EP1905844A2 - Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen - Google Patents

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EP1905844A2
EP1905844A2 EP07015834A EP07015834A EP1905844A2 EP 1905844 A2 EP1905844 A2 EP 1905844A2 EP 07015834 A EP07015834 A EP 07015834A EP 07015834 A EP07015834 A EP 07015834A EP 1905844 A2 EP1905844 A2 EP 1905844A2
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EP
European Patent Office
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tumor
pharmaceutical composition
rna
mrna
composition according
Prior art date
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Withdrawn
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EP07015834A
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Ingmar Dr. Hoerr
Florian VON DER MüLBE
Steve Dr. Pascolo
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Curevac SE
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Curevac AG
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Publication date
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one mRNA comprising at least one region coding for at least one antigen from a tumor, in conjunction with a water-soluble solvent and preferably a cytokine, for example GM-CSF, and a process for the preparation of the pharmaceutical Composition.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is used in particular for the therapy and / or prophylaxis against cancer.
  • Gene therapy and genetic vaccination are molecular medical procedures whose application in the treatment and prevention of diseases will have a significant impact on medical practice. Both methods are based on the introduction of nucleic acids into cells or tissue of the patient as well as on the subsequent processing of the information encoded by the introduced nucleic acids, i. the expression of the desired polypeptides.
  • DNA viruses as DNA vehicles.
  • DNA viruses have such viruses the advantage that due to their infectious properties, a very high transfection rate can be achieved.
  • the viruses used are genetically modified so that no functional infectious particles are formed in the transfected cell. Despite this precautionary measure, however, a certain risk of uncontrolled spread of introduced gene-therapeutically effective and viral genes can not be ruled out due to possible recombination events.
  • the DNA introduced into the cell is to some extent integrated into the genome of the transfected cell.
  • this phenomenon can exert a desired effect, since it can achieve a long-lasting effect of the introduced DNA.
  • integration into the genome carries a significant risk of gene therapy.
  • an insertion of the introduced DNA into an intact gene can occur, which represents a mutation which impedes the function of the endogenous gene or even completely eliminates it.
  • the risk of cancer formation can not be ruled out when using DNA viruses as gene therapeutics and vaccines.
  • the corresponding DNA vehicles contain a strong promoter, for example the viral CMV promoter. Integration of such promoters into the genome of the treated cell can lead to undesirable changes in the regulation of gene expression in the cell.
  • DNA as a gene therapeutic and vaccine is Another disadvantage of using DNA as a gene therapeutic and vaccine.
  • Another disadvantage of using DNA as a gene therapeutic and vaccine is the induction of pathogenic anti-DNA antibodies in the patient, eliciting a potentially fatal immune response.
  • RNA Unlike DNA, the use of RNA as a gene therapy or vaccine is much safer. In particular, RNA does not involve the risk of being stably integrated into the genome of the transfected cell. Furthermore, there are no viral sequences, as promoters, for efficient transcription required. In addition, RNA is much easier to degrade in vivo . Probably due to the relatively short half-life of RNA in the bloodstream compared to DNA, no anti-RNA antibodies have been detected so far. Therefore, RNA can be considered as the molecule of choice for molecular medical therapies.
  • RNA expression systems based on RNA expression systems, medical procedures still require a solution to some fundamental problems before broader use.
  • One of the problems with the use of RNA is the safe, cell- or tissue-specific efficient transfer of the nucleic acid. Since RNA in solution usually proves to be very unstable, the conventional methods used in DNA have made it impossible or very inefficient to use RNA as a therapeutic or vaccine.
  • RNAases ribonucleases
  • RNAases RNA-degrading enzymes
  • ribonucleases RNA-degrading enzymes
  • Even the smallest impurities of ribonucleases are sufficient to completely degrade RNA in solution.
  • the natural degradation of mRNA in the cytoplasm of cells is very finely regulated.
  • the terminal structure is of crucial importance At the 5 'end is the so-called "cap structure" (a modified guanosine nucleotide) and at the 3' end a sequence of up to 200 adenosine nucleotides (the so-called poly A tail).
  • cap structure a modified guanosine nucleotide
  • poly A tail adenosine nucleotides
  • RNA Surveillance System was described ( Hellerin and Parker, Annu. Rev. Genet. 1999, 33: 229-260 ), in which incomplete or nonsense mRNA is recognized and made available for degradation by certain feedback protein-protein interactions in the cytosol, with a majority of these processes being carried out by exonucleases.
  • WO 99/14346 describes further methods for stabilizing mRNA.
  • modifications of the mRNA are proposed which stabilize the mRNA species against the degradation of RNases.
  • modifications relate to the stabilization by sequence modifications, in particular reduction of the G and / or U content by base elimination or base substitution.
  • chemical modifications in particular the use of nucleotide analogues, as well as 5'- and 3'-blocking groups, an increased length of the poly-A tail and the complexation of mRNA with stabilizing agents and combinations of said measures are proposed.
  • TGT transient gene therapy
  • mice increased antibody formation against the gag protein was seen in mice immunized with the synthetic DNA construct and also observed enhanced cytokine release in vitro in transfected mouse spleen cells. Finally, induction of a cytotoxic immune response in mice immunized with the gag expression plasmid could be detected.
  • the authors of this article essentially attribute the improved properties of their DNA vaccine to a change in nucleocytoplasmic transport of the mRNA expressed by the DNA vaccine as a result of optimized codon usage. In contrast, the authors consider the impact of altered codon usage on translation efficiency to be low.
  • composition comprising at least one mRNA comprising at least one region coding for at least one antigen from a tumor, in association with an aqueous solvent.
  • antigen from a tumor means that the corresponding antigen expresses in cells associated with a tumor. Therefore, according to the invention, antigens from tumors are in particular those which are produced in the degenerate cells themselves. Preferably, these are located on the surface of the cells antigens. Furthermore, the antigens from tumors are also those that are expressed in cells that are not (or were not originally) degenerate themselves, but are associated with the tumor in question. These include, for example, antigens associated with tumor-supplying vessels or their (re) education, in particular those antigens associated with neovascularization or angiogenesis, for example. Growth factors such as VEGF, bFGF, etc. Furthermore, such include antigens associated with a tumor such as cells from the tissue embedding the tumor. Mentioned here are corresponding antigens of connective tissue cells, for example antigens of the extracellular matrix.
  • the pharmaceutical composition in the pharmaceutical composition one (or more) mRNAs for therapy or vaccination, i. Vaccination, used for the treatment or prevention (prophylaxis) of cancer.
  • the vaccine is based on the introduction into the organism, in particular the cell, of an antigen (or several antigens) of a tumor, in the present case the genetic information for the antigen in the form of the mRNA coding for the antigen (s).
  • the mRNA contained in the pharmaceutical composition is translated into the (tumor) antigen, i. the polypeptide or antigenic peptide encoded by the modified mRNA is expressed, thereby stimulating an immune response directed against that polypeptide or antigenic peptide.
  • the immune response is achieved by introducing the genetic information for antigens from a tumor, in particular proteins expressed exclusively on cancer cells, in which a pharmaceutical composition according to the invention is administered comprising a contains mRNA encoding such a cancer antigen. This expresses the cancer antigen (s) in the organism, thereby eliciting an immune response that is effectively directed against the cancer cells.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is particularly useful for the treatment of cancers (the mRNA preferably encoding a tumor-specific surface antigen (TSSA)), for example for the treatment of malignant melanoma, colon carcinoma, lymphoma, sarcoma, small cell lung carcinoma, blastomas etc., into consideration.
  • tumor antigens include 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, ⁇ -catenin / m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27 / m, CDK4 / m, CEA, CT.
  • the antigen (s) from a tumor is a polyepitope of the antigen (s) from a tumor.
  • a "polyepitope" of one or more antigens is an amino acid sequence that represents multiple or multiple regions of the antigen (s) that interact with the antigen-binding portion of an antibody or with a T-cell receptor.
  • the polyepitope can be present completely and unmodified. However, it may also be modified according to the present invention, in particular for optimizing the antibody / antigen or T cell receptor / antigen interaction.
  • a modification to the wild-type polyepitope may include a deletion, addition and / or substitution of one or more amino acid residues. Accordingly, in the modified polyepitope-encoding mRNA of the present invention, one or more nucleotides are removed, added and / or replaced with the mRNA encoding the wild-type polyepitope.
  • each (m) RNA contained in the pharmaceutical composition has one or more modifications, in particular chemical modifications, which are used to increase the half-life of the (m) Contribute RNA (one or more) in the organism or improve the transfer of (m) RNA (one or more) into the cell.
  • DSE destabilizing sequence elements
  • the modified mRNA preferably contained in the pharmaceutical composition according to the invention, one or more alterations to the corresponding region of the wild-type mRNA are optionally made in the region coding for the at least one antigen from a tumor, so that no destabilizing sequence elements are contained.
  • non-translated regions 3'- and / or 5'-UTR
  • Such destabilizing sequences are, for example, AU-rich sequences ("AURES") which occur in 3 'UTR sections of numerous unstable mRNAs ( Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670-1674 ).
  • the RNA molecules contained in the pharmaceutical composition according to the invention are therefore preferably modified from the wild-type mRNA in such a way that they have no such destabilizing sequences.
  • sequence motifs which are recognized by possible endonucleases, for example the sequence GAACAAG, which is contained in the 3 'UTR segment of the gene encoding the transferrin receptor ( Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969-1980 ).
  • sequence motifs are also preferably eliminated in the modified mRNA of the pharmaceutical composition according to the invention.
  • base substitutions are introduced using a DNA template for the production of the modified mRNA using techniques of common directional mutagenesis; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001 ,
  • the DNA template has a suitable promoter, for example a T7 or SP6 promoter, for in vitro transcription followed by the desired nucleotide sequence for the targeting mRNA and a termination signal for in vitro transcription.
  • the DNA molecule forming the template of the RNA construct to be produced is prepared by fermentative propagation and subsequent isolation as part of a plasmid replicable in bacteria.
  • plasmids for the present invention for example, the plasmids pT7TS (GenBank accession number U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349-2360 ; see also Figure 8), pGEM ® series, for example, pGEM ® -1 (GenBank accession number X65300;.. by Promega) and pSP64 (GenBank accession number X65327) can be mentioned; vgL too Mezei and Storts, Purification of PCR. Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001 ,
  • the desired nucleotide sequence can be cloned into a suitable plasmid according to methods well known to those skilled in the art (see Maniatis et al, supra) ).
  • the DNA molecule is then excised from the plasmid in which it may be single or multiple copy by digestion with restriction endonucleases.
  • the modified mRNA contained in the pharmaceutical composition of the present invention may further have a 5'-cap structure (a modified guanosine nucleotide).
  • a 5'-cap structure a modified guanosine nucleotide.
  • cap structures may be mentioned m7G (5 ') ppp (5' (A, G (5 ') ppp (5') A and G (5 ') ppp (5') G).
  • the modified mRNA contains a poly (A + ) tail of at least about 25, more preferably at least about 30, preferably at least about 50 nucleotides, more preferably at least about 70 nucleotides, most preferably at least about 100 nucleotides.
  • the poly (A + ) tail may also comprise 200 and more nucleotides.
  • Efficient translation of the mRNA requires efficient binding of the ribosomes to the ribosome binding site (Kozak sequence GCCGCCACCAUGG, the AUG forms the start codon). In this regard, it has been found that increased A / U content around this site allows for more efficient ribosome binding to the MRNA.
  • IRES internal ribosomal entry side
  • IRES sequences which can be used according to the invention are those from picornaviruses (eg FMDV), pestiviruses (CFFV), polioviruses (PV), encephalococytitis viruses (ECMV), foot-and-mouth disease viruses (FMDV), hepatitis C viruses (HCV), classical swine fever virus (CSFV), murine leucoma virus (MLV), simean immunodeficiency virus (SIV) or cricket paralysis virus (CrPV).
  • picornaviruses eg FMDV
  • CFFV pestiviruses
  • PV polioviruses
  • ECMV encephalococytitis viruses
  • FMDV foot-and-mouth disease viruses
  • HCV hepatitis C viruses
  • CSFV classical swine fever virus
  • MMV murine leucoma virus
  • SIV simean immunodeficiency virus
  • CrPV cricket paralysis virus
  • the mRNA has stabilization sequences in the 5 'and / or 3' untranslated regions which are capable of increasing the half-life of the mRNA in the cytosol.
  • stabilizing sequences may have 100% sequence homology to naturally occurring sequences found in viruses, bacteria and eukaryotes, but may also be partially or wholly synthetic.
  • stabilizing sequences useful in the present invention mention may be made of the non-translational sequences (UTR) of the ⁇ -globin gene, for example of Hamo sapiens or Xenopus laevis .
  • UTR non-translational sequences
  • Another example of a stabilization sequence has the general formula (C / U) CCAN x OOO (U / A) Py x UO (C / U) OC, which in the 3'UTR of the very stable mRNA.
  • stabilizing sequences may be used alone or in combination with each other as well as in combination with other stabilizing sequences known to one skilled in the art.
  • the mRNA it is also preferred that it has at least one analogous naturally occurring nucleotide. This is due to the fact that the RNA-degrading enzymes found in the cells preferentially recognize naturally occurring nucleotides as the substrate. Inserting nucleotide analogues can therefore make RNA degradation more difficult; wherein the effect on translational efficiency upon incorporation of these analogs, particularly into the coding region of the mRNA, may have a positive or negative effect on translation efficiency.
  • nucleotide analogues useful in the present invention include phosphoramidates, phosphorothioates, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine, and inosine.
  • the preparation of such analogs are one skilled in the art, for example. From the U.S. Patents 4,373,071 . US 4,401,796 . US 4,415,732 . US 4,458,066 . US 4,500,707 . US 4,668,777 . US 4,973,679 . US 5,047,524 . US 5,132,418 . US 5,153,319 . US 5,262,530 and 5,700,642 known. According to the invention, such analogs can occur in untranslated and translated regions of the modified mRNA.
  • the effective transfer of the, preferably modified, mRNA into the cells to be treated or the organism to be treated can be improved by associating or binding the mRNA with a cationic or polycalionic agent, in particular a corresponding peptide or protein.
  • the mRNA in the pharmaceutical composition according to the invention is preferably complexed or condensed with such an agent.
  • the use of protamine as a polycationic, Nwkimäuru-büi & n & n protein is particularly effective.
  • other cationic peptides or proteins such as poly-L-lysine, poly-L-arginine or histones, is also possible. This procedure for the stabilization of the modified mRNA is in EP-A-1083232 described, the related disclosure of which is fully included in the present invention.
  • the mRNA modified according to the invention may also contain, in addition to the antigenic or gene therapeutic peptide or polypeptide, at least one further functional segment, for example for a cytokine promoting the immune response (monokine, lymphokine, interleukin or chemokine, such as IL-1, IL -2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , GM-CFS , LT- ⁇ or growth factors, such as hGH.
  • a cytokine promoting the immune response such as IL-1, IL -2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , GM-CFS , LT- ⁇ or growth factors, such as hGH.
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain one or more adjuvants.
  • adjuvant is meant any chemical or biological compound that favors a specific immune response.
  • compounds which promote endocytosis of the modified mRNA by dendritic cells (DC) contained in the pharmaceutical composition form a first class of useful adjuvants.
  • Other compounds which allow the maturation of DC for example lipopolysaccharides, TNF- ⁇ or CD40 ligand, are another class of suitable adjuvants.
  • any "danger signal” type of agent LPS, GP96, oligonucleotides with the CpG motif
  • cytokines in particular GM-CFS
  • LPS lipopeptides
  • GP96 oligonucleotides with the CpG motif
  • cytokines in particular GM-CFS
  • cytokines which influence the immune system
  • the above-mentioned cytokines are preferred.
  • Other known adjuvants are aluminum hydroxide, Freud's adjuvant and the abovementioned stabilizing cationic peptides or polypeptides, such as protamine.
  • lipopeptides such as Pam3Cys, are also particularly suitable for use as adjuvants in the pharmaceutical composition of the present invention; see. Deres et al., Nature 1989, 342: 561-564 ,
  • RNA or mRNA species which can be added to the pharmaceutical composition of the present invention to increase immunogenicity.
  • adjuvant RNA is advantageously chemically modified for stabilization ("cis modification” or “cis stabilization"), for example by the abovementioned nucleotide analogs, in particular phosphorothioate-modified nucleotides, or else by the above further measures for the stabilization of RNA .
  • a further advantageous possibility of stabilization is the complexation or association ("trans-association” or "trans-modification” or “trans-stabilization”) with the abovementioned cationic or polycationic agents, for example with protamine.
  • the stability of the RNA molecules contained in the pharmaceutical composition is increased by one or more RNase inhibitors.
  • RNase inhibitors are peptides or proteins, especially those from placenta (eg, from human placenta) or pancreas. Such RNase inhibitors can also present recombinantly.
  • a specific example of an RNase inhibitor is RNasin ®, which, for example, from Promega is commercially available. Such RNase inhibitors are generally useful for stabilizing RNA.
  • a pharmaceutical composition which contains at least one RNA coding for at least one antigen, in particular mRNA, and at least one RNase inhibitor as defined above, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable solvent, carrier and / or vehicle.
  • RNA coding for at least one antigen in particular mRNA
  • RNase inhibitor as defined above
  • a pharmaceutically acceptable solvent, carrier and / or vehicle optionally in combination with a pharmaceutically acceptable solvent, carrier and / or vehicle.
  • Corresponding antigens in general form as well as solvents, carriers or vehicles are defined below.
  • the preferred pharmaceutical composition containing at least one mRNA coding for at least one antigen from a tumor is referred to the embodiments herein.
  • the pharmaceutical composition according to the invention preferably contains, in addition to the aqueous solvent and the mRNA, one or more further pharmaceutically acceptable carriers and / or one or more further pharmaceutically acceptable vehicles.
  • Appropriate routes for suitable formulation and preparation of the pharmaceutical composition according to the invention are given in " Remington's Pharmaceutical Sciences "(Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980 ), which is incorporated by reference in its entirety in the disclosure of the present invention.
  • For parenteral administration come as carriers, for example, in addition to sterile.
  • Water or sterile saline solutions as the aqueous solvent also polyalkylene glycols, hydrogenated naphthalene and in particular biocompatible lactide, lactide / glycolide or polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymers into consideration.
  • compositions according to the invention can be fillers or substances such as lactose, mannitol, substances for the covalent attachment of polymers such as polyethylene glycol to inhibitors of the invention, complexation with metal ions or inclusion of materials in or on particular preparations of polymer compound such as polylactate, polyglycolic acid, hydrogel or Liposomes, microemulsions, micelles, unilamellar or multilamellar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • polymer compound such as polylactate, polyglycolic acid, hydrogel or Liposomes, microemulsions, micelles, unilamellar or multilamellar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • the particular embodiments of the compositions are chosen depending on the physical behavior, for example with regard to solubility, stability, bioavailability or degradability.
  • Controlled or constant release of the active ingredient component of the invention in the composition closes Formulations based on lipophilic depots (eg fatty acids, waxes or oils).
  • lipophilic depots eg fatty acids, waxes or oils.
  • Coatings of substances according to the invention or compositions containing such substances, namely coatings with polymers (for example polyoxamers or polyoxamines) are also disclosed in the context of the present invention.
  • substances or compositions according to the invention may have protective coatings, for example protease inhibitors or permeability enhancers.
  • Preferred aqueous carrier materials are, for example, water for injection (WFI) or water buffered with phosphate, citrate or acetate, etc., wherein the pH is typically adjusted to 5.0 to 8.0, preferably 6.0 to 7.0.
  • aqueous solvent or carrier (s) or vehicle (s) will additionally preferably contain salt components, eg sodium chloride, potassium chloride or other components which render the solution, for example, isotonic.
  • aqueous solvents or the one or more further carriers or the further vehicle (s) may contain, in addition to the abovementioned constituents, additional components, such as human serum albumin (HSA), polysorbate 80, sugars or amino acids.
  • HSA human serum albumin
  • the manner of administration and the dosage of the pharmaceutical composition according to the invention depend on the disease to be treated and its progress stage, as well as the body weight, the age and the sex of the patient.
  • the concentration of modified mRNA in such formulations may therefore vary within a wide range of 1 ⁇ g to 100 mg / ml.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably administered to the patient parenterally, for example intravenously, intraarterially, subcutaneously, intramuscularly. It is also possible to administer the pharmaceutical composition topically or orally. Preferably, the pharmaceutical composition according to the invention is administered intradermally. Furthermore, a transdermal application by means of electrical currents or by osmotic forces is possible. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention can be locally injected into a tumor.
  • a method of treatment or a vaccination method for the prevention of cancers for example the diseases mentioned above, which comprises administering the pharmaceutical composition according to the invention to a patient, in particular a human.
  • a preferred Aushihrungs form the treatment or vaccination process or in the above-defined use of the mRNA according to the invention, coding for at least one antigen from a tumor, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of Krebsesianhungen the patient in addition to the pharmaceutical composition of the invention one or more cytokines (e) administered
  • a method of treatment or vaccination comprising administering at least one RNA encoding at least one antigen from a tumor (as defined above), preferably mRNA, optionally stabilized as above, and at least a cytokine, for example one or more of the abovementioned cytokines, in particular GM-CSF, to a patient, in particular a human.
  • the method is used in particular for the treatment and / or.
  • Prevention of corresponding cancer conditions eg the above cancer forms).
  • the present invention is also generally directed to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one RNA encoding at least one antigen from a tumor (as hereinbefore defined), preferably mRNA optionally stabilized as above, and at least one cytokine ,
  • a pharmaceutically-acceptable carrier and / or vehicle eg a water solvent, or one or more of the carriers, solvents or vehicles defined above.
  • cytokines for example one or more of the abovementioned cytokines, in particular GM-CSF, in combination with one or more RNA molecules as defined above, in particular mRNA, for the treatment and / or prevention of cancers (eg, the cancers listed above).
  • the cytokine for example GM-CSF
  • the administration of the cytokine, in particular GM-CSF takes place shortly before (eg about 15 minutes or less, for example about 10 or about 5 minutes) or shorter time (for example about 5, 10, 15, 30, 45 or 60 min) after or longer time (eg about 2, 6, 12, 24 or 36 h) after the administration of the pharmaceutical composition defined above or generally according to the at least one (m) RNA coding for at least one antigen from a tumor.
  • cytokine for example GM-CFS
  • GM-CFS cytokine
  • Suitable routes of administration as well as the appropriate formulation possibilities with respect to the cytokine (s) can be found in the above statements regarding the pharmaceutical compositions according to the invention.
  • a GM-CSF dose of 100 micrograms / m 2 is recommended.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention or the RNA encoding an antigen from a tumor and, optionally, the cytokine (s) associated therewith are administered in the form of interval doses.
  • a dose of a pharmaceutical composition of the invention may be administered at shorter intervals, for example, daily, every other day, every third day, etc., or, more preferably, at longer intervals, for example, once a week, once every two weeks, once in a month three weeks, once a month etc.
  • the intervals may also be variable, taking into account in particular the patient's immunological parameters. For example.
  • a pharmaceutical composition according to the invention (and optionally also the administration thereof or the cytokine / cytokine) follow a treatment regimen in which at the beginning of treatment, the interval is shorter, for example. Once every two weeks, and then, depending on the course of treatment or the corresponding immunological parameters of the patient, the interval to eg. is renewed once a month.
  • a therapy scheme tailored to the respective individual can be used.
  • the tumor tissue of the patient can be obtained, for example, by a simple biopsy. It may also be provided by surgical removal of tumor-infested tissue.
  • the preparation of the cDNA library or a portion thereof according to step (a) of the manufacturing process of the present invention may be carried out after the corresponding tissue has been deep-frozen for storage, preferably at temperatures below -70 ° C.
  • first an isolation of the total RNA, for example from a tumor tissue biopsy is carried out. Methods for this purpose are described, for example, in Maniatis et al., Supra .
  • kits for this purpose are commercially available, for example from the company Roche AG (eg the product "High Pure RNA Isolation Kit”). From the total RNA. According to a method known to a person skilled in the art (see, for example, Maniatis et al., supra ), the corresponding poly (A + ) RNA is isolated. Also for this purpose, commercially available kits are available. An example is the "High Pure RNA Tissue Kit” from Roche AG. Starting from the thus obtained poly (A + ) RNA, the cDNA library is subsequently prepared (cf. also, for example, Maniatis et al., Supra ) .
  • kits for example the "SMART PCR cDNA Synthesis Kit” from Clontech Inc., are available to a person skilled in the art.
  • the individual sub-steps from the poly (A + ) RNA to Double-stranded cDNA are shown schematically in the example of the method according to the "SMART PCR cDNA Synthesis Kit” from Clontech Inc. in FIG. 11.
  • a template for in vitro transcription is synthesized from the cDNA library (or a part thereof). This is done according to the invention in particular by the fact that the cDNA fragments obtained are cloned into a suitable RNA production vector.
  • the suitable DNA template and plasmids preferred according to the invention have already been mentioned above in connection with the preparation of the mRNA for the pharmaceutical composition according to the invention.
  • step (b) For in vitro transcription of the template prepared in step (b) according to the invention, if it is present as circular plasmid (c) DNA, it is first linearized with a corresponding residual thion enzyme. Preferably, the construct thus cut before the actual in vitro transcription is purified again, for example by appropriate phenol chloroform and / or chloroform / phenol / isoamyl alcohol mixtures. This ensures in particular that the DNA template is present in protein-free form. Next, the synthesis of the RNA proceeds from the purified template.
  • This sub-step is carried out in a reaction mixture containing the linearized, protein-free DNA template in a suitable buffer to which preferably a ribonuclease inhibitor is added using a mixture of the required ribonucleotide triphosphates (rATP, rCTP, rUTP and rGTP) and a sufficient amount of RNA Polymerase, for example T7 polymerase.
  • the reaction mixture is present in RNase-free water.
  • a CAP analogue is added in the actual enzymatic synthesis of RNA.
  • the DNA template is degraded by the addition of RNase-free DNase, which is preferably incubated again at 37 ° C.
  • the RNA thus prepared is precipitated by means of ammonium acetate / ethanol and optionally washed one or more times with RNase-free ethanol. Finally, the thus purified RNA is dried and, in a preferred embodiment, taken up in RNase-free water. In addition, the RNA thus produced can undergo several extractions be subjected to phenol / chloroform or phenol / chloroform / isoamyl alcohol.
  • a so-called subtraction library can also be used as part of the total cDNA library in order to provide the mRNA molecules according to the invention.
  • a preferred portion of the tumor tissue cDNA library encodes the tumor specific antigens.
