FR3067466A1 - Methode d'isolement et de detection de cellules souches cancereuses - Google Patents
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Abstract
La présente invention porte sur l utilisation in vitro d au moins une lectine reconnaissant le motif fucose α 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, choisie parmi les lectines Ulex Europaeus agglutinin 1 (UEA-1), Agaricus Bisporus agglutinin (ABA), Amaranthus Caudatus agglutinin (ACA), jacaline, GSL-I et GSL-II Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I) et Griffonia Simplicifolia lectin II (GSL-II), pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique.
Description
La présente invention concerne une méthode d’isolement et de détection de cellules souches cancéreuses (CSCs) pulmonaires.
Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer en France chez l’homme et la deuxième chez la femme, la première étant le cancer du sein. Il touche 37000 personnes par an. Le taux de survie à 5 ans est très faible, d’où la notion de précocité du diagnostic qui intervient dans cette pathologie où la présente invention prend tout son sens.
Le cancer du poumon comme d’autres types de cancers a de multiples facteurs induisant un taux de mortalité élevé au sein de la population concernée avec notamment un diagnostic tardif, dont découlent à la fois un cancer plus évolué dit métastatique mais aussi un fort taux de récidive. En effet, ce taux dépend directement du stade auquel est dépisté le cancer. Néanmoins, il faut savoir que même lorsque le stade de détection est précoce, le taux de récidive reste élevé car certains paramètres ne sont pour l’heure pas pris en compte.
En effet, ce phénomène de récidive peut s’expliquer en partie par la progression tumorale ainsi que les mécanismes de résistance qui reposent sur l’existence de cellules souches cancéreuses ou cellules initiatrices de tumeur ou cellules pré-cancéreuses, non prise en compte à ce jour. L’échappement thérapeutique de la tumeur aux traitements radio- et chimiothérapeutique dépend de la présence de ces cellules au sein de la tumeur. Par conséquent, la détection de ces cellules dans le tissu tumoral constitue un moyen de définir le niveau d’agressivité de la tumeur. La caractérisation de biomarqueurs spécifiques des cellules souches cancéreuses est donc d’un grand intérêt diagnostique et pronostique dans le traitement du cancer. Cependant, il n’existe pas actuellement de marqueurs spécifiques des cellules souches cancéreuses (CSCs) qui permettent leur discrimination avec certitude des autres cellules tumorales.
Les difficultés majeures pour isoler et caractériser les CSCs résident dans la taille restreinte de leur population (3 à 4% de la population tumorale) et l’absence de marqueurs spécifiques.
Il existe donc un besoin important de diagnostic précoce et de développement d’une nouvelle méthode de détection et/ou d’isolement des cellules souches cancéreuses.
Une identification précoce de la présence des cellules souches cancéreuses permettrait aux cliniciens de disposer d’un facteur prédictif de la maladie.
De plus, elle offrirait de nouvelles perspectives dans le diagnostic de dangerosité du cancer. En effet, l’information supplémentaire disponible pour le clinicien devrait permettre de limiter les risques de récidive ou d’aggravation de la maladie par une adaptation du traitement.
La présente invention concerne une méthode spécifique de détection puisqu’elle ne reconnaît que les cellules souches cancéreuses pulmonaires et est donc plus efficace que les méthodes classiques. De plus, sa mise en œuvre est plus rapide par rapport aux méthodes existantes, car ces dernières ne sont pas généralisables en raison de leur non-reproductibilité et regroupent à la fois des cellules souches et non souches cancéreuses.
Dans un premier aspect, la présente invention concerne l’utilisation, en tant que moyen de marquage, d’une lectine, pour la détection et/ou l’isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Dans un second aspect, la présente invention concerne une méthode d’isolement et de détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires comprenant le marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine.
Dans un troisième aspect, la présente invention concerne une méthode de diagnostic de l’agressivité et/ou du risque de récidive d’un cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire comprenant une étape d’isolement et/ou de détection des cellules cancéreuses pulmonaires.
Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne un kit comprenant une lectine pour détecter ou isoler des cellules souches cancéreuses pulmonaires.
La présente invention repose sur la mise en évidence par les Inventeurs que le motif fucose a 1-2 galactose exprimé à la surface des cellules souches cancéreuses pulmonaires permet de détecter et d’isoler ces cellules en utilisant une lectine reconnaissant ce motif.
Au sens de la présente invention, on entend par « moyen de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires » une substance capable de se lier spécifiquement à un marqueur exprimé à la surface des cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Selon un aspect général, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, choisie parmi les lectines Ulex Europaeus agglutinin 1 (UEA-1), Agaricus Bisporus agglutinin (ABA), Amaranthus Caudatus agglutinin (ACA), jacaline, GSL-I et GSL-II Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I) et Griffonia Simplicifolia lectin II (GSL-II), pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique.
Ces lectines sont bien connues de l’homme de métier et disponibles commercialement (notamment par la société Vector Laboratories). Des revues répertorient leur structure (Lectin Structure, Rini JM, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1995 ; 24 : 551-77) tandis que d’autres plus récentes décrivent tout leur historique (Insight of Lectins-A review, Singh et al., International Journal of Scientific and Engineering Research, volume 3, issue 4, avril 2012) et les avancées dans leur utilisation notamment en immunohistochimie (Lectin Histochemistry : Historical Perspectives, State of the Art, and the Future, Brooks SA, Methods Mol Biol, 2017, 1560 :93-107).
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro de la lectine UEA-1 pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique.
Au sens de la présente invention, l’échantillon biologique est un échantillon prélevé sur un patient présentant un cancer pulmonaire ou susceptible de présenter un cancer pulmonaire, également appelé cancer du poumon.
Cet échantillon est susceptible de contenir des cellules souches cancéreuses.
Contrairement ou en compléments des analyses usuelles en anatomo-pathologie, l’utilisation des lectines selon la présente invention permet in fine de caractériser à un stade précoce ledit échantillon, comme étant pré-tumoral ou tumoral.
Par le terme « pré-tumoral » on entend en amont de la tumeur avec un potentiel pouvant ou non amener un caractère tumoral à l’échantillon.
