WO2014118474A1 - Procédé de detection d'un cancer colorectal - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de diagnostic, in vitro, du cancer colorectal chez un patient, par la détermination de la présence de la prolidase, dans un échantillon biologique du patient.

Description

PROCEDE DE DETECTION D'UN CANCER COLORECTAL

La présente invention concerne le diagnostic du cancer colorectal chez un patient humain.

Le cancer colorectal (CCR) est un problème majeur de santé publique.

Son incidence mondiale a été estimée à 1 234 216 nouveaux cas en 2008, contre 875 000 en 1996. En France, le nombre de nouveaux cas par an a été estimé en 201 1 à 40 500. Le taux d'incidence standardisé au niveau mondial était en 201 1 de 36,3 pour 100 000 hommes et de 24,7 pour 100 000 femmes, Le cancer colorectal se situe, tous sexes confondus, au troisième rang des cancers les plus fréquents (deuxième cancer chez la femme et troisième chez l'homme). Le taux de survie à 5 ans, tous stades confondus, est voisin de 56%.

D'après les estimations, le nombre de cancers colorectaux devrait augmenter dans les prochaines années pour atteindre en France 45 000 nouveaux cas annuels en 2020. En 2008, le cancer colorectal était le cancer le plus fréquent dans une dizaine de pays européens incluant la République Tchèque, la Hongrie, la Slovaquie, le Danemark, la Norvège, l'Italie, les Pays- Bas, l'Allemagne, la Belgique et la Slovénie, avec un taux d'incidence standardisé à la population mondiale variant entre 35,5 et 43 pour 100 000. La France fait partie des pays dans lesquels le risque de cancer colorectal est élevé, tout comme les autres pays d'Europe de l'Ouest, les USA, l'Australie et, plus récemment, le Japon. Seul un diagnostic précoce offre l'espoir d'un traitement curatif. Or, à l'heure actuelle, il n'existe aucun test sérologique de dépistage, ni de diagnostic spécifique qui soit précoce.

En France comme dans un certain nombre de pays d'Europe, la politique de dépistage de masse mise en place pour le cancer colorectal repose sur la réalisation de la recherche de sang dans les selles, par un test paraclinique biennal dans les selles (Faecal Occult Blood test, FOBT, commercialisé par exemple sous le nom d'Hémoccult®). Cette technique a démontré son utilité clinique. Lorsqu'elle est utilisée tous les 2 ans chez les personnes âgées de 50 à 74 ans, elle peut réduire de 15 à 20% la mortalité par cancer colorectal. Pour cela, il faut que plus de la moitié de la population concernée participe régulièrement au dépistage et qu'une coloscopie soit faite en cas de test positif, suivie éventuellement d'un traitement adapté. Néanmoins, cette technique de dépistage souffre d'un certain nombre de handicaps :

• L'inconvénient majeur de ce test est sa sensibilité médiocre, tout spécialement pour les adénomes (lésion dysplasique pré-cancéreuse) qui, s'ils sont de grande taille ou en dysplasie sévère, conduiront dans 1 cas sur 10 au développement d'un cancer.

• L'apparition de sang dans les selles peut être liée à une affection non tumorale : hémorragies recto-coliques, hémorroïdes, fistules, ...

• Il est difficile d'obtenir une acceptabilité importante, car il s'agit d'un test dans les selles. De ce fait, un dépistage de masse efficace repose sur une organisation très structurée, avec mise en place de relances systématiques.

• Enfin les tests de détection de sang dans les selles basés sur un test au gaïac, de type Hemoccult®, ne sont pas spécifiques de l'hémoglobine humaine. Ils sont délicats à interpréter, et doivent donc être lus dans des centres spécialisés, par un personnel qualifié et compétent.

Des tests immunologiques spécifiques de l'hémoglobine humaine (OC- Sensor, FOB Gold, Magstream...) ont également été décrits. Ils constituent un progrès par rapport au test Hemoccult®, en permettant en particulier une augmentation de la sensibilité à la fois pour les cancers et pour les adénomes, mais avec une diminution de la spécificité, et en conséquence une augmentation du nombre de coloscopies inutiles. Toutefois il s'agit encore d'un test de détection de sang dans les selles avec les problèmes inhérents à de tels tests : détection de saignements non spécifiques, variation dans le temps des saignements, et surtout risque de mauvaise adhésion de certains patients réticents à réaliser un test dans les selles.

Aux Etats-Unis, il n'y a pas à proprement parler de politique de dépistage de masse systématique pour le cancer colorectal. Il existe par contre des recommandations pour réaliser un dépistage, par une ou plusieurs méthodes existantes. En particulier, en plus de la recherche de sang dans les selles (par un test immunologique ou au gaïac), on peut réaliser une sigmoïdoscopie associée ou non à un test FOBT, une coloscopie, une coloscopie virtuelle ou un lavement baryté à double contraste. Les nouvelles méthodes, comme la recherche de mutations ou de méthylation de l'ADN dans les selles, sont encore à l'étude.

La réalisation systématique d'une coloscopie après 50 ans permet en théorie de réduire la mortalité par cancer colorectal. C'est l'examen le plus sensible et le plus spécifique pour la détection des cancers, qui permet de plus l'exérèse éventuelle de lésions précancéreuses. Mais l'acceptabilité de cet examen chez des sujets en bonne santé est trop faible pour qu'une politique de dépistage utilisant l'endoscopie diminue la mortalité (l'acceptabilité pour la colonoscopie dans les pays d'Europe ayant mis en place cette stratégie de dépistage est aux alentours de 2%). Il existe un risque non négligeable (1%o) de perforation et hémorragie du côlon et de décès (1/10 000), ainsi qu'un coût élevé pour la santé publique. De plus, la colonoscopie nécessite une préparation colique préalable très contraignante, qui explique en grande partie la faible adhésion.

Des marqueurs tumoraux dosables par immunoessais ont été décrits de longue date dans le cadre du cancer colorectal. Il s'agit notamment de l'antigène carcino-embryonnaire (ACE) et du CA19-9.

L'ACE est utilisé pour le suivi. Il ne peut pas être utilisé pour le dépistage, ni pour le diagnostic précoce du cancer colorectal car sa sensibilité et sa spécificité sont insuffisantes. En effet, ce marqueur est exprimé par d'autres types de cancers et dans des pathologies bénignes, et surtout il ne détecte qu'un petit nombre des cancers colorectaux.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence de façon surprenante un nouveau marqueur de cancer colorectal qui pallie les inconvénients précités, notamment le manque de spécificité et de sensibilité, et qui de ce fait est bon candidat tant pour le diagnostic que pour le dépistage du cancer colorectal même à des stades très précoces et jusqu'à un stade encore non cancéreux que représente l'adénome.

Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic ou de dépistage du cancer colorectal par la détermination de la présence de la prolidase chez un patient.

Le procédé de l'invention peut aussi être mis en œuvre pour le diagnostic précoce du cancer colorectal chez un patient, ou pour la détection des carcinomes au stade in situ (Tis T0) ou encore pour la détection d'un adénome colorectal.

Selon une première variante de l'un quelconque des procédés de l'invention ci-dessus, le procédé est appliqué au diagnostic, ou au diagnostic précoce, du cancer colorectal, in vitro, ou à la détection d'un adénome colorectal ou d'un carcinome in situ, in vitro, par la détermination de la présence de la prolidase dans au moins un échantillon biologique du patient. Les procédés ci-dessus peuvent être mis en œuvre, sans pour autant y être limités, sur des patients suspectés de cancer, par exemple de cancer colorectal.

L'invention a aussi pour objet un procédé de dépistage, in vitro, d'un cancer colorectal dans une population par détermination de la présence de la prolidase dans un échantillon biologique d'un individu.

Par détermination de la présence de la prolidase, on comprend qu'on détecte la prolidase et/ou au moins un traceur représentatif de la prolidase. Ce traceur est caractéristique de la présence de la prolidase. Selon la teneur en prolidase chez le patient ou dans l'échantillon biologique et selon la technique employée, la détection d'un traceur précité peut être plus pertinente que celle de la prolidase en soi. Ainsi, un traceur peut être choisi parmi les précurseurs de la prolidase, les métabolites de la prolidase, ou à une réponse immune due à la prolidase. Ainsi, un traceur de la prolidase est de préférence choisi parmi des peptides, de préférence des mélanges de peptides de la prolidase ; des acides nucléiques, de préférence des ARN messagers ou une modification du gène codant pour la prolidase, comme une méthylation de son promoteur, ou une modification de l'acide nucléique conduisant à une modification de l'expression de la prolidase ; des anticorps reconnaissant spécifiquement la prolidase et produits chez le patient en réponse à une présence de la prolidase, par réaction immunogénique.

Plus particulièrement, selon un procédé de diagnostic ou de diagnostic précoce, du cancer colorectal, ou de détection d'un adénome colorectal, ou de détection d'un carcinome in situ, de l'invention, on détecte la prolidase et/ou au moins un traceur représentatif de la prolidase, dans ledit échantillon biologique.

Un procédé de l'invention peut en outre comprendre une mise en évidence d'une variation de l'expression de la prolidase. Avantageusement, on met en évidence une diminution de l'expression de la prolidase. Cette variation peut être observée par comparaison à une population de référence dite contrôle, de patients non suspectés de CCR, par exemple des patients ayant eu une coloscopie qui s'est révélée normale, ou par comparaison à une valeur de référence prédéterminée.

De préférence, la variation est comparée à une population de référence, avec des échantillons de même origine, tels que définis ci-dessous.

L'invention concerne également l'utilisation d'un quelconque procédé ci- dessus, tant dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic, que dans le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer colorectal.

Par échantillon biologique, on entend tout échantillon susceptible de contenir la prolidase et/ou au moins un traceur représentatif de la prolidase. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement de tout fluide biologique, comme le sang total, le sérum, le plasma, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, les sécrétions organiques, la salive, les selles par exemple, ou d'un prélèvement tissulaire ou des cellules isolées. De préférence, l'échantillon est distant de la tumeur potentielle.

La détermination de la présence de la prolidase dans un échantillon biologique distant ou non de la tumeur permet alors de conclure à la pathologie recherchée. Un des avantages du procédé de l'invention réside donc en la possibilité d'utiliser un échantillon distant de la tumeur potentielle à titre d'échantillon de diagnostic, ce qui permet un diagnostic simple et non invasif alors qu'un diagnostic tissulaire nécessite une biopsie prélevée de façon invasive. En effet, l'étude de marqueurs tissulaires, par exemple sur coupe de tissu (immunohistochimie), peut présenter un intérêt pronostique mais n'a aucun intérêt pour le dépistage ou le diagnostic précoce du cancer colorectal.

Un procédé de l'invention peut aussi être associé à la détermination de la présence, en plus de la prolidase, d'au moins un autre marqueur. Avantageusement, cet autre marqueur est choisi parmi les marqueurs suivants :

ACE; Aminoacylase 1 ; Apolipoprotéine A1 ; Apolipoprotéine A2; Beta 2 Microglobuline; CA242; CA50; CA72-2; CA19-9; Calgranuline C; Calréticuline; CCSA-3 (colon cancer spécifie antigen) ; CCSA-4; CD24;

CD26; Cripto-1 ; Cytokératine 20; Epithelial-Cadhérine; Ezrine; Galectine-3; GST Pi (GSTP1 ); HSP60; lntelectine-1 ; Intestinal Fatty Acid-Binding Protein; Kératine type I Cytoskeletal 18; Kératine type I Cytoskeletal 19; Kératine type II Cytoskeletal 8; Leucocyte Elastase Inhibitor, associé ou non à la Protéinase 3 (PRN3) ; Liver Fatty Acid-

Binding Protein; L-Lactate Deshydrogénase Chaîne B (LDHB); Maspine; MIF; MUC5AC; Ostéopontine; Plastine-I; Protéasome 20S; (Pro)défensine-A5; (Pro)défensine-A6; Protéine Disulfide Isomérase (PDI); Pyruvate kinase M2-PK; Regenerating Islet-Derived Protein 3 Alpha; S100A8; S100A9; Testostérone; TIMP-1 ; Translationally-

Controlled Tumor Protein; Tumor-Associated Calcium Signal Transducer 1 ; Tumor-Associated Calcium Signal Transducer 1 ; Villine; Vimentine; Heat Shock cognate 71 kDa (HSP71 ), BIP (ou GRP-78), Peroxiredoxin-5, Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) ; Alpha-Enolase ;

- ADN méthylé dans le sang, de préférence l'ADN méthylé du gène

AXL4 (Aristaless-like Homeobox-4 Gene Methylation) ou l'ADN méthylé du gène Septin-9 ;

des altérations spécifiques de fragments d'ADN dans les selles comme des mutations spécifiques de l'ADN dans les selles ou des altérations spécifiques du profil de méthylation de l'ADN dans les selles ; haptoglobine dans les selles ;

hémoglobine humaine dans les selles.

Mieux encore, on détermine la présence, en plus de la prolidase, d'associations de marqueurs précités. Comme cela sera illustré dans les exemples, certaines associations sont avantageuses.

Ainsi, l'invention se rapporte aussi à un procédé précité selon lequel, on détermine la présence de la prolidase et celle d'au moins les associations suivantes de marqueurs :

ACE et CA19-9,

LFABP et PDI,

LFABP, CA19-9 et ACE,

LFABP, ACE et Timpl ,

LFABP, ACE et M2PK,

L-FABP, CA19-9, ACE et PDI

LFABP, ACE, M2PK et Timpl ,

LFABP, ACE, CA19-9 et PDI,

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9 et PDI,

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine et PDI,

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, G3PDH et PDI,

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine et G3PDH,

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine, G3PDH et PDI.

L'invention est ci-après décrite plus en détails.

La prolidase, aussi appelée Proline dipeptidase, Xaa-pro dipeptidase, Imidodipeptidase, Peptidase D, PEPD (Gene ID: 5184, Uniprot accession number P12955, EC=3.4.13.9) est un membre de la famille des peptidases, plus particulièrement des métallo-protéinases (matrix métallo protéine, MMP). C'est une exopeptidase manganèse dépendante, qui forme un homodimère qui hydrolyse les imidodipeptides ou les imidotripeptides qui comportent en C- terminal un résidu proline ou hydroxy-proline (X-Pro or X-Hyp, ou X représente n'importe quel acide aminé). Trouvée dans le plasma, elle permet la libération de la proline comme stade final du catabolisme protéique, et particulièrement du collagène, source la plus importante de ces imidodipeptides. Cette enzyme a un rôle important pour le recyclage de la proline, et son absence est un facteur limitant pour la production du collagène. Elle joue de ce fait un rôle important dans le remodelage et la croissance cellulaire.

Le gène de la prolidase (PEPD) est situé sur le chromosome 19 (localisation chromosomique 19q13.1 1 ) et code pour un polypeptide de 493 acides aminés avec un poids moléculaire de 54 kDa. La forme mature de l'enzyme est un dimère composé de 2 sous-unités identiques. Le gène présente de nombreux polymorphismes alléliques, sans qu'il y ait d'impact sur l'activité enzymatique. Des mutations rares dans le gène, trouvées sur les exons 7, 8, 12 et 14 sont responsables de la déficience en prolidase, qui est une pathologie caractéristique par l'excrétion urinaire d'une grande quantité de peptides contenant de la proline (imidopeptidurie), d'atteintes cutanées, d'infections récurrentes, de retard mental et de la présence à une concentration élevée de dipeptides à proline dans le plasma.

Dans les articles de la littérature, les taux de prolidase sont obtenus par mesure de l'activité enzymatique de la protéine, par mesure de la quantité de proline relarguée par minute et par milligramme de protéine [http://www. cancer.gov/cancertopics/factsheet/Detection/colorectal-screening ; Screening for Colorectal Cancer: A Targeted, Updated Systematic Review for the U.S. Préventive Services Task Force. Ann Intern Med. 2008;149(9):638- 658].

Ainsi, l'activité enzymatique de la prolidase a été évaluée dans le sérum de patientes porteuses d'un cancer de l'endomètre, atteintes d'un cancer de l'ovaire ou d'un cancer du sein et dans tous les cas, l'activité enzymatique était plus importante chez ces patientes que chez des sujets contrôles.

L'activité enzymatique de la prolidase a été évaluée dans ces différents cancers dans le sérum (comparaison à d'autres pathologies) ou dans le tissu (comparaison du tissu cancéreux par rapport au tissu « sain »). L'expression de la prolidase a été évaluée dans les tissus de cancer du poumon [Karna E, Surazynski A, Palka J, Int J Exp Pathol. 2000 Oct;81(5):341-7. Collagen metabolism disturbances are accompanied by an increase in prolidase activity in lung carcinoma planoepitheliale] et de l'estomac [Guszczyn T, Sobolewski K., Deregulation of collagen metabolism in human. stomach cancer. Pathobiology 2004;71:308-13] de façon semi-quantitative, par Western Blot, et était augmentée. Par contre, l'expression de la prolidase n'a jamais été mesurée à distance de la tumeur, comme par exemple dans le sang ou le sérum, quelle que soit la pathologie associée à son expression. De plus, dans un tel fluide, il n'y a pas forcément de parallèle entre l'activité enzymatique d'une protéine et son expression. Il n'y a pas non plus forcément de corrélation entre l'expression tissulaire d'une protéine et la mesure des taux d'expression de cette même protéine à distance de la tumeur.

Les marqueurs dont la présence peut être déterminée, en plus de la prolidase, selon des variantes des procédés de l'invention sont ci-après décrits plus en détails.

Il convient de préciser que les marqueurs ci-après, à savoir Alpha- Enolase, G3PDH, BIP (GRP78), HSP71 (HSC70), Peroxy-5 et PDI, constituent en tant que tels des marqueurs du cancer colorectal et qu'ils peuvent, seuls ou en combinaison les uns avec les autres et/ou avec la prolidase et/ou tout autre marqueur, être utilisés dans un procédé de diagnostic du cancer colorectal chez un patient. A cet effet, on détermine chez ledit patient la présence d'au moins l'un des marqueurs ci-dessus. Selon une variante de ce procédé, on diagnostique, in vitro, un cancer colorectal chez un patient, par détermination de la présence d'au moins l'un de ces marqueurs dans un échantillon biologique du patient. Comme la prolidase, la détermination de la présence de ces marqueurs, seuls ou en combinaison entre eux, avec la prolidase et/ou tout autre marqueur, permet de diagnostiquer précocement un cancer colorectal invasif ou de détecter un adénome colorectal, ou de déterminer la présence d'un carcinome in situ, T0, chez un patient ou dans un échantillon biologique d'un patient, in vitro.

Les scores individuels de chacun des marqueurs précités pour la détection du CCR sont présentés dans l'exemple 6.

La définition d'échantillon biologique donnée précédemment en référence à la prolidase, s'applique à tout marqueur précité.

La détermination de la présence de ces marqueurs, seuls ou en combinaison, peut être mise en œuvre par toute méthode bien connue de l'homme du métier, et en particulier celles exposées dans la présente description en référence à la prolidase.

Ainsi comme pour la prolidase, la détermination de leur présence peut résulter d'une détection directe de ces marqueurs et/ou d'une détection d'au moins un des traceurs représentatifs de ces marqueurs, tels que ceux choisis parmi les précurseurs de ces marqueurs, les métabolites de ces marqueurs, les produits de dégradation ou de clivage de ces marqueurs, et toute molécule associée à au moins une activité de ces marqueurs, par exemple une réponse immune. Ainsi, un traceur d'un tel marqueur est de préférence choisi parmi des peptides, de préférence des mélanges de peptides tels que ceux décrits ci- après pour chacun des marqueurs ; des acides nucléiques, de préférence des ARN messagers ou une modification du gène codant pour ledit marqueur, comme une méthylation de son promoteur, ou une modification de l'acide nucléique conduisant à une modification de l'expression du marqueur ; des anticorps reconnaissant spécifiquement ce marqueur et produits chez le patient en réponse à une présence de ce marqueur, par réaction immunogénique.

Selon une variante du procédé comprenant la détermination de la présence de plusieurs marqueurs, telle que décrit précédemment, les marqueurs, et/ou leurs traceurs, peuvent être détectés dans le même échantillon biologique, dans des échantillons biologiques différents mais provenant d'un fluide ou d'un tissu de même nature, dans des échantillons biologiques différents et de nature différente.

Parmi ces marqueurs, ceux décrits plus en détail ci-dessous sont des marqueurs préférés :

Alpha-Enolase

L'Alpha-Enolase, aussi appelée 2-phospho-D-glycerate hydro-lyase, C- myc promoter-binding protein, Enolase 1 ou Non-neural enolase (ENOA_HUMAN, Gene ID: ENO1 , Uniprot accession number P06733, EC=4.2.1 .1 1 ) appartient à la famille des Enolases. C'est une enzyme multi- fonctionnelle, qui joue un rôle dans la glycolyse, et intervient dans de nombreux processus comme le contrôle de la croissance, la tolérance à l'hypoxie et les réponses allergiques. C'est en particulier une enzyme métabolique impliquée dans la synthèse du pyruvate. Elle stimule la production d'immunoglobulines. Elle peut par ailleurs servir de récepteur et d'activateur du plasminogène à la surface de plusieurs types cellulaires, comme les leucocytes et les neurones En tant que récepteur du plasminogène, elle permet l'action de la plasmine et la dégradation de la matrice extra-cellulaire dans les processus tumoraux. Elle favoriserait l'invasion tumorale, et pourrait avoir une valeur diagnostique et pronostique.

Le gène de l'Alpha-Enolase code pour un polypeptide de 434 acides aminés avec un poids moléculaire de 47 kDa. C'est une protéine de 493 acides aminés. L'Enolase est chez les mammifères composée de 3 sous-unités qui peuvent former des homo ou des hétéro-dimères. Leur association est spécifique des sous-types cellulaires et du stade de développement. Elle est localisée dans le cytoplasme, avec une possible translocation à la membrane plasmique. Les homodimères alpha/alpha sont exprimés dans la plupart des tissus adultes et embryonnaires. Il a été montré que l'Alpha-Enolase est inductible en cas de lymphome, et est up-régulée en réponse à une infection par entérovirus 71 . L'hétérodimère alpha/gamma est un marqueur d'hypoxie cérébrale après arrêt cardiaque. Un variant d'épissage du gène donne une isoforme plus courte qui peut lier le promoteur c-myc et fonctionner comme un suppresseur de tumeur. Des anticorps dirigés contre l'Alpha-Enolase ont été retrouvés dans les sérums de patients atteints de cancers, accompagnés d'une « rétinopathie associée au cancer » (CAR, pathologie paranéoplasique surtout associée au cancer du poumon à petites cellules). Le gène ENO1 a été montré comme ayant un rôle central de « nœud » de connexion entre différents gènes au cours des processus cancéreux. L'Alpha-Enolase semble avoir un rôle dans la transformation cellulaire et l'invasion via l'induction de l'expression de CCL20, et sa surexpression est liée au pronostic dans les cancers de la tête et du cou. La surexpression de l'Alpha-Enolase a été rapportée comme corrélée à la progression des tumeurs, en particulier du poumon et du neuroblastome, et elle a été rapportée dans l'hépato carcinome, et analysée dans des lignées coliques.

