EP1766404A1 - Nouveau systeme microfluidique et procede de capture de cellules. - Google Patents

Nouveau systeme microfluidique et procede de capture de cellules.

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Publication number
EP1766404A1
EP1766404A1 EP05788488A EP05788488A EP1766404A1 EP 1766404 A1 EP1766404 A1 EP 1766404A1 EP 05788488 A EP05788488 A EP 05788488A EP 05788488 A EP05788488 A EP 05788488A EP 1766404 A1 EP1766404 A1 EP 1766404A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
chamber
group
cavity
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05788488A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Bennetau
Phuong-Lan Tran
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
École Normale Supérieure Paris-Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Ecole Normale Superieure de Cachan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1, Ecole Normale Superieure de Cachan filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1766404A1 publication Critical patent/EP1766404A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid

Definitions

  • the subject of the invention is a novel microfluidic device and its use for capturing subpopulations of cells within a biological fluid. More particularly, the invention relates to a device comprising a fluid circulation chamber whose wall is provided with a graft for capturing a sub-population of cells in a biological sample circulated in this chamber. This device allows the capture of cells present in a very small amount in this biological sample. The invention also relates to a method for capturing cells in a biological sample, this method being characterized in that it comprises a step of passing the biological sample in such a device.
  • the device of the invention can be used for the purification and characterization of circulating tumor cells from a patient's blood sample or for the purification and characterization of fetal cells from a maternal blood sample. .
  • CTCs circulating tumor cells
  • the ability to purify and characterize circulating tumor cells is of major interest in diagnosing and monitoring the evolution of breast cancer, but also other types of cancer such as prostate, kidney, bladder cancer. , liver, colon, lung.
  • WO 03/091730 discloses a device for controlling the migration of leukocytes, this device comprising two chambers interconnected by a channel. The goal is to study the mechanisms of leukocyte binding to the walls of blood vessels. Compounds mediating the migration of leukocytes composed of endothelial cells can be placed in the channel. Compounds to be tested can also be placed in this device.
  • US-2003/0044766 discloses a method and apparatus for detecting an interaction between two types of cells, one being fixed in a passage subjected to a laminar flow of a dispersion comprising the second type of cell. This device is intended to study the interactions between leukocyte populations and endothelial cells.
  • A. Pierres et al, Faraday Discuss., 1998, 111, 321-330 discloses the use of a laminar flow chamber to study the formation of bonds between streptavidin coated spheres and the graft-coated chamber walls. biotin.
  • the shear force, the strength of the ligand-receptor binding, the density of receptors on the surface are important parameters.
  • WO 00/23802 discloses a diagnostic method for determining the cell binding capacity in a biological sample of passing this sample over a covered surface of a substrate binding to these cells.
  • This document is more particularly directed towards the diagnosis of platelet anomalies and thromboses.
  • the shear conditions that are applied are intended to mimic the conditions that these cells experience in vivo in the blood vessels.
  • the documents of the prior art essentially relate to devices and methods for studying interactions between two cell populations: leukocytes and endothelial cells, to study platelet adhesion or cellular models (liposome spheres) carrying receptors. .
  • the cells to which the present invention is more particularly concerned have the particularity of being present in very low concentration in the biological samples studied, in the middle of other predominantly large cell populations.
  • the specific receptors of these cells are expressed in low density on their surface. It is these two particularities that make their capture and identification within a biological sample particularly difficult.
  • the use of a prior art laminar flow device whose wall is conventionally grafted with a CTC ligand does not make it possible to capture CTC within a blood sample because these are present in excess.
  • a small amount and the antigen-antibody interaction concerned by this capture is of the order of 50 to 150 piconewtons, which is extremely low compared to the interactions of the adhesion molecules between two cell populations.
  • the invention more particularly relates to the capture of a population of cells whose specific surface markers interact with their receptors with an intensity ranging from 1OpN to InN, advantageously from 20pN to 50OpN, preferably from 30 to 30OpN, more specifically from 50 to 15OpN.
  • the problems to be solved by the present invention are the capture of a CTC minority cell population within a biological sample, using a reduced amount of biological sample, and having as high a capture yield as possible. .
  • the grafting endowed with the device of the invention has the particularity of presenting a homogeneous regular surface onto which a population of ligands specific for the sub-population of cells which it is sought to capture can be grafted.
  • the surface homogeneity favors weak ligand-receptor or antigen-antibody interactions which under other material conditions would not allow this capture.
  • a fluid flow chamber comprises a cavity, preferably a parallelepiped-type cavity, having two orifices placed at two ends of the cavity, the fluid being injected through a first orifice and collected by a second orifice.
  • the dimensions of the fluid circulation chamber are advantageously chosen so that it is a laminar flow chamber. It can also be a cavity of a microfluidic device such as that described in FIG. US-6,408,878.
  • the internal cavity of the fluid circulation chamber has a volume less than or equal to 30 .mu.l, more preferably still less than or equal to 12 .mu.l, which makes it possible to treat biological samples of reduced volume.
  • the device is provided with a pump for injecting the sample fluid into the fluid circulation chamber.
  • the device comprises a circuit for circulating the fluid in a loop connected to a pump, so that the sample to be treated passes more than once in the fluid flow chamber before being collected.
  • At least one wall of the fluid circulation chamber is provided with a particular grafting.
  • it is a wall parallel to the flow that passes through the fluid flow chamber.
  • the fluid flow chamber is a parallelepiped and one of its internal faces comprises a particular grafting.
  • the wall of the specially grafted fluid flow chamber consists of a solid support, which may be a glass or silicon slide or any metallic solid surface with -OH surface features, which is placed in the fluid circulation chamber.
  • the solid support surface, glass slide, Si or other is functionalized by a homogeneous, monomolecular, self-assembled layer of chlorosilane chains.
  • a protein entity for recognizing the population of target cells, in particular circulating tumor cells is grafted directly or via a suitable coupling agent onto the layer of chlorosilanes.
  • the selectivity of the recognition biomolecule is critical for the capture of the target cell population.
  • the solid support (blade) prepared is then mounted in the fluid circulation device.
  • the functionalization of the solid support for cellular capture comprises 3 steps: the grafting of cholorosilanes on the glass slide, the grafting of a coupling agent (which may be a chemical coupling agent or a protein A or G protein agent) and finally grafting a recognition protein entity (antibody, or the ligand of a membrane receptor of a cell).
  • FIG. 1 illustrates a glass slide of this type grafted with an antibody: the solid support is grafted by an organized self-assembled silane layer, to which is attached by a covalent bond a layer of coupling agent (linker).
  • a biomolecule layer of specific recognition of the target cell population is covalently or non-covalently attached to the coupling agent.
  • the presence of the coupling agent layer is optional: according to a variant of the invention, it is possible for the recognition biomolecules to be directly attached to the organized self-assembled silane layer.
  • To carry out the covalent immobilization of organic molecules on a mineral surface it is first necessary to graft thereon coupling molecules that will ensure the attachment of organic molecules on the mineral substrate.
  • Organosilicon coupling molecules have been proposed for this purpose by LA Chrisey et al. ⁇ Nucletic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039) and U. Maskos et al. (Nucleic Acids Research, 1992, 20, 7, 1679-1684).
  • the molecules used namely 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and various aminosilanes, however, have the disadvantage of being deposited randomly and not reproducibly on the surface. They form an inhomogeneous film whose thickness can not be controlled, a film which is also not very robust with respect to subsequent chemical treatments, the inhomogeneity of the film indicating indeed poor protection of the siloxane bonds. It is therefore very difficult to obtain a reproducible grafting of these molecules.
  • Prior to binding or synthesizing oligonucleotides on the substrate additional surface reactions are required to decrease the steric gene at the surface (e.g.
  • organosilicon compounds have been described in WO 01/53303. These compounds can be used as coupling molecules to deposit on the surface of a solid support, an organized self-assembled monolayer. Such molecules have been used in particular for the immobilization of biomolecules such as nucleic acids.
  • the method described in WO 01/53303 makes it possible to obtain a solid support grafted by immobilized biomolecules on an organized self-assembled monolayer. This characteristic results in the presentation of a homogeneous surface of biomolecules that promotes the capture of a minority population of cells, with a low density of specific sensors in a biological sample flowing on this surface.
  • the grafts of the prior art did not make it possible to obtain a satisfactory surface homogeneity and this defect resulted in a low rate of capture of minority target cells within a biological sample.
  • the solid support is modified by an organized self-assembled monolayer comprising at least one organosilicon compound corresponding to formula (I):
  • n is between 15 and 35, preferably between 20 and 25, m is equal to 0 or 1,
  • X 1 , X 2 and X 3 which may be identical or different from each other, are selected from the group consisting of linear or branched, saturated C 1 to C 6 alkyl groups, and the hydrolysable groups, at least one X 1 , X 2 or X 3 representing a hydrolysable group,
  • A represents a group -O- (CH 2 -CH 2 -O) k - (CH 2 ) j - in which k represents an integer between 0 and 100, preferably between 0 and 5, and i represents a number an integer greater than or equal to 0, preferably equal to 0 or 1, - B represents a group chosen from -OCOR, -OR,
  • R, Ri, R 2 being chosen from: a hydrogen atom, a hydrocarbon chain optionally substituted by one or more halogen atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, comprising 1 to 24 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, or an aromatic group optionally substituted by one or more halogen atoms.
  • aromatic is meant any group which has one or more aryl rings, for example a phenyl ring.
