RU2777648C1 - Флуоресцентная многоцелевая наноразмерная метка и конъюгаты на её основе - Google Patents
Флуоресцентная многоцелевая наноразмерная метка и конъюгаты на её основе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777648C1 RU2777648C1 RU2021125428A RU2021125428A RU2777648C1 RU 2777648 C1 RU2777648 C1 RU 2777648C1 RU 2021125428 A RU2021125428 A RU 2021125428A RU 2021125428 A RU2021125428 A RU 2021125428A RU 2777648 C1 RU2777648 C1 RU 2777648C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- quantum dot
- cdzns
- cdteses
- cds
- zns
- Prior art date
Links
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims abstract description 103
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 35
- 229910052984 zinc sulfide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 35
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 34
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229910052950 sphalerite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- KUDUQBURMYMBIJ-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol diacrylate Substances C=CC(=O)OCCOC(=O)C=C KUDUQBURMYMBIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 6
- SRZXCOWFGPICGA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-dithiol Chemical compound SCCCCCCS SRZXCOWFGPICGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229960000304 Folic Acid Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229910052980 cadmium sulfide Inorganic materials 0.000 claims description 51
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 claims description 14
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 claims description 7
- -1 CdZnS Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 abstract description 10
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 5
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000005693 optoelectronics Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 abstract 1
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 28
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 26
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M Tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 14
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 13
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 13
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 12
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 12
- CCCMONHAUSKTEQ-UHFFFAOYSA-N Octadecene Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC=C CCCMONHAUSKTEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 11
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 8
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 4,4'-Azobis(4-cyanopentanoic acid) Chemical compound OC(=O)CCC(C)(C#N)N=NC(C)(CCC(O)=O)C#N VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 7
- 239000008079 hexane Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 7
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 6
- CXKCTMHTOKXKQT-UHFFFAOYSA-N cadmium oxide Inorganic materials [Cd]=O CXKCTMHTOKXKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 6
- KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N octane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCS KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 5
- RMZAYIKUYWXQPB-UHFFFAOYSA-N trioctylphosphane Chemical compound CCCCCCCCP(CCCCCCCC)CCCCCCCC RMZAYIKUYWXQPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N Oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Substances CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- FTMKAMVLFVRZQX-UHFFFAOYSA-N Octadecylphosphonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCP(O)(O)=O FTMKAMVLFVRZQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMBHCYHQLYEYDV-UHFFFAOYSA-N Trioctylphosphine oxide Chemical compound CCCCCCCCP(=O)(CCCCCCCC)CCCCCCCC ZMBHCYHQLYEYDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000004054 semiconductor nanocrystal Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N (Z)-octadec-9-en-1-amine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCN QGLWBTPVKHMVHM-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100019002 ABL1 Human genes 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 102100016493 CD33 Human genes 0.000 description 2
- 101700017647 CD33 Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 102100016662 ERBB2 Human genes 0.000 description 2
- 101700025368 ERBB2 Proteins 0.000 description 2
- 101710004393 HAVCR2 Proteins 0.000 description 2
- 102100016384 HAVCR2 Human genes 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N Maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 101710037934 QRSL1 Proteins 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 102100002199 TNFSF11 Human genes 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 2
- 239000003418 antiprogestin Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 2
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- ZTSAVNXIUHXYOY-CVBJKYQLSA-L cadmium(2+);(Z)-octadec-9-enoate Chemical compound [Cd+2].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O ZTSAVNXIUHXYOY-CVBJKYQLSA-L 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 2
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 230000003623 progesteronic Effects 0.000 description 2
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 2
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- RKQOSDAEEGPRER-UHFFFAOYSA-L zinc;N,N-diethylcarbamodithioate Chemical compound [Zn+2].CCN(CC)C([S-])=S.CCN(CC)C([S-])=S RKQOSDAEEGPRER-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060006693 ABL Proteins 0.000 description 1
- 102100020540 CCN2 Human genes 0.000 description 1
- 101700026049 CCN2 Proteins 0.000 description 1
- 102100005826 CD19 Human genes 0.000 description 1
- 101700087100 CD19 Proteins 0.000 description 1
- 102100003279 CD38 Human genes 0.000 description 1
- 101700044948 CD38 Proteins 0.000 description 1
- 102100013078 CD47 Human genes 0.000 description 1
- 101700033237 CD47 Proteins 0.000 description 1
- 102100019449 CD79B Human genes 0.000 description 1
- 101700045471 CD79B Proteins 0.000 description 1
- 102000033243 CDKN2A Human genes 0.000 description 1
- 101710043956 CEACAM5 Proteins 0.000 description 1
- 102100011842 CEACAM5 Human genes 0.000 description 1
- 102100006400 CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102100005310 CTLA4 Human genes 0.000 description 1
- 101700054183 CTLA4 Proteins 0.000 description 1
- RPPBZEBXAAZZJH-UHFFFAOYSA-N Cadmium telluride Chemical compound [Te]=[Cd] RPPBZEBXAAZZJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004613 CdTe Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 229940039227 DIAGNOSTIC AGENTS Drugs 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N Diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100010782 EGFR Human genes 0.000 description 1
- 101700039191 EGFR Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 108060003023 F Proteins 0.000 description 1
- 102100011898 FOLR1 Human genes 0.000 description 1
- 101700050183 FOLR1 Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101700075868 HER1 Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 1
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 1
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710030888 KDR Proteins 0.000 description 1
- 102100013180 KDR Human genes 0.000 description 1
- 102100017339 KLRC1 Human genes 0.000 description 1
- 101710036388 KLRC1 Proteins 0.000 description 1
- 108060004270 LAG3 Proteins 0.000 description 1
- 102100017213 LAG3 Human genes 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102100000165 MS4A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710010909 MS4A1 Proteins 0.000 description 1
- 102100006044 MUC16 Human genes 0.000 description 1
- 101700008449 MUC16 Proteins 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinylpyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-hydroxy-Succinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700001465 NBR1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 229940074730 OPHTHAMOLOGIC DIAGNOSTIC AGENTS Drugs 0.000 description 1
- 229940049964 Oleate Drugs 0.000 description 1
- 102100005352 PCSK9 Human genes 0.000 description 1
- 101700000651 PCSK9 Proteins 0.000 description 1
- 108091007929 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 101700067249 POP2 Proteins 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 102100018484 TACSTD2 Human genes 0.000 description 1
- 101710024898 TACSTD2 Proteins 0.000 description 1
- 102100006047 TIGIT Human genes 0.000 description 1
- 101700052319 TIGIT Proteins 0.000 description 1
- 102100009534 TNF Human genes 0.000 description 1
- 101710040537 TNF Proteins 0.000 description 1
- 101710022358 TNFSF11 Proteins 0.000 description 1
- 102100019730 TP53 Human genes 0.000 description 1
- 241001455273 Tetrapoda Species 0.000 description 1
- ZJCCRDAZUWHFQH-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane Chemical compound CCC(CO)(CO)CO ZJCCRDAZUWHFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 229910052798 chalcogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004770 chalcogenides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001787 chalcogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000017256 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040009258 epidermal growth factor-activated receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- BHBPJIPGXGQMTE-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;2-methylprop-2-enoic acid Chemical compound OCCO.CC(=C)C(O)=O.CC(=C)C(O)=O BHBPJIPGXGQMTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-M oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-M 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011941 photocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N stearylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- MYXKPFMQWULLOH-UHFFFAOYSA-M tetramethylazanium;hydroxide;pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[OH-].C[N+](C)(C)C MYXKPFMQWULLOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000005429 turbidity Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к нанотехнологии, оптоэлектронике и медицинской диагностике и может быть использовано при специфической флуоресцентной молекулярно-нацеленной визуализации маркеров, диагностике заболеваний, а также при изготовлении средств для обнаружения утечек. Квантовая точка имеет кристаллическую структуру вюрцита и размер 6-8 нм. Ядро квантовой точки имеет кристаллическую структуру вюрцита, размер 2-4 нм и состав CdTeSeS; а оболочка - CdS, CdZnS, CdS/ZnS, CdS/CdZnS или CdZnS/ZnS. Количество монослоёв оболочки от 5 до 8. Квантовая точка характеризуется молярным содержанием Cd, Se и S, %: 21-29, 14-20, 52-64, соответственно, квантовым выходом 50-70% и высокой интенсивностью флуоресценции в диапазоне 630-720 нм. Флуоресцентный конъюгат для визуализации молекулярных маркеров состоит из указанной квантовой точки, покрытой полимерной оболочкой, и лиганда, обеспечивающего специфичность связывания. Полимерная оболочка выполнена из сополимера метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, терминированного 1,6-гександитиолом; сополимера метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата с тиолизированным олигомером; сополимера поливинилпирролидона и акриловой кислоты. Лиганд выбран из фолиевой кислоты, антитела или его фрагмента и конъюгирован с полимерной оболочкой через линкер, представляющий собой полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль акрилат или стрептавидин. Молекулярный маркер представляет собой вещество белковой или нуклеиновой природы, являющееся продуктом жизнедеятельности живых клеток и входящее в их состав. Указанные конъюгаты также характеризуются высокой интенсивностью флуоресценции. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 32 ил., 1 табл.