L'expression tissulaire de l'Alpha-Enolase été étudiée dans The Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/ENSG00000074800) à l'aide de l'anticorps CAB018614 (la confiance dans les marquages est incertaine d'après les critères de contrôle qualité du site). L'expression de l'Alpha-Enolase est cytoplasmique, et ponctuellement nucléaire. Elle est modérée dans les tissus digestifs normaux dans plus de 75% des cas, de même dans les tissus colorectaux tumoraux. Par contre, le dosage sérique de l'Alpha-Enolase n'a jamais été décrit pour le diagnostic, ni le suivi du cancer colorectal, ni pour son dépistage ou l'évaluation du pronostic.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence que les taux de l'Alpha-Enolase dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont augmentés par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour l'Alpha-Enolase avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

G3PDH

C'est une protéine de 335 acides aminés, de 36 KDalton.

La GAPDH est un homotétramère qui appartient à la famille des glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, et a à la fois des activités glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et nitrosylase, et joue un rôle respectivement dans la glycolyse et dans les fonctions nucléaires. Elle permet de moduler l'assemblage du cytosquelette, et stimule la liaison de CHP1 aux microtubules, et se lie elle-même aux microtubules.

Par ailleurs, la GAPDH est une enzyme clé pour la glycolyse, qui catalyse la première étape en convertissant le D-glycéraldéhyde 3-phosphate (G3P) en phospho-D-glyceroyl phosphate, avec du NAD comme substrat.

Au niveau cellulaire, elle est exprimée à la fois dans le cytoplasme, le noyau et à la membrane, et est liée au cytosquelette.

Le gène de la GAPDH est connu comme étant un gène normalisateur dans des analyses semi-quantitatives dans les expériences de Northern Blot ou de PCR. Il est de ce fait utilisé comme standard interne dans de nombreuses publications concernant la quantification de marqueurs de type ARNm, car il est connu pour avoir un taux d'expression stable. Contre toute attente, il a été montré que l'expression de la GAPDH est augmentée dans les tissus de cancer colorectal par rapport aux tissus sains adjacents, et de même dans les lignées cancéreuses. Cette expression élevée pourrait jouer un rôle dans le développement du cancer et l'apparition de métastases, et la GAPDH pourrait être une cible thérapeutique. Mais d'autres auteurs ont étudié la régulation par l'hypoxie de la GAPDH, comme la GAPDH est utilisée comme gène de standardisation. Il apparaît que la GAPDH n'est pas régulée par l'hypoxie dans des lignées d'hépato-carcinome, de cancer du poumon ni de cancer du côlon, et ne semble donc pas être une bonne cible thérapeutique.

La GAPDH n'a jamais été montrée comme marqueur diagnostic du cancer colorectal.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence que les taux de GAPDH dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont augmentés par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour la GAPDH avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

BIP

C'est une protéine de 654 acides aminés, de 72.3 KDalton ; elle appartient à la famille des Heat Shock protein 70.

Elle possède un rôle probable pour faciliter l'assemblage de complexes protéiques multimériques dans le réticulum endoplasmique, et joue un rôle comme auto-antigène dans la polyarthrite rhumatoïde.

La GRP78 fait partie d'un grand complexe de protéines chaperones comprenant JB1 1 , HSP90B1 , HYOU, PDIA2, PDIA4, PDIA6, PPIB, SDF2L1 , UGT1A1 . Comme protéine chaperone, elle a un rôle anti-apoptotique, et peut se lier au calcium. La GRP78 favorise la prolifération cellulaire, la survie, l'apparition de métastases et la résistance aux chimiothérapies. Elle pourrait avoir un rôle comme cible thérapeutique. Il a été suggéré récemment que le niveau d'expression tissulaire de la GRP78, tout comme la présence d'auto- anticorps dans le sérum des patients, pouvait servir à stratifier les patients et prévoir la réponse au traitement [Mintz PJ, Kim J, Do KA, et al. Fingerprinting the circulating répertoire of antibodies from cancer patients. Nat Biotechnol 2003;21:57-63; Gonzalez-Gronow M, Cuchacovich M, Llanos C, Urzua C, Gawdi G, Pizzo SV. Prostate cancer cell prolifération in vitro is modulated by antibodies against glucose-regulated protein 78 isolated from patient sérum. Cancer Res 2006;66:11424-31]. Des auto-Ac anti-GRP78 ont été trouvés dans 3 cancers du côlon sur 15, chez 17/60 des cancers gastriques, et absents chez les sujets sains (0/20).

La GRP78 avait été identifiée en 1997 lors d'une analyse en électrophorèse bi-dimensionnelle de la lignée cellulaire de cancer colique LIM 1215 [Ji H, Reid GE, Moritz RL, Eddes JS, Burgess AW, Simpson RJ, Electrophoresis. 1997 Mar-Apr; 18(3-4) :605-13. A two-dimensional gel database of human colon carcinoma proteins.], sans qu'on puisse en conclure des propriétés diagnostiques. Elle est exprimée de façon relativement ubiquitaire à la surface des cellules. Il a été par ailleurs montré que des carcinogènes comme la nicotine impactent le promoteur de la GRP78, reflet du stress induit sur le réticulum endoplasmique [Nicotine increases oxidative stress, activâtes NF-kappaB and GRP78, induces apoptosis and sensitizes cells to genotoxic/xenobiotic stresses by a multiple stress inducer, deoxycholate: relevance to colon carcinogenesis. Crowley-Weber CL, Dvorakova K, Crowley C, Bernstein H, Bernstein C, Garewal H, Payne CM. Chem Biol Interact. 2003 Mar 6;145(1):53-66]. La GRP78 et l'HSP90 ont été montrées comme étant constitutivement exprimées dans des lignées de cancers gastro-intestinaux [Heat shock proteins are differentially expressed in human gastrointestinal cancers. Ehrenfried JA, Herron BE, Townsend CM Jr, Evers BM. Surg Oncol. 1995 Aug;4(4):197-203], avec une expression différentielle dans les cancers gastriques, pancréatiques et coliques, et peut être comme ayant un rôle protecteur.

Xioming Xing et al. ont étudié l'expression de la GRP78 au niveau protéique et de l'expression d'ARNm dans les tissus coliques. Alors qu'il ne semble pas y avoir de différence au niveau de l'expression de l'ARNm de la GRP78, la protéine est surexprimée au cours de la carcinogénèse colique, mais sans corrélation avec la différentiation dans les tissus cancéreux [Xing X, Lai M, Wang Y, Xu E, Huang Q. Clin Chim Acta. 2006 Feb;364(1-2):308-15. Epub 2005 Sep 21]; selon les mêmes auteurs, cette surexpression semble associée avec la prolifération des cellules cancéreuses et leur résistance à l'apoptose [Xing X, Li Y, Liu H, Wang L, Sun L. Acta Histochem. 2011 Dec;113(8):777-82. doi: 10.1016/j.acthis.2010.11.006. Epub 2010 Dec 14].

Dans la demande de brevet WO2004/005928A2, sont décrits des changements d'expression de diverses protéines, dont la GRP78 pour la détection de cellules cancéreuses non dépendantes des stéroïdes.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence de façon inattendue que les taux de GRP78 dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont diminués par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour la GRP78 avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

HSP71 (HSC70)

La protéine Heat shock cognate 71 kDA (HSC70) appartient à la famille des HSP70 qui comprend une douzaine de protéines ayant un poids moléculaire entre 66 et 78kDa. Les HSP70 sont des protéines chaperonnes, c'est à dire des molécules qui, en se liant temporairement à une protéine nouvellement formée au sein d'une cellule vivante, lui permettent d'acquérir sa forme caractéristique.

Chaque protéine HSP70 possède une structure commune qui contient deux domaines : une extrémité amino-terminale hautement conservée à activité ATPase et une extrémité carboxy-terminale moins conservée liant des peptides. En coopération avec les autres chaperonnes, les HSP70s stabilisent les protéines pré-existantes contre l'agrégation et modifient le repliement des polypeptides nouvellement traduits dans le cytosol ainsi qu'à l'intérieur des organelles.

La longueur de la séquence de HSC70 est de 646 AA, et elle fait 70,9

KDalton. HSC70 est rapidement transloquée du cytoplasme vers le noyau, et particulièrement vers le nucléole, sous l'effet de la hausse de température. Récemment, une surexpression dans le cancer colorectal de la protéine HSC70 a été mise en évidence dans une étude utilisant l'électrophorèse bi- dimensionnelle de tissus micro-disséqués, sans indication d'un possible rôle diagnostique. Une autre étude retrouve des résultats similaires, avec une expression augmentée de HSC70 dans les tissus tumoraux coliques, associée à une expression augmentée de HSP90, sans qu'il y ait de corrélation avec le stade du cancer.

Par contre, le dosage sérique de l'HSP71 (HSC70) n'a jamais été décrit pour le diagnostic ni le suivi du cancer colorectal, ni pour son dépistage ou l'évaluation du pronostic. La Demanderesse a maintenant mis en évidence de façon inattendue que les taux de HSP71 dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont augmentés par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour l'HSP71 avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

Peroxy-5

N° Swiss Noms synonyme de la ! Noms du

Nom de la protéine

Prot protéine ! gène

Peroxiredoxin-5,

mitochondrial

Alu corepressor 1

Antioxidant enzyme B166 Prx-V PRDX5

P30044

Peroxiredoxin V Peroxy-5 ACR1

Thioredoxin peroxidase

PMP20

Thioredoxin reductase La peroxyredoxin-5 est une protéine de 214 acides aminés, de 22

KDaltons. Elle appartient à la famille des peroxiredoxines 2. Elle est de localisation cytoplasmique ou mitochondriale.

Elle est impliquée dans les voies d'oxydation/réduction (système redox) intra-cellulaire, en réduisant les peroxydes d'hydrogène.

Elle a été décrite chez la souris comme une peroxidase pouvant inhiber l'apoptose induite par p53.

Elle n'a jamais été décrite comme outil diagnostic pour le cancer colorectal. La Demanderesse a maintenant mis en évidence que les taux de Peroxy-5 dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont augmentés par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour la Peroxy-5 avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

PDI

La PDI est une protéine multi-fonctionnelle qui catalyse la formation, la rupture et le réarrangement des ponts disulfures intramoléculaire. A la surface des cellules elle agit en tant que réductase et clive les ponts disulfures des protéines attachées aux cellules. A l'intérieur des cellules, c'est une molécule soluble localisée dans la lumière du Réticulum Endoplasmique, où elle forme et réarrange les ponts disulfures des protéine néosynthétisées. C'est une protéine multi-fonctionnelle avec 2 domaines catalytiques de type Thioredoxine avec un motif CXXC caractéristique. A haute concentration la PDI fonctionne comme une protéine chaperonne qui inhibe l'agrégation des protéines mal repliées. A faible concentration, elle a un rôle antagoniste et facilite l'agrégation.

La PDI forme également la sous unité structurale de différentes enzymes, comme la Prolyl Hydroxylase qui catalyse l'hydroxylation des résidus proline des chaînes pro-alpha du pro-collagène.

La PDI a été trouvé comme particulièrement abondante à la surface de cellules cancéreuses. Des modifications post traductionnelles ont été observées en cas de cancer du côlon par T. Tomonaga et al. [T. Tomonaga et al. Clin. Cane. Reas. 2004, 2007-2014]. R. Stierum et al. [R. Stierum et al. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 73-91] ont montré que la différentiation de la lignée cellulaire du cancer colique Caco-2 s'accompagnait d'une augmentation de la concentration cellulaire de PDI. La Demanderesse a maintenant mis en évidence que les taux de PDI dans les sérums des patients, dosés par exemple par une technologie de spectrométrie de masse de type Multiple Reaction Monitoring, sont diminués par rapport à ceux de sujets contrôles. Et que si l'on associe les scores obtenus pour la PDI avec ceux obtenus pour la prolidase, on améliore le diagnostic du cancer colorectal.

Les différents procédés objets de l'invention et définis précédemment peuvent être mis en œuvre par toute technique appropriée et bien connue de l'homme du métier.

Ainsi, on peut doser la prolidase par une technique quantitative de spectrométrie de masse, ou par toute technique immunologique, ou une combinaison des deux techniques. On peut utiliser par exemple la technique LC-MRM-MS qui combine la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en mode MRM (Mutiple Reaction Monitoring).

On entend par détermination de la présence de la prolidase soit la détection directe de la prolidase, soit la culture de cellules ou d'un tissu sensibles à l'activité de la prolidase, ou tout autre procédé de détermination de la présence d'une protéine dans un échantillon, connu de l'homme du métier. Comme dit précédemment, la méthode de détermination de la présence de la prolidase objet de la présente invention, s'applique également aux méthodes de détermination de la présence des marqueurs choisis parmi Alpha-Enolase, G3PDH, BIP, HSP71 , Peroxy-5, PDI.

La détermination de la présence de la prolidase par détection directe de la prolidase constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.

Par détection directe de la prolidase, on entend la mise en évidence de la prolidase elle-même dans l'échantillon biologique.

La détection directe de la prolidase dans l'échantillon biologique peut être mise en œuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, comme par exemple par test immunologique ou par spectrométrie de masse, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.

Le test immunologique peut être tout test largement connu de l'homme du métier impliquant des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre la prolidase et un partenaire de liaison spécifique de la prolidase.

Les partenaires de liaison spécifiques de la prolidase sont tout partenaire susceptible de se lier à la prolidase. A titre d'exemple, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les récepteurs, les mimotopes, les anticorps synthétiques, les anticorps recombinants, les aptamères et toute autre molécule capable de se lier à la prolidase.

Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux, ou encore des analogues d'anticorps et en particulier les protéines d'affinité aux propriétés compétitives connues sous la dénomination Nanofitines.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec de la prolidase, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment la prolidase. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.

Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro), avec de la prolidase, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de la prolidase pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.

Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier.

Des exemples d'anticorps anti-prolidase sont connus et sont disponibles notamment dans le catalogue de Abnova, et de USCN Life Science Inc. Les partenaires de liaison spécifiques de la prolidase pourront être marqués pour la révélation de la liaison prolidase/partenaire de liaison lorsque le partenaire de liaison est utilisé comme réactif de détection, et donc pour la détection directe de la prolidase dans l'échantillon biologique.

Par marquage des partenaires de liaison, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en :

• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la α-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,

• les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,

• les molécules radioactives comme le ³²P, le ³⁵S ou le ¹²⁵l, et

· les molécules fluorescentes telles que l'alexa ou les phycocyanines,

• Des acides nucléiques qui peuvent ensuite être amplifiés pour obtenir une augmentation du signal.

Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti- ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte le partenaire de liaison. L'anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand.

Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR2781802A1 ou WO95/08000A2 de l'une des Demanderesses ou à l'article de J. Chevalier et al. [J. Chevalier, J. Yi, O. Michel, et XM Tang, J. Histochem. Cytochem. 45 : 481-491, 1997].

Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage.

A titre d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu'ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immunodétection directe comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot et le Dot-blot.

On peut également utiliser des méthodes dites « digitales » pour augmenter la sensibilité de détection, en permettant de détecter des molécules uniques.

Dans le cas des méthodes dites de compétition, la prolidase est marquée comme décrit précédemment pour le partenaire de liaison.

Des exemples d'immunoessais sous forme de kits commerciaux peuvent être trouvés : par exemple la prolidase pourrait également être dosée à l'aide des tests en format microplaque comme les kits commercialisés par la société USCN Life science Inc (ELISA Kit for Peptidase D, ref 8101 1 ). Ou à l'aide des couples d'anticorps commercialisés par la société Abnova (PEPD Matched

Antibody Pair, Catalog # : H00005184-AP1 1 ).

La spectrométrie de masse peut également être utilisée pour la détection directe de la prolidase dans l'échantillon biologique. Le principe de la spectrométrie est largement connu de l'homme du métier et est décrit par exemple dans Patterson, S., 2000, Mass spectrometry and proteomics.

Physiological Genomics 2, 59-65.

Pour ce faire, l'échantillon biologique préalablement traité ou non est passé dans un spectromètre de masse et on compare le spectre obtenu avec celui de la prolidase. Un exemple de traitement préalable de l'échantillon consiste à le faire passer sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison de la prolidase, par exemple un anticorps dirigé contre la prolidase. Un autre exemple de traitement préalable de l'échantillon peut être le pré-fractionnement de l'échantillon biologique, afin de séparer entre elles les protéines de l'échantillon. Dans des techniques bien connues de l'homme du métier, on peut par exemple tout d'abord dépléter les protéines majoritaires de l'échantillon.

La spectrométrie de masse à mettre en œuvre dans le procédé de l'invention est largement connue de l'homme du métier comme un outil puissant pour l'analyse et la détection de différents types de molécules. De façon générale, tout type de molécule pouvant être ionisée peut être détecté en fonction de sa masse moléculaire à l'aide d'un spectromètre de masse. Selon la nature de la molécule à détecter, d'origine protéique ou métabolique, certaines technologies de spectrométrie de masse peuvent être plus adaptées. Néanmoins, quelle que soit la méthode de spectrométrie de masse utilisée pour la détection, cette dernière comprend une étape d'ionisation de la molécule cible en ions dits moléculaires, dans le cas présent une étape d'ionisation des marqueurs de caractérisation, et une étape de séparation des ions moléculaires obtenus en fonction de leur masse.

Tous les spectromètres de masse comportent donc :

i) une source d'ionisation destinée à ioniser les marqueurs présents dans l'échantillon à analyser, c'est-à-dire à conférer une charge positive ou négative à ces marqueurs;

ii) un analyseur de masse destiné à séparer les marqueurs ionisés, ou ions moléculaires, en fonction de leur ratio masse sur charge (m /z) ;

iii) un détecteur destiné à mesurer le signal produit soit directement par les ions moléculaires, soit par des ions produits à partir des ions moléculaires, comme détaillés ci-après.

L'étape d'ionisation nécessaire pour la mise en œuvre d'une spectrométrie de masse peut être mise en œuvre par tout procédé connu de l'homme du métier. La source d'ionisation permet d'amener les molécules à doser sous un état gazeux et ionisé. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et seront utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. On peut citer, notamment :

- l'ionisation électronique (El), l'ionisation chimique (Cl) et la désorption-ionisation chimique (DCI)

- le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS)

- le couplage plasma inductif (ICP)

- l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI)

- l'électronébulisation ou électrospray (ESI)

- la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS)

- l'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART)

Notamment, l'ionisation peut être mise en œuvre comme suit :

L'échantillon contenant les molécules cibles est introduit dans une source d'ionisation, où les molécules sont ionisées à l'état gazeux et ainsi transformées en ions moléculaires qui correspondent aux molécules initiales. Une source d'ionisation de type électrospray (ESI pour ElectroSpray Ionisation) permet d'ioniser une molécule tout en la faisant passer d'un état liquide à un état gazeux. Les ions moléculaires obtenus correspondent alors aux molécules présentes à l'état liquide, avec en mode positif un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus. Par exemple, lorsque la molécule cible est une protéine, une ionisation des peptides protéotypiques obtenus après fractionnement de la protéine cible, grâce à une source de type électrospray fonctionnant en mode positif, conduit à des ions polypeptidiques à l'état gazeux, avec un, deux, voire trois protons supplémentaires ou plus et qui sont donc porteurs de une, deux, voire trois charges ou plus, et permet un passage d'un état liquide à un état gazeux. Ce type de source est particulièrement bien adapté, lorsque les molécules cibles ou peptides protéotypiques obtenus sont préalablement séparées par chromatographie liquide en phase inverse. Néanmoins, le rendement d'ionisation des molécules présentes dans l'échantillon peut varier en fonction de la concentration et de la nature des différentes espèces en présence. Ce phénomène se traduit par un effet matrice bien connu de l'homme de l'art.

Une source d'ionisation MALDI permettra d'ioniser des molécules, à partir d'un échantillon à l'état solide.

L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF).

La séparation des ions moléculaires en fonction de leur ratio m/z peut être mise en œuvre une seule fois (spectrométrie de masse simple ou MS), ou bien plusieurs séparations MS successives peuvent être menées. Lorsque deux séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS ou MS2. Lorsque trois séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MS/MS/MS ou MS3 et plus généralement, lorsque n séparations MS successives sont réalisées, l'analyse est appelée MSn. Parmi les techniques mettant en œuvre plusieurs séparations successives, les modes SRM (Selected Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage d'une seule molécule cible, ou bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en cas de détection ou dosage de plusieurs molécules cibles, sont des utilisations particulières de séparation MS2. De même le mode MRM3 est une utilisation particulière de séparation en MS/MS/MS. On parle alors de spectrométrie de masse ciblée.

Dans le cas d'une détection en mode MS simple, c'est le rapport masse/charge des ions moléculaires obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter.

Dans le cas d'une détection en mode MS/MS, essentiellement deux étapes sont ajoutées, par rapport à un dosage MS qui sont :

i) une fragmentation des ions moléculaires, alors appelés ions précurseurs, pour donner des ions dit ions fragments de 1 ère génération, et ii) une séparation des ions dit ions fragments de 1 ère génération en fonction de leur masse (m/z)2, le rapport (m/z)1 correspondant au rapport (m/z) des ions précurseurs.

C'est alors le rapport masse/charge des ions fragments de 1 ère génération ainsi obtenus qui est corrélé à la molécule cible à détecter. Par ion fragment de première génération, on entend un ion issu de l'ion précurseur, suite à une étape de fragmentation et dont le rapport masse sur charge m/z est différent de l'ion précurseur.

Les couples (m/z)1 et (m/z)2 sont baptisés transitions et sont représentatifs des ions caractéristiques à détecter.

Le choix des ions caractéristiques qui sont détectés pour être corrélés à la molécule cible est effectué par l'homme du métier selon les méthodes standards. Leur sélection conduira avantageusement aux dosages les plus sensibles, les plus spécifiques et les plus robustes possibles, en termes de reproductibilité et fiabilité. Dans les méthodes développées pour la sélection de peptides protéotypiques (m/z)1 , et de fragment de première génération (m/z)2, le choix est essentiellement basé sur l'intensité de la réponse. Pour plus de détails, on pourra se référer à V. Fusaro et al. [V. Fusaro et al. Nature Biotech. 27 ; 2009 ; 190-198]. Des logiciels commerciaux, tels que les logiciels MIDAS et MRM Pilote d'Applied Biosytems ou encore MRMaid [J. Mead et al., MCP, 15 nov 2008, E-pub] pourront être utilisés par l'homme de l'art pour lui permettre de prédire tous les couples de transitions possibles. Il pourra également être fait appel à une base de données nommée PeptideAtlas, construite par F. Desiere et al. [F. Desiere et al. Nucleic Acids Res. 2006, Jan 1 ; 34(database issue) : D655-8] pour compiler l'ensemble des transitions MRM de peptides décrites par la communauté scientifique. Cette base PeptideAtlas est disponible en accès libre sur internet. Pour des molécules non protéiques, il est également possible d'utiliser des bases de données, telles que par exemple celle accessible au travers du logiciel Cliquid de la société Applied Biosytems (USA).

