EP1766402A2 - Vorrichtung und verfahren zur analyse von wechselwirkungen zwischen biomolekülen - Google Patents
Vorrichtung und verfahren zur analyse von wechselwirkungen zwischen biomolekülenInfo
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- EP1766402A2 EP1766402A2 EP05857270A EP05857270A EP1766402A2 EP 1766402 A2 EP1766402 A2 EP 1766402A2 EP 05857270 A EP05857270 A EP 05857270A EP 05857270 A EP05857270 A EP 05857270A EP 1766402 A2 EP1766402 A2 EP 1766402A2
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Classifications
-
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- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
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-
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
Definitions
- the present invention relates to a device comprising a plurality of biomolecules, which are arranged on the surface of a substrate, wherein the biomolecules are immobilized in pairs spaced from each other via a linker on the surface. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a device according to the invention and to a method for detecting interactions between biomolecules.
- biomolecules the skilled worker understands, for example, compounds from the classes of nucleic acids and their derivatives, proteins, peptides and carbohydrates. These classes of compounds may also be referred to as “biopolymers”.
- nucleic acids In addition to nucleic acids, natural products or libraries thereof, but also arrangements of oligopeptides and proteins have been applied to such chips.
- cellulose, glass, polypropylene, polyethylene nitrocellulose, PTFE membranes and special agar were used as support materials for these arrangements.
- mRNA messenger RNA
- DNA copies of that mRNA the available one Information for a number of reasons is insufficient to understand the processes of both intracellular and extracellular processes and to make use of them in various biotechnological applications.
- One reason for this is that the amount of mRNA in a cell often does not match the corresponding one produced in the cell Protein amount correlates.
- proteins can be significantly influenced by minor chemical modifications in the cell (post-translational modifications) in their biological function.
- nucleic acids for example, nucleic acids, peptides or
- the present invention is therefore based on the object, means for the parallel detection of interactions between at least two different biopolymers, such as peptides, nucleic acids (DNA, RNA, PLA etc), and their derivatives, provide, which is suitable for a be used in a system with high throughput, and on the other hand only a small sample volume needed.
- biopolymers such as peptides, nucleic acids (DNA, RNA, PLA etc), and their derivatives
- a further object of the present invention is a method for detecting an interaction between an immobilized biomolecule, in particular a biopolymer with at least one other, different from the first, immobilized biomolecule, or biopolymer and further a method for determining the effectiveness and selectivity of an active ingredient to provide.
- the object underlying the invention is achieved by a device for analyzing interactions between biomolecules comprising a carrier on which a plurality of biomolecules in a regular or irregular
- the linker has a substantially fork-shaped structure.
- the advantage of this bifurcated structure is the ability to position biomolecules targeted in the immediate vicinity and directed on the surface, and depending on the specific design of the fork-shaped structure (the so-called “molecular fork”) to arrange at a defined distance from each other.
- the linker contains three reactive groups and is covalently bonded to the carrier surface via one of these reactive groups.
- the biomolecules are biopolymers which very particularly preferably consist of regular or irregular sequences of monomer building blocks.
- the advantage of this embodiment is the ability to synthesize the biopolymers fixed in situ directly from the monomer building blocks on the surface.
- the biopolymers are selected from terpenes, nucleic acid sequences, sugar sequences, amino acid sequences and peptide glycoconjugate sequences.
- biopolymer sequences bound to a linker are replaced by a spacer in are arranged at a defined distance from each other.
- the advantage of this embodiment is the possibility of positioning biopolymer sequences at different distances, also shifted from one another, since interactions often depend on the correct distances of the chemical groups involved.
- the material of the carrier is preferably selected from glass, ceramics, metals and their alloys, cellulose, chitin and synthetic polymers.
- the advantage of such support materials is i) to provide a mechanically strong planar surface and ii) to provide the possibility of chemical modifiability.
- the object of the present invention is achieved by a method for detecting interactions between biopolymers immobilized on a surface, comprising the steps:
- the result is a measurable signal when at least two different immobilized biomolecules come very close to each other through interactions.
- the detection of the interaction takes place at amino acid sequences.
- the amino acid sequence with fluorescent radicals such as. B. the o-aminobenzoic acid or a Fluoresceinrest is modified.
- the interaction is detected by bringing the device into contact with another molecule that is capable of distinguishing between interacting, immobilized biopolymers and non-interacting, immobilized biopolymers.
- the interaction of the immobilized biopolymers is detected by a method which indicates the presence of the added molecule and which is selected from the group comprising autoradiography, plasmon resonance spectroscopy, immunology and fluorescence spectroscopy.
- a method which indicates the presence of the added molecule and which is selected from the group comprising autoradiography, plasmon resonance spectroscopy, immunology and fluorescence spectroscopy.
- the detection of the interaction is carried out directly using a detection method that is able to interact with each other, immobilized biopolymers, such. G., Peptides, and non-interacting, immobilized biopolymers, such as. As peptides to distinguish.
- immobilized biopolymers such as. G., Peptides, and non-interacting, immobilized biopolymers, such as. As peptides to distinguish.
- the advantage of direct detection of the interaction is the independence of other detection reagents that can interfere with an interaction.
- the detection of the interaction is carried out using a detection method that gives different signals for different distances between mutually interacting, immobilized biopolymers, and non-interacting, immobilized biopolymers.
- Indicating distance change and selected from the group comprising nuclear magnetic resonance spectroscopy, electron spin resonance spectroscopy, CD spectroscopy, mass spectrometry, FT infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy.
- the detection of the interaction is carried out using a detection method that after addition of excipients preferably gives deuterated different signals for interacting, immobilized biopolymers and non-interacting, immobilized biopolymers.
- the interaction of the immobilized biopolymers is detected by a process that the Indicating change in the rate of exchange of amide deuterons and selected from the group comprising MALDI mass spectrometry, ESI mass spectrometry and NMR spectroscopy.