Description
Область техники
Данное изобретение относится к области нанотехнологии, в частности, к созданию новых квантовых точек, визуализирующих агентов на их основе. Описываемые методы и частицы могут применяться, в частности, для специфической флуоресцентной молекулярно-нацеленной визуализации маркеров и диагностики различных заболеваний, в качестве средства для обнаружения утечек и т.д.
Уровень техники
Флуоресцентные наночастицы имеют широкое применение, например, в изготовлении различных средств для диагностики заболеваний, визуализации молекулярных маркеров, изготовлении флуоресцентных чернил и пигментов, средств для обнаружения утечек, например, хладагента в холодильных установках и системах кондиционирования воздуха, обнаружения движения жидкостей, например, выявление загрязнения нефтепластов, оптоэлектронике и т.д.
В качестве флуоресцентных меток, используемых для визуализации, особое место занимают функционализированные модифицированные коллоидные нанокристаллы (квантовые точки). Используя флуоресцентные нанокристаллы, можно подобрать флуоресцентные характеристики (варьируя материал, размер и конструкцию нанокристаллов) и осуществлять методы диагностики различных патологий. Флуоресцентные нанокристаллы имеют ряд преимуществ по сравнению с органическими красителями. Флуоресцентные нанокристаллы имеют высокий квантовый выход и большую фотостабильность и более высокий коэффициент молярного поглощения, а также большую величину стоксовского сдвига, чем у органических красителей, что проявляется в виде более высокой яркости и увеличения интенсивности аналитического сигнала. Все это упрощает диагностический процесс, повышает порог обнаружения и повышает надежность исследования. Различные способы синтеза флуоресцентных нанокристаллов (квантовых точек) были описаны, например, в патентах РФ №2497746, 2381304 и 2540385.
Описанные на сегодняшний день флуоресцентные нанокристаллы и их конъюгаты имеют ряд ограничений, не позволяющих применять их в медицине в качестве диагностических агентов. Основной проблемой, ограничивающей их применение, является большой размер, способность проникать в клетку и ядра и специфично связываться с целевыми рецепторами (Jennifer Е. Francis et all/ Evaluation of quantum dot conjugated antibodies for immunofluorescent labelling of cellular targets/ Beilstein J. Nanotechnol. 2017, 8, 1238-1249. https://doi.org/10.3782/binano.8.125), при этом известные разработки с малыми квантовыми точками не имеют подтвержденной фотостабильности и эффективности. Из уровня техники также известен флуоресцентый конъюгат, описанный в работе Здобновой Т.А., Комплексы полупроводниковых нанокристаллов и рекомбинантных антител для флуоресцентной визуализации опухолевых клеток (Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 2011, с. с.4-10).
Таким образом, сохраняется потребность создания флуоресцентных нанокристаллов, обладающих малым размером, высоким квантовым выходом флуоресценции, коллоидной стабильностью и возможностью применения в лабораторно-клинической практике без использования специального оборудования (с максимумом эмиссии в диапазоне 630-720 нм).
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка и создания новых квантовых точек, характеризующихся малым размером, высокой интенсивностью флуоресценции в диапазоне 630-720 нм (оптический диапазон с минимальным уровнем автофлуоресценции тканей и клеток), высокой фотостабильностью, а также конъюгатов для флуоресцентного маркирования на их основе.
Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке и получении новых квантовых точек с кристаллической структурой вюрцита, характеризующихся малым размером 6-8 нм (фигуры 1-9) при сохранении их высокой фотостабильности (более 3 часов) (таблица 1), высокой интенсивностью флуоресценции в диапазоне 630-720 нм, высоким уровнем флуоресцентного сигнала (квантовым выходом до 70%), шириной на полувысоте (FWHM) менее 65 нм. Помимо этого, технический результат настоящего изобретения заключается в разработке конъюгатов для флуоресцентного маркирования на основе квантовых точек по изобретению, которые в свою очередь характеризуются высокой интенсивностью флуоресценции и специфичностью связывания с целевыми мишенями (маркерами).
Технический результат настоящего изобретения также заключается в разработке нового способа получения квантовых точек по изобретению, который позволяет получить квантовые точки малого размера с вюрцитной структурой (фигуры 1-9); способ по изобретению позволяет эффективно наращивать полупровдниковые оболочки на ядро квантовых точек.
Указанный технический результат достигается за счет разработки и получения квантовой точки, имеющей кристаллическую структуру вюрцита и характеризующуюся размером 6-8 нм, структура которой выражается общей формулой А/Б, где:
- А - ядро квантовой точки, представляющее собой полупроводниковый материал состава CdTeSeS;
- Б - оболочка квантовой точки, покрывающая ядро и представляющая собой полупроводниковый материал состава CdS, CdZnS, CdS/ZnS, CdS/CdZnS или CdZnS/ZnS;
причем ядро квантовой точки имеет кристаллическую структуру вюрцита, размером в диапазоне 2-4 нм и с максимумом в распределении по размеру 2,5 нм, количество монослоев оболочки, покрывающей ядро, составляет от 5 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения квантовая точка имеет структуру CdTeSeS/CdS, CdTeSeS/CdZnS, CdTeSeS/CdS/CdZnS, CdTeSeS/CdZnS/ZnS или CdTeSeS/CdS/ZnS.
В частных вариантах воплощения изобретения молярное содержание Cd в квантовой точке составляет от 21 до 29%.
В частных вариантах воплощения изобретения молярное содержание Se в квантовой точке составляет от 14 до 20%.
В частных вариантах воплощения изобретения молярное содержание S в квантовой точке составляет от 52 до 64%.
В частных вариантах воплощения изобретения квантовые точки по изобретению характеризуются квантовым выходом от 50 до 70%.
Технический результат также достигается за счет разработки и получения флуоресцентного конъюгата для визуализации молекулярных маркеров, состоящего из фотостабильной флуоресцентной квантовой точки по изобретению, покрытой полимерной оболочкой и лиганда, обеспечивающего специфичность связывания.
В частных вариантах воплощения изобретения полимерная оболочка представляет собой сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, терминированный 1,6-гександитиолом; сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, с тиолизированным олигомером; сополимер поливинилпирролидона и акриловой кислоты, размером частиц около 1-2 нм по данным динамического рассеяния света (DLS) (фигура 18) и обеспечивающих незначительное увеличение размеров наночастиц (фигуры 16,17,19,20).
В частных вариантах воплощения изобретения лиганд конъюгирован с полимерной оболочкой через линкер.
В частных вариантах воплощения изобретения линкер представляет собой полипропиленгликоль, полиэтилен гликоль акрилат, стрептавидин или стрептавидин с His-tag.
В частных вариантах воплощения изобретения лиганды включают, но не ограничиваются ими, малые молекулы, пептиды, антитела, фрагменты антител, нанотела, нуклеиновые кислоты, причем указанные лиганды обладают специфичностью к молекулярным маркерам (мишеням), включая, но не ограничиваясь ими, фолаты, RGD-пептиды, антитела, фрагменты антител, нанотела анти-HERI, анти-HER2, анти-ЕрСАМ, анти-EGFR, анти-VEGF, анти-р16, анти-Ki-67, ЕР, анти-PR, анти-CD3, анти-CD19, анти- CD20, анти-CD33, анти-CD33, анти-CD38, анти-CD47, анти-CD-52, анти-CD79 В, анти-PD-1, анти-CD269, анти-CD274, анти-CD319, анти-CTLA-4, анти-c-Met, анти-Anti-Nectin-4, анти-TF, анти-TROP2, анти-FRα, анти-NGF, анти-CTGF, анти-TNFSF11, анти-RANKL, анти-Trop-2, анти-TIGIT, анти-IL-1, анти-IL6, анти-IL-23, анти-СЕАСАМ5, анти-VEGFR2, анти-TGF-βRII, анти-CD3, анти-TIM-3, анти-CLDN18.2, анти-СА125, анти-NKG2A, анти-LAG-3, анти-PDGF-R α, анти-IFN-gamma, анти-TIM-3, анти-PCSK9, анти-TNF, анти-GM-CSF, нуклеиновые кислоты (ДНК-зонды), комплементарные фрагментам различных онкогенов, например, онкогена HER2, ABL, c-Met и другие, для определения делеций, например, р-плеча хромосомы 12, ТР53 гена, анализа транслокации t(2;5)(p23;q35), трисомий и другие.