  • the corresponding antigens are known. It may be first determined (i.e., prior to step (a) of the above-defined method), according to a further preferred embodiment, the portion of the cDNA library which codes for the tumor-specific antigens. This is preferably accomplished by detecting the sequences of the tumor-specific antigens by alignment with a corresponding healthy tissue cDNA library.
  • the comparison according to the invention comprises, in particular, a comparison of the expression patterns of the healthy tissue with that of the tumor tissue in question.
  • Corresponding expression patterns can be determined at the nucleic acid level, for example with the aid of suitable hybridization experiments.
  • the corresponding (m) RNA or cDNA libraries of the tissues can each be separated into suitable agarose or polyacrylamide genes, transferred to membranes and hybridized with corresponding nucleic acid probes, preferably oligonucleotide probes which represent the respective genes become (Northern or Southern Blots).
  • a comparison of the corresponding hybridizations thus provides those genes that are exconcemiert either exclusively by the tumor tissue or in it more.
  • said hybridization experiments are diagnosed by microarrays (one or more microarrays).
  • a corresponding DNA microarray comprises a defined arrangement, in particular in the smallest or smallest space, of nucleic acid, in particular oligonucleotide probes, each probe, for example, in each case one gene whose presence or absence in the corresponding (m) RNA or cDNA Bilhothek is to be examined.
  • a corresponding microarray hundreds, thousands and even tens to hundreds of thousands of genes can be represented.
  • the poly (A + ) RNA or, what is preferred, the corresponding cDNA with a suitable marker, in particular fluorescence markers are used, labeled and brought under suitable hybridization conditions with the microarray in contact. If a cDNA species binds to a probe molecule present on the microarray, in particular an oligonucleotide probe molecule, a more or less pronounced fluorescence signal which can be measured with a suitable detection device, for example a correspondingly designed fluorescence spectrometer, is accordingly observed. The stronger the cDNA (or RNA) species in the library is represented, the greater will be the signal, eg the fluorescence signal.
  • a suitable marker in particular fluorescence markers
  • microarray hybridization experiment (or several or many of them) is carried out separately for the tumor tissue and the healthy tissue.
  • the difference between the signals read out from the microarray experiments therefore suggests that the genes expressed exclusively or increasingly by the tumor tissue.
  • DNA microarray analyzes are, for example, in Schena (2002), Microarray Analysis, ISBN 0-471-41443-3, John Wiley & Sons, Inc., New York , wherein the relevant disclosure of this document is fully incorporated into the present invention.
  • tumor tissue specific expression patterns is by no means limited to analysis at the nucleic acid level.
  • a person skilled in the art will naturally also be familiar with methods known in the prior art which serve for expression analysis at the protein level.
  • techniques of 2D gel electrophoresis and mass spectrometry should be mentioned here, these techniques advantageously also having protein biochips (ie microarrays at the protein level, in which, for example, a protein extract from healthy or tumor tissue with antibodies and / or peptides applied to the microarray substrate brought into contact) can be combined.
  • protein biochips ie microarrays at the protein level, in which, for example, a protein extract from healthy or tumor tissue with antibodies and / or peptides applied to the microarray substrate brought into contact
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight
  • Example 1 Tumor vaccination with RNA in the animal model
  • Captured mRNA encoding a truncated version of the rat Her-2 / neu protein (“ECD-TM neu rat” containing the extracellular domain and the transmembrane region, but not the cytoplasmic region) was amplified using "SP6 mMessagemMachine "(Ambion) with the aid of a plasmid which is substantially the same as shown in FIG. 8, but instead of the 17 promoter contained an SP6 promoter and in which the ECD-TM neu rat construct was inserted after the SP6 RNA polymerase promoter.
  • the prepared mRNA was dissolved in injection buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES) at a concentration of 0.8 mg / ml and mixed with protamine sulfate (Sigma) (1 mg protamine per 1 mg RNA). 50 ⁇ l of this solution was injected into the auricles (25 ⁇ l per ear) of the mice. There were eight injections, one each at ages 6, 8, 13, 15, 20, 22, 27, and 29 weeks. The controls used were mice which were given appropriate injections with injection buffer, with plasmid DNA coding for ECD-TM neu rat or with antisense mRNA corresponding to the mRNA according to the invention.
  • injection buffer 150 mM NaCl, 10 mM HEPES
  • protamine sulfate Sigma
  • mice Female BalB-neu T mice (BalB / c mice expressing rat oncogene Her2 / neu; Rovero et al. (2000) J. Immunol. 165 (9): 5133-5142 ), which spontaneously develop mammary carcinomas, were immunized with RNA encoding a truncated version of the Her-2 / neu protein ("ECD-TM neu rat" containing the extracellular domain and the transmembrane region, but not the cytoplasmic region). The negative control served four mice treated with injection buffer. Another group of three mice were injected for the truncated Her-2 / neu coding DNA.
  • ECD-TM neu rat truncated version of the Her-2 / neu protein
  • mice received the mRNA according to the invention coding for the tumor antigen Her-2 / neu (shortened version ECD-TM, see above).
  • a further control group served four mice injected with the corresponding antisense RNA.
  • a tumor multiplicity of 10 on average was observed after 26 weeks, with all animals having palpable breast tumors at the age of about 20 weeks.
  • a marked slowing of carcinoma formation can be observed; in particular, a tumor multiplicity of 10 is reached only at the age of 30 weeks. Furthermore, the tumor size is reduced (not shown).
  • mice treated with the mRNA according to the invention Of the 4 mice treated with the mRNA according to the invention, one was still tumor-free after 9 months.
  • the group of mice injected with the antisense mRNA all showed tumors at the age of 6 months.
  • the comparison group of mice, those for the shortened version Injection of Her-2 / neu-encoding Plamid DNA also showed a slower carcinoma formation compared to the untreated control group (vgL also with respect to corresponding plasmid DNA experiments with intramuscular injection: Di Carlo et al. (2001) Clin. Cancer Res. 7 (3rd supplement): 830s-837s
  • carcinoma formation was not as much retarded until the 27th week of life as in immunization with mRNA encoding the truncated version of Hei2 / neu according to the invention.
  • the above-mentioned disadvantages in particular the risk of integration of the DNA into the genome, the formation of anti-DNA antibodies, etc. to be considered.
  • mice 6-10 week old BALB-c AnNCrlBR (H-2 d ) mice (female) were purchased from Charles River (Sulzfeld, Germany).
  • laevis was transformed into the plasmid pT7TS (PA Creek, Austin, TX), to produce the plasmid pT7TS-kozak-5'beta.gl-lacZ-3'beta.glA30C30 (cf. Hoerr et al. (2000) Eur. J. Immonol 30: 1-7 ).
  • the general structure of the plasmid pT / TS with the flanking 5'- and 3'-untranslated sequences from the beta globin gene of X. Laevis is shown schematically in FIG.
  • the plasmid thus prepared was linearized with Pst I and transjugated in vitro using the m-MessagemMachine T7 kit (Ambion, Austin, TX USA).
  • the RNA thus prepared was purified by LiCl precipitation, phenol / chloroform extraction and ammonium acetate precipitation cleaned.
  • the purified RNA was finally resuspended at a concentration of 0.5 mg / ml in injection buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES).
  • P815 and P13.1 cells were transfected into RPMI 1640 (Bio-Whittaker, Verviers, Belgium) supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (PAN systems, Germany), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml Penicillin and 100 mg / ml streptomycin, cultured.
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • CIL cultures were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 0.05 ⁇ M beta-mecraptoethanol, 50 mg / ml gentamycin, MEM.
  • FCS fetal calf serum
  • B-Glycylcholine 100 U / ml penicillin
  • 100 mg / ml streptomycin 100 mg / ml streptomycin
  • beta-mecraptoethanol 50 mg / ml gentamycin
  • MEM Non Essential Amino Assids (100x) and 1mM sodium pyruvate.
  • CTL were restimulated for 1 week with 1 mg / ml beta galactosidase protein (Sigma, Taufkirchen, Germany).
  • 4 ml of culture supernatant was carefully pipetted off and replaced with fresh medium containing 10 U /
  • mice 3 BALB / c mice per group were anesthetized with 20 mg pentobarbital ip per mouse. Mice were then injected id into both auriculae 25mg of beta-galactosidase (beta-gal) -coding mRNA injection buffer (150mM NaCl, 10mM HEPES). In some cases, additional granomycete macrophage colony stimulation factor (GM-CFS) was added to the same site 24 hours or 2 hours before or 24 hours after RNA injection, or to an injection site (in the auricle or sc in the back ), injected.
  • beta-gal beta-galactosidase
  • mRNA injection buffer 150mM NaCl, 10mM HEPES
  • GM-CFS granomycete macrophage colony stimulation factor
  • mice were each injected with 10 mg of a beta-gal-encoding DNA plasmid in PBS id in both auriculae.
  • a boost injection was performed in the same manner as in the first injection.
  • blood was taken, the mice were sacrificed, and the spleen removed.
  • Splenocytes obtained from the spleen were stimulated with beta-gal protein in vitro , and CTL activity was confirmed after 6 days using a standard 51- hr 51 Cr test, as described in US Pat Rammensee et al. (1989) Immunogenetics 30: 296-302 , described, determined. Briefly, target cells were labeled with 51 Cr and loaded with the peptide TPHPARIGL for 20 min at room temperature.
  • the plates were saturated with 200 ml blocking buffer (0.05% Twen 20.1% BSA in PBS) for 2 h at 37 ° C. After washing three times with washing buffer, 100 ml of cell culture supernatants were incubated for 5 h at 37 ° C. The plates were then washed four times with wash buffer and 100 ml of biotinylated anti-mouse anti-IFN gamma or IL-4 detection antibodies (Becton Dickenson, Heidelberg, Germany) per well at a concentration of 0.5 mg / ml in blocking buffer and incubated for 1 h at room temperature.
  • mice Two weeks after the boost injection, the mice were bled via the orbital vein and blood serum was produced.
  • coating buffer 0.05 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , pH 7.5
  • the plates were then washed three times with 200 ml wash buffer (0.05M Tris-HCl, 0.15M NaCl, 0.01M MEDTA, 0.1% Tween 20, 1% BSA, pH 7.4) and 200, ml Wash buffer saturated with protein overnight at 4 ° C.
  • the plates were washed three times with washing buffer and blood sera added at 1/10, 1/30 and 1/90 dilution in washing buffer, respectively. After 1 h at 37 ° C, the plates were washed three times with washing buffer and 100 ml of 1/1000 dilutions of goat anti-mouse IgG1 or IgG2a antibodies (Caltag, Burlington, CA) were added , After 1 h at room temperature, the wells were washed three times with wash buffer and 100 ml of ABTS substrate per well was added. After 15-30 min at room temperature, the absorbance at 405 nm was measured with a Sunrise ELISA reader (Tecan, Crailsheim, Germany).
  • RNA coding for beta-galactosidase into mice auricles leads to an anti-beta-galactosidase immune response, essentially of the Th2 type: a production of anti-beta IG1-type galactosidase immunoglobulins (Figure 3A) and secretion of IL-4 ( Figure 2 B) in beta-galactosidase-stimulated splenocytes from mice injected with beta-galactosidase-encoding RNA.
  • Figure 3A anti-beta IG1-type galactosidase immunoglobulins
  • IL-4 Figure 2 B
  • GM-CFS can enhance the immune response elicited by RNA vaccination.
  • the injection of GM-CFS one day before the injection of RNA shows little effect on the strength or type of immune response.
  • GM-CFS when GM-CFS is injected one day after the RNA vaccine into the same site or in a remote site (not shown), the immune response is not only enhanced overall (see the antibody response of Figure 3) but the immune response is polarized to the Th1 type (compare IFN-gamma production by beta-gal protein-stimulated splenocytes according to Fig. 2A, the production of IgG2a antibodies to beta-Gal according to Fig. 3B and the production of activated CIL according to Fig . 1).
  • the injection of GM-CFS a few minutes or a few hours after the RNA injection should give the same effect (amplification and polarization) of the immune response.
  • mice Naked or protamine-associated mRNA encoding beta-galactosidase (prepared as described in Example 2) was added to the auricles of mice in an amount of 25 mg RNA in injection buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES). injected. Further mice were injected with the beta-galactosidase-encoding mRNA together with 10 U of the RNase inhibitor RNasin (a pancreatic-extracted RNase enzymatic inhibitor available from Roche or Promega). The RNase inhibitor was immediately mixed with the RNA solution before injection. After 12 hours, the ears were removed from the mice. Microscopic thin sections of the Auriculare were prepared and stained with X-Gal.
  • RNasin pancreatic-extracted RNase enzymatic inhibitor available from Roche or Promega
  • Example 4 RNA vaccination in patients with malignant diseases
  • Cytotoxic T lymphocytes recognize antigens as short peptides (8-9 amino acids) that are expressed on MHC class I glycoproteins bound to the cell surface (1). These peptides are fragments of intracellular protein molecules.
  • antigens taken up exogenously by macropinocytosis or phagocytosis can lead to the CD8 + T-cell-mediated immune response.
  • the proteins are cleaved into proteosomes, the resulting peptides are transported from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum and bound to MHC class I molecules.
  • the proteins thus processed are transported to the cell surface as a peptide / MHC class I complex and presented to the CTL. This process takes place in each cell, allowing the immune system to closely monitor each individual cell for the presence of altered or embryonic proteins, whether derived from intracellular pathogens, oncogenes or dysregulated genes. As a result, cytotoxic lymphocytes are able to recognize and lyse infected or neoplastic cells (2,3).
  • TAA tumor-associated antigens
  • APC antigen presenting cells
  • Vaccination therapies may also result in the selection of tumor cells, allowing escape from the immune system and progression of the disease despite therapy.
  • the use of several different tumor antigens as provided in the treatment plan of the present example according to the invention is intended to prevent selection of tumor cells and escape of the malignant cells from the immune system by antigen loss.
  • a treatment scheme according to the invention for the tumor vaccination of patients with advanced malignant diseases is provided.
  • IMP influenza matrix protein
  • the tumor antigens mentioned are expressed on the malignant cells of mammary, ovarian, colorectal, pancreatic and renal cell carcinomas.
  • the laboratory-prepared RNA species encoding CEA, MUC1, Her-2 / neu, telomerase, Mage-1 and IMP are initially id Administered 4 times on days 0,14, 28 and 42.
  • the patients in each case one day after the RNA-vaccination GM-CSF (Leucomax ®, 100 ug / m 2, Novartis / Essex Pharma) administered sc.
  • the treatment according to the invention is an immunization approach which requires only minimal intervention in the patient (injection).
  • the therapy is performed on an outpatient basis and is suitable for many tumor patients without the restriction to specific HLA types or defined T-cell epitopes.
  • polyclonal CD4 + T helper as well as CD8 + CIL can be induced by this therapy.
  • RNAs for several tumor antigens are administered to patient id on days 0,14,28 and 42.
  • the patients receive respectively one day after the RNA-vaccination GM-CSF (Leucomax ® (100 g / m 2) Novartis / Essex Pharma) sc.
  • GM-CSF Leucomax ® (100 g / m 2) Novartis / Essex Pharma) sc.
  • GM-CSF Leucomax ® (100 g / m 2) Novartis / Essex Pharma
  • RNA production unit For the production of a vaccine based on mRNA, only chemically syndtetisiene and bacteria-based Vottren required This is preferably accomplished in a specially equipped RNA production unit. This is located in a closed space, which is declared as RNase-free zone, ie work with RNase (eg, that of plasmids) should not be performed. Likewise, the contamination with natudich vodoommenden RNasen is constantly checked.
  • RNA production unit is used exclusively for enzymatic production ( In vitro transcription of mRNA used (without bacterial, viral or cell culture work) includes a sterile RNA solution in HEPES / NaCl buffer. Quality analyzes are performed on a Klarmaldehyd agarose gel. In addition, the RNA concentration and the proportion of proteins are determined photometrically (OD 320 ⁇ 0.1, ratio of OD 260 / OD 280. > 1.8 in the case of pure RNA). Possible contamination by LPS is analyzed in the LAL test. All RNA samples are sterile filtered before administration.
  • the selected genes (CEA, Mucin1, Her-2 / neu, telomerase, Mage-Al and Influenza matrix) are amplified by PCR using a thermostable high-performance enzyme (pfu, Stratagene).
  • the genes are derived from tumor cDNA (mucin1, Hec2 / neu, telomerase), or they have been cloned into bacterial vectors (influenza matrix and MAGE-A1).
  • the PCR fragments are cut with restriction enzymes (Mucin1: BglII-SpeI; Her-2 / neu: HinDIIIblunt-SpeI; Telomerase: BglII-SpeI; MAGE-A1: BamHI-SpeI; Influenza matrix protein: BglII-SpeI) and into the T7TS plasmid (see Fig. 8) via the BglII and SpeI restriction sites cloned. High purity plasmids are obtained via the Endo-free Maxipreparation Kit (Qiagen, Hilden, Germany). The sequence of the vector is monitored and documented by double-stranded sequencing from the T7 promoter to the PstI site.
  • Plasmids whose inserted gene sequence is correct and without mutations are used for in vitro transcription. (Control over the published sequences: accession numbers: M11730 for Her-2 / neu, NM_002456 for MUC1, NM_003219 for Telomerase TERT, V01099 for Influenza Matrix and M77481 for MAGE-A1).
  • each plasmid 500 ⁇ g of each plasmid are linearized in a volume of 0.8 ml by digestion with the restriction enzyme PstI in a 2 ml Eppendorf reaction vessel. This cut construct is transferred to the RNA production unit. 1 ml of a mixture of phenol / chloroform / isoamyl alcohol is added to the linearized DNA. The reaction tube is vortexed for 2 minutes and centrifuged for 3 minutes at 15,000 rpm.
  • the aqueous phase is taken off and mixed with 0.7 ml of 2-propanol in a 2 ml reaction vessel. This vessel is centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, the supernatant discarded and 1 ml of 75% ethanol added. The reaction vessel is centrifuged for 10 minutes at 15,000 rpm and the ethanol is removed. The vessel is again centrifuged for 2 minutes, and the remainder of the ethanol is removed with a microliter pipette tip. The DNA pellet is then dissolved in 1 ⁇ g / ml in RNase-free water.
  • reaction mixture 100 ⁇ g linearized protein-free DNA, 1 ml 5x buffer (200 mM Tris-HCl (pH 7.9), 30 mM MgCl 2 , 10 mM spermidine, 50 mM NaCl, 50 mM DTI), 2001 Ribonuclease (RNase) inhibitor (recombinant, 5000 U), 1 ml rNTP mix (each 10 mM ATP, CTP, UIP, 2 mM GTP), 1 ml CAP analog (8 mM), 150 ⁇ l T7 Polymense (3000 U) and 2 , 55 ml RNase-free water.
  • RNase Ribonuclease
  • the total volume is 5 mL
  • the mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C in a heating block. Thereafter, 100 U of RNase DNase are added and the mixture is again incubated for 30 minutes at 37 ° C. In this case, the DNA template is degraded enzymatically.
  • T7 polymerase purified from an E. Coli strain containing a plasmid with the gene for the polymerase. This RNA polymerase uses as substrate only 17 promoter phage sequences; Fa. Fennentas. NTPs: chemically synthesized and purified by HPLC. Purity over 96%; Fa. Fermentas. CAP analogue: chemically synthesized and purified by HPLC. Purity over 90%; Institute of Organic Chemistry, University of Tübingen. RNase inhibitor: RNasin, for injection, produced recombinantly ( E. coli ); Fa. Promega. DNase: Pulmozyme • ("dornase alfa"); Fa. Roche
  • the DNase-treated RNA is mixed with 20 ml of a solution of 3.3 ml of 5 M NH4OAc plus 16.65 ml of ethanol.
  • the mixture is incubated for 1 hour at -20 ° C and centrifuged at 4000 rpm for 1 hour.
  • the supernatant is removed and the pellet washed with 5 ml of 75% RNase-free ethanol.
  • the vessel is again centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes and the supernatant removed.
  • the vessel is again centrifuged under the previous conditions and the remaining ethanol removed with a microliter pipette tip.
  • the reaction vessel is opened and the pellet is dried under a sterile bench in a sterile environment.
  • RNA 1 ml of RNase-free water is added to the dried RNA.
  • the pellet is incubated at 4 ° C for at least 4 hours.
  • 2 ⁇ l of the aqueous solution is subjected to a quantitative analysis (determination of UV absorption at 260 nm).
  • 2 ml of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution are added to 1 ml of aqueous RNA solution.
  • the mixture is vortexed for 2 minutes and centrifuged at 4000 rpm for 2 minutes.
  • the aqueous phase is removed with a microliter pipette and transferred to a new reaction vessel. 4 ml of a solution of 0.66 ml of 5 MNH4OAc plus 3.33 ml of ethanol are added.
  • the mixture is incubated for 1 hour at -2o ° C and centrifuged at 4000 rpm for 1 hour. The supernatant is removed and the pellet washed with 75% RNase free ethanol. The vessel is again centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes and the supernatant is removed. The vessel is again centrifuged under the previous conditions and the remaining ethanol removed with a microliter pipette tip. The reaction vessel is opened and dried under a sterile bench, the pellet in a sterile environment.
  • RNA is dissolved in RNase-free water and adjusted to a concentration of 10 mg / ml. It is incubated for 12 hours at 4 ° C. By adding injection buffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES), a final concentration of 2 mg / ml is achieved.
  • injection buffer 150 mM NaCl, 10 mM HEPES
  • the final product is preferably sterile filtered under GMP conditions before use.
  • Each patient receives an intradermal (id) injection of 150 ⁇ L each of the injection solution at two different sites, each containing 100 ⁇ g of antigen-encoding mRNA (CEA, Her-2 / neu, MA-GE-A1, mucin 1, telomerase , Influenza matrix protein) is dissolved.
  • CEA antigen-encoding mRNA
  • MA-GE-A1 mucin 1, telomerase , Influenza matrix protein
  • a booster immunization is performed every 14 days to repeat the vaccinations on a monthly basis.
  • GM-CSF subcutaneous (s.c.) GM-CSF (Leucomax®, Sandoz / Essex Pharma).
  • the induction of tumor-specific T cells and a measurable tumor emission is used.
  • the parameters considered are in vitro and in vivo measured T cell reactions as well as size changes of bidimensionally detectable tumor manifestations or laboratory chemical parameters.
  • the objective remission is defined as the best response in the form of a complete or partial response, according to the criteria listed below.
  • the remission rate is calculated as the ratio of the number of patients with objective remission and the total number of evaluable patients.
  • a change in immune status as determined by immunotyping of peripheral mononuclear cells, increase in antigen-specific CIL precursor frequency in peripheral blood, and induction of sustained tumor-specific T-cell activity are assessed.
  • in vitro induction cultures for the activation of tumor-specific CTL are established.
  • Example 5 Incubation with autologous, amplified tumor RNA in patients with malignant melanoma
  • TAA tumor-associated antigens
  • Dendritic cells have been shown to be potent antigen presenting cells that result in two ways to the induction of the immune response: the first is the direct presentation of peptides to CD8 + - T-lymphocytes and their activation (Schuler & Steinmann, 1985; Inaba, et al., 1987; Romani et al., 1989), the second is the generation of a protective immune response mediated by CD4 + helper lymphocytes, which presupposes a presentation of peptides via MHC class II molecules (Grabbe et al., 1991, 1992, 1995).
  • TAA tumor-associated antigens
  • RNA over peptides can be processed and presented from a TAA-encoding mRNA.
  • a polyvalent vaccine By such a polyvalent vaccine, the probability of the occurrence of so-called clonal "tumor escape" phenomena can be significantly reduced.
  • this approach can induce T-cell mediated immune responses to naturally processed and presented antigens with potentially higher immunodominance.
  • MHC class II restricted epitopes By additional involvement of MHC class II restricted epitopes, the induced tumor-specific immune response can be enhanced and maintained longer. Nevertheless, this method is because of the necessary cultivation of autologous DCs feasible only with high laboratory costs (GMP conditions).
  • RNA expression profile present in the patient's autologous tumor. This takes into account the specific tumor profile of the patient, including unknown TAAs in the vaccine. The time-consuming cultivation of the DC is eliminated since RNA (no transfected DCs) is used in the vaccination.
  • a vaccine therapy using amplified autologous tumor RNA is provided to patients with metastatic malignant melanoma, in particular stage III / IV.
  • a tumor-specific cytotoxic T cells are induced in vivo in order to achieve a clinical-therapeutic effect (tumor response). It is an immunization approach that requires minimal intervention in the patient (injection).
  • the therapy can be done on an outpatient basis and is suitable for many tumor patients without the restriction to specific HLA types or defined T-cell epitopes.
  • polyclonal CD4 + T helper as well as CD8 + CIL can be induced by this therapy.
  • consideration of hitherto unknown TAAs in the vaccination protocol, as well as the exclusive use of autologous material is particularly advantageous.
  • the amplified autologous tumor RNA is administered to patient id on days 0, 14, 28 and 42.
  • the patients receive respectively one day after the RNA-vaccination GM-CSF (Leucomax® 100 ⁇ g / m 2, Novartis / Essex) sc
  • GM-CSF Leucomax® 100 ⁇ g / m 2, Novartis / Essex
  • tumor response was assessed by staging (including sonography, chest X-ray, CT, etc., see below) and by evaluating the immunological parameters induced by the therapy.
  • Patients receive vaccinations every 4 weeks if the disease is stable or if the tumor response is objective (CR or PR). Further restaging examinations can be provided, for example, on day 126, then at intervals of 12 weeks.
  • the treatment plan is shown schematically in FIG.
  • the aim is the production of autologous poly (A + ) RNA.
  • poly (A + ) RNA is isolated from the patient's own tumor tissue. This isolated RNA is intrinsically very unstable and limited in amount. Therefore, the genetic information is conserved in a much more stable cDNA library and thus. Based on the patient's own cDNA library, stabilized autologous RNA can be produced throughout the treatment period.
  • the procedure according to the invention is shown schematically in FIG.
  • RNA isolation For the isolation of total RNA from a tumor tissue biopsy, a method of Roche AG is used. The High Pure RNA Isolation Kit (order no 1828665) according to the manufacturer's instructions. Poly (A + ) RNA is isolated from the total RNA by another method of Roche AG with the High Pure RNA Tissue Kit (Order No. 2033674).
  • the cDNA library is constructed with the "SMART PCR cDNA Synthesis Kit” (Clontech Inc., USA, order number PT3041-1) according to the manufacturer's instructions.
  • the single-stranded poly (A + ) RNA is reverse transcribed via a special primer.
  • a poly-C overhang at the 3 'end of the newly synthesized DNA can be used to hybridize a further primer, via which the construct can be amplified by PCR.