- the interaction of the immobilized biopolymers is detected by a method which, after irradiation of the amino acid sequence groups with light of suitable frequency and intensity, leads selectively to a covalent bond between the interacting amino acid sequences and the reading out of the corresponding measurement signal is selected group comprising MALDI mass spectrometry, ESI mass spectrometry and NMR spectroscopy.
- a method which, after irradiation of the amino acid sequence groups with light of suitable frequency and intensity, leads selectively to a covalent bond between the interacting amino acid sequences and the reading out of the corresponding measurement signal is selected group comprising MALDI mass spectrometry, ESI mass spectrometry and NMR spectroscopy.
- the device is contacted with a reagent before the interaction of the immobilized biopolymers is detected by one of the abovementioned detection methods.
- the device will be contacted with a reagent selected from the group consisting of drugs, potential agents, organic molecules and natural products.
- a reagent selected from the group consisting of drugs, potential agents, organic molecules and natural products.
- the advantage of this embodiment is the targeted high-throughput search for inhibitors of interactions between biopolymers even in the absence of both substances in substance.
- the present invention will now be described in more detail by way of nonlimiting example of a device having amino acid sequence groups immobilized on a surface, preferably amino acid sequence quartet and gan2 particularly preferred amino acid sequence pairs.
- biopolymers eg. a nucleic acid sequence and an amino acid sequence, or a sugar and a nucleic acid sequence or an amino acid sequence are bound.
- the amino acid sequences are immobilized on the surface via a molecular fork according to the invention (compare FIG.
- the surface is a planar surface.
- interactions or binding events between two or more of the immobilized amino acid sequences can be detected.
- the arrangement according to the invention surprisingly allows a protein-protein interaction to be broken down into a multiplicity of peptide-peptide interactions. It is particularly advantageous that, in the case of direct detection of the interaction between amino acid sequences immobilized on the molecular fork, in a particularly preferred case only the sequence information of two proteins, but not the proteins in substance, is necessary in order to obtain the To map interaction surfaces or binding sites of the two proteins.
- the two interacting proteins A and B are broken down into peptides, preferably so-called overlapping peptides. Subsequently, all combinations, preferably binary combinations, of the peptides derived from the proteins A and B are applied either step-by-step directly or by directed immobilization onto a correspondingly designed molecular fork.
- the surface is the substrate on which the plurality of amino acid sequence groups are immobilized.
- the immobilization can be carried out in such a way that it takes place via a covalent bond.
- other forms of immobilization in particular adsorptive immobilization or immobilization via specific interaction systems are possible.
- immobilization is particularly preferred via a covalent bond, in which case a chemoselective binding of the amino acid sequence to the surface of the carrier material takes place.
- a number of reactions known to those skilled in the art Lemieux, GA & Bertozzi, CR., 1998, TIBTECH 1 16, 506-513, see FIG. 3 can be used for this purpose.
- Suitable reactions are the formation of thioethers from halo-carboxylic acids and thiols, thioethers from thiols and maleimides, amide bonds from thioesters and 1,2-aminothiols, thioamide bonds from dithioesters and 1,2-aminothiols, from thiazolidines from aldehydes and 1,2-aminothiols, of oxazolidines of aldehydes / ketones and 1,2-aminoalcohols, of imidazoles of aldehydes / ketones and 1,2-diamines, (see also Fig. 3) of thiazoles of thioamides and alpha-halo Ketones, of aminothiazoles from amino-oxy-compounds and alpha-
- Isothiocyanato ketones of oximes of amino-oxy compounds and aldehydes, of oximes of amino-oxy compounds and ketones, of hydrazones of hydrazines and aldehydes, of hydrazones of hydrazides and ketones.
- the radicals R1-R5 shown in FIG. 3 or the radicals in the abovementioned chemoselective reactions can be alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or aryl radicals, or heterocycles be, wherein alkyl is branched and unbranched C 1-20 -alkyl] CyI, C 3 _ 20 cycloalkyl, preferably 1.
- Alkenyl is branched and unbranched C 2-20 alkenyl, branched and unbranched C 1-20 alkyl-OC 2-20 alkenyl, C 1-20 (-O / SC 2-20 ) 2-2 o al ke nyl, aryl-C 2 _ 2O alkenyl, heterocyclyl and unbranched C 2 _ 20 branched alkenyl, C 3-20 - cycloalkenyl, preferably represents branched and unbranched C 2-12 - alkenyl, branched and unbranched C 1-12 ( -0 / SC 2-12) 2- 12 alkenyl, particularly preferably branched and unbranched C 2-6 alkenyl, branched and unbranched C 1-6 (- 0 / SC 2-12) 2- 12 alkenyl, particularly preferably branched and unbranched C 2-6 alkenyl, branched and unbranched C 1-6 (- 0 / SC 2-12) 2- 12 alkenyl, particularly
- alkynyl preferably branched and unbranched C 2-12 alkynyl, branched and unbranched C 1-12 (- 0 / SC 2-12 ) 2-12 alkynyl, particularly preferably branched and unbranched C 2-6 alkynyl, branched and unbranched C 1-6 (-O / SC 2-8 ) 2-8 alkynyl radicals;
- Cycloalkyl represents bridged and unbridged C 3-40 -cycloalkyl, preferably bridged and unbridged C 3-26 -cycloalkyl, more preferably bridged and unbridged C 3 .
- aryl represents substituted and unsubstituted mono-or multi-linked phenyl, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, Indacenyl-, acenaphthyl, fluorenyl, phenalenyl, phenanthrenyl, preferably for substituted and unsubstituted mono-or multi- linked phenyl, pentalenyl, azulenyl, anthracenyl, indenyl, indacenyl, acenaphthyl, fluorenyl, particularly preferably substituted and unsubstituted mono- or multi-linked phenyl, pentalenyl, anthracenyl radicals, and their partially hydrogenated derivatives
- Heterocycles may be unsaturated and saturated 3-15-membered mono- and tricyclic rings having 1-7 heteroatoms, preferably 3-7.