En effet, l'anatomo-pathologie étudie les lésions macroscopiques et microscopiques de tissus prélevés sur des êtres vivants malades ou décédés par biopsie, frottis ou biopsie extemporanée. Cette branche de la médecine s’attache ainsi à l'étude morphologique des anomalies macroscopiques et microscopiques des tissus biologiques et des cellules pathologiques prélevées, mais pas à la recherche de cellules souches cancéreuses et donc pas aux propriétés d’auto-réplication des cellules.
L’anatomo-pathologie ne permet pas à partir d’études morphologiques, d’établir une caractérisation précoce de l’échantillon car les anomalies observées surviennent à un stade où le caractère d’auto-réplication des cellules cancéreuses est déjà exprimé.
Au contraire, la présente invention s’attachant directement à la détection de la présence de cellules souches cancéreuses, celle-ci permet de caractériser l’échantillon à un stade plus précoce que l’anatomo-pathologie, soit avant même que les cellules souches cancéreuses aient pu exprimer leur caractère d’auto-réplication entraînant les anomalies morphologiques au niveau des tissus.
La méthode selon la présente invention peut être mise en œuvre en aval d’une analyse d’anatomo-pathologie. Dans ce cas l’échantillon est caractérisé comme tumoral, susceptible d’être tumoral ou non suspecté d’être tumoral suite à l’étude d’anatomo-pathologie. La méthode selon la présente invention s’intéressant spécifiquement aux cellules souches cancéreuses, elle permet dans ce cas de confirmer le diagnostic obtenu en anatomopathologie, ou d’infirmer ce diagnostic.
En effet, dans le cas où un échantillon n’est pas suspecté d’être tumoral en anatomopathologie, la présente invention peut permettre d’infirmer ce diagnostic en révélant le caractère tumoral ou pré-tumoral dudit échantillon du fait qu’elle est basé sur des paramètres différent de l’anatomo-pathologie, en l’occurrence la présence et éventuellement la quantification de cellules souches cancéreuses.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange d’au moins deux lectines choisies parmi UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et
GSL-II.
Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisi parmi les mélanges suivants : (UEA-1, AB A), (UEA-1, AC A), (UEA-1, Jacaline), (UEA-1, GSL-I), (UEA-1, GSL-II), (AB A, AC A), (AB A, Jacaline), (ABA, GSL-I), (ABA, GSL-II), (ACA, Jacaline), (ACA, GSL-I), (ACA, GSLII), (Jacaline, GSL-I), (Jacaline, GSL-II), (GSL-I, GSL-II).
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange des deux lectines GSL-I et GSL-II.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange d’au moins trois lectines choisies parmi UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II , en particulier le mélange de UEA-1, jacaline et ABA, ou le mélange de UEA-1, jacaline et ACA.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines choisi parmi les mélanges suivants :
(UEA-1, ABA, ACA), (UEA-1, ABA, Jacaline), (UEA-1, ABA, GSL-I), (UEA-1, ABA, GSL-II), (UEA-1, ACA, Jacaline), (UEA-1, ACA, GSL-I), (UEA-1, ACA, GSL-II), (UEA-1, Jacaline, GSL-I), (UEA-1, Jacaline, GSL-II), (UEA-1, GSL-I, GSL-II), (ABA, ACA, Jacaline), (ABA, ACA, GSL-I), (ABA, ACA, GSL-II), (ABA, Jacaline, GSL-I), (ABA, Jacaline, GSL-II), (ABA, GSL-I, GSL-II), (ACA, Jacaline, GSL-I), (ACA, Jacaline, GSLII), (ACA, GSL-I, GSL-II), (Jacaline, GSL-I, GSL-II).
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro du mélange des trois lectines UEA-1, jacaline et ABA, ou du mélange de UEA-1, jacaline et ACA.
L’utilisation de deux ou trois lectines permet dans certains cas une meilleure spécificité du marquage des cellules souches cancéreuses.
La combinaison des deux GSL est un mode de réalisation avantageux dans la détection et l’isolement des CSCs.
La lectine utilisée dans le cadre de l’invention peut être conjuguée.
Au sens de l’invention, on entend par le terme « conjuguée » que la lectine est liée de manière covalente à une autre molécule.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à un fluorophore.
Au sens l’invention, un fluorophore peut être tout fluorophore susceptible d’être utilisé pour la cytométrie en flux. De tels fluorophores sont disponibles dans le commerce. Il s’agit par exemple de l’Alexa fluor, en particulier l’Alexa fluor 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 750 ou 790, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la Rhodamine, l’allophycocyanine (APC) et la Phycoérythrine (PE).
Avantageusement, le fluorophore est choisi parmi la rhodamine, le FITC ou l’Alexa fluor, en particulier l’Alexa fluor 488, l’Alexa fluor 594 ou l’Alexa fluor 633.
Cette caractérisation du fluorophore au sens de l’invention, s’applique à tout mode de réalisation de la présente invention faisant intervenir un fluorophore.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à un radio-isotope.
Au sens de l’invention, un radio-isotope est choisi parmi l’iode 125, le tritium ou le technétium.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à une enzyme.
Au sens de l’invention, l’enzyme est une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, c’est-à-dire une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou une enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent, c’est-à-dire une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent.
Au sens de l’invention, un « substrat chromogène » désigne un substrat donnant un produit coloré après conversion par une enzyme.
Au sens de l’invention un « substrat chimioluminescent» désigne un substrat donnant un produit luminescent après conversion par une enzyme.
Dans un cas particulier de l’invention, ladite enzyme catalysant la formation d’un produit coloré est choisie parmi la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la β-galactosidase.
Dans le cas particulier de la HRP, le substrat chromogène est choisi parmi 3,3'Diaminobenzidine (DAB), 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB), ou 2,2'-azino-bis(acide 3ethylbenzothiazoline-6-sulphonique) (ABTS).
Dans le cas particulier de la phosphatase alcaline, le substrat chromogène est le NBT (Nitrobleu de tétrazolium) et le BCIP (bromochlorylindolophosphate).
Dans un cas particulier de l’invention, ladite enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent est la HRP et le substrat luminescent est le luminol.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à des billes d’or.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à la biotine.
Il a également été mis en évidence par les Inventeurs que les cellules souches cancéreuses pulmonaires pouvaient être détectées via l’utilisation d’une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Au sens de la présente invention, on entend par « détection » le fait d’identifier par des méthodes d’UV/visible, de luminescence, de fluorescence, de radioactivité, d’enzymologie la présence de cellules souches cancéreuses pulmonaires au sein d’un échantillon biologique.
Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires suivi de la détection des cellules souches cancéreuses dans un échantillon biologique, via la détection de ladite lectine conjuguée.
Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée de manière covalente à un fluorophore.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à un fluorophore et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires par microscopie à fluorescence ou par lecteur de fluorescence.
Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à un radio-isotope.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à un radio-isotope et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par une gamma caméra.
Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène ou un substrat chimioluminescent.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à la péroxydase de raifort et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par microscopie à luminescence ou par un lecteur de luminescence par ajout d’un substrat chimio luminescent, tel que le luminol.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à la péroxydase de raifort et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par microscopie UV/visible ou par lecteur d’absorbance, via l’ajout d’un substrat chromogène choisi parmi 3,3'-Diaminobenzidine (DAB), 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB), ou 2,2'azino-bis(acide 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonique) (ABTS).
Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à des billes d’or.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à des billes d’or et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par microscopie électronique.
Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à la biotine, pour donner une lectine biotinylée.
Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à la biotine et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par la lectine conjuguée à la biotine par l’un des modes précédemment décrit dans le quel ledit marqueur, fluorophore, radio-isotope, enzyme, billes d’or, est lui-même conjugué avec de la streptavidine ou de l’avidine.
Lorsque le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à la biotine et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par la lectine conjuguée à la biotine, la détection est faite :
o par microscopie à fluorescence lors de l’utilisation d’un fluorophore conjugué à de la streptavidine ou à de l’avidine, o par lecteur de luminescence lors de l’utilisation d’une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent conjuguée à de la streptavidine ou à de l’avidine o par gamma caméra lors de l’utilisation d’un radio-isotope conjugué à de la streptavidine ou à de l’avidine, o par microscopie électronique lors de l’utilisation de billes d’or conjuguées à de la streptavidine ou à de l’avidine, o par microscopie UV/visible lors de l’utilisation d’une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à de la streptavidine ou à de l’avidine.
Il a également été mis en évidence par les Inventeurs que les cellules souches cancéreuses pulmonaires pouvaient être isolées via l’utilisation d’une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Par « isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires » on entend l’extraction des cellules souches cancéreuses pulmonaires d’un échantillon biologique, débarrassées de tout autre type cellulaire.
Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires suivi de l’isolement des cellules souches cancéreuses dans un échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée.
Cet isolement permet un enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Par le terme « enrichissement », on entend que la proportion des cellules souches cancéreuses pulmonaires par rapport aux cellules totales contenues dans l’échantillon est augmentée, du fait de la déplétion de l’échantillon en cellules non souches cancéreuses.
On parle alors d’un échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Ainsi par l’expression « isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires » dans le contexte de l’invention, on entend « enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses pulmonaires ».
Ainsi, au sens de la présente invention, on entend également par « isolement » le fait d’obtenir une population de cellules enrichie en cellules souches cancéreuses pulmonaires à partir d’un échantillon biologique. Le terme « enrichi » désigne au sens de la présente invention une population de cellules dans laquelle le rapport nombre de cellules souches cancéreuses / nombre total de cellules est d’ au moins 9 tel que déterminé par le rapport cellules Epcam high + / cellules Epcam high - par cytométrie en flux.
L’enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses permet une détection et une quantification plus fiable et plus aisée des cellules souches cancéreuses du fait que la population cellulaire recherchée est alors présente en plus grande proportion dans l’échantillon.
Ainsi, il a été mis en évidence par les Inventeurs qu’un échantillon biologique pouvait être enrichi en cellules souches cancéreuses de manière particulièrement efficace en utilisant une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose.
Dans un mode de réalisation particulier, l’isolement des cellules souches cancéreuses marquées par au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose peut être suivie d’une étape d’amplification cellulaire. Ainsi, après l’isolement des cellules, celles-ci peuvent être mises en culture dans un milieu permettant d’augmenter la quantité de cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée et est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées.
Dans un mode particulier de réalisation, la lectine est conjuguée à la biotine et l’isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées est réalisé via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine.
Dans ce mode de réalisation, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées avec une lectine conjuguée à la biotine, sont fixées sur le support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine, par l’affinité biotine-streptavidine ou biotine-avidine.
Le support peut également être en verre, en polydiméthylsiloxane (PDMS), en silicone, ou en plastique tel que le polyméthylméthacrylate (PMMA), le polystyrène (PS) ou en copolymère cyclique d’oléfines (COC).
Des exemples de supports appropriés sont donnés dans la revue de Kim et al. (Protein immobilization techniques for microfluidics assays, Kim et al., Biomicrofluidics, 7, 041501, 2013).
Par le terme « fonctionnalisé », on entend que le support est chimiquement modifié pour être recouvert de streptavidine ou d’avidine immobilisée.
La revue Kim et al., précédemment citée, donne des exemples de fonctionnalisation de support.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit support est constitué de billes magnétiques.
Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l’invention, ledit support est constitué de billes magnétiques et l’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées est réalisé par tri magnétique en présence d’un aimant.
Dans ce mode de réalisation, les cellules souches cancéreuses pulmonaires avec une lectine conjuguée à la biotine, sont fixées sur les billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine, par l’affinité biotine-streptavidine ou biotine-avidine.
Sous l’effet d’un aimant, les cellules souches cancéreuses pulmonaires fixées sur les billes magnétiques sont isolées au sein de l’échantillon.
Cet isolement peut être suivi de la récupération de l’échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses, par élimination du surnageant, puis par élution des cellules souches cancéreuses liées audit support.
Ladite élution peut être réalisée en condition acide pour rompre la liaison streptavidine- biotine ou avidine-biotine.
Dans le cas particulier où ledit support est constitué par des billes magnétiques et où la streptavidine ou l’avidine est liée aux billes magnétiques par une liaison ADN, ladite élution est réalisée par traitement à la DNAse.
Selon un autre mode de réalisation, la lectine utilisée pour le marquage est une lectine conjuguée à un fluorophore et l’isolement est réalisé par tri cellulaire en cytométrie en flux.
Le tri cellulaire par cytométrie en flux permet ainsi d’obtenir une fraction de l’échantillon enrichie en cellules souches cancéreuses pulmonaires.