  • the double-stranded cDNA fragments are available for cloning into a suitable RNA production vector (eg, pT7TS, see Fig. 8).
  • the cDNA-PCR fragments are cut with the restriction enzymes NotI and SpeI and cloned into the corresponding restriction sites of the pT7TS vector analogously to the procedure given in Example 4.
  • High purity plasmids are obtained via the Endo-free Maxipreparation Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Plasmids whose cloned gene sequence corresponds to the expected size fractionation (200bp-4000bp) of the cDNA library are used for in vitro transcription.
  • An example of a separation of a representative cDNA library in an agarose gel is shown in FIG.
  • the relative abundance of antigen-specific CTL precursor cells in the peripheral blood of the patient is measured over the course of the vaccine therapy.
  • FACS analyzes are used to quantify CTL progenitor cells that are directed against antigens expressed to a particular extent by melanoma cells (tyrosinase, MAGE-3, melan-A, GP100).
  • melanoma cells thyroid-derived cells
  • ELIspot investigations are carried out, which are designed so that in addition CTL precursor cells are detected, which are specifically directed against previously unknown antigens.
  • autologous dendritic cells which are cultured from the peripheral blood of the patients, are incubated with the same RNA with which the vaccine was also carried out. These then serve as stimulator cells in the ELIspot study. The measurement thus covers the entire vaccine spectrum.
  • immunosupport blood sampling may be provided as part of the staging tests and additionally on days 0,14, 28 and 42 of a total of 30 ml (20 ml ELIspot, 10 ml FACS analysis) and a one-time decrease of 100 ml on day 70 to raise the DC.
  • skin biopsy samples from the injection site can be obtained for histological examination for T cell infiltration.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine mRNA, umfassend mindestens einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierenden Bereich, in Verbindung mit einem wässrigen Lösungsmittel und vorzugsweise einem Cytokin, bspw. GM-CSF, und ein Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dient insbesondere der Therapie und/oder Prophylaxe gegen Krebs.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine mRNA, umfassend mindestens einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierenden Bereich, in Verbindung mit einem wässtigen Lösungsmittel und vorzugsweise einem Cytokin, bspw. GM-CSF, und ein Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dient insbesondere der Therapie und/odet Prophylaxe gegen Krebs.
  • Die Gentherapie und die genetische Vakzinierung sind molekularmedizinische Verfahren, deren Anwendung in der Therapie und Prävention von Erkrankungen erhebliche Auswirkungen auf die medizinische Praxis haben wird. Beide Verfahren beruhen auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. in Gewebe des Patienten sowie auf der anschließenden Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren codierten Information, d.h. der Expression der erwünschten Polypeptide.
  • Die übliche Vorgehensweise bisheriger Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung ist die Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzuschleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Calciumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion und Lipofektion, entwickelt worden, wobei sich insbesondere die Lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat.
  • Ein weiteres Verfahren, das insbesondere bei genetischen Vakzinierungsverfahren vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren haben den Vorteil, daß aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate zu erzielen ist. Die verwendeten Viren werden genetisch verändert, so daß in der transfizierten Zelle keine funktionsfähigen infektiösen Partikel gebildet werden. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme kann jedoch aufgrund möglicher Rekombinationsercignisse ein gewisses Risiko der unkontrollierten Ausbreitung der eingebrachten gentherapeutisch wirksamen sowie viralen Gene nicht ausgeschlossen werden.
  • Üblicherweise wird die in die Zelle eingebrachte DNA in gewissem Ausmaß in das Genom der transfizierten Zelle integriert. Einerseits kann dieses Phänomen einen erwünschten Effekt ausüben, da hierdurch eine langandauernde Wirkung der eingebrachten DNA erzielt werden kann. Andererseits bringt die Integration in das Genom ein wesentliches Risiko der Gentherapie mit sich. So kann es bspw. zu einer Insertion der eingebrachten DNA in ein intaktes Gen kommen, was eine Mutation darstellt, welche die Funktion des endogenen Gens behindert oder gar vollkommen ausschaltet. Durch solche Integrationsereignisse können einerseits für die Zelle lebenswichtige Enzymsysteme ausgeschaltet werden, andererseits besteht auch die Gefahr einer Transformation der so veränderten Zelle in einen entarteten Zustand, falls durch die Integration der Fremd-DNA ein für die Regulation des Zellwachstums entscheidendes Gen verändert wird. Daher kann bei der Verwendung von DNA-Viren als Gentherapeutika und Vakzine ein Risiko der Krebsbildung nicht ausgeschlossen werden. In diesem Zusammenhang ist auch zu beachten, daß zur wirksamen Expression der in die Zelle eingebrachten Gene die entsprechenden DNA-Vehikel einen starken Promotor, bspw. den viralen CMV-Promotor, enthalten. Die Integration derartiger Promotoren in das Genom der behandelten Zelle kann zu unerwünschten Veränderungen der Regulierung der Genexpression in der Zelle führen.
  • Ein weiterer Nachteil der Verwendung von DNA als Gentherapeutika und Vakzine ist die Induktion pathogener Anti-DNA-Antikörper im Patienten unter Hervorrufung einer möglicherweise tödlichen Immunantwort.
  • Im Gegensatz zu DNA ist der Einsatz von RNA als Gentherapeutikum oder Vakzin als wesentlich sicherer einzustufen. Insbesondere bringt RNA nicht die Gefahr mit sich, stabil in das Genom der transfizierten Zelle integriert zu werden. Des weiteren sind keine viralen Sequenzen, wie Promotoren, zur wirksamen Transkription, erforderlich. Darüber hinaus wird RNA wesentlich einfacher in vivo abgebaut. Wohl aufgrund der gegenüber DNA relativ kurzen Halbwertszeit von RNA im Blutkreislauf sind bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen worden. Daher kann RNA für molekularmedizinische Therapieverfahren als Molekül der Wahl angesehen werden.
  • Allerdings bedürfen auf RNA-Expressionssystemen beruhende medizinische Verfahren vor einer breiteren Anwendung noch der Lösung einiger grundsätzlicher Probleme. Eines der Probleme bei der Verwendung von RNA ist der sichere, Zell- bzw. Gewebe-spezifische effiziente Transfer der Nukleinsäure. Da sich RNA in Lösung normalerweise als sehr Instabil erweist, konnte durch die herkömmlichen Verfahren, die bei DNA verwendet werden, RNA bisher nicht oder nur sehr ineffizient als Therapeutikum bzw. Impfstoff verwendet weiden.
  • Für die Instabilität sind RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonucleasen), verantwortlich. Selbst kleinste Verunreinigungen von Ribonucleasen reichen aus, um RNA in Lösung vollständig abzubauen. Der natürliche Abbau von mRNA im Cytoplasma von Zellen ist sehr fein reguliert. Diesbezüglich sind mehrere Mechanismen bekannt. So ist für eine funktionale mRNA die endständige Struktur von entscheidender Bedeutung Am 5'-Ende befindet sich die sogenannte "Cap-Struktur" (ein modifiziertes Guanosin-Nucleotid) und am 3'-Ende eine Abfolge von bis zu 200 Adenosin-Nucleotiden (der sog. Poly-A-Schwanz). Über diese Strukturen wird die RNA als mRNA erkannt und der Abbau reguliert. Darüber hinaus gibt es weitere Prozesse, die RNA stabilisieren bzw. destabilisieren. Viele diese Prozesse sind noch unbekannt, oftmals scheint jedoch eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich zu sein. Bspw. wurde kürzlich ein "mRNA-Surveillance-System" beschrieben (Hellerin und Parker, Annu. Rev. Genet. 1999, 33: 229 bis 260), bei dem durch bestimmte Feedhack-Protein-Wechselwirkungen im Cytosol unvollständige oder Nonsense-mRNA erkannt und dem Abbau zugänglich gemacht wird, wobei ein Hauptteil dieser Prozesse durch Exonucleasen vollzogen wird.
  • Im Stand der Technik sind einige Maßnahmen vorgeschlagen worden, um die Stabilität von RNA zu erhöhen und dadurch ihren Einsatz als Gentherapeutikum bzw. RNA-Vakzine zu ermöglichen.
  • In EP-A-1083232 wird zur Lösung des vorstehend genannten Problems der Instabilität von RNA ex vivo ein Verfahren zur Einbringung von RNA, insbesondere mRNA, in Zellen und Organismen vorgeschlagen, bei welchem die RNA in Form eines Komplexes mit einem kationischen Peptid oder Protein vorliegt.
  • WO 99/14346 beschreibt weitere Verfahren zur Stabilisierung von mRNA. Insbesondere werden Modifizierungen der mRNA vorgeschlagen, welche die mRNA-Spezies gegenüber dem Abbau von RNasen stabilisieren. Derartige Modifikationen betreffen einerseits die Stabilisierung durch Sequenzmodifikationen, insbesondere Verminderung des G und/oder U-Gehalts durch Baseneliminierung oder Basensubstitution. Andererseits werden chemische Modifikationen, insbesondere die Verwendung von Nucleotidanaloga, sowie 5'- und 3'- Blockierungsgruppen, eine erhöhte Länge des Poly-A Schwanzes sowie die Komplexierung der mRNA mit stabilisierenden Mitteln und Kombinationen der genannten Maßnahmen vorgeschlagen.
  • In den US-Patenten US 5,580,859 und US 6,214,804 werden unter anderem im Rahmen der "transienten Gentherapie" (TGT) mRNA-Vakzine und -Therapeutika offenbart. Es werden verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Translationseffizienz und der mRNA-Stabilität beschrieben, die sich vor allem auf die nicht-translatierten Sequenzbereiche beziehen.
  • Bieler und Wagner (in : Schleef (Hisg.), Plasmids for Therapy and Vaccination, Kapitel 9, Seiten 147 bis 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) benichten von der Verwendung synthetischer Gene im Zusammenhang mit gentherapeutischen Methoden unter Verwendung von DNA-Vakzinen und lentiveralen Vektoren. Es wird die Konstruktion eines synthetischen, von HIV-1 abgeleiteten gag-Gens beschrieben, bei welchem die Codons gegenüber der Wildtyp-Sequenz derart modifiziert wurden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage"), daß sie der Verwendung von Codons entsprach, die in hoch exprimierten Säugergenen zu finden ist. Dadurch wurde insbesondere der A/T-Gehalt gegenüber der Wildtyp-Sequenz vermindert. Die Autoren stellen insbesondere eine erhöhte Expressionsrate des synthetischen gag-Gens in transfizierten Zellen fest. Des weiteren wurde in Mäusen eine erhöhte Antikörperbildung gegen das gag-Protein bei mit dem synthetischen DNA-Konstrukt immunisierten Mäusen und auch eine verstärkte Cytokinfreisetzung in vitro bei transfizierten Milzzellen von Mäusen beobachtet. Schließlich konnte eine Induzienmg einer cytotoxischen Immunantwort in mit dem gag-Expressionsplasmid immunisierten Mäusen festgestellt werden. Die Autoren dieses Artikels führen die verbesserten Eigenschaften ihres DNA-Vakzins im wesentlichen auf einen durch die optimierte Codonverwendung hervorgerufene Veränderung des nucleocytoplasmatischen Transports der vom DNA-Vakzin exprimierten mRNA zurück. Im Gegensatz dazu halten die Autoren die Auswirkung der veränderten Codonverwendung auf die Translationseffizienz für gering.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Gentherapie und genetischen Vakzinierung für Tumoren bereitzustellen, das die mit den Eigenschaften von DNA- Therapeutika und-Vakzinen verbundenen Nachteile überwindet.
  • Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelost.
  • Insbesondere wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, enthaltend mindestens eine mRNA, umfassend mindestens einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierenden Bereich, in Verbindung mit einem wässerigen Lösungsmittel.
  • Der Begriff "Antigen aus einem Tumor" bedeutet dass das entsprechende Antigen in mit einem Tumor assozierten Zellen exprimiert wind. Daher sind erfindungsgemäß Antigene aus Tumoren insbesondere solche, die in den entarteten Zellen selbst produziert werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um auf der Oberfläche der Zellen lokalisierte Antigene. Des Weiteren sind die Antigene aus Tumoren aber auch solche, die in Zellen exprimiert werden, welche nicht selbst (oder ursprünglich nicht selbst) entartet sind (waren), jedoch mit dem in Rede stehenden Tumor assoziiert sind. Dazu gehören bspw. auch Antigene, die mit Tumor-versorgenden Gefäßen bzw. deren (Neu-)Bildung zusammenhangen, insbesondere solche Antigene, die mit der Neovaskularisierung oder Angiogenese assoziiert sind, bspw. Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF, usw. Weiterhin umfassen derartige mit einem Tumor zusammenhängende Antigene solche aus Zellen des den Tumor einbettenden Gewebes. Zu nennen sind hier entsprechende Antigene von Bindegewebszellen, z.B. Antigene der extrazellulären Matrix.
  • Erfindungsgemaß wird in der pharmazeutischen Zusammensetzung eine (oder mehrere) mRNAs zur Therapie bzw Impfung, d.h. Vakzinierung, zur Behandlung oder Prävention (Prophylaxe) von Krebs verwendet. Die Vakzinienmg beruht auf der Einbringung eines Antigens (oder mehrerer Antigene) eines Tumors, im vorliegenden Fall der genetischen Information für das Antigen in Form der für das oder die Antigen(e) codierenden mRNA, in den Organismus, insbesondere in die Zelle. Die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene mRNA wird in das (Tumor-)Antigen translatiert, d.h. das von der modifizierten mRNA codierte Polypeptid bzw. antigene Peptid wird exprimiert, wodurch eine gegen dieses Polypeptid bzw. antigene Peptid gerichtete Immunantwort stimuliert wird. Im vorliegenden Fall der Verwendung als genetische Vakzine zur Behandlung von Krebs wird daher die Immunantwort durch Einbringung der genetischen Information für Antigene aus einem Tumor, insbesondere Proteine, die ausschließlich auf Krebszellen exprimiert werden, erreicht, in dem eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, die eine für ein derartiges Krebsantigen codierende mRNA enthält. Dadurch wird das oder die Krebsantigen(e) im Organismus exprimiert, wodurch eine Immunantwort hervorgerufen wird, die wirksam gegen die Krebszellen gerichtet ist.
  • In ihrer Verwendung als Vakzine komint die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere zur Behandlung von Krebserkrankungen (wobei die mRNA vorzugsweise für ein tumorspezifisches Oberflächenantigen (TSSA) codiert), bspw. zur Behandlung von malignern Melanom, Kolon-Karzinom, Lymphomen, Sackomen, kleinzelligem Lungenkarzinom, Blastomen usw., in Betracht. Spezifische Beispiele von Tumorantigenen sind u.a. 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 und WT1.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das oder sind die Antigen(e) aus einem Tumor ein Polyepitop des/der Antigens/Antigene aus einem Tumor. Ein "Polyepitop" eines Antigens bzw. mehrerer Antigene ist eine Aminosäuresequenz, in der mehrere oder viele Regionen des/der Antigens/Antigene repräsentiert sind, die mit dem Antigenbindenden Teil eines Antikörpers oder mit einem T-Zell-Rezeptor in Wechselwirkung treten. Das Polyepitop kann dabei vollständig und unmodifiziert vorliegen. Es kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Optimierung der Antikörper/Antigen- bzw. T-Zell-Rezeptor/Antigen-Wechselwirkung, auch modifiziert vorliegen. Eine Modifikation gegenüber dem Wildtyp-Polyepitop kann bspw. eine Deletion, Addition und/oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste umfassen. Dementsprechend wird/werden in der für das modifizierte Polyepitop codierenden mRNA der vorliegenden Erfindung gegenüber der für das Wildtyp-Polyepitop codierenden mRNA ein oder mehrere Nucleotide entfernt, hinzugefügt und/oder ersetzt.
  • Um die Stabilität der in der pharmazeutischen Zusammensetzung dervorliegenden Erfindung enthaltene (m)RNA zu erhöhen, weist vorzugsweise jede in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene (m)RNA eine oder mehrere Modifikationen, insbesondere chemische Modifikationen, auf, welche zur Erhöhung der Halbwertszeit der (m)RNA (eine oder mehrere) im Organismus beitragen bzw. den Transfer der (m)RNA (eine oder mehrere) in die Zelle verbessern.
  • Beispielsweise gibt es in den Sequenzen eukaryotischer mRNAs destabilisierende Sequenzelemente (DSE), an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der mRNA in vivo regulieren. Daher werden zur weiteren Stabilisierung der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bevorzugt enthaltenen modifizierten mRNA gegebenenfallss im für das mindestens eine Antigen aus einem Tumor codierenden Bereich ein oder mehrere Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen, so daß keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene DSE aus der mRNA zu eliminieren.
  • Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83:1670 bis 1674). Die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen RNA-Moleküle sind daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, daß sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweisen. Dies gilt auch für solche Sequenzmotive, die von möglichen Endonucleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor codierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994,13:1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der modifizierten mRNA der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eliminiert.
  • Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die zur Substitution von Codons in der erfindungsgemäßen modifizierten mRNA geeignet sind. Im Falle kürzerer codierender Bereiche (die für biologisch wirksame oder antigene Peptide codieren) kann bspw. die gesamte mRNA chemisch unter Verwendung von Standardtechninken synthetisiert werden.
  • Bevorzugt werden allerdings Basensubstitutionen unter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der modifizierten mRNA mit Hilfe von Techniken der gängigen züelgerichteten Mutagenese eingeführt; Maniatis et aL, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl., Cold Spring Harbor, NY, 2001.
  • Bei diesem Verfahren wird zur Herstellung der mRNA daher ein entsprechendes DNA. Molekül in vitro transkribiert. Diese DNA-Matrize besitzt einen geeigneten Promotor, bspw. einen T7 -oder SP6-Promotor, für die in vitro Transkription, dem die gewünschte Nucleotidsequenz für die hetzustellende mRNA und ein Termisationssignal für die in in vitro Transkribtion folgen. Erfindungsgemäß wird das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden RNA-Konstrukts bildet, durch fermentative Vermehrung und anschließende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt Als für die vorliegende Erfindung geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7TS (GenBank-Zugriffsnummer U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360; vgl, auch Fig. 8), pGEM®-Reihe, bspw. pGEM®-1 (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgL auch Mezei und Storts, Purification of PCR. Products, in: Griffin und Griffin(Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
  • Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer DNA-Oligonucleotide, die an den entstehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene die gewünschte Nucleotidsequenz nach einem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid cloniert werden (vgl. Maniatis et al, s.o.). Das DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restrionsendonukleasen ausgeschnitten.
  • Die modifizierte mRNA, welche in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, kann darüber hinaus eine 5'-Cap-Struktur (ein modifiziertes Guanosin-Nucleotid) aufweisen. Als Beispiele von Cap-Strukturen können m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G genannt werden.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die modifizierte mRNA einen Poly(A+)-Schwanz von mindestens etwa 25, insbesondere mindestens etwa 30, vorzugsweise mindestens etwa 50 Nucleotiden, mehr bevorzugt mindestens etwa 70 Nucleotiden, besonders bevorzugt mindestens etwa 100 Nucleotiden. Der Poly(A+)-Schwanz kann jedoch auch 200 und mehr Nucleotide umfassen.
  • Für eine effiziente Translation der mRNA ist weiterhin eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz GCCGCCACCAUGG, das AUG bildet das Startcodon) erforderlich. Diesbezüglich ist festgestellt worden, daß ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die MRNA ermöglicht.
  • Des weiteren ist es möglich, in die mRNA eine oder mehrere sog. IRES (engl. "internal ribosomal entry side) einzufügen. Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA dienen, die mehrere Peptide bzw. Polypeptide codiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische" oder "polycistronische" mRNA). Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Cricket-Paralysis-Viren (CrPV).
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorligenden Erfindung weist die mRNA in den 5'- und/oder 3'-nicht translatierten Bereichen Stabilierungssequenzen auf, die befähigt sind, die Halbwertszeit der mRNA im Cytosol zu erhöhen.
  • Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, aufweisen, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatienen Sequenzen (UTR) des β-Globingens, bspw. von Hamo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxOOO(U/A)PyxUO(C/U)OC auf, die im 3'UTR der sehr stabilen mRNA. enthalten ist, die für a-Globin, a-(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase codiert (vgl. Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabilisierungssequenzen verwendet werden.
  • Zur weiteren Stabilisierung der mRNA ist es außerdem bevorzugt, daß diese mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nucleotide aufweist. Dies beruht auf der Tatsache, daß die in den Zellen vorkommenden RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nucleotide erkennen. Durch Einfügen von Nucleotidanaloga kann daher der RNA-Abbau erschwert werden; wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Einfügen von diesen Analoga, insbesondere in den codierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann.
  • In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nucleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnucleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden. Die Herstellung derartiger Analoga sind einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071 , US 4,401,796 , US 4,415,732 , US 4,458,066 , US 4,500,707 , US 4,668,777 , US 4,973,679 , US 5,047,524 , US 5,132,418 , US 5,153,319 , US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt. Erfindungsgemäß können derartige Analoga in nicht-translatierten und translatierten Bereichen der modifizierten mRNA vorkommen.
  • Des weiteren kann der wirksame Transfer der, vorzugsweise modifizierten, mRNA in die zu behandelnden Zellen bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, daß die mRNA mit einem kationischen oder polykalionischen Agens, insbesondere einem entsprechenden Peptid oder Protein, assoziiert oder daran gebunden ist. Daher liegt die mRNA in der erfinungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bevorzugt mit einem derartigen Agens komplexiert oder kondensiert vor. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin als polykationischem, Nwkimäuru-büi&n&n Protein besonders wirksam. Des weiteren ist die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin oder Histonen, ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Stabilisierung der modifizierten mRNA ist in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen ist.
  • Darüber hinaus kann die erfindungsgemäß modifizierte mRNA neben dem antigenen oder dem gentherapeutisch wirksamen Peptid bzw. Polypeptid auch mindestens einen weiteren funktionalen Abschnitt enthalten, der bspw. für ein die Immunantwort förderndes Cytokin (Monokin, Lymphokin, Interleukin oder Chemokin, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CFS, LT-α oder Wachstumsfaktoren, wie hGH, codiert.
  • Des weiteren kann zur Erhöhung der Immunogenizität die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein oder mehrere Adjuvanzien enthalten. Unter "Adjuvans" ist dabei jede chemische oder biologische Verbindung zu verstehen, die eine spezifische Immunantwort begünstigt. In Abhängigkeit der verschiedenen Arten von Adjuvanzien können diesbezüglich verschiedene Mechanismen in Betracht kommen, Bspw. bilden Verbindungen, die eine Endocytose der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen modifizierten mRNA durch dendritische Zellen (DC) fördern, eine erste Klasse von verwendbaren Adju vanzien. Andere Verbindungen, welche die Reifung der DC erlauben, bspw Lipopolysaccharide, TNF-α oder CD40-Ligand, sind eine weitere Klasse geeigneter Adjuvanzien. Allgemein kann jedes das Immunsystem beeinflussende Agens von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96, Oligonucleotide mit dem CpG-Motiv) oder Cytokine, insbesondere GM-CFS, als Adjuvans verwendet werden, welche es erlauben, eine Immunantwort gegen ein Antigen, das durch die modifizierte mRNA codiert wird, zu erhöhen und/oder gerichtet zu beeinflussen. Insbesondere sind dabei die vorstehend genannten Cytokine bevorzugt. Weitere bekannte Adjuvanzien sind Aluminiumhydroxid, das Freud'sche Adjuvans sowie die vorstehend genannten stabilisierenden kationischen Peptide bzw. Polypeptide, wie Protamin. Des weiteren sind Lipopeptide, wie Pam3Cys, ebenfalls besonders geeignet, um als Adjuvanzien in der pharmazeutischen Zusammmensetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt zu werden; vgl. Deres et al., Nature 1989, 342: 561-564.
  • Weitere besonders geeignete Adjuvanzien sind darüber hinaus (andere) RNA- oder auch mRNA-Spezies, die der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung der Immunogenizität zugesetzt werden können. Derartige Adjuvans-RNA ist vorteilhafter weise zur Stabilisation chemisch modifiziert ("cis-Modifikation" oder "cis-Stabilisierung") sein, beispielsweise durch die vorstehend genannten Nucleotidanaloga, insbesondere Phosphorthioat-modifizierte Nucleotide, oder aber durch die obigen weiteren Maßnahmen zur Stabilisation von RNA. Eine weitere vorteilhafte Möglichkeit der Stabilisation stellt die Komplexierung oder Assoziation ("trans-Assoziation" oder "trans-Modifikation" bzw. "trans-Stabilisierung") mit den vorstehend genannten kationischen oder polykationischen Agenzien, bspw. mit Protamin, dar.
  • Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird die Stabilität der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen RNA-Moleküle (mRNA, codierend für ein Tumorantigen, und ggf. Adjuvans-(m)RNA) durch einen oder mehrere RNase-Inhibitoren erhöht. Bevorzugte RNase-Inhibitoren sind Peptide oder Proteine, insbesondere solche aus Placenta (z.B, aus humaner Placenta) oder Pankreas. Derartige RNase-Inhibitoren können auch rekombinant vorliegen. Ein spezifisches Beispiel eines RNase-Inhibitors ist RNasin®, der im Handel, z.B. bei Promega erhältlich ist. Derartige RNase-Inhibitoren sind allgemein zur Stabilisierung von RNA verwendbar. Daher wird erfindungsgemäß auch allgemein eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, enthaltend mindestens eine für mindestens ein Antigen codierende RNA, insbesondere mRNA, und mindestens ein wie vorstehend definierter RNase-Inhibitor, ggf. in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, Träger und/oder Vehikel. Entsprechende Antigene in allgemeiner Form sowie Lösungsmittel, Träger bzw. Vehikel sind nachstehend definiert. Hinsichtlich bevorzugter Tumorantigene wird auf die diesbeszüglichen Ausführungen hinischtlich der bevorzugten pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierende mRNA, verwiesen.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zummmensetzung enthält neben dem wässerigen Lösungsmittel und der mRNA vorzugsweise einen oder mehrere weitere(n) pharmazeutisch verträgliche (n) Träger und/oder ein oder mehrere weitere(s) pharmazeutisch verträgliche(s) Vehikel. Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. neben sterilem. Wasser oder sterilen Kochsalzlösungen als wässrigem Lösungsmittel auch Polyalkylenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße Zusammmetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylactat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrocyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Polyoxamere oder Polyoxamine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte wässerige Trägermaterialien sind z.B. Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Citrat oder Acetat usw., wobei der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eingestellt wird. Das wässerige Lösungsmittel bzw. der oder die weitere(n) Träger bzw. das oder die weitere(n) Vehikel wird/werden zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann wässerige Lösungsmittel bzw. der oder die weitere(n) Träger bzw. das oder die weitere(n) Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, enthalten.