- chemoselective immobilization is meant herein in particular that each biopolymer sequence, in particular an amino acid sequence of the amino acid sequence group, is bound to the molecular fork via a defined reactive group or cluster of reactive groups.
- binding specificity it is achieved that, within the usual reaction conditions, the individual amino acid sequences will be immobilized in a defined ratio on the molecular fork.
- array of amino acid sequence groups is understood to mean, in particular, that each amino acid sequence group is immobilized at a particular location on a surface via a molecular fork, and preferably, each of these locations can be identified thus to distinct places, where each substantially a group of amino acid sequence is immobilized.
- the single amino acid sequence group may represent a variety of molecules, however, in terms of their amino acid sequence composition, i. The nature and sequence of the amino acids constituting them are substantially identical.
- the identity of the amino acid sequences is determined essentially by the method of preparation of the individual amino acid sequences. It is within the scope of the present invention that the amino acid sequences are synthesized in situ on the surface of the device, all possible shapes being conceivable here, i. H. sequential addition of the individual amino acids constituting the amino acid sequence, as well as the use of block synthesis techniques in which groupings of amino acids are assembled and then the individual blocks are sequenced and the blocks or sequences thereof are then immobilized or attached to already immobilized amino acid sequences ,
- the array comprises a certain number of different amino acid sequence groups. It can be provided that the same
- Amino acid sequence group at several distinct locations on the surface or the carrier material is present.
- an internal standard can be realized
- edge effects can be represented and recorded.
- biocompatible, functionalized or functionalizable materials can be used as materials for the surface or as support materials. These materials may be present, for example, as solid support plates (monolithic blocks), membranes, films or laminates. Suitable materials are polyolefins, such as z. As polyethylene, polypropylene, halogenated polyolefins (PVDF, PVC, etc.) and polytetrafluoroethylene. On the inorganic material side, for example, ceramics, silicates, silicon and glass can be used. Although non-metallic carrier plates are preferred, it is also within the scope of the present invention to use metallic carrier materials despite their tendency to form potentially nonspecific adsorption effects. Examples of such materials are gold or metal oxides, such as titanium oxide.
- the surface structure can vary. It is in principle possible that the surface on which molecular forks are attached, on which again the directed immobilization of the amino acid sequences takes place, simultaneously represents the carrier material. However, it is also possible that the surface carrying the molecular forks is different from the carrier material. Such a configuration is given, for example, when the (preferably planar) surface forming material is in the form of a film, which is then, not least for stabilization purposes, applied to a further base support material.
- the surface of the support plate may be functionalized.
- functionalization may also be omitted.
- a first functionalization which is already suitable for effecting covalent attachment of the molecular forks to the surface, can be achieved by providing amino and / or carboxyl groups as reactive groups.
- a Such functionalization regardless of the chemical nature of the reactive groups applied, is also referred to herein as the first functionalization.
- carboxyl groups can be carried out, for example, starting from polyolefins, as the surface-providing material, by oxidation with chromic acid. Alternatively, this can be accomplished, for example, by high pressure reaction with oxalyl chloride as well as plasma oxidation, free radical or light induced addition of acrylic acid, and the like.
- halogenated polyolefins can lead to base-double bonds by base-catalyzed elimination processes, leading both to the generation of amino- and carboxy-reactive groups, with subsequent functionalization of the reactive double bonds carboxy- or amino-functionalized.
- Ceramics, glasses, silicon dioxide and titanium oxide can be easily mixed with the in a variety of commercially available substituted silanes such.
- Support plates with hydroxyl groups on the surface are to be modified by a variety of reactions. Reactions with bis-electrophiles, such as, for example, direct carboxymethylation with bromoacetic acid; Acylation with a corresponding amino acid derivative, such as. B. the
- a particularly advantageous method is the reaction with carbonyldiimidazole or phosgene or triphosgene or p-nitrophenyl chloroformate or thiocarbonyldiimidazole, followed by the reaction with Diamines or monoprotected diamines to attach amino functions via a stable urethane bond on the surface to the support materials.
- Molecular forks can be any chemical compounds and structures which on the one hand permit covalent bonding to the surface of the support material and on the other hand have at least two further chemical functions which allow either the stepwise synthesis or the chemoselective immobilization of biopolymer sequences to form further covalent bonds ( see Fig. 1).
- alkyl represents branched and unbranched C 1 _ 20 alkyl, C 3-20 - cycloalkyl, preferably branched and unbranched C 1-12 - alkyl, C 3 _ 12 cycloalkyl, and particularly preferably represents branched and unbranched C 1-6 -alkyl, C 3-6 -cycloalkyl represents radicals.
- Alkenyl is branched and unbranched C 2 _ 20 alkenyl, branched and unbranched C 1-20 -alkyl-OC 2 _ 20 -alkenyl, C 1-20 (- O / SC 2 _ 20 ) 2 _ 20 alkenyl, aryl C 2 _ 20 alkenyl branched and unbranched heterocyclyl C 2 _ 20 alkenyl, C 3 _ 20 cycloalkenyl, preferably represents branched and unbranched C 2 _ 12 alkenyl, branched and unbranched C 1-12 (-0 / SC 2-12) 2 _ 12 alkenyl, particularly preferably branched and unbranched C 2-6 - alkenyl, branched and unbranched C 1-6 (-0 / SC 2-8) 2-8 alkenyl groups; Alkynyl represents branched and unbranched C 2-20 - alkynyl, branched and unbranched C 1-20 (-0 / SC
- Heterocycles may be unsaturated and saturated 3-15-membered monobibo- and tricyclic rings having 1-7 heteroatoms, preferably 3-10-membered mono-bi and tricyclic rings having 1-5
- Heteroatoms and particularly preferred 5-, 6- and 10-membered mono-, bi- and tricyclic rings having 1-3 heteroatoms.