  • organized self-assembled monolayer means an assembly of molecules in which the molecules are organized, an organization due to interactions and a strong cohesion between the chains of the molecules, giving rise to a stable and ordered anisotropic film (A. Ulman, Chem Rev., 1996, 96, 1533-1554).
  • An organized self-assembled monolayer formed on a solid support makes it possible to obtain a dense, homogeneous organic surface and well defined parameters both chemically and structurally.
  • the formation of this monolayer obtained thanks to the self-assembling properties of the compounds of formula (I) for well-defined values of n, m, k and i, it is perfectly reproducible for each organosilicon compound.
  • the formation of an organized, very dense, self-assembled monolayer protects the siloxane bonds against chemical treatments (acidic or basic), which allows to realize various chemical reactions on this surface.
  • organosilicon compounds of formula (I) used in the present invention advantageously have very varied functionalities and a high reactivity, having regard to the nature of the group A and the diversity of the terminal groups B usable, these group B may of course be modified and functionalized at will according to the organic chemistry reactions well known to those skilled in the art.
  • the compounds described above make it particularly advantageous for the selected organosilicon compounds of formula (I) to immobilize biomolecules on a support in a reliable and reproducible manner, with regard to the homogeneity and stability of the self-assembled organized monolayer formed on the support.
  • the biomolecules are immobilized on the modified support by strong covalent bonds, without degradation of the siloxane bonds developed between the organosilicon compounds and the solid support.
  • Suitable solid supports are, in general, those whose surface is hydrated and / or those whose surface has hydroxyl groups.
  • said support is selected from the group consisting of glasses, ceramics (for example oxide type), metals (for example aluminum or gold) and metalloids (such as silicon).
  • hydrolyzable means any group capable of reacting with an acid in an aqueous medium so as to give the compounds XiH, X 2 H or X 3 H, X 1 , X 2 and X 3 being such that defined in formula (I).
  • said hydrolysable group is selected from the group consisting of halogen atoms, the group -N (R ') 2 and the groups -OR', R 'being a saturated alkyl group in C 1 to C 6 , linear or branched.
  • suitable halogen atoms are fluorine as well as chlorine, bromine or iodine.
  • X 1 , X 2 and X 3 represent chlorine atoms.
  • n is greater than or equal to 22.
  • solid supports modified according to the present invention is particularly advantageous for the preparation of supports on which are covalently attached protein entities (antibodies, ligand of a cellular receptor, protein ...) capable of selectively binding cells representing a subpopulation within a biological sample.
  • protein entities antibodies, ligand of a cellular receptor, protein
  • the preparation of the grafted solid support comprises the following steps: a) preparation of a modified solid support by an organized self-assembled monolayer comprising at least one organosilicon compound corresponding to formula (I) as defined above, wherein said organosilicon compounds have at their end a carboxylic acid function hydroxyl or amine protected; b) optionally, deprotection of the hydroxyl or amine carboxylic acid function; c) optionally grafting a coupling agent onto the modified solid support; d) grafting the protein entity.
  • Step a) is advantageously carried out by the following steps: i) removal of the contaminants from the solid support and hydration and / or hydroxylation of its surface; j) introduction into a mixture of at least two solvents comprising at least one non-hydrocarbon solvent; polar, under an inert atmosphere, of an organilicon compound of formula (I) as defined above, said compound having at one end a hydroxyl or protected amino carboxylic acid function, k) silanization of the support obtained in step i) by immersion in the solution prepared in step j),
  • step k) 1) optionally, annealing the silanized support obtained in step k), carrying the self-assembled monolayer, at a temperature of between 50 and 120 ° C., for a duration of 5 minutes to one night, and m) rinsing the modified support obtained in step k) or 1) to the acid of a solvent, preferably polar.
  • contaminants of the solid support is meant any compound such as grease, dust or other, present on the surface of the support and which is not part of the chemical structure of the support itself.
  • step i) can be carried out using one or more solvents and / or oxidizing and / or hydroxylating (for example a sulfochromic mixture), a detergent solution (for example Hellmanex®), photochemical ozone treatment or any other appropriate treatment.
  • solvents and / or oxidizing and / or hydroxylating for example a sulfochromic mixture
  • a detergent solution for example Hellmanex®
  • photochemical ozone treatment or any other appropriate treatment.
  • Step j) may advantageously be carried out in a mixture of at least one non-polar hydrocarbon solvent and at least one polar solvent.
  • the volume proportions of non-polar solvent and polar solvent are preferably between 70/30 and 95/5.
  • a usable non-polar hydrocarbon solvent is cyclohexane and a polar solvent that can be used is chloroform.
  • the concentration of the organosilicon compound in the solvent mixture is preferably between 1 ⁇ 10 -5 and 10 -2 mol / liter.
  • Step (k) of silanization of the support may be carried out for a time of between 1 minute and 3 days and at a temperature of between -10 ° C. and 120 ° C., depending on the solvents used.
  • Step c) grafting a coupling agent may be implemented differently depending on the nature of the terminal function of the group of formula (I).
  • a homo-bifunctional or hetero-bifunctional coupling agent may be chosen.
  • the functional group for reacting with the protein is either carbonyl at sulfosuccinimidyl (BS3) or sulfo NHS ester (Sulfo-SMCC). It can be:
  • BS3 (Sulfosuccinimidyl) suberate (Staros JV (1982) N-Hydroxysulfosuccinimide active esters: Bis (7H-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linker, Biochemistry 21: 3950. ), which is implemented according to scheme 1:
  • Sulfo-SMCC 1-cyclohexane-4- (N-maleimidomethyl) sulfosuccinimidylcarboxylate (Samoszuk MK et al., (1989) Antibody, Immunocojugates, Radiopharm 2:37), which is implemented according to Scheme 2 :
  • PA or PG can be coupled directly to the chlorosilane chain terminated in NH 2 in the presence of EDC [1-ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] (Grabarek Z and Gergely J (1990) Zero- length crosslinking procedure with the use of active esters, Anal Biochem 185: 131).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • a hetero-bifunctional coupling agent is:
  • the hetero-bifunctional coupling agent is:
  • KMUH N-hydrazide of k-maleimidoundecanoic acid (Trail PA, et al (1993) Science 261: 212), the implementation of which is as illustrated by Scheme 5:
  • step d) the protein entity is chosen according to the use that is desired of the device:
  • the nature of the cell subpopulation that is to be captured is critical to the choice of this protein entity. The latter must have a specific affinity for the targeted subpopulation.
  • the CTC capture strategy is based on the recognition properties of cell surface molecules. These molecules are cell adhesion molecules, or membrane receptors. Cellular capture is mediated through the interaction of specific ligands with its receptors or antibodies directed against an epitope of an adhesion molecule or receptor. Whatever the protein entity used for cellular capture
  • the strategy for attachment of the recognition protein entity may be in the use of the (5-Succinimidyl-S-acetyl) SATA Acetate Reagent by a two-step process (Durican RJS, Weston PD et al (1983) A It can be used to provide sulfhydryl groups in proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassays, Anal Biochem 132: 68) as shown in Schemes 6 and 7, or TRAUT reagent (2-immothiolane * HCl).
  • Ep-CAM 5 an intercellular adhesion molecule (Gastl G Spizzo G Obrist P et al. (2000) Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. The Lancet 356: 1981).
  • Ep-CAM is also referred to as 17-1A, ESA, EGP40. It is a 40 kDa transmembrane epithelial glycoprotein encoded by the GA 733-2 gene (Linnenbach AJ,
  • Ep-CAM a human antigen is a homophilic cell. cell adhesion molecule J Cell Biol 125: 437). Ep-CAM is suggested as a therapeutic target, particularly in immunotherapy.
  • Ber-EP4, or MOC31 or HA-125 may be linked either directly to protein A or protein G, or to the NH 2 , OH or COOH-terminated chlorosilane chain, via a suitable coupling agent, b) Over-expression of HER-2
  • the human growth factor receptor 2 (HER-2) / new (c-erbB-2) gene is located on chromosome 17q and encodes a transmembrane protein receptor with tyrosine kinase activity, from the family of factor receptors. epidermal growth (EGFR) or the HER family.
  • EGFR epidermal growth
  • Anti-HER-2 antibody (trastuzumab) is used in antitumor therapy.
  • the anti-HER-2 (anti-human ErB2) antibody is used as a specific marker to capture breast cancer CTCs. Combined with detection by the Ber-EP4 antibody, it will act as a potential CTC marker.
  • MUC1 Mucins are expressed by various types of normal epithelial cells in a rough environmental setting such as the air / water interface of the respiratory system, the acidic environment of the stomach, and the complex environment of the tract. intestinal and secretory epithelial surfaces of specialized organs such as the liver, pancreas, gallbladder, kidneys, salivary glands, lacrimal glands and the eye.
  • the mucin family comprises at least 17 secreted and uncreated molecules and plays a central role in the maintenance of homeostasis (Hollingsworth MA and Swanson BJ (2004) Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. : 45).
  • Mucins are high molecular weight glycoproteins with tandem repeats of serine, threonine and proline-rich sequences attached to oligosaccharides by O-glycosidic linkages.
  • MUCl is an integral membrane protein. In breast tumors, MUC1 is over-expressed and aberrantly glycosylated (Rahn JJ, Dabbagh L, Pasdar M et al (2001) The importance of MUCl cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients Cancer 91: 1973).