Une approche alternative pour sélectionner les peptides protéotypiques, (m/z)1 et (m/z)2, consiste à utiliser les spectres de fragmentation MS/MS obtenus à l'occasion d'autres travaux. Ces travaux peuvent être, par exemple, les phases de découverte et d'identification des biomarqueurs par analyse protéomique. Cette approche a été proposée par Thermo Scientific lors de réunion utilisateurs. Elle permet de générer une liste de transitions candidates à partir des peptides identifiés expérimentalement par le logiciel SIEVE (Thermo Scientific). Certains critères ont été détaillés dans la littérature pour le choix des ions (m/z)1 et (m/z)2 et sont détaillés ci-après :

Les peptides avec des sites de clivage interne, c'est-à-dire avec de la Lysine ou de l'Arginine interne, doivent être évités, sauf si la Lysine ou l'Arginine est suivie par de la Proline,

Les peptides avec de l'Asparagine ou de la Glutamine doivent être évités car ils peuvent se désaminer,

Les peptides avec de la Glutamine ou de l'Acide Glutamique en N-terminal doivent être évités car ils peuvent se cycliser spontanément,

· Les peptides avec de la Méthionine doivent être évités car ils peuvent être oxydés,

Les peptides avec de la Cystéine doivent être évités car ils peuvent être modifiés de façon non reproductible lors d'une éventuelle étape de dénaturation, réduction et blocage des fonctions thiols,

· Les peptides avec de la Proline peuvent être considérés comme favorables parce qu'ils produisent généralement des fragments intenses en MS/MS avec un seul pic très majoritaire. Cependant, un seul fragment très majoritaire ne permet pas de valider l'identité de la transition dans un mélange complexe. En effet, seule la présence simultanée de plusieurs fragments caractéristiques permet de vérifier que l'ion précurseur recherché est bien détecté, Les peptides ayant une Proline adjacente au C-terminal (position n-1 ) ou en seconde position par rapport au C-terminal (position n-2) sont à éviter car, dans ce cas, la taille du peptide fragment de première génération est généralement considérée comme trop petite pour être suffisamment spécifique, · La sélection de fragments ayant une masse supérieure au précurseur est à privilégier pour favoriser la spécificité. Pour cela, il faut sélectionner un ion précurseur dichargé et sélectionner l'ion fragment de première génération le plus intense ayant une masse supérieure au précurseur, c'est à dire un ion fragment de première génération monochargé.

La fragmentation des ions précurseurs sélectionnés est mise en œuvre dans une cellule de fragmentation telle que les modèles de type triple quadripôle, ou de type trappe ionique, ou encore de type temps de vol (TOF), lesquels permettent également la séparation des ions. La ou les fragmentations seront classiquement réalisées par collision avec un gaz inerte tel que l'argon ou l'azote, au sein d'un champ électrique, par photo-excitation ou photodissociation à l'aide d'une source lumineuse intense, collision avec des électrons ou espèces radicalaires, par application d'une différence de potentiel, par exemple dans un tube de temps de vol, ou par tout autre mode d'activation. Les caractéristiques du champ électrique conditionnent l'intensité et la nature de la fragmentation. Ainsi, le champ électrique appliqué en présence d'un gaz inerte, par exemple dans un quadripôle, conditionne l'énergie de collision apportée aux ions. Cette énergie de collision sera optimisée, par l'homme du métier, pour accroître la sensibilité de la transition à doser. A titre d'exemple, il est possible de faire varier l'énergie de collision entre 5 et 180 e-V en q2 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems (Foster City, Etats Unis d'Amérique). De même, la durée de l'étape de collision et l'énergie d'excitation au sein, par exemple, d'une trappe ionique seront optimisées, par l'homme du métier, pour conduire au dosage le plus sensible. A titre d'exemple, il est possible de faire varier cette durée, baptisée temps d'excitation, entre 0,010 et 50 ms et l'énergie d'excitation entre 0 et 1 (Unité Arbitraire) en Q3 dans un spectromètre de masse AB SCIEX QTRAP® 5500 de la société Applied Biosystems.

Enfin, la détection des ions caractéristiques sélectionnés se fait de façon classique, notamment grâce à un détecteur et à un système de traitement. Le détecteur collecte les ions et produit un signal électrique dont l'intensité dépend de la quantité d'ions collectée. Le signal obtenu est ensuite amplifié pour qu'il puisse être traité informatiquement. Un ensemble informatique de traitement des données permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse.

Le principe du mode SRM, ou encore du mode MRM, est de sélectionner spécifiquement un ion précurseur, de le fragmenter, puis de sélectionner spécifiquement l'un de ses ions fragments. Pour de telles applications, des dispositifs du type triple quadripôle ou des hybrides triple quadripôle à trappe ionique sont généralement utilisés.

Dans le cas d'un dispositif triple quadripôle (Q1 q2Q3) utilisé en mode MS2, en vue du dosage ou de la détection d'une protéine cible, le premier quadripôle (Q1 ) permet de filtrer les ions moléculaires, correspondant aux peptides protéotypiques caractéristiques de la protéine à doser et obtenus lors d'une étape antérieure de digestion, en fonction de leur ratio masse sur charge (m/z). Seuls les peptides ayant le ratio masse/charge du peptide protéotypique recherché, ratio appelé (m/z)1 , sont transmis dans le deuxième quadripôle (q2) et jouent le rôle d'ions précurseurs pour la fragmentation ultérieure. L'analyseur q2 permet de fragmenter les peptides de ratio masse/charge (m/z)1 en ions fragments de première génération. La fragmentation est généralement obtenue par collision des peptides précurseurs avec un gaz inerte, comme de l'azote ou de l'argon dans q2. Les ions fragments de première génération sont transmis dans un troisième quadripôle (Q3) qui filtre les ions fragments de première génération en fonction d'un ratio masse sur charge spécifique, ratio appelé (m/z)2. Seuls les ions fragments de première génération ayant le ratio masse/charge d'un fragment caractéristique du peptide protéotypique recherché (m/z)2 sont transmis dans le détecteur pour être détectés, voire quantifiés.

Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, en relation avec la sélection de l'ion précurseur d'une part et de la sélection de l'ion fragment de première génération d'autre part. La spectrométrie de masse en mode SRM ou MRM est donc avantageuse pour la quantification

Lorsque la spectrométrie de masse mise en œuvre dans le procédé de l'invention est une spectrométrie de masse en tandem (MS2, MS3, MS4 ou MS5), plusieurs analyseurs de masse peuvent être couplés entre eux. Par exemple, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.

Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, le procédé de l'invention comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :

- la spectrométrie de masse, mise en œuvre pour les propriétés de typage, de résistance potentielle à au moins un antimicrobien et facteur de virulence, est une spectrométrie de type MS/MS, ce qui a pour avantage de générer un fragment spécifique de la molécule à détecter ou à quantifier, et ainsi d'apporter une grande spécificité à la méthode de dosage ;

- la spectrométrie MS/MS est de la MRM, ce qui a pour avantage d'utiliser un temps de cycle d'analyse dans le spectromètre de masse de quelques dizaines de millisecondes, ce qui permet de détecter ou de quantifier avec une grande sensibilité, et de façon multiplexée, un grand nombre de molécules différentes ;

- la détermination des propriétés de typage, résistance à un antimicrobien et facteur de virulence est mise en œuvre dans le même appareil de spectrométrie de masse, de préférence simultanément, ce qui a pour avantage de réduire le temps d'analyse et le coût de l'instrument, cela facilite également le traitement et le rendu des résultats.

Lorsque les marqueurs à doser dans un fluide biologique sont d'origine protéique, en amont de la détection par spectrométrie de masse, l'échantillon à analyser est préférentiellement traité au préalable pour générer des peptides à partir de l'ensemble des protéines présentes dans l'échantillon pour fragmenter ces protéines en peptides, par exemple par digestion avec une enzyme protéolytique (protéase), ou par action d'un réactif chimique. En effet, le clivage des protéines peut être fait par un traitement physico-chimique, par un traitement biologique ou par une combinaison des deux traitements. Parmi les traitements utilisables, on peut citer le traitement par des radicaux hydroxyle, notamment avec de ΙΉ₂Ο₂. Le traitement par les radicaux hydroxyle provoque une coupure des liaisons peptidiques qui se fait de manière aléatoire sur n'importe quelle liaison peptidique de la protéine. La concentration en radicaux hydroxyle conditionne le nombre de clivages opérés et donc la longueur des fragments peptidiques obtenus. D'autres traitements chimiques peuvent également être utilisés comme, par exemple, le traitement au bromure de cyanogène (CNBr) qui scinde spécifiquement les liaisons peptidiques au niveau du groupe carboxylique des résidus méthionyle. Il est également possible de réaliser un clivage acide partiel au niveau des résidus aspartyle par chauffage à 100°C d'une solution de protéines dans de l'acide trifluoroacétique.

Le traitement des protéines par digestion enzymatique est néanmoins préféré par rapport au traitement physico-chimique car il préserve davantage la structure des protéines, et est plus facile à contrôler. Par « digestion enzymatique », on entend l'action simple ou combinée d'une ou de plusieurs enzymes dans des conditions de réaction appropriées. Les enzymes effectuant la protéolyse, appelées protéases, coupent les protéines à des endroits spécifiques. Chaque protéase reconnaît généralement une séquence d'acides aminés au sein desquels elle effectue toujours la même coupure. Certaines protéases reconnaissent un seul acide aminé ou une séquence de deux acides aminés entre lesquels elles opèrent un clivage, d'autres protéases ne reconnaissent que des séquences plus longues. Ces protéases peuvent être des endoprotéases ou des exoprotéases. Parmi les protéases connues on peut citer, comme celles décrites dans la demande de brevet WO2005/098017A1 :

- les enzymes spécifiques comme la trypsine qui scinde la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus Arg et Lys, l'endolysine qui clive la liaison peptidique du groupe -CO des lysines, la chymotrypsine qui hydrolyse la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la pepsine qui coupe au niveau du groupe NH₂ des résidus aromatiques (Phe, Tyr et Trp), la protéase V8 de la souche V8 de Staphylococcus aureus qui clive la liaison peptidique au niveau du groupe carboxylique du résidu Glu ;

- les enzymes non-spécifiques comme la thermolysine provenant de la bactérie Bacillus thermoproteolyticus qui hydrolyse la liaison peptidique du groupe NH2 des acides aminés hydrophobes (Xaa-Leu, Xaa-lle, Xaa-Phe), la subtilisine et la pronase qui sont des protéases bactériennes qui hydrolysent pratiquement toutes les liaisons et peuvent transformer les protéines en oligopeptides dans des conditions de réaction contrôlées (concentration en enzyme et durée de réaction).

Plusieurs protéases peuvent être utilisées de façon simultanée, si leurs modes d'action sont compatibles, ou elles peuvent être utilisées de façon successive. Dans le cadre de l'invention, la digestion de l'échantillon est, de préférence, réalisée par action d'une enzyme protéase, par exemple la trypsine.

La génération de peptides à l'aide d'un réactif chimique ou d'une protéase, peut être obtenue par simple réaction en solution. Elle peut également être mise en œuvre avec un four à micro-ondes, ou sous pression, ou bien encore avec un dispositif à ultrasons. Dans ces trois derniers cas, le protocole sera beaucoup plus rapide.

Parmi les peptides ainsi obtenus, les peptides spécifiques de la protéine, sont nommés peptides protéotypiques. Ce sont eux qui seront dosés par spectrométrie de masse.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les marqueurs de caractérisation sont des protéines dosables dans un fluide biologique. En particulier, lesdites protéines sont digérées en peptides, de préférence par une enzyme, de préférence encore par la trypsine.

De même, l'échantillon contenant des marqueurs d'origine protéique peut également être préalablement traité à des fins de purification. Lorsque les marqueurs sont d'origine protéique, ce traitement préalable de purification peut être mis en œuvre avant ou après l'étape de génération de peptides tels que décrits précédemment.

Le traitement préalable de purification d'échantillon est largement connu de l'homme du métier et pourra notamment mettre en œuvre des techniques de centrifugation, de filtration, d'électrophorèse ou de chromatographie. Ces techniques séparatives peuvent être utilisées seules ou combinées entre elles pour obtenir une séparation multidimensionnelle. Par exemple, une chromatographie multidimensionnelle peut être utilisée en associant une séparation par chromatographie d'échange d'ions à une chromatographie en phase inverse, comme décrit par T. Fortin et al. [T. Fortin et al., 2009, Mol. Cell Proteomics, 8(5) : 1006-1015], ou H. Keshishian et al [H. Keshishian et al., 2007, Mol. Cell Proteomics, 2212-2229]. Dans ces publications, le milieu chromatographique peut être en colonne ou en cartouche (extraction en phase solide).

La fraction électrophorétique ou chromatographique (ou le temps de rétention en chromatographie mono ou multidimensionnelle) des peptides protéotypiques est caractéristique de chaque peptide et la mise en œuvre de ces techniques permet donc de sélectionner le ou les peptides protéotypiques à doser. Un tel fractionnement des peptides générés permet d'accroître la spécificité du dosage ultérieur par spectrométrie de masse.

Pour toutes les méthodes de spectrométrie de masse décrites ci-dessus, un calibrage est nécessaire pour pouvoir corréler l'aire du pic mesurée, correspondant à l'intensité de courant induit par les ions détectés, à la quantité de molécule cible à doser. Pour cela, les calibrages classiquement utilisés en spectrométrie de masse pourront être mis en œuvre, dans le cadre de l'invention. Les dosages MRM sont classiquement calibrés à l'aide de standards externes ou, de préférence, à l'aide de standards internes tels que décrits par T. Fortin et al. précité. Dans le cas où la molécule cible est un peptide protéotypique, permettant de doser une protéine d'intérêt, la corrélation entre la mesure quantitative et la quantité de peptide protéotypique cible, et par la suite de protéine d'intérêt, est obtenue en étalonnant le signal mesuré par rapport à un signal étalon pour lequel la quantité à doser est connue. L'étalonnage peut être réalisé au moyen d'une courbe d'étalonnage, par exemple obtenue par injections successives de peptide protéotypique étalon à différentes concentrations (étalonnage externe), ou de façon préférentielle, par étalonnage interne en utilisant un peptide lourd, comme standard interne, par exemple conformément aux méthodes AQUA, QconCAT ou PSAQ détaillées ci-après. Par « peptide lourd », on entend un peptide correspondant au peptide protéotypique, mais dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone 12 (¹²C) est (sont) remplacé(s) par du carbone 13 (¹³C), et/ou un ou plusieurs atomes d'azote 14 (¹⁴N) est (sont) remplacé(s) par de l'azote 15 (¹⁵N).

L'utilisation de peptides lourds, comme standards internes (AQUA), a également été proposée dans la demande de brevet US2004/0229283A1 . Le principe est de synthétiser artificiellement des peptides protéotypiques avec des acides aminés comportant des isotopes plus lourds que les isotopes naturels usuels. De tels acides aminés sont obtenus, par exemple, en remplaçant certains des atomes de carbone 12 (¹²C) par du carbone 13 (¹³C), ou en replaçant certains des atomes d'azote 14 (¹⁴N) par de l'azote 15 (¹⁵N). Le peptide artificiel (AQUA) ainsi synthétisé a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que le peptide naturel (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est généralement ajouté, à une concentration donnée, à l'échantillon, en amont du dosage par spectroscopie de masse, par exemple entre le traitement entraînant le clivage des protéines de l'échantillon d'intérêt et le fractionnement des peptides obtenus après l'étape de traitement. De ce fait, le peptide AQUA est co-purifié avec le peptide naturel à doser, lors du fractionnement des peptides. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour le dosage. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et AQUA, dont la concentration est connue, permet de calculer la concentration du peptide naturel et de remonter ainsi à la concentration de la protéine à doser. Une variante de la technique AQUA a été proposée par J.-M. Pratt et al. [J.-M. Pratt et al., 2006, Nat. Protoc., 1 :1029- 1043] sous le nom de QconCat. Cette variante est également décrite dans la demande de brevet WO2006/128492A1 . Elle consiste à concaténer différents peptides AQUA et à produire le polypeptide artificiel sous forme de protéine recombinante lourde. La protéine recombinante est synthétisée avec des acides aminés comportant des isotopes lourds. De cette façon, il est possible d'obtenir un standard pour calibrer le dosage simultané de plusieurs protéines à moindre coût. Le standard QconCAT est ajouté dès le début, en amont du traitement entraînant le clivage des protéines et avant les étapes de fractionnement des protéines, de dénaturation, de réduction puis de blocage des fonctions thiols des protéines, si celles-ci sont présentes. Le standard QconCAT subit donc le même cycle de traitement entraînant le clivage des protéines que la protéine naturelle, ce qui permet de tenir compte du rendement de l'étape de traitement entraînant le clivage des protéines. En effet, le traitement, notamment par digestion, de la protéine naturelle peut ne pas être complet. Dans ce cas l'utilisation d'un standard AQUA conduirait à sous- estimer la quantité de protéine naturelle. Pour un dosage absolu, il peut donc être important de tenir compte des rendements de traitement entraînant le clivage des protéines. Cependant, V. Brun et al. [V. Brun et al., 2007, Mol. Cell Proteomics, 2139-2149] ont montré que, parfois, les standards QconQAT ne reproduisaient pas exactement le rendement de traitement notamment par digestion de la protéine naturelle, sans doute du fait d'une conformation tridimensionnelle différente de la protéine QconCAT.

V. Brun et al. ont alors proposé d'utiliser une méthode baptisée PSAQ et décrite dans la demande de brevet WO2008/145763A1 . Dans ce cas, le standard interne est une protéine recombinante, ayant la même séquence que la protéine naturelle mais synthétisée avec des acides aminés lourds. La synthèse est réalisée ex-vivo avec des acides aminés lourds. Ce standard a rigoureusement les mêmes propriétés physicochimiques que la protéine naturelle (à l'exception d'une masse plus élevée). Il est ajouté dès le début, avant l'étape de fractionnement des protéines, lorsque cette dernière est présente. Il est donc co-purifié avec la protéine native, lors de l'étape de fractionnement des protéines. Il présente le même rendement de traitement, notamment par digestion, que la protéine native. Le peptide lourd obtenu après clivage est également co-purifié avec le peptide naturel, si une étape de fractionnement des peptides est réalisée. Les deux peptides sont donc injectés simultanément dans le spectromètre de masse, pour être dosé quantitativement. Ils subissent alors les mêmes rendements d'ionisation dans la source. La comparaison des aires de pic des peptides naturels et des peptides de référence dans la méthode PSAQ permet de calculer la concentration de la protéine à doser en tenant compte de la totalité des étapes du procédé de dosage.

L'ensemble de ces techniques, à savoir AQUA, QconCAT ou PSAQ ou toute autre technique de calibrage, utilisée dans des dosages par spectrométrie de masse et en particulier dans les dosages MRM ou MS, pourront être mises en œuvre pour effectuer le calibrage, dans le cadre de l'invention.

De façon préférentielle, la spectrométrie de masse utilisée dans le procédé de détection selon l'invention est de type MS/MS. Plus préférentiellement, la spectrométrie de masse est la MRM.

Dans un mode préféré de l'invention, on mesure les aires de pic des peptides naturels (échantillon à doser) et du standard interne rajouté à l'échantillon, dont la concentration est connue. Le résultat est exprimé sous forme de ratio aire peptide naturel/aire standard interne. Pour obtenir une quantification absolue au cours d'une même expérience, une quantité fixe de standard est ajoutée à tous les échantillons analysés.

On dispose d'un standard à mesurer pour chaque transition suivie.

Par dosage on entend toute méthode analytique qui permet de quantifier une protéine donnée, qu'il s'agisse d'un dosage par MRM, par ELISA, ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. La quantification peut être absolue. La dose de protéine est alors exprimée dans une unité du système international, comme les ng/ml. Ou relative, la dose est alors exprimée en Unités Arbitraires, quand on s'étalonne par rapport à une molécule de référence. C'est le cas par exemple pour la quantification par MRM, où l'on en effectue le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde: aire léger / aire lourd. Pour le CA19-9, la quantité est estimée par rapport à un étalon international, comme décrit dans la notice de la trousse Vidas® CA19-9 de la Demanderesse.

Lorsque l'on utilise la spectrométrie de masse, et en particulier la technique LC-MRM-MS décrite ci-dessus, les doses pour plusieurs transitions d'une même protéine sont summerisées pour obtenir un seul dosage de la protéine. Par summerisation et summeriser, on entend combiner entre eux plusieurs dosages indépendants de la même protéine, qui corrèlent entre eux, pour obtenir une dose unique qui est représentative de la dose de la protéine dans l'échantillon biologique étudié.

La summerisation peut être réalisée par exemple par la méthode de médian polish comme avec le package r qui utilise la procédure de Tukey Package stats version 2.15.0 Index ; http://stat.ethz.ch/R-manual/R- patched/library/stats/html/med polish. html.

L'échantillon sur lequel le procédé de l'invention peut être mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir la prolidase et les autres marqueurs d'intérêt, ou l'un quelconque de leurs traceurs. Il peut alors correspondre à un prélèvement de fluide biologique (sang total, sérum, plasma, urine, salive, liquide céphalo-rachidien, sécrétion organique, selles par exemple), sous forme liquide ou déposé par exemple sur un papier de recueil du type papier Watman (dried blood spot), un prélèvement tissulaire ou des cellules isolées. Ce prélèvement peut être utilisé tel quel dans la mesure où la prolidase, un de ses traceurs, ou l'un des autres marqueurs ou de leurs traceurs sont disponibles dans l'échantillon testé, ou bien il peut subir préalablement à l'analyse, une préparation de type enrichissement, extraction, concentration, purification, culture, selon des méthodes connues de l'homme du métier.

L'échantillon biologique utilisé pour la détection directe de la prolidase, susceptible de contenir de la prolidase en tant que tel, peut être constitué par du fluide biologique ou un tissu provenant de la biopsie de la tumeur, des ganglions ou des métastases du patient considéré.

A titre de fluide biologique, on peut citer le sang total ou ses dérivés tels que le sérum ou le plasma, la moelle osseuse, le lait, la salive, les selles, le liquide céphalo-rachidien, les urines et les épanchements. On préfère le sang ou ses dérivés, la salive, les urines et les selles.

Pour la détection de la prolidase, le fluide biologique, qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention, peut nécessiter un traitement particulier. En effet, le fluide biologique peut contenir la prolidase en tant que tel, ou bien il peut contenir des cellules tumorales circulantes qui contiennent de la prolidase, et/ou des cellules tumorales circulantes qui sont capables de sécréter la prolidase. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le fluide biologique est préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes contenues dans le dit fluide.

Par isoler les cellules tumorales circulantes, on entend obtenir une fraction cellulaire enrichie en cellules tumorales circulantes.