- alkyl alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or natural product 0 to 30 (preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5)
- substituent may occur singly or in combination: fluorine, chlorine, bromine , Iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, ureas, carbamate, with the following being preferred: fluorine, chlorine, bromine, Hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, ureas, carbamate, and most preferably: chlorine, hydroxyl, amide, ester, acid, ether
- the molecular fork contains a first chemically reactive group for immobilization on one macromolecular surface.
- this first reactive group is selected from the group consisting of alcohols, amines, carboxylic acids, carbonyl compounds, hydroxylamines, aldehydes, ketones, acetals, ketals, amino-oxy compounds, azides, hydrazides, thiols, thiocarbonyl, thioketals and Thioacetals, sulfides, sulfonates, alkenes, alkynes, halogen compounds and cyano compounds, so that in preferred embodiments the compound to the functionalized surface via -CONH-, -O-, -S-, -COO-, -CH.dbd.N-, -NHCONH, -NHCSNH, -CC or -NHNH- groupings.
- the molecular fork contains at least a second and a third chemically reactive group for the immobilization or stepwise synthesis of biopolymer sequences.
- This group includes, but is not limited to, alcohols, amines, carboxylic acids, carbonyl compounds, hydroxylamines, aldehydes, ketones, acetals, ketals, aminooxy compounds, azides, hydrazides, thiols, thiocarbonyl compounds, thioketals and thioacetals, sulfides, sulfonates, alkenes, Alkynes, halogen compounds and cyano compounds include These may be masked by protecting groups.
- these molecular forks allow the number of biopolymer sequence Molecules covalently fixed on one side of the molecular fork are very similar to the number of biopolymer sequence molecules covalently fixed on one side of the molecular fork.
- the amino acid sequences immobilized on the molecular fork have a spacer.
- spacers also referred to herein as “spacers”
- the amino acid sequences gain more efficiency within additional degrees of freedom
- a spacer may be essentially any molecule, particularly any biocompatible molecule containing at least two functional groups.
- the spacer when used, is incorporated as an element between the surface-mounted molecular fork and the amino acid sequence.
- Suitable spacers are the following compound classes:
- Alkanes branched or unbranched, in particular those having a chain length of C2 to C30, in particular C4 to C8;
- Polyether d. H. Polymers of polyethylene oxide or polypropylene oxide, wherein the polyether preferably consist of 1 to 5 polyethylene oxide units or Polypropylenöxidein whatsoever; Polyalcohols, branched or unbranched, such as
- Polyglycol and derivatives thereof such as O, O'-bis (2-aminopropyl) polyethylene glycol 500 and 2,2 '- (ethylene dioxide) diethylamine; Polyurethanes, polyhydroxy acids, polycarbonates, polyimides, polyamides, polyesters, polysulfones, especially those consisting of 1-100 monomer units, most preferably consisting of 1-10 monomer units; Combinations of the aforementioned alkanes with those mentioned above polyethers; Polyurethanes, polyhydroxy acid, polycarbonates, polyimides, polyamides, polyamino acids, polyesters and polysulfones; Diaminoalkanes, branched or unbranched, preferably those having a chain length of C2 to C30, most preferably those having a chain length of C2 to C8; Examples which may be mentioned here 1,3-diaminopropane, 1, 6-diaminohexane and 1, 8-diaminooctane, and their combinations with poly
- the spacer has two functional ends, it is possible to select these functionalities so that the amino acid sequences to be immobilized on the surface either through their C-terminus or their N-terminus or via another functional moiety within the immobilized amino acid sequence can be immobilized. If immobilization is to occur via the C-terminus, the functional group of the spacer which acts on the C-terminus will preferably be an amino group. Should the amino acid sequences by means of the N-terminus to the Surface are immobilized, the corresponding functional group of the spacer is a carboxyl group.
- the spacer is a branched spacer.
- branched spacers are also referred to as dendrimeric structures or dendrimers for short, and are known to those skilled in the art.
- Dendrimeric structures for the immobilization of nucleic acids are described, for example, in Beier, M. & Hoheisel, J.D., 1999, Versatile Derivatization of Solid Support Media for Covalent Bonding on DNA Microchips, 9, 1970-1977.
- the function of such dendrimeric structures is to increase the number of reactive groups per unit area of the surface and thus the signal intensity.
- Dendrimeric structures can be provided with almost all functional or functionalizable groups, which then allow immobilization of the amino acid sequences.
- the number of reactive groups per unit area of the planar surface can be increased by a factor of 2 to 100, preferably by a factor of 2 to 20, and more preferably by a factor of 2 to 10.
- a further functionalization can take place.
- the remaining reactive group of the spacer is further functionalized by additional measures.
- This second functionalization can be carried out directly at the molecular fork, at the provided with a spacer molecule fork or at a dendrimeric structure.
- One reason for the second functionalization is that due to the amino and carboxyl groups present in the amino acid sequences, thiol functions, imidazole functions and guanido functions, no uniform immobilization with respect to the orientation of the
- Amino acid sequence can be achieved on the molecular fork.
- a second functionalization provides access to further chemoselective reactions to achieve directional immobilization.
- Suitable for this second functionalization are all those compounds which are distinguished by the presence of non-proteinogenic functional groups.
- the following compounds may be mentioned without limitation: maleimido compounds such as maleimido-amines or maleimido-carboxylic acids; alpha-halo ketones such as bromopyruvic acid or 4-carboxy-alpha-bromo-acetophenone, alpha-isothiocyanato-ketones such as 4-carboxy-alpha-isothiocyanato-acetophenone, aldehydes such as carboxybenzaldehyde, ketones such as levulinic acid, thiosemicarbazides, thioamides such as succinic monothioamide, alpha- Bromocarboxylic acids such as bromoacetic acid, hydrazines such as 4-hydrazinobenzoic acid, O-alkylhydroxylamines such as amino-oxy-acetic acid, and hydrazides such as glutaric acid
- Blocking ensures that during or after the chemoselective reaction of the amino acid sequences with the functionalized molecular forks, unreacted but still reactive groups or groups on the molecular fork or surface are inactivated become.