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярные маркеры включают, но не ограничиваются ими, белковые структуры, входящие в состав клеток, например биомолекулы, участвующие в онкогенезе, в клеточном цикле, являющиеся сигнальными и характеризующие развитие различных заболеваний, интегрины, HER1, HER2, ЕрСАМ, EGFR, VEGF, р16, Ki-67, ЕР, PR, CD3, CD19, CD20, CD33, CD33, CD38, CD47, CD-52, CD79B, PD-1, CD269, CD274, CD319, CTLA-4, c-Met, Anti-Nectin-4, TF, TROP2, FRα, NGF, CTGF, TNFSF11, RANKL, Trop-2, TIGIT, IL-1, IL6, IL-23, CEACAM5, VEGFR2, TGF-βRII, CD3, TIM-3, CLDN18.2, CA125, NKG2A, LAG-3, PDGF-R α, IFN-gamma, TIM-3, PCSK9, TNF, GM-CSF, протоонкоген ABL и другие.
В частных вариантах воплощения изобретение может быть использовано в микроскопии (фигура 24) и цитофлуорометрии (фигура 23).
Технический результат также достигается посредством осуществления способа получения квантовой точки по изобретению, который включает следующие стадии:
а) синтез ядра квантовый точки, включающий:
- осуществление подготовки растворов прекурсоров Se, Те и S;
- смешивание при интенсивном перемешивании в атмосфере инертного газа CdO, октадецилфосфоновой кислоты и триоктилфосфин оксида при температуре 345-360°С до полного растворения CdO;
- добавление триоктилфосфина в реакционную смесь после растворения CdO;
- добавление в реакционную смесь растворов прекурсоров Se, Те и S;
- охлаждение реакционной смеси;
- очистка ядер путем двухкратного переосаждения метанолом из смеси толуол-бутанол 1:1;
б) наращивание оболочки на ядро квантовой точки.
В частных вариантах воплощения изобретения стадия смешивания при интенсивном перемешивании в атмосфере инертного газа CdO, октадецилфосфоновой кислоты и триоктилфосфин оксида осуществляется при температуре 350-355°С.
В частных вариантах воплощения изобретения инертный газ представляет собой аргон.
В частных вариантах воплощения изобретения оболочка представляет собой CdZnS, CdS/ZnS, CdS/CdZnS или CdZnS/ZnS.
В частных вариантах воплощения изобретения квантовая точка имеет структуру CdTeSeS/CdS, CdTeSeS/CdZnS, CdTeSeS/CdS/CdZnS, CdTeSeS/CdZnS/ZnS, или CdTeSeS/CdS/ZnS.
В частных вариантах воплощения изобретения для синтеза ядра используется Те с содержанием от 0,1 до 15% от общего содержания прекурсоров.
В частных вариантах воплощения изобретения для синтеза ядра используется Те с содержанием от 1,5 до 5% от общего содержания прекурсоров.
Несмотря на большой потенциал, заключенный в функциональных характеристиках квантовых точек, работающих в диапазоне, красного и пограничном к ближнему инфракрасному излучению, на сегодняшний день нерешенными остаются проблемы, связанные с их низкой фото- и коллоидной стабильностью, низким уровнем защиты квантовых точек полимерными оболочками, стабильностью самих квантовых точек, и возможности таргетирования внутриклеточных структур, обуславливающие обесцвечивание, токсичность и невозможность определения ряда молекулярных маркеров (мишеней), что существенно ограничивает диапазон их потенциальных применений. Задача, решаемая в настоящем изобретении, позволяет расширить доступный арсенал средств в данной области техники. Создаваемые квантовые точки и конъюгаты на их основе универсальны и могут применяться в составе различных средств для диагностики заболеваний, визуализации молекулярных маркеров, изготовлении флуоресцентных чернил и пигментов, средств для обнаружения утечек, например, хладагента в холодильных установках и системах кондиционирования воздуха, обнаружения движения жидкостей, например, выявление загрязнения нефтепластов, оптоэлектронике, изготовлении светодиодов, дисплеев, фотоприемников, изготовлении фотокатализаторов, нанометок для товаров и т.д.
Краткое описание чертежей Фигура 1. - ПЭМ ядер квантовых точек CdTeSeS. Фигура 2. - Распределение размера ядер CdTeSeS. Фигура 3. - ПЭМ ядер квантовых точек CdTeSeS.
Фигура 4. - ПЭМ ядер квантовых точек CdTeSeS и визуализация межатомных расстояний. Согласно анализу изображений ПЭМ BP, полученные значения d соответствуют таковым для фазы P63mc, таким образом, образцы ядер содержат наночастицы вюрцита. Элементы 1-4, которые выделены на фигуре 3.
Фигура 5. Квантовые точки CdTeSeS/CdZnS.
Фигура 6. Квантовые точки CdTeSeS/CdS/ZnS.
Фигура 7. Распределение размера квантовых точек CdTeSeS/CdZnS.
Фигура 8. ПЭМ квантовых точек CdTeSeS/CdZnS.
Фигура 9. ПЭМ квантовых точек CdTeSeS/CdZnS и визуализация межатомных расстояний. Согласно анализу изображений ПЭМ BP, полученные значения d (interatomic distance) соответствуют таковым для фазы P63mc, таким образом, можно сделать вывод, что все образцы содержат наночастицы вюрцита. Элементы 1-4, которые выделены на фигуре 8.
Фигура 10. Спектр оптического поглощения полимера PEGPT 1%.
Фигура 11. Спектр оптического поглощения полимера PEGPTT 1%.
Фигура 12. Спектр оптического поглощения квантовых точек (CdTeSeS/CdS/ZnS, 8 монослоев) в полимере PEGPT.
Фигура 13. Спектр оптического поглощения квантовых точек (CdTeSeS/CdS/ZnS, 8 монослоев) в полимере PEGPTT
Фигура 14. Спектр флуоресценции квантовых точек (CdTeSeS/CdS/ZnS) в полимере PEGPT.
Фигура 15. Спектры флуоресценции образцов квантовых точек в полимере PEGPT с различным количеством монослоев.
Фигура 16. Гидродинамический диаметр квантовых точек CdTeSeS/CdS/ZnS в полимере PEGPT.
Фигура 17. Гидродинамический диаметр квантовых точек CdTeSeS/CdZnS в полимере PEGPT.
Фигура 18. Гидродинамический диаметр полимера PEGPT.
Фигура 19. Распределение размера квантовых точек по изобретению со структурой CdTeSeS/CdS/CdZnS в полимере PEGPTT, полученных с использованием МРА - со средним размером инкапсулированных квантовых точек 8 нм.
Фигура 20. Распределение размера квантовых точек по изобретению со структурой CdTeSeS/CdS/CdZnS, со средним размером 6.7 нм.
Фигура 21. Распределение размера ядер квантовых точек по изобретению со структурой CdTeSeS, средним размером 2-4 нм.
Фигура 22. Смешанная карта EDX S/Se/Cd и соответствующий профиль линии, взятый вдоль двух квантовых точек.
Фигура 23. Исследование цитометрии квантовых точек CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT, конъюгированных с антителами против антигена CD3 человека.
Фигура 24. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток линии НТ29 КТ CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT, конъюгированных с антителами против антигена c-Met человека.
Фигура 25. Распределение размера квантовых точек CdTeSeS/CdS/CdZnS. Фигура 26. Спектр оптического поглощения квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT.
Фигура 27. Спектр флуоресценции квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT.
Фигура 28. Спектр оптического поглощения квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT, конъюгирован со стрептавидином (SA).
Фигура 29. Спектр флуоресценции квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT, конъюгирован со стрептавидином (SA).
Фигура 30. Спектр оптического поглощения квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT), конъюгирован со стрептавидином (SA), связанным с антителом против прогестеронового рецептора.
Фигура 31. Спектр флуоресценции квантовых точек (CdTeSeS/CdS/CdZnS) в полимере PEGPTT), конъюгирован со стрептавидином (SA), связанным с антителом против прогестеронового рецептора.