La cytométrie en flux est une technique bien connue de l’Homme du métier qui permet notamment de trier les cellules en différentes fractions en fonction de leur marquage fluorescent.
Le tri cellulaire par cytométrie en flux dans le cadre de l’invention permet ainsi d’obtenir :
- d’une part, une fraction de l’échantillon comportant les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par une lectine conjuguée à un fluorophore, et
- d’autre part, une fraction de l’échantillon contenant les autres types cellulaires contenus dans l’échantillon de départ.
L’invention permet également le marquage, l’isolement puis la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires en utilisant au moins une lectine conjuguée.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires avec une lectine conjuguée est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées puis de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées, via un nouveau marquage desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine.
Ainsi dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à une biotine ou à un fluorophore et est suivi de
- l’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine dans le cas d’une lectine conjuguée à la biotine comme décrit dans la présente invention, ou via la cytométrie en flux dans le cas d’une lectine conjuguée avec un fluorophore, comme décrit dans la présente invention, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées et isolées,
- puis d’un nouveau marquage avec une lectine conjuguée selon l’invention, desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées et isolées, suivi de la détection desdites cellules selon les modes de détection décrits dans la présente demande.
Selon un mode de réalisation de la présente invention ledit échantillon biologique à partir duquel les cellules souches cancéreuses sont isolées ou détectées est un échantillon biologique pulmonaire.
L’échantillon biologique pulmonaire peut notamment être une biopsie tumorale prélevée chez un patient atteint d’un cancer des poumons ou une biopsie prélevée chez un patient suspecté d’avoir un tel cancer.
L’échantillon biologique pulmonaire peut également être une lignée cellulaire cancéreuse pulmonaire ou une tumeur induite chez un animal par injection de lignées cellulaires cancéreuses, par exemple chez la souris ou le rat. La lignée cellulaire est de préférence une lignée cellulaire cancéreuse pulmonaire. Selon ce mode de réalisation, la tumeur induite contient des cellules souches cancéreuses pulmonaires qui sont avantageusement isolées des autres cellules de la tumeur afin d’être étudiées.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique, dans laquelle ledit échantillon biologique est constitué par des cellules en suspension.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline,
GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique, dans laquelle ledit échantillon biologique est constitué par un tissu cellulaire.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro telle que précédemment décrite, d’un mélange d’au moins deux lectines, lesdites au moins deux lectines étant en quantité égale dans ledit mélange.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro telle que précédemment décrite, de deux lectines, lesdites deux lectines étant un mélange de GSL-I et GSL-II, dans lequel chacune des lectines sont en quantité égale.
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro telle que précédemment décrite, de trois lectines, lesdites trois lectines étant choisies parmi un mélange de UEA-1, jacaline et AB A, ou un mélange de UEA-1, jacaline et AC A, et lesdites trois lectines étant présentes chacune dans le mélange en quantité égale.
La présente invention concerne également un procédé de marquage in vitro des cellules souches cancéreuses pulmonaires, comprenant une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique.
Ce procédé de marquage peut être intégré au sein d’un procédé de détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires utilisant une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, la biotine ou des billes d’or.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique, comprenant:
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape de détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à un fluorophore, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées sont détectées par microscopie à fluorescence ou lecteur de fluorescence.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à un radio-isotope, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées sont détectées par une gamma caméra.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré telle que la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la β-galactosidase, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées sont détectées par microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance suite à l’ajout d’un substrat chromogène.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à une enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent telle la HRP, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées sont détectées en microscopie à luminescence ou par un lecteur de luminescence, suite à l’ajout d’un substrat chimioluminescent tel que le luminol.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à des billes d’or, les cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées sont détectées par microscopie électronique.
Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée avec de la biotine, lesdites cellules souches cancéreuses pulmonaires sont détectées par l’un des modes de détection décrit ci-dessus dans lequel ledit marqueur est conjugué à la streptavidine ou à l’avidine.
Le procédé de marquage peut également être intégré au sein d’un procédé d’isolement de cellules souches cancéreuses pulmonaires utilisant une lectine conjuguée un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, la biotine ou des billes d’or.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon la présente invention permet d’isoler les cellules souches cancéreuses pulmonaires. Cette étape d’isolement permet en particulier d’étudier les cellules souches cancéreuses pulmonaires détectées dans un échantillon tumoral pulmonaire afin, par exemple, de découvrir de nouveaux traitements capables d’éliminer ces cellules souches cancéreuses fréquemment à l’origine de récidives et de métastases.
Par « procédé in vitro d’isolement », on entend que l’échantillon biologique est enrichi en cellules souches cancéreuses (CSCs) pulmonaires par déplétion des cellules non souches cancéreuses (CNSCs) pulmonaires.
Les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont spécifiquement séparées des autres types cellulaires présents dans l’échantillon, tel qu’éventuellement des cellules non souches cancéreuses pulmonaires (CNSCs), par l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II.
Cet enrichissement de l’échantillon en CSCs permet d’obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont majoritairement représentées, c’està-dire qu’elles sont présentent en quantité supérieure par rapport aux autres types cellulaires, notamment par rapport aux CNSCs.
Ainsi, la présente invention concerne également un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique comprenant :
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine ou à un fluorophore, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine.
Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon comprenant :
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisi parmi les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine, via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine.
Cet isolement peut être suivi de la récupération de l’échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses, par élimination du surnageant, puis par élution des cellules souches cancéreuses liées audit support.
Ladite élution peut être réalisée en condition acide pour rompre la liaison streptavidine/avidine - biotine.
Selon un mode de réalisation, ledit support est constitué par des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine et ladite étape d’isolement est réalisée par tri magnétique en présence d’un aimant.
Dans le cas particulier où ledit support est constitué par des billes magnétiques et où la streptavidine ou l’avidine est liée aux billes magnétiques par une liaison ADN, ladite élution est réalisée par traitement à la DNAse.
Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique comprenant :
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisi parmi les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un fluorophore pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine, par tri cellulaire en cytométrie en flux.
Le tri cellulaire en cytométrie en flux permet ainsi d’obtenir une fraction de l’échantillon enrichie en cellules souches cancéreuses.