- This blocking reaction is necessary because otherwise the added proteins or other components of the biological sample used nonspecifically react with these, not yet blocked, reactive groups and thus may possibly provide a large background signal.
- Such nonspecific reactions with surfaces are a common cause of unfavorable signal-to-noise ratios in biochemical analyzes.
- For this blocking are those compounds that are not sterically demanding, react very well with the groups to be blocked and generate the most favorable surface properties. The choice of these compounds will depend on the nature of the sample or interacting partner which interacts with one of the amino acid sequence groups.
- the compound is preferably made hydrophilic if the proteins used preferably bind non-specifically to hydrophobic surfaces and hydrophobic if the samples used preferably binds non-specifically to hydrophilic surfaces.
- a biomolecule such as a protein
- hydrophilic solvent tends to hide all, or rather, as many hydrophobic moieties as possible.
- hydrophobic surface If such a protein enters a more hydrophobic environment (hydrophobic surface), the protein may fold over and unfold, leading to inactivation.
- proteins are known that exist in their natural occurrence within (hydrophobic) biomembranes. Such proteins would fold upon contact with a hydrophilic surface and thereby denature or inactivated. In such a case, a hydrophobic surface is desirable.
- the constituents of the amino acid sequences of the device of the invention are amino acids which are preferably selected from the group comprising L and D amino acids. Furthermore, the amino acids are selected from the group that includes natural and non-natural amino acids. A preferred group within each of the above groups of amino acids are the corresponding alpha-amino acids.
- the amino acid sequences consist, for example, of a sequence of amino acids from any of the above groups. Thus, for example, a combination of D and L amino acids within the scope of the invention as well as amino acid sequences consisting either exclusively of D or L amino acids.
- the constituents of the amino acid sequences may moreover comprise molecules other than amino acids.
- PNAs peptide nucleic acids
- the density of the amino acid sequence groups is 1 / cm 2 to 1000 / cm 2 , the density being preferably 1 / cm 2 to 500 / cm 2 and most preferably 1 / cm 2 to 200 / cm 2 .
- Such densities of distinct sites on a surface, each containing an amino acid sequence group can be achieved using various techniques, such as piezoelectric pipetting robots, with fine needles of various materials such as polypropylene, stainless steel or tungsten or alloys thereof so-called "pin tools" that either slotted needles represent or are composed of a ring containing the substance mixture to be applied, and a needle which passes through the substance mixture contained in this ring through this on the corresponding surface. But also with a motor-driven
- Syringe connected capillaries are suitable (spotter). Another possibility is to apply the amino acid sequences to be immobilized by means of suitable punches.
- Amino acid sequences by means of suitable pipettes or so-called Multipetten by hand is possible. Furthermore, it is possible to generate the densities of distinct locations indicated above by direct in situ synthesis of the amino acid sequences on the molecular forks of the surface. (M.
- the different amino acid sequence groups consist of two different sequences and that one of these sequences is identical in the different amino acid sequence groups (FIG. 7). Or else, there are two chemically different sequences before, such as a nucleic acid sequence and an amino acid sequence, etc.
- Amino acid sequences are overlapping peptides that cover the entire primary structure of a protein.
- FRET fluorescence energy resonance transfer
- NMR magnetic core spin resonance
- auxiliary structures may be attached to the amino acid sequences such that only in the event of an interaction between the
- Amino acid sequences of an amino acid sequence group is a new structure from those on the
- Amino acid sequence interactions in contacted auxiliary structures forms, which in turn is selectively detectable.
- Such a structure may be a structure known to those skilled in the art as a discontinuous epitope, which can be detected selectively by binding suitable antibodies.
- these auxiliary structures may be elements that, under certain conditions, tend to dimerize or oligomerize only when there is an interaction between the amino acid sequences of an amino acid sequence group.
- Examples of such auxiliary structures are complementary DNA or RNA, or PNA strands.
- Further examples of such auxiliary structures are short oligo-proline sequences, which are known to those skilled in the art that they form a so-called polyproline or triple helix in a corresponding pre-orientation, which in turn each generate a specific CD signal.
- the present invention also provides a method to search for substances that can inhibit the interaction of the immobilized biopolymers. For this purpose, after contacting the device with a reagent which is selected from the group of active ingredients, potential active substances, organic molecules and natural substances, the change of a signal that results from one of the detection methods described above, read out.
- Fig.l shows the schematic structure of a molecular fork, which is immobilized on the one hand on a support surface and on the other hand carries two different biopolymer sequences
- Fig. 2 shows schematically the possibilities for interactions of two different biopolymers immobilized on a surface via a binary molecular fork
- Fig. 4 shows schematically the procedure for loading a binary molecular fork with two different amino acid sequences by sequential chemoselective
- Fig. 6 shows the chemical structure of the example molecular fork MG2,
- Fig. 9 shows the analysis of streptavidin / Strep-tag II
- Figure 12 shows the analysis of streptavidin / strep-tag II interaction using inhibition with natural biotin.
- Figure 13 shows the mapping of the interaction site of the Raf peptide (RQRSTpSTPNV) on the 14-3-3 protein.
- Figure 14 shows the mapping of the interaction site of the mT peptide (ARSHpSYPA) on the 14-3-3 protein.
- Figure 15 shows the mapping of the interaction site of the FKBP12 / FAP48 interaction.
- Figure 16 shows the mapping of the interaction site of FKBP12 / EGF receptor interaction.
- FIG. 17 shows the inhibition of streptavidin-peptide / streptag II interactions using the natural product biotin and its derivatives.
- FIG. 1 shows the schematic structure of a device 100 according to the invention, in which two different biopolymer sequences 101 and 102 are immobilized on a suitable carrier surface 104 via a binary molecular fork 103.