Фигура 32. Распределение размера квантовых точек CdTeSeS/CdS/CdZnS в полимере PEGPTT, полученных без использования МРА-со средним размером 16 нм.
Термины и определения
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Термин «квантовая точка» (КТ) в соответствии с использованием в настоящем документе обозначает полупроводниковые нанокристаллы, которые содержат ядро и оболочку, имеют распределение по размерам 6-8 нм.
Термин «монослой» представляет собой единый, плотно упакованный слой атомов.
Термин «лиганд» - любое химическое соединение, которое способно специфически взаимодействовать с другим химическим соединением, в т.ч. с молекулярным маркером, образуя стабильный комплекс.
Термин «молекулярный маркер» - любое химическое соединение, представляющее ценность для получения информации об объекте исследования.
Термин «линкер» - химическое вещество, обеспечивающее химическую связь между КТ и лигандом и не оказывающее неблагоприятного воздействия на свойства и стабильность лиганда.
Подробное раскрытие изобретения
Квантовые точки (КТ) по изобретению без полимерного покрытия, где А-ядро/Б-полупроводниковая оболочка характеризуются, в частности, следующей структурой: CdTeSeS/CdS, CdTeSeS/CdZnS, CdTeSeS/CdS/CdZnS, CdTeSeS/CdZnS/ZnS или CdTeSeS/CdS/ZnS.
Квантовые точки по изобретению могут быть инкапсулированы в полимерное покрытие для их гидрофилизации и последующей конъюгации, в частности, полимером для гидрофилизации является:
PEGPT - сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, терминированный 1,6-гександитиолом;
PEGPTT - сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, с тиолизированным олигомером;
PTVP - сополимер поливинилпирролидона и акриловой кислоты.
На поверхность полимерной оболочки могут быть иммобилизованы лиганды, позволяющие эффективно связываться с биологическими распознаваемыми молекулами. Полимерные оболочки позволяют экранировать КТ от внешних воздействий, для целей их последующего применения в составе современных высокочувствительных биомедицинских диагностических тест-систем.
Инкапсуляция в полимерные оболочки квантовых точек преследует следующие цели: придание гидрофильных свойств и обеспечение растворимости квантовых точек и флуоресцентных конъюгатов в заданном растворителе; предотвращение агрегации и осаждения квантовых точек и флуоресцентных конъюгатов; введение необходимых функциональных групп для последующей конъюгации биокомпонентов. Общая стратегия придания флуоресцентным нанокристаллам диспергируемости в воде включает замену исходных гидрофобных лигандов лигандами, имеющими, с одной стороны, химические группы, способные связываться с поверхностью нанокристалла, с другой - полярные группы (например, гидроксильные), направленные в водную фазу. Другой подход основан на сохранении оригинальных лигандов и создании оболочки из амфифильных молекул или полимеров, имеющих гидрофобные группы для связи с оригинальными лигандами, и гидрофильные группы, обеспечивающие растворимость в воде.
Полученные образцы характеризовали спектрофотометрически (фигуры 10-13, 26, 28, 30).
Для получения КТ по настоящему изобретению используется следующая общая схема (технологическая цепочка):
1. Синтез ядер КТ.
2. Наращивание полупроводниковых оболочек.
3. Выделение и очистка КТ, их характеризация.
Для получения флуоресцентных конъюгатов на основе КТ по настоящему изобретению используется следующая общая схема (технологическая цепочка):
1. Синтез ядер квантовых точек.
2. Наращивание полупроводниковых оболочек.
3. Выделение и очистка квантовых точек, их харастеризация.
4. Синтез водорастворимого полимера для создания полимерной гидрофильной оболочки, имеющей функциональные группы для конъюгации с лигандами за счет ковалентного взаимодействия.
5. Инкапсуляция квантовых точек в полимерную оболочку. Выделение и очистка флуоресцентных нанокристаллов в оболочке, их характеризация.
6. Конъюгация квантовых точек в полимерной оболочке с лигандами, обладающими специфичностью связывания с целевыми биомолекулами.
Способ синтеза квантовых точек по изобретению характеризуется тем, что осуществляется совместное введения серы с другими прекурсорами при синтезе ядра CdTeSeS, и предназначен для получения ультрамалых ядер квантовых точек CdTeSeS, с количеством вводимого Те от 0,1 до 15% (в предпочтительных вариантах воплощения изобретения от 0,15 до 5%) от общего количества халькогенов, с максимумом в распределении размера ядра 2,5 нм, а собственно готовых квантовых точек с полупровдниковыми оболочками размером 6-8 нм и структурой, в частности, CdTeSeS/CdS, CdTeSeS/CdZnS, CdTeSeS/CdS/CdZnS, CdTeSeS/CdZnS/ZnS или CdTeSeS/CdS/ZnS.
Ключевым достижением данного изобретения является возможность формирования ядра квантовых точек размером в диапазоне 2-4 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) (фигура 1,2) и с максимумом в распределении размера 2,5 нм по данным динамического рассеяния света (DLS) при температуре 345-360°С.
При этом, формируется вюрцитовая структура кристалла, которая подтверждена данными ТЕМ (см. фигуры 4,9). Кроме того, это также подтверждается тем фактом, что осуществляется равномерное и эффективное наращивание полупроводниковых оболочек на данные ядра и высокой фотостабильностью квантовых точек.
С целью снижения размеров наночастиц при сопоставимой длине волны эмиссии были синтезированы ядра CdTeSeS, включающие Те. Используя, в частности, 0,17 и 5% Те и снизив температуру ввода прекурсора, в частности, до 350°С, удалось получить ядра с эмиссией от 540 нм. Наращивание дополнительных полупроводниковых оболочек позволяло смещать спектр в требуемый диапазон (630-720 нм).
В стандартных, описанных в уровне техники технологиях синтеза КТ с ядрами CdTe и CdTeSe подобного размера, в которых используют температуру синтеза ниже 340°С, синтез осуществляют в водной среде (например, CN104974742A), в результате это приводит к формированию кристаллической структуры сфалерита, либо тетраподов. Последние варианты структур отличаются низкой способностью к наращиванию дополнительных полупроводниковых оболочек, поскольку рост идет неравномерно и происходит агрегация частиц. При наслаивании оболочек возникают дефекты в кристаллической структуре, которые негативно влияют на свойства наносистемы, в т.ч. на фотостабильность.
Ядра КТ по изобретению, полученные способом синтеза по изобретению, характеризуются тем, что наращивание оболочек на них осуществляется эффективно, в частности оболочки CdS, что приводит к получению КТ с максимумом эмиссии 630-720 нм, при размере 6-8 нм характеризуются высокой фотостабильностью.
В частных вариантах воплощения изобретения инкапсуляция КТ в полимер осуществляется с полимером с тиолизированным олигомером (фигура 19, 32). В предпочтительном варианте тиолизированный олигомер представляет собой политиол, в частном варианте тритиол.
Инкапсуляция КТ по изобретению в полимер с тиолизированным олигомером через замещение, в частности, с использованием 3-меркаптопропионовой кислоты дает конечный размер частиц в диапазоне 8-18 нм (см. пп 2.3.4). Инкапсуляция КТ по изобретению в полимер с тиолизированным олигомеров дает конечный размер частиц в диапазоне 10-33 нм. Такая флуоресцентная наноразмерная метка может применяться в качестве контрастирующего агента для визуализация (КТ в сополимерной оболочке, где присутствуют мономер полиэтиленгликоля и/или другие компоненты, обеспечивающие ее стабильность), может быть конъюгирована через линкер, предпочтительно -полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль акрилат с малой молекулой, пептидом, нанотелом, фрагментами антител, антителами, нуклеиновыми кислотами.
В ходе проведенных работ были синтезированы КТ с количеством монослоев от 1 до 8. Для наращивания оболочек использовали процедуры, описанные в методиках молекулярного наслаивания [4].
В результате проведенных исследований было установлено, что в отсутствии полупроводниковых оболочек наступает агрегация частиц, что, скорее всего, связано с низким сродством поверхности ядра к полимеру. Кроме того, квантовый выход (KB) при этом не превышает 5%, что является следствием недостаточной пассивации ядра КТ.
Аналогичная ситуация наблюдается, когда монослоев 3 и менее монослоев. Оптимальная полупроводниковая оболочка, дающая KB 60%, составляет от 5 до 8 монослоев.