  • Die Art und Weise der Verabreichung und die Dosierung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung hängen von der zu behandelnden Erkrankung und deren Fortschrittsstadium, wie auch dem Körpergewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab.
  • Die Konzentration der modifizierten mRNA in derartigen Formulierungen kann daher innerhalb eines weiten Bereichs von 1 µg bis 100 mg/ml variieren. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise parenteral, bspw. intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, dem Patienten verabreicht. Ebenso ist es möglich, die pharmazeutische Zusammensetzung topisch oder oral zu verabreichen. Vorzugsweise wind die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung intradermal verabreicht. Weiterhin ist eine transdermale Applikation mit Hilfe von elektrischen Strömen bzw. durch osmotische Kräfte möglich. Des Weiteren kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung lokal in einen Tumor injiziert werden.
  • Somit wird erfindungsgemäß auch ein Verfahren zur Behandlung bzw. ein Impfverfahren zur Prävention von Krebsechankungen, bspw der vorstehend genannten Erkrankungen, bereitgestellt, welches das Verabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst.
  • Gemäß einer bevorzugten Aushihrungsform des Behandlungs- bzw Impfverfahrens bzw. bei der vorstehend definierten Verwendung der erfindungsgemäßen mRNA, codierend für mindestens ein Antigen aus einem Tumor, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention von Krebsensianhungen wird dem Patienten neben der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ein oder mehrere Cytokin(e) verabreicht
  • Daher wird erfindungsgemäß auch allgemein ein Behandlungs- bzw. Impfverfahren bereitgestellt, umfassend das Verabreichen mindestens einer mindestens ein Antigen aus einem Tumor (gemäß obiger Definition) codierenden RNA, vorzugsweise mRNA, die ggf. gemäß den obigen Ausführungen stabilisiert ist (sind), und mindestens eines Cytokins, bspw. eines oder mehrerer der vorstehend genannten Cytokine, insbesondere GM-CSF, an einen Patienten, insbesondere einen Menschen. Das Verfahren dient insbesondere zur Behandlung und/oder. Prävention entsprechender Krebsennanhmgen (bspw. die obigen Krebserbmib.tngen). Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung auch allgemein auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, umfassend mindestens eine mindestens ein Antigen aus einem Tumor (nach vorstehender Definition) codierende RNA, vorzugsweise mRNA, die ggf. gemäß den obigen Ausführungen stabilisiert ist (sind), und mindestens ein Cytokin, bspW eines oder mehrerer der vorstehend genannten Cytokine, wie GM-CSF, vorzugsweise in Verbindung mit einem pharmazeutisch vertraglichen Träger und/oder Vehikel, z.B. einem wassengen Lösungsmittel, oder einem oder mehreren der vorstehend definierten Träger, Lösungsmittel bzw. Vehikel. Erfindungsgemäß wird somit auch die Verwendung von Cytokinen, bspw. eines oder mehrerer der vorstehend genannten Cytokine, insbesondere GM-CSF, in Kombination mit einem oder mehreren, wie vorstehend definierten RNA-Molekül(en), insbesondere mRNA, zur Behandlung und/oder Prävention von Krebserkrankungen (z.B. vorstehend angeführter Krebserkrankungen) offenbart.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Cytokin, bspw GM-CSF, gleichzeitig oder, was mehr bevorzugt ist, vor oder nach der pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend die für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierende mRNA verabreicht (bzw. zur Herstellung eines entsprechendes Arzneimittels zur gleichzeitigen Verabreichung mit oder zur Verabreichung vor oder nach der vorstehend aufgeführten (m)RNA verwendet). Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Verabreichung des Cytokins, insbesondere GM-CSF, kurz vor (z.B. etwa 15 min oder weniger, bspw. etwa 10 oder etwa 5 min) oder kürzere Zeit (bspw. etwa 5, 10, 15, 30, 45 oder 60 min) nach oder längere Zeit (z.B. etwa 2, 6, 12, 24 oder 36 h) nach der Verabreichung der vorstehend definierten pharmazeutischen Zusammensetzung bzw. allgemein nach der mindestens einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierenden (m)RNA.
  • Die Applikation des Cytokins, bspw. GM-CFS, kann dabei auf dem gleichen Wege wie die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. die mindestens eine für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierende (m)RNA oder in einer davon getrennten Weise erfolgen. Geeignete Verabreichungswege sowie auch die geeigneten Formulierungsmöglichkeiten in Bezug auf das oder die Cytokin(e) können den obigen Ausführungen hinsichtlich der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen entnommen werden. Bei einem humanen Patienten ist insbesondere eine GM-CFS-Dosis von 100 Mikrogramm/m2 empfehlenswert. Besonders bevorzugt erfolgt die Verabreichung des Cytokins, bspw. GM-CFS, durch eine s.c.-Injektion.
  • Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bzw. die für ein Antigen aus einem Tumor codierende RNA und gegebenenfalls damit zusammenhängend das oder die Cytokin(e) in Form von Intervall-Dosen appliziert. Beispielsweise kann eine Dosis einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in kürzeren Intervallen, bspw. täglich, jeden zweiten Tag, jeden dritten Tag usw., oder aber, was mehr bevorzugt ist, in längeren Intervallen, bspw. einmal wöchentlich, einmal in zwei Wochen, einmal in drei Wochen, einmal im Monat usw Dabei können die Intervalle auch veränderlich sein, wobei insbesondere die immunologischen Parameter des Patienten zu berücksichtigen sind. Bspw. kann die Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (und gegebenenfalls damit zusammenhängend auch die Verabreichung des oder der Cytokins/Cytokine) einem Behandlungsschema folgen, bei dem zu Beginn der Behandlung das Intervall kürzer ist, bspw. einmal in zwei Wochen, und dann, je nach Behandlungsverlauf bzw. den entsprechend bestimmten immunologischen Parametern des Patienten, das Intervall auf bspw. einmal im Monat verlängert wird. Je nach Patient, insbesondere dessen Zustand und seinen immunologischen Parametern, kann so ein auf das jeweilige Individuum zugeschnittenes Therapieschema angewandt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die Schritte:
    1. (a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon aus Tumorgewerbe eines Patienten,
    2. (b) Herstellen einer Matrize für die In vitro-Transkription von RNA anhand der cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon und
    3. (c) In vitro-Transkribieren der Matrize.
  • Das Tumorgewebe des Patienten kann bspw. durch eine einfache Biopsie gewonnen werden. Es kann aber auch durch operative Entfernung von Tumor-befallenem Gewebe bereitgestellt werden. Des Weiteren kann die Herstellung der cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon gemäß Schritt (a) des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, nachdem das entsprechende Gewebe zur Lagerung, vorzugsweise auf Temperaturen unterhalb von -70 °C, tiefgefroren wurde. Zur Herstellung der cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon wird zunächst eine Isolierung der Gesamt-RNA, bspw. aus einer Tumorgewebe-Biopsie, durchgeführt. Verfahren hierzu sind bspw. in Maniatis et al., supra, beschrieben. Des Weiteren sind hierfür entsprechende Kits im Handel, bspw. bei der Fa. Roche AG (z.B. das Produkt "High Pure RNA Isolation Kit"), erhältlich. Aus der Gesamt-RNA. wird gemäß einem Fachmann bekannter Verfahren (vgl. bspw. Maniatis et al., supra) die entsprechende Poly(A+)-RNA isoliert. Auch hierfür sind im Handel entsprechende Kits erhältlich. Ein Beispiel ist das "High Pure RNA Tissue Kit" der Fa. Roche AG. Ausgehend von der so gewonnenen Poly(A+)-RNA wird danach die cDNA Bibliothek hergestellt (vgL auch hierzu bspw. Maniatis et al., supra). Auch für diesen Schritt bei der Herstellung der cDNA-Bibliothek stehen einem Fachmann im Handel erhältliche Kits, bspw. das "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" der Fa. Clontech Inc., zur Verfügung. Die einzelnen Unterschritte von der Poly(A+)-RNA zur doppelsträngigen cDNA sind am Beispiel des Verfahrens gemäß dem "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" der Fa. Clontech Inc. in der Fig. 11 schematisch dargestellt.
  • Gemäß Schritt (b) des vorstehenden Herstellungsverfahrens wird ausgehend von der cDNA-Bibliothek (oder eines Teils davon) eine Matrize für die In vitro -Transkription synthetisiert. Dies erfolgt erfindungsgemäß insbesondere dadurch, daß die erhaltenen cDNA-Fragmente in einen geeigneten RNA-Produktionsvektor cloniert werden. Die geeignete DNA-Matrize und erfindungsgemäß bevorzugte Plasmide sind bereits vorstehend im Zusammenhang mit der Herstellung der mRNA für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung angegeben.
  • Zur In vitro -Transkription der im erfindungsgemäßen Schritt (b) hergestellten Matrize wird diese, wenn sie als zirkuläre Plasmid-(c)DNA vorliegt, zunächst mit einem entsprechenden Restdhionsenzym linearisiert. Vorzugsweise wird das so geschnittene Konstrukt vor der eigentlichen In vitro -Transkription noch einmal gereinigt, bspw. durch entsprechende Phenol Chloroform- und/oder Chloroform/Phenol/Isoamylalkohol-Gemische. Hierdurch wird insbesondere sichergestellt, daß die DNA- Matrize in proteinfreier Form vorliegt. Als nächstes erfolgt die Synthese der RNA ausgehend von der gereinigten Matrize. Dieser Unterschritt erfolgt in einem Reaktionsgemisch, enthaltend die linearisierte, proteinfreie DNA-Matrize in einem geeigneten Puffer, dem vorzugsweise ein Ribonuclease-Inhibitor zugesetzt wird unter Verwendung eines Gemischs der benötigten Ribonucleotidtriphosphate (rATP, rCTP, rUTP und rGTP) und einer ausreichenden Menge einer RNA-Polymerase, bspw. T7-Polymerase. Das Reaktionsgemisch liegt dabei in RNase-freiem Wasser vor. Bevorzugt wird bei der eigentlichen enzymatischen Synthese der RNA auch ein CAP-Analogon zugefügt. Nach einer entsprechend langen, bspw. 2 h, Inkubation bei 37°C, wird die DNA-Matrize durch Zugabe von RNase-freier DNase abgebaut, wobei bevorzugt wieder bei 37°C inkubiert wird.
  • Vorzugsweise wird die so hergestellte RNA mittels Ammoniumacetat/Ethanol gefällt und gegebenenfalls ein oder mehrmals mit RNase-freiem Ethanol gewaschen. Schließlich wird die so gereinigte RNA getrocknet und gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in RNase-freiem Wasser aufgenommen. Des Weiteren kann die so hergestellte RNA mehreren Extraktionen mit Phenol/Chloroform bzw. Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol unterworfen werden.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des vorstehend definierten Herstellungsverfahrens wird nur ein Teil einer Gesamt-cDNA-Bibliothek gewonnen und in entsprechende mRNA-Moleküle überführt. Daher kann erfindungsgemäß auch eine sog. Subtraktionsbibliothek als Teil der Gesamt-cDNA-Bibliothek verwendet werden, um die erfindungsgemäßen mRNA-Moleküle bereitzustellen. Ein bevorzugter Teil der cDNA-Bibliothek des Tumorgewebes codiert für die tumorspezifischen Antigene. Bei bestimmten Tumoren sind die entsprechenden Antigene bekannt. Es kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der für die tumorspezifischen Antigene codierende Teil der cDNA-Bibliothek zunächst ermittelt werden (d.h. vor Schritt (a) des vorstehend definierten Verfahrens). Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß die Sequenzen der tumorspezifischen Antigene durch einen Abgleich mit einer entsprechenden cDNA-Bibliodthek aus gesundem Gewebe festgestellt werden.
  • Der erfindungsgemäße Abgleich umfasst insbesondere einen Vergleich der Expressionsmuster des gesunden Gewebes mit dem des in Rede stehenden Tumorgewebes. Entsprechende Expressionsmuster werden können auf Nukleinsäureebene bspw. mit Hilfe geeigneter Hybridisierungsexperimente bestimmt. Hierzu können bspw. die entsprechenden (m)RNA- oder cDNA-Bibliotheken der Gewebe jeweils in geeigneten Agarose- oder Polyacrylamid-Genen aufgetrennt, auf Membranen überführt und mit entsprechenden Nukleinsäure-Sonden, vorzugsweise Oligonukleotid-Sonden, welche die jeweiligen Gene repräsentieren, hybridisiert werden (Northern- bzw. Southern-Blots). Ein Vergleich der entsprechenden Hybridisierungen liefert somit diejenigen Gene, die entweder ausschließlich vom Tumorgewebe oder darin stärker exprämiert werden.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die genannten Hybridisierungsexperimente mit Hilfe einer Diagnose durch Mikroarrays (ein oder mehrere Mikroarrays). Ein entsprechender DNA-Mikroarray umfaßt eine definierte Anordnung, insbesondere auf kleinem oder kleinstem Raum, von Nukleinsäure-, insbesondere Oligonukleotid Sonden, wobei jede Sonde bspw. jeweils ein Gen, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit in der entsprechenden (m)RNA- oder cDNA-Bilhothek zu untersuchen ist, repräsentiert. In einer entsprechenden Mikroanordnung können so Hunderte, Tausende und sogar Zehn- bis Hundertta suende von Genen repräsentiert sein. Zur Analyse des Expressionsmusters des jeweiligen Gewebes wird dann entweder die Poly(A+)-RNA oder, was bevorzugt ist, die entsprechende cDNA mit einem geeigneten Marker, insbesondere werden hierzu Fluoreszenzmarker verwendet, markiert und unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit dem Mikroarray in Kontakt gebracht. Bindet eine cDNA-Spezies an einem auf dem Mikroarray vorhandenen Sondenmolekül, insbesondere einem Oligonukleotid-Sondenmolekül, wird dementsprechend ein mehr oder minder stark ausgeprägtes Fluoreszenzsignal, das mit einem geeigneten Detektionsgerät, bspw. einem entsprechend ausgelegten Fluroeszenzspektrometer, gemessen werden kann, beobachtet. Je stärker die cDNA (oder RNA) -Spezies in der Bibliothek repräsentiert ist, desto größer wird das Signal, bspw. das Fluoreszenzsignal, sein. Das entsprechende Mikroarray-Hybridisierungsexperiment (bzw. mehrere oder viele davon) wird (werden) getrennt für das Tumorgewebe und das gesunde Gewebe durchgeführt. Die Differenz der aus den Mikroarray-Experimenten ausgelesenen Signale läßt daher auf die ausschließlich oder vermehrt vom Tumorgewebe exprimierten Gene schließen. Derartige DNA-Mikroarray-Analysen sind bspw. in Schena (2002), Mikroarray Analysis, ISBN 0-471-41443-3, John Wiley & Sons, Inc., New York, dargestellt, wobei der diesbezügliche Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift vollumfänglich in die vorliegende Erfindung aufgenommen ist.
  • Die Erstellung tumorgewebsspezifischer Expressionsmuster ist jedoch keineswegs auf Analysen auf Nukleinsäureebene beschränkt. Einem Fachmann sind selbstvetständlich auch im Stand der Technik bekannte Verfahren geläufig, welche der Expressionsanalyse auf Proteinebene dienen. Hier sind insbesondere Techniken der 2D-Gelelektrophorese und der Massensprektrometrie zu nennen, wobei diese Techniken vorteilhafterweise auch mit Proteinbiochips (also Mikroarrys auf Proteinebene, bei denen bspw. ein Proteinextrakt aus gesundem bzw. Tumorgewebe mit auf dem Mikroarray-Substrat aufgetragenen Antikörpern und/oder Peptiden in Kontakt gebracht wird), kombiniert werden können. Hinsichtlich der massenspektroskopischen Verfahren sind diesbezüglich insbesondere MALDI-TOF- ("matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight"-) Verfahren zu nennen. Die genannten Techniken zur proteinchemischen Analyse zur Gewinnung des Expressionsmusters von Tumor- im Vergleich zu gesundem Gewebe sind bspw. in Rehm (2000) Der Experimentaton Proteinbiochemie/Proteomics, spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 3. Aufl., beschrieben, auf dessen diesebezüglichen Offenbarungsgehalt in der vorliegenden Erfindung expressis verbis ausdrücklich Bezug genommen. Hinsichtlich Protein-Mikroarrays wird außerdem wiederum auf die diesbszüglichen Ausführungen in Schena (2002), supra, verwiesen.
  • Die Figuren zeigen:
    • Fig. 1
    zeigt in einer graphischen Darstellung die Ergebnisse einer Tumorvakzinierung von Mäusen (Ratten-Her-2/neu-transgene Tiere), die spontan Mammakarzinome entwickeln, mit RNA. Es ist die Tumormultiplizität auf der γ-Achse gegen das Alter der Mäuse auf der x-Achse aufgetragen. Unbehandelte Mäuse (n = 4), die als Kontrolle dienten, wiesen alle in einem Alter von 6 Monaten Tumore auf. Drei Mäusen wurde für Her-2/neu codierende DNA injiziert, wobei eine Maus nach 10 Monaten tumorfrei war. Als weitere Negativkontrolle erhielten 4 Mäuse eine zur mRNA für Her-2/neu komlementäre Antisense-mRNA. Diese Mäuse wiesen ebenfalls nach 6 Monaten alle Tumore auf (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu war eine von 4 Mäusen, denen für Her-2/neu codierende mRNA (also der Sinnstrang) injiziert wurde, nach 9 Monaten tumorfrei.
    Fig. 2
    zeigt in einer graphischen Darstellung die Ergebnisse von Experimenten zur beta-Galaktosidase (beta Gal)-spezifischen CIL (cytotoxische T-Lymphocyten)-Aktivität durch die Immunisierung mit einer für beta-Gal codierenden mRNA unter dem Einfluß von GM-CSF. BALB/c-Mäuse wurden durch Injektion in die innere Auricula mit 25 µg für beta-Gal codierender mRNA immunisiert. Die Splenocyten wurden in vitro mit beta-Gal-Protein stimuliert, und die CTL-Aktivät wurde 6 Tage nach der in vitro-Stimulation unter Verwendung eines Standard-51Cr-Freisetzungstests bestimmt. Die Zielzellen waren P815 (H2 d)-Zellen, die mit dem synthetischen Peptid TPHPA-RIGL, das dem H2 d-Epitop von beta-Gal entspricht, beladen (■) oder nicht beladen (▲) waren. Es wurden jeweils drei oder zwei Tiere pro Gruppe behandelt. Als Negativkontrolle dienten Tiere, denen i.d. in beide Auriculae nur Injektionspuffer injiziert wurden. Als Positivkontrolle ("DNA") dienten Tiere, denen in beide Auriculae i.d. 10 µg eines für beta-Gal codierenden Plasmids in PBS injiziert wurde. Die Testgruppen erhielten für beta-Gal codierende RNA allein bzw. in Kombination mit GM-CSF, der 24 h ("GM-CSF t-1"),2 h vor der RNA-Injektion ("GM-CSF t0") oder 24 h nach der RNA-Injektion (''GM-CFS t+1") in dieselbe Stelle (in die Auriculae) oder an einer anderen Stelle (s.c. auf dem Rücken) injiziert wurde. Es wurden jeweils drei verschiedene Effektor-/Zielzellen-Verhälnisse (200, 44,10) getestet.
    Fig. 3
    zeigt in weiteren graphischen Darstellungen die Ergebnisse von für IFN-gamma (A) bzw. IL-4 (B) spezifische ELISA-Standardtests, die die entsprechende Cytokin-Produktion von Splenocyten dokumentieren, die in vitro mit beta-Gal-Protein restimuliert wurden. BALB/c-Mäuse wurden, wie bereits vorstehend bei Fig. 2 angegeben, immunisiert. Die Splenocyten wurden in vitro mit beta-Gal-Protein stimuliert, die entsprechenden Kulturüberstände wurden gewonnen, und die IFN-gamma- oder IL-4-Konzentration wurde unter Verwendung eines ELISA-Standardtests bestimmt.
    Fig. 4
    zeigt weitere graphische Darstellungen, welche die Antikörper-Antwort von erfindungsgemäß immunisierten Mäusen demonstriert. BALB/c-Mäuse wurden, wie in Fig. 2 angegeben, immunisiert. Zwei Wochen nach demBoost wurde Blut abgenommen und daraus das Blutserum gewonnen. Beta-Gal-spezifische IgG1- (A) und IgG2a-Antikötper (B) wurden mit Hilfe eines ELISA-Test bestimmt. Dargestellt ist jeweils die Extinktion (OD) bei 405 nm auf der y-Achse, die aus der Umsetzung des Substrats ABTS beim ELISA-Test resultiert. Die gezeigten Extinktionen sind die Werte, von denen die entsprechenden Werte von mit Injektionspuffer behandelten Mäusen subtrahiert sind.
    Fjg.5
    zeigt mit X-Gal gefärbte mikroskopische Schnitte der Auricula von Mäusen, denen für beta-Galaktosidase codierende mRNA in die Auricula i.d. injiziert wurde. 12 Stunden nach der Injektion von 25 µg RNA in HEPES-NaCl-Injektionspuffer wurden die Ohren entfernt und X-Gal-gefärbte Schnitte angefertigt. Blaue Zellen zeigen eine beta Galaktosidase-Aktivität an. Wie bei beiden Schnitten zu sehen ist, sind nur wenige blaue Zellen vorhanden.
    Fig. 6
    zeigt einen der Fig. 5 entsprechenden Schnitt durch eine Auricula einer Maus, der in die Auricula für beta-Galaktosidase codierende mRNA injiziert wurde, welche Protamin-stabilisiert war. Der mit X-Gal gefärbte mikroskopische Schnitt zeigt einige wenige blau gefärbte Zellen.
    Fig. 7
    zeigt zwei weitere Schnitte durch die Auricula von Mäusen, wobei pro Schnitt zwei Bilder angefertigt wurden, um einen größeren Ausschnitt darzustellen. In diesem Fall wurde in die Auricula für beta-Galaktosidase codierende mRNA in einem Puffer injiziert, dem 10 U RNasin, ein enzymatischer RNase-Inhibitor aus Pankreas (erhältlich von Roche oder Promega) direkt vor der Injektion zugefügt wurde. Im Vergleich zu den Schnitten von Fig. 5 und Fig. 6 sind deutlich mehr blau gefärbte Bereiche von Zellen mit beta-Galaktosidase-Aktivität zu erkennen.
    Fig. 8
    zeigt in einer schematischen Darstellung das Plasmid pT7TS, das für die In vitro - Transkription verwendet wurde. Erfindungsgemäße Konstrukte wurden in die BglII- und SpeI-Stellen, deren relative Lage zueinander angegeben ist, cloniert. Der schwarz ausgefüllte Bereich enthält die 5'-nicht translatierte Region des beta-Globingens aus Xenopus laevis, während der grau ausgefüllte Bereich eine entsprechende 3'-nicht translatierte Region des beta-Globingens aus X. laevis darstellt. Des Weiteren ist die relative Lage des T7-Promotors, die zur Sequenzierung verwendete PstI-Stelle, der Poly(A+)-Schwanz (A30C30) sowie mit einem Pfeil die Transkriptionsrichtung angegeben.
    Fig. 9
    zeigt in einem beispielhaften Ablaufschema den Verlauf einer erfindungsgemäßen RNA-Impftherapie mit unterstützender Gabe von GM-CFS. Die für ein oder mehrere Tumorantigene (MUC1, Her-2/neu, Tilomerase, MAGE-1) codierende mRNA-Moleküle bzw. eine für ein Kontrollanantigen (Influenza Matrix Protein (IMP), ein virales Antigen) codierende mRNA werden dem Patienten i.d. an den Tagen 0, 14, 28 und 42 verabreicht. Zusätzlich wird dem Patienten einen Tag nach der RNA-Impfung GM-CFS (Leucomax® (100 µg/m2) von Novartis/Essex Pharma) s.c. injiziert. Bei stabilem Verlauf bzw. objektivem Tumoransprechen (komplette Remission (CR) bzw. partielle Remission (PR)) erhalten die Patienten die Vakzinierungen einmal im Monat s.c. Nach der vierten Injektion (Tag 49) wird das Ansprechen des Tumors radiologisch, laborchemisch bzw. sonographisch sowie die durch die Therapie induzierten immunologischen Phänomene evaluiert. Ab Tag 70 erfolgt die Fortführung der Immunisierungstherapie in 4-wöchentlichen Abständen. Am Tag 0, 14, 28, 42 und 49 werden Blutproben zur Bestimmung entsprechender Laborparameter, des Differenzialblutbilds (Diff-BB), FACS-Analyse und Cytokine entnommen. Das Restaging des Patienten erfolgt ab Tag 49 sowie ggf. alle weitere 4 bis 8 Wochen.
    Fig.10
    zeigt in einem Fließschema die Konstruktion von autologer, stabilisierter RNA gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Zunächst wird Tumorgewebe, bspw. durch Biopsie, gewonnen. Daraus wird die Gesamt-RNA extrahiert. Anhand der aus der RNA-Extraktion gewonnenen Poly(A+)-RNA wird eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Davon ausgehend wird nach Herstellung einer entsprechenden DNA-Matrize die autologe, stabilisierte RNA mittels In vitro- Transkription gewonnen.
    Fig. 11
    zeigt in einem Reaktionsschema die Schritte zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek, ausgehend von Poly(A+)-RNA beispielhaft für das SMART PCR cDNA Synthesis Kit der Fa. Clontech Inc.
    Fig. 12
    zeigt eine fotographische Aufnahme eines Agarosegels, das die typische Größenfraktionerung einer cDNA-Bibliothek erstellt aus humanem Placenta-Gewebe, zeigt. In der Spur M ist ein Längenmarker mit Fragmenten der links angegebenen Länge aufgetragen. Die Spur "DS cDNA" enthält die cDNA-Bibliothek. Diejenigen Fragmente, die der erwarteten Größenfraktion entsprechen (etwa 200 BP bis 4000 BP) werden für die In vitro-Transkription verwendet.