  • the anti-MUC1 antibody (CT2 Mab) is used as a specific marker to capture breast cancer CTCs. Combined with detection by the Ber-EP4 antibody, it will act as a potential CTC marker.
  • the grafting of the anti-MUC1 antibody can be done like that of the Ber-EP4 antibody.
  • Selected membrane antigens comprising an Ep-CAM membrane glycoprotein, the MUC1 glycoprotein, and a HER-2 / neu growth factor receptor are over-expressed tumor markers in CTCs.
  • the tumor cells can reveal optimized cell surface molecule density, thereby promoting specific cell uptake.
  • the density of CTC in the peripheral blood is a totally unknown parameter. This parameter can vary according to the degree of the pathology and revolves around 1 CTC for 10 3 to 2 ⁇ 10 4 leukocytes.
  • the antibodies directed against these molecules are specific and sufficiently selective to allow CTC capture under the best possible conditions in terms of conservation, cell morphology and viability.
  • the length of the X 3 -Si (CH 2 ) 22- antibody-coupling agent complex varies between 40 to 50 ⁇ thus producing great flexibility in a favorable presentation of the antibody to the cellular antigen.
  • a rapid evaluation gives 8 receptors in a square area of 10 ⁇ .
  • the evaluation by atomic force microscopy (AFM) the graft density of organosilicon chains being 3 to 5 molecules per nm, this configuration is very favorable to obtain a good bonding agent grafting and antibody.
  • Figure 2 illustrates cellular capture by means of a laminar flow chamber.
  • the present method of cellular capture uses a laminar flow chamber (1), made of Plexiglas ®, comprising a cavity (2) of size 20 ⁇ 6 ⁇ 0.2 mm 3 (L ⁇ 1 ⁇ h), and connected to the external through inlet (3) and outlet (4) openings for the circulation of cells and fluids.
  • a laminar flow chamber (1) made of Plexiglas ®, comprising a cavity (2) of size 20 ⁇ 6 ⁇ 0.2 mm 3 (L ⁇ 1 ⁇ h), and connected to the external through inlet (3) and outlet (4) openings for the circulation of cells and fluids.
  • the wall (5) constituting the floor of the chamber is a glass slide or crystalline Si removable and chemically functionalized.
  • This blade is applied in a notch (6) against the cavity (2) of the chamber (1) by means of an O-ring (7) for sealing. It can be provided that the ends of the cavity (2) are rounded so as to promote the positioning of the O-ring (7).
  • It is screwed (8) onto the Plexiglas® base by a metal plate (9).
  • a Teflon® gasket (9a) separates the glass slide from the metal plate. Any other means known to those skilled in the art and allowing the attachment of the solid support in the cavity can be used. In the case illustrated in FIG.
  • the metal plate (9) comprises in its central part a transparent zone (not hatched) which makes it possible to observe the interior of the cavity (2 ) using a microscope (not shown).
  • Teflon® joint (9a) has a transparent central area (not hatched). The proportion of opaque and transparent areas may vary.
  • the inflow and evacuation of the fluids through the openings (3, 4) are placed under the control of a peristaltic pump (10) imposing the flow rate and the flow velocity.
  • the peristaltic pump (10) takes the biological sample (11) in a receptacle (12), provided for this purpose, closed so as to be kept sterile, and injected into the circulation tube (13). It can take reagents (14a, 14b) in the receptacles (14), also closed so as to ensure the proper preservation of the products they contain, and inject them into the circulation tubes (15).
  • a valve (16) at the intersection of the circulation tubes (15), (13) and (17) regulates the connection between the circulation tubes (15) and (13) and the introduction tube (17). in the laminar flow chamber (1). The fluids pass through the laminar flow chamber (1) under control of the peristaltic pump (10) and exit through the outlet tube (18).
  • a valve (19) allows the fluid of the outlet tube (18) to be directed either towards an evacuation tube (20) or to a recycling tube (21) connected to the cavity (2), which makes it possible to pass again the fluid in the laminar flow chamber (1).
  • the recycling tube (21) is connected to the cavity (2) via the receptacle (12), but it is possible to provide a direct connection between the recycling tube (21) and the cavity ( 2).
  • the recycling of the biological sample by this circuit allows a better capture efficiency of the target cells.
  • the flow direction of the fluids in the device is indicated by arrows.
  • the device described above is an example of implementation of the invention. Other variations are included within the scope of the invention.
  • the essential characteristic lies in the circulation of the biological sample in a fluid circulation chamber allowing a flow laminar flow whose inner wall is provided with a particular grafting described above.
  • the fluid circulation circuit outside the fluid circulation chamber can be arranged according to the reagents that one wishes or not to use.
  • the device may comprise a plurality of fluid circulation chambers placed in series or in parallel.
  • This fluid flow chamber may be included in any microfluidic device of configuration suitable for cell capture, such as for example a microfluidic device such as that described in US-6,408,878.
  • the biological sample is passed through the fluid circulation chamber one or more times, depending on the experimental protocol chosen, it is possible to recover the cells which have been fixed on the grafted wall according to the invention by injecting into the fluid circulation chamber a reagent allowing the stalling of these cells. They are then recovered for analysis and counting.
  • the device of FIG. 2 can be constructed as follows: A solid support grafted with hydroxyl-terminated, amino-protected or acid-protected chlorosilane functions is fixed in the cavity (2) as described above, so as to close the cavity (2). The other mechanical elements of the device are placed as in FIG. 2. A deprotection reagent for the terminal functions is injected into the cavity (2) from one of the receptacles (14), then a coupling agent is injected into the cavity (2) and finally the biomolecule of recognition. It is indeed possible, from the mechanical device described in FIG. 2, to functionalize the wall (solid support) grafted with chlorosilanes by an appropriate sequence of injections of reagents, rinsing steps that can be provided intermediately.
  • a volume of 3-5 ml of peripheral blood of patients developing breast cancer and / or cancer-free controls is harvested in a conventional manner in Hanks medium (In VitroGen) containing 5mM EDTA (ethylene diamine tetra acid). acetic).
  • the nucleated cells (leukocytes and tumor cells) are then separated from red blood cells and platelets on a gradient containing ficoll (Amersham) in pre-adapted tubes (Leucosep).
  • Cell fractions containing leukocytes and CTCs are then diluted in Hanks medium containing 0.1% HSA (human serum albumin) at 1 x 10 6 cells per ml before subjecting them to isolation. average of the laminar flow chamber.
  • the flow rate of the peristaltic pump is set around 50 ⁇ l / min corresponding to a shear rate of 15 sec -1 and a shear stress of 0.15 dyne / cm 2 .
  • IHC immunohistochemistry
  • the present method can also be used in obstetrics in prenatal diagnosis for early genetic analyzes of fetal cells in maternal blood (Bianchi, D., 1999) Fetal cells in maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis Br J Maematol 105: 574 Fisk N. (1998) Maternal-fetal medicine and prenatal diagnosis, Curr Opin Obstet Gynecol 10:81).
  • the target fetal cell population in our process is trophoblastic, epithelial, and short-lived cells during the first trimester of pregnancy (Shulman LP., 2003) Fetal cells in maternal blood. ).
  • the density of this cell population is very low: ⁇ 1 fetal trophoblast for 10 6 maternal cells.
  • Cellular uptake can be by means of antibodies directed against membrane epithelial antigens, or an antibody against the human placental lactogen (Latham SE, Suskin HA, Petropoulos A et al (1996)
  • a monoclonal antibody to human placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from maternal blood in a model system Prenat Diagn 16: 813).
  • the present method has a certain advantage over existing methods such as flow cytometry or magnetic beads.
  • Isolated fetal cells undergo molecular genetic characterization for the detection of genetic abnormalities (PCR, FISH).
  • PCR PCR, FISH.
  • Another application of the present method is the detection of CTC in bone marrow and peripheral blood (Chapter 15: Tumor Cell Contamination (2001) Autologous blood and Marrow Transplantation: Proceedings of the Tenth International Symposium, edited by Karel A. Dicke and A Keating).
  • CTC CTC in bone marrow and peripheral blood
  • the present method relates to a two-step evaluation on the same patient: 1) on the presence and percentage of CTC in the peripheral blood before ablative chemotherapy of the cord, and 2) the absence of CTC on the blood sample processed and purged to obtain a hematopoietic stem cell population for autologous transplantation.

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Abstract

Dispositif microfluidique et ses applications pour la capture de sous-population de cellules au sein d'un fluide biologique. Le dit dispositif comporte une chambre (1) de circulation des fluides dont une paroi interne (5) est dotée d'un greffage par une couche de silane autoassemblée organisée, à laquelle est fixée une couche de biomolécules de reconnaissance spécifiques de la population de cellules.

Description

NOUVEAU SYSTEME MICROFLUIDIQUE ET PROCEDE DE CAPTURE DE
CELLULES
L'invention a pour objet un nouveau dispositif microfluidique et son utilisation pour la capture de sous populations de cellules au sein d'un fluide biologique. Plus particulièrement l'invention concerne un dispositif comportant une chambre de circulation des fluides dont une paroi est dotée d'un greffage permettant la capture d'une sous population de cellules au sein d'un échantillon biologique mis en circulation dans cette chambre. Ce dispositif permet la capture de cellules présentes en très petite quantité dans cet échantillon biologique. L'invention a également pour objet un procédé de capture de cellules au sein d'un échantillon biologique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte une étape de passage de l'échantillon biologique dans un tel dispositif.