Примеры осуществления изобретения
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Ниже приведен пример синтеза наноразмерной метки и конъюгатов на ее основе. 1. Синтез КТ.
1.1 Синтез ядер CdTeSeS.
Способ синтеза реализуется следующим образом. В каждой колбе растворяют селен и теллур в триоктилфосфине, серу в смеси октантиола с октадецен-1. Процесс растворения проводят в герметично закрытой колбе, сопровождают дегазацией и последующей продувкой инертным газом и облучением ультразвуком при температуре 60°С. После этого растворенные вещества облучают ультразвуком до исчезновения мутности.
В частных вариантах воплощения изобретения процентное содержание вводимого Те по отношению к другим прекурсорам составляет от 0,1 до 15%. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения процентное содержание вводимого Те составляет от 0,15 до 5%. В колбу добавляют 0,6 г CdO, 4 г октадецилфосфоновой кислоты и 30 г триоктилфосфин оксида и герметично закрывают и при интенсивном перемешивании смесь дегазируют и продувают инертным газом. После полного растворения кадмия добавляют 10 мл триоктилфосфина. Температура синтеза может быть в диапазоне 350-355°С. Далее в реакционную смесь вводят 5 мл (общая концентрация халькогенидов 1М) растворенного селена, серы и теллура с молярным содержанием добавки прекурсора теллура в расчете на содержание Те в ядре от 0,15 до 5%. Реакцию ведут в течение 3 мин, после смесь охлаждают до комнатной температуры и проводят очистку путем двукратного переосаждения метанолом из смеси толуол-бутанол 1:1, конечный продукт растворяют в толуоле.
1.2 Наращивание оболочки CdS
В колбу добавляют 4,48 г CdO, 25 мл олеиновой кислоты, 75 мл октадецен-1 и 0,5 мл уксусной кислоты. Процесс растворения проводят в герметично закрытой колбе, сопровождают дегазацией и последующей продувкой инертным газом при температуре 150°С и интенсивном перемешивании до получения прозрачного раствора. Октантиол с октадецен-1 получали как описано выше. Объемы растворов рассчитывали на количество монослоев с учетом разбавления, необходимых для настройки длины волны флуоресценции. После этого производили очистку продукта по тому же протоколу
Продукт, полученный на предыдущем этапе, растворенный в гексане 100 нмоль выливают в смесь 3 мл октадецен-1 и 3 мл олеиламина. Колбу герметично закрывают и смесь вакуумируют при комнатной температуре 1 час и при 120°С 20 мин до полного удаления растворителей и газов. После раствор нагревают до 310°С со скоростью 18°С/мин в токе инертного газа и перемешивании. При достижении температуры 240°С рассчитанные количества олеата кадмия в 6 мл октадецен-1 и октантиола (1,2 эквивалента относительно олеата Cd в 6 мл октадецен-1) прибавляют по каплям со скоростью 3 мл/ч с помощью шприца. Затем быстро вливают 1 мл олеиновой кислоты и раствор нагревают далее до 310°С в течение 60 мин. Полученный продукт осаждают ацетоном, затем редиспергируют в гексане. Далее очищают дважды осаждением-редиспергированием и окончательно суспендируют в гексане или хлороформе.
Оболочки CdS наращивают послойно, поочередным введением олеата кадмия 0,1 М в октадецен-1 и серы 0,1 М в октадецен-1. Введение каждого прекурсора в реакционную смесь ведут в течение 3~5 мин. Время роста 10 мин после каждого введения. После раствор охлаждают до комнатной температуры и очищают аналогично.
1.3 Наращивание оболочки ZnS
В колбу помещают 5 мл октадецен-1, 2 мл триоктилфосфина, рассчитанное количество диэтилдитиокарбамата цинка и 0,35 М раствор Zn(OAc)2 в смеси с олеиламином и октадеценом-1 (1:2) (соотношение диэтилдитиокарбамата цинка: Zn(OAc)2=1:1 мол. экв.). Количества прекурсоров рассчитывают для настройки длины волны флуоресценции по методу молекулярного наслаивания (SILAR), исходя из количества исходных КТ [1], как описано выше. Сначала реакционную массу дегазируют при температуре 80-100°С. Затем продувают инертным газом при температуре 150°С в течение 30 мин и перемешивании. По окончанию синтеза реакционную смесь охлаждают и очищают аналогично описанному выше способу.
1.4 Наращивание оболочки CdZnS
В колбу вносят 10 г октадециламина, 30 мл октадецен-1 и рассчитанное количество КТ CdTeSeS/CdS в толуоле. Далее колбу герметично закрывали и смесь дегазировали при температуре 80-100°С при постоянном перемешивании. После вводили инертный газ и вели реакцию при 240°С проводя поочередное введение смеси кадмия 0,35 М и цинка 0,35 М (мольное соотношение 1:1) с интервалом 30 минут и 0,35 М раствора S с интервалом 60 минут. Количества прекурсоров рассчитывали по методу молекулярного наслаивания (SILAR). Смеси кадмия и цинка вводят не более, чем в течение 30 секунд, раствор серы вводят по каплям в течение 10 минут. После этого цикл наращивания повторяют. В конце синтеза смесь охлаждают и очищают аналогично описанному выше способом.
2 Инкапсуляция КТ
2.1 Вариант 1. Инкапсуляция в PTVP
2.1.1 Синтез полимера PTVP
Полимер PTVP был синтезирован по методике [3].
В 250 мл трехгорлую колбу помещают 15 мл N-винил-2-пирролидон (далее VP) (140 ммоль), 5 г (51 ммоль) малеинового ангидрида (далее MAN) в смеси 10 мл уксусной кислоты и 15 мл тетрагидрофурана. MAN растворяют при перемешивании и затем добавляют 0,66 г (2,4 ммоль) 4,4'-азобис(4-циановалериановой кислоты) (далее ABCVA). Смесь продувают инертным газом, в предпочтительном варианте аргоном, и кипятят 15 мин при перемешивании. Затем добавляют 2 мл (10,6 ммоль) этиленгликоль диметакрилат (далее EGDMA) и 0,3 г (1,2 ммоль) ABCVA, растворенных в 20 мл тетрагидрофурана. После 10 мин кипячения реакцию останавливают добавлением 1,6-гександитиола (далее НТ) (15 мл, 102 ммоль) в 20 мл тетрагидрофурана. После этого нагрев прекращают, и раствор охлаждают до комнатной температуры. Далее добавляют 3 объема диэтилового эфира для осаждения полимера. Далее полимер отделяют центрифугированием при 10000g и растворении в N,N-диметилформамиде (далее DMF). Цикл растворение/осаждение повторяют дважды, полученный продукт промывают диэтиловым эфиром.
2.1.2 Подготовка КТ к инкапсуляции в PTVP
Раствор КТ в толуоле центрифугируют с 4-кратным количеством безводного этанола (18000д, 15 мин), осадок ресуспендируют в хлороформе. Водный раствор 100 мМ 3-меркаптопропионовой кислоты (далее МРА) (800 мкл) с ТМАОН (рН 11,0), добавляют к раствору КТ в хлороформе (800 мкл) и энергично встряхивают 4 ч в темноте. Водную фазу, содержащую КТ, отделяют, и далее центрифугируют при 15000д 15 мин, супернатант диализируют 8 ч против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) в темноте в герметично закрытой колбе.
2.1.3 Инкапсуляция КТ в PTVP
К дисперсии 0,5 г КТ-МРА (МРА - 3-меркаптопропионовая кислота) в 7 мл воды при перемешивании добавляют 0,75 г PTVP-PPG-FA в 10 мл воды. Через 30 мин перемешивания смесь центрифугируют.Супернатант обрабатывают тетрагидрофураном до помутнения дисперсии. Осадок отделяют и диспергируют в 10 мл воды. Далее проводят очистку.
2.2 Вариант 2. Инкапсуляция в PEGPT 2.2.1 Синтез полимера PEGPT
В колбу помещают 40 г метилового эфира ПЭГ-акрилата 83 ммоль, 4,6 г (42 ммоль) малеинового ангидрида (далее MAN) в смеси 50 мл уксусной кислоты и 100 мл тетрагидрофурана. MAN растворяют при перемешивании и затем добавляют 1,2 г (4,2 ммоль) ABCVA. Смесь продувают инертным газом и кипятят 10 мин при перемешивании. Затем добавляют 3,5 мл (18,6 ммоль) EGDMA и 0,12 г (0,42 ммоль) ABCVA, растворенных в 20 мл тетрагидрофурана. После 10 мин кипячения реакцию останавливают добавлением НТ (15 мл, 102 ммоль) в 20 мл тетрагидрофурана. После этого смесь выдержают при температуре 75°С 1 час, и раствор охлаждают до комнатной температуры. Для осаждения полимера добавляют около 3-х объемов гексана. Полимер отделяют на делительной воронке. Дополнительно промывают 100 мл гексана и дважды 100 мл диэтилового эфира.