    Fig.13
    zeigt einen beispielhaften Behandlungsplan für die erfindungsgemäße Tumor-Therapie durch Injektion einer Tumor-mRNA-Bibliothek, hier in Kombination mit GM-CSF, für Patienten mit malignem Melanom. Hierfür wird aus patienteneigenem Tumorgewebe hergestellte, autologe, stabilisierte RNA verwendet. Diese amplifizierte autologe Tumor-RNA wird dem Patienten i.d. an den Tagen 0, 14, 28 und 42 verabreicht. Zusätzlich wird dem Patienten einen Tag nach der RNA-Injektion GM-CFS (Leucomax® 100 µg/m2 Novartis/Essex Phanna) s.c. injiziert. Zwei Wochen nach der vierten Injektion (Tag 56) wird das Ansprechen des Tumors durch eine Staging Untersuchung (u.a. Sonographie, Thorax-Röntgen, CT usw.) sowie durch die Auswertung der durch die Therapie induzierten immunologischen Parameter evaluiert. Bei stabilem Krankheitsverlauf bzw. objektivem Tumoransprechen (CR bzw. PR) erhält der Patient alle vier Wochen jeweils eine weitere Vakzinierung. Weitere Restaging-Untersuchungen werden am Tag 126 und danach in 12-wöchigem Abstand durchgeführt.
    Fig. 14
    zeigt noch einmal schematisch den generellen Ablauf einer Therapie mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit autologer, amplifizerter Tumor-RNA, d.h. die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene RNA repräsentiert eine cDNA-Bibliothek des Tumorgewebes. Es wird zunächst eine Probe des Tumorgewebes, bspw. über eine Biopsie, gewonnen. Aus dem Gewebe wird die Gesamt-, dann die Poly(A+)-RNA durch entsprechende Extraktionen hergestellt. Ausgehend von der Poly(A+)-RNA wird eine cDNA-Bibliothek konstruiert, die in einen zur nachfolgenden In vitro-Transkription geeigneten Vektor kloniert wird. Durch In vitro-Transkription wird dann ein RNA-Vakzin gewonnen, das dem Patienten, dem das Tumorgewebe entnommen wurde, zur Bekämpfung des Tumors injiziert wird.
  • Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuchränken.
    • BEISPIELE Beispiel 1: Tumorvakzinierung mit RNA im Tiermodell Materialien und Methoden
  • Gekappte mRNA, codierend für eine verkürzte Version des Her-2/neu-Proteins der Ratte ("ECD-TM-neu-Ratte", enthaltend die extrazelluläre Domäne und die Transmembranregion, nicht jedoch die cytoplasmatische Region) wurde unter der Verwendung von "SP6 mMessagemMachine" (Ambion) mit Hilfe eines Plasmids hergestellt, das im wesentlichen dem in Fig. 8 gezeigten Aufbau entsprach, jedoch statt des 17-Promotors einen SP6-Promotor enthielt, und in welchem das ECD-TM-neu-Ratte-Konstrukt hinter den SP6-RNA-Polymerase-Promotor eingefügt war. Die hergestellte mRNA wurde in Injektionspuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES) bei einer Konzentration von 0,8 mg/ml gelöst und mit Protamin-Sulfat (Sigma) (1mg Protamin pro 1 mg RNA) gemischt. 50 µl dieser Lösung wurden in die Auriculae (je 25 µl pro Ohr) der Mäuse injiziert. Es erfolgten acht Injektionen, jeweils eine im Alter von 6, 8, 13, 15, 20, 22, 27 und 29 Wochen. Als Kontrollen dienten Mäuse, denen entsprechende Injektionen mit Injektionspuffer, mit für ECD-TM-neu-Ratte codierender Plasmid-DNA oder mit einer der erfindungsgemäßen mRNA entsprechenden Antisense-mRNA verabreicht wurden.
    • Ergebnisse
  • Weibliche BalB-neu T-Mäuse (BalB/c-Mäuse, die das Onkogen Her2/neu der Ratte exprimieren; vgl. Rovero et al. (2000) J. Immunol. 165(9):5133-5142), die spontan Mammakarzinome entwickeln, wurden mit für eine verkürzte Version des Her-2/neu-Proteins ("ECD-TM-neu-Ratte", enthaltend die extrazelluläre Domäne und die Transmembranregion, nicht jedoch die cytoplasmatische Region) codierender RNA immunisiert. Als Negativkontrolle dienten vier mit Injektionspuffer behandelte Mäuse. Einer weiteren Gruppe von drei Mäusen wurde für das verkürzte Her-2/neu codierende DNA injiziert. Vier Mäuse erhielten die erfindungsgemäß für das Tumorantigen Her-2/neu (verkürzte Version ECD-TM, siehe oben) codierende mRNA. Als weitere Kontrollgruppe dienten vier Mäuse, denen die entsprechende Antisense-RNA injiziert wunde. Wie in der Fig. 1 gezeigt, wurde bei den Tieren der unbehandelten Kontrollgruppe nach 26 Wochen eine Tumormultiplizität von durchschnittlich 10 beobachtet, wobei alle Tiere im Alter von etwa 20 Wochen tastbare Brusttumore aufwiesen. Im Gegensatz dazu ist bei der Immunisierung mit der für ECD-TM-neu-Ratte codierenden mRNA eine deutliche Verlangsamung der Karzinomentstehung zu beobachten, insbesondere wird erst im Alter von 30 Wochen eine Tumormultiplizität von 10 erreicht. Des Weiteren ist auch die Tumorgröße vermindert (nicht gezeigt). Von den 4 mit der erfindungsgemäßen mRNA behandelten Mäusen war eine nach 9 Monaten immer noch tumorfrei. Diejenige Gruppe von Mäusen, denen die Antisense-mRNA injiziert worden war, zeigten alle im Alter von 6 Monaten Tumore. Die Vergleichsgruppe der Mäuse, denen für die verkürzte Version von Her-2/neu codierende Plamid-DNA injiziert wurde, zeigten ebenfalls eine im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe verlangsamte Karzinomentstehung (vgL auch bezüglich entsprechender Plasmid-DNA-Experimente bei Intramuskulärer Injektion: Di Carlo et aL (2001) Clin. Cancer Res. 7(3. Ergänzungsband): 830s-837s), wobei jedoch die Karzinomentstehung bis zur 27. Lebenswoche nicht so stark verlangsamt war wie bei der Immunisierung mit erfindungsgemäßer, für die verkürzte Version von Hei2/neu codierender mRNA. Darüber hinaus sind bei der Immunisierung mit DNA die vorstehend genannten Nachteile, insbesondere die Gefahr der Integration der DNA in das Genom, die Entstehung von anti-DNA-Antikörpem usw. zu berücksichtigen.
    • Beispiel 2: Einfluss von GM-CFS auf die RNA-Vakzinierung Materialien und Methoden Mäuse
  • 6-10 Wochen alte BALB-c AnNCrlBR (H-2d) Mäuse (weiblich) wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen.
    • Plasmide und Herstellung un RNA
  • Der für beta-Galaktosidase codierende ORF (LacZ), flankiert von 5'- und 3'-nicht-translatierten Sequenzen aus dem beta-Globingen von X. Laevis, wurde in das Plasmid pT7TS (P.A. Creek, Austin, TX, USA), um das Plasmid pT7TS-kozak-5' beta gl-lacZ-3' beta glA30C30 herzustellen (vgL Hoerr et al. (2000) Eur. J. Immonol 30:1-7). Der generelle Aufbau des Plasmids pT/TS mit den flankierenden 5'- und 3'- nicht-translatierten Sequenzen aus dem beta-Globingen von X. Laevis ist in Fig. 8 schematisch dargestellt.
  • Das derart hergestellte Plasmid wurde mit Pst I linearisiert und in vitro unter Verwendung des m-MessagemMachineT7 Kit (Ambion, Austin, TX USA) transhipiert. Die so hergestellte RNA wurde mittels LiCl-Präzipitation, Phenol/Chloroform-Extraktion und Ammoniumacetat-Fällung gereinigt. Die gereinigte RNA wurde schließlich in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Injektionspuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES) resuspendiert.
    • Medien und Zellkultur
  • P815 und P13.1-Zellen wurden in RPMI 1640 (Bio-Whittaker, Verviers, Belgien), ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) (PAN systems, Deutschland), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, kultiviert.
  • CIL-Kulturen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 0,05 µM beta-Mecraptoethanol, 50 mg/ml Gentamycin, MEM-Non Essential Amino Assids (100×) und 1 mM Natriumpyruvat, gehalten. CTL wurden für eine Woche mit 1 mg/ml beta-Galaktosidaseprotein (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) restimuliert. Am Tag 4 wurden 4 ml Kulturüberstand vorsichtig abpipettiett und durch frisches Medium, enthaltend 10 U/ml rIL-2 (Endkonzentration) ersetzt.
    • Immunisierung
  • 3 BALB/c-Mäuse pro Gruppe wurden mit 20 mg Pentobarbital i.p. pro Maus betäubt. Den Mäusen wurde dann i.d. in beide Auriculae 25 mg für beta-Galaktosidase (beta-Gal) codierende mRNA Injektionspuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES) injiziert. In einigen Fällen wurde zusätzlich Granomycyten-Makrophagen-Kolonie-Stmulisierungsfaktor (GM-CFS) 24 h oder 2 h vor bzw. 24 h nach der RNA-Injektion in dieselbe Stelle oder ia eine davon entfernte Injektionsstelle (in die Auricula oder s.c. in den Rücken), injiziert. Als Positivkontrolle wurde Tieren jeweils 10 mg eines für beta-Gal codierenden DNA-Plasmids in PBS i.d. in beide Auriculae injiziert. Eine Gruppe von Tieren, denen in beide Auriculae nur Injektionspuffer i.d. appliziert wurde, diente als Negativkontrolle. Zwei Wochen nach der Erstinjektion wurde eine Boost-Injektion in jeweils der gleichen Weise wie bei der ersten Injektion durchgeführt. Zwei Wochen nach der Boost-Injektion wurde Blut genommen, die Mäuse wurden getötet und die Milz entfernt.
    • 51Cr-Freisetzungtest
  • Aus der Milz erhaltene Splenocyten wurden in vitro mit beta-Gal-Protein stimuliert und die CTL-Aktivität wurde nach 6 Tagen unter Verwendung eines 6stündigen 51-Cr-Standardtests, wie in Rammensee et aL (1989) Immunogenetics 30: 296- 302, beschrieben, bestimmt. Kurz zusammengefasst wurden Zielzellen mit 51Cr markiert und mit dem Peptid TPHPARIGL für 20 min bei Raumtemperatur beladen. Nach der Co-Inkubation von Effektor- und Zielzellen (bei jeweils drei verschiedenen Verhältnissen von Effektor:Zielzellen: 200, 44 und 10) in runden Platten mit 96 Vertiefungen für 6 h wurden 50 ml von 200 ml Kulturüberstand in eine Luma-Szintillationsplatte (Packard) mit 96 Vertiefungen pipettiert, und nach dem Trocknen wurde die Radioaktivität mit einem Szintillationszähler (1405 Microbeta Plus) gemessen. Die prozentuale spezifische Freisetzung wurde aus der Menge des in das Medium freigesetzten 51Cr (A) minus der spontanen Freisetzung (B) geteilt durch die Gesamtfreisetzung (C) (unter Verwendung von Triton X-100) minus der spontanen Freisetzung (B) bestimmt: Prozent spezifische Lyse = 100 (A-B)/(GB).
    • Cytokin-ELISA
  • Nach 4 Tagen der Restimulierung mit beta-Gal-Protein wurde der Überstand der Splenocytenkultur abpipettiert und bei - 50°C bis zur Verwendung gelagert. Auf MaxiSorb-Platten (Nalge Nunc International, Nalge, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C 100 ml Anti-Maus-Anti-IFN-gamma- oder -IL-4-Fängerantikörper (Becton Dickenson, Heidelberg, Deutschland) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in Beschichtungspuffer (0,02 % NaN3, 15 mM Na2CO3, 15 mM NaHCO3, BH 9,6) auspipettiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (0,05 % Tween 20 in PBS) wurden die Platten mit 200 ml Blockingpuffer (0,05 % Twen 20,1% BSA in PBS) für 2 h bei 37° C abgesättigt. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden 100 ml der Zellkulturüberstände für 5 h bei 37° C inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 ml biotinylierte Anti-Maus-Anti-IFN-gamma- oder -IL-4-Detektionsantikörper (Becton Dickenson, Heidelberg, Deutschland) pro Vertiefung bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Blockierungspuffer pipettiert und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden in jede Vertiefung 100 ml einer 1/1000-Verdünnnung Spreptavidin-HRP (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer und zweimal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Danach wurden in jede Vertiefung 100 ml des ABTS-Substrats zugegeben. Nach 15 - 30 min bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei 405 nm mit einem Sunrise-ELISA-Lesegerät (Tecan, Crailsheim, Deutschland) gemessen.
    • Antikörper-ELISA
  • Zwei Wochen nach der Boost-Injektion wurde den Mäusen Blut über die Orbitalvene abgenommen und Blutserum hergestellt Auf Maxisorb-Platten (Nalge Nunc International, Nalge, Dänemark) wurden für 2 h bei 37° C 100 ml beta-Gal-Protein in einer Konzentration von 100 mg/ml in Beschichtungspuffer (0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5) auspipettiert. Dann wurden die Platten dreimal mit 200 ml Waschpuffer (0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,01 MEDTA, 0,1% Tween 20, 1% BSA, pH7,4) gewaschen und mit 200, ml Waschpuffer über Nacht bei 4° C mit Protein abgesättigt. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden Blut-Seren in einer Verdünnung von 1/10, 1/30 bzw. 1/90 in Waschpuffer zugegeben. Nach 1 h bei 37° C wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 ml von 1/1000-Verdünnungen von Ziege-Anti-Maus-IgG1- oder -IgG2a-Antikörpern (Caltag, Burlington, CA, USA) zugegeben. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 ml ABTS-Substrat pro Vertiefung zugefügt. Nach 15-30 min bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei 405 nm mit einem Sunrise-ELISA Lesegerät (Tecan, Crailsheim, Deutschland) gemessen.
    • Ergebnisse und Diskussion
  • Es wurde bestätigt, daß die direkte Injektion von RNA, die für beta-Galaktosidase codiert, in die Auricula von Mäusen eine Anti-beta-Galaktosidase-Immunantwort, im wesentlichen vom Th2-Typ, auslöst: Es wird eine Produktion von Anti-beta-Galaktosidase-Immunglobulinen vom IG1-Typ (Fig. 3A) und eine Sekretion von IL-4 (Fig. 2 B) bei mit beta-Galaktosidasestimulierten Splenocyten von Mäusen festgestellt, denen die für beta-Galaktosidase codierende RNA injiziert wurde. Um die Effizienz der RNA-Vakzine zu verstärken, wurde zusätzlich das Cytokin GM-CFS verabreicht. Dieses Cytokin verstärkt die Effizienz bei einigen DNA-Vakzinen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der Zeitpunkt der GM-CFS-Injektion im Vergleich zur DNA-Injektion den Typus der Immunantwort beeinflußt (Kusakabe (2000) J. Immunol. 164:3102-3111). Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß GM-CFS die durch eine RNA-Vakzinierung hervorgerufene Immunantwort verstärken kann. Die Injektion von GM-CFS einen Tag vor der Injektion von RNA zeigt kaum einen Einfluß auf die Stärke oder den Typus der Immunantwort. Im Gegensatz dazu verstärkt die Injektion von GM-CFS 2 Stunden vor der Injektion der RNA die Immunantwort (vgl. die IL-4-Freisetzung in Fig. 2B bei den 2 Mäusen, denen GM-CFS beim Zeitpunkt T = 0 injiziert wurde), beeinflußt jedoch nicht die Th2-Polarität. Wird GM-CFS dagegen einen Tag nach der RNA-Vakzine in dieselbe Stelle oder in eine davon entfernte Stelle (nicht gezeigt) injiziert, wird die Immunantwort nicht nur insgesamt verstärkt (vgl. die Antikörper-Antwort gemäß Fig. 3), sondern die Immunantwort wird zum Th1-Typ polarisiert (vgl. die IFN-gamma-Produktion durch beta-Gal-Protein-stimulierte Splenocyten gemäß Fig. 2A, die Produktion von IgG2a-Antikörpern gegen beta-Gal gemäß Fig. 3B und die Produktion aktivierter CIL gemäß Fig. 1). Die Injektion von GM-CFS einige Minuten oder einige Stunden nach der RNA-Injektion sollte die gleiche Auswirkung (Verstärkung und Polarisierung) der Immunantwort ergeben.
    • Beispiel 3: Auswirkung von RNase-Inhibitor auf die mRNA-Expression in vivo
  • Es wurde nackte oder protamin-assoziierte bzw. -komplexierte mRNA, die für beta-Galaktosidase codiert (hergestellt wie in Beispiel 2 angegeben) in die Auricula von Mäusen in einer Menge von 25 mg RNA in Injektionspuffer (150 mM NaCl,10 mM HEPES) injiziert. Weiteren Mäusen wurde die für beta-Galaktosidase codierende mRNA zusammen mit 10 U des RNase-Inhibitors RNasin (ein aus Pankreas extrahierter enzymatischer RNase-Inhbitor, erhaltlich von Roche oder Promega) injiziert. Der RNase-Inhibitor wurde unmittelbar mit der RNA-Lösung vor der Injektion vermischt. Nach 12 Stunden wurden jeweils den Mäusen die Ohren abgenommen. Mikroskopische Dünnschnitte der Auriculare wurden hergestellt und mit X-Gal gefärbt. Die Injektion nackter oder protamin-assoziierter mRNA führt zu einer detektierbaren beta-Galaktosidase-Aktivität in einigen wenigen Zellen bei den entsprechenden Dünnschnitten (blaue Zellen in Fig. 5 und 6). Somit haben hier einige Zellen die exogene RNA aufgenommen und in das Protein translatiert. Wenn die für beta-Galaktosidase codierende mRNA mit dem RNase-Inhibitor RNasin geschützt vorlag, wurden sehr viel mehr blaue Zellen als im Fall der nackten oder protamin-assoziierten RNA beobachtet (Fig. 7). Da RNasin RNasen inhibiert, wird die Halbwertszeit der injizierten mRNA Moleküle in vivo, dort wo die Umgebung (interstitielles Gewebe) mit RNasen kontaminiert ist, verlängert. Die derartige Stabilisierung der RNA führt zu einer verstärkten Aufnahme durch die umgebenden Zellen und dadurch zu einer verstärkten Expression des von der exogenen RNA codierten Proteins. Diese Phänomen kann daher auch für eine verstärkte Immunantwort gegen ein von der injizierten mRNA codierten Antigen genutzt werden.
    • Beispiel 4: RNA-Vakzinierung bei Patienten mit malignen Erkrankungen Einleitung
  • Cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) erkennen Antigene als kurze Peptide (8-9 Aminosäuren), die an MHC Klasse I Glykoproteine gebunden an der Zelloberfläche exprimiert werden (1). Diese Peptide sind Fragmente intrazellulärer Eiweißmoleküle. Es gibt jedoch Hinweise, daß auch exogen durch Makropinocytose oder Phagocytose aufgenommene Antigene zur CD8+ T-Zell-vermittelten Immunantwort führen können. Die Proteine werden in Proteosomen gespalten, die hierbei entstehenden Peptide werden aus dem Cytosol in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums transportiert und an MHC Klasse I Moleküle gebunden.
  • Die so prozessierten Proteine werden als Peptid/MHC-Klasse I-Komplex an die Zelloberfläche transportiert und den CTL präsentiert. Dieser Vorgang findet in jeder Zelle statt und ermöglicht so dem Immunsystem ein genaues Überwachen jeder einzelnen Zelle auf das Vorhandensein körpedremder bzw. veränderter oder embryonaler Proteine, unabhängig davon ob sie von intrazellulären pathogenen Keimen, Onkogenen oder dysregulierten Genen stammen. Dadurch sind cytotoxische Lymphocyten in der Lage, infizierte bzw. neoplastische Zellen zu erkennen und zu lysieren (2,3).
  • In den letzten Jahren ist es gelungen, verschiedene tumor-assozierte Antigene (TAA) und Peptide, die von CTL erkannt werden und dadurch zur Lyse von Tumorzellen führen, zu isolieren (21-27). Diese TAA sind in der Lage, T-Zellen zu stimulieren und antigenspezifische CTL zu induzieren, wenn sie als Komplex aus HLA-Molekül und Peptid auf Antigenpräsentierenden Zellen (APC) exprimiert werden.
  • In zahlreichen Untersuchungen, die vor allem bei Patienten mit malignem Melanom durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass maligne Zellen beim Fortschreiten der Tumorerkrankung die Expression von TAA verlieren. Ähnliches wird auch bei Vakzinierungen mit einzelnen Tumorantigenen beobachtet. Unter Vakzinierungstherapien kann es auch zur Selektion von Tumorzellen kommen, was ein Entkommen vom Immunsystem und eine Progression der Erkrankung trotz Therapie ermöglicht. Die Anwendung von mehreren verschiedenen Tumorantigenen wie im erfindungsgemäßen Bebandlungsplan des vorliegenden Beispiels vorgesehen, soll eine Selektion von Tumorzellen sowie ein Entkommen der malignen Zellen vom Immunsystem durch Antigenverlust verhindern.
  • Vor kurzem wurde eine Methode, mit der DC mit RNA aus einem Plasmid, das ein Tumorantigen kodiert, transfiziert werden können, entwickelt (Nair et al., 1998, Nair et al., 2000). Die Transfektion von DC mit RNA für CEA oder Telomerase führte zur Induktion von Antigen-spezifischen CIL. Dieses Verfahren ermöglicht es, CIL sowie T-Helfer Zellen gegen mehrere Epiope auf verschiedenen HLA-Molekülen aus einem Tumorantigen zu induzieren. Ein weiterer Vorteil dieser Strategie ist die Tatsache, dass sie weder die Charakterisierung der verwendeten Tumorantigene bzw. Epitope noch die Definition des HLA-Haplotyps des Patienten voraussetzt. Durch eine derartige polyvalente Vakzine könnte die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von sogenannten klonalen "tumor escape"- Phänomenen deutlich gesenkt werden. Darüber hinaus könnten durch diesen Ansatz T-Zell-vermittelte Immunantworten gegen auf natürlichem Wege prozessierte und präsentierte Antigene mit eventuell höherer Immundominanz induziert werden. Durch zusätzliche Beteiligung von MHC-Klasse II restringierten Epitopen könnte die induzierte tumorspezifische Immunantwort verstärkt und länger aufrecht erhalten werden.
  • Es wird beispielhaft ein erfindungsgemäßes Behandlungsschema zur Tumor-Vakzinierung von Patienten mit fortgeschrittenen malignen Erkrankungen (Mamma-, Ovarial-, kolorektale, Pankreas- und Nierenzellkarzinome) bereitgestellt. Hierbei wird RNA, die aus Plasmiden, die für MUC1, Her-2/neu, Telomerase und MAGE-1 Tumorantigene sowie Influenza-Matrix-Protein (IMP) (positive Kontrolle) codieren, hergestellt wurde, Patienten mit oben erwähnten malignen Erkrankungen intra dermal verabreicht. Dadurch wird eine CTL-Induktion in vivo ermöglicht, um so die Progression der Erkrankung zu verhindern bzw. deren Rückbildung zu bewirken. Die genannten Tumorantigene werden auf den malignen Zellen von Mamma-, Ovarial-, kolorektalen, Pankreas- und Nierenzellkarzinomen exprimiert.
  • Gemäß dem Bahandlungsplan (vgl. die diesbezüglichen nachstehenden Ausfühnmgen sowie Fig. 9) werden die im Labor hergestellten RNA-Spezies, die für CEA, MUC1, Her-2/neu, Telomerase, Mage-1 und IMP kodieren, den Patienten i.d., zunächst 4 x an den Tagen 0,14, 28 und 42, verabreicht. Zusätzlich wird den Patienten jeweils einen Tag nach der RNA-Impfung GM-CSF (Leucomax®, 100 µg/m2, Novartis/Essex Pharma) s.c. verabreicht.
  • Bei der erfindungsgemäßen Behandlung handelt es sich um einen Immunisierungsansatz, der nur minimale Eingriffe beim Patienten (Injektion) erfordert. Die Therapie erfolgt ambulant und ist für viele Tumorpatienten geeignet ohne die Einschränkung auf bestimmte HLA-Typen oder definierte T-Zellepitope. Des Weiteren, können durch diese Therapie polyklonale CD4+-T-Helfer als auch CD8+-CIL induziert werden.
    • Behandlungsplan
  • Die RNAs für mehrere Tumorantigene (MUC1, Her-2/neu, Telomerase, MAGE-1) und für ein Kontrollantigen, dem Influenzamatrixprotein (IMP, virales Antigen), werden dem Patienten i.d. an den Tagen 0,14,28 und 42 verabreicht. Zusätzlich erhalten die Patienten jeweils einen Tag nach der RNA-Impfung GM-CSF (Leucomax® (100 µg/m2) Novartis/Essex Pharma) s.c.. Bei stabilem Krankheitsverlauf bzw. einem objektiven Tumoransprechen (komplette Remission (CR) bzw. partielle Remission (PR)) erhalten die Patienten ggf. die Vakzinierungen einmal im Monat s.c. Nach der vierten Injektion (Tag 49) wird das Ansprechen des Tumors radiologisch, laborchemisch und/oder sonographisch sowie die durch die Therapie induzierten immunologischen Phänomene evaluiert.
  • Ab Tag 70 erfolgt eine Fortführung der Immunisierungstherapie in 4-wöchtentlichen Abständen.
  • An den Tagen 0, 14, 28, 42 und 49 werden jeweils Blutproben für Labor, Diff-BB, FACS-Analyse und Cytokine entnommen (insgesamt 50 ml). Das Restaging der Patienten erfolgt ab Tag 49 sowie ggf. alle weitere 4 bis 8 Wochen.
  • Der Behandlungsplan ist in der Fig. 9 schematisch dargestellt.
    • Labor.
    Gerinnung, Elektrolyte, LDH, β2-M, CK, Leberenzyme, Bilirubin, Kreatinin, Harnsäure, Gesamteiweiß, Gerinnung, CRP, Tumormarker (Ca 12-5, Ca 15-3, CEA, Ca 19-9):15 ml Blut.
    Diff-BB:
    Differentialblutbild mit Ausstrich (5 ml EDTA-Blut).
    Cytokine:
    10 ml Serum.
    FACS:
    10 ml Heparin-Blut.
    ELIspot:
    20 ml Heparin-Blut.
    Multitest:
    Analyse der DTHReaktion.
    DTH:
    (engl. "delayed type hypersensitivity", verspätete T-Zell-vermittelte Reaktion) Analyse der Reaktion auf intra dermal verabreichte RNA. Zusätzlich soll eine Hautbiopsie bei postiver DTH-Reaktion erfolgen (hierfür ist keine Lokalanästhesie eiforderlich).