Le dispositif de l'invention peut être utilisé pour la purification et la caractérisation des cellules tumorales circulantes à partir d'un échantillon de sang du patient ou pour la purification et la caractérisation de cellules fœtales à partir d'un échantillon sanguin prélevé chez la mère.
Le cancer du sein est la tumeur maligne la plus fréquente chez la femme en Europe et aux Etats-Unis. Le contrôle de la dissémination métastatique est un facteur important dans le pronostic de la pathologie. La purification et la caractérisation moléculaire des cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un enjeu primordial dans le suivi de patientes, à la fois comme paramètre d'appréciation de la maladie micrométastatique à un stade précoce, et comme outil phénotypique et génotypique à un stade tardif.
La possibilité de purifier et de caractériser des cellules tumorales circulantes présente un intérêt majeur dans le diagnostic et le suivi de l'évolution du cancer du sein mais également d'autres types de cancer comme le cancer de la prostate, du rein, de la vessie, du foie, du côlon, du poumon.
Les procédures actuelles de purification de CTC utilisent le CELLection kit qui fonctionne suivant le principe de séparation des cellules par capture par des billes magnétiques sur lesquelles l'anticorps anti-épithélial spécifique est greffé (Dynal® RAM IgGl CELLection™ Kit). Cette méthode combine plusieurs étapes de centrifugation très lourdes. Elle demande pratiquement un jour et demi de manipulation. Les rendements sont très faibles. Il y a beaucoup de pertes de CTC principalement dues à leur accrochage aux billes magnétiques. C'est pour cette raison que cette technique est difficilement utilisable en application clinique de routine.
On connaît dans l'art antérieur des dispositifs comprenant une chambre à flux laminaire et permettant la capture de cellules. Le document WO 03/091730 décrit un dispositif destiné à contrôler la migration des leucocytes, ce dispositif comportant deux chambres reliées entre elles par un canal. L'objectif est d'étudier les mécanismes de liaison des leucocytes aux parois des vaisseaux sanguins. Des composés médiateurs de la migration des leucocytes composés de cellules endothéliales peuvent être placés dans le canal. Des composés à tester peuvent également être placés dans ce dispositif.
Le document US-2003/0044766 décrit un procédé et un dispositif pour détecter une interaction entre deux types de cellules, l'une étant fixée dans un passage soumis à un flux laminaire d'une dispersion comprenant le second type de cellule. Ce dispositif est destiné à étudier les interactions entre des populations de leucocytes et des cellules endothéliales.
Le document A. Pierres et al, Faraday Discuss., 1998, 111, 321-330 décrit l'utilisation d'une chambre à flux laminaire pour étudier la formation de liaisons entre des sphères recouvertes de streptavidine et les parois de la chambre greffées par de la biotine.
Le document M.R. Wattenberger et al., Biophys. J., vol. 57, April 1990,
765-777 étudie de façon détaillée les paramètres qui régissent l'interaction entre une surface recouverte par un ligand et des cellules porteuses d'un récepteur. Des récepteurs incorporés dans des liposomes ont servi de modèle de cellule. Les essais ont été faits dans une chambre à flux laminaire.
La force de cisaillement, la force de la liaison ligand-récepteur, la densité de récepteurs sur la surface sont des paramètres importants.
Le document WO 00/23802 décrit une méthode de diagnostic permettant de déterminer la capacité de liaison de cellules dans un échantillon biologique consistant à faire passer cet échantillon sur une surface couverte d'un substrat se liant à ces cellules.
Ce document est plus particulièrement orienté vers le diagnostic des anomalies plaquettaires et des thromboses. Les conditions de cisaillement qui sont appliquées sont destinées à imiter les conditions que connaissent ces cellules in vivo dans les vaisseaux sanguins. Toutefois, les documents de l'art antérieur concernent essentiellement des dispositifs et des procédés destinés à étudier des interactions entre deux populations cellulaires : les leucocytes et les cellules endothéliales, à étudier l'adhérence plaquettaire ou des modèles cellulaires (sphères liposomes) porteurs de récepteurs.
Aucun de ces documents ne concerne la capture et l'étude de cellules tumorales circulantes ou de cellules fœtales.
Les documents de l'art antérieur concernent l'étude du comportement de populations de cellules qui sont présentes en grande concentration dans les échantillons traités et qui sont couvertes de récepteurs présents à leur surface avec une densité très élevée.
Les cellules auxquelles s'intéresse plus particulièrement la présente invention ont la particularité d'être présentes en très faible concentration dans les échantillons biologiques étudiés, au milieu d'autres populations de cellules fortement majoritaires. Les récepteurs spécifiques de ces cellules sont exprimés en faible densité à leur surface. Ce sont ces deux particularités qui rendent leur capture et leur identification au sein d'un échantillon biologique particulièrement difficiles.
L'utilisation d'un dispositif à flux laminaire de l'art antérieur dont une paroi serait greffée de façon classique par un ligand des CTC ne permet pas de capturer de CTC au sein d'un échantillon sanguin car celles-ci sont présentes en trop faible quantité et l'interaction antigène-anticorps concernée par cette capture est de l'ordre de 50 à 150 piconewtons, ce qui est extrêmement faible par comparaison avec les interactions des molécules d'adhérence entre deux populations de cellules. L'invention concerne plus particulièrement la capture d'une population de cellules dont les marqueurs spécifiques de surface ont une interaction avec leurs récepteurs d'une intensité allant de 1OpN à InN, avantageusement de 2OpN à 50OpN, préférentiellement de 30 à 30OpN, plus spécifiquement de 50 à 15OpN.
Les problèmes que vise à résoudre la présente invention sont la capture d'une population cellulaire minoritaire du type CTC au sein d'un échantillon biologique, en utilisant une quantité réduite d'échantillon biologique, et en ayant un rendement de capture aussi élevé que possible.
Ce problème a pu être résolu grâce à un dispositif comprenant une chambre de circulation des fluides dont une paroi interne est dotée d'un greffage particulier.
Le greffage dont est doté le dispositif de l'invention possède la particularité de présenter une surface régulière homogène sur laquelle peut être greffée une population de ligands spécifiques de la sous population de cellules que l'on cherche à capturer. L'homogénéité de surface favorise des interactions ligand-récepteur ou antigène- anticorps de faible intensité qui dans d'autres conditions matérielles ne permettraient pas d'effectuer cette capture.
Une chambre de circulation des fluides comporte une cavité, de préférence une cavité de type parallélépipédique, comportant deux orifices placés à deux extrémités de la cavité, le fluide étant injecté par un premier orifice et collecté par un second orifice.
Les dimensions de la chambre de circulation des fluides sont avantageusement choisies de façon à ce qu'elle soit une chambre à flux laminaire. Il peut également s'agir d'une cavité d'un dispositif microfluidique comme celui décrit dans le document US-6,408,878. Avantageusement, la cavité interne de la chambre de circulation des fluides a un volume inférieur ou égal à 30 μl, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 12 μl, ce qui permet de traiter des échantillons biologiques de volume réduit.
Avantageusement le dispositif est muni d'une pompe permettant d'injecter le fluide échantillon dans la chambre de circulation des fluides.
Avantageusement encore le dispositif comporte un circuit de circulation du fluide en boucle relié à une pompe, de telle sorte que l'échantillon à traiter passe plus d'une fois dans la chambre de circulation des fluides avant d'être collecté.
Selon la présente invention au moins une paroi de la chambre de circulation des fluides est dotée d'un greffage particulier. De préférence il s'agit d'une paroi parallèle au flux qui traverse la chambre de circulation des fluides. De préférence la chambre de circulation des fluides est un parallélépipède et l'une de ses faces internes comporte un greffage particulier.
La paroi de la chambre de circulation des fluides dotée d'un greffage particulier est constituée d'un support solide, qui peut être une lame de verre ou de silicium ou de toute surface solide métallique comportant des fonctions -OH en surface, qui est placée dans la chambre de circulation des fluides.
La surface de support solide, lame de verre, de Si ou autre est fonctionnalisée par une couche homogène, monomoléculaire auto-assemblée de chaînes chlorosilanes.
Une entité protéique de reconnaissance de la population de cellules cibles, notamment de cellules tumorales circulantes (anticorps ou ligand protéique) est greffée directement ou par l'intermédiaire d'un agent de couplage adéquat sur la couche de chlorosilanes. La sélectivité de la biomolécule de reconnaissance est déterminante pour la capture de la population de cellules cibles. Le support solide (lame) préparé est ensuite monté dans le dispositif de circulation des fluides.
