou que très faiblement pour la RCH ou pour les patients sains.

Concernant les cellules de la lamina propria, on peut également noter un déficit d'expression pour les patients atteints de RCH par rapport aux témoins sains.

La détection de PPARy dans la muqueuse colique est un nouveau marqueur permettant de faire le diagnostic rapide de RCH et/ou de MC. Cette détection est possible par la réalisation de biopsies faites en muqueuse saine ou lésée au cours d'un examen endoscopique qui peut se limiter à

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l'exploration des 20 premiers cm du côlon au niveau du rectum et du sigmoïde.

Les tests réalisés sur l'ensemble des échantillons analysés montrent que la sensibilité et la spécificité est de 100 % dans la MC et RCH.

Les techniques mises en oeuvre sont simples et peuvent être réalisées en routine par tous les laboratoires d'anatomopathologie.

Parmi les autres avantages du procédé selon l'invention, on peut citer en particulier le fait que : - les biopsies peuvent être effectuées aussi bien en muqueuse saine qu'en muqueuse lésée, pendant les périodes de quiescence ou de poussée de la maladie ; et que les biopsies rectales nécessitent uniquement une endoscopie courte, sans anesthésie générale, sans préparation colique.

L'invention concerne également un dispositif de diagnostic comprenant des moyens adaptés pour la mise en oeuvre des différentes étapes du procédé précédemment décrit.

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Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé in vitro de détermination de la quantité de produit d'expression du gène codant pour le PPARy (gène PPARy) sur un échantillon de tissu intestinal, ledit échantillon comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon de tissu intestinal chez un patient susceptible d'être atteint d'une ou d'évoluer vers une maladie inflammatoire de l'intestin, ledit prélèvement comprenant au moins des cellules de l'épithélium et/ou de la lamina propria intestinaux ; b) la mise en contact du produit d'expression du gène PPARy avec un composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARy, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre ledit composé et ledit produit d'expression, ledit composé étant marqué ou susceptible d'être marqué afin d'obtenir un signal représentatif de la quantité dudit produit d'expression présent dans l'échantillon et, le cas échéant, permettant de localiser ledit produit d'expression ; et c) la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b).

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon de tissu intestinal comprend au moins des cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux, et en ce qu'il met en oeuvre en outre une étape de comparaison de la distribution du produit d'expression dudit gène PPARy entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu

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intestinal prélevé au niveau du côlon ou de l'intestin grêle du patient.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est une biopsie de tissu intestinal prélevé au niveau du côlon du patient.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARy est le produit de traduction dudit gène PPARy, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit produit d'expression du gène PPARy à l'étape b) est choisi parmi les composés suivants : un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy ; et

un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) : les protéines totales sont extraites de l'échantillon prélevé ; puis

- séparées et transférées sur membrane (Western blot) ; et en ce que à l'étape c), on quantifie le signal obtenu à l'étape b).

7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que préalablement à l'étape b) : - on réalise une coupe histologique de l'échantillon prélevé, ledit échantillon prélevé ayant été, le cas échéant, fixé dans une solution de paraformaldéhyde ou formaldéhyde et inclus dans de la parafinne ; et en ce que à l'étape c), on visualise le signal obtenu à l'étape b).

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit produit d'expression dudit gène PPARy est le produit de transcription ARNm dudit gène PPARy, et en ce que le composé capable de se fixer spécifiquement audit

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produit d'expression du gène PPARY à l'étape b) est choisi parmi les séquences nucléiques, le cas échéant marquées, capables de s'hybrider spécifiquement avec un fragment dudit ARNm.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on compare la quantification ou la visualisation du signal obtenu à l'étape b), et le cas échéant, la distribution du produit d'expression dudit gène PPARy entre lesdites cellules de l'épithélium et de la lamina propria intestinaux sur l'échantillon du patient avec celles obtenues pour un échantillon témoin.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit échantillon témoin est un échantillon de tissu intestinal prélevé sur un patient sain ou atteint d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin, de préférence choisie parmi la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH). il. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy.

12. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy.

13. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARy.

14. Utilisation d'un composé choisi parmi : un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy ;

un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARy ; ou une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARy,

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pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic ou au pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient.

15. Utilisation d'un composé selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie chronique.

16. Utilisation d'un composé selon la revendication 15, caractérisér en ce que ladite maladie inflammatoire chronique de l'intestin est la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).

17. Utilisation d'un composé selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite maladie inflammatoire de l'intestin est une maladie aigüe de l'intestin chez un patient.

18. Kit ou nécessaire pour le diagnostic ou le pronostic de maladie inflammatoire de l'intestin chez un patient caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins l'un des composés choisis parmi les composés suivants : un anticorps monoclonal ou polyclonal, le cas échéant marqué, dirigé contre le récepteur PPARy ;

un ligand agoniste ou antagoniste, naturel ou synthétique, le cas échéant marqué, du récepteur PPARY, ou une séquence nucléique, le cas échéant marquée, capable de s'hybrider spécifiquement avec un fragment de l'ARNm codant pour le récepteur PPARy ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la formation d'un complexe entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARY ; c) le cas échéant les réactifs permettant la quantification ou la visualisation de complexes éventuellement formés entre ledit composé tel que défini en a) et un produit d'expression du gène PPARy ; d) le cas échéant, un échantillon témoin, de préférence un extrait de protéines totales d'un échantillon de tissu

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intestinal ou une coupe de tissu intestinal prélevé chez un patient sain ou chez un patient atteint d'une maladie inflammatoire de l'intestin de type connu.