Avant le marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires à l’étape (a), les cellules de l’échantillon sont avantageusement dissociées les unes des autres. Cette dissociation des cellules peut être réalisée selon des procédures conventionnelles, par exemple en utilisant une ou plusieurs enzymes capables de séparer les cellules les unes des autres sans altérer les glycanes exprimés à la surface des cellules, en particulier le motif fucose a 1-2 galactose. La dissociation des cellules peut par exemple être mise en œuvre avec le mélange Liberase® commercialisé par la société Roche Diagnostic.
La présente invention concerne donc également des procédés selon l’invention, comprenant une étape préalable de dissociation des cellules de l’échantillon les unes des autres avant l’étape de marquage.
L’étude des cellules souches cancéreuses à des fins de recherche et de diagnostic représente aujourd’hui une nécessité, en particulier pour mettre en évidence de nouvelles substances capables d’agir contre ces cellules. L’étude de ces cellules est également particulièrement utile dans le cadre de la médecine personnalisée.
Les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont une population de cellules particulières qui, en raison de leur résistance aux traitements de chimiothérapie, conduisent à la reformation de la tumeur et à la récidive tumorale. La présente invention permet donc, par la détection ou l’isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires, d’évaluer le risque de récidive du cancer pulmonaire.
La détection des cellules souches cancéreuses pulmonaires, éventuellement suivie de leur quantification, permet d’évaluer les risques de progression d’une tumeur.
La présente invention concerne donc également l’utilisation d’une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le diagnostic in vitro du risque de récidive et/ou de l’agressivité d’un cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire.
Ainsi, la présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire, comprenant une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires d’un échantillon biologique pulmonaire avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic selon l’invention comprend les étapes de :
(a) Marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine, dans ledit échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radioisotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine, (b) Détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par
- microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;
- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;
(c) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires ;
(d) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique (e) Déduction du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic selon l’invention comprend les étapes de :
(a) Marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore ou de la biotine, (b) Isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine conjuguée :
lors du marquage avec une lectine conjuguée la biotine, ledit isolement est effectué via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine, en particulier ledit support fonctionnalisé est constitué de billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine et ledit isolement est effectué par tri cellulaire magnétique en présence d’un aimant, ou lors du marquage avec une lectine conjuguée un fluorophore, ledit isolement est effectué par tri cellulaire en cytométrie en flux.
(c) Nouveau marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées et marquées par le nouveau marquage, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radioisotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine, (d) Détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées et marquées par le nouveau marquage par
- microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;
- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;
(e) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires ;
(f) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique ;
(g) Déduction du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Par le terme de « cancer pulmonaire », on entend cancer du poumon.
L’intensité de la détection des cellules souches cancéreuses pulmonaires, et éventuellement leur quantification est comparée par rapport un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique.
L’échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique est utilisé comme témoin.
Par « échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique » on entend un échantillon prélevé sur le même individu que l’échantillon biologique, mais dans un tissu voisin de celui où est prélevé ledit échantillon biologique, et qui ne présente pas de cellules tumorales en analyse d’anatomo-pathologie et qui ne présente pas de cellules souches cancéreuses par la méthode selon l’invention.
L’échantillon sain est donc un échantillon caractérisé par l’absence de cellules tumorales en analyse par anatomo-pathologie et l’absence de cellules souches cancéreuses par la méthode selon l’invention.
La quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires permet de déterminer l’agressivité du cancer pulmonaire. Cette quantification peut être établie par différentes méthodes telles que : la cytométrie en flux, le western blot, la PCR quantitative avec des marqueurs génériques tels que Oct-4, cMycl, Gli-1 ou EpCam ou un test de clonogénicité.
Plusieurs de ces méthodes peuvent également être utilisées en parallèle afin de former un faisceau de présence de CSCs et ainsi augmenter la fiabilité de la quantification.
Dans un mode de réalisation particulier, la quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisée par un test de clonogénicité.
Un test de clonogénicité consiste en la mise en culture de l’échantillon biologique pour observer la capacité des cellules à reformer des sphères tumorales. Cette propriété d’autorenouvellement et d’auto-réplication est propre aux cellules souches cancéreuses, une cellule souche cancéreuse unique est ainsi à l’origine d’une sphère tumorale formée. Ainsi, la comptabilisation des sphères tumorales formées, permet de quantifier les cellules souches cancéreuses dans l’échantillon.
Ces méthodes, avantageusement la qPCR avec des marqueurs génériques tels que Oct-4, cMyc, Gli-1 ou EpCam et le test de clonogénicité, permettent également la détection des cellules souches cancéreuses afin de déterminer la présence ou l’absence de ces cellules après l’étape d’isolement des cellules souches cancéreuses.
Ces méthodes se présentent donc comme des alternatives aux susdites étapes (c) et (d), correspondant respectivement au nouveau marquage et à la détection des cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées.
Cette détection est facilité et rendue plus fiable de par l’enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses.
La détection par ces méthodes permet également de valider l’efficacité de l’enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses pulmonaires par la méthode selon l’invention, soit l’efficacité de la méthode à isoler des cellules souches cancéreuses pulmonaires.
Dans les méthodes de diagnostic de la présente invention, plus l’intensité de la détection dans l’échantillon biologique est élevé par rapport à un échantillon sain jouxtant le l’échantillon biologique, plus le risque de récidive du cancer pulmonaire est fort et plus le cancer est agressif.
De la même manière, plus la quantité de de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans l’échantillon biologique est élevée par rapport à un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, plus le risque de récidive du cancer pulmonaire est fort et plus le cancer est agressif.
La détection et la quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon biologique permettent ainsi de déterminer l’agressivité du cancer pulmonaire et sa capacité à se développer.
La détection et la quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires s’inscrivent également dans une démarche de médecine personnalisée. En effet, la détection des cellules souches cancéreuses pulmonaires dans l’échantillon biologique permettant d’évaluer la valeur pronostique du traitement, permet ainsi d’adapter le traitement.
La présente invention concerne également un kit de détection in vitro de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique, comprenant au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine.
La présente invention concerne également un kit d’isolement in vitro de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique, comprenant au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSLI et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine.
La présente invention concerne également un kit d’isolement in vitro de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique comprenant au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisi parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un fluorophore.
La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire, comprenant :
- au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine,
- et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, conjuguée à un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.
La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire, comprenant :
- au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée un fluorophore,
- et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, conjuguée à la biotine, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.