La fonctionnalisation du support solide pour la capture cellulaire comprend 3 étapes : le greffage de cholorosilanes sur la lame de verre, le greffage d'un agent de couplage (qui peut être un agent de couplage chimique ou un agent de type protéine A ou G) et en final le greffage d'une entité protéique de reconnaissance (anticorps, ou le ligand d'un récepteur membranaire d'une cellule). La Figure 1 illustre une lame de verre de ce type greffée par un anticorps : le support solide est greffé par une couche de silane autoassemblée organisée, à laquelle est fixée par une liaison covalente une couche d'agent de couplage (linker). Une couche de biomolécules de reconnaissance spécifique de la population cellulaire cible est fixée de façon covalente ou non à l'agent de couplage. La présence de la couche d'agent de couplage est facultative : selon une variante de l'invention, on peut prévoir que les biomolécules de reconnaissance soient directement fixées sur la couche de silane autoassemblée organisée. Pour effectuer l'imrnobilisation de façon covalente de molécules organiques sur une surface minérale, il est tout d'abord nécessaire de greffer sur celle-ci des molécules de couplage qui vont assurer la fixation des molécules organiques sur le substrat minéral. Des molécules de couplage organosiliciées ont été proposées dans ce but par L.A. Chrisey et al. {Nucléic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039) et U. Maskos et al. (Nucléic Acids Research, 1992, 20, 7, 1679-1684). Les molécules utilisées, à savoir le 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane et différents aminosilanes, présentent toutefois l'inconvénient de se déposer de façon aléatoire et non reproductible sur la surface. Ils y forment un film inhomogène dont l'épaisseur ne peut être contrôlée, film qui est en outre peu robuste vis-à-vis de traitements chimiques ultérieurs, l 'inhomogénéité du film indiquant en effet une mauvaise protection des liaisons siloxaniques. Il est donc très difficile d'obtenir un greffage reproductible de ces molécules. Avant de fixer ou de synthétiser des oligonucléotides sur le substrat, des réactions de surface supplémentaires sont nécessaires pour diminuer la gène stérique à la surface (par exemple greffage de molécules hétérocycliques bifonctionnelles, comme décrit par L. A. Chrisey et al), rendre la surface plus hydrophile (U. Maskos et al. décrivent le greffage d'éthylène glycol, de penta- ou d'hexa-éthylèneglycol) et/ou pallier la faible réactivité des fonctions de surface, opérations supplémentaires qui, elles aussi, ne sont pas maîtrisées. A. Ulman a décrit, dans Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554, la formation de monocouches autoassemblées organisées sur des supports solides à l'aide de composés organosiliciés de type alkyltrichlorosilanes fonctionnalisés. Leur utilisation pour la fixation de biomolécules est proposée, méthode qui nécessite vraisemblablement, dans ce contexte, une modification de la biomolécule par une fonction thiol et une modification de la surface par des molécules hétérobifonctionnelles.
Pour pallier ces inconvénients des composés organosiliciés ont été décrits dans le document WO 01/53303. Ces composés peuvent être utilisés comme molécules de couplage pour déposer à la surface d'un support solide, une monocouche autoassemblée organisée. De telles molécules ont été utilisées notamment pour l'immobilisation de biomolécules telles que des acides nucléiques.
Contrairement aux méthodes de greffage de biomolécules de l'art antérieur, la méthode décrite dans WO 01/53303 permet d'obtenir un support solide greffé par des biomolécules immobilisées sur une monocouche autoassemblée organisée. Cette caractéristique se traduit par la présentation d'une surface homogène de biomolécules qui favorise la capture d'une population minoritaire de cellules, dotées d'une faible densité de capteurs spécifiques dans un échantillon biologique circulant sur cette surface. En effet les greffages de l'art antérieur ne permettaient pas d'obtenir une homogénéité de surface satisfaisante et ce défaut a pour conséquence un faible taux de capture de cellules cibles minoritaires au sein d'un échantillon biologique.
Dans le dispositif de l'invention, le support solide est modifié par une monocouche autoassemblée organisée comprenant au moins un composé organosilicié répondant à la formule (I) :
dans laquelle :
- n est compris entre 15 et 35, de préférence entre 20 et 25, - m est égal à 0 ou à 1,
- X1, X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents entre eux, sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en Ci à C6, linéaires ou ramifiés, et les groupement hydrolysables, au moins l'un de X1, X2 ou X3 représentant un groupement hydrolysable,
- A représente un groupement -O-(CH2-CH2-O)k-(CH2)j- dans lequel k représente un nombre entier compris entre 0 et 100, de préférence entre 0 et 5, et i représente un nombre entier supérieur ou égal à 0, de préférence égal à 0 ou à 1, - B représente un groupement choisi parmi -OCOR, -OR,
-COOR, -R, -COR, -NR1R2, -CONR1R2, COOR -SR, un atome d'halogène,
- R, Ri, R2 étant choisis parmi : un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes d'halogène, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant I h 24 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 6 atomes de carbone, ou un groupement aromatique éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène.
On entend par « aromatique » tout groupement qui possède un ou plusieurs noyaux aryles, par exemple un noyau phényle.
On entend par « monocouche autoassemblée organisée » un assemblage de molécules dans lequel les molécules sont organisées, organisation due à des interactions et à une forte cohésion entre les chaînes des molécules, donnant lieu à un film anisotrope stable et ordonné (A. Ulman, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554).
Une monocouche autoassemblée organisée formée sur un support solide permet l'obtention d'une surface organique dense, homogène et de paramètres bien définis à la fois chimiquement et structurellement. La formation de cette monocouche, obtenue grâce aux propriétés ά" autoassemblage des composés de formule (I) pour des valeurs de n, m, k et i bien définies, est parfaitement reproductible pour chaque composé organosilicié. En outre, la formation d'une monocouche autoassemblée organisée, très dense, protège les liaisons siloxaniques vis-à-vis des traitements chimiques (acides ou basiques), ce qui permet de réaliser des réactions chimiques variées sur cette surface.
Les composés organosiliciés de formule (I) utilisés dans la présente invention présentent avantageusement des fonctionnalités très variées et une grande réactivité, eu égard à la nature du groupe A et à la diversité des groupements B terminaux utilisables, ces groupement B pouvant bien entendu être modifiés et fonctionnalisés à volonté selon les réactions de chimie organique bien connues de l'homme du métier.
Les composés décrits ci-dessus permettent, de façon particulièrement avantageuse et de par les composés organosiliciés de formule (I) sélectionnés, d'immobiliser des biomolécules sur un support de façon fiable et reproductible, eu égard à l'homogénéité et à la stabilité de la monocouche autoassemblée organisée formée sur le support. Les biomolécules sont immobilisées sur le support modifié par des liaisons covalentes fortes, sans dégradation des liaisons siloxaniques développées entre les composés organosiliciés et le support solide.
Des supports solides convenables sont, de manière générale, ceux dont la surface est hydratée et/ou ceux dont la surface présente des groupements hydroxyles. De préférence, ledit support est sélectionné dans le groupe constitué par les verres, les céramiques (par exemple de type oxyde), les métaux (par exemple l'aluminium ou l'or) et les métalloïdes (tel que le silicium).
Au sens de la présente invention, on entend par « hydrolysable » tout groupe capable de réagir avec un acide en milieu aqueux de façon à donner les composés XiH, X2H ou X3H, Xj, X2 et X3 étant tels que définis dans la formule (I).
Selon un mode de mise en œuvre avantageux, ledit groupement hydrolysable est sélectionné dans le groupe constitué par les atomes d'halogène, le groupement -N(R')2 et les groupements -OR', R' étant un groupe alkyle saturé en C1 à C6, linéaire ou ramifié. En ce qui concerne les groupements B et les groupements hydrolysables, des atomes d'halogène convenables sont aussi bien le fluor que le chlore, le brome ou l'iode.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux, Xi, X2 et X3 représentent des atomes de chlore. Avantageusement, n est supérieur ou égal à 22.
L'utilisation de supports solides modifiés selon la présente invention est particulièrement avantageuse pour la préparation de supports sur lesquels sont fixés, de façon covalente, des entités protéiques (anticorps, ligand d'un récepteur cellulaire, protéine...) susceptibles de fixer de façon sélective des cellules représentant une sous population au sein d'un échantillon biologique.
La préparation du support solide greffé selon la présente invention comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un support solide modifié par une monocouche autoassemblée organisée comprenant au moins un composé organosilicié répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, dans lequel lesdits composés organosiliciés présentent à leur extrémité une fonction acide carboxylique hydroxyle ou aminé protégée ; b) éventuellement, déprotection de la fonction acide carboxylique hydroxyle ou aminé ; c) éventuellement, greffage d'un agent de couplage sur le support solide modifié ; d) greffage de l'entité protéique.
L'étape a) est avantageusement réalisée par les étapes suivantes : i) élimination des contaminants du support solide et hydratation et/ou hydroxylation de sa surface, j) introduction dans un mélange d'au moins deux solvants comprenant au moins un solvant hydrocarboné non polaire, sous atmosphère inerte, d'un composé organisilicié de formule (I) telle que définie ci-dessus, ledit composé présentant à une extrémité une fonction acide carboxylique hydroxyle ou aminé protégée, k) silanisation du support obtenu à l'étape i) par immersion dans la solution préparée à l'étape j),
1) éventuellement, recuit du support silanisé obtenu à l'étape k), portant la monocouche autoassemblée, à une température comprise entre 50 et 120°C, pour une durée de 5 minutes à une nuit, et m) rinçage du support modifié obtenu à l'étape k) ou 1) à l'acide d'un solvant, de préférence polaire.
La préparation de supports solides fonctionnalisés par une couche de silanes est illustrée de façon détaillée dans le document WO01/53303. Par « contaminants » du support solide, on entend tout composé tel que de la graisse, des poussières ou autres, présent à la surface du support et qui ne fait pas partie de la structure chimique du support lui-même.
Selon la nature du support solide, l'étape i) peut être effectuée à l'aide d'un ou plusieurs solvants et/ou oxydants et/ou hydroxylants (par exemple un mélange sulfochromique), d'une solution de détergent (par exemple Hellmanex®), d'un traitement photochimique à l'ozone ou tout autre traitement approprié.