    Herstellung von RNA aus Plasmiden
  • Für die Produktion einer Vakzine auf mRNA Basis werden nur chemisch syndtetisiene und aus Bakterien aufgetenugte Votstufen benötigt Dies wird vorzugsweise in einer besonders ausgerüsteten RNA Produktions-Einheit bewerkstelligt. Diese befindet sich in einem abgeschlossenen Raum, der als RNase-freie Zone deklariert ist, d.h. Arbeiten mit RNase (z.B, die von Plasmiden) dii1fen nicht ausgeführt werden. Ebenso wird die Kontamination mit natudich vodoommenden RNasen stetig überprüft. Dieser Raum ist mit Neugeräten (4°C. und -20°C-Kühlschränke, Heizblock, Sterilbank, Zentrifuge, Pipetten ausgestattet, welche noch nie in Benutzung für biologische oder klinische Arbeiten waren. Diese RNA-Produktionseinheit wird ausschließlich für die enzymatische Produktion (In vitro-Transkription von mRNA genutzt (ohne bakterielle, virale oder Zellkultur-Arbeiten). Das Endprodukt umfasst eine sterile RNA-Lösung in HEPES/NaCl-Puffer. Qualitätsanalysen werden auf einem Förmaldehyd-Agarosegel durchgeführt. Zusätzlich wird die RNA Konzentration sowie der Anteil an Proteinen photometrisch bestimmt (OD320 < 0,1; Verhältnis von OD260/OD280. > 1,8 bei reiner RNA). Eine mögliche Kontamination durch LPS wird im LAL-Test analysiert. Alle RNA-Proben werden vor dem Verabreichen steril filtriert.
    • PIasmid-Konstrukte
  • Die ausgewählten Gene (CEA, Mucin1, Her-2/neu, Telomerase, Mage-Al and Influenza Matrix) werden über PCR durch den Einsatz eines thermostabilen High-Peformance-Enzyms (pfu, Stratagene) amplifiziert. Die Gene stammen aus Tumor-cDNA (Mucin1, Hec2/neu, Telomerase), oder sie wurden in bakterielle Vektoren kloniert (Influenza Matrix und MAGE-A1). Die PCR-Fragmente werden mit Restriktionsenzymen geschnitten (Mucin1: BglII-SpeI; Her-2/neu: HinDIIIblunt-SpeI; Telomerase: BglII-SpeI; MAGE-A1: BamHI-SpeI; Influenza Matrix Protein: BglII-SpeI) und in das T7TS-Plasmid (vgl. Fig. 8) über die BglII und SpeI Restriktionsstellen kloniert. Plasmide hoher Reinheit werden über das Endo-free Maxipreparation Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) erhalten. Die Sequenz des Vektors wird über eine Doppelstrang-Sequenzierung vom T7 Promotor bis zur PstI Stelle kontrolliert und dokumentiert. Plasmide, deren insertierte Gensequenz korrekt und ohne Mutationen ist, werden für die In vitro -Transkription benutzt. (Kontrolle über die publizierten Sequenzen: Accession Nummern: M11730 für Her-2/neu, NM_002456 für MUC1, NM_003219 für Telomerase TERT, V01099 für Influenza Matrix und M77481 für MAGE-A1).
    • In vitro-Transkription Produktion von linearer, proteinfreier DNA
  • 500 µg von jedem Plasmid werden in einem Volumen von 0,8 ml über ein Verdau mit dem Restriktionsenzym PstI in einem 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß linearisiert. Dieses geschnittene Konstrukt wird in die RNA-Produktionseinheit überführt. 1 ml eines Gemischs von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wird zu der linearisierten DNA gegeben. Das Reaktionsgefäß wird für 2 Minuten gevortext und für 3 Minuten bei 15.000 UpM abzentrifuguiert.
  • Die wässerige Phase wird abgenommen und mit 0,7 ml 2-Propanol in einem 2 ml Reaktionsgefäß vermischt. Dieses Gefäß wird 15 Minuten bei 15000 UpM zentrifugiert, der Überstand verworfen, und es wird 1 ml 75% Ethanol hinzugefügt. Das Reaktionsgefäß wird für 10 Minuten bei 15.000 UpM zenrifugiert, und der Ethanol wird entfernt. Das Gefäß wird nochmals für 2 Minuten zentrifugiert, und die Reste des Ethanols werden mit einer MikroliterPipettenspitze entfernt. Das DNA-Pellet wird dann in 1 µg/ml in RNase-freiem Wasser aufgelöst.
    • Enzymatische Synthese der RNA
  • In einem 50 ml Falcon-Röhrchen wird folgendes Reaktionsgemisch hergestellt: 100 µg linearisierte proteinfreie DNA, 1 ml 5x Puffer (200mM Tris-HCl (pH7,9), 30 mMMgCl2, 10 mM Spermidin, 50 mM NaCl, 50 mM DTI), 2001 Ribonuclease (RNase)-Inhibitor (rekombinant, 5000 U), 1 ml rNTP-Mix(jeweils 10mM ATP, CTP,UIP; 2mM GTP), 1ml CAP Analogon (8 mM),150 µl T7 Polymense (3000 U) und 2,55 ml RNase-freies Wasser. Das Gesamtvolumen beträgt 5 mL Das Gemisch wird für 2 Stunden bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Danach werden 100 U RNase-fteie DNase zugefügt, und das Gemisch wird wieder für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Hierbei wird die DNA-Matrize enzymatisch abgebaut.
    • Beschreibung und Herkunft der einzelnen Komponenten
  • T7 Polymerase: aufgereinigt aus einem E .coli -Stamm, der ein Plasmid mit dem Gen für die Polymerase enthält. Diese RNA-Polymerase verwendet als Substrat nur Promotorsequenzen des 17-Phagen; Fa. Fennentas.
    NTPs: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 96%; Fa. Fermentas.
    CAP Analogon: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 90%; Institut für Organische Chemie der Universität Tübingen.
    RNase Inhibitor: RNasin, zur Injektion, rekombinant hergestellt (E. coli); Fa. Promega.
    DNase: Pulmozym•("dornase alfa"); Fa. Roche
    • Reinigung
  • Die mit DNase behandelte RNA wird mit 20 ml von einer Lösung aus 3,3 ml 5 M NH4OAc plus 16,65 ml Ethanol vermischt Das Gemisch wird für 1 Stunde bei -20°C inkubiert und bei 4000 UpM für 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet mit 5 ml 75% RNase-freiem Ethanol gewaschen. Das Gefäß wird nochmals bei 4000 UpM für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Gefäß wird nochmals unter den vorherigen Bedingungen zentrifugiert und der verbleibende Ethanol mit einer Mikroliterpipettenspitze entfernt. Das Reaktionsgefäß wird geöffnet, und das Pellet wird unter einer Sterilbank im sterilen Umfeld getrocknet.
  • 1 ml RNase-freies Wasser wird zur getrockneten RNA hinzugefügt. Das Pellet wird bei 4 °C für mindestens 4 Stunden inkubiert. 2 µl der wässerigen Lösung werden einer quantitativen Analyse (Bestimmung der UV-Absorption bei 260 nm) unterzogen. 2 ml einer Phenol/Chloroform /Isoamylalkohol-Lösung werden zu 1 ml wässeriger RNA-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wird für 2 Minuten gevortext und bei 4000 UpM für 2 Minuten zentrifugiert. Die wässerige Phase wird mit einer Mikroliterpipette entfernt und in ein neues Reakionsgefäß überführt. 4 ml einer Lösung aus 0,66 ml 5 MNH4OAc plus 3,33 ml Ethanol werden hinzugefügt. Das Gemisch wird für 1 Stunde bei -2o°C inkubiert und bei 4000 UpM für 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet mit 75% RNase freiem Ethanol gewaschen. Das Gefäß wird nochmals bei 4000 UpM für 15 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Das Gefäß wird nochmals unter den vorherigen Bedingungen zentrifugiert und der verbleibende Ethanol mit einer Mikroliterpipettenspitze entfernt. Das Reaktionsgefäß wird geöffnet und unter einer Sterilbank das Pellet im sterilen Umfeld getrocknet.
  • Die RNA wird in RNase-freiem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10 mg/ml eingestellt. Sie wird 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Durch Zugabe von Injektionspuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES) wird eine Endkonzentration von 2 mg/ml erreicht. Das Endprodukt wird vorzugsweise unter GMP-Bedingungen vor Gebrauch sterilfiltriert.
    • Applikation der RNA
  • Jeder Patient erhält an zwei verschiedenen Stellen eine intradermale (i.d.) Injektion von je 150 µl der Injektionslösung, in der je 100 µg Antigen-codierende mRNA (CEA, Her-2/neu, MA-GE-A1, Mucin 1, Telomerase, Influenza Matrix Protein) gelöst vorliegt.
  • Nach der Primärimmunisierung wird alle 14 Tage eine Booster-Immunisierung durchgeführt, um dann die Impfungen in monatlichem Abstand zu wiederholen. Jeweils einen Tag nach der RNA-Injektion wird den Patienten zusätzlich GM-CSF (Leucomax®, Sandoz/Essex Pharma) sub cutan (s.c.) verabreicht.
  • Bei vorhandenem klinischen Ansprechen bzw. Stabilisierung der Erkrankung wird diese Therapie in monatlichen Abständen fortgeführt.
    • Weitere immunologische Untersuchungen in vitro (optional)
  • Durchflusscytometrische Untersuchungen von PBMC zur Quantifizierung von CIL-Vorläufern;
    51Cr-Freisetzungstests;
    Lösliche Rezeptoren- und Cytokinspiegel im Serum;
    DTH-Reaktion (Hautreaktion auf intra dermal injizierte RNA, "delayed type hypersensitivitγ", T-Lymphocyten vermittelte Reaktion); und
    Hautbiopsieproben aus der Injektionsstelle zur histologischen Untersuchung auf T-ZellInfiltration (Pathologie).
    • Parameter zur Beurteilung der Wirksamkeit
  • Um die Frage nach der Wirksamkeit dieser Immuntherapie beantworten zu können, wird die Induktion tumorspezifischer T-Zellen und einer meßbaren Tumonemission herangezogen. Als Parameter gelten in vitro und in vivo gemessene T-Zellreaktionen sowie Größenänderungen bidimensional erfaßbarer Tumormanifestationen oder laborchemischer Verlaufsparameter.
  • Die objektive Remission ist definiert als bestes Ansprechen in Form einer kompletten oder partiellen Remission, entsprechend den unten aufgeführten Kriterien. Die Remissionsrate berechnet sich aus dem Verhältnis aus der Anzahl der Patienten mit objektiver Remission und der Gesamtzahl auswertbarer Patienten.
  • Als immunologisches Ansprechen auf die Therapie wird eine Veränderung im Immunstatus, bestimmt durch Immuntypisierung peripherer mononukleärer Zellen, Erhöhung der antigen-spezifischen CIL-Vorläuferfrequenz im peripheren Blut und die Induktion einer anhaltenden tumorspezifischen T-Zellaktivität gewertet. Hierzu werden in vitro Induktionskulturen zur Aktivierung tumorspezifischer CTL etabliert.
    • Remissionskriterien (gem UICC)
    • Komplette Remission (CR):
    Vollständige Rückbildung aller messbaren Tumormanifestationen, dokumentiert durch 2 mindestens 4 Wochen ausemanderliegende Kontrolluntersuchungen.
    Partielle Remission (PR):
    Größenabnahme der Summe der Flächenmaße (Produkt zweier Tumordurchmesser oder lineare Messung eindimensional messbarer Läsionen aller Tumorbefunde um 50% für mindestens 4 Wochen). Kein Neuauftreten von Tumormanifestationen oder Progression eines Tumorbefunds.
    "No Change" (NC):
    Abnahme aller messbaren Tumormanifestationen um weniger als 50 % oder Zunahme eines Tumorbefundes.
    Progression (PD):
    Größenzulmahme der Tumorparameter in mindestens einem Herd oder Neuauftreten einer Tumormanifestation.
    Referenzen
    1. 1. Rammensee HG, Falk K, Rotzschke O: Peptides naturally presented by MHC class I molecules. Annu Rev Immunol 11: 213,1993.
    2. 2. Bevan MJ: Antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes in vivo. J Exp Med 182: 639,1995.
    3. 3. Rock K.L: A new foreign policy: MHC class I molecules police the outside world. Immunol Today 17:131,1996.
    4. 4. Steinman, A.M: The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev Immunol 9:271,1991.
    5. 5. Steinman RM, Witmer-Pack M, Inaba K: Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol 329:1,1993.
    6. 6. Inaba K, Metlay JP, Crowley MT, Steinman RM: Dendritic cells pulsed with protein antigens in vitro can prime antigen-specific, MHGrestricted T cells in situ. J Exp Med 172:631,1990.
    7. 7. Austyn JM: New insight into the mobilisation and phagocytic activity of dendritic cells. J Exp Med 183:1287,1996.
    8. 8. Romani N, Koide S, Crowley M, Witmer-Pack M, Livingstone AM, Fathman OG, Steinman RM: Presentation of exogenous protein antigens by dendritlc cells to T cell clones. J Exp Med 169:1169,1989.
    9. 9. Nair S, Zhou F, Reddy R, Huang L, Rouse BT: Soluble proteins delivered to dendritic cells via pH-sensitive liposomes induce primary cytotoxic T lymphocyte responses in vitro. J Exp Med 175:609, 1992.
    10. 10. Cohen PJ, Cohen PA, Rosenberg SA, Katz SI, Mule JJ: Murine epidermal Langerhans cells and splenic dendritic cells present tumor-associated antigens to primed T cells. Eur J Immunol 24:315, 1994.
    11. 11. Porgador A, Gilboa E: Bone-marrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med 182:255, 1995.
    12. 12. Celluzzi CM, Mayordomo JI, Storkus WJ, M. T. Lotze MT, and L. D. Falo LD: Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific, CTL-mediated protective tumor immunity. J Exp Med 183:283,1996.
    13. 13. Zitvogel L, Mayordomo JI, Tjandrawan T,DeLeo AB,Clarke MR, Lotze MT, Storkus WJ: Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines. J Exp Med 183:87, 1996.
    14. 14. Porgador A, Snyder D, Gilboa E: Induction of antiaumor immunity using bone marrow-generated dendritic cells. J Immunol 156:2918,1996.
    15. 15. Paglia P, Chiodoni C, Rodolfo M, Colombo MP: Murine dendritic cells loaded in vitro with soluble protein prime cytotoxic T lymphocytes against tumor antigen in vivo. J Exp Med 183:317,1996.
    16. 16. Brossart P, Goldrath AW, Butz EA, Martin S, Bevan MJ: Adenovirus mediated delivery of antgenic epitopes into DC by a means of CTL induction. J Immunol 158: 3270, 1997.
    17. 17. Fisch P, Köhler G, Garbe A, Herbst B, Wider D, Kohler H, Schaefer HE, Mertelsmann R, Brugger W, Kanz L: Generation of antigen-presenting cells for soluble protein antigens ex vivo from peripheral blood CD34+hematopoetic progenitor cells in cancer patients. Eur J Immunol 26:595,1996.
    18. 18. Sallusto F, Cella M, Danieli C, Lanzavecchia A: Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the Major Histocompatibility Complex class II compartment: Down regulation by cytokines and bacterial products. J Exp Med 182:389,1995.
    19. 19. Bembard H, Disis ML, Heimfeld S, Hand S, Gralow JR, Cheever MA: Generetion of immunostimulatorry dendritic cells from human CD34+ hematopoetic pcogemtor cells of th bone manowand periphereal blood. Cancer Res 55:1099,1995.
    20. 20. Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, Liles TM, Czerwinski D, Taidi B, Engelman EG, Levy R: Vaccination of patients with B-cell lympnoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. Nat Med 2: 52, 1996.
    21. 21. Robbins PF, Kawakami Y: Human tumor antigens recognized by T cells. Cuir Opin Immunol 8:628,1996.
    22. 22. Linehan DC, Goedegebuure PS, Peoples GE, Rogers SO, Eberlein TJ: Tumor-specific and HLA-A2 restricted cytolysis by tumor-associated lymphocytes in human metastatic breast cancer. J Immunol 155: 4486,1995.
    23. 23. Peoples GE, Goedegebuure PS, Smith R, Linehan DC, Yoshino I, Eberlein TJ: Breast and ovarian cancer specific cytotoxic T lymphocytes recognize the same HER-2/-neu derived peptide. Proc Natl Acad Sci USA 92: 432,1995.
    24. 24. Fisk B, Blevins TL, Wharton JT, Ioannides CG: Identification of an immunodomonant peptide of HER-2/neu protooncogene recognized by ovarian tumor-specific cytotoxic t lymphocyte lines. J Exp Med 181: 2109, 1995.
    25. 25. Brossart P, Stuhler G, Flad T, Stevanovic S, Rammensee H-G, Kanz L and Brugger W. HER-2/neu derived peptides are tumor-associated antigens expressed by human renal cell and colon carcinoma lines and are recognized by in vitro induced specific cytotoxic Tlymphocytes. Cancer Res. 58:732-736,1998.
    26. 26. Apostolopoulos, V. and McKenzie, I. F. C, Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit. Rev. ImmunoL 14:293-302,1995.
    27. 27. Brossart P, Heinrich KS, Stevanovic S, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Muhm A, Rammensee H G, Kanz L, Brugger W. Identification of HLA-A2 restricted T cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable cancer vaccines. Blood 93: 4309-4317,1999
    28. 28. Brossart P, Wirths S, Stuhler G, Reichardt VL., Kanz L, Brugger W. Induction of CIL responses in vivo after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. Blood 96:3102-8, 2000
    29. 29. Kugler A, Stub1er G, Walden P, ZäHer G, Zobywalski A, Brossart P, Trefzer U, UDrich S, Müller CA, Becker V, Gross AJ, Hemmerlein B, Kanz L, Müller GA, Ringert RH. Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids. Nature Med 3: 332-336, 2000 (IF 25,58)
    30. 30. Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G, Schadendorf D (1998) Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat.Med. 4:328
    31. 31. Schuler-Thurner B, Dieckmann D, Keikavoussi P, Bender A, Maczek C, Jonuleit H, Roder C, Haendle I, Leisgang W, Dunbar R, Cerundolo V, von Den DP, Knop J, Brocker EB, Enk A, Kampgen E, Schuler G (2000) Mage-3 and influenza-matrix peptide-specific cytotoxic T cells are inducible in terminal stage HLA-A2.1 + melanoma patients by mature monocyte-derived dendritic cells. J. Immunol. 165:3492
    32. 32. Thurner B, Haendle I, Roder C, Dieckmann D, Keikavoussi P, Jonuleit H, Bender A, Maczek C, Schreiner D, von Den DP, Brocker EB, Steinman RM, Enk A, Kampgen E, Schuler G (1999) Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanona. J. Exp. Med. 190:1669
    Beispiel 5: Vekzinierung mit autologer, amplifizierter Tumor-RNA bei Patienten mit malignern Melanom Einleitung
  • Die Inzidenz des malignen Melanoms ist in den letzten Jahren weltweit stark angestiegen. Falls sich die Melanomerkrankung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits im metastasierten Stadium befindet, so gibt es derzeit keine Therapie, die den weiteren Krankheitsverlauf mit ausreichender Sicherheit positiv beeinflußt.
  • Bislang durchgeführte Vakzinierungstherapien unter Verwendung von dendritischen Zellen sind wegen der komplizierten Anzüchtung der Zellen sehr labor, kosten- und zeitintensiv (GMP-Bedingungen). Weiterhin konzentrierten sich die Studien bislang vorwiegend auf bekannte tumorassoziierte Antigene (TAA), wie zum Beispiel Melan-A oder Tyrosinase.
  • Eine Reihe verschiedener immunologischer Phänomene wie unter anderem das Auftreten von spontanen Tumorregressionen oder der spontanen Involution von Metastasen haben das Melanom zum vorrangigen Kandidaten zur Erprobung immuntherapeutischer Untersuchungen gemacht (Parkinson et al., 1992). Neben Versuchen der unspezifichen Stimulation des Immunsystems mittels Interleukin-2, Mistelextrakten, BOG und Interferonen, die bisher zu keinen entscheidenden Durchbrüchen in der Therapie fortgeschrittener Tumorerkrankungen führten, wurde in den letzten Jahren insbesondere die Strategie der Induktion verschiedener hochspezifischer cytotoxischer T-Lymphocyten (CTL) verfolgt. Diese CTL sind in der Lage autologe Melanomzellen zu erkennen und abzutöten (Boon et al., 1994; Houghton, 1994). Untersuchungen dieses Vorgangs ergaben, dass die CIL definierte Peptide in Verbindung mit MHC-Klasse-I-Molekülen erkennen. Die Präsentation von Peptiden durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) sind der physiologische Weg zur Erzeugung von spezifischen Immunantworten durch Lymphocyten (Rammensee, 1993). Dendritische Zellen haben sich als potente Antigen-präsentierende Zellen erwiesen, die auf zwei Wegen zu einer Induktion der Immunantwort führen: Der erste ist die direkte präsentation von Peptiden gegenüber CD8+- T-Lymphocyten und deren Aktivierung (Schuler &Steinmann, 1985; Inaba, et al., 1987; Romani et al., 1989), der zweite ist die Erzeugung einer protektiven Immunantwort, die von CD4+-Helferlymphocyten vermittelt wird, und eine Präsentation von Peptiden über MHC-Klasse-II-Moleküle voraussetzt (Grabbe et al., 1991,1992,1995).
  • Mittels der Peptidanalyse konnten so verschiedene Tumor-assozierte Antigene (TAA) identifiziert werden, die für das Melanom spezifisch sind und nach Präsentation in Verbindung mit dem MHC-Molekül und Erkennung durch die CTL zur Cytolyse der Tumorzellen führen (Schadendorf et al.,1997, S.21-27).
  • Die Verwendung von autologen, dendritischen Zellen wurde im Rahmen einer Pilotstudie bei Melanompatienten bezüglich seines Potentials, effektiv, schnell und zuverlässig cytotoxische T-Lymphocyten zu induzieren, getestet. In dieser Studie wurden 16 bereits chemotherapeutisch vorbehandelte Melanompatienten im Stadium IV mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen vakziniert. Die Ansprechraten lagen über 30% (5/16 Patienten) (Nestle et al., 1998). In einer weiteren unabhängigen Studie konnte eine noch höhere Ansprechrate von mehr als 50% (6/11 Patienten) nach Immunisierung von bereits chemotherapeutisch vorbehandelten, metastasierten Melanompatienten mit MAGE-3A1-beladenen dendritischen Zellen gezeigt werden (Thumer et al., 1999). Ebenfalls wurde eine signifikante Expansion von MAGE-A3-spezifischen CD8+-T-Zellen in 8/11 Patienten beobachtet. Es erfolgte nach der DG Vakzinierung in einigen Fällen eine Regression der Metastasen. Dies wurde von einer CD8+-T-Zell-Infiltration begleitet. Dies zeigte, dass die induzierten T-Zellen in vivo aktiv waren. Nachteil dieser Strategie ist der große kosten- und labortechnische Aufwand (insbesondere GMP-Bedingungen). Für die zeitinsive Generierung der DC werden große Mengen an Patientenblut benötigt. Bei der Herstellung der Peptide kann zum einen nur auf bekannte tumorassoziierte Antigene zurückgegriffen werden, zum anderen sind je nach HLA-Haplotyp verschiedene Peptide notwendig.
  • Eine Weiterentwicklung dieses Ansatzes ist die Vakzinierung mit RNA-transfizierten DC (Nair et al., 1998, Nair et aL, 2000). Zahlreiche Studien belegen inzwischen, daß DC von Maus und Mensch, die mit mRNA transfiziert wurden, eine effiziente CTL-Antwort in vitro und in-vivo auslösen können und zu einer deutlichen Reduktion von Metastasen führen können (Boczkowski et aL, 1996, 2000; Ashley et aL, 1997; Nair et aL, 1998, 2000; Heiser et aL, 2001; Mitchell and Nair, 2000; Koido et al., 2000; Schmitt et aL, 2001). Ein großer Vorteil bei der Verwendung von RNA gegenüber Peptiden ist, dass verschiedenste Peptide aus einer für ein TAA codierenden mRNA prozessiert und präsentiert werden können. Durch eine derartige polyvalente Vakzine kann die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von sogenannten klonalen "tumor escape"- Phänomenen deutlich gesenkt werden. Darüber hinaus können durch diesen Ansatz T-Zell-vermittelte Immunatworten gegen auf natürlichem Wege prozessierte und präsentierte Antigene mit potentiell höherer Immundominanz induziert werden. Durch zusätzliche Beteiligung von MHC-Klasse-II-restringierten Epitopen kann die induzierte tumorspezifische Immunantwort verstärkt und länger aufrecht erhalten werden. Trotzdem ist auch dieses Verfahren wegen der nötigen Kultivierung der autologen DCs nur mit hohem Laboraufwand (GMP-Bedingungen) durchführbar.
  • Bei der vorliegenden erfindungsgemäßen Strategie wird mit dem im autologen Tumor des Patienten vorhandenen RNA-Expressionsprofil vakziniert. Dadurch wird dem spezifischen Tumorprofil des Patienten Rechnung getragen, wobei auch unbekannte TAAs in die Impfung mit eingehen. Die aufwendige Anzucht der DC entfällt, da bei der Vakzinierung RNA (keine transfizierten DCs) verwendet werden.
  • Erfindungsgemäß wird daher eine Impftherapie unter Verwendung von amplifizierter autologer Tumor-RNA an Patienten mit metastasiertem malignem Melanom, insbesondere Stadium III/IV, bereitgestellt.
  • Durch die Vakzinierung werden in vivo eine tumorspezifische cytotoxische T-Zellen induziert, um so einen klinisch-therapeutischen Effekt (Tumor-Response) zu erreichen. Es handelt sich um einen Immunisierungsansatz, der nur minimale Eingriffe beim Patienten (Injektion) erfordert. Die Therapie kann ambulant erfolgen und ist für viele Tumorpatienten geeignet ohne die Einschränkung auf bestimmte HLA-Typen oder definierte T-Zellepitope. Darüber hinaus können durch diese Therapie polyklonale CD4+ T-Helfer als auch CD8+-CIL induziert werden. Von der Strategie her entscheidend ist auch die Berücksichtigung bislang unbekannter TAAs beim Impfprotokoll, sowie die ausschließliche Verwendung von autologem Material besonders vorteilhaft.
    • Behandlungplan
  • Die amplifizierte autologe Tumor-RNA wird dem Patienten i.d. an den Tagen 0;14, 28 und 42 verabreicht. Zusätzlich erhalten die Patienten jeweils einen Tag nach der RNA-Impfung GM-CSF (Leucomax® 100 µg/m2, Novartis/Essex) s.c. Jeder Patient erhält an zwei verschiedenen Stellen eine i.d. Injektion von je 150 µl der Injektionslösung, in der je 100 µg autologe Tumor-RNA gelöst ist.