2.2.3 Инкапсуляция КТ в PEGPT
Полимер PEGPT 1 г растворяют в 4 мл тетрагидрофурана при перемешивании.
Вводят 0,6 мл 22% гидрофобных КТ CdTeSeS/CdS/CdZnS в хлороформе и перемешивают 20 мин, затем вводят по каплям 1 мл насыщенного раствора тетраметиламмоний гидроксид пентагидрата (далее ТМАОН) в 50% водном DMF и перемешивают 30 мин. Затем смесь разбавляют диэтиловым эфиром и осадок центрифугируют 5 мин 10000g. Далее его диспергируют в 5 мл тетрагидрофурана и процедуру осаждения повторяют. Полученный остаток сушат в вакууме для удаления остатков растворителей и диспергируют в 5 мл воды. Очистку полученного продукта от избытка лигандов и ТМАОН осуществляют ультрафильтрацией через мембрану 30000 MWCO двукратно. Остаток диспергируют в натрий-фосфатном буфере рН 8,0 до концентрации КТ 5 мкМ.
2.3 Вариант 3. Инкапсуляция в PEGPTT
2.3.1 Синтез тиолизированного олигомера ТТ - тритиол (политиол)
15 г 1,6-гександитиола (0,1 моль) растворяют в 20 мл тетрагидрофурана и после добавляли 0,05 г триоктилфосфина (0,135 ммоль) в качестве катализатора. При перемешивании вводят 8,36 г (0,02 моль) триметилолпропан этоксилат триметакрилата. Смесь разогревалась до 50°С и перемешивают еще 1 час.Затем растворители удаляют вакуумированием.
2.3.2 Синтез полимера PEGPTT
В колбу вносят 40 г метилового эфира ПЭГ-акрилата Мп 480 г/моль (83 ммоль), 4,6 г (42 ммоль) MAN в смеси 50 мл уксусной кислоты и 100 мл тетрагидрофурана. MAN растворяют при перемешивании и затем добавляют 1,2 г (4,2 ммоль) ABCVA. Смесь продувают инертным газом и кипятят 10 мин при перемешивании. Затем добавляют 3,5 мл (18,6 ммоль) EGDMA и 0,12 г (0,42 ммоль) ABCVA, растворенных в 20 мл тетрагидрофуране. После 10 мин кипячения реакцию останавливают добавлением ТТ (20 г) в 20 мл тетрагидрофурана. Затем смесь выдерживают 1 час при температуре 75°С, и после охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 3 объема гексана и продукт отделяют на делительной воронке. Дополнительно промывают 100 мл гексана и дважды 100 мл диэтилового эфира.
2.3.3 Инкапсуляци КТ в PEGPTT, вариант 1
Полимер PEGPTT 1 г растворяют в 4 мл тетрагидрофурана.и водят 0,5 мл 22% гидрофобных КТ CdTeSeS/CdS/CdZnS в хлороформе. Смесь перемешивают 20 мин, затем вводят по каплям 1 мл насыщенного раствора ТМАОН в 50% водном ДМФА. Перемешивают еще 30 мини после разбавляют диэтиловым эфиром до помутнения. Осадок центрифугируют 5 мин 10000g. Далее его диспергируют в 5 мл тетрагидрофурана и процедуру осаждения повторяют. Полученный остаток сушат в вакууме для удаления остатков растворителей и диспергируют в 5 мл воды. Очистку полученной дисперсии от избытка лигандов и ТМАОН осуществляют ультрафильтрацией двукратно. Остаток диспергируют в натрий-фосфатном буфере рН 9,0.
2.3.4 Инкапсуляция КТ в PEGPTT, вариант 2
2.3.4.1 Подготовка полимера PEGPTT к модификации КТ 10 г PEGPTT растворяют в 30 мл дистиллята. Доводят раствор до рН 8,5 постепенным добавлением ЗМ NaOH. После этого раствор оставляют на ночь при перемешивании. Затем фракцию менее 30 кДа получают путем ультрафильтрации. Массовую концентрацию низкомолекулярной фракции определяют путем упаривания аликвоты (0,05 мл) при 100°С в течение 2 ч.
2.3.4.2 Присоединение МРА к КТ
В дисперсию 0,5 г гидрофобных КТ в 40 мл хлороформа при перемешивании вводят 30 мл 30% раствора МРА в метаноле, нейтрализованного тетраметиламмоний гидроксидом до рН 6-7. Перемешивание ведут 1-2 часа до формирования крупного, легко оседающего осадка. Осадок отделяют центрифугированием 10000g, 2 мин. КТ диспергируют в 20 мл 5% раствора тетраметиламмоний гидроксида в метаноле. Дисперсию осаждают добавлением 2-4х объемов диэтилового эфира. Осадок отделяют центрифугированием 10000g, 2 мин и подсушивают от остатков диэтилового эфира. Полученный остаток диспергируют в 2% водном растворе тетраметиламмоний гидрооксида.
2.3.4.3 Синтез КТ- PEGPTT
Подготовленный к модификации полимер по пп. 2.3.4.1 разбавляют до концентрации 5%. 5 мл КТ-МРА в концентрации 1,5% медленно добавляют к 40 мл раствора PEGPTT при эффективном перемешивании. После добавления дисперсии, смесь перемешивают еще 2 ч при комнатной температуре, затем избыток полимера и низкомолекулярные примеси отделяют путем ультрафильтрации. Очистку ультрафильтрацией проводят дважды, остаток разбавляют дистиллятом до требуемой концентрации.
3. Получение конъюгатов
3.1. Вариант 1. Получение конъюгатов с малыми молекулами
3.1.1 Синтез конъюгата KT-PTVP-PPG-FA (где КТ CdTeSeS/CdS/CdZnS; PPG -полипропиленгликоль (линкер); FA фолиевая кислота (лиганд)).
К дисперсии 0,5 г КТ-МРА в 7 мл воды при перемешивании добавляют 0,75 г PTVP-PPG-FA в 10 мл воды. Через 30 мин перемешивания смесь центрифугируют, агрегированные частицы удаляют.Супернатант обрабатывают тетрагидрофураном до помутнения дисперсии. Осадок отделяют и диспергируют в 10 мл воды и проводят очистку.
3.1.2 Блокировка -СООН групп (синтез конъюгата KT-PTVP-PPG-FA-OH)
5 мл дисперсии КТ (~20 нмоль) активируют в присутствии 500eq N-гидроксисукцинимида (далее NHS) и 1000eq N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорида (далее EDC) в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 10000eq диэтаноламина. Выдерживают 1 час при перемешивании и после очищают.
Блокировка карбоксигрупп обеспечивает снижение неспецифического связывания частиц.
3.2 Вариант 2. Получение конъюгатов с антителами
Примером конъюгата по изобретению являются конъгат с квантовыми точками (CdTeSeS/CdS/CdZnS) по изобретению KT-PEGPTT и лигандом (биотинилированными антителами), который может быть конъюгирован через линкер, который представляет собой стрептавидин или His-tag стрептавидин.
Биотинилированные антитела разводят PBS рН 8,5 до концентрации 0,8 мкМ. Добавляют раствор бис-аминополиэтиленгликоля до концентрации 0,2%. Затем при перемешивании вводят дисперсию KT-PEGPTT-стрептавидин 0,2 мкМ. Смесь выдерживают один час при комнатной температуре. Избыток антител удаляют методом ультрафильтрации или гель-фильтрации. Сконцентрированную дисперсию разводят в подходящем буфере с рН не менее 8,5.
3.3 Вариант 3. Получение конъюгатов с антителами карбодиимидным способом
5 мл дисперсии KT-PEGPTT (~2 нмоль) активируют в присутствии 500 мол-экв NHS и 1000 мол-экв EDC в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мол-экв антител в натрий-фосфатном буфере рН 8,0. Выдерживают 1 час при перемешивании. Очистку полученной дисперсии от избытка низкомолекулярных продуктов осуществляют ультрафильтрацией. Остаток хроматографируют на колонке Sephadex G200 натрий-фосфатным буфером с рН 8,5. Флуоресцентную фракцию, содержащую КТ доочищают и концентрируют на мембране Advantec 20 до концентрации КТ 5 мкМ. Затем проводят центрифугирование для удаления агрегатов (5 мин 15000g).