L'étape j) peut avantageusement être réalisée dans un mélange d'au moins un solvant hydrocarboné non polaire et d'au moins un solvant polaire. Dans ce cas, les proportions volumiques de solvant non polaire et de solvant polaire sont de préférence comprises entre 70/30 et 95/5.
A titre d'exemple et de façon non limitative, au cours de l'étape j), un solvant hydro carboné non polaire utilisable est le cyclohexane et un solvant polaire utilisable est le chloroforme.
Lors de l'étape j), la concentration du composé organosilicié dans le mélange de solvants est de préférence comprise entre 1.10"5 et LlO"2 mole/litre.
L'étape k) de silanisation du support peut être effectuée pendant un temps compris entre 1 minute et 3 jours et à une température comprise entre -10°C et 120°C selon les solvants utilisés.
L'étape c) de greffage d'un agent de couplage peut être mise en œuvre de façon différente en fonction de la nature de la fonction terminale du groupe de formule (I).
(i) Dans le cas des chaînes à terminaison -NH2 :
Un agent de couplage homo-bifonctionnel ou hétéro-bifonctionnel peut être choisi. Le groupement fonctionnel destiné à réagir avec la protéine est soit le carbonyle en a du sulfosuccinimidyl (BS3) soit l'ester de sulfo NHS (Sulfo-SMCC). Il peut s'agir de :
- BS3 : subérate de te(sulfosuccinimidyle) (Staros JV. (1982) N- Hydroxysulfosuccinimide active esters: Bis(7V-hydroxysulfosuccmimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linker. Biochemistry 21:3950.), que l'on met en œuvre suivant le schéma 1 :
SCHEMA 1
- Sulfo-SMCC : Carboxylate de l-cyclohexane-4-(N-maléimidométhyle) sulfosuccinimidyl e (Samoszuk MK et al. (1989) Antibody, Immunocojugates. Radiopharm 2:37), que l'on met en œuvre suivant le schéma 2 :
SCHEMA 2 - A la place d'un agent de couplage chimique, la protéine A (PA) ou la protéine G (PG) peuvent jouer le rôle d'agent de couplage (Eliasson M, Olsson A, Palmcrantz E et al. (1988) Chimeric-binding receptors engineered from Staphylococcal protein A and Streptococcal protein G. J Biol Chem 263:4323). Dans ce cas, PA ou PG peut être couplé directement à la chaîne chlorosilane terminée en NH2 en présence de EDC [Chlorydrate de l-éthyle-3-(3-Diméthylaminopropyle)carbodiimide] (Grabarek Z and Gergely J (1990) Zero-length crosslinking procédure with the use of active esters. Anal Biochem 185:131). Cette variante est illustrée par le schéma 3 :
Protéine A ou G
SCHEMA 3
(ii) Dans le cas des chaînes terminées en OH :
Un agent de couplage hétéro-bifonctionnel est :
- PMPI : Isocyanate de N-(p-maléimidophényle) (Annunziato ME et al. (1993) p-maleimidophenyl isocyanate : a novel heterobifunctionnal linker for hydroxyl to thiol coupling. Bioconjug Chem 4:212) dont la mise en œuvre se fait comme illustré par le schéma 4 :
SCHEMA 4
(iii) Dans le cas des chaînes terminées en COOH
L'agent de couplage hétéro-bifonctionnel est :
- KMUH : N-hydrazide de l'acide k-maléimidoundécanoique (Trail PA, et al (1993) Science 261:212) dont la mise en œuvre se fait comme illustré par le schéma 5 :
SCHEMA 5
- Dans le cas des chaînes à terminaison en -COOH, il est également possible d'utiliser la protéine A ou la protéine G comme décrit ci-dessus. A l'étape d) on choisit l'entité protéique en fonction de l'utilisation que l'on souhaite faire du dispositif :
La nature de la sous-population de cellules que l'on cherche à capturer est déterminante pour le choix de cette entité protéique. Cette dernière doit présenter une affinité spécifique pour la sous-population ciblée. La stratégie de la capture des CTC est fondée sur les propriétés de reconnaissance des molécules de la surface cellulaire. Ces molécules sont des molécules d'adhérence cellulaire, ou des récepteurs membranaires. La capture cellulaire est médiée par l'interaction de ligands spécifiques avec ses récepteurs ou d'anticorps dirigés contre un épitope d'une molécule d'adhérence ou d'un récepteur. Quelle que soit l'entité protéique utilisée pour la capture cellulaire
(ligand ou anticorps), il est nécessaire de modifier les fonctions NH2 latérales des lysines de la protéine de reconnaissance et de les transformer en groupement hydrosulfure (SH). Dans le cas d'un anticorps, pour une reconnaissance antigène-anticorps, la modification du NH2 latéral de la lysine située sur la portion Fc a une grande importance car elle permet de laisser les sites de liaison libres sur les fragments Fab, ces sites étant nécessaires à la reconnaissance des antigènes cellulaires.
La stratégie de fixation de l'entité protéique de reconnaissance peut consister dans l'utilisation du réactif SATA Acétate de (iV-Succinimidyl-S-acétyle) par un procédé comprenant deux étapes (Durican RJS, Weston PD et al. (1983) A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the préparation of conjugates for immunoassays. Anal Biochem 132:68) comme illustré sur les schémas 6 et 7, ou du réactif de TRAUT (2-immothiolane*HCl), comme illustré sur le schéma 8, (Ghosh SS, Kao PM, McCue AW et al. (1990) Use of maleimide thiol coupling chemistry for efficient suntheses of oligonucleotide-enzyme conjugate hybridization probes. Bioconjug Chem 1:71) :
A. Réaction des NH2 avec SATA (étape I)
SCHEMA 6
B. Déprotection des SH par l'hydroxylamine (étape II)
HO - N -C - CH3
SCHEMA 7
C. Modification des NH2 par le réactif de TRAUT
SCHEMA 8
Quelques exemples d'anticorps reconnaissant des molécules de surface et destinés à être greffés dans le dispositif de l'invention : a) Sur-expression de la molécule d'adhérence intercellulaire Ep-CAM
Les tumeurs solides du sein dérivant des tissus épithéliaux sur-expriment Ep-CAM5 une molécule d'adhérence intercellulaire (Gastl G, Spizzo G, Obrist P et al. (2000) Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. The Lancet 356:1981). Ep-CAM est également désigné sous les noms : 17-1 A, ESA, EGP40. C'est une glycoprotéine épithéliale transmembranaire de 40 kDa codée par le gène GA 733-2 (Linnenbach AJ,
- Woicierowski J, Wu S et al. (1989) Séquence investigation for the major gastrointestinal tumor-associated antigène family, GA733. Proc natl Acad USA 86:27; Gôttlinger HG,
Funke I, Johnson JP et al. (1986) The epithelial cell surface antigen, a target for antibody- mediated tumor therapy: its biochemical nature, tissue distribution and récognition by différent monoclonal antibodies. Int J Cancer 38:47). Elle est reconnue comme un antigène tumoral sur-exprimé dans la plupart des carcinomes, et est impliquée dans le processus métastatique (Litvinov SV, Velders MP, Bakker HA et al. (1994) Ep-CAM : a human antigen is a homophilic cell-cell adhésion molécule. J Cell Biol 125:437). Ep-CAM est suggéré comme cible thérapeutique, particulièrement en immunothérapie. Divers anticorps monoclonaux, 17- IA, MOC31, Ber-EP4, et HA- 125 sont dirigés contre divers épitopes de cette molécule. L'anticorps monoclonal Ber-EP4 reconnaît deux épitopes de 34 et 39 kDa de Ep-CAM (Latza U, Niedobitek G, Schawarting R et al. (1990) Ber-EP4: a new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J Clin Pathol 43:213).
Ber-EP4, ou MOC31 ou HA- 125 peuvent être liés soit directement sur la protéine A ou la protéine G, soit à la chaîne chlorosilane à terminaison NH2, OH ou COOH, par l'intermédiaire d'un agent de couplage adéquat, b) Sur-expression de HER-2
Le gène du récepteur du facteur de croissance humain 2 (HER-2)/new (c- erbB-2) est localisé sur le chromosome 17q et code pour un récepteur protéique transmembranaire avec une activité tyrosine kinase, de la famille des récepteurs des facteurs de croissance épidermique (EGFR) ou la famille des HER. L'amplification du gène HER-2/neu ou la sur-expression de la protéine HER-2 (pl85HER2) sont des facteurs pronostiques dans le cancer du sein et de divers carcinomes (Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et al. (1987) Human breast cancer: corrélation of relapse and survival with amplification of the Her-2-/«eu oncogene. Science 235:177). L'anticorps anti-HER-2 (trastuzumab) est utilisé en thérapie anti-tumorale.
L'anticorps anti-HER-2 (anti-humain ErB2) est utilisé comme marqueur spécifique pour capturer les CTC du cancer du sein. Associé à la détection par l'anticorps Ber-EP4, il jouera le rôle d'un marqueur potentiel des CTC.
Le greffage de l'anticorps anti-Her-2 peut être fait comme celui de l'anticorps Ber-EP4. c) Sur-expression.de MUCl Les mucines sont exprimées par divers types de cellules épithéliales normales dans un cadre environnemental rugueux comme l'interface air/eau du système respiratoire, l'environnement acide de l'estomac, l'environnement complexe du tractus intestinal et les surfaces épithéliales sécrétrices des organes spécialisés comme le foie, le pancréas, la vésicule biliaire, les reins, les glandes salivaires, les glandes lacrymales et l'œil. La famille des mucines comprend au moins 17 molécules sécrétées ou non et joue un rôle central dans le maintien de l'homéostase (Hollingsworth MA and Swanson BJ. (2004) Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Reviews Cancer 4:45).