Les diagnostics selon l’invention sont réalisés sur un échantillon biologique, en particulier un échantillon pulmonaire.
Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins deux lectines conjuguées choisies parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSLII, lesdites au moins deux lectines conjuguées étant en quantité égale.
Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins trois lectines conjuguées choisies parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSLII, lesdites au moins deux lectines conjuguées étant en quantité égale.
DESCRIPTION DES FIGURES :
La Figure 1 montre les résultats de la séparation de cellules souches cancéreuses pulmonaires sur un échantillon de cellules issues de la lignée A549 ce à l’aide du ratio Epcam High + / Epcam High - avec utilisation des billes magnétiques sur lesquelles est greffée de la streptavidine et UEA-1 biotinylée (Lectine UEA-1), AB A biotinylée (Lectine AB A), AC A biotinylée (Lectine ACA), Jacaline biotinylée (Lectine Jacaline), GSL-I biotinylée (Lectine GSL-I), GSL-II biotinylée (Lectine GSL-II), le mélange de lectines biotinylées UEA-1 / Jacaline / AB A (Mélange 1), le mélange de lectines biotinylées UEA-1 / Jacaline / ACA (Mélange 2), et le mélange de lectines biotinylées GSL-I / GSL-II (Mélange 3).
EXEMPLES
Exemple 1 : Protocole d’isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires
I. Matériels requis
Réactifs et matériel
Lectine individuelle biotinylée ou mélange de lectines biotinylées marquant spécifiquement les Cellules Souches Cancéreuses du Cancer Pulmonaire (préparé à partir des lectines individuelles Vector Laboratories)
Kit CELLection Biotin Binder (Invitrogen) contenant des billes magnétiques couplées à la streptavidine par une liaison ADN
Aimant
Tampons
Versène (Invitrogen) comprenant du tampon phosphate salin (PBS) et de l’EDTA
Tampon 1 : PBS (Tampon phosphate salin sans Ca2+ et Mg2+) avec 0.1% BSA (Albumine de sérum bovin), pH 7.4
Tampon 2 : PBS (Phosphate Buffer Saline sans Ca2+ et Mg2+) avec 0.1% BSA (Bovine Sérum Albumine) et 0.6% de citrate de sodium
Tampon 3 : RPMI 1640 avec 1% de FCS ( Sérum de veau fêtai), ImM CaCl2 et 5mM de MgCl2, pH 7.0-7.4.
II. Durée de l’expérimentation min pour préparer les cellules min pour marquer les cellules min pour incuber les cellules marquées avec les billes min pour récupérer la suspension non enrichie en CSCs min pour casser la liaison CSCs/billes min pour récupérer la suspension enrichie en CSCs d’intérêt
- TOTAL : lh30
III. Mode opératoire par tri magnétique :
1. Préparation des cellules. Les cellules de la lignée A549 (lignée immortalisée de cancer du poumon provenant d’un prélèvement de patient atteint d’un cancer du poumon) sont décollées de leur support avec du Versène pendant 10 min à 37°C.
2. Les cellules sont comptées et le nombre de cellules est ajusté à 1.107 dans l’échantillon.
3. La suspension cellulaire est centrifugée à 300g pendant 10 min puis le surnageant est éliminé.
4. Blocage des sites aspécifiques. lmL de Tampon 2 est ajouté.
5. Marquage des cellules. Une quantité totale en lectines de 10 pg est ajoutée, de manière à ce que lors d’une pluralité de lectines, les quantités de chacune soient identiques.
Ainsi, sont ajoutés :
- 10 pg d’une lectine individuelle biotinylée choisie parmi : UEA-1, AB A, AC A, Jacaline, GSL-I et GSL-II, ou
- 3.33 pg de chaque lectine pour le mélange 1 (UEA-1 / ABA / Jacaline), ou
- 3.33 pg de chaque lectine pour le mélange 2 (UEA-1 / ACA / Jacaline) ou
-5 pg de chaque lectine pour le mélange 3 (GSL-I / GSL-II)
Le mélange alors obtenu est incubé 10 min à 4°C.
6. 500pL de Tampon 2 est ajouté afin de laver les cellules et la suspension est centrifugée à 300g pendant 10 min et le surnageant est éliminé.
7. Ajout des billes. Les cellules sont resuspendues dans lmL de Tampon 2 puis 25pL de billes magnétiques couplées à la streptavidine préalablement lavées sont ajoutées et resuspendues à l’aide de Tampon 1. Le mélange est incubé 20 min à 4°C sous agitation douce.
8. Récupération de la suspension NON enrichie en CSCs. Le tube est alors placé sur l’aimant pendant 2 min. Les cellules marquées par les lectine biotinylées et liées aux billes magnétiques couplées à la streptavidine, précipitent en direction de l’aimant (tri cellulaire magnétique) et sont alors séparées des cellules non marquées. Le surnageant contenant les cellules non marquées est ensuite retiré en maintenant le tube placé sur l’aimant, et est conservé dans un tube Falcon
9. Le tube contenant alors les cellules souches cancéreuses marquées est retiré de l’aimant, lmL de Tampon 1 est ajouté, le tube est agité par vortex et replacé sur l’aimant pendant 2 min avant de conserver de nouveau le surnageant dans le même falcon qu’à l’étape 8. Cette étape est répétée deux fois.
10. Les cellules souches cancéreuses marquées, encore liées aux billes magnétiques, sont resuspendues à l’aide de 200μ1 de Tampon 3 préchauffé à 37°C. 4pL de tampon de coupure de la liaison cellules/billes constitué de DNasel sont ajoutés. Ce mélange est incubé 15 min à température ambiante sous agitation douce.
11. La suspension est agitée avec une pipette vigoureusement 5 à 10 fois afin de faciliter la libération des cellules.
12. Récupération de la suspension enrichie en CSCs. Le tube est placé sur l’aimant pendant 2 min. Les billes magnétiques sont alors séparées des cellules souches cancéreuses marquées et le surnageant contenant les cellules souches cancéreuses marquées est transféré dans un tube contenant 200pL de tampon 3 préchauffé à 37°C. Les étapes 11 et 12 peuvent être répétées une nouvelle fois afin d’enrichir le rendement.