Le traitement du fluide pour isoler les cellules tumorales circulantes peut être effectué par tri cellulaire dans un cytomètre de flux, par enrichissement sur Ficoll, par enrichissement par billes magnétiques recouvertes d'anticorps spécifiques, par filtration en fonction de la taille des cellules ou de leurs propriétés physico-chimiques, ou par toute autre méthode d'enrichissement spécifique connue de l'homme du métier.

Dans le cas du sang ou de la moelle à titre de fluide biologique, les cellules tumorales circulantes peuvent être isolées grâce à une technique de séparation cellulaire sur Ficoll associée à une déplétion des cellules sanguines utilisant des anticorps anti-CD45 couplés à des billes magnétiques (Dynal Biotech ASA, Norvège).

La détection directe de la prolidase et des autres marqueurs d'intérêt peut alors être effectuée directement à partir de cellules tumorales circulantes isolées du fluide biologique, par exemple par marquage immunocytochimique de ces cellules avec un anticorps anti-prolidase, après avoir déposé les cellules tumorales circulantes sur une lame par cytospin. La détection directe de la prolidase peut également être effectuée directement dans les cellules tumorales circulantes en utilisant la méthode de cytométrie de flux telle que décrite dans Métézeau P, Ronot X, Le Noan-Merdrignac G, Ratinaud MH, La cytométrie en flux pour l'étude de la cellule normale ou pathologique (Tome I), Eds Medsi-MacGrawhill.

Dans ces conditions, lesdites cellules circulantes peuvent être traitées dans des conditions permettant le blocage de la prolidase à l'intérieur desdites cellules. Un tel traitement est décrit par exemple dans Intracellular Flow Cytometry, Applied reagents and Techniques, pp 1 -21 , BD Pharmingen.

La détection de la prolidase se fait alors après avoir rendu perméable la membrane des cellules pour faire rentrer les partenaires de liaison spécifique de la prolidase.

La détection directe de la prolidase à partir des cellules circulantes peut également être effectuée à l'aide du procédé décrit dans la demande de brevet WO03/076942A2 déposée par l'une des Demanderesses. La détection directe de la prolidase dans les cellules tumorales peut encore être effectuée dans le milieu de culture desdites cellules après les avoir cultivées dans des conditions telles qu'elles sécrètent de la prolidase.

Ces conditions de culture sont des conditions classiques telles que 37°C sous atmosphère humide et à 5% de CO₂.

Lorsque l'échantillon biologique à tester est du tissu provenant de la biopsie de la tumeur, des ganglions ou des métastases du patient, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention, la détection directe de la prolidase est effectuée directement sur les coupes obtenues, sans traitement préalable dudit tissu.

Un autre mode de détection de la présence de la prolidase consiste en la culture, en présence de l'échantillon biologique, de cellules sensibles à la prolidase, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.

Dans ce cas, la détection de la présence de la prolidase dans un échantillon biologique est mise en évidence par la réaction des cellules sensibles à la prolidase.

Par cellules sensibles à la prolidase, on entend toute cellule sensible à l'activité biologique de la prolidase.

L'échantillon biologique que l'on peut utiliser pour la détection de la présence de la prolidase par culture de cellules sensibles à la prolidase peut être tout échantillon tel que décrit précédemment.

Ainsi, l'échantillon biologique peut être constitué de fluide biologique, le cas échéant préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes, elles-mêmes pouvant ensuite être cultivées en conditions telles qu'elles sécrètent de la prolidase, comme décrit précédemment.

Un autre mode de détection de la présence de prolidase dans les échantillons biologiques consiste en la détection de l'ARNm de la prolidase dans ledit échantillon, ce qui constitue un autre mode de réalisation de l'invention.

On entend par acide nucléique les oligonucléotides, les acides désoxyribonucléiques et les acides ribonucléiques, ainsi que leurs dérivés.

Le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino- 5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphodiester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR- A-2 607 507, les LNA tels que phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA décrits dans Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998, pages 2219-2222, et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., [M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897], sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié.

Une autre modification peut être par exemple une variation de l'épissage des ARNm entraînant un changement dans la structure de la protéine. Par exemple la prolidase peut être exprimée sous forme tronquée. La détection d'ARNm dans un échantillon liquide est largement connue de l'homme du métier. Elle peut par exemple être mise en œuvre par des réactions d'hybridation entre l'ARNm cible et un acide nucléique capable de liaison avec l'ARNm cible.

La révélation des réactions d'hybridation peut être effectuée par marquage des acides nucléiques de liaison, comme illustré précédemment.

Avant hybridation avec l'acide nucléique de liaison, l'ARNm cible peut être extrait par des méthodes connues de l'homme du métier, puis éventuellement amplifié, comme par exemple par RT-PCR ou par NASBA [Maleck, L, et al., 1994, Methods in Molecular Biology, 28, ch 36, Ed P.G. Isaac, Humana Press, Inc., Totowa, NJ].

L'échantillon biologique que l'on peut utiliser pour la détection de la présence de la prolidase par détection d'ARNm de la prolidase peut être tout échantillon tel que décrit précédemment.

Ainsi, l'échantillon biologique peut être constitué de tissu issu de biopsie de tumeur, de ganglion ou de métastase, ou bien de fluide biologique, le cas échéant préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes, comme décrit précédemment.

Un autre mode de détection de la présence de prolidase dans les échantillons biologiques consiste en la détection de tout ou partie du gène de la prolidase dans ledit échantillon, ayant subi des modifications conduisant à une modification dans l'expression de la prolidase, ce qui constitue un autre mode de réalisation de l'invention. Une telle modification peut être par exemple une méthylation du promoteur du gène de la prolidase. D'autres modifications peuvent être la présence de mutations de la chaîne nucléotidique ou des variations d'épissage de l'ARNm, entraînant une changement d'expression de la prolidase ou l'expression d'une forme modifiée de la prolidase.

Dans un mode préféré de l'invention, on peut détecter un traceur de la prolidase consécutif à la présence d'une forme modifiée de la prolidase. Par exemple, on peut détecter la présence d'auto-anticorps dirigés contre la prolidase dans un échantillon distant de la tumeur.

La présente invention est maintenant illustrée par les exemples qui suivent qui en dégagent les intérêts et avantages.

Exemple 1 : Détection de la prolidase par la technique LC-MRM-MS

1 ) Méthodologie de la technique Multiple Reaction Monitorinq (M RM) Le principe de ce dosage repose sur l'association entre la chromatographie liquide et un spectromètre de masse de type hybride triple quadrupole/trappe ionique (5500QT d'AB Sciex Toronto, Canada) fonctionnant en mode MRM (Q1 q2Q3). Dans le principe, pour chaque protéine d'intérêt on choisit les peptides trypsiques d'intérêt. Les transitions sont prédites par exemple à l'aide des logiciels Skyline (MIT Cambridge USA) ou MRM pilot™ d'AB Sciex.

On quantifie la prolidase par le biais de la quantification d'un ou plusieurs de ses peptides. Ces peptides sont choisis en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques, et de leur capacité à être détectés dans le spectromètre de masse. Les peptides sélectionnés sont isolés dans le premier quadrupole Q1 , pour être fragmentés dans la cellule de collision du spectromètre de masse (q2). A partir des ions fils générés, les plus représentatifs et spécifiques ont été choisis, et l'intensité de ces ions fils a été monitorée après sélection dans le troisième quadrupole Q3. Le couple de masse ion parent/ion fils est appelé transition, et c'est l'association de la transition au temps de rétention chromatographique qui lui correspond qui définit la spécificité de l'essai par rapport à la protéine cible. Pour avoir un dosage quantitatif, il faut ajouter un standard interne (par exemple un peptide identique « lourd » qui va servir d'étalon, en quantité connue, qui est ajouté à l'échantillon et est élué au même temps chromatographique et qui permet la quantification relative. Les peptides ont été sélectionnés en fonction de leur sensibilité (meilleure réponse dans le spectromètre de masse) et de leur spécificité dans la matrice.

Des peptides de séquences identiques aux peptides cibles sélectionnés ont été synthétisés, avec de la lysine ou de l'arginine marquées (¹³C et ¹⁵N) : +8 Dalton pour la lysine, +10 Da pour l'arginine, afin de pouvoir réaliser des dosages quantitatifs. En effets, ces peptides lourds ont les mêmes propriétés physico-chimiques que les peptides cibles, et sont élués aux mêmes temps de rétention chromatographiques.

Afin de pouvoir baisser la limite de détection à quelques ng/ml, un procédé amélioré de MRM-MS a été mis en œuvre, il comprend les étapes successives suivantes : digestion trypsique ; fractionnement SPE (Solid-Phase Extraction) des peptides ; et chromatographie liquide (LC) couplée à la MRM- MS et décrites ci-après.

La mise au point a été réalisée sur des échantillons surchargés en ajoutant les peptides synthétiques.

Calibration

Pour réaliser une étude quantitative relative de la prolidase, on a rajouté à chaque échantillon une quantité fixe (1 ΟμΙ) d'un pool de peptides lourds de la protéine à doser synthétisés avec de l'Arginine ou de la Lysine comportant du ¹³C et du ¹⁵N. La quantification est relative et non absolue, car la quantité de peptides synthétisés et ajoutée est fixe pour tous les échantillons, mais elle est seulement estimée et pas connue de façon précise. Digestion enzymatigue

Les échantillons de sérums sont dénaturés dans une solution d'urée 6M tamponnée par 10 mM de Tris pH 8 et contenant 30 mM de dithiothreitol, pendant 40 minutes à 40°C, puis alkylés par de l'iodoacétamide 50 mM, à température ambiante, pendant 40 minutes, à l'obscurité. Ils sont dilués 6 fois dans l'eau, puis la digestion trypsique est réalisée à 37°C, sur la nuit, en utilisant un ratio enzyme substrat de 1 :30 (Promega). La digestion est arrêtée par ajout d'acide formique à une concentration finale de 0,5%. Les échantillons digérés sont dessalés par extraction sur phase solide (SPE, solid phase extraction) en utilisant les cartouches en phase inverse Oasis HLB 3cc (60 mg) (Waters, Manchester UK). Après application de l'échantillon, les cartouches sont lavées par 1 ml d'acide formique à 0,1 %, puis l'élution a été réalisée par un mélange méthanol/eau (80/20 v/v) contenant 0,1 % d'acide formique. Les éluats sont séchés sous vide.

Fractionnement SPE

Les échantillons secs sont repris dans 1 ml de tampon acétate et chargés sur les cartouches mixtes (hydrophobe et échange de cation) Oasis MCX (mixed cation exchange) 60 mg (Waters, Manchester UK) équilibrées au préalable en tampon acétate et méthanol. Les cartouches sont lavées par 1 ml de tampon acétate et 1 ml de méthanol. Les peptides d'intérêt (Tableau 1 ) sont élués par 1 ml d'un mélange méthanol/tampon acétate (50/50 v/v)). Le pH du tampon acétate est choisi en fonction du point isoélectrique du peptide d'intérêt. Les éluats sont séchés sous vide, dissous dans 200 μΙ d'une solution d'acétonitrile/eau (3/97 v/v) contenant 0,1 % d'acide formique. Un aliquot de 50 μΙ a été injecté dans la LC couplée à un système MS-MS.

Chromatoqraphie liquide et spectrométrie de masse

L'analyse LC-MS a été effectuée sur un système chromatographique haute pression (HPLC) de type HP 1 100 séries avec pompe binaire et injecteur (Agilent Technologies, Santa Clara Californie USA) couplé à un spectromètre de masse, AB Sciex 5500 QTrap (MS hybride triple quadripôle - trappe ionique) (AB Sciex, Toronto Canada) pour une meilleure sensibilité. La séparation LC a été effectuée sur une colonne Cis Symmetry (Waters, Manchester UK), à un débit d'élution de 300 μΙ/min. (Eluent A = 0,1 % acide formique dans l'eau, éluent B = 0,1 % acide formique dans l'acétonitrile, gradient linéaire de 5%B à 50%B en 25 min, puis de 50%B à 100%B en 3 min). L'analyse MS est réalisée en mode d'ionisation positive à une tension de 5500 V appliquée à l'aiguille permettant l'ionisation dans la source. Le contrôle de l'instrument et l'acquisition des données sont réalisés avec le logiciel Analyst 1 .4.1 . Les débits du gaz de nébulisation (air) et du gaz rideau (azote) sont de 30 et 20 psi, respectivement. La source ionique Turbo V™ est réglée à 400°C, le flux d'azote auxiliaire à 40 psi. L'énergie de collision (CE), la tension d'orifice (DP, declustering potential) et la tension à la sortie de la cellule de collision (CXP, collision cell exit potential) sont optimisées pour chacune des transitions MRM sélectionnées.

Tous les ions parents di- ou tri- chargés des peptides tryptiques théoriques dans un intervalle de masse allant de 800 à 3000 Da et tous les ions fragments possibles de type y ou b. Pour chaque protéine, chaque transition possible a été testée afin de déterminer les transitions les plus sensibles et les plus spécifiques. Le résultat de cette sélection est récapitulé dans le Tableau 1 . La séparation chromatographique MCX a été réalisée à différents pH, le pH choisi pour la suite des expériences étant le pH qui permet d'obtenir l'aire du pic la plus élevée.

2) Exemple des peptides et transitions suivis pour le dosage de la prolidase

Tableau 1

Il est possible de réaliser le dosage de la prolidase en suivant et en quantifiant une ou plusieurs transitions comme décrit ci-dessus. Dans un mode préféré de l'invention, les transitions suivies sont moyennées par tout moyen connu de l'homme du métier. Dans un mode préféré de l'invention, il est par exemple possible de moyenner les transitions utilisées pour le dosage par la méthode du médian polish. Dans un mode préféré de l'invention on peut utiliser un package r suivant la procédure de Tukey pour réaliser le médian polish.

Dans un autre mode préféré de l'invention, on peut réaliser le dosage de la prolidase dans des échantillons en suivant une seule transition, par exemple la transition 400.2/686.3 du peptide de SEQ ID NO : 1 , et la transition du peptide lourd correspondant. On établira pour chaque transition suivie le ratio de l'aire sous la courbe du pic chromatographique de la transition naturelle divisée par l'aire sous la courbe du pic chromatographique de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans les exemples 3 et 4 pour l'obtention de doses et de score de prolidase ont été obtenues en suivant et en quantifiant la transition 400.2/686.3 du peptide de SEQ ID NO : 1 .

Exemple 2 : Détection de marqueurs tumoraux par la technique LC- MRM-MS

Le principe des dosages utilisant la technologie de dosage Multiple Reaction Monitoring MRM décrit à l'exemple 1 pour le dosage de la prolidase peut être appliqué de la même façon au dosage de tout marqueur protéique dont on connaît la séquence. Ces dosages peuvent être utilisés pour doser tous types d'échantillons biologiques, comme par exemple le sang, le sérum, le plasma, les selles, les urines...

Comme décrit dans l'exemple 1 , pour une protéine donnée on peut quantifier un marqueur en suivant une ou plusieurs transitions. Chaque transition peut être suivie de façon indépendante, ou bien on peut réaliser une moyenne entre les transitions, en utilisant toute méthode de summerisation connue de l'homme du métier.

De la même façon pour la calibration, on réalise une étude quantitative relative de chaque marqueur, on a rajouté à chaque échantillon une quantité fixe (1 ΟμΙ) d'un pool de peptides lourds de la protéine à doser synthétisés avec de l'Arginine ou de la Lysine comportant du ¹³C et du ¹⁵N. La quantification est relative et non absolue, car la quantité de peptides synthétisés et ajoutée est fixe pour tous les échantillons, mais elle est seulement estimée et pas connue de façon précise. Pour obtenir les doses en Unités Arbitraires utilisées en combinaison dans l'exemple 4, on a effectué le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde.

On peut doser la protéine Alpha-Enolase en suivant par exemple les transitions listées dans le tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra la transition 452.7/662.2 du peptide IEEELGSK (SEQ ID NO : 5), et la transition du peptide lourd correspondant, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en suivant la transition 452.7/662.2 du peptide de SEQ ID NO : 5.

On peut doser la protéine 78 kDa glucose-regulated protein (BIP, GRP78) en suivant par exemple les transitions listées dans le tableau 3 ci- dessous : Tableau 3

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra les transitions du peptide de SEQ ID NO : 6 et leurs transitions du peptide lourd correspondant, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en summerisant entre- elles les doses des 3 transitions du peptide de SEQ ID NO : 6, en utilisant la méthode médian polish.

On peut doser la protéine G3PDH (GAPDH) en suivant par exemple les transitions listées dans le Tableau 4 ci-dessous : Tableau 4

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra les transitions du peptide de SEQ ID NO : 9, ou les transitions 403,2/550,3 et 403,2/706,3 du peptide de SEQ ID NO : 12, ou la transition 435,3/657,2 du peptide de SEQ ID NO : 10, ou la transition 765,9/949,5 du peptide de SEQ ID NO : 1 1 , et leurs transitions des peptides lourds correspondants, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en summerisant entre- elles les doses des transitions 403,2/550,3 et 403,2/706,3 du peptide de SEQ ID NO : 12, les doses de la transition 765,9/949,5 du peptide de SEQ ID NO : 1 1 , et les doses de la transition 435,3/657,2 du peptide de SEQ ID NO : 10, en utilisant la méthode médian polish. On peut doser la protéine HSP71 (HSC70) en suivant par exemple les transitions listées dans le tableau 5 ci-dessous :

Tableau 5

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra les transitions 600,3/671 ,4 et 600,3/742,5 du peptide de SEQ ID NO : 14, ou la transition 494,6/793,4 du peptide de SEQ ID NO : 15, et leurs transitions des peptides lourds correspondants, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en summerisant entre- elles les doses des transitions 600,3/671 ,4 et 600,3/742,5 du peptide de SEQ ID NO : 14, et la dose de la transition 494,6/793,4 du peptide de SEQ ID NO : 15, en utilisant la méthode médian polish.

On peut doser la protéine PDI en suivant par exemple les transitions listées dans le tableau 6 ci-dessous : Tableau 6

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra les transitions du peptide de SEQ ID NO : 17, et leurs transitions du peptide lourd correspondant, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en summerisant entre- elles les doses des différentes transitions du peptide de SEQ ID NO : 17, en utilisant la méthode médian polish.

On peut doser la protéine peroxy-5 en suivant par exemple les transitions listées dans le tableau 7 ci-dessous :

Tableau 7

Peroxi-5

Q1 Q3

Q1 Q3

(peptide (peptide

(peptide (peptide

Séquences pi TR lourd lourd DP EP CE CXP léger léger

standard standard

naturel) naturel)

interne) interne)

THLPGFVEQAEALK 5,4 16 513,9 659,4 516,6 667,4 79,9 3 16,2 17 (SEQ ID NO : 18) 653,4 653,4 79,9 3 18,7 13

788,4 796,4 79,9 3 16,2 19

677,4 685,4 103 3 25,1 15

LLADPTGAFGK

5,8 14,8 545,3 792,4 549,3 800,4 103 3 20 17 (SEQ ID NO : 19)

863,4 871 ,4 103 3 17,1 20

607,4 615,4 104,2 3 16,5 15

VNLAELFK

6 18,9 467,3 720,4 471 ,3 728,4 104,2 3 15,4 15,3 (SEQ ID NO : 20)

834,5 842,5 104,2 3 14,4 16

Dans un mode préféré de l'invention, on suivra la transition 545,3/677,4 du peptide de SEQ ID NO : 19, ou les transitions 513,9/653,4 et 513,9/788,4 du peptide de SEQ ID NO : 18, et leurs transitions des peptides lourds correspondants, on établira pour chaque transition le ratio des aires des pics chromatographiques de la transition naturelle divisée par l'aire de la transition lourde pour obtenir une dose par transition pour chaque échantillon, puis on summerisera entre elles ou non les doses obtenues pour les différentes transitions.

Les doses qui seront utilisées dans l'exemple 4 pour la réalisation d'un score en combinaison avec la prolidase, et dans l'exemple 6 pour l'obtention d'une dose et d'un score en individuel, ont été obtenues en summerisant entre- elles les doses de la transition 545,3/677,4 du peptide de SEQ ID NO : 19, et les doses des transitions 513,9/653,4 et 513,9/788,4 du peptide de SEQ ID NO : 18, en utilisant la méthode médian polish.

Exemple 3 : Utilisation des dosages sériques réalisés en Immuno- essais 1 ) Sélection des protéines et dosages

La Demanderesse a montré dans l'exemple 3 que des doses anormalement diminuées de protéine prolidase pouvaient être observées dans la circulation sanguine de certains patients atteints d'un cancer colorectal. D'autre part, la Demanderesse a montré dans les demandes de brevet WO2009024691 , WO2009019365, WO2009019368, WO2009019369, WO2009019366, WO2009019370, WO2009019367, WO2010004214, WO20101 12777 que des doses anormalement élevées ou anormalement diminuées de d'autres marqueurs tumoraux comme Ezrine, L-FABP, Apo A1 , Apo A2, Beta2 Microglobuline, ACE, CA19-9, Galectine-3, Protéasome 20S (Prosomes), Protéine Disulfide isomérase (PDI) et ProDefensine A6 pouvaient être observées dans la circulation sanguine de certains patients atteints d'un cancer colorectal. Les procédés de dosage de ces marqueurs tumoraux ont été décrits dans les demandes de brevets suscités.

En pratique, les doses des différents marqueurs dosés en ELISA utilisés pour la combinaison avec la prolidase dans l'exemple 4 ont été obtenues de la façon suivante :

Le procédé de dosage de Timpl a été mis en œuvre avec le kit ELISA Timpl de IBL International (N° RE54081 ) selon les instructions du fabricant, pour le dosage de la protéine Timpl dans les plasma EDTA des patients et contrôles.

Le procédé de dosage de M2PK a été mis en œuvre avec le kit ELISA M2PK de Schebo (ScheBo® Tumor M2-PK™ EDTA Plasma Test Cat.- No 08) selon les instructions du fabricant, pour le dosage de la protéine M2PK dans les plasma EDTA des patients et contrôles.

Le procédé de dosage pour le marqueur HSP60 est décrit dans l'article de Hamelin et al. [Céline Hamelin, Emilie Cornut, Florence Poirier, Sylvie Pons, Corinne Beaulieu, Jean-Philippe Charrier, Hader Haïdous, Eddy Cotte, Claude Lambert, Françoise Piard, Yasemin Ataman-Ônal, Geneviève Choquet-Kastylevsky. Identification and vérification of HSP60 as a potential sérum marker for colorectal cancer. FEBS J. 2011 Dec;278(24):4845-4859].

Les protéines ApoA1 et ApoA2 ont été dosées dans les sérums avec les kits commercialisés par Abnova (APOA1 ELISA Kit, Catalog # : KA0460, APOA2 ELISA Kit, Catalog # : KA0461 ), selon les instructions du fabricant.

Les marqueurs tumoraux ACE, β2 Microglobuline et CA19-9 ont été dosés à l'aide des trousses de dosage de la Demanderesse, respectivement Vidas® CEA(s), Vidas® β2 Microglobulin, Vidas® CA19-9, en suivant le protocole opératoire propre à chaque trousse.