Исследование элементного состава методом энергодисперсионного рентгеновского излучения (EDX) образцов коллоидных флуоресцентных нанокристаллов (КТ) по изобретению
1. Объект испытания: квантовые точки CdTeSeS /CdS/CdZnS
Образцы КТ наносили на сеточки с поддерживающим слоем Lacey/Formvar.
2. Ход испытания.
Проводили сканирование образцов в режиме EDX.
3. Параметры испытания:
Карты энергодисперсионного рентгеновского излучения (EDX) были получены на Titan Themis Z, работающего при 200 кВ.
4. Результаты испытания: Получены EDX-карты КТ (фигура 22), которые показывают особенности структуры ядро-оболочка КТ. Видно, что размер пятна, соответствующего Se немного меньше по размеру, чем размер пятна, соответствующего Cd, что согласуется со структурой CdTeSeS/CdS/CdZnS, т.к. Se входит в состав только ядра. Профиль линий, взятых вдоль оси, демонстрирует то, что синтез ядер проходит успешно с включением серы S в его состав. Также видны пики содержания серы вне ядра, что соответствует лиганду (октантиол) на поверхности ядра, CdS в структуре CdTeSeS/CdS/CdZnS и лиганду (октантиол) на поверхности оболочек. Дуплет Те полностью перекрывается сигналом от Cd, поэтому данный метод не подходит для обнаружения низкого содержания Те в КТ. Уровень сигнала от Zn составил значения близкие к шуму, что соответствует незначительному количеству Zn в КТ. Среднее атомное отношение, рассчитанное для КТ составило для S - 58±3%, Se - 17±3%, Cd 25±4%.
Заключение: EDX-карты КТ демонстрируют включение атомов в структуру КТ в соответствии с осуществляемым синтезом.
Исследование спектральных характеристик образцов конъюгатов коллоидных флуоресцентных нанокристаллов (КТ) по изобретению.
На первом этапе измерены спектральные характеристики полученного полимера. Изучены спектры оптического поглощения полимера PEGPT (Фиг. 10) и PEGPTT (Фиг. 11). На втором этапе определены спектры оптического поглощения инкапсулированных КТ по изобретению в PEGPT и PEGPTT (Фиг. 12 и 13 соответственно). На третьем этапе измерены спектры флуоресценции инкапсулированных КТ на длине волны возбуждения 450 нм (Фиг. 14).
Результаты исследований спектральных характеристик полученных образцов нанокристаллов и конъюгатов на их основе демонстрируют, что с помощью разработанной методики получаются наночастицы с оптимальными спектральными характеристиками для визуализации молекулярных маркеров, а именно возбуждение в синем спектре оптического диапазона (менее 450 нм) и эмиссия в красном диапазоне и пограничном к ближнему инфракрасному.
После проведены спектрофлуорометрические исследования. На первом этапе определили флуоресценцию KT-PEGPT (Фиг. 15). После изучены спектрофлуорометрические характеристики конъюгатов в зависимости от продолжительности облучения и проведено их сравнение с инкапсулированными КТ и определена их фотостабильность (Таблица 1). На последнем этапе изучены спектральные характеристики образцов КТ, которые имеют различное количество монослоев (Фиг. 15).
В результате проведенных исследований установлено, что уменьшение количества монослоев снижает квантовый выход КТ, таким образом, оптимальное количество монослоев составляет от 5 до 8.
Определены квантовые выходы образцов КТ с различным количеством монослоев.
1. Ядра CdTeSeS 0ML (0 монослоев оболочки).
В случае отсутствия оболочки происходит агрегация, KB<5%.
2. CdTeSeS/CdS/CdZnS: -1 ML KB<5%;
- 3ML KB<5%;
-5 ML KB=50-57%
- 6ML KB=54-62%;
- 8ML KB=68-72%.
В КТ с 8 ML после центрифугирования в течение 30 мин 10000g KB составляет в среднем 70%.
Результаты исследования фотостабильности КТ с полимерной оболочкой и их конъюгатов приведены в таблице 1.
В результате сравнительного анализа экспериментальных данных по методам синтеза конъюгатов и исследованию их оптических свойств может быть сделан вывод о том, что увеличение количества тиольных групп в составе полимера и более мягкие условия конъюгации обеспечивают получение фотостабильных конъюгатов.
Исследование цитометрии квантовых точек CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT, конъюгированных с антителами против антигена CD3 человека
1. Объект испытания: конъюгат антитела CD3 с квантовыми точками CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT.
Подготовка образцов: рабочее разведение конъюгата антитела с квантовыми точками получали путем разведения в 10, 50 и 100 раз в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Исходная концентрация препарата по квантовым точкам составляла 3,6 мкМ.
2. Ход испытания.
Проводили забор 5 мл венозной крови человека. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Фракцию мононуклеарных клеток крови выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/мл). К 1×106 выделенных лифмоцитов объеме 10 мкл добавляли 50 мкл разведенного конъюгата антитела CD3 с квантовыми точками, инкубировали 30 мин, отмывали центрифугированием и регистрировали флуоресценцию клеток.
Подготовка культуры клеток лейкоцитов крови человека с концентрацией 1×106.
3. Параметры испытания:
Флуоресценцию клеток регистрировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S Beckman-Couter.
Возбуждающий свет 488 нм.
Температура проведения опыта 25±2°С.
4. Результаты испытания: при окрашивании лимфоцитов с помощью конъюгата антитела CD3 с квантовыми точками получены следующие гистограммы флуоресценции представленные на фигуре 23.
1. В канале регистрации 690/50 нм процент флуоресцирующих клеток в опыте составлял 70%, что соответствовало доле окрашенных лимфоцитов в положительном контроле при окрашивании клеток конъюгатом CD3-FITC (70%).
2. В канале регистрации 690/50 нм интенсивность флуоресценции позитивных клеток составляла 6900 отн. ед., интенсивность флуоресценции негативных клеток составляла 550 отн. ед. в канале регистрации 525/40 нм флуоресценция отсутствовала.
3. Титр коньюгата антитела CD3 с квантовыми точками составлял не менее 1:100. Заключение: конъюгат антитела CD3 с квантовыми точками демонстрирует хорошую флуоресценцию при окрашивании лимфоцитов человека. Полученный конъюгат может использоваться для определения доли Т-лимфоцитов человека при многоцветном окрашивании. Квантовые точки потенциально могут использоваться для конъюгации с другими антителами и применяться для окрашивания клеток in vitro или in vivo.
Иммуноцитохимическое исследование фрагмента человеческого антитела acMet-Fab, конъюгированного с КТ CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT
Квантовые точки CdTeSeS/CdZnS-PEGPTT, конъюгированные с антителами против антигена c-Met человека тестировали в разведении 1:5 иммуноцитохимическим методом на клетках линии НТ29. Результаты представлены на фигуре 24 (увеличение 40х). Ярко окрашены мембраны клеток. Использование конъюгатов на основе заявленных КТ позволяет количественно и качественно оценить экспрессию целевого маркера.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
[1] - P. Reiss, М. Protie're, L. Li / Small 2009, 5, No. 2, 154-168.
[2] - D.Kalinowska, I.Grabowska-Jadach, M.Drozd, M.Pietrzak Comparative studies of biological activity of cadmium-based quantum dots with different surface modifications Applied Nanoscience, 2018, Volume 8, pp 309-321.
[3] - S.V. Dezhurov, D.V. Krylsky, A.V. Rybakova, S.A. Ibragimova, P.P. Gladyshev, A.A. Vasiliev, O.S. Morenkov. One-pot synthesis of polythiol ligand for highly bright and stable hydrophilic quantum dots toward bioconjugate formation Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology 2017.
[4] - P. Reiss, M. Protie're, L. Li / Core/Shell Semiconductor Nanocrystals/ Small 2009, 5, No. 2, 154-168.
Claims (15)
1. Квантовая точка, имеющая кристаллическую структуру вюрцита и характеризующаяся размером 6-8 нм, структура которой выражается общей формулой А/Б, где:
- А - ядро квантовой точки, представляющее собой полупроводниковый материал состава CdTeSeS;
- Б - оболочка квантовой точки, покрывающая ядро и представляющая собой полупроводниковый материал состава CdS, CdZnS, CdS/ZnS, CdS/CdZnS или CdZnS/ZnS; причем ядро квантовой точки имеет кристаллическую структуру вюрцита и размер 2-4 нм, количество монослоев оболочки, покрывающей ядро, составляет от 5 до 8.