Ces expériences ont été réalisées dans des conditions similaires avec chacune des lectines individuellement (UEA-1, AB A, AC A, Jacaline, GSL-I, GSL-II), un mélange de deux lectines (Mélange 3 : GSL-I / GSL-II ) ou deux mélanges de trois lectines (Mélange 1 : UEA-1 / AB A / Jacaline; Mélange 2 : UEA-1 / ACA / Jacaline ).
Les résultats de ces différents essais sont présentés dans la figure 1.
Ainsi que le montrent les résultats de ces essais, l’utilisation d’UEA-1 seule permet l’isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires et ce de façon prépondérante par rapport aux autres essais réalisés en parallèle.
De bons résultats sont également obtenus avec la lectine GSL II seule et avec le mélange 3 constitué d’un mélange des lectines GSL-I / GSL-II en quantité égale.
Exemple 2 : Test de clonogénicité
L’objectif d’un test de clonogénicité est d’observer la capacité des cellules à reformer des sphères (correspondant chez le patient à la reformation d’une masse tumorale) donc leur capacité proliférative.
Le test de clonogénicité est dans cet exemple utilisé pour confirmer la présence des cellules souches cancéreuses pulmonaires et quantifier lesdites cellules dans un échantillon après isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires par la méthode d’isolement décrite dans la présente invention. Il permet ainsi de démontrer l’efficacité de la méthode d’isolement selon l’invention par rapport à un échantillon témoin non soumis cette méthode (cellules non triées).
Les tests de clonogénicité ont été réalisés dans une plaque à 6 puits à une densité de 500 cellules /cm2 dans un milieu de composition DMEM (Gibco) supplémenté de 50 unités/mL de pénicilline, 50 unités/mL de streptomycine (Gibco) et 2.4 g/L de bicarbonate de sodium, 1 M de tampon HEPES (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), IX progestérone (Sigma Aldrich), IX putrescine (Sigma), 0.025 g/mL héparine (Sigma Aldrich), 30% (m/v) glucose (Sigma Aldrich,), IX supplément de croissance B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng/mL EGF (Sigma Aldrich), 20 ng/mL FGF humain basique (Sigma Aldrich), IX supplément insuline-transferrine- sélénite de sodium (Roche diagnostics, Meylan, France).
L’évolution des colonies a été observée après incubation à 37 °C dans une atmosphère de CO2 pendant trois semaines et quantifiée avec le logiciel ImageJ®.
Les cellules souches cancéreuses issues de cancers pulmonaires isolées à partir de la méthode d’isolement décrite dans la présente invention conduisent à la formation de sphères contrairement au témoin. Il s’agit d’un test de clonogénicité ayant pour témoin des cellules non triées (T-), contre des cellules triées positivement par UEA-1 biotinylée (Lectine UEA-1), ABA biotinylée (Lectine ABA), ACA biotinylée (Lectine ACA), Jacaline biotinylée (Lectine Jacaline), GSL-I biotinylée (Lectine GSL-I), GSL-II biotinylée (Lectine GSL-II), le mélange de lectines biotinylées UEA-1 / Jacaline / ABA (Mélange 1), le mélange de lectines biotinylées UEA-1 / Jacaline / ACA (Mélange 2), et le mélange de lectines biotinylées GSL-IGSL-II (Mélange 3). La méthode selon la présente invention permet donc d’obtenir des cellules souches capables de reformer des tumeurs (résultats non présentés).
Exemple 3 : Marquage visible de lectines sur coupe histologique paraffinée
Matériel utilisé : Blocs de paraffine, Glace, Microtome, Lames superfrost®, Automate Bond Max (Leica Microsystems) avec ordinateur, Consommables Leica (alcool, tampon de lavage, tampon ER1, tampon dewax, étiquettes, coverslips, tubes), tampon PB S-BSA 5%, Lectines biotinylées (UEA-1, Jacaline, ABA, ACA, GSL-I et GSL-II) (Vector Lab), Kit Bond Intense R détection (Leica), milieu de montage Leica, lamelles et microscope.
Les blocs de paraffine contenant les prélèvements de poumon provenant de chacun des patients identifiés par leur numéro (donné par le service d’anatomie pathologique) ont été placés dans la glace pendant environ 1 heure afin d’être refroidis, ceci afin de faciliter leur coupe au microtome à une épaisseur de 4pm.
Des lames dites « superfrost », ceci pour un maximum d’adhésion du tissu coupé ont été identifiées par les mêmes numéros que ceux présents sur les blocs. Une goutte d’eau a été placée au centre de chacune de ces lames.
Les coupes ont été réalisées au microtome et placées sur la goutte d’eau préalablement déposée. Les lames ont par la suite été posées sur une plaque chauffante à 37°C afin de faciliter leur adhésion et l’excédent d’eau a été retiré. L’ensemble des lames réalisé a été placé au sein d’une étuve à 37°C dans l’objectif de les sécher.
La suite de la manipulation a fait intervenir l’automate Bond Max de chez Leica relié à un ordinateur possédant un logiciel pilotant l’automate.
Durant le temps où les lames sont à l’étuve, l’ensemble de la manipulation de marquage immunohistochimique a été préparé en commençant par la vérification du niveau sur l’automate de chacun des produits nécessaires à la réalisation de la manipulation, puis à l’identification des lames avec leur même numéro ceci sur le logiciel pilotant l’automate. Des étiquettes permettant un protocole standardisé ont été générées. La dilution des lectines et leur quantité ont été calculées et le kit nécessaire préparé. Il est à noter que chacun des produits utilisés a dû être scanné et le niveau remis à zéro avant chacune des expérimentations effectuées.
Les étiquettes ont par la suite été collées sur leurs lames correspondantes à la sortie de l’étuve et des covershps, éléments en plastique placés sur la coupe permettant une répartition homogène du produit sur toute la surface de la lame au cours de la manipulation grâce aux propriétés de contact, ont été placés sur chacune des lames.
Le portoir de lames a été placé dans l’automate et après reconnaissance par le lecteur de chacun des éléments et des lames identifiés par leurs codes-barres présents sur les étiquettes, la manipulation a été initiée.
Elle a commencé par un déparaffinage à la chaleur grâce au produit Dewax de chez Leica permettant par la suite l’accessibilité des anticorps. Cette étape ainsi que toutes les autres a été suivie de lavages, grâce au Bond Wash 10X préalablement dilué, ceci à trois reprises.