- Les protéines Galectine 3 et Protéasome 20S (Prosomes) ont été dosées comme décrit dans le brevet de la Demanderesse, WO_2010004214, avec des tests ELISA sandwich développés sur l'automate Vidas®.

La protéine Ezrine a été dosée comme décrit dans le brevet WO_2009019365, avec un tests ELISA sandwich développé sur l'automate Vidas®.

La protéine LFABP a été dosée comme décrit ci-après : Dosage de la LFABP

Obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre la LFABP

Obtention de la protéine recombinante

Pour réaliser des immunisations et obtenir des anticorps monoclonaux contre la protéine L-FABP nous avons tout d'abord obtenu de la protéine recombinante L-FABP.

L'ADN complémentaire, les vecteurs d'expression, le clonage et l'obtention de la protéine recombinante LFABP (expression et purification) ont été réalisés de la même façon que décrits dans le brevet WO2010/004214.

Immunisations

Modèle animal

Les expériences d'immunisation ont été réalisées chez des souris BALB/c (H-2^d) femelles âgées de 6 à 8 semaines au moment de la première immunisation.

Immunogènes et immunisations

Afin d'augmenter les réponses immunes obtenues chez les souris et pouvoir générer des anticorps monoclonaux, la protéine L-FABP a été produite sous forme de protéine recombinantes produite selon les modes opératoires décrits dans la demande de brevet WO2010/004214. La protéine a été mélangée volume pour volume avec l'adjuvant de Freund (Sigma), préparé sous forme d'émulsion eau-dans-huile et dont il est connu qu'il présente un bon pouvoir immunogène. Trois souris ont été immunisées. Les souris ont reçu 3 doses successives de 10 g des immunogènes à 0, 2 et 4 semaines. Toutes les injections ont été réalisées par voie sous-cutanée. La première injection est faite en mélange avec l'adjuvant de Freund complet, les deux suivantes se font en mélange avec l'adjuvant de Freund incomplet. Entre J50 et J70 après la première injection, les réponses humorales ont été restimulées avec une injection intraveineuse de 100 g de la protéine recombinante.

Suivi de l'apparition de la réponse humorale

Afin de suivre l'apparition des anticorps, on effectue régulièrement sur les souris des prélèvements de sang. La présence des anticorps anti-marqueur tumoral est testée en utilisant un ELISA. La protéine d'intérêt est utilisée en capture (1 g/puits), après saturation on fait réagir avec l'antigène différentes dilutions des sérums à tester (incubation à 37°C, pendant 1 h). Les anticorps spécifiques présents dans le sérum sont révélés par un anticorps de chèvre anti-lgG de souris AffiniPure conjugué à la phosphatase alcaline (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat no. 1 15-055-146), qui se lie aux anticorps recherchés (0,1 pg/puits).

Obtention d'anticorps monoclonaux

Trois jours après la dernière injection, pour chaque marqueur tumoral, une des souris immunisées a été sacrifiée ; le sang et la rate ont été prélevés. Les splénocytes obtenues à partir de la rate ont été mises en culture avec les cellules de myélome Sp2/0-Ag14 pour qu'elles fusionnent et s'immortalisent, selon le protocole décrit par Kôhler et Milstein [G. Kôhler et C. Milstein, 1975, Nature, 256, 495-497 ; G. Kôhler et C. Milstein, 1976, Eur J Immunol, 6, 511- 519]. Après une période d'incubation de 12-14 jours les surnageants des hybridomes obtenus ont été criblés pour déterminer la présence d'anticorps anti-marqueur tumoral en utilisant le test ELISA décrit dans le point 3 de cet exemple. Les colonies d'hybridome positives ont été sous-clonées deux fois selon la technique de la dilution limite, bien connue par l'homme du métier.

Caractérisation des anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux obtenus contre la L-FABP sont les suivants : 2E5G9, 3A7B4, 5A8H2, 2C9G6, 3D6G1 , 8B10B8, 7D8A1 1

Ils ont été analysés par la technique du Western blot.

Complémentarité des anticorps

Pour pouvoir construire le test ELISA sur permettant de doser les échantillons de patients, on a tout d'abord testé la complémentarité des anticorps. Ce sont les mêmes anticorps qui sont utilisés en capture ou en révélation (après biotinylation). Chaque anticorps de révélation biotinylé est testé avec chaque anticorps de capture (anticorps du cône VIDAS). Les couples sont testés avec la protéine recombinante L-FABP décrite ci-dessus. Le tableau 8 récapitule les résultats obtenus pour les différents couples d'anticorps.

Tableau 8

Tableau croisé montrant les résultats obtenus pour chaque couple d'anticorps avec la protéine recombinante L-FABP (moyenne du signal - moyenne du bruit de fond en RFV). (RFV ou Relative Fluorescence Value est le signal lu par

Vidas®). Détection

Capture 2E5G9 3A7B4 5A8H2 2C9G6 3D6G1 8B10B8 7D8A1 1

2E5G9 10,5 16,5 25 10537 10377,5 5066 0,5

3A7B4 42 198 707,5 10071 9923 10009 24,5

5A8H2 36 109 513 10404 10283,5 9930 18,5

2C9G6 10753,5 10815 10708,5 1417,5 213 10774,5 1562

3D6G1 10136,5 10707,5 10684,5 606,5 138 10462 1038,5

8B10B8 8846 9940,5 9677 10385,5 10637,5 87 363,5

7D8A1 1 5,5 21 ,5 14 8053,5 8094,5 128 4,5

A l'issu de ces tests on retient 6 couples d'anticorps complémentaires :

3A7B4 / 3D6G1

- 5A8H2 / 3D6G1

2C9G6 / 5A8H2

3D6G1 / 5A8H2

8B10B8 / 5A8H2

2C9G6/2E5G9

Caractérisation des épitopes

Les épitopes reconnus par les anticorps monoclonaux ont été caractérisés en utilisant les techniques du Spotscan, le criblage de banque de peptides portés par des phages, et la construction de protéines chimères (librairie de fragements).

- Méthodologie

La technique du Spotscan, adaptée d'après Frank et Dôring, permet de synthétiser de façon simultanée un grand nombre de peptides fixés sur membrane de cellulose. Ces peptides reproduisent la séquence de l'antigène cible sous forme de peptides de 8 à 12 acides aminés, se chevauchant de 1 à 4 résidus. Ces peptides sont ensuite mis en contact avec l'anticorps à étudier dans un test colorimétrique de type Blot, et l'identification des peptides immunoréactifs permet de déduire la séquence minimale de l'épitope de l'anticorps et de le localiser précisément sur l'antigène.

La synthèse s'effectue sur une membrane de cellulose portant uniformément des bras en polyéthylène glycol (PEG) d'une longueur de 8 à 10 unités, présentant une fonction NH₂ libre en bout de chaîne. Elle se déroule de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale des peptides. Les acides aminés ont leur fonction aminée protégée par un groupement Fmoc (9- fluoréméthyloxycarbonyl), et leurs chaînes latérales, susceptibles de réagir au cours de la synthèse, sont également protégées par des groupements trityl, t- butyl ou t-butyl-éther. Les solutions-mères d'acides aminés sont préparées à une concentration de 0,33 M dans du NMP (N-méthyl-pyrrolidone) contenant 0,5 M de HOBt (hydroxybenzotriazole). Le dépôt des acides aminés s'effectue à l'aide du robot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Allemagne), piloté par l'intermédiaire du logiciel AutoSpot XL. L'utilisation de ce robot permet de faire en simultané jusqu'à 4 membranes de 96 spots, soit 384 peptides.

Pour un cycle de couplage d'un acide aminé, le robot dépose 0,7 μΙ de la solution d'acide aminé activé extemporanément (un volume de solution de diisopropyl-carbodiimide 1 ,1 M dilué en NMP pour 3 volumes de solution-mère d'acide aminé) sur les membranes. Ce dépôt est répété une seconde fois, puis les membranes sont rincées en DMF (Ν,Ν-diméthylformamide). Les groupements NH₂ n'ayant pas réagi sont ensuite été acétylés par 4 à 6 incubations de 10 minutes dans une solution d'anhydride acétique 10 % en DMF, afin d'éviter l'apparition de peptides abortifs ou tronqués. Après 3 lavages de 2 minutes en DMF, les groupements Fmoc protégeant la fonction aminée des acides aminés sont clivés par une incubation de 5 minutes dans une solution de pipéridine 20 % en DMF. Après 4 lavages en DMF, les spots sont colorés à l'aide d'une solution de bleu de bromophénol 1 % en DMF, puis la membrane est rincée 3 fois en méthanol et séchée à l'air libre avant le cycle de couplage suivant.

Ce protocole est répété pour l'ajout de chaque nouvel acide aminé. Après le couplage du dernier acide aminé, les peptides sont acétylés afin de permettre le blocage de tous les groupements NH₂ libres, empêchant ainsi l'ajout d'un autre acide aminé. Puis les chaînes latérales de tous les peptides sont déprotégées par l'incubation des membranes dans un bain acide trifluoroacétique / dichlorométhane / triisobutylsilane (5 : 5 : 0,3) pendant 1 heure. Les membranes sont ensuite rincées 4 fois en dichlorométhane, 3 fois en DMF et 3 fois en méthanol avant d'être séchées à l'air libre et conservées à -20°C jusqu'à l'immunorévélation.

Pour immunorévéler les spots avec un anticorps monoclonal, les membranes sont d'abord rincées en méthanol, puis lavées en TBS (Tris-HCI 50 mM pH 8,0, NaCI 140 mM, KCI 3 mM) avant d'être incubées sur la nuit à température ambiante dans la solution de saturation (solution concentrée 10X à base de caséine (Western Blocking reagent, Roche) diluée en TBS-Tween 20 0,05% (TBS-T) et contenant 5% de saccharose). Après un lavage de 10 minutes en TBS-T, les membranes sont incubées pendant 1 h30 à 37°C avec l'anticorps monoclonal dilué à 20 g/ml en solution de saturation. Les membranes sont ensuite lavées 3 fois en TBS-T, puis sont incubées avec le conjugué anti-souris couplé à la phosphatase alcaline (Jackson Immunoresearch), dilué au 1/2000^eme en solution de saturation. Après 2 lavages de 10 minutes en TBS-T, puis 2 lavages en CBS (acide citrique 10 mM pH 7, NaCI 140 mM, KCI 3 mM), le révélateur, préparé extemporanément (5- bromo, 4-chloro, 3-indoyl, phosphate 600 μΜ, thiazolyl blue tetrazolium bromide 720 μΜ, et MgC 5 mM en CBS), est mis en contact avec la membrane pendant 30 à 45 minutes à l'obscurité. Les peptides immunoréactifs apparaissent en bleu-violet. Après 3 rinçages en eau distillée, les membranes sont scannées puis conservées dans l'eau jusqu'à la régénération.

La régénération permet d'éliminer les anticorps et les conjugués fixés sur les peptides, ce qui permet ainsi de réaliser un nouveau test d'immunoréactivité vis-à-vis d'un autre anticorps. Les membranes subissent une série de lavages de 10 minutes chacun : 1 lavage en eau distillée, 6 lavages en DMF, 3 lavages en tampon de régénération A (urée 8 M, SDS (sodium dodecyl sulfate) 35 mM, β-mercaptoethanol 0,1 %), 3 lavages en tampon de régénération B (eau distillée / éthanol / acide acétique 4 : 5 : 1 ), puis 2 lavages en méthanol. Les membranes sont ensuite séchées à l'air libre avant d'être stockées à -20°C.

La caractérisation des épitopes par criblage de banques de peptides portés par des phages a été réalisée en utilisant le kit commercial PhD12 Phage Display Peptide Library Kit (Cat. No. E#81 10S) de New England Biolabs, en suivant les instructions fournies avec le kit, version 2.7 du protocole datant de novembre 2007.

Une troisième technologie de localisation d'épitope a été utilisée : la construction d'une librairie de fragments de protéine L-FABP recombinante, contre laquelle on a testé l'afficité des anticorps d'intérêt

- Résultats

Le Tableau 9 récapitule les épitopes reconnus par 5 anticorps L-FABP dont l'épitope a été analysé par les 3 techniques mentionnées. Tableau 9

aSéquence en acide aminé de la région de fixation de la L-FABP à l'anticorps testé. Les nombres entre parenthèses correspondent à la position de l'épitope sur la séquence en acides aminés de la LFABP, la numérotation commençant à la méthionine initiale.

Les épitopes reconnus par les anticorps 3A7B4 et 5A8H2 n'ont pas pu être déterminés par la technique du Spotscan, ce qui indique qu'ils ne sont pas linéaires. Le criblage des banques de peptides portés par des phages a permis de sélectionner un mimotope (séquence linéaire mimant un épitope) qui réagit avec l'anticorps 5A8H2. La séquence consensus de ce mimotope a été alignée afin de déterminer une séquence consensus qui est indiquée dans le tableau 9, qui représente la séquence minimale reconnue par l'anticorps. Il n'a pas été possible de retrouver cette séquence consensus dans la structure primaire (ou séquence peptidique) de la L-FABP. Ainsi, cette séquence consensus correspond à des résidus situés à différents endroits sur la structure primaire de la protéine mais qui partagent une proximité dans sa structure tridimensionnelle afin de former un épitope conformationnel. Par ailleurs l'utilisation de la librairie de fragments de protéine recombinante a permis de localiser l'épitope pour les anticorps 2C9G6, 3D6G1 et 8B10B8 dans les 56 premiers acides aminés de la protéine. L'anticorps 5A8H2 a besoin quant à lui de 9 acides aminés supplémentaires (AA 1 à 65) pour se fixer, site de liaison à l'opposé du site de liaison de l'anticorps 7D8A1 1 . L'anticorps 7D8A1 1 est le seul qui ait un épitope linéaire que l'on a pu caractériser en spotscan. Développement de tests ELISA sandwich contre la protéine LFABP sur l'automate Vidas®

La protéine LFABP a été dosée à l'aide des anticorps décrit dans l'exemple 1 et d'un immuno-essai de type sandwich en utilisant par exemple l'automate d'ELISA Vidas® (bioMérieux). Ce type de test peut aussi être réalisé en microplaque, de façon automatisée ou manuelle. Dans un premier temps, les différents anticorps disponibles ont été testés pour choisir un couple d'anticorps fonctionnel, c'est à dire, au moins un anticorps capable de capturer la protéine biomarqueur (anticorps de capture) et au moins un anticorps capable de révéler la molécule biomarqueur (anticorps de révélation).

Pour ce faire, le test ELISA a été construit en utilisant les réactifs du kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. No. 30315). Les réactifs ont été utilisés tels que décrits dans la notice correspondante (réf. 1 1728 D - FR - 2005/05), modifiée ainsi :

Les réactifs ont été utilisés tels que décrits dans la notice correspondante (réf. 1 1728D-FR-2005/05), avec les modifications suivantes :

- Les cônes ont été sensibilisés avec les 5 Ac de capture sélectionnés utilisés à une concentration de 10 g/ml.

- Le contenu du deuxième puit de la cartouche HBS Ag Ultra a été remplacé par 300 μΙ d'anticorps de révélation, couplé à la biotine, dilués à 1 g/ml dans le tampon du deuxième puit du kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampon avec sérum de chèvre et azoture de sodium à 1 g/l).

- L'échantillon de sérum (50μΙ) a été dilué directement dans le deuxième puit de la cartouche HBS Ag Ultra.

- La réaction ELISA a été réalisée à l'aide de l'automate Vidas® et du protocole HBS dont l'étape d'incubation de l'échantillon avec les anticorps de capture et de révélation avait été porté à 100 cycles.

- Les résultats ont été obtenus sous forme de valeurs brutes après soustraction du bruit de fond (lecture du substrat avant réaction). Une courbe étalon a été établie en dosant une gamme de concentration de la protéine biomarqueur recombinante. La courbe étalon a été tracée en reportant en abscisse la concentration de la protéine biomarqueur et en ordonnée le signal lu par Vidas® (RFV ou Relative Fluorescence Value). La concentration de la protéine biomarqueur présente dans le fluide corporel à doser (sang, sérum, plasma, selle) a été calculée en reportant la concentration correspondant au signal RFV lu par Vidas®.

Equivalence des différents tests ELISA développés

On a voulu évaluer la corrélation entre les différents immuno-essais sandwich développés. Les tests Vidas® ont été comparés entre eux et également comparés au test commercialisé par la société Hycult biotechnology pour doser la protéine L-FABP humaine (Cat. No. HK404), tel que décrit dans le brevet WO 2009019368.

Ces tests d'équivalence ont été réalisés grâce à des échantillons sériques de patients atteints de cancer colorectal (CCR) ou de sujet sain contrôles donneurs de sang (EFS), obtenus respectivement dans des services hospitaliers dans le cadre de 2 protocoles loi Huriet, et dans un établissement français de banque du sang (sujets sains).

Tableau 10

Doses de LFABP en ng/ml obtenus avec le test commercial Hycult

biotechnology et avec les différents tests Vidas® développés

Patient Hycult 2C9G6/ 5A8H2/ 2C9G6/ 3A7B4/ 3D6G1/ 8B10B8/

5A8H2 3D6G1 2E5G9 3D6G1 5A8H2 5A8H2

CBSE004 7,78 2,87 1 ,74 2,57

CBSE01 1 7,73 1 ,92 1 ,33 1 ,72

CBSE012 0, 1 1 2,31 1 ,83 2,07

CBSE018 1 ,35 0,75 1 , 19

CBSE019 6,65 4,48 3,41 3,98

CBSE023 8,21 4,60 4,92 4,07

CBSE025 16,38 7,88 7,45 6,87

CLSP043 2,89 1 ,94 2,49 1 ,70 2,47 2,29 0,22

CLSP047 1 ,94 1 ,39 0,00 1 ,22

CLSP078 2,56 13,01 8,27 1 1 ,33

CLSP090 3,77 1 , 18 0,98 1 ,04

CLSP164 6,54 4, 18 4,77 4,60 4,49 4, 14 1 ,54

CLSP165 7,86 1 ,27 1 ,68 1 ,80 2,32 1 ,82 1 ,64

CLSP167 8, 17 0,00 0,43 0,00 2,01 0,00 0,52

CLSP170 6,02 4,36 4,26 4,61 4, 16 3,60 2, 1 1

CLSP174 23,64 5,57 6,73 6,26 7,80 4,67 7,39

CLSP182 7,25 4,47 4,61 5,50 4,46 4,21 4,06

CLSP183 16,90 1 1 ,07 10, 12 9,79 9,32 7,08 15,94

CLSP185 19,63 5,35 7,01 6,36 8,41 4,44 5,32 CLSP186 7,06 4,59 4,42 5,35 4,44 3,39 2,72

CLSP189 5,34 0,00 0,25 0,00 1,16 0,00 0,69

CLSP194 13,09 5,38 5,65 6,71 5,40 5,17 5,52

CLSP198 8,16 2,20 3,10 3,14 4,24 2,88 1,94

CLSP207 6,02 4,60 4,71 5,58 4,67 4,01 1,91

GHBD020 2,24 5,46 3,08 4,81

GHBD021 1,84 1,58 1,41

GHBD029 2,75 3,42 2,74 3,05

N000533 3,46 0,59 1,18 0,96 1,51 1,21 1,85

N002301 7,78 5,54 5,19 4,88

N005702 2,74 1,04 0,79 0,91

N009944 3,49 1,41 2,06 2,66 1,90 1,98 1,69

N011147 2,86 0,92 1,52 1,82 1,41 1,50 1,16

N011968 2,06 1,26 1,56 1,64 1,62 1,65 0,97

N011984 5,29 0,87 1,32 1,21 1,80 1,45 1,19

N014106 2,66 0,45 0,91 0,66 1,25 0,89 0,74

N015402 4,41 1,34 0,90 1,18

N017234 4,04 1,90 2,49 3,33 2,41 2,61 2,48

N017269 2,89 1,46 2,13 2,38 2,00 1,97 2,01

N018544 2,42 0,99 1,47 2,17 1,49 1,67 1,11

N018552 2,28 0,00 0,15 0,00 0,52 0,00 0,47

N020501 11,37 2,61 2,90 2,34

N045730 2,29 0,19 0,69 0,63 0,89 0,61 0,74

N054582 1,84 1,45 1,65 1,28

N057046 5,59 0,82 0,00 0,70

N057054 21,05 2,69 3,25 2,40

N074598 2,53 1,53 1,13 1,36

N286613 4,11 2,38 2,54 3,30 2,56 3,00 3,83

N286656 7,95 1,77 2,26 2,73 3,24 2,60 4,12

N286680 4,58 2,75 2,86 3,30 2,85 3,39 1,45

N318050 3,93 1,56 2,16 2,18 2,05

N318341 4,46 1,72 2,38 2,86 2,12 2,40 1,86

N318384 1,63 0,60 1,19 1,29 1,12 1,18 0,71

N318421 3,86 0,69 1,15 1,45 1,47 1,14 1,56

N329630 6,90 1,24 1,69 2,34 2,28 1,82 4,04

N376488 4,73 0,64 1,20 1,30 1,57 1,14 1,57

N376912 2,55 0,27 0,84 0,94 1,15 0,80 1,07

N40776- 3,46 0,62 1,00 0,98 1,35 1,15 1,21

N418599 2,60 1,11 1,46 1,94 1,49 1,63 2,01

N46043- 4,18 0,67 1,34 1,18 1,72 1,03 0,90

N461993 2,92 0,00 0,16 0,01 0,69 0,00 0,73

N462187 3,96 0,79 1,32 1,18 1,79 1,43 1,23 N483535 6,42 0,00 0,30 0,00 1 ,28 0,00 0,83

N491678 7,73 3,86 3,38 3,43

N494801 4,38 2,96 2,64 2,65

N51 1498 2,24 0,46 0,81 0,71 1 ,03 0,78 0,51

N520547 7,74 3,03 3,74 2,70

N527039 2,36 0,31 0,79 0,41 1 ,03 0,70 0,60

N530485 6,80 0,00 0,32 0,00 1 ,40 0,00 0,66

N5931 16 2,38 0,99 1 ,41 1 ,95 1 ,42 1 ,49 1 ,46

N734641 3,04 8,30 7,31 7,23

N748022 2, 14 0 0, 17 0,00 0,46 0,00 0,47

N828353 8,21 4,52 4, 1 1 4,01

N831245 7,74 2,77 2,32 2,48

N862300 3,59 1 ,79 4,75 3,53 2,33

Les corrélations de ces différents tests par rapport au test 2C9G6 / 5A8H2 sont rapportées dans le tableau 1 1 ci-dessous :

5 Tableau 11

Données de corrélation entre les différents tests ELISA

Les différents tests développés en Vidas® ont une bonne corrélation îo entre eux et peuvent tous être utilisés pour doser la protéine LFABP.