Les mucines sont des glycoprotéines de haut poids moléculaire avec des répétitions en tandem de séquences riches en serine, thréonine et prolines attachées à des oligosaccharides par des liaisons O-glycosidiques. MUCl est une protéine de membrane intégrale. Dans les tumeurs du sein, MUCl est sur-exprimée et glycosylée de façon aberrante (Rahn JJ, Dabbagh L, Pasdar M et al. (2001) The importance of MUCl cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients and review of the literature. Cancer 91:1973). L'anticorps anti-MUCl (CT2 Mab) est utilisé comme marqueur spécifique pour capturer les CTC du cancer du sein. Associé à la détection par l'anticorps Ber-EP4, il jouera le rôle d'un marqueur potentiel des CTC.
Le greffage de l'anticorps anti-MUCl peut être fait comme celui de l'anticorps Ber-EP4. Les antigènes de membrane choisis comprenant une glycoprotéine de membrane Ep-CAM, la glycoprotéine MUCl, et un récepteur du facteur de croissance HER-2/neu sont des marqueurs tumoraux sur-exprimés dans les CTC. De ce fait, les cellules tumorales peuvent révéler une densité de molécules de surface cellulaire optimisée, favorisant ainsi la capture cellulaire spécifique. U est à noter que la densité de CTC dans le sang périphérique est un paramètre totalement inconnu. Ce paramètre peut varier selon le degré de la pathologie et tourne autour de 1 CTC pour 103 à 2x104 leukocytes. Les anticorps dirigés contre ces molécules sont spécifiques et suffisamment sélectifs pour permettre une capture de CTC dans les meilleures conditions possibles en termes de conservation, de morphologie cellulaire et de viabilité.
La stratégie d'utilisation des longues chaînes organosiliciées (n = 22) pour le greffage des surfaces, l'addition d'un agent de couplage, et le greffage de la portion Fc de l'anticorps sont des atouts pour optimiser la capture cellulaire.
En effet, la longueur de l'ensemble X3-Si-(CH2)22-agent de couplage- anticorps varie entre 40 à 50 Â produisant ainsi une grande flexibilité dans une présentation favorable de l'anticorps à l'antigène cellulaire. En effet, en admettant une densité de récepteurs HER-2 sur-exprimés sur la surface totale de la cellule tumorale de 106, une évaluation rapide donne 8 récepteurs dans une surface carrée de 10 Â de côté. Selon l'évaluation par la microscopie de force atomique (AFM), la densité de greffage de chaînes organosiliciées étant de 3 à 5 molécules par nm , cette configuration est très favorable à l'obtention d'un bon greffage d'agent de liaison et d'anticorps.
EXEMPLE
1- Dispositif
La figure 2 illustre la capture cellulaire au moyen d'une chambre à flux laminaire. Le présent procédé de capture cellulaire utilise une chambre à flux laminaire (1), fabriquée en Plexiglas ®, comprenant une cavité (2) de dimension 20 x 6 x 0,2 mm3 (L x 1 x h), et reliée à l'extérieur par des ouvertures d'entrée (3) et de sortie (4) pour la circulation des cellules et des fluides.
La paroi (5) constituant le plancher de la chambre est une lame de verre ou de Si cristallin amovible et fonctionnalisée chimiquement. Cette lame est appliquée dans une encoche (6) contre la cavité (2) de la chambre (1) au moyen d'un joint torique (7) destiné à en assurer l'étanchéité. On peut prévoir que les extrémités de la cavité (2) soient arrondies de façon à favoriser le positionnement du joint torique (7). Elle est vissée (8) sur la base en Plexiglas® par une plaque métallique (9). Un joint en Téflon® (9a) sépare la lame de verre de la plaque métallique. Tout autre moyen connu de l'homme du métier et permettant la fixation du support solide dans la cavité peut être utilisé. Dans le cas illustré sur la figure 2, et selon une variante préférée de l'invention, la plaque métallique (9) comporte dans sa partie centrale une zone transparente (non hachurée) qui permet d'observer l'intérieur de la cavité (2) à l'aide d'un microscope (non représenté). De même pour le joint en Téflon® (9a) comporte une zone centrale transparente (non hachurée). La proportion des zones opaques et transparentes peut varier. Les arrivées et les évacuations des fluides par les ouvertures (3, 4) sont placées sous le contrôle d'une pompe péristaltique (10) imposant le débit et la vitesse d'écoulement.
La pompe péristaltique (10) prélève l'échantillon biologique (11) dans un réceptacle (12), prévu à cet effet, fermé de façon à être maintenu stérile, et l'injecte dans le tube de circulation (13). Elle peut prélever des réactifs (14a, 14b) dans les réceptacles (14), également fermés de façon à assurer la bonne conservation des produits qu'ils contiennent, et les injecter dans les tubes de circulation (15). Une vanne (16) à l'intersection des tubes de circulation (15), (13) et (17) permet de réguler la connexion entre les tubes de circulation (15) et (13) et le tube (17) d'introduction dans la chambre à flux laminaire (1). Les fluides traversent la chambre à flux laminaire (1) sous contrôle de la pompe péristaltique (10) et en sortent par le tube de sortie (18). Une vanne (19) permet d'orienter le fluide du tube de sortie (18) soit vers un tube d'évacuation (20) soit vers un tube de recyclage (21) relié à la cavité (2), qui permet de faire passer à nouveau le fluide dans la chambre à flux laminaire (1). Sur la figure 2 le tube de recyclage (21) est relié à la cavité (2) par l'intermédiaire du réceptacle (12), mais il est possible de prévoir une connexion directe entre le tube de recyclage (21) et la cavité (2). Le recyclage de l'échantillon biologique par ce circuit permet un meilleur rendement de capture des cellules cibles. Le sens de la circulation des fluides dans le dispositif est indiqué par des flèches. Le dispositif décrit ci-dessus constitue un exemple de mise en œuvre de l'invention. D'autres variantes sont incluses dans la portée de l'invention. La caractéristique essentielle réside dans la mise en circulation de l'échantillon biologique dans une chambre de circulation des fluides permettant un écoulement en flux laminaire dont une paroi interne est dotée d'un greffage particulier décrit ci-dessus. Le circuit de circulation des fluides en dehors de la chambre de circulation des fluides peut être aménagé en fonction des réactifs que l'on souhaite ou non utiliser. Selon une variante de l'invention, le dispositif peut comporter plusieurs chambres de circulation des fluides placées en série ou en parallèle. Cette chambre de circulation des fluides peut être incluse dans tout dispositif microfluidique de configuration appropriée à la capture de cellules, comme par exemple un dispositif microfluidique tel que celui décrit dans le document US-6,408,878.
Lorsque l'échantillon biologique est passé à travers la chambre de circulation des fluides une ou plusieurs fois, en fonction du protocole expérimental choisi, il est possible de récupérer les cellules qui se sont fixées sur la paroi greffée selon l'invention en injectant dans la chambre de circulation des fluides un réactif permettant le décrochage de ces cellules. Elles sont ensuite récupérées en vue de leur analyse et de leur comptage.
Selon une variante de l'invention, le dispositif de la figure 2 peut être construit de la façon suivante : Un support solide greffé par des fonctions chlorosilane à terminaison hydroxyle, aminé ou acide protégées est fixé dans la cavité (2) comme décrit ci-dessus, de façon à fermer la cavité (2). Les autres éléments mécaniques du dispositif sont placés comme sur la figure 2. Un réactif de déprotection des fonctions terminales est injecté dans la cavité (2) à partir de l'un des réceptacles (14), puis un agent de couplage est injecté dans la cavité (2) et enfin la biomolécule de reconnaissance. On peut en effet à partir du dispositif mécanique décrit sur la figure 2, fonctionnaliser la paroi (support solide) greffée par les chlorosilanes par une séquence appropriée d'injections de réactifs, des étapes de rinçage pouvant être prévues de façon intermédiaire.
2- Protocole d'isolement des CTC
Un volume de 3 à 5 ml de sang périphérique de patients développant un cancer du sein et/ou de témoins sans cancer est prélevé d'une façon classique dans un milieu de Hanks (In VitroGen) contenant 5mM d'EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique). Les cellules nuclées (leukocytes et cellules tumorales) sont ensuite séparées des globules rouges et des plaquettes sur un gradient contenant du ficoll (Amersham) dans des tubes pré-adaptés (Leucosep). Les fractions de cellules contenant les leukocytes et les CTC sont ensuite diluées dans du milieu de Hanks contenant 0,1 % de HSA (albumine de sérum humain) à raison de 1 x 106 cellules par ml avant de les soumettre à l'isolement au moyen de la chambre à flux laminaire. Le débit de la pompe péristaltique est réglé autour de 50 μl/min correspondant à une vitesse de cisaillement de 15 s"1 et une contrainte de cisaillement de 0,15 dyne/cm2.
La récupération des CTC isolées peut être effectuée par dissociation de la liaison antigène-anticorps par diverses méthodes : par compétition en utilisant un inhibiteur peptidique; soit en augmentant la vitesse de flux d'un facteur de 10 à 100, soit par une dissociation des ponts S=S des fragments des anticorps pour le relargage des cellules capturées.