- FIG. 2 shows the schematic structure of an arrangement 200 according to the invention, wherein in FIG. 2A two non-interacting biopolymer sequences 201 and 202 are immobilized on a suitable carrier surface 204 via a binary molecular fork 203.
- FIG. 2 B is the possible interaction of identical biopolymer sequences 208, 209, which are immobilized on different, spatially adjacent molecular forks 205, 206, shown schematically.
- Figure 2C2 the interaction of various biopolymer sequences 213, 214, 215, 216 immobilized on different, spatially adjacent molecular forks 218, 219 is shown schematically.
- Figure 2C1 also shows the interaction of two different biopolymer sequences 211, 212 immobilized on a molecular fork. It will be apparent to those skilled in the art that the proportion of cases B and C2 is highly dependent on the density of loaded molecular forks on the support surface.
- the radical R 1 in this case represents alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or aryl radicals, or heterocycles or surfaces
- the radicals R 4 -R 5 represent alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or Aryl radicals, or heterocycles or surfaces or H, D, or T, where alkyl is branched and unbranched C 1-10 -alkyl, C 3-20 -
- Cycloalkyl preferably for branched and unbranched C 1-12 - alkyl, C 3 _ 12 cycloalkyl and particularly preferably branched and unbranched C 1-6 alkyl, C 3 _ 6 cycloalkyl radicals.
- Alkenyl represents branched and unbranched C 2 _ 20 alkenyl, branched and unbranched C 1-20 alkyl-OC 2 _ 20 alkenyl, C 1-20 (- 0 / SC 2-20) 2 _ 20 alkenyl, aryl C 2 _ 20 alkenyl, branched and unbranched C heterocyclyl.
- 2 20 alkenyl, C 3 _ 20 cycloalkenyl preferably represents branched and unbranched C 2 _ 12 alkenyl, branched and unbranched C 1-12 (-O / SC. 2 12) 2 _ 12 alkenyl, particularly preferably branched and unbranched C 2-6 -
- Alkynyl represents branched and unbranched C 2-20 - alkynyl, branched and unbranched C 1-20 (-0 / SC 2-20) 2 _ 20 alkynyl, preferably represents branched and unbranched C 2-12 - alkynyl, branched and unbranched C 1-12 (-0 / SC 2-12 J 2, 12 alkynyl, more preferably branched and unbranched C 2-6 alkynyl, branched and unbranched C 1-6 (- 0 / SC 2-8) 2 _ 8 alkynyl radicals;
- cycloalkyl is bridged and non-bridged 3 C 40 -cycloalkyl, preferably bridged and non-bridged C 3-26 cycloalkyl, more preferably bridged and non-bridged C 3-15 cycloalkyl radicals,
- Heterocycles may be unsaturated and saturated 3-15-membered monobibo- and tricyclic rings having 1-7 heteroatoms, preferably 3-10-membered mono-bi and tricyclic rings having 1-5
- Heteroatoms and particularly preferred 5,6 and 10-membered mono-bi and tricyclic rings with 1-3 heteroatoms.
- alkyl alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroatoms, heterocycles, biomolecule or natural product 0 to 30 (preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5)
- substituents may be used singly or in combination with each other; Fluorine, chlorine, bromine, iodine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, acetal, ketal, thiol, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, peroxide, sulfonic acid, thioether, nitrile, ureas, carbamate, with the following being preferred: fluorine , Chlorine, bromine, hydroxyl, amide, ester, acid, amine, ether, phosphate, sulfate, sulfoxide, thioether, nitrile, ureas, carbamate, and most preferably: chlorine, hydroxyl, amide
- FIG. 4 shows the schematic structure of a device 400 according to the invention, in which two different biopolymer sequences 403, 404 are immobilized by a person skilled in the art via a binary molecular fork 401 on a suitable carrier surface 405 and chemoselective reactions are explained in FIG ,
- the first biopolymer sequence 403 is formed by a chemoselective immobilization reaction under formation anchored to a chemical bond on the molecular fork (reaction step A).
- reaction step A the second biopolymer sequence 404 is subjected to a chemoselective immobilization reaction / which preferably differs from the first immobilization reaction
- FIG. 5 shows the structure of the molecular fork MG1, which is connected to the surface of the carrier via two ⁇ -alanine molecules as spacers.
- Fmoc and Dde are protective groups known to those skilled in the art which, after selective removal, allow the loading of the molecular fork with corresponding biomolecules.
- FIG. 6 shows the structure of the molecular fork MG2, which is connected via two ⁇ -alanine molecules as spacers to the surface of the carrier.
- Fmoc and Dde which are known to the person skilled in the art, represent protective groups which, after selective removal, allow the loading of the molecular fork with corresponding biomolecules.
- FIG. 7 shows a particular embodiment 700 of the invention utilizing binary molecular forks.
- the same biopolymer sequence 704 is either immobilized or synthesized stepwise (black spheres correspond to the biomonomers, the left-hand biopolymer sequence being identical in this example).
- biopolymer subsequences 705, 706, 707 e.g. As peptides, either immobilized or synthesized stepwise, the sequence of a naturally occurring biopolymer, eg. As a protein, as represent overlapping Biopolymerteilquoe.
- the complete sequence or just one or more subregions of the sequence can be imaged by the entirety of the subsequence pieces.
- the desired biopolymer sequence 705, 706, 707 is represented by overlapping trimeric partial sequences with two overlapping biomonomers.
- proteins are represented as biopolymer sequences by means of overlapping partial sequences, the entirety of the partial sequences is known to the person skilled in the art as a peptide scan.
- the present Figure 7 is thus the peculiarity that on the one hand all binary molecular forks 701, 702, 703 same in a molecule, but form a biopolymer scan with the second half 705, 706, 707.