Exemple 4 : Détection des patients atteints de cancers colorectaux et de patients contrôles par le dosage MRM de la prolidase

15 1 ) Patients et prélèvements

La collecte des échantillons de sang a été réalisée grâce à un réseau de 8 centres cliniques répartis dans toute la France, dans le cadre de 2 protocoles loi Huriet pour les patients atteints de cancer colorectal. Pour les patients contrôles, coloscopies négatives, une étude multicentrique impliquant une trentaine de gastroentérologues a été mise en place pour collecter le sang de patients Hemoccult™ positifs, de 50 à 75 ans, avant la réalisation de la coloscopie et de toute préparation colique. Les patients sains donneurs de sang ont été collectés dans l'établissement français du sang (EFS) de Lyon, et dans l'EFS de Grenoble. Les patients étiquetés « MedGe » sont des patients de 51 à 74 ans, qui ont été collectés en Pologne dans le cadre d'une consultation de médecine générale.

Tous les prélèvements ont été réalisés en conformité avec la législation en vigueur et les Bonnes Pratiques Cliniques, suivant un process de stockage et de suivi conformes aux bonnes pratiques de laboratoire, les patients cancer colorectal et les contrôles coloscopies négatives étant prélevés exactement dans les mêmes conditions.

Pour l'obtention de sérum, le prélèvement sanguin se fait sur tube sec. Après coagulation, le tube est centrifugé 10 min à 1000 g, le sérum est prélevé, aliquoté et conservé à -80°C. Les échantillons sont parfaitement documentés pour l'histoire clinique des patients.

Pour l'obtention de plasma, le prélèvement sanguin se fait sur tube EDTA. Après centrifugation 10 min à 1000 g, le plasma est prélevé, aliquoté et conservé à -80°C. Les échantillons sont parfaitement documentés pour l'histoire clinique des patients.

Au total, 331 patients ont été testés : 102 patients atteints de cancer colorectal invasif, de stades TNM I à IV, 1 1 patients atteints de Tis T0 , 3 patients atteints d'adénomes colorectaux et 215 patients contrôles :

70 patients contrôle avec une coloscopie totalement normale (ColoNeg),

38 donneurs sains de l'EFS de Grenoble (EFS Gre)

37 donneurs sains de l'EFS de Lyon (EFS Ly)

70 contrôles collectés en consultation de médecine générale

(MedGe)

2) Dosages de la prolidase dans les échantillons cliniques

La protéine prolidase a été dosée avec la technologie MRM, comme décrit dans l'exemple 1 . En pratique seule la transition 400.2/ 686.3 du peptide de SEQ ID NO : 1 a été suivie et quantifiée, ainsi que la transition lourde correspondante. Les résultats sont exprimés en Unité Arbitraire, en réalisant le ratio de l'aire sous la courbe du pic chromatographique de la transition naturelle divisée par l'aire sous la courbe du pic chromatographique de la transition lourde : aire léger / aire lourd.

Tableau 12

Dosages sériques de la prolidase chez les patients cancer colorectal (CCR) et les contrôles (ColoNeq, EFS Lv, EFS Gre, MedGe) prolidase

Patient Age Sexe Classe Stade Dose Ratio

Unité Arbitraire

CBSE011 57 Homme Tis T0 0,113

CLSP234 57 Homme Tis T0 0,105

CLSP286 50 Femme Tis T0 0,109

CLSP300 60 Homme Tis T0 0,123

CLSP315 59 Homme Tis T0 0,096

CLSP367 57 Homme Tis T0 0,109

CLSP724 58 Homme Tis T0 0,122

CNSE003 59 Homme Tis T0 0,115

CNSE004 56 Homme Tis T0 0,132

GHBD015 58 Femme Tis T0 0,135

GHBD036 57 Femme Tis T0 0,148

CBSE001 56 Femme CCR I 0,098

CBSE016 74 Homme CCR I 0,091

CLSP047 76 Femme CCR I 0,10759

CLSP162 63 Femme CCR I 0,163

CLSP196 55 Homme CCR I 0,103

CLSP224 84 Femme CCR I 0,080

CLSP235 71 Femme CCR I 0,079

CLSP263 51 Homme CCR I 0,123

CLSP340 64 Femme CCR I 0,143

CLSP344 59 Femme CCR I 0,105

CLSP364 58 Femme CCR I 0,093

CLSP376 58 Homme CCR I 0,141

GHBD003 54 Homme CCR I 0,111

GHBD094 65 Homme CCR I 0,144

CLSP075 59 Homme CCR il 0,168

CLSP076 56 Homme CCR II 0,101

CLSP080 56 Femme CCR M 0,133 CLSP096 51 Femme CCR II 0,110

CLSP110 52 Femme CCR II 0,113

CLSP117 55 Femme CCR II 0,097

CLSP130 61 Homme CCR II 0,109

CLSP133 60 Homme CCR H 0,077

CLSP143 61 Homme CCR II 0,065

CLSP147 55 Femme CCR H 0,084

CLSP154 50 Femme CCR H 0,089

CLSP155 63 Homme CCR H 0,065

CLSP157 58 Femme CCR H 0,097

CLSP165 58 Femme CCR il 0,114

CLSP170 60 Femme CCR H 0,070

CLSP173 61 Homme CCR II 0,093

CLSP177 60 Homme CCR H 0,057

CLSP178 60 Homme CCR H 0,109

CLSP179 61 Homme CCR H 0,095

CLSP186 63 Femme CCR II 0,131

CLSP194 60 Homme CCR H 0,093

CLSP201 55 Homme CCR H 0,086

CLSP207 55 Homme CCR II 0,077

CLSP209 64 Homme CCR H 0,118

CLSP220 53 Homme CCR il 0,090

CLSP222 58 Homme CCR H 0,083

CLSP253 61 Femme CCR II 0,10650 \

CLSP256 86 Femme CCR 0,088

CLSP280 62 Homme CCR H 0,103

CLSP296 56 Homme CCR H 0,169

CLSP310 81 Homme CCR II 0,122

CLSP327 64 Homme CCR H 0,063

CLSP333 60 Homme CCR H 0,116

CLSP341 53 Homme CCR II 0,079

CLSP346 66 Homme CCR H 0,105

CLSP347 49 Femme CCR il 0,132

CLSP380 60 Homme CCR H 0,083

CNSE002 62 Femme CCR II 0,087

GHBD021 71 Femme CCR H 0,117

GHBD043 71 Homme CCR H 0,084

GHBD064 83 Femme CCR H 0,099

GHBD066 82 Femme CCR H 0,138 GHBD075 58 Homme CCR II 0,104

GHBD087 62 Femme CCR II 0,123

GHBD090 59 Homme CCR II 0,191

GHBD096 62 Femme CCR II 0,110

GHBD100 75 Homme CCR H 0,067

GHBD103 68 Homme CCR II 0,192

CBSE023 76 Homme CCR m 0,141

CLSP044 80 Homme CCR m 0,113

CLSP074 79 Femme CCR m 0,058

CLSP078 72 Femme CCR m 0,078

CLSP081 78 Femme CCR m 0,059

CLSP098 61 Homme CCR m 0,057

CLSP174 77 Homme CCR III 0,086

CLSP227 52 Homme CCR m 0,093

CLSP233 59 Homme CCR m 0,078

CLSP255 42 Femme CCR m 0,078

CLSP289 52 Homme CCR m 0,129

CLSP320 70 Homme CCR m 0,104

CLSP324 53 Homme CCR m 0,061

CLSP383 78 Homme CCR III 0,131

CLSP384 37 Homme CCR m 0,144

CNSE001 78 Homme CCR m 0,131

CNSE016 65 Homme CCR m 0,089

CNSE017 77 Femme CCR III 0,093

CSEM015 65 Femme CCR m 0,147

CSEM029 63 Femme CCR m 0,098

GHBD004 58 Homme CCR m 0,092

GHBD017 70 Homme CCR m 0,078

GHBD034 48 Femme CCR m 0,139

GHBD042 77 Femme CCR m 0,140

GHBD045 73 Homme CCR III 0,032

GHBD089 54 Femme CCR m 0,093

GHBD105 79 Homme CCR m 0,118

CBSE012 37 Femme CCR IV 0,095

CBSE026 72 Homme CCR IV 0,073

CLSP156 59 Homme CCR IV 0,066

CLSP159 69 Femme CCR IV 0,170

CLSP167 81 Homme CCR IV 0,089

CLSP260 57 Femme CCR IV 0,120

P04002014 MG 62 Homme Témoin MedGe 0,137

P04002015 HT 61 Homme Témoin MedGe 0,143

P04002017JS 60 Homme Témoin MedGe 0,150

P04002018 PB 59 Homme Témoin MedGe 0,158

P04002019 PK 52 Homme Témoin MedGe 0,144

P04002020 KA 54 Homme Témoin MedGe 0,100

P04002021 JL 63 Homme Témoin MedGe 0,232

P04002022 MK 69 Homme Témoin MedGe 0,158

P04002023 CM 67 Homme Témoin MedGe 0,117

P04002024 TM 58 Homme Témoin MedGe 0,242

P04002025 PA 53 Homme Témoin MedGe 0,214

P04002026 MR 59 Homme Témoin MedGe 0,121

P04002027 HF 57 Homme Témoin MedGe 0,100

P04002030 Z,J 60 Homme Témoin MedGe 0,149

P04002031 PW 56 Homme Témoin MedGe 0,115

P04002032 WR 51 Homme Témoin MedGe 0,141

P04002033 WZ 68 Homme Témoin MedGe 0,171

P04002034 SJ 59 Homme Témoin MedGe 0,132

P04002035 KF 70 Homme Témoin MedGe 0,115

P04002036 PZ 52 Homme Témoin MedGe 0,203

P04002037 GB 62 Homme Témoin MedGe 0,126

P04002038 WS 74 Homme Témoin MedGe 0,160

P04002039 KK 54 Homme Témoin MedGe 0,184

P04002040 RT 59 Homme Témoin MedGe 0,171

P04002041 JJ 62 Homme Témoin MedGe 0,118

P04002042 WZ 63 Homme Témoin MedGe 0,128

P04003011 BH 61 Homme Témoin MedGe 0,146

P04003012 BJ 59 Homme Témoin MedGe 0,152

P04003013JE 52 Homme Témoin MedGe 0,246

P04003014GT 51 Homme Témoin MedGe 0,146

P04003015SM 64 Homme Témoin MedGe 0,103

P04003016CB 64 Homme Témoin MedGe 0,144

P04003018SS 62 Homme Témoin MedGe 0,162

P04003019 RH 57 Homme Témoin MedGe 0,152

P04003020 TJ 56 Homme Témoin MedGe 0,140

P04003021 RW 51 Homme Témoin MedGe 0,124

P04003022 ZZ 60 Homme Témoin MedGe 0,171

P04003023 PA 63 Homme Témoin MedGe 0,152

P04003024 LS 52 Homme Témoin MedGe 0,157 P04003026 PS 69 Homme Témoin MedGe 0,165

P04003027 FZ 62 Homme Témoin MedGe 0,200

P04003028 WT 52 Homme Témoin MedGe 0,124

P04003029 BZ 64 Homme Témoin MedGe 0,149

P04003030 MR 53 Homme Témoin MedGe 0,169

P04003031 TM 52 Homme Témoin MedGe 0,111

P04003032 BW 55 Homme Témoin MedGe 0,117

P04003033 JR 52 Homme Témoin MedGe 0,158

P04003034 RJ 66 Homme Témoin MedGe 0,136

P04003036 CZ 61 Homme Témoin MedGe 0,147

P04003037 SZ 52 Homme Témoin MedGe 0,153

P04003038 BT 60 Homme Témoin MedGe 0,128

P04003039 CJ 62 Homme Témoin MedGe 0,168

P04003040 DF 59 Homme Témoin MedGe 0,213

P04003041 MN 56 Homme Témoin MedGe 0,130

P04003042 SA 67 Homme Témoin MedGe 0,119

P04003043 KJ 61 Homme Témoin MedGe 0,124

P04003044 LA 53 Homme Témoin MedGe 0,136

P04003045 BM 52 Homme Témoin MedGe 0,144

P04003046 TS 55 Homme Témoin MedGe 0,146

P04003047 NJ 59 Homme Témoin MedGe 0,170

P04003048 KZ 58 Homme Témoin MedGe 0,203

P04003049 CK 63 Homme Témoin MedGe 0,157

P04003051 DJ ND Homme Témoin MedGe 0,162

P04003052 DJ ND Homme Témoin MedGe 0,246

P04003053 SZ ND Homme Témoin MedGe 0,156

P04006005 SH 61 Homme Témoin MedGe 0,153

P04006006 SM 71 Homme Témoin MedGe 0,141

P04006007 K-J 70 Homme Témoin MedGe 0,136

N0037612 54 Homme Témoin EFS Ly 0,126

N0037639 36 Femme Témoin EFS Ly 0,093

N0037751 54 Homme Témoin EFS Ly 0,184

N011968 50 Homme Témoin EFS Ly 0,180

N0247243 42 Homme Témoin EFS Ly 0,155

N0247366 32 Femme Témoin EFS Ly 0,152

N027871X 59 Femme Témoin EFS Ly 0,131

N0352209 65 Femme Témoin EFS Ly 0,136

N0352217 54 Femme Témoin EFS Ly 0,127

N0352305 59 Homme Témoin EFS Ly 0,176

La prolidase est diminuée chez les patients atteints de CCR invasif et les patients atteints de carcinome in situ Tis T0 par rapport aux patients contrôles avec la technique MRM utilisée. Dans cet exemple avec le test MRM utilisé, on fixe le seuil pour la détection des cancers colorectaux invasifs et des Tis à 0,10696 (dose strictement inférieure à celle du deuxième contrôle ColoNeg de la cohorte pour le ratio échantillon/standard de la quantification du pic de la transition 400,2/ 686,3 du peptide de SEQ ID NO : 1 . 59 patients CCR ou Tis sur 1 13 sont en dessous du seuil et sont détectés comme cancer colorectal, alors que seul 1 contrôle ColoNeg, 3 contrôles MedGe et 2 contrôles EFS Ly sont en dessous du seuil. Soit 52,2% de sensibilité (42,61 % à 61 ,70%) pour 97% de spécificité (94,03% à 98,97%).

Tableau 13

Dosages sériques de la prolidase chez les patients adénomes colorectaux

En gardant le seuil fixé ci-dessus à 0,10696, la prolidase est diminuée chez un patient porteur d'adénome colorectal sur 3.

Exemple 5 : Utilisation des dosages sériques des marqueurs tumoraux en combinaison

1 ) Sélection des protéines et dosages

La Demanderesse a montré dans l'exemple 4 que des doses anormalement diminuées de de peptides traceurs de la prolidase pouvaient être observées dans la circulation sanguine de certains patients atteints d'un cancer colorectal. D'autre part, la Demanderesse a montré dans les demandes de brevet WO2009024691 , WO2009019365, WO2009019368, WO2009019369, WO2009019366, WO2009019370, WO2009019367, WO2010004214, WO20101 12777 que des doses anormalement élevées ou anormalement diminuées de d'autres marqueurs tumoraux comme Ezrine, L- FABP, Apo A1 , Apo A2, Beta2 Microglobuline, ACE, CA19-9, Galectine-3, Protéasome 20S, Protéine Disulfide isomérase (PDI) et ProDefensine A6 pouvaient être observées dans la circulation sanguine de certains patients atteints d'un cancer colorectal. Les procédés de dosage de ces marqueurs tumoraux ont été décrits dans les demandes de brevets suscités.

Les protéines L-FABP, Apo A1 , Apo A2, Beta 2 Microglobuline, HSP60, ACE, CA19-9, Galectine-3, Ezrine, Protéasome 20S (prosomes), Timpl et M2PK ont été dosées comme décrit dans l'exemple 3.

Les dosages peuvent également être réalisés en utilisant la technologie de dosage en spectrométrie de masse de type MRM, comme décrite dans les exemples 1 , 2 et 4. En particulier la prolidase (PEPD) a été dosée comme décrit dans les exemples 1 et 4, et la protéine Alpha-Enolase, la protéine 78 kDa glucose-regulated protein (BIP, GRP78), la protéine Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (G3PDH, GAPDH), la protéine Heat shock cognate 71 kDa protein (HSC70), la protéine Disulfite isomérase (PDI), la protéine Peroxiredoxin-5, mitochondriale (Peroxy-5) ont été dosées dans les sérums des patients et contrôles comme décrit dans l'exemple 2.

2) Patients et prélèvements

Les patients testés pour la combinaison de marqueurs sont les 1 13 patients atteints de cancer colorectal invasif (CCR) ou de Tis et les 70 contrôles coloscopie négative (ColoNeg) qui ont été décrits dans l'exemple 4. Les prélèvements testés sont des sérums, sauf pour les protéines Timpl et M2PK pour lesquelles ce sont les plasmas des mêmes patients, collectés au même moment suivant la procédure décrite dans l'exemple 4. 3) Méthodologie de combinaison et scores

De façon surprenante, l'augmentation ou la diminution de la dose sanguine de deux marqueurs donnés n'est pas systématiquement observée chez les mêmes patients. De ce fait, la combinaison de plusieurs marqueurs tumoraux permet d'augmenter le nombre de patients identifiés comme ayant un cancer colorectal. C'est ainsi qu'un patient A peut présenter une augmentation ou une diminution d'un ou plusieurs marqueurs tumoraux (groupe X), les dits marqueurs du groupe X pouvant être normaux chez un patient B ; chez ce même patient B un ou plusieurs autres marqueurs tumoraux (groupe Y) peuvent être élevés ou diminués, les dits marqueurs du groupe Y pouvant être normaux chez le patient A.

Les différents marqueurs tumoraux dosés par la Demanderesse peuvent ainsi être combinés au moyen de divers algorithmes mathématiques bien connus de l'homme du métier. A titre d'illustration et sans que cet exemple ait un caractère exhaustif, il a été mis en œuvre le procédé suivant :

- Une valeur seuil a été fixée pour chaque marqueur tumoral, en fonction d'une spécificité minimale souhaitée. - Lorsque la dose sanguine du marqueur tumoral était augmentée en cas de cancer colorectal, la dose sanguine obtenue pour un patient donné a été divisée par sa valeur seuil. Lorsque la dose sanguine du marqueur tumoral était diminuée en cas de cancer colorectal, la dose sanguine obtenue pour un patient donné a été inversée puis multipliée par sa valeur seuil.

- Lorsque le ratio, dose sanguine divisée par valeur seuil, était supérieur à 1 , le ratio a été multiplié par un coefficient, par exemple 10. La valeur ainsi obtenue a été baptisée « score » pour le patient étudié du marqueur tumoral considéré. Le score est donc systématiquement positif, que le marqueur tumoral soit augmenté ou diminué dans la circulation sanguine des patients atteints de cancer colorectal.

- Les scores obtenus pour différents marqueurs tumoraux ont été ajoutés en les pondérant d'un facteur propre à chaque marqueur. Dans le cas de l'exemple ci-dessous tous les facteurs de pondération ont été fixés à 1 .

- La somme des scores a été divisée par le nombre total de scores sommés et la valeur ainsi obtenue a été baptisée « score total ».

- Le patient est diagnostiqué comme ayant un cancer colorectal lorsque son score total est augmenté par rapport à un score seuil, fixé à nouveau en fonction de la spécificité souhaitée.

Avec ce procédé, il suffit donc pour un patient donné qu'un seul marqueur ait un score positif pour que le score total en combinaison soit positif.

Les scores totaux pour une sélection de différentes combinaisons à 2 marqueurs comprenant la prolidase sont donnés dans le Tableau 16. Les scores totaux pour une sélection de différentes combinaisons à 3, 4, 5 et 8 marqueurs comprenant la prolidase sont donnés dans le Tableau 15. Les scores totaux pour des exemples de combinaisons à 3 et à 4 marqueurs ne comprenant pas la prolidase sont donnés dans le tableau 16.

La combinaison des marqueurs a été évaluée sur le même groupe de 1 13 patients atteints de cancer colorectal invasif ou de Tis, et de 70 contrôles témoins avec une coloscopie totalement négative.

Le tableau 14 donne les résultats pour la prolidase en dose (dose du marqueur diminuée chez certains cancers colorectaux CCR invasifs et certains Tis) et en score (score augmenté, >1 , chez certains cancers colorectaux CCR invasifs et certains Tis).