D'autres essais ont été faits sur des dispositifs microfluidiques et des chambres à flux laminaires dont les dimensions sont données dans les tableaux 1 et 2 ci- dessous :
Tableau 1 : dimensions de la chambre à flux laminaire
Tableau 2 : dimensions du dispositif mi crofluidi que
3- Caractérisation moléculaire du phénotype tumoral
Divers procédés pour la caractérisation des CTC isolées peuvent être appliqués. a) Caractérisation morphologique, immuno-cytoloRique et génétique des CTC
- par immuno-hîstochimie (IHC) : détection de marquage par des anticorps : antikératine (CKl 9, CK20, CK22), anti-CD45 spécifique des leukocytes
- Marqueurs tumoraux (IHC et RT-PCR) : sur-expression de HER- 2/nen, télomérase, MUC-I b) Caractérisation cvtogénétique
- CGH (hybridation in situ comparative) - FISH (fluorescence in situ hybridation)
4- Autres applications a) Le diagnostic prénatal
Le présent procédé peut également être utilisé en obstétrique dans le diagnostic prénatal pour des analyses génétiques précoces de cellules fœtales dans le sang maternel (Bianchi D. (1999) Fetal cells in the maternai circulation: feasibility for prénatal diagnosis. Br J Maematol 105:574 ; Fisk N. (1998) Maternal-fetal medicine and prénatal diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol 10:81). La population de cellules fœtales visées dans notre procédé est constituée par des cellules trophoblastiques, de type épithélial, et de courte vie pendant le premier trimestre de gestation (Shulman LP. (2003) Fetal cells in maternai blood. Current Women's Health Reports 3:47). La densité de cette population de cellules est très basse :~ 1 trophoblaste fœtal pour 106 cellules maternelles. La capture cellulaire peut se faire à l'aide d'anticorps dirigés contre des antigènes épithéliaux membranaires, ou un anticorps dirigé contre le lactogène placentaire humain (Latham SE, Suskin HA, Petropoulos A et al. (1996) A monoclonal antibody to human placental lactogen hormone facilitâtes isolation of fetal cells from maternai blood in a model System. Prenat Diagn 16:813). Le présent procédé présente un avantage certain par rapport aux méthodes existantes comme la cytométrie de flux ou les billes magnétiques.
Les cellules fœtales isolées sont soumises à une caractérisation moléculaire génétique pour la détection d'anomalies génétiques (PCR, FISH). b. Détection de CTC dans le sanfi périphérique et la moelle osseuse
Une autre application du présent procédé concerne la détection de CTC dans la moelle osseuse et le sang périphérique (Chapter 15 : Tumor CeIl Contamination (2001) Autologous blood and Marrow TransplantationX: Proceedings of the Tenth International Symposium, ed by Karel A. Dicke and A. Keating). Dans le premier cas, la présence de CTC métastatique dans la moelle osseuse permet d'évaluer le pronostic afin de cibler les thérapies.
Dans le deuxième cas, le présent procédé concerne une évaluation en deux étapes sur une même patiente : 1) sur la présence et le pourcentage de CTC dans le sang périphérique avant une chimiothérapie ablative de la moelle, et 2) l'absence de CTC sur le prélèvement sanguin traité et purgé pour obtenir une population de cellules souches hématopoïétiques pour une transplantation autologue.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif micro fluidique pour la capture d'une population de cellules comportant une chambre (1) de circulation des fluides dont une paroi interne (5) est dotée d'un greffage par une couche de silane autoassemblée organisée, à laquelle est fixée une couche de biomolécules de reconnaissance spécifiques de la population de cellules, caractérisé en ce que la couche de silane autoassemblée organisée comprend au moins un composé organosilicié répondant à la formule (I) :
dans laquelle :
- n est compris entre 15 et 35, de préférence entre 20 et 25,
- m est égal à 0 ou à 1 , - X1, X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents entre eux, sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en Cj à C6, linéaires ou ramifiés, et les groupement hydrolysables, au moins l'un de X1, X2 ou X3 représentant un groupement hydrolysable,
- A représente un groupement -O-(CH2-CH2-O)k-(CH2)i- dans lequel k représente un nombre entier compris entre 0 et 100, de préférence entre 0 et 5, et i représente un nombre entier supérieur ou égal à 0, de préférence égal à 0 ou à 1,
- B représente un groupement choisi parmi -OCOR, -OR, -COOR, -R, -COR, -NRiR2, -CONRiR2, COOR, -SR, un atome d'halogène,
- R, Ri, R2 étant choisis parmi : un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes d'halogène, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant 1 à 24 atomes de carbone, ou un groupement aromatique éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, étant entendu que lorsque R=H ou R=alkyle, alors B≠-R
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la couche de biomolécules est liée à la couche de silane autoassemblée organisée par l'intermédiaire d'une couche d'agent de couplage.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la paroi interne (5) de la chambre (1) de circulation des fluides dotée d'un greffage particulier est constituée d'un support solide (5), qui peut être une lame de verre, de silicium ou de toute surface solide métallique comportant des fonctions -OH en surface.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les dimensions de la chambre (1) de circulation des fluides sont choisies de telle sorte qu'elle soit une chambre à flux laminaire.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre (1) de circulation des fluides comporte une cavité (2) de type parallélépipédique, comportant deux orifices (3,4) placés à deux extrémités de la cavité, le fluide étant injecté par un premier orifice (3) et collecté par un second orifice (4).
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre (1) de circulation des fluides comporte une cavité (2) d'un volume inférieur ou égal à 30 μl, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 12 μl.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est muni d'une pompe (10) permettant d'injecter le fluide échantillon dans la chambre (1) de circulation des fluides.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la paroi (5) dotée d'un greffage particulier est parallèle au flux qui traverse la chambre (1) de circulation des fluides.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le groupe hydrolysable est sélectionné parmi : les atomes d'halogène, le groupement -N(R')2 et les groupements -OR', R' étant un groupe alkyle saturé en C1 à C6, linéaire ou ramifié.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que X1, X2 et X3 représentent des atomes de chlore.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que n est supérieur ou égal à 22.
12. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de couplage est sélectionné parmi :
- le Subérate de bis(sulfosuccinimidyle) ; le carboxylate de l-cyclohexane-4-(N-maléimidométhyle) sulfosuccinimidyle) - la protéine A
- la protéine G
- l'isocyate de N-(p-maléimido phényle)
- le N-hydrazide de l'acide k-maléimidoundécanoïque.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la biomolécule de reconnaissance est une protéine dont les fonctions
NH2 latérales des lysines ont été transformées en groupement hydrosulfure (SH).
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la biomolécule de reconnaissance est sélectionnée parmi : - les anticorps monoclonaux 17- IA, MOC31, Ber-EP4, et HA- 125 qui reconnaissent la molécule d'adhérence intercellulaire Ep-CAM,
- l'anticorps anti-HER-2 (anti-humain ErB2)
- l'anticorps anti-MUCl (CT2 Mab)
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre à flux laminaire (1), comprenant une cavité (2) et des ouvertures d'entrée (3) et de sortie (4) pour la circulation des cellules et des fluides, une lame (5) de verre ou de Si cristallin amovible et fonctionnalisée chimiquement constituant le plancher de la chambre (1) fixée à la cavité (2) , une pompe péristaltique (10) contrôlant l'arrivée et les évacuations des fluides par les ouvertures (3, 4), au moins un réceptacle (12) dans lequel est placé l'échantillon biologique (11), au moins un tube de circulation (13) reliant le réceptacle (12) à l'ouverture (3) et au moins un tube de sortie
(18) relié à l'ouverture (4).
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que le réceptacle (12) est relié à l'ouverture (3) par l'intermédiaire d'un tube (17) d'introduction dans la chambre à flux laminaire (1),
17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réceptacle (14) comprenant un réactif (14a, 14b), un tube de circulation (15) reliant le réceptacle (14) à l'ouverture (3) par l'intermédiaire du tube (17), une vanne (16) à l'intersection des tubes de circulation (15), (13) et (17) pour réguler la connexion entre les tubes (15) et (13) et (17).
18. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un tube d'évacuation (20) et un tube de recyclage (21) relié à la cavité (2) et une vanne
(19) d'orientation du fluide entre les tubes (18), (20) et (21).
19. Procédé de capture de cellules au sein d'un échantillon biologique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte une étape de passage de l'échantillon biologique dans la chambre (1) de circulation des fluides d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 19.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux étapes de passage de l'échantillon biologique dans la chambre (1) de circulation des fluides.
21. Procédé selon la revendication 19 ou la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de décrochage des cellules.
22. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la capture d'une population de cellules dans un échantillon biologique.
23. Utilisation selon la revendication 22 pour la capture dans un échantillon biologique d'une population de cellules dont les marqueurs spécifiques de surface ont une interaction avec leurs récepteurs d'une intensité allant de 1OpN à InN, avantageusement de 2OpN à 50OpN, préférentiellement de 30 à 30OpN, plus spécifiquement de 50 à 15OpN.
24. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la purification et la caractérisation des cellules tumorales circulantes à partir d'un échantillon de sang.
25. Utilisation selon la revendication 24 pour le diagnostic et le suivi de l'évolution d'une pathologie sélectionnée parmi le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du rein, le cancer de la vessie, le cancer du foie, le cancer du côlon, le cancer du poumon.
26. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la purification et la caractérisation de cellules fœtales à partir d'un échantillon sanguin de la mère.
27. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la détection de cellules tumorales circulantes dans la moelle osseuse.
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