  • 2 Wochen nach der vierten Injektion (Tag 56) werden gff. das Ansprechen des Tumors durch eine Staging-Untersuchung (u.a. Sonografie, Röntgen-Thorax, CT usw.; siehe hierzu die weiter unten stehenden Ausführungen) sowie durch die Auswertung der durch die Therapie induzierten immunologischen Parmeter evaluiert.
  • Bei stabilem Krankheitsverlauf oder einem objektiven Tumoransprechen (CR bzw. PR) erhalten die Patienten die Vakzinierungen alle 4 Wochen. Weitere Restaging-Untersuchungen können bspw. Tag 126, dann im 12-wöchigem Abstand vorgesehen werden.
  • Der Behandlungsplan ist in der Fig. 13 schematisch dargestellt.
    • Herstellung autologer Tumor-RNA
  • Ziel ist die Herstellung autologer Poly(A+)-RNA. Hierfür wird aus patienteneigenen Tumorgewebe Poly(A+)-RNA isoliert. Diese isolierte RNA ist an sich sehr instabil und in ihrer Menge limitiert. Deshalb wird die genetische Information in eine wesentlich stabilere cDNA-Bibliothek und somit konserviert. Ausgehend von der patienteneigenen cDNA-Bibliothek kann für den gesamten Behandlungszeitraum stabilisierte autologe RNA hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Vorgehen ist in der Fig.10 schematisch dargestellt.
    • RNA-Isolierung
  • Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus einer Tumorgewebe-Biopsie wird ein Verfahren der Fa. Roche AG angewendet. Hierbei wird das High Pure RNA Isolation Kit (Bestellnummer 1828665) nach Herstellerangaben eingesetzt. Poly(A+)-RNA wird aus der Gesamt-RNA über ein weiteres Verfahren der Roche AG mit dem High Pure RNA Tissue Kit (Bestellnummer 2033674) isoliert.
    • Herstellung einer cDNA-Bibliothek
  • Die cDNA Bibliothek wird mit dem "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" (Fa. Clontech Inc., USA; Bestellnummer PT3041-1) gemäß den Angaben des Herstellers konstruiert.
  • Hierbei wird die einzelsträngige Poly(A+)-RNA über einen speziellen Primer revers transkribiert. Über einen poly-C-Überhang am 3'-Ende der neu synthetsierten DNA kann ein weiterer Primer hybridisieren, über den das Konstrukt durch PCR amplifiziert werden kann. Die doppelsträngigen cDNA-Fragmente stehen num zur Klonierung in einen geeigneten RNA-Produktionsvektor (z.B. pT7TS; vgl. Fig. 8) bereit.
  • Das Verfahren zur Herstellung der cDNA-Bibliothek aus der Poly-A+-RNA mit Hilfe des obigen Kits ist in der Fig.11 schematisch dargestellt.
    • Plasmid-Konstrukte
  • Die cDNA-PCR-Fragmente werden mit den Restriktionsenzymen NotI und SpeI geschnitten und in die entsprechenden Restriktionsstellen des pT7TS Vektors analog der im Beispiel 4 angegebenen Vorgehensweise kloniert. Plasmide hoher Reinheit werden über das Endo-free Maxipreparation Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) erhalten. Plasmide, deren einklonierte Gensequenz der erwarteten Grössenfraktionierung (200bp-4000bp) der cDNA-Bibliothek entsprechen, werden für die In vitro -Transkription benutzt. Ein Beispiel einer Auftrennung einer repräsentativen cDNA-Bibliothek in einem Agarosegel ist in der Fig. 12 gezeigt.
    • In vitro-Transkription und RNA-Applikation
  • Die In vitro -Transkription und die Verabreichung der RNA erfolgen wie im vorstehenden Beispiel 4 beschrieben.
    • Untersuchungen während der Behandlung
  • Vor jeder Impfung (am Tag der Impfung):
    Körperliche Untersuchung (einschließlich RR, Fieber;
    Blutabnahme Routine-Laborwerte
    1. 1. Blutbild, Differential. Blutbild:3 ml
    2. 2. Elektrolyte, LDH, CK, Leberenzyme, Bilirubin, Kreatinin, Harnsäure, Gesamteiweiß, CRP: 5 ml
    3. 3. Blutsenkung: 2 ml; und
    bei Wiederholungsimpfungen zusätzlich: Inspektion der Injektionsstellen.
  • Am Tag 1 nach jeder Impfung:
    Körperliche Untersuchung (einscbließlich RR, Fieber); und
    Inspektion der Injektionsstellen.
  • Bei Staging-Untersuchungen am Tag 56 und 126 nach der ersten Impfung, dann alle 12 Wochen, zusätzlich:
    Erweiterte Routine-Blutentnahme:
    1. 1. Tumormaker S100 (7 ml)
    2. 2. Gerinnungeswerte (3 ml) ;
    Blutentnahme Immunmonitoring (30 ml);
    Allgemeibefinden (ECOG-Score);
    Bildgebende Verfahren (Röntgen-Thorax, Sonographie, Skelettszintigramm, CT-Abdomen, Becken, Thorax, Schädel); und
    EKG. Weitere immunologische Untersuchungen in vitro
  • Es wird ggf. die relative Häufigkeit von antigen-spezifischen CTL Vorläuferzellen im peripheren Blut des Patienten im zeitlichen Verlauf der Impftherapie gemessen.
  • Zum einen werden hierbei mit FACS-Analysen (Tetramerfärbung) CTL-Vorläuferzellen quantifiziert, die gegen von Melanomzellen im besonderen Maße exprimierte Antigene gerichtet sind (Tyrosinase, MAGE-3, Melan-A, GP100). Zum anderen werden ELIspot Untersuchungen durchgeführt, die so ausgelegt sind, dass zusätzlich CTL-Vorläuferzzellen erfasst werden, die spezifisch gegen bislang unbekannte Antigene gerichtet sind. Dazu werden autologe dendritische Zellen, die aus dem peripheren Blut der Patienten kultiviert werden, mit der gleichen RNA inkubiert, mit der auch die Impfung durchgeführt wurde. Diese dienen dann als Stimulatorzellen in der ELIspot-Untersuchung. Die Messung erfasst somit das gesamte Impfspektrum. Für diese Untersuchungen können Blutentnahmen für das Immunmonitoring im Rahmen der Staging-Untersuchungen und zusätzlich an den Tagen 0,14, 28 und 42 von insgesamt 30 ml (20 ml ELIspot, 10 ml FACS-Analyse) vorgesehen werden, sowie eine einmalige Abnahme von 100 ml an Tag 70 zur Anzucht der DC.
  • Des Weiteren können Hautbiopsieproben aus der Injektionsstelle zur histologischen Untersuchung hinsichtlich einer T-Zell-Infilration gewonnen werden.
    • Parameter zur Beurteilung der Wirksamkeit
  • Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Therapie wird anhand der vorstehend im Beispiel 4 angegebenen Parameter bewertet.
    • Referenzen
    • Anichini, A, Mortarini, R., Maccalli, C., Squarcina, P., Fleishhauer, K., Mascheroni, L., Parmiani, G. (1996). Cytotoxic T cells directed to tumor antigens not expressed on normal melanocytes dominate HLA-A2.1-restricted immune repertoire to melanoma. J. Immunol. 156,208-217.
    • Ashley, DM., Faiola, B., Nair, S., Hale, I.P., Bigner, DD, Gilboa, E. (1997). Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with tumor extracts or tumor RNA induce anti-tumor immunity against central nervous system tumors. J. Exp. Med. 186,1177-1182.
    • Boczkowski, D., Nair, SK., Synder, D., Gilboa, E. (1996). Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J. Exp. Med. 184, 465-472 .
    • Boczkowski, D., Nair, SK., Nam, J., Lyerly, K., Gilboa, E. (2000). Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60, 1028-1034.
    • Boon, T., Coulie, P., Marchand, M, Weynants, P., Wölfel, T., Brichard, V. (1994). Genes coding for tumor rejection antigens: perspectives for specific immunotherapy. In Important Advances in Oncology 1994. De Vita, VT, Hellman, S., Rosenberg, SA, ed. (Philadelphia: Lippincott Co), pp. 53-69.
    • Garbe, C, Orfanos, CE (1989): Epidemiologie des malignen Melanoms in der Bundesrepublik Deutschland im internationalen Vergleich. Onkologie 12, 253-262.
    • Grabbe, S., Bruvers, S., Gallo, R.L., Knisely, T.L., Nazareno, R., and Granstein, R.D. (1991). Tumor antigen presentation by murine epidermal cells. J Immunol. 146,3656-3661.
    • Grabbe, S., Bruvers, S., Lindgren, A.M., Hosoi, J., Tan, K.C., and Granstein, R.D. (1992). Tumor antigen presentation by epidermal antigen-presenting cells in the mouse: modulation by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, tumor necrosis factor alpha, and ultraviolet radiation. J Leukoc. Biol. 52, 209-217.
    • Grabbe, S., Beisseit, S., Schwarz, T., and Granstein, R.D. (1995). Dendritic cells as initiators of tumor immune responses: a possible strategy for tumor immunotherapy?. Immunol. Today 16,117-121.
    • Grünebach, F, Müller, MR, Nencioni, A, Brugger, W, and Brossart P (2002). Transfection of dendritic cells with RNA induces cytotoxic T lymphocytes against breast and renal cell carcinomas and reveals the immunodominacnce of presented T cell epitopes. submitted.
    • Heiser, A., Maurice, MA., Yancey, DR., Coleman, DM., Dahm, P., Vieweg, J. (2001). Human dendritic cells transfected with renal tumor RNA stimulate polyclonal T cell responses against antigens expressed by primary and metastatic tumors. Cancer Res. 61, 3388-3393.
    • Heiser, A., Maurice, MA., Yancey, DR., Wu, NZ., Dahm, P., Pruitt, SK., Boczkowski, D., Nair, SK., Ballo, MS., Gilboa, E., Vieweg, J. (2001). Induction of polyclonal prostate cancer-specific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA. J. Immunol. 166, 2953-2960.
    • Hoerr, I, Obst, R, Rammensee, HG, Jung, G (2000). In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies. Eur J Immunol. 30, 1-7.
    • Houghton, AN (1994). Cancer antigens: immune recognition of self and altered self. J.Exp.Med 180,1-4
    • Inaba, K, Young, JW and Steinman, RM (1987). Direct activation of CD8+ cytotoxic T lymphocytes by dendritic cells. J.Exp.Med. 166,182-194.
    • Koido, S., Kashiwaba, M, Chen, D., Gendler, S., Kufe, D., Gong, J. (2000). Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. J. Immunol. 165,5713-5719.
    • Mitchell, DA., Nair, SK. (2000). RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069.
    • Nair, S., Boczkowski, S., Synder, D., Gilboa, E. (1998). Antigen presenting cells pulsed with unfractionated tumor-derived peptides are potent tumor vaccines. Eur. J. ImmunoL 27, 589-597.
    • Nair, S., Heiser, A., Boczkowski, D., Majumdar, A., Naoe, M, Lebkowski, JS., Vieweg, J., Gilboa, E. (2000). Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelated tumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells. Nat. Med. 6,1011-1017 .
    • Nestle, F.O., Alijagic, S., Gilliet, M., Sun, Y., Grabbe, S., Dummer, R, Burg, G., and Schadendorf, D. (1998). Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat.Med 4, 328-332.
    • Parkinson, DR, Houghton, AN, Hersey, P, Borden, EC (1992). Biologic therapy for melanoma. I Cutaneous melanoma. Balch, CM, Houghton, AN, Milton GW, Soober, AJ, Soong, SJ, ed. (Lippincott Co), pp. 522-541
    • Rammensee, H.G., Falk, K., and Rotzschke, O. (1993). Peptides naturally presented by MHC class I molecules. Annu.Rev.Immunol. 11, 213-244.
    • Romani N, Koide S, Crowley M, Witmer-Pack M, Livingstone AM, Fathmm OG, steinman RM: Presentation of exogenous protein antigens by dendritic cells to T cell clones. J Exp Med 169:1169, 1989.
    • Schadendorf, D, Grabbe, S, Nestle, FO (1997). Vaccination with Dendritic Cells - A specific Immunomodulatory Approach. In Strategies for Immunointervention in Dermatoilogy. Burg, G, Dummer, RG, ed. (Heidelberg, NeW York: Springer-Verlag),
    • Schmitt, WE., Stassar, MJJG., Schmitt, W., Littlee, M, Cochlovius, B. (2001). In vitro induction of a bladder cancer-specific T-cell response by mRNA-transfected dendritic cells. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127, 203-206.
    • Schmoll HJ, Höffken K, Possinger K (1997): Kompendium Internistische Onkologie, 2. Aufl., Springer-Verlag Berlin, Teil 2,1415.
    • Schuler G and Steinmann RM (1985). Murine epidermal Langerhans cells mature into potent immunostimulatory dendritic cells in vitro. J.Exp.Med. 161,526-546.
    • Thumer, B., Haendle, I., Roder, C. et al. (1999). Vaccination with Mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derrived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J. Exp. Med. 190, 1669-1678.

Claims (27)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine mRNA, umfassend mindestens einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor codierenden Bereich, in Verbindung mit einem wässerigen Lösungsmittel.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der für das oder die Antigen(e) aus einem Tumor codierende Bereich und/oder der 5'- und/oder der 3'-nicht-translatierte Bereich der mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA derart verändert ist, dass er keine destabilisierenden Sequenzelemente aufweist.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mRNA eine 5'-Cap-Struktur und/oder einen Poly(A+)-Schwanz vonmindestens etwa 25 Nucleotiden und/oder mindestens eine IRES und/oder mindestens eine 5'-Stabilisierungssequenz und/oder mindestens eine 3'-Stabilisierungssequenz aufweist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die 5'- und/oder die 3'-Stabiliserungssequenz(en) aus der Gruppe, bestehend aus nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des β-Globingens und einer Stabilisierungssequenz der allgemeinen Formel (C/U)OCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)OC, ausgewählt istw/sind.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die mRNA mindestens ein Anologes natürlich vorkommender Nucleotide aufweist.
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Analoge aus der Gruppe, bestehend aus Phosphorthioaten, Phosphoramidaten, Peptidnucleotiden, Methylphosphonaten, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin, ausgewählt ist.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das oder die Antigen(e) aus einem Tumor ein Polyepitop von Antigenen aus einem Tumor ist/sind.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Polyepitop durch Deletion, Addition und/oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste modifiziert ist.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die mRNA zusätzlich für mindestens ein Cytokin codiert.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welche weiter ein oder mehrere Adjuvanzien enthält.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Adjuvans aus der Gruppe, bestehend aus Lipopolysaccharid, TNF-α, CD40-Ligand, GP96, Oligonucleotiden mit dem CpG-Motiv, Aluminiumhydroxid, Freud'sches Adjuvans, Lipopeptiden und Cytokinen, ausgewählt ist.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Cytokin GM-CSF ist.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die mRNA mit mindestens einem kationischen oder polykationischen Agens komplexiert oder kondensiert vorliegt.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das kationische oder polykationische Agens aus der Gruppe, bestehend aus Protamin, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin und Histonen, ausgewählt ist.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welche weiter mindestens einen RNase-Inhibitor enthält.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der RNase-Inhibitor RNasin ist.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, die eine Mehrzahl von mRNA Molekülen enthält, welche eine cDNA-Bibliothek oder einen Teil davon eines Tumorgewebes repräsentieren.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der Teil der cDNA-Bibliothek für die tumorspezifischen Antigene codiert.
  19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das oder die Antigen(e) aus einem Tumor aus der Gruppe, bestehend aus 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT),iCE, KIAA0205, LAGE, LDIR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM.1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 und WT1, ausgewählt ist/sind.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die mRNA einen Sequenzbereich enthält, welcher der Erhöhung der Translationsrate dient.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, enthaltend mindestens einen weiteren pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder mindestens ein weiteres pharmazeutisch verträgliches Vehikel.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Therapie und/oder Prophylaxe gegen Krebs.
  23. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, umfassend die Schritte:
    (a) Herstellen einer cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon aus Tumorgewebe eines Patienten,
    (b) Herstellen einer Matrize für die In vitro-Transkription von RNA anhand der cDNA-Bibliothek oder eines Teils davon und
    (c) In vitro- Transkribieren der Matrize.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Teil der cDNA-Bibliothek des Tumorgewebes für die tumorspezifischen Antigene codiert.
  25. Vefahren nach Anspruch 24, in welchem vor Schritt (a) die Sequenzen der tumorspezifischen Antigene ermittelt werden.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Ermitteln der Sequenzen der tumorspezifischen Antigene einen Abgleich mit einer cDNA-Bibliothek aus gesundem Gewebe umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei däs Ermitteln der Sequenzen der tumorspezifischen Antigene eine Diagnose durch einen Mikroarray umfasst.
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ES (1) ES2298418T3 (de)
WO (1) WO2003051401A2 (de)

Cited By (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010037539A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
US8216582B2 (en) 2006-06-23 2012-07-10 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
US8580257B2 (en) 2008-11-03 2013-11-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1 (KAAG1)
US8703906B2 (en) 2009-09-03 2014-04-22 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US8937163B2 (en) 2011-03-31 2015-01-20 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US8968746B2 (en) 2010-07-30 2015-03-03 Curevac Gmbh Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US8999380B2 (en) 2012-04-02 2015-04-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9107886B2 (en) 2012-04-02 2015-08-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding basic helix-loop-helix family member E41
US9181319B2 (en) 2010-08-06 2015-11-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9186372B2 (en) 2011-12-16 2015-11-17 Moderna Therapeutics, Inc. Split dose administration
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9334328B2 (en) 2010-10-01 2016-05-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9402887B2 (en) 2007-10-09 2016-08-02 Curevac Ag Composition for treating prostate cancer (PCa)
US9421255B2 (en) 2011-02-21 2016-08-23 Curevac Ag Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9533047B2 (en) 2011-03-31 2017-01-03 Modernatx, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
US10064934B2 (en) 2015-10-22 2018-09-04 Modernatx, Inc. Combination PIV3/hMPV RNA vaccines
US10064935B2 (en) 2015-10-22 2018-09-04 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus RNA vaccines
US10124055B2 (en) 2015-10-22 2018-11-13 Modernatx, Inc. Zika virus RNA vaccines
US10172935B2 (en) 2011-03-02 2019-01-08 Curevac Ag Vaccination in newborns and infants
US10273269B2 (en) 2017-02-16 2019-04-30 Modernatx, Inc. High potency immunogenic zika virus compositions
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US10369216B2 (en) 2014-04-01 2019-08-06 Curevac Ag Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant
US10428106B2 (en) 2015-10-16 2019-10-01 Modernatx, Inc. Phosphate replacement mRNA cap analogs
US10441653B2 (en) 2006-07-31 2019-10-15 Curevac Ag Nucleic acid comprising GlXmGn as an immune-stimulating agent/adjuvant
US10449244B2 (en) 2015-07-21 2019-10-22 Modernatx, Inc. Zika RNA vaccines
US10493143B2 (en) 2015-10-22 2019-12-03 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
US10695419B2 (en) 2016-10-21 2020-06-30 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US10815291B2 (en) 2013-09-30 2020-10-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11084872B2 (en) 2012-01-09 2021-08-10 Adc Therapeutics Sa Method for treating breast cancer
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
EP4035659A1 (de) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosome zur ausgabe von therapeutischen wirkstoffen
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US11464848B2 (en) 2017-03-15 2022-10-11 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
US11643441B1 (en) 2015-10-22 2023-05-09 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (VZV)
US11690910B2 (en) 2012-01-31 2023-07-04 CureVac SE Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
US11739125B2 (en) 2013-08-21 2023-08-29 Cure Vac SE Respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11866754B2 (en) 2015-10-16 2024-01-09 Modernatx, Inc. Trinucleotide mRNA cap analogs
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
US11965000B2 (en) 2023-09-07 2024-04-23 CureVac SE Respiratory syncytial virus (RSV) vaccine

Families Citing this family (175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1832603B1 (de) * 2001-06-05 2010-02-03 CureVac GmbH Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt, enkodierend für ein bakterielles Antigen sowie deren Verwendung
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
EP2338478B1 (de) 2002-06-28 2014-07-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Verfahren zur Herstellung von Liposomen
DE10229872A1 (de) * 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10335833A1 (de) * 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
WO2006001844A2 (en) * 2004-01-29 2006-01-05 Pinnacle Pharmaceuticals β-CYCLODEXTRIN DERIVATIVES AND THEIR USE AGAINST ANTHRAX LETHAL TOXIN
GB0501125D0 (en) * 2005-01-19 2005-02-23 Ribostem Ltd Method of genotypically modifying cells by administration of rna
DE102004035227A1 (de) * 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102005023170A1 (de) * 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
HUE043492T2 (hu) 2005-08-23 2019-08-28 Univ Pennsylvania Módosított nukleozidokat tartalmazó RNS és eljárások az alkalmazására
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
DE102006035618A1 (de) * 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
HUE030386T2 (en) * 2007-01-31 2017-05-29 Yeda Res & Dev Redirected, genetically modified regulatory T-cells and their use for suppression of autoimmune and inflammatory disease
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
US20130108663A1 (en) * 2007-09-14 2013-05-02 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and their use in vaccination
US9408909B2 (en) 2007-09-14 2016-08-09 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the T-cell stimulatory capacity of human antigen presenting cells in vitro and in vivo and its use in vaccination
KR101483715B1 (ko) 2008-01-31 2015-01-19 큐어백 게엠바하 면역증강제／애주번트인 화학식（ＮｕＧｌＸｍＧｎＮｖ）ａ를 포함하는 핵산 및 이의 유도체
EP2772251B1 (de) * 2008-05-26 2021-03-03 Universität Zürich Protamin-/RNA-Nanopartikel für die Immunstimulierung
US20110236345A1 (en) * 2008-07-03 2011-09-29 Duke University Composition and methods for eliciting an immune response
ME03327B (de) 2009-12-01 2019-10-20 Translate Bio Inc Steroidderivat zur ausgabe von mrna bei humangenetischen erkrankungen
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
EP2633034B1 (de) * 2010-10-26 2017-11-29 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg NFkB-SIGNALWEG-MANIPULIERTE DENDRITISCHE ZELLEN
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
NZ730355A (en) 2011-05-24 2022-10-28 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Individualized vaccines for cancer
PL2714071T3 (pl) 2011-05-24 2019-12-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Zindywidualizowane szczepionki przeciwrakowe
BR112013031553A2 (pt) 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
JP6185553B2 (ja) 2012-03-27 2017-08-23 キュアバック アーゲー タンパク質又はペプチドの発現を改善するための人工核酸分子
US10080809B2 (en) 2012-03-27 2018-09-25 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules comprising a 5′TOP UTR
CA2866955A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
JP2015518705A (ja) 2012-04-02 2015-07-06 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
EP3536787A1 (de) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nukleaseresistente polynukleotide und verwendungen davon
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
EP3417874A1 (de) 2012-11-28 2018-12-26 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualisierte impfstoffe gegen krebs
EP3578200A1 (de) 2013-02-22 2019-12-11 CureVac AG Kombination von impfung und hemmung des pd-1-pfades
CA2897858A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of the pd-1 pathway
KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2015-11-18 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 정제 방법
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
AU2014236305B2 (en) 2013-03-14 2019-01-17 Ethris Gmbh CFTR mRNA compositions and related methods and uses
HUE055044T2 (hu) 2013-03-14 2021-10-28 Translate Bio Inc MRNS-kódolt ellenanyagok bejuttatására szolgáló eljárások és készítmények
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
EP2971161B1 (de) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Nukleinsäurereinigung
ES2670529T3 (es) 2013-03-15 2018-05-30 Translate Bio, Inc. Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
EP2983804A4 (de) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ionenaustauschreinigung von mrna
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
HUE056760T2 (hu) 2013-07-11 2022-03-28 Modernatx Inc A CRISPR-hez kapcsolódó fehérjéket és a szintetikus SGRNS-ket kódoló szintetikus polinukleotidokat tartalmazó készítmények és felhasználási módjaik
WO2015024665A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Rabies vaccine
WO2015024669A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Combination vaccine
WO2015024667A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Curevac Gmbh Method for increasing expression of rna-encoded proteins
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EA034103B1 (ru) 2013-10-22 2019-12-27 Транслейт Био, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
WO2015061500A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
WO2015062738A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Gmbh Modified rna with decreased immunostimulatory properties
ES2712092T3 (es) 2013-12-30 2019-05-09 Curevac Ag Moléculas de ácido nucleico artificiales
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
JP6584414B2 (ja) 2013-12-30 2019-10-02 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
AU2014375404C1 (en) 2013-12-30 2020-11-19 CureVac Manufacturing GmbH Methods for RNA analysis
US10307472B2 (en) 2014-03-12 2019-06-04 Curevac Ag Combination of vaccination and OX40 agonists
SG10201912038TA (en) 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
CN117402871A (zh) 2014-04-25 2024-01-16 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
CA2945629C (en) 2014-06-10 2023-08-22 Curevac Ag Methods and means for enhancing rna production
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
EP3169693B1 (de) 2014-07-16 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Chimäre polynukleotide
EP3998481A1 (de) 2014-09-10 2022-05-18 F. Hoffmann-La Roche AG Screeningplattform für immunogene mutante peptide
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
WO2016091391A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP4353257A2 (de) 2015-04-13 2024-04-17 CureVac Manufacturing GmbH Verfahren zur herstellung von rna-zusammensetzungen
WO2016165831A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Curevac Ag Lyophilization of rna
JP6912384B2 (ja) 2015-04-22 2021-08-04 キュアバック アーゲー 癌疾患の処置のための、ｒｎａ含有組成物
EP3289101B1 (de) 2015-04-30 2021-06-23 CureVac AG Immobilisierte poly(n)polymerase
EP3294885B1 (de) 2015-05-08 2020-07-01 CureVac Real Estate GmbH Verfahren zur herstellung von rna
CN107810009A (zh) 2015-05-15 2018-03-16 库瑞瓦格股份公司 涉及施用至少一种mRNA构建体的初免‑加强方案
CN107635587A (zh) 2015-05-20 2018-01-26 库瑞瓦格股份公司 包含长链rna的干燥粉末组合物
EP3297682B1 (de) 2015-05-20 2021-07-14 CureVac AG Trockenpulverzusammensetzung mit langkettiger rna
US11608513B2 (en) 2015-05-29 2023-03-21 CureVac SE Method for adding cap structures to RNA using immobilized enzymes
DK3303583T3 (da) 2015-05-29 2020-07-13 Curevac Real Estate Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling og oprensning af rna, omfattende mindst et trin til tangential-flow-filtrering
US10501768B2 (en) 2015-07-13 2019-12-10 Curevac Ag Method of producing RNA from circular DNA and corresponding template DNA
EP4286012A2 (de) 2015-09-17 2023-12-06 ModernaTX, Inc. Verbindungen und zusammensetzungen zur intrazellulären verabreichung von therapeutischen wirkstoffen
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
US10849920B2 (en) 2015-10-05 2020-12-01 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
EP3362576A1 (de) 2015-10-12 2018-08-22 CureVac AG Automatisiertes verfahren zur isolierung, auswahl und/oder bestimmung von mikroorganismen oder zellen in einer lösung
EP3362460A1 (de) 2015-10-16 2018-08-22 Modernatx, Inc. Mrna-kappenanaloga und verfahren zum mrna-kappen
WO2017066791A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Sugar substituted mrna cap analogs
WO2017066789A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified sugar
WO2017066782A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Hydrophobic mrna cap analogs
US11413346B2 (en) 2015-11-09 2022-08-16 Curevac Ag Rotavirus vaccines
KR20180107109A (ko) 2015-12-22 2018-10-01 큐어백 아게 Rna 분자 조성물의 제조 방법
EP4036079A3 (de) 2015-12-22 2022-09-28 ModernaTX, Inc. Verbindungen und zusammensetzungen zur intrazellulären verabreichung von wirkstoffen
WO2017109161A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Curevac Ag Method of rna in vitro transcription using a buffer containing a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid or a salt thereof
SI3405212T1 (sl) 2016-01-19 2020-09-30 Pfizer Inc. Cepiva proti raku
MX2018009917A (es) 2016-02-17 2019-08-14 Curevac Ag Vacuna contra el virus del zika.