Tableau 14

prolidase Dose Ratio

Patient Classe Stade Unité Arbitraire prolidase Score

Seuil 0,10696 1

CBSE011 Tis TO 0,113 0,95

CLSP234 Tis TO 0,105 16,2

CLSP286 Tis TO 0,109 0,98

CLSP300 Tis TO 0,123 0,87

CLSP315 Tis TO 0,096 17,8

CLSP367 Tis TO 0,109 0,98

CLSP724 Tis TO 0,122 0,88

CNSE003 Tis TO 0,115 0,93

CNSE004 Tis TO 0,132 0,81

GHBD015 Tis TO 0,135 0,79

GHBD036 Tis TO 0,148 0,72

CBSE001 CCR I 0,098 17,5

CBSE016 CCR I 0,091 18,8

CLSP047 CCR I 0,108 0,99

CLSP162 CCR I 0,163 0,65

CLSP196 CCR I 0,103 16,7

CLSP224 CCR I 0,080 21,5

CLSP235 CCR I 0,079 21,6

CLSP263 CCR I 0,123 0,87

CLSP340 CCR I 0,143 0,75

CLSP344 CCR I 0,105 16,4

CLSP364 CCR I 0,093 18,4

CLSP376 CCR I 0,141 0,76

GHBD003 CCR I 0,111 0,97

GHBD094 CCR I 0,144 0,74

CLSP075 CCR M 0,168 0,64

CLSP076 CCR M 0,101 16,9

CLSP080 CCR M 0,133 0,80

CLSP096 CCR M 0,110 0,97

CLSP110 CCR M 0,113 0,94

CLSP117 CCR M 0,097 17,6

CLSP130 CCR M 0,109 0,98

CLSP133 CCR M 0,077 22,2

CLSP143 CCR M 0,065 26,2

CLSP147 CCR M 0,084 20,5

CLSP154 CCR M 0,089 19,2

CLSP155 CCR M 0,065 26,2

CLSP157 CCR M 0,097 17,7 CLSP165 CCR M 0,114 0,93

CLSP170 CCR M 0,070 24,4

CLSP173 CCR M 0,093 18,4

CLSP177 CCR II 0,057 30,3

CLSP178 CCR M 0,109 0,98

CLSP179 CCR M 0,095 18,0

CLSP186 CCR M 0,131 0,81

CLSP194 CCR II 0,093 18,3

CLSP201 CCR M 0,086 20,0

CLSP207 CCR M 0,077 22,3

CLSP209 CCR M 0,118 0,90

CLSP220 CCR II 0,090 19,0

CLSP222 CCR M 0,083 20,7

CLSP253 CCR M 0,106 16,1

CLSP256 CCR M 0,088 19,4

CLSP280 CCR II 0,103 16,5

CLSP296 CCR M 0,169 0,63

CLSP310 CCR M 0,122 0,88

CLSP327 CCR M 0,063 27,0

CLSP333 CCR M 0,116 0,92

CLSP341 CCR M 0,079 21,6

CLSP346 CCR M 0,105 16,3

CLSP347 CCR M 0,132 0,81

CLSP380 CCR M 0,083 20,7

CNSE002 CCR M 0,087 19,7

GHBD021 CCR M 0,117 0,92

GHBD043 CCR M 0,084 20,4

GHBD064 CCR M 0,099 17,2

GHBD066 CCR M 0,138 0,78

GHBD075 CCR M 0,104 16,4

GHBD087 CCR M 0,123 0,87

GHBD090 CCR M 0,191 0,56

GHBD096 CCR M 0,110 0,98

GHBD100 CCR M 0,067 25,4

GHBD103 CCR M 0,192 0,56

CBSE023 CCR III 0,141 0,76

CLSP044 CCR III 0,113 0,95

CLSP074 CCR III 0,058 29,4

CLSP078 CCR III 0,078 21,8

CLSP081 CCR III 0,059 28,8

CLSP098 CCR III 0,057 30,0

CLSP174 CCR III 0,086 19,8

CLSP227 CCR III 0,093 18,5

CLSP233 CCR III 0,078 21,9 CLSP255 CCR III 0,078 22,0

CLSP289 CCR III 0,129 0,83

CLSP320 CCR III 0,104 16,4

CLSP324 CCR III 0,061 28,2

CLSP383 CCR III 0,131 0,82

CLSP384 CCR III 0,144 0,74

CNSE001 CCR III 0,131 0,82

CNSE016 CCR III 0,089 19,2

CNSE017 CCR III 0,093 18,4

CSEM015 CCR III 0,147 0,73

CSEM029 CCR III 0,098 17,5

GHBD004 CCR III 0,092 18,6

GHBD017 CCR III 0,078 22,0

GHBD034 CCR III 0,139 0,77

GHBD042 CCR III 0,140 0,77

GHBD045 CCR III 0,032 54,3

GHBD089 CCR III 0,093 18,4

GHBD105 CCR III 0,118 0,90

CBSE012 CCR IV 0,095 18,0

CBSE026 CCR IV 0,073 23,3

CLSP156 CCR IV 0,066 26,1

CLSP159 CCR IV 0,170 0,63

CLSP167 CCR IV 0,089 19,3

CLSP260 CCR IV 0,120 0,89

CLSP334 CCR IV 0,189 0,57

CLSP357 CCR IV 0,125 0,85

CLSP365 CCR IV 0,176 0,61

CLSP366 CCR IV 0,157 0,68

GHBD022 CCR IV 0,145 0,74

GHBD071 CCR IV 0,149 0,72

CLSP197 CCR NA 0,128 0,83

HGED005 Témoin ColoNeg 0,112 0,96

PROMIS 21-01-005 Témoin ColoNeg 0,124 0,86

PROMIS 21-01-006 Témoin ColoNeg 0,177 0,60

PROMIS 21-01-009 Témoin ColoNeg 0,149 0,72

PROMIS 21-01-011 Témoin ColoNeg 0,209 0,51

PROMIS 21-01-012 Témoin ColoNeg 0,129 0,83

PROMIS 21-02-001 Témoin ColoNeg 0,159 0,67

PROMIS 21-02-003 Témoin ColoNeg 0,188 0,57

PROMIS 21-02-004 Témoin ColoNeg 0,294 0,36

PROMIS 21-02-006 Témoin ColoNeg 0,130 0,82

PROMIS 21-02-008 Témoin ColoNeg 0,197 0,54

PROMIS 21-02-011 Témoin ColoNeg 0,120 0,89

PROMIS 21-02-014 Témoin ColoNeg 0,123 0,87 PROMIS 21-02-016 Témoin ColoNeg 0,191 0,56

PROMIS 21-03-004 Témoin ColoNeg 0,136 0,79

PROMIS 21-03-013 Témoin ColoNeg 0,279 0,38

PROMIS 21-03-015 Témoin ColoNeg 0,194 0,55

PROMIS 21-04-002 Témoin ColoNeg 0,117 0,92

PROMIS 21-04-006 Témoin ColoNeg 0,111 0,96

PROMIS 21-04-007 Témoin ColoNeg 0,171 0,62

PROMIS 21-04-008 Témoin ColoNeg 0,237 0,45

PROMIS 21-04-009 Témoin ColoNeg 0,203 0,53

PROMIS 21-04-013 Témoin ColoNeg 0,121 0,88

PROMIS 21-07-004 Témoin ColoNeg 0,149 0,72

PROMIS 21-12-001 Témoin ColoNeg 0,159 0,67

PROMIS 21-12-007 Témoin ColoNeg 0,10716 0,998

PROMIS 21-12-011 Témoin ColoNeg 0,169 0,63

PROMIS 21-22-001 Témoin ColoNeg 0,195 0,55

PROMIS 21-22-006 Témoin ColoNeg 0,155 0,69

PROMIS 21-22-008 Témoin ColoNeg 0,129 0,83

PROMIS 37-03-004 Témoin ColoNeg 0,110 0,98

PROMIS 37-04-001 Témoin ColoNeg 0,252 0,42

PROMIS 37-04-005 Témoin ColoNeg 0,112 0,96

PROMIS 37-05-008 Témoin ColoNeg 0,160 0,67

PROMIS 37-06-001 Témoin ColoNeg 0,144 0,74

PROMIS 37-09-002 Témoin ColoNeg 0,167 0,64

PROMIS 37-11-001 Témoin ColoNeg 0,10696 1,000

PROMIS 37-11-002 Témoin ColoNeg 0,170 0,63

PROMIS 37-11-011 Témoin ColoNeg 0,121 0,88

PROMIS 37-11-016 Témoin ColoNeg 0,153 0,70

PROMIS 37-12-002 Témoin ColoNeg 0,222 0,48

PROMIS 37-13-003 Témoin ColoNeg 0,174 0,62

PROMIS 37-13-006 Témoin ColoNeg 0,160 0,67

PROMIS 37-13-008 Témoin ColoNeg 0,203 0,53

PROMIS 37-14-009 Témoin ColoNeg 0,132 0,81

PROMIS 37-14-018 Témoin ColoNeg 0,087 19,7

PROMIS 37-14-021 Témoin ColoNeg 0,129 0,83

PROMIS 37-15-002 Témoin ColoNeg 0,165 0,65

PROMIS 37-15-006 Témoin ColoNeg 0,239 0,45

PROMIS 37-16-001 Témoin ColoNeg 0,256 0,42

PROMIS 37-17-001 Témoin ColoNeg 0,184 0,58

PROMIS 37-17-003 Témoin ColoNeg 0,140 0,76

PROMIS 37-17-004 Témoin ColoNeg 0,139 0,77

PROMIS 37-18-001 Témoin ColoNeg 0,134 0,80

PROMIS 37-18-003 Témoin ColoNeg 0,158 0,68

PROMIS 37-18-004 Témoin ColoNeg 0,188 0,57

PROMIS 37-18-005 Témoin ColoNeg 0,111 0,97 PROMIS 37-18-024 Témoin ColoNeg 0, 128 0,84

PROMIS 37-19-006 Témoin ColoNeg 0, 122 0,88

PROMIS 37-19-007 Témoin ColoNeg 0, 136 0,79

PROMIS 37-20-004 Témoin ColoNeg 0, 179 0,60

PROMIS 71-02-003 Témoin ColoNeg 0, 159 0,67

PROMIS 71-04-003 Témoin ColoNeg 0, 161 0,67

PROMIS 71-09-007 Témoin ColoNeg 0, 175 0,61

PROMIS 71-10-001 Témoin ColoNeg 0, 171 0,63

PROMIS 71-10-007 Témoin ColoNeg 0, 162 0,66

PROMIS 71-1 1-001 Témoin ColoNeg 0, 191 0,56

PROMIS 71-1 1-006 Témoin ColoNeg 0, 155 0,69

PROMIS 71-1 1-008 Témoin ColoNeg 0, 181 0,59

PROMIS 71-1 1-009 Témoin ColoNeg 0, 140 0,76

4) Résultats des combinaisons de la prolidase avec un autre marqueur chez les patients et les contrôles

En suivant le même principe de score, on peut combiner les résultats obtenus pour la prolidase avec les résultats obtenus avec d'autres marqueurs, 2 à 2. Pour un patient, si un marqueur est retenu comme étant au-dessus d'un seuil fixé à l'avance en fonction de la spécificité souhaité, le score final sera considéré comme significativement positif. L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Galectine 3 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^a » augmentés chez 65 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Gal3 était augmenté chez 13 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et LFABP permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^b » augmentés chez 77 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage LFABP était augmenté chez 42 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^e » augmentés chez 71 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage ACE était augmenté chez 29 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et HSP60 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^d » augmentés chez 68 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage HSP60 était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Alpha-Enolase permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^e » augmentés chez 71 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Alpha-Enolase était augmenté chez 17 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et BIP permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^f » augmentés chez 67 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul score du marqueur BIP était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et G3PDH permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^g » augmentés chez 76 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage G3PDH était augmenté chez 31 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et HSP71 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^h » augmentés chez 67 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage HSP71 était augmenté chez 13 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Peroxi-5 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2' » augmentés chez 71 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Peroxi-5 était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et CA19-9 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^j » augmentés chez 71 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage CA19-9 était augmenté chez 23 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et ApoA1 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^k » augmentés chez 64 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul score du marqueur ApoA1 était augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et ApoA2 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2¹ » augmentés chez 65 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul score du marqueur ApoA2 était augmenté chez 10 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Prosomes permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^m » augmentés chez 68 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Prosomes était augmenté chez 14 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et M2PK permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2ⁿ » augmentés chez 72 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage M2PK était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Timpl permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2° » augmentés chez 67 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Timpl était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Ezrine permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^P » augmentés chez 65 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Ezrine était augmenté chez 17 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et PDI permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^q » augmentés chez 72 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul score de PDI était augmenté chez 29 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase et Beta2- microglobuline permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 2^r » augmentés chez 69 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, et le seul dosage Beta2-microglobuline était augmenté chez 29 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

Tis: Patients atteints d'une tumeur in situ (carcinome intra-muqueux T0), CCR = patients atteints d'un cancer colorectal invasif de stade TNM I à IV (Adénocarcinome), ColoNeg- = sujets contrôles, avec une coloscopie totalement normale, et un test FOBT positif Score 2^a: Association Gal3, prolidase

Score 2^b: association LFABP, prolidase

Score 2^e: association ACE, prolidase

Score 2^d: association HSP60, -prolidase

Score 2^e: association Alpha-Enolase, prolidase

Score 2 : association BIP, prolidase

Score 2⁹: association G3PDH, prolidase

Score 2^h: association HSP71 , prolidase

Score 2': association Peroxy-5, prolidase

Score 2^j: association CA19-9, prolidase

Score 2^k : association ApoA1 , prolidase

Score 2' : association ApoA2, prolidase

Score 2^m : association Prosomes, prolidase

Score 2ⁿ : association M2PK, prolidase

Score 2° : association Timpl , prolidase

Score 2^P : association Ezrine, prolidase

Score 2^q : association PDI, prolidase

Score 2^r : association Beta2-microglobuline, prolidase

5) Résultats des combinaisons de la prolidase avec plusieurs marqueurs chez les patients et les contrôles

La Demanderesse a également associé les performances de la prolidase avec plusieurs marqueurs. La prolidase est particulièrement utile pour la détection du cancer colorectal, car elle permet de compléter la détection effectuée par les autres marqueurs du cancer colorectal. Voir Tableaux 15 et 16.

A titre d'exemple on peut citer les associations ci-dessous :

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 3^S » augmentés chez 83 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal, pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 42 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil, et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, CA19-9 et

ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 4* » augmentés chez 85 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage CA19-9 était augmenté chez 23 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, M2PK et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 4^U » augmentés chez 86 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage M2PK était augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, Timpl et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 4^V » augmentés chez 87 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage Timpl était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, M2PK, Timpl et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 5^wa » augmentés chez 88 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage M2PK était augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage Timpl était augmenté chez 22 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, ACE, PDI et CA19-9 permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 5^wb » augmentés chez 93 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul score de PDI était augmenté chez 29 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, et le seul dosage CA19-9 était augmenté chez 23 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

L'association des marqueurs tumoraux prolidase, LFABP, M2PK, Timpl , Villine, CA19-9, G3PDH et ACE permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 8^X » augmentés chez 94 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Alors que le seul score de prolidase était augmenté chez 59 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour un patient Coloscopie Négative avec un score au-dessus du seuil, le seul dosage LFABP était augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage M2PK était augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage Timpl était augmenté chez 4 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage Villine était augmenté chez 5 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage G3PDH était augmenté chez 24 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage CA19-9 était augmenté chez 21 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil et le seul dosage ACE était augmenté chez 25 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil.

6) La prolidase peut à elle seule remplacer la combinaison de plusieurs marqueurs

La Demanderesse a également montré que par ses performances la prolidase remplace avantageusement à elle seule une combinaison de plusieurs marqueurs. Par exemple, l'association de la LFABP, de l'ACE et du marqueur M2PK permet d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 3 sans prolidase^y » augmentés chez 58 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 2 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil, avec le seul dosage ACE augmenté chez 25 patients adénocarcinome colorectal sans patient Coloscopie Négative au- dessus du seuil, le seul dosage M2PK augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, et seul dosage LFABP augmenté chez 39 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Sur ce même groupe de patients, à elle seule la prolidase permet de détecter 59 patients pour un Coloscopie Négative en-dessous du seuil, comme décrit dans l'exemple 1 .

Avec un autre exemple, l'association de l'ACE, du CA19-9, du marqueur Timpl et du marqueur M2PK permet ainsi d'obtenir pour le même groupe de 183 patients des scores totaux « 4 sans prolidase² » augmentés chez 54 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 3 patients Coloscopie Négative au-dessus du seuil, avec le seul dosage ACE augmenté chez 25 patients adénocarcinome colorectal sans patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage M2PK augmenté chez 18 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, le seul dosage Timpl augmenté chez 22 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil, et le seul dosage CA19-9 augmenté chez 23 patients atteints d'un adénocarcinome colorectal invasif ou d'un Tis pour 1 patient Coloscopie Négative au-dessus du seuil. Sur ce même groupe de patients, à elle seule la prolidase permet de détecter 59 patients pour un Coloscopie Négative en-dessous du seuil, comme décrit dans l'exemple 1 .

Cet exemple peut être répété avec différents marqueurs connus qui permettent en combinaison de détecter environ 50% des cancers colorectaux.