- Figure 8 shows the interactions of 50 peptide pairs corresponding to the embodiment shown in Figure 7 with overlapping dodecapeptides representing the streptavidin sequence and the strep-tag II peptide.
- the cellulose modified via molecular forks of the MGl form with peptide pairs was analyzed using 100 nM streptavidin followed by Western blot analysis and immunodetection.
- the constant peptide block Strep-tag II was synthesized at the Dde site. At the Fmoc side, overlapping 12m peptides with an overlap of 9 amino acids were synthesized, spanning the entire streptavidin sequence. The densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). The ordinate represents the difference from the reciprocal of the Intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities. Large positive values correspond to a weak signal in the blot and show potential interaction in the peptide pair.
- streptavidin sequences corresponding to the interacting peptides are tabulated.
- FIG. 9 shows the interactions in 75 peptide pairs according to the embodiment shown in FIG. 7 with overlapping overlapping dodecapeptides comprising the
- the constant peptide block Strep-tag II was synthesized at the Dde side. At the Fmoc side, overlapping 12m peptides spanning the entire streptavidin sequence with a 2 amino acid shift were synthesized. The densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). The ordinate represents the difference from the reciprocal of the Intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities. Large positive values correspond to a weak signal in the blot and show potential interaction in the peptide pair. The streptavidin sequences corresponding to the interacting peptides are tabulated.
- Figure 10 shows the interactions in 75 peptide pairs according to the embodiment shown in Figure 7 with overlapping dodecapeptides representing the streptavidin sequence and Strep-Tag II peptide.
- the APEG-amino-polypropylene surface modified via molecular forks MG2 with peptide pairs was analyzed using 100 nM streptavidin followed by Western blot analysis and immunodetection.
- the constant peptide block streptag II was synthesized on the Dde side.
- overlapping 12m peptides that span the entire streptavidin sequence with a 2-amino acid shift were synthesized.
- the densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad).
- the ordinate represents the difference between the reciprocal of the intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities. Large positive values correspond to a weak signal in the blot and show potential interaction in the peptide pair.
- the streptavidin sequences corresponding to the interacting peptides are tabulated.
- FIG. 11 shows the interactions in peptide pairs of peptide pairs according to the embodiment shown in FIG. 7 with overlapping length-varied peptides which the
- Streptavidin sequence Arg59-AlalOO and Strep-Tag II peptide The constant peptide block Strep-tag II was synthesized on the Dde side. At the Fmoc side, overlapping 12mers to ⁇ mers peptides spanning the streptavidin sequence Arg59-Alal00 with a 2-amino acid shift were synthesized. The cellulose modified via molecular forks MG2 with peptide pairs was analyzed using 50 nM streptavidin followed by Western blot analysis and immunodetection.
- streptavidin sequences which correspond to the interacting peptides and thus represent the minimal binding motif, are tabulated.
- Figure 12 shows the biotin-blocked binding of streptavidin to Strep-Tag II peptide.
- the cellulose modified via molecular forks of the MGl form according to the embodiment shown in Fig. 7 was analyzed using a preformed biotin / streptavidin complex (60 ⁇ g streptavidin / 6 ⁇ g biotin, Ih preincubation) followed by Western blot analysis and immunodetection.
- Peptide pairs modified cellulose was prepared using 150 nM 14-3-3 protein followed by Western blot analysis and immunodetection.
- the constant peptide block Raf peptide was synthesized at the Dde site. At the Fmoc side, overlapping 12m peptides that span the entire 14-3-3 protein sequence with a 2 amino acid shift were synthesized.
- the densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). The ordinate represents the difference between the reciprocal of the intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities. Large positive values correspond to a weak signal in the blot and show potential interaction in the peptide pair.
- the 14-3-3 protein sequences corresponding to the interacting peptides are tabulated.
- the cellulose modified via molecular forks of the MG2 form with peptide pairs was analyzed using 200 nM 14-3-3 protein followed by Western blot analysis and immunodetection.
- the constant peptide block mT peptide was synthesized at the Dde site. At the Fmoc side, overlapping lOmere peptides spanning the entire 14-3-3 sequence with a 2 amino acid shift were synthesized. The densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). The ordinate represents the difference between the reciprocal of the intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities. Large positive values correspond with a weak signal in the blot and show potential interaction in the peptide pair. The 14-3-3 protein sequences corresponding to the interacting peptides are tabulated.
- Figure 15 shows the detection of interactions in 48 peptide pairs according to the embodiment shown in Figure 7 with overlapping dodecapeptides representing the FKBP12 sequence and FAP48-derived peptides interacting with FKBP12.
- Figure 16 shows the detection of interactions in 48 peptide pairs according to the embodiment shown in Figure 7 with overlapping dodecapeptides representing the FKBP12 sequence and peptides derived from the cytoplasmic domain of the EGF receptor, - which interact with FKBP12.
- the cellulose modified via molecular forks MG2 with peptide pairs was analyzed using 200 nM FKBP12 followed by Western blot analysis and immunodetection.
- the constant peptide block acetyl-PHVCRLLGICLTS from the EGF receptor (Pro748-Ser760) was synthesized at the Dde site.
- overlapping 13m peptides that span the entire FKBP12 sequence with a 2 amino acid shift were synthesized.
- the densitometric analysis was performed using a GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). The ordinate represents the difference between the reciprocal of the intensity of each spot analyzed and the reciprocal of the average spot intensities.
- Figure 17 shows the mapping of the streptavidin / strep-tag II interaction by means of 75 pairs of peptides consisting of overlapping dodecapeptides representing the streptavidin sequence and the strep-tag II peptide. Shown is the reading of the signal via fluorescence and the inhibition of streptavidin-peptide / Strep-tag II interactions using the natural product biotin and its derivatives.
- the peptide on the Fmoc side was labeled with a dansyl residue and the peptide on the aloe side was labeled with fluorescein.