2. Квантовая точка по п. 1, в которой квантовая точка имеет структуру CdTeSeS/CdS, CdTeSeS/CdZnS, CdTeSeS/CdS/CdZnS, CdTeSeS/CdZnS/ZnS, или CdTeSeS/CdS/ZnS.
3. Квантовая точка по п. 1, в которой молярное содержание Cd в квантовой точке составляет от 21 до 29%.
4. Квантовая точка по п. 1, в которой молярное содержание Se в квантовой точке составляет от 14 до 20%.
5. Квантовая точка по п. 1, в которой молярное содержание S в квантовой точке составляет от 52 до 64%.
6. Квантовая точка по п. 1, характеризующаяся квантовым выходом от 50 до 70%.
7. Флуоресцентный конъюгат для визуализации молекулярных маркеров, состоящий из фотостабильной флуоресцентной квантовой точки по п. 1, покрытой полимерной оболочкой, и лиганда, обеспечивающего специфичность связывания.
8. Флуоресцентный конъюгат по п. 7, характеризующийся тем, что в качестве полимерной оболочки используют сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового
ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата, терминированный 1,6-гександитиолом; сополимер метоксиполиэтиленгликольакрилата-ко-малеинового ангидрида-ко-этиленгликольдиакрилата с тиолизированным олигомером; сополимер поливинилпирролидона и акриловой кислоты.
9. Флуоресцентный конъюгат по п. 7, характеризующийся тем, что лиганд представляет собой фолиевую кислоту, антитело или его фрагмент.
10. Флуоресцентный конъюгат по п. 7, характеризующийся тем, что лиганд конъюгирован с полимерной оболочкой через линкер.
11. Флуоресцентный конъюгат по п. 10, характеризующийся тем, что линкер представляет собой полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль акрилат, стрептавидин или стрептавидин с His-tag.
12. Флуоресцентный конъюгат по п. 7, характеризующийся тем, что молекулярный маркер представляет собой вещество белковой или нуклеиновой природы, являющееся продуктом жизнедеятельности живых клеток и входящее в их состав.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2022/050226 WO2023027609A1 (ru) | 2021-08-27 | 2022-07-20 | Флуоресцентная многоцелевая наноразмерная метка и конъюгаты на её основе |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777648C1 true RU2777648C1 (ru) | 2022-08-08 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2814452C1 (ru) * | 2023-10-09 | 2024-02-28 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) | Флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2381304C1 (ru) * | 2008-08-21 | 2010-02-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-исследовательский институт прикладной акустики" | Способ синтеза полупроводниковых квантовых точек |
| US20100289003A1 (en) * | 2007-10-29 | 2010-11-18 | Kahen Keith B | Making colloidal ternary nanocrystals |
| US20110233468A1 (en) * | 2007-08-06 | 2011-09-29 | Agency For Science, Technology And Research | Process of forming a cadmium and selenium containing nanocrystalline composite and nanocrystalline composite obtained therefrom |
| RU2497746C2 (ru) * | 2008-09-03 | 2013-11-10 | Эмори Юниверсити | Квантовые точки, способы получения квантовых точек и способы использования квантовых точек |
| RU2540385C2 (ru) * | 2013-06-17 | 2015-02-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "ВГУ") | Способ получения полупроводниковых коллоидных квантовых точек сульфида кадмия |
| CN104974742A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-10-14 | 天门市天宝化工科技有限公司 | 一种CdTeSeS/ZnTe核壳量子点的水相微波制备方法 |
| US20160237345A1 (en) * | 2013-09-27 | 2016-08-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Use of sulfur and selenium compounds as precursors to nanostructured materials |
| EP3293244A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-14 | Christie Digital Systems USA, Inc. | Core-shell quantum dots and method of synthesizing thereof |
| CN110982530A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-04-10 | 纳晶科技股份有限公司 | 一种近红外量子点及其制备方法和应用 |
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110233468A1 (en) * | 2007-08-06 | 2011-09-29 | Agency For Science, Technology And Research | Process of forming a cadmium and selenium containing nanocrystalline composite and nanocrystalline composite obtained therefrom |
| US20100289003A1 (en) * | 2007-10-29 | 2010-11-18 | Kahen Keith B | Making colloidal ternary nanocrystals |
| RU2381304C1 (ru) * | 2008-08-21 | 2010-02-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-исследовательский институт прикладной акустики" | Способ синтеза полупроводниковых квантовых точек |
| RU2497746C2 (ru) * | 2008-09-03 | 2013-11-10 | Эмори Юниверсити | Квантовые точки, способы получения квантовых точек и способы использования квантовых точек |
| RU2540385C2 (ru) * | 2013-06-17 | 2015-02-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "ВГУ") | Способ получения полупроводниковых коллоидных квантовых точек сульфида кадмия |
| US20160237345A1 (en) * | 2013-09-27 | 2016-08-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Use of sulfur and selenium compounds as precursors to nanostructured materials |
| CN104974742A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-10-14 | 天门市天宝化工科技有限公司 | 一种CdTeSeS/ZnTe核壳量子点的水相微波制备方法 |
| EP3293244A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-14 | Christie Digital Systems USA, Inc. | Core-shell quantum dots and method of synthesizing thereof |
| CN110982530A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-04-10 | 纳晶科技股份有限公司 | 一种近红外量子点及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗДОБНОВА Т.А. Комплексы полупроводниковых монокристаллов и рекомбинантных антител для флуоресцентной визуализации опухолевых клеток, Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук, Москва, 2011, с.с. 4-10. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2814452C1 (ru) * | 2023-10-09 | 2024-02-28 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) | Флуоресцентный гидрогель для детекции биологических молекул |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2497746C2 (ru) | Квантовые точки, способы получения квантовых точек и способы использования квантовых точек | |
| Karakoti et al. | Surface functionalization of quantum dots for biological applications | |
| JP6740906B2 (ja) | 抗体結合蛍光体集積ナノ粒子、抗体結合蛍光体集積ナノ粒子の製造方法および免疫染色キット | |
| JPWO2010016289A1 (ja) | 量子ドットを含有する蛍光標識剤 | |
| JP2004300253A (ja) | ポリエチレングリコール修飾半導体微粒子、その製造法及び生物学的診断用材料 | |
| CN107787352A (zh) | 连续发射的核/壳纳米片 | |
| JP6614161B2 (ja) | 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子 | |
| JP6743703B2 (ja) | 免疫染色法、およびこれに用いられる免疫染色試薬キット | |
| JP6923956B2 (ja) | エクソソーム−コンジュゲートされた量子ドットナノ粒子、並びにそれを用いたエクソソーム及び癌の検出方法 | |
| TWI698255B (zh) | 配位體共軛之量子點奈米粒子及使用彼等偵測dna甲基化之方法 | |
| Linkov et al. | Selection of the optimal chromatography medium for purification of quantum dots and their bioconjugates | |
| RU2777648C1 (ru) | Флуоресцентная многоцелевая наноразмерная метка и конъюгаты на её основе | |
| WO2023027609A1 (ru) | Флуоресцентная многоцелевая наноразмерная метка и конъюгаты на её основе | |
| JP2019194617A (ja) | 蛍光ナノ粒子用希釈液、これを用いた蛍光免疫染色用キット、蛍光免疫染色用溶液、および蛍光免疫染色法、遺伝子染色法 | |
| JP6443581B2 (ja) | がんまたは免疫系が関係する疾患の診断または治療のための情報取得方法 | |
| JP5754309B2 (ja) | 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤 | |
| JP7001083B2 (ja) | 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子 | |
| Rees et al. | Dextran-functionalized quantum dot immunoconjugates for cellular imaging | |
| JP2020016568A (ja) | 蛍光標識体、組織染色方法、蛍光標識体の製造方法及び蛍光標識体の安定化方法 | |
| Pierce et al. | Applications of quantum dots in bioimaging and bioassays | |
| Sukhanova et al. | Oriented conjugates of monoclonal and single-domain antibodies with quantum dots for flow cytometry and immunohistochemistry diagnostic applications | |
| Ke | Recent Patents on quantum dot engineering for biomedical application | |
| Bhave et al. | Surfactants as Quantum Dots used in Bio-Imaging | |
| WO2009144983A1 (ja) | 無機ナノ粒子標識剤 | |
| Mardyani et al. | Interfacing peptides identified using phage-display screening with quantum dots for the design of nanoprobes |