Tableau 16

Score Score Score Score Score Score Score Score 3 sans Score 3 sans

Patient Classe Stade

3s 4t 4u 4v 5wa 5wb 8x prolidase y prolidase z

CBSE01 1 Tis T0 0,55 0,44 8,99 5,52 1 1 ,2 0,51 6,78 1 1 ,7 13,7

CLSP234 Tis T0 1 1 ,8 8,56 8,61 8,75 7,05 7,03 4,51 6,07 0,36

CLSP286 Tis T0 0,36 0,31 0,39 0,40 0,42 3,65 4,73 0, 19 0,30

CLSP300 Tis T0 0,67 0,51 0,63 0,62 0,61 4,86 0,42 0,55 0,37

CLSP315 Tis T0 12,2 8,86 8,96 8,99 7,29 7,27 4,57 6,00 0,33

CLSP367 Tis T0 0,63 0,50 5,37 4,66 7,57 0,54 6,01 6,83 9,09

CLSP724 Tis T0 6,99 9,30 5, 13 5, 10 4,25 7,59 5,81 6,55 6, 14

CNSE003 Tis T0 10,3 7,26 14, 1 7,37 1 1 ,4 9, 16 7,21 18,5 7, 10

CNSE004 Tis T0 0,42 0,32 0,51 0,44 0,51 3,57 0,41 0,42 0,35

GHBD015 Tis TO 7,47 5,31 5,44 5,46 4,52 4,41 6, 12 6,99 0,50

GHBD036 Tis TO 0,62 0,49 0,53 4,59 3,65 3,74 3,03 0,47 4,28

CBSE001 CCR I 14,4 10,4 10,6 16,0 12,8 8,51 5,51 8,27 5,85

CBSE016 CCR I 22,2 16,2 16,3 21 ,6 17,3 13, 1 8,44 15,5 10, 1

CLSP047 CCR I 0,40 0,31 0,40 0,50 0,50 4,01 0,42 0, 10 0,34

CLSP162 CCR I 0,43 0,32 0,43 0,45 0,45 0,43 0,41 0,36 0,25

CLSP196 CCR I 1 1 ,5 8,44 8,51 8,53 6,94 6,93 4,45 5,79 0,59

CLSP224 CCR I 31 , 1 22,2 22,4 22,4 18, 1 18,0 1 1 ,4 22,7 0,74

CLSP235 CCR I 7,28 5,49 5,49 5,53 4,45 10,4 2,81 0, 13 0, 15

CLSP263 CCR I 0,63 5,08 0,55 0,63 0,57 4,20 3, 17 0,45 6,33

CLSP340 CCR I 0,46 0,37 0,42 0,47 0,43 0,41 0,43 0,30 0,30

CLSP344 CCR I 5,67 4,27 4,31 4,39 3,56 3,60 2,33 0,30 0,30

CLSP364 CCR I 6,24 4,72 4,78 4,86 3,96 3,90 2,56 0,25 0,39

CLSP376 CCR I 0,41 0,42 0,48 0,43 0,48 0,45 0,45 0,38 0,51

GHBD003 CCR I 0,41 0,33 0,36 0,44 0,39 0,41 0,31 0, 16 0,26 GHBD094 CCR I 0,50 0,43 0,54 0,54 0,57 0,51 0,37 0,54 0,50

CLSP075 CCR II 0,44 0,34 0,41 0,50 0,47 0,46 0,40 0,34 0,34

CLSP076 CCR M 11 ,4 8,30 8,40 8,50 6,88 6,83 4,40 5,56 0,36

CLSP080 CCR M 0,33 0,29 0,34 0,38 0,38 0,38 0,36 0,19 0,31

CLSP096 CCR M 12,3 9,27 14,9 9,44 12,1 7,60 7,61 19,5 14,8

CLSP110 CCR M 6,12 4,33 4,43 4,51 3,70 7,04 2,38 5,59 0,34

CLSP117 CCR M 17,2 12,4 16,5 17,2 17,1 10,1 10,6 16,0 6,49

CLSP130 CCR M 6,61 4,69 4,77 4,90 4,00 3,94 2,55 6,03 0,44

CLSP133 CCR II 7,55 5,69 5,80 5,79 4,75 8,18 3,02 0,35 0,35

CLSP143 CCR II 9,26 6,96 7,11 7,06 5,78 9,79 3,58 0,74 0,56

CLSP147 CCR II 7,04 5,29 15,1 9,75 15,5 7,95 7,71 13,2 14,2

CLSP154 CCR II 16,7 12,6 12,7 12,7 10,3 10,3 6,54 10,5 8,00

CLSP155 CCR II 19,4 20,4 14,7 14,7 11 ,9 16,5 7,59 10,9 15,9

CLSP157 CCR II 6,24 4,68 4,79 4,79 3,93 3,93 4,67 0,48 0,29

CLSP165 CCR M 0,51 0,39 0,46 0,54 0,50 3,86 0,43 0,30 0,28

CLSP170 CCR II 15,7 11 ,5 11 ,6 11 ,6 9,4 9,38 5,99 7,29 0,63

CLSP173 CCR II 6,20 4,73 4,80 4,86 4,01 3,96 5,60 0,26 0,50

CLSP177 CCR II 10,5 12,4 10,5 13,1 13,0 9,99 8,74 0,55 14,8

CLSP178 CCR II 93,7 66,7 66,9 66,8 53,6 53,6 33,7 88,8 14,7

CLSP179 CCR M 11 ,8 5,07 5,15 5,10 4,21 4,21 2,73 0,88 0,63

CLSP186 CCR II 7,87 5,57 5,61 5,76 4,66 4,63 2,96 7,21 0,39

CLSP194 CCR II 16,8 12,1 12,1 12,2 9,8 13,1 6,24 10,1 0,25

CLSP201 CCR II 15,9 11 ,5 11 ,5 19,5 15,5 9,28 8,19 8,67 7,98

CLSP207 CCR II 16,0 11 ,8 11 ,6 11 ,8 9,5 9,63 6,01 8,07 5,53

CLSP209 CCR II 10,4 7,31 7,34 13,3 10,6 9,15 3,92 9,49 6,02

CLSP220 CCR II 19,2 14,2 14,2 14,3 11 ,6 11 ,6 7,36 12,6 5,69

CLSP222 CCR M 19,0 13,7 20,1 18,2 19,6 11 ,1 10,3 19,9 11 ,2

CLSP253 CCR II 5,68 4,27 4,37 4,41 3,63 6,74 2,30 0,48 0,38

CLSP256 CCR II 6,96 5,31 17,6 9,29 14,3 4,40 9,04 17,1 13,0

CLSP280 CCR II 5,84 4,45 4,49 9,08 7,26 3,71 6,07 0,47 4,91

CLSP296 CCR II 5,86 11 ,7 0,53 8,59 6,73 9,57 6,31 0,49 22,7

CLSP310 CCR M 0,50 0,44 0,47 0,59 0,54 0,55 0,42 0,33 0,47

CLSP327 CCR II 9,30 6,97 7,17 7,15 5,88 5,77 3,80 0,57 0,44

CLSP333 CCR II 5,98 0,73 0,62 0,73 0,65 0,71 0,56 0,53 0,58

CLSP341 CCR II 7,37 5,55 5,61 5,70 4,63 4,62 5,11 0,27 0,34

CLSP346 CCR II 12,2 15,3 9,38 9,37 7,67 12,4 7,13 7,08 13,4

CLSP347 CCR II 7,30 5,47 5,63 5,69 4,68 4,49 5,74 7,24 5,51

CLSP380 CCR II 7,21 5,42 5,64 5,52 4,61 4,47 5,72 0,62 0,44

CNSE002 CCR M 6,83 5,17 6,83 5,36 5,35 4,29 3,14 0,41 0,60

GHBD021 CCR II 0,37 0,30 0,34 0,43 0,39 0,40 0,36 0,15 0,26

GHBD043 CCR II 7,14 5,43 5,51 15,6 12,4 4,53 5,90 0,54 10,4

GHBD064 CCR M 37,4 27,5 33,3 27,7 26,8 22,2 16,9 38,7 20,7 GHBD066 CCR II 0,53 0,40 0,52 0,61 0,60 0,51 0,45 0,44 0,41

GHBD075 CCR M 5,84 4,39 4,51 4,49 3,70 3,67 2,39 0,54 0,39

GHBD087 CCR M 0,72 0,58 0,60 0,68 0,61 3,67 0,44 0,52 0,39

GHBD090 CCR M 0,40 0,33 0,45 0,46 0,49 0,39 0,35 0,42 0,40

GHBD096 CCR M 0,74 0,56 5,64 0,71 4,64 4,25 2,95 7,20 5,41

GHBD100 CCR M 9,40 5,93 13,8 14,5 16,6 10,8 7,14 13,8 12,4

GHBD103 CCR M 6,05 4,29 4,35 4,42 3,61 3,58 2,34 5,62 0,33

CBSE023 CCR III 6,58 4,72 6,18 6,18 6,18 3,95 7,38 8,88 0,43

CLSP044 CCR III 68,5 51 ,4 51 ,5 51 ,5 41 ,3 41 ,3 26,0 68,3 51 ,3

CLSP074 CCR III 10,0 7,56 7,66 12,5 10,0 6,24 4,07 0,40 5,16

CLSP078 CCR III 19,4 14,0 14,1 14,2 11 ,5 14,4 7,28 11 ,6 0,43

CLSP081 CCR III 9,85 7,41 9,84 9,84 9,84 6,09 8,03 0,37 0,21

CLSP098 CCR III 10,2 7,67 7,75 7,77 6,30 10,5 6,01 0,34 0,29

CLSP174 CCR III 46,8 75,3 46,0 44,9 44,6 60,3 40,5 59,2 113,1

CLSP227 CCR III 44,5 32,2 32,4 32,3 26,0 25,9 16,3 37,0 10,5

CLSP233 CCR III 7,46 5,63 5,71 5,69 4,64 7,85 2,95 0,30 0,31

CLSP255 CCR III 18,6 23,5 13,5 13,6 10,9 19,0 10,1 10,6 13,6

CLSP289 CCR III 0,62 0,47 0,54 0,58 0,54 0,56 0,49 0,45 0,29

CLSP320 CCR III 5,70 4,29 4,43 4,40 3,64 6,87 2,36 0,43 0,40

CLSP324 CCR III 9,72 7,44 7,49 7,52 6,17 6,11 6,25 0,59 0,81

CLSP383 CCR III 0,42 0,33 4,76 5,34 7,72 0,43 2,62 6,07 9,44

CLSP384 CCR III 71 ,9 57,6 63,9 53,7 51 ,3 46,2 32,3 85,0 63,1

CNSE001 CCR III 6,40 11 ,0 4,91 4,99 4,08 12,4 2,77 6,28 12,8

CNSE016 CCR III 67,8 62,8 53,6 48,9 43,0 50,3 31 ,4 65,0 37,4

CNSE017 CCR III 15,0 10,9 10,9 11 ,0 8,9 13,3 5,58 8,44 0,29

CSEM015 CCR III 6,74 4,76 6,33 6,33 6,33 7,47 3,26 9,13 0,14

CSEM029 CCR III 6,17 4,65 4,79 9,03 7,26 7,74 2,61 0,54 4,60

GHBD004 CCR III 21 ,2 16,0 16,0 16,1 12,9 12,9 8,10 15,1 11 ,5

GHBD017 CCR III 7,40 5,59 5,70 9,85 7,91 4,63 3,02 0,26 4,41

GHBD034 CCR III 0,31 0,26 0,32 0,41 0,39 0,39 3,94 0,16 0,32

GHBD042 CCR III 0,45 0,47 0,44 0,51 0,49 0,53 0,38 0,33 0,47

GHBD045 CCR III 18,2 13,6 13,8 13,9 11 ,2 11 ,0 7,02 0,33 0,46

GHBD089 CCR III 28,8 21 ,7 21 ,7 21 ,8 17,5 20,9 11 ,0 22,8 17,2

GHBD105 CCR III 0,58 6,18 6,95 4,49 5,75 5,08 3,78 8,96 14,3

CBSE012 CCR IV 6,40 11 ,7 5,02 4,99 4,17 12,8 4,87 0,68 9,58

CBSE026 CCR IV 329,6 3920 328,6 328,6 328,6 3136 1723 481 ,3 10043

CLSP156 CCR IV 21 ,9 23,0 21 ,2 16,5 17,1 21 ,8 16,0 19,6 23,3

CLSP159 CCR IV 47,6 60,7 44,8 35,6 36,0 48,8 30,7 59,6 73,3

CLSP167 CCR IV 6,60 10,4 5,06 9,15 7,32 12,0 2,85 0,32 11 ,4

CLSP260 CCR IV 66,9 48,4 48,4 48,4 38,9 38,9 24,5 64,3 21 ,2

CLSP334 CCR IV 0,40 0,33 0,53 0,42 0,52 0,41 2,95 0,52 0,48

CLSP357 CCR IV 9,04 18,5 6,98 6,92 5,70 14,9 9,40 9,03 22,1 CLSP365 CCR IV 27,5 195,3 25,6 20,9 20,6 156,3 68,5 33,9 253,3

CLSP366 CCR IV 0,54 8,46 0,64 0,55 0,64 6,93 3,09 0,63 1 1 ,0

GHBD022 CCR IV 1265,0 948,6 948,5 953,0 762,5 759,0 474,6 1264,5 951 ,9

GHBD071 CCR IV 56,5 47,7 46,8 41 ,5 37,5 38,3 27,9 62, 1 40,0

CLSP197 CCR NA 0,43 0,40 0,53 0,43 0,52 0,51 4,20 0,53 0,47

HGED005 Témoin ColoNeg 0,57 0,46 0,62 0,67 0,69 0,51 0,54 0,51 0,59

PROMIS 21 -01 -005 Témoin ColoNeg 0,53 0,55 0,49 0,54 0,51 0,61 0,43 0,36 0,49

PROMIS 21 -01 -006 Témoin ColoNeg 0,29 0,24 0,29 0,37 0,36 0,37 0,23 0, 19 0,26

PROMIS 21 -01 -009 Témoin ColoNeg 0,58 0,52 0,45 0,53 0,45 0,57 0,43 0,37 0,30

PROMIS 21 -01 -01 1 Témoin ColoNeg 0, 19 0, 18 0, 19 0,29 0,27 0,28 0,22 0,09 0,26

PROMIS 21 -01 -012 Témoin ColoNeg 0,47 0,43 0,44 0,47 0,45 0,50 0,36 0,31 0,42

PROMIS 21 -02-001 Témoin ColoNeg 6,46 4,59 4,72 1 1 ,3 9,05 3,78 2,61 6,08 6,87

PROMIS 21 -02-003 Témoin ColoNeg 0,35 0,45 0,34 0,41 0,39 0,52 0,31 0,26 0,51

PROMIS 21 -02-004 Témoin ColoNeg 0,37 0,29 0,37 0,42 0,41 0,31 0,39 0,37 0,28

PROMIS 21 -02-006 Témoin ColoNeg 0,41 0,34 0,41 0,42 0,42 4,07 0,36 0,27 0,27

PROMIS 21 -02-008 Témoin ColoNeg 5,95 0,51 0,58 0,58 0,58 0,56 0,43 0,59 0,29

PROMIS 21 -02-01 1 Témoin ColoNeg 0,46 0,47 0,45 0,45 0,45 0,55 0,38 0,23 0,48

PROMIS 21 -02-014 Témoin ColoNeg 0,57 0,43 0,55 0,55 0,55 0,53 0,33 0,40 0, 12

PROMIS 21 -02-016 Témoin ColoNeg 0,39 0,33 0,48 0,44 0,50 0,39 0,40 0,46 0,52

PROMIS 21 -03-004 Témoin ColoNeg 0,76 0,58 0,75 0,74 0,75 0,62 0,49 0,74 0,56

PROMIS 21 -03-013 Témoin ColoNeg 0,23 0, 18 0,25 0,37 0,36 0,34 0,25 0,21 0,29

PROMIS 21 -03-015 Témoin ColoNeg 0,46 0,35 0,42 0,52 0,48 0,44 0,34 0,37 0,34

PROMIS 21 -04-002 Témoin ColoNeg 0,56 0,51 0,63 0,55 0,63 0,56 0,58 0,53 0,49

PROMIS 21 -04-006 Témoin ColoNeg 0,44 0,35 0,39 0,44 0,40 0,48 0,37 0,20 0,24

PROMIS 21 -04-007 Témoin ColoNeg 0,48 0,38 0,50 0,57 0,57 0,46 0,37 0,46 0,44

PROMIS 21 -04-008 Témoin ColoNeg 0,39 0,30 0,40 0,44 0,44 0,38 0,38 0,38 0,32

PROMIS 21 -04-009 Témoin ColoNeg 0,37 0,38 0,49 0,46 0,54 0,42 0,41 0,48 0,60

PROMIS 21 -04-013 Témoin ColoNeg 0,65 0,59 0,59 0,61 0,58 0,63 0,39 0,50 0,53

PROMIS 21 -07-004 Témoin ColoNeg 0,65 0,51 0,57 0,64 0,59 0,53 0,38 0,51 0,37

PROMIS 21 -12-001 Témoin ColoNeg 0,44 0,43 5,58 0,45 4,56 0,49 2,93 7,21 5,58

PROMIS 21 -12-007 Témoin ColoNeg 0,53 0,42 0,52 0,51 0,50 0,53 0,33 0,28 0,20

PROMIS 21 -12-01 1 Témoin ColoNeg 0,52 0,47 0,54 0,52 0,54 0,52 0,38 0,51 0,58

PROMIS 21 -22-001 Témoin ColoNeg 0,42 0,48 0,39 4,42 0,51 0,52 0,37 0,34 0,67

PROMIS 21 -22-006 Témoin ColoNeg 0,52 0,40 0,51 0,51 0,51 0,49 0,36 0,45 0,34

PROMIS 21 -22-008 Témoin ColoNeg 0,46 0,36 0,41 0,47 0,43 0,42 0,36 0,28 0,24

PROMIS 37-03-004 Témoin ColoNeg 0,48 0,38 0,46 0,50 0,48 0,47 0,48 0,29 0,30

PROMIS 37-04-001 Témoin ColoNeg 0,74 0,58 0,70 0,74 0,72 0,57 0,53 0,79 0,64

PROMIS 37-04-005 Témoin ColoNeg 0,60 0,47 0,58 0,58 0,58 0,51 0,34 0,40 0, 17

PROMIS 37-05-008 Témoin ColoNeg 0,46 0,36 0,45 0,48 0,47 0,46 0,42 0,38 0,28

PROMIS 37-06-001 Témoin ColoNeg 0,57 0,47 0,61 0,54 0,59 0,51 0,39 0,57 0,45

PROMIS 37-09-002 Témoin ColoNeg 0,31 0,48 0,33 0,46 0,44 0,55 0,41 0,23 5,58

PROMIS 37-1 1 -001 Témoin ColoNeg 0,44 0,34 0,41 0,46 0,44 0,45 0,33 0,22 0,24 PROMIS 37-1 1 -002 Témoin ColoNeg 0,29 0,23 0,42 0,38 0,47 0,37 0,38 0,35 0,39

PROMIS 37-1 1 -01 1 Témoin ColoNeg 0,53 0,40 0,48 0,54 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30

PROMIS 37-1 1 -016 Témoin ColoNeg 0,30 0,27 0,47 0,47 0,57 0,37 0,37 0,39 0,55

PROMIS 37-12-002 Témoin ColoNeg 0,31 0,25 0,32 0,36 0,36 0,35 0,32 0,27 0,29

PROMIS 37-13-003 Témoin ColoNeg 0,46 0,41 0,45 0,54 0,52 0,47 0,35 0,40 0,44

PROMIS 37-13-006 Témoin ColoNeg 0,57 0,43 0,54 0,66 0,63 0,51 0,39 0,50 0,43

PROMIS 37-13-008 Témoin ColoNeg 0,32 0,24 0,30 0,36 0,34 0,35 0,33 0,23 0,20

PROMIS 37-14-009 Témoin ColoNeg 0,57 0,42 0,49 0,58 0,51 0,50 0,31 0,38 0,27

PROMIS 37-14-018 Témoin ColoNeg 6,80 5, 12 6,79 6,79 6,79 4,26 3,43 0,35 0, 12

PROMIS 37-14-021 Témoin ColoNeg 0,35 0,30 0,33 0,40 0,37 0,39 0,26 0, 16 0,29

PROMIS 37-15-002 Témoin ColoNeg 0,36 0,30 0,33 0,52 0,46 0,38 0,32 0,22 0,38

PROMIS 37-15-006 Témoin ColoNeg 0,41 0,32 0,41 0,52 0,50 0,42 0,32 0,40 0,40

PROMIS 37-16-001 Témoin ColoNeg 0,32 0,27 0,43 0,36 0,45 0,35 0,43 0,44 0,40

PROMIS 37-17-001 Témoin ColoNeg 0,45 0,37 0,41 0,46 0,43 0,43 0,36 0,35 0,35

PROMIS 37-17-003 Témoin ColoNeg 0,68 0,52 0,66 0,63 0,63 0,53 0,42 0,62 0,55

PROMIS 37-17-004 Témoin ColoNeg 0,50 0,40 0,53 0,50 0,53 0,47 0,35 0,45 0,38

PROMIS 37-18-001 Témoin ColoNeg 0,45 0,36 0,40 0,45 0,41 0,45 0,33 0,26 0,25

PROMIS 37-18-003 Témoin ColoNeg 0,50 0,39 0,42 0,51 0,45 0,49 0,31 0,34 0,25

PROMIS 37-18-004 Témoin ColoNeg 0,32 0,26 0,32 0,43 0,41 0,37 0,30 0,24 0,30

PROMIS 37-18-005 Témoin ColoNeg 0,49 0,39 0,44 0,50 0,46 0,47 0,31 0,26 0,29

PROMIS 37-18-024 Témoin ColoNeg 0,43 0,36 0,45 0,48 0,49 0,47 0,31 0,32 0,39

PROMIS 37-19-006 Témoin ColoNeg 0,59 0,44 0,54 0,56 0,53 0,47 0,37 0,42 0,25

PROMIS 37-19-007 Témoin ColoNeg 0,42 0,31 0,37 0,45 0,41 0,42 0,29 0,23 0,24

PROMIS 37-20-004 Témoin ColoNeg 0,37 0,28 0,48 0,44 0,52 0,36 0,52 0,44 0,44

PROMIS 71 -02-003 Témoin ColoNeg 0,31 0,24 0,39 0,36 0,42 0,36 0,31 0,30 0,33

PROMIS 71 -04-003 Témoin ColoNeg 0,50 0,41 0,46 0,50 0,48 0,50 0,33 0,39 0,33

PROMIS 71 -09-007 Témoin ColoNeg 0,41 0,35 0,36 0,47 0,42 0,43 0,35 0,28 0,33

PROMIS 71 -10-001 Témoin ColoNeg 0,34 0,40 0,37 0,37 0,39 0,45 0,35 0,28 0,47

PROMIS 71 -10-007 Témoin ColoNeg 0,41 0,34 0,47 0,48 0,51 0,40 0,45 0,41 0,50

PROMIS 71 -1 1 -001 Témoin ColoNeg 0,40 0,32 0,39 0,44 0,43 0,38 0,33 0,34 0,35

PROMIS 71 -1 1 -006 Témoin ColoNeg 0,41 0,33 0,37 0,43 0,40 0,41 0,31 0,27 0,25

PROMIS 71 -1 1 -008 Témoin ColoNeg 0,34 0,33 0,31 0,38 0,35 0,40 0,24 0,22 0,33

PROMIS 71 -1 1 -009 Témoin ColoNeg 0,50 0,43 0,44 0,49 0,45 0,50 0,35 0,34 0,32

Score Score Score Score Score Score Score Score 3 sans Score 3 sans renoriTiances

3^S 4' 4^U 4^V 8^X prolidase^y prolidase²

Seuil 0,76 0,73 0,75 0,74 0,75 0,63 0,58 0,88 0,81

Sensibilité % 73,5 75,2 76, 1 77 77,9 82,3 83,2 51 ,3 47,8

Spécificité % 95,7 97,2 95,7 95,7 95,7 95,7 95,7 97,2 95,7

CCR invasif et Tis au-dessus du seuil 83 85 86 87 88 93 94 58 54

ColoNeg au-dessus du seuil 3 2 3 3 3 3 3 2 3 Tis: Patients atteints d'une tumeur in situ (carcinome intra-muqueux TO), CCR = patients atteints d'un cancer colorectal de stade TNM I à IV (Adénocarcinome), ColoNeg- = sujets sains, avec un test FOBT positif et une coloscopie totalement normale.

Score 3^S : association prolidase, LFABP, ACE

Score 4' : association prolidase, LFABP, ACE, CA19-9

Score 4^U : association prolidase, LFABP, ACE, M2PK

Score 4^V : association prolidase, LFABP, ACE, Timpl

Score 5^wa : association prolidase, LFABP, ACE, M2PK, Timpl

Score 5^wb : association prolidase, LFABP, ACE, PDI, CA19-9

Score 8^X : association prolidase, LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine, G3PDH

Score 3 sans prolidase^y: association LFABP, ACE, M2PK

Score 3 sans prolidase² : association ACE, M2PK, C19-9, Timpl .

Exemple 6 : Détection des patients atteints de cancers colorectaux et de patients contrôles par le dosage MRM des marqueurs Alpha enolase, G3PDH, BIP, HSP71, Peroxy-5 et PDI Pour chacun de ces marqueurs, les scores ont été obtenus dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l'obtention des scores de la prolidase et décrites à l'exemple 5 (Tableau 14).

Tableau 17

Claims

REVENDICATIONS

1 . Procédé de diagnostic, in vitro, du cancer colorectal chez un patient, par la détermination de la présence de la prolidase, dans un échantillon biologique du patient.

2. Procédé de diagnostic précoce, in vitro, du cancer colorectal chez un patient, par la détermination de la présence de la prolidase, dans un échantillon biologique du patient.

3. Procédé de détection, dans un échantillon biologique d'un patient, d'une tumeur Tis colorectale, par la détermination de la présence de la prolidase, dans un échantillon biologique du patient.

4. Procédé de détection, dans un échantillon biologique d'un patient, d'un adénome colorectal, par la détermination de la présence de la prolidase, dans un échantillon biologique du patient.

5. Procédé de dépistage, in vitro, d'un cancer colorectal dans une population par détermination de la présence de la prolidase dans un échantillon biologique d'un individu.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le patient est suspecté de cancer, par exemple de cancer colorectal.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on détecte la prolidase et/ou au moins un traceur représentatif de la prolidase et choisi parmi des peptides, des acides nucléiques, des anticorps, dans ledit échantillon biologique.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase et on met en évidence une variation de son expression.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on met en évidence une diminution de l'expression de la prolidase.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase et celle d'au moins un marqueur choisi parmi les marqueurs suivants :

ACE; Aminoacylase 1 ; Apolipoprotéine A1 ; Apolipoprotéine A2;

Beta 2 Microglobuline; CA242; CA50; CA72-2; CA19-9; Calgranuline C;

Calréticuline; CCSA-3 (colon cancer spécifie antigen) ; CCSA-4; CD24; CD26;

Cripto-1 ; Cytokératine 20; Epithelial-Cadhérine; Ezrine; Galectine-3; GST Pi (GSTP1 ); HSP60; lntelectine-1 ; Intestinal Fatty Acid-Binding Protein; Kératine type I Cytoskeletal 18; Kératine type I Cytoskeletal 19; Kératine type II Cytoskeletal 8; Leucocyte Elastase Inhibitor, associé ou non à la Protéinase 3 (PRN3) ; Liver Fatty Acid-Binding Protein; L-Lactate Deshydrogénase Chaîne B (LDHB); Maspine; MIF; MUC5AC; Ostéopontine; Plastine-I; Protéasome 20S; (Pro)défensine-A5; (Pro)défensine-A6; Protéine Disulfide Isomérase (PDI); Pyruvate kinase M2-PK; Regenerating Islet-Derived Protein 3 Alpha; S100A8; S100A9; Testostérone; TIMP-1 ; Translationally-Controlled Tumor Protein; Tumor-Associated Calcium Signal Transducer 1 ; Tumor-Associated Calcium Signal Transducer 1 ; Villine; Vimentine; Heat Shock cognate 71 kDa (HSP71 ), BIP (GRP-78), Peroxiredoxin-5, Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) ; Alpha-Enolase ;

ADN méthylé dans le sang, de préférence l'ADN méthylé du gène AXL4 (Aristaless-like Homeobox-4 Gene Methylation) ou l'ADN méthylé du gène Septin-9;

des altérations spécifiques de fragments d'ADN dans les selles comme des mutations spécifiques de l'ADN dans les selles ou des altérations spécifiques du profil de méthylation de l'ADN dans les selles;

haptoglobine dans les selles ;

hémoglobine humaine dans les selles.

1 1 . Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase et celle d'au moins un marqueur choisi parmi L-FABP, CA19-9, ACE, Béta-2 Microglobuline, Timpl , M2PK, HSP60, (Pro)defensine A6, BIP (GRP78), G3PDH, Gal3, PDI, ApoA1 et ApoA2,

12. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase et celle d'au moins les associations suivantes de marqueurs :

ACE et CA19-9,

LFABP et PDI,

L-FABP, CA19-9 et ACE,

LFABP, ACE et Timpl ,

LFABP, ACE et M2PK,

LFABP, CA19-9, ACE et PDI

LFABP, ACE, M2PK et Timpl ,

LFABP, ACE, CA19-9 et PDI.

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9 et PDI.

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine et PDI.

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, G3PDH et PDI. LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine et G3PDH.

LFABP, ACE, M2PK, Timpl , CA19-9, Villine, G3PDH et PDI.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique du patient est choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, les urines, la salive, le tissu et les selles.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est distant de la tumeur et est de préférence choisi parmi le sang, le sérum et le plasma.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase par une technique de spectrométrie de masse.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase par la technique LC-MRM-MS qui combine la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en mode M RM (Mutiple Reaction Monitoring).

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase par une technique immunologique.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'on détermine la présence de la prolidase en associant une technique immunologique et une technique de spectrométrie de masse.

19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'on détecte un peptide ou un mélange de peptides choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 1 à 3.

20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'on détecte les peptides de la prolidase en suivant les transitions listées dans le tableau 1 .

21 . Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'on suit la transition 400.2/686.3 du peptide de SEQ ID NO : 1 , et la transition du peptide lourd correspondant, pour déterminer la présence de la prolidase.

22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 21 , caractérisé en ce que l'on suit la transition 452.7/662.2 du peptide de SEQ ID NO : 5, et la transition du peptide lourd correspondant, pour déterminer la présence de l'Alpha-Enolase.

23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 22, caractérisé en ce que l'on suit les transitions 699,4/557,4; 699,4/685,4; 699,4/784,5 du peptide de SEQ ID NO : 6, et la transition du peptide lourd correspondant, pour déterminer la présence de la protéine BIP (GRP78).

24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 23, selon lequel on suit les transitions 403,2/550,3 et 403,2/706,3 du peptide de SEQ ID NO : 12 ou la transition 435,3/657,2 du peptide de SEQ ID NO : 10, et les transitions des peptides lourds correspondants, pour déterminer la présence de la G3PDH.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 24, selon lequel on suit la transition 494,6/793,4 du peptide de SEQ ID NO : 15, et la transition du peptide lourd correspondant, pour déterminer la présence de l'HSP71 (HSC70).

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 25, selon lequel on suit les transitions 496,3/407,3; 496,3/522,3; 496,3/635,4 du peptide du peptide de SEQ ID NO : 17, et les transitions du peptide lourd correspondant, pour déterminer la présence de la PDI.

27. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, dans le dépistage, le diagnostic précoce, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer colorectal.