Cette étape a été suivie d’un prétraitement pendant 5 min avec un tampon citrate à pH =6, le tampon ER1) de chez Leica, qui permet de démasquer les antigènes, c’est-à-dire de les rendre accessibles.
La lectine biotinylée ou un mélange de lectines biotinylées (2 ou 3) choisies parmi UEA-1, ABA, ACA, Jacaline, GSL-I, GSL-II, ceci toujours à l’aide du diluant PBS BSA-5% (afin d’empêcher les accroches aspécifiques de par son pouvoir saturant), a été placé sur la coupe pendant 20 min.
Le kit Bond Intense R détection (Leica) grâce à l’intervention d’une streptavidine-HRP jouant le rôle d’anticorps secondaire a permis de par ses propriétés de révéler cette ou ces lectines biotinylées en marron grâce aux propriétés de la DAB, substrat de l’enzyme HRP (peroxydase du raifort), permettant de révéler le complexe biotine/streptavidine-HRP.
Une étape de contre coloration bleutée grâce à la présence d’hématoxyline a ensuite été réalisée pendant 7 min afin de rendre l’ensemble du prélèvement identifiable.
Les lames ont été retirées de l’automate. Les coupes ont été ensuite réhydratées en plongeant les lames manuellement dans un bain d’alcool par deux fois pendant 5 min. Cette étape de réhydratation a été poursuivie par un bain de toluène durant 5 min également.
Les lames ont pu dès lors être montées en mettant une goutte de milieu de montage (Leica).
Les lames ont enfin été observées au microscope.
Le marquage d’un tissu sain pulmonaire par UEA-1 a montré l’absence de marquage des cellules. Il peut donc en être déduit l’absence de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ce tissu (résultats non présentés).
Dans un tissu tumoral coexistent plusieurs types cellulaires : des cellules non-souches tumorales, des cellules souches non-tumorales, des cellules souches tumorales et des cellules non-souches non-tumorales. Le marquage d’un tissu tumoral par UEA-1 seul met en évidence la capacité de la lectine UEA-1 à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses pulmonaires (résultats non présentés).
Claims (11)
1. Utilisation in vitro d’au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose pour le marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires, choisie parmi les lectines Ulex Europaeus agglutinin 1 (UEA-1), Agaricus Bisporus agglutinin (ABA), Amaranthus Caudatus agglutinin (ACA), jacaline, GSL-I et GSL-II Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I) et Griffonia Simplicifolia lectin II (GSL-II), pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans un échantillon biologique, notamment au moins deux lectines choisies parmi UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSLI et GSL-II, en particulier le mélange de GSL-I et GSL-II, notamment au moins trois lectines choisies parmi UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II , en particulier le mélange de UEA-1, jacaline et ABA, ou le mélange de UEA-1, jacaline et ACA.
2. Utilisation in vitro selon la revendication 1, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi :
- un fluorophore en particulier choisi parmi la rhodamine, FITC ou l’Alexa Fluor
- un radio-isotope en particulier choisi parmi l’iode 125, le tritium ou le technétium,
- une enzyme utilisant un substrat chromogène ou luminescent, ladite enzyme étant en particulier choisie parmi la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la β-galactosidase,
- des billes d’or ou
- la biotine.
3. Utilisation in vitro selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires est réalisé avec une lectine conjuguée et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées via la détection de la lectine conjuguée.
4. Utilisation in vitro selon l’une des revendications 1 à 3, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses pulmonaires avec une lectine conjuguée à un marqueur est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées, dans laquelle ledit marqueur est la biotine et ledit isolement est réalisé via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine constitué de billes magnétiques et en présence d’un aimant, ou dans laquelle ledit marqueur est un fluorophore et ledit isolement est réalisé en cytométrie en flux.
5. Utilisation in vitro selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon biologique pulmonaire.
6. Procédé in vitro de détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique, comprenant:
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, choisie parmi les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape de détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine.
7. Procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses pulmonaires, dans un échantillon biologique comprenant :
(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose, les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine ou à un fluorophore, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses pulmonaires sont marquées par au moins une lectine, suivi d’ (b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine, ladite étape d’isolement étant réalisée via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine constitué par des billes magnétiques et en présence d’un aimant, lorsque ladite lectine est conjuguée à la biotine, et ladite étape d’isolement étant réalisée par tri cellulaire en cytométrie en flux, lorsque ladite lectine est conjuguée à un fluorophore.
8. Méthode de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire, comprenant une étape de marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires d’un échantillon biologique pulmonaire avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon.
9. Méthode de diagnostic selon la revendication 8, comprenant les étapes de :
(a) Marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore ou de la biotine, (b) Isolement des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par ladite au moins une lectine conjuguée :
lors du marquage avec une lectine conjuguée la biotine, ledit isolement est effectué via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine, en particulier ledit support fonctionnalisé est constitué de billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine et ledit isolement est effectué par tri cellulaire magnétique en présence d’un aimant, ou lors du marquage avec une lectine conjuguée un fluorophore, ledit isolement est effectué par tri cellulaire en cytométrie en flux.
(c) Nouveau marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, ABA, ACA, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées et marquées, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radioisotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine, (d) Détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires isolées et marquées par
- microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;
- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine
- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;
(e) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires ;
(f) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à T intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique (g) Déduction du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses pulmonaires.
10. Méthode de diagnostic selon la revendication 8, comprenant les étapes de :
(a) Marquage des cellules souches cancéreuses pulmonaires avec au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radioisotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine, (b) Détection desdites cellules souches cancéreuses pulmonaires marquées par
- microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;
- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimioluminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine
- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;
- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;
(c) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses pulmonaires ;
(d) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses pulmonaires dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique;
(e) Déduction du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses pulmonaires.
11. Kit de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer pulmonaire et/ou de l’agressivité du cancer pulmonaire pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer pulmonaire, comprenant au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine, et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines UEA43
1, ΑΒΑ, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, conjuguée à un fluorophore, un radioisotope, une enzyme ou des billes d’or, ou comprenant au moins une lectine reconnaissant le motif fucose a 1-2 galactose choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée un fluorophore, et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines UEA-1, AB A, AC A, jacaline, GSL-I et GSL-II, conjuguée à la biotine, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.
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