AU2017222461A1 (en) * 2016-02-22 2018-08-30 Oceanside Biotechnology Neoantigen compositions and methods of using the same in immunooncotherapy
US11920174B2 (en) 2016-03-03 2024-03-05 CureVac SE RNA analysis by total hydrolysis and quantification of released nucleosides
KR102369898B1 (ko) 2016-04-08 2022-03-03 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 다량체 코딩 핵산 및 그 용도
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
EP3448427A1 (de) 2016-04-29 2019-03-06 CureVac AG Für einen antikörper codierende rns
EP3452101A2 (de) 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna-codierung eines therapeutischen proteins
WO2017191264A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Curevac Ag Nucleic acid molecules and uses thereof
SG11201809912UA (en) 2016-06-09 2018-12-28 Curevac Ag Hybrid carriers for nucleic acid cargo
CN109312313A (zh) 2016-06-13 2019-02-05 川斯勒佰尔公司 用于治疗鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的信使rna疗法
US20200069599A1 (en) 2016-06-14 2020-03-05 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3472193A4 (de) * 2016-06-20 2020-01-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Zirkuläre rna und deren verwendung in der immunmodulation
SG11201811432WA (en) 2016-08-19 2019-03-28 Curevac Ag Rna for cancer therapy
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018096179A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Curevac Ag Method for purifying rna
US11464836B2 (en) 2016-12-08 2022-10-11 Curevac Ag RNA for treatment or prophylaxis of a liver disease
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
EP3558354A1 (de) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Impfstoff gegen das lassa-virus
EP3558356A2 (de) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Mers-coronavirus-impfstoff
WO2018115507A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Henipavirus vaccine
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
AU2018229278A1 (en) 2017-02-28 2019-10-17 Sanofi Therapeutic RNA
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
PT3596041T (pt) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx Inc Compostos e composições para entrega intracelular de agentes terapêuticos
EP3601576A1 (de) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Für crispr-assoziierte proteine kodierende nukleinsäuren und verwendungen davon
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
AU2018268859A1 (en) 2017-05-16 2019-12-12 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding CFTR
EP3638678A1 (de) 2017-06-14 2020-04-22 Modernatx, Inc. Verbindungen und zusammensetzungen zur intrazellulären verabreichung von wirkstoffen
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
PE20200613A1 (es) * 2017-07-11 2020-03-11 Pfizer Composiciones inmunogenicas
WO2019036638A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR PREPARING MODIFIED RNA
EP3673069A1 (de) 2017-08-22 2020-07-01 CureVac AG Bunyaviren-vakzin
US11744801B2 (en) 2017-08-31 2023-09-05 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
KR20200071081A (ko) 2017-10-19 2020-06-18 큐어백 아게 신규 인공 핵산 분자
SG11202003247RA (en) 2017-11-08 2020-05-28 Curevac Ag Rna sequence adaptation
EP3723796A1 (de) 2017-12-13 2020-10-21 CureVac AG Flavivirus-impfstoff
CA3084061A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3728634A1 (de) 2017-12-21 2020-10-28 CureVac AG Lineare doppelsträngige, mit einem einzelträger oder einem tag gekoppelte dna und verfahren zur herstellung der besagten linearen doppelsträngigen dna
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
EP3841208A1 (de) 2018-08-24 2021-06-30 Translate Bio, Inc. Verfahren zur reinigung von messenger-rna
EP3853202A1 (de) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Verbindungen und zusammensetzungen zur intrazellulären verabreichung von therapeutischen wirkstoffen
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
AU2019355177A1 (en) 2018-10-04 2021-05-06 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
WO2020086742A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US20220126244A1 (en) 2019-01-31 2022-04-28 Modernatx, Inc. Vortex mixers and associated methods, systems, and apparatuses thereof
SG11202108100PA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Modernatx Inc Methods of preparing lipid nanoparticles
CN110331147A (zh) * 2019-06-21 2019-10-15 苏州吉玛基因股份有限公司 一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
US11576966B2 (en) 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
US11241493B2 (en) 2020-02-04 2022-02-08 Curevac Ag Coronavirus vaccine
CA3178455A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid nanoparticle composition
EP4132576A1 (de) 2020-04-09 2023-02-15 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Nukleinsäureimpfstoffe gegen coronavirus
JP2023532663A (ja) 2020-06-25 2023-07-31 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 環状ｒｎａ翻訳を駆動する遺伝エレメント及び使用方法
JP2023532707A (ja) 2020-06-30 2023-07-31 スージョウ・アボジェン・バイオサイエンシズ・カンパニー・リミテッド 脂質化合物及び脂質ナノ粒子組成物
KR20230054672A (ko) 2020-08-20 2023-04-25 쑤저우 아보젠 바이오사이언시스 컴퍼니 리미티드 지질 화합물 및 지질 나노입자 조성물
ES2962700T1 (es) * 2020-10-12 2024-03-20 Hpvvax Llc Composición y método para tratar el cáncer, usando una vacuna como un primer ingrediente activo terapéutico en combinación con un segundo ingrediente activo
JP2024502210A (ja) 2020-12-22 2024-01-17 キュアバック エスイー ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対するＲＮＡワクチン
WO2022152109A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2022152141A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polymer conjugated lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
CN116472275A (zh) 2021-05-24 2023-07-21 苏州艾博生物科技有限公司 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CA3231523A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Acyclic lipids and methods of use thereof
TW202328067A (zh) 2021-09-14 2023-07-16 美商雷納嘉德醫療管理公司 環狀脂質及其使用方法
CN116064598B (zh) 2021-10-08 2024-03-12 苏州艾博生物科技有限公司 冠状病毒的核酸疫苗
WO2023056917A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
AR127312A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Compuestos lipídicos ycomposiciones de nanopartículas lipídicas
WO2023122752A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
WO2023196931A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
WO2024037578A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Composition of lipid nanoparticles

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990011092A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-04 Vical, Inc. Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
WO1998034640A2 (en) * 1997-02-07 1998-08-13 Merck & Co., Inc. Synthetic hiv gag genes
WO1999014346A2 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
EP1083232A1 (de) * 1999-09-09 2001-03-14 Jung, Günther, Prof. Dr. Transfer von mRNAs unter Verwendung von polykationischen Verbindungen
WO2002098443A2 (de) * 2001-06-05 2002-12-12 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/ c- gehalt und otimierter codon usage für die gentherapie

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3906092A (en) * 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5132418A (en) * 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) * 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) * 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) * 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4373071A (en) * 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4401796A (en) * 1981-04-30 1983-08-30 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4737462A (en) * 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5116943A (en) * 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US4688777A (en) * 1985-11-01 1987-08-25 The Budd Company Pair of stacked springs for a railway car
US5017691A (en) * 1986-07-03 1991-05-21 Schering Corporation Mammalian interleukin-4
US5153319A (en) * 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4879111A (en) * 1986-04-17 1989-11-07 Cetus Corporation Treatment of infections with lymphokines
US5047524A (en) * 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5262530A (en) * 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6214804B1 (en) * 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
WO1993014778A1 (en) 1992-01-23 1993-08-05 Vical, Inc. Ex vivo gene transfer
CA2107097A1 (en) 1992-01-27 1993-07-28 Michael W. Gallatin Icam-related protein
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
EP0609739A1 (de) 1993-02-02 1994-08-10 American Cyanamid Company Methode der Umkehrung der Immunsuppression in Vakzinen
DK0668350T4 (da) * 1994-02-16 2009-02-23 Us Gov Health & Human Serv Melanomassocieret antigen, epitoper deraf samt vacciner mod melanom
IL112820A0 (en) 1994-03-07 1995-05-26 Merck & Co Inc Coordinate in vivo gene expression
HUT76094A (en) * 1994-03-18 1997-06-30 Lynx Therapeutics Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5570642A (en) * 1995-01-06 1996-11-05 Lehrman; David Adjustable ironing board assembly
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6265387B1 (en) * 1995-10-11 2001-07-24 Mirus, Inc. Process of delivering naked DNA into a hepatocyte via bile duct
US20030143204A1 (en) * 2001-07-27 2003-07-31 Lewis David L. Inhibition of RNA function by delivery of inhibitors to animal cells
US6090391A (en) * 1996-02-23 2000-07-18 Aviron Recombinant tryptophan mutants of influenza
US5853719A (en) 1996-04-30 1998-12-29 Duke University Methods for treating cancers and pathogen infections using antigen-presenting cells loaded with RNA
CA2258568A1 (en) 1996-06-21 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Vaccines comprising synthetic genes
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
ATE292980T1 (de) * 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0839912A1 (de) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Ansteckende Klone von RNA-Viren und darauf basierende Impfstoffe und diagnostisches Verfahren
EP0855184A1 (de) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmazeutisches Präparat das ein Polynukleotid und ein Antigen enthält, insbesondere zur Impfung
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6589940B1 (en) * 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
ES2326848T3 (es) 1997-06-06 2009-10-20 The Regents Of The University Of California Inhibidores de la actividad de secuencias inmunoestimulatorias de adn.
JP2001520041A (ja) 1997-10-20 2001-10-30 ジェンザイム トランスジェニックス コーポレイション 新規な改変核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法
WO1999026663A2 (en) * 1997-11-20 1999-06-03 Vical, Inc. Treatment of cancer using cytokine-expressing polynucleotides and compositions therefor
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US6207643B1 (en) * 1998-11-13 2001-03-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Mimetic insect allatostatin analogs for insect control
CA2369119A1 (en) 1999-03-29 2000-05-25 Statens Serum Institut Nucleotide construct with optimised codons for an hiv genetic vaccine based on a primary, early hiv isolate and synthetic envelope
NZ515957A (en) 1999-06-08 2003-08-29 Aventis Pasteur Immunostimulant oligonucleotide
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
WO2001004313A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 American Home Products Corporation Methods and compositions for preventing the formation of aberrant rna during transcription of a plasmid sequence
US20050112141A1 (en) * 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20040106567A1 (en) * 1999-09-07 2004-06-03 Hagstrom James E. Intravascular delivery of non-viral nucleic acid
US6864066B1 (en) * 1999-09-08 2005-03-08 The Regents Of The University Of California Epithelial protein lost in neoplasm (EPLIN)
WO2001021810A1 (en) 1999-09-17 2001-03-29 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
WO2002064799A2 (en) 1999-09-28 2002-08-22 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger rna
US6239118B1 (en) * 1999-10-05 2001-05-29 Richard A. Schatz Method for preventing restenosis using a substituted adenine derivative
AU2001231245A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
JP2004530629A (ja) 2000-06-07 2004-10-07 バイオシネクサス インコーポレーテッド 免疫刺激ｒｎａ／ｄｎａハイブリッド分子
DK1292615T3 (da) 2000-06-23 2007-02-19 Wyeth Corp Modificerede morbillivirus V-proteiner
WO2002002606A2 (en) * 2000-07-03 2002-01-10 Chiron S.P.A. Immunisation against chlamydia pneumoniae
IL154009A0 (en) 2000-07-21 2003-07-31 Glaxo Group Ltd Codon-optimized papilloma virus sequences
EP1322338A4 (de) * 2000-10-04 2005-04-13 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und methoden zur verwendung des kapsidproteins aus flaviviren oder pestviren
US20030077604A1 (en) * 2000-10-27 2003-04-24 Yongming Sun Compositions and methods relating to breast specific genes and proteins
US6652006B1 (en) * 2000-10-31 2003-11-25 Frank Digiacomo Fluid transfer device
US20020132788A1 (en) * 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
DE10119005A1 (de) 2001-04-18 2002-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Proteinexpression ausgehend von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen
DE10291734D2 (de) * 2001-04-23 2004-05-27 Lorbach Elke Pufferlösung für die Elektroporation und Verfahren umfassend die Verwendung derselben
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US7547551B2 (en) * 2001-06-21 2009-06-16 University Of Antwerp. Transfection of eukaryontic cells with linear polynucleotides by electroporation
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
DE10148886A1 (de) * 2001-10-04 2003-04-30 Avontec Gmbh Inhibition von STAT-1
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
DE10162480A1 (de) * 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2003059381A2 (en) 2002-01-18 2003-07-24 Curevac Gmbh Immunogenic preparations and vaccines on the basis of mrna
CA2474709A1 (en) 2002-02-04 2003-08-14 Biomira, Inc. Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
IL164354A0 (en) * 2002-04-04 2005-12-18 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US7316925B2 (en) * 2002-07-16 2008-01-08 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Codon optimized synthetic plasmids
EP1393745A1 (de) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulierung der immunstimulierenden Eigenschaften von Oligonukleotiden und Analoga durch optimale Darstellung der 5'-Enden
AU2003302743B2 (en) 2002-12-23 2008-09-04 Dynavax Technologies Corporation Branched immunomodulatory compounds and methods of using the same
WO2004092329A2 (en) 2003-04-08 2004-10-28 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Semi-synthetic saponin analogs with carrier and immune stimulatory activities for dna and rna vaccines
DE10335833A1 (de) * 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
IL162933A0 (en) 2004-07-08 2005-11-20 Brombine Compounds Ltd Novel fire retardants
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
US20060241076A1 (en) * 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
HUE043492T2 (hu) 2005-08-23 2019-08-28 Univ Pennsylvania Módosított nukleozidokat tartalmazó RNS és eljárások az alkalmazására

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990011092A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-04 Vical, Inc. Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
WO1998034640A2 (en) * 1997-02-07 1998-08-13 Merck & Co., Inc. Synthetic hiv gag genes
WO1999014346A2 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 Sequitur, Inc. SENSE mRNA THERAPY
EP1083232A1 (de) * 1999-09-09 2001-03-14 Jung, Günther, Prof. Dr. Transfer von mRNAs unter Verwendung von polykationischen Verbindungen
WO2002098443A2 (de) * 2001-06-05 2002-12-12 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/ c- gehalt und otimierter codon usage für die gentherapie

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOCZKOWSKI D ET AL: "DENDRITIC CELLS PULSED WITH RNA ARE POTENT ANTIGEN-PRESENTING CELLSIN VITRO AND IN VIVO" JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, TOKYO, JP, Bd. 184, Nr. 2, August 1996 (1996-08), Seiten 465-472, XP002921123 ISSN: 0022-1007 *
HOERR INGMAR ET AL: "In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies." EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, Bd. 30, Nr. 1, Januar 2000 (2000-01), Seiten 1-7, XP002243972 ISSN: 0014-2980 *
HOLCIK MARTIN ET AL: "Four highly stable eukaryotic mRNAs assemble 3' untranslated region RNA-protein complexes sharing cis and trans components." PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, Bd. 94, Nr. 6, 1997, Seiten 2410-2414, XP002243974 1997 ISSN: 0027-8424 *

Cited By (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8216582B2 (en) 2006-06-23 2012-07-10 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
US10441653B2 (en) 2006-07-31 2019-10-15 Curevac Ag Nucleic acid comprising GlXmGn as an immune-stimulating agent/adjuvant
US9402887B2 (en) 2007-10-09 2016-08-02 Curevac Ag Composition for treating prostate cancer (PCa)
US10434154B2 (en) 2007-10-09 2019-10-08 Curevac Ag Composition for treating prostate cancer (PCa)
WO2010037408A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
EP2762165A2 (de) * 2008-09-30 2014-08-06 CureVac GmbH Zusammensetzung enthaltend ein komplexiertes (m)RNA und ein nacktes mRNA zur Bereitstellung oder Verbesserung einer Immunostimulationsreaktion in einem Säugetier und seine Anwendungen
EP2762165A3 (de) * 2008-09-30 2014-10-29 CureVac GmbH Zusammensetzung enthaltend ein komplexiertes (m)RNA und ein nacktes mRNA zur Bereitstellung oder Verbesserung einer Immunostimulationsreaktion in einem Säugetier und seine Anwendungen
US9572874B2 (en) 2008-09-30 2017-02-21 Curevac Ag Composition comprising a complexed (M)RNA and a naked mRNA for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
WO2010037539A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
US8580257B2 (en) 2008-11-03 2013-11-12 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies that specifically block the biological activity of kidney associated antigen 1 (KAAG1)
US9855291B2 (en) 2008-11-03 2018-01-02 Adc Therapeutics Sa Anti-kidney associated antigen 1 (KAAG1) antibodies
US10751424B2 (en) 2009-09-03 2020-08-25 Curevac Ag Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US8703906B2 (en) 2009-09-03 2014-04-22 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US9907862B2 (en) 2009-09-03 2018-03-06 Curevac Ag Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US9314535B2 (en) 2009-09-03 2016-04-19 Curevac Ag Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
US8968746B2 (en) 2010-07-30 2015-03-03 Curevac Gmbh Complexation of nucleic acids with disulfide-crosslinked cationic components for transfection and immunostimulation
US9447164B2 (en) 2010-08-06 2016-09-20 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9181319B2 (en) 2010-08-06 2015-11-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9937233B2 (en) 2010-08-06 2018-04-10 Modernatx, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9334328B2 (en) 2010-10-01 2016-05-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9701965B2 (en) 2010-10-01 2017-07-11 Modernatx, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9657295B2 (en) 2010-10-01 2017-05-23 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US10064959B2 (en) 2010-10-01 2018-09-04 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US10568958B2 (en) 2011-02-21 2020-02-25 Curevac Ag Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
US9421255B2 (en) 2011-02-21 2016-08-23 Curevac Ag Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
US10172935B2 (en) 2011-03-02 2019-01-08 Curevac Ag Vaccination in newborns and infants
US10596252B2 (en) 2011-03-02 2020-03-24 Curevac Ag Vaccination in newborns and infants
US10729761B2 (en) 2011-03-02 2020-08-04 Curevac Ag Vaccination in newborns and infants
US11672856B2 (en) 2011-03-02 2023-06-13 CureVac SE Vaccination in newborns and infants
US9950068B2 (en) 2011-03-31 2018-04-24 Modernatx, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US8937163B2 (en) 2011-03-31 2015-01-20 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US9533047B2 (en) 2011-03-31 2017-01-03 Modernatx, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US10597450B2 (en) 2011-03-31 2020-03-24 Adc Therapeutics Sa Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US9828426B2 (en) 2011-03-31 2017-11-28 Adc Therapeutics Sa Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US9393302B2 (en) 2011-03-31 2016-07-19 Alethia Biotherapeutics Inc. Antibodies against kidney associated antigen 1 and antigen binding fragments thereof
US10022425B2 (en) 2011-09-12 2018-07-17 Modernatx, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US10751386B2 (en) 2011-09-12 2020-08-25 Modernatx, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9295689B2 (en) 2011-12-16 2016-03-29 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of PLGA microspheres
US9186372B2 (en) 2011-12-16 2015-11-17 Moderna Therapeutics, Inc. Split dose administration
US9271996B2 (en) 2011-12-16 2016-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of PLGA microspheres
US11084872B2 (en) 2012-01-09 2021-08-10 Adc Therapeutics Sa Method for treating breast cancer
US11690910B2 (en) 2012-01-31 2023-07-04 CureVac SE Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
US9301993B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding apoptosis inducing factor 1
US8999380B2 (en) 2012-04-02 2015-04-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9587003B2 (en) 2012-04-02 2017-03-07 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9675668B2 (en) 2012-04-02 2017-06-13 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding hepatitis A virus cellular receptor 2
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9782462B2 (en) 2012-04-02 2017-10-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9814760B2 (en) 2012-04-02 2017-11-14 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9827332B2 (en) 2012-04-02 2017-11-28 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9828416B2 (en) 2012-04-02 2017-11-28 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9255129B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding SIAH E3 ubiquitin protein ligase 1
US9233141B2 (en) 2012-04-02 2016-01-12 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with blood and lymphatic disorders
US9220755B2 (en) 2012-04-02 2015-12-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with blood and lymphatic disorders
US9221891B2 (en) 2012-04-02 2015-12-29 Moderna Therapeutics, Inc. In vivo production of proteins
US9095552B2 (en) 2012-04-02 2015-08-04 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding copper metabolism (MURR1) domain containing 1
US9089604B2 (en) 2012-04-02 2015-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for treating galactosylceramidase protein deficiency
US9061059B2 (en) 2012-04-02 2015-06-23 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for treating protein deficiency
US9220792B2 (en) 2012-04-02 2015-12-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding aquaporin-5
US9107886B2 (en) 2012-04-02 2015-08-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding basic helix-loop-helix family member E41
US9114113B2 (en) 2012-04-02 2015-08-25 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding citeD4
US9149506B2 (en) 2012-04-02 2015-10-06 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding septin-4
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9050297B2 (en) 2012-04-02 2015-06-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
US9192651B2 (en) 2012-04-02 2015-11-24 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9216205B2 (en) 2012-04-02 2015-12-22 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding granulysin
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US11739125B2 (en) 2013-08-21 2023-08-29 Cure Vac SE Respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
US10815291B2 (en) 2013-09-30 2020-10-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US10369216B2 (en) 2014-04-01 2019-08-06 Curevac Ag Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant
US11110166B2 (en) 2014-04-01 2021-09-07 Curevac Ag Polymeric carrier cargo complex for use as an immunostimulating agent or as an adjuvant
US11007260B2 (en) 2015-07-21 2021-05-18 Modernatx, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
US10702597B2 (en) 2015-07-21 2020-07-07 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
US10449244B2 (en) 2015-07-21 2019-10-22 Modernatx, Inc. Zika RNA vaccines
US10428106B2 (en) 2015-10-16 2019-10-01 Modernatx, Inc. Phosphate replacement mRNA cap analogs
US10563195B2 (en) 2015-10-16 2020-02-18 Modernatx, Inc. Phosphate replacement mRNA cap analogs
US10570388B2 (en) 2015-10-16 2020-02-25 Modernatx, Inc. Phosphate replacement MRNA cap analogs
US11866754B2 (en) 2015-10-16 2024-01-09 Modernatx, Inc. Trinucleotide mRNA cap analogs
US11278611B2 (en) 2015-10-22 2022-03-22 Modernatx, Inc. Zika virus RNA vaccines
US10238731B2 (en) 2015-10-22 2019-03-26 Modernatx, Inc. Chikagunya virus RNA vaccines
US10702599B2 (en) 2015-10-22 2020-07-07 Modernatx, Inc. HPIV3 RNA vaccines
US10716846B2 (en) 2015-10-22 2020-07-21 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus RNA vaccines
US11872278B2 (en) 2015-10-22 2024-01-16 Modernatx, Inc. Combination HMPV/RSV RNA vaccines
US10675342B2 (en) 2015-10-22 2020-06-09 Modernatx, Inc. Chikungunya virus RNA vaccines
US10064934B2 (en) 2015-10-22 2018-09-04 Modernatx, Inc. Combination PIV3/hMPV RNA vaccines
US10543269B2 (en) 2015-10-22 2020-01-28 Modernatx, Inc. hMPV RNA vaccines
US10064935B2 (en) 2015-10-22 2018-09-04 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus RNA vaccines
US10933127B2 (en) 2015-10-22 2021-03-02 Modernatx, Inc. Betacoronavirus mRNA vaccine
US10517940B2 (en) 2015-10-22 2019-12-31 Modernatx, Inc. Zika virus RNA vaccines
US10124055B2 (en) 2015-10-22 2018-11-13 Modernatx, Inc. Zika virus RNA vaccines
US10493143B2 (en) 2015-10-22 2019-12-03 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
US10702600B1 (en) 2015-10-22 2020-07-07 Modernatx, Inc. Betacoronavirus mRNA vaccine
US10383937B2 (en) 2015-10-22 2019-08-20 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus RNA vaccines
US11643441B1 (en) 2015-10-22 2023-05-09 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (VZV)
US11484590B2 (en) 2015-10-22 2022-11-01 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus RNA vaccines
US11235052B2 (en) 2015-10-22 2022-02-01 Modernatx, Inc. Chikungunya virus RNA vaccines
US10272150B2 (en) 2015-10-22 2019-04-30 Modernatx, Inc. Combination PIV3/hMPV RNA vaccines
US11541113B2 (en) 2016-10-21 2023-01-03 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US10695419B2 (en) 2016-10-21 2020-06-30 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US11197927B2 (en) 2016-10-21 2021-12-14 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11696946B2 (en) 2016-11-11 2023-07-11 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
EP4035659A1 (de) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosome zur ausgabe von therapeutischen wirkstoffen
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US10273269B2 (en) 2017-02-16 2019-04-30 Modernatx, Inc. High potency immunogenic zika virus compositions
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
US11464848B2 (en) 2017-03-15 2022-10-11 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11918644B2 (en) 2017-03-15 2024-03-05 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
US11207398B2 (en) 2017-09-14 2021-12-28 Modernatx, Inc. Zika virus mRNA vaccines
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US11965000B2 (en) 2023-09-07 2024-04-23 CureVac SE Respiratory syncytial virus (RSV) vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
ES2298418T3 (es) 2008-05-16
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US9155788B2 (en) 2015-10-13
AU2002360055B2 (en) 2008-01-17
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US9463228B2 (en) 2016-10-11
US20160089424A1 (en) 2016-03-31
EP2769733A1 (de) 2014-08-27
US9433670B2 (en) 2016-09-06

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