- the analysis was carried out by detecting the emission light at 510-530 nm after excitation with light of wavelength 366 nm by means of the Raytest DIANA Chemiluminescence detection system.
- C) The modified membrane as described under B) was incubated for 30 minutes in a solution containing 0.5 mM biotin, 1 mM 2-iminobiotin (Ka 8.0 ⁇ 10 6 M -1 ) or diaminobiotin (GO Reznik, S. Vajda, T. Sano, CR., Cantor; 1998, A streptavidin mutant with altered ligand binding speeificity, Proc. Natl. Acad., USA, 95, 13525-13530).
- Example 1 Immobilization of Peptide Pairs via a Molecular Fork (MGI, FIG. 5) to Amino-Functionalized Cellulose Surfaces
- Fmoc-Lys (Dde) -OH and Boc-Lys (Fmoc) -OH were dissolved in DMF in 0.3 M and added by addition of a Equivalent PyBOP activated in the presence of DIEA (10%, v / v).
- Fmoc-Lys (Dde) -OH was coupled to the ( ⁇ -Ala) 2 spacer of the amino-functionalized cellulose surface in DMF.
- the cleavage of the N ⁇ -Fmoc protective group was carried out using 20% piperidines in DMF twice for 5 min or 15 min at RT. Subsequently, Boc-Lys (Fmoc) -OH was coupled in DMF.
- the cleavage of the N ⁇ -Fmoc protective group was carried out using 20% piperidines in DMF twice for 5 min or 15 min at RT. It was then washed with DMF (3 ⁇ 10 min) and methanol (2 ⁇ 5 min) and the cellulose was dried.
- the first peptide chain was carried out automatically using the standard SPOT synthesis method with the device Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Germany).
- the free N-terminal amino groups were acetylated using 5% acetic anhydride / 2% DIEA in DMF for 30 min. Subsequently, the Dde-protecting group on the molecular fork was removed using 2% hydrazine in DMF for 3 x 3 min.
- the synthesis of the second peptide chain was performed automatically by the standard SPOT synthesis method, and after completion of the second peptide chain synthesis, the free N-terminal amino groups were acetylated using 5% acetic anhydride / 2% DIEA in DMF for 30 min.
- Example 2 Immobilization of peptide pairs via a molecular fork (MG2, Figure 6) to amino-functionalized cellulose surfaces.
- the cleavage of the N ⁇ -Fmoc protective group was carried out using 20% piperidines in DMF twice for 5 min or 15 min at RT. It was then washed with DMF (3 ⁇ 10 min) and methanol (2 ⁇ 5 min) and the cellulose was dried. This was followed by the two-fold coupling of 0.3 M PyBOP-activated Boc-Lys (Fmoc) -OH (0.3 M) in DMF with DIEA (10% v / v).
- the cleavage of the N ⁇ -Fmoc protective group was carried out using 20% piperidines in DMF twice for 5 min or 15 min at RT.
- the first peptide chain was carried out automatically using the standard SPOT synthesis method with the device Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Germany).
- the free N-terminal amino groups were prepared using 5% acetic anhydride / 2% DIEA in DMF for 30 min acetylated. Subsequently, the Dde-protecting group on the molecular fork was removed using 2% hydrazine in DMF for 3 x 3 min.
- the synthesis of the second peptide chain was performed automatically by the standard SPOT synthesis method, and after completion of the second peptide chain synthesis, the free N-terminal amino groups were acetylated using 5% acetic anhydride / 2% DIEA in DMF for 30 min.
- the deprotection was done using 50% TFA / DCM with 2% triisopropylsilane and 3% water for 3 h at RT with gentle shaking. The cellulose was then washed twice each with DCM for 5 minutes, with DMF three times for 15 minutes and twice with MeOH for 10 minutes, dried and stored at -20 ° C. for further use.
- Example 3 Immobilization of peptide pairs via a molecular fork to amino-functionalized APEG- ⁇ mino- polypropylene surfaces.
- Fmoc-Glu-Lys (Dde) -CONH 2 was prepared as described in Example 2 and activated by PyBOP. The coupling then takes place to the ( ⁇ -Ala) 2 spacer of the APEG-amino-polypropylene surfaces (AMIS Scientific Products GmbH, Germany). The further synthesis was carried out as described in Example 2.
- Example 4 Analysis of streptavidin / strep-tag II interaction using molecular fork MGI.
- peptide pairs were synthesized on MG1, whereby the constant peptide block Strep-tag II was synthesized at the Dde side.
- MG1 constant peptide block Strep-tag II
- Figure 8A overlapping 12m peptides spanning the entire streptavidin sequence with a 3-amino acid shift
- peptide pairs were synthesized on MGl, whereby the constant peptide block Strep-tag II was synthesized on the Fmoc side.
- overlapping 12m peptides spanning the entire streptavidin sequence with a 3 amino acid shift were synthesized (Figure 8B). There were 50 individual spots each.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- streptavidin as a detection molecule, which can not interact with interacting peptides, but with strep-tag II, which is not involved in a peptide-peptide interaction, can interact.
- peptide pairs were synthesized on MG2 to synthesize the constant peptide block Strep-tag II at the Dde side.
- overlapping 12m peptides spanning the entire streptavidin sequence with a 2 amino acid shift were synthesized. This resulted in 75 individual spots.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- streptavidin as a detection molecule, which can not interact with interacting peptides, but with streptag II, which is not involved in a peptide-peptide interaction, can interact.
- the detection of strepatvidin was carried out by immunodetection and visualization by the ECL system (Amersham Pharmacia).
- Example 6 Mapping the length of the streptavidin / strep-tag II interaction regions using the molecular fork MG2
- peptide pairs were synthesized on MG2, the constant peptide block Strep-tag II was synthesized at the Dde site.
- the constant peptide block Strep-tag II was synthesized at the Dde site.
- 6mers to 12mers peptides that span the sequence of the streptavidin fragment Arg 59 -Ala 100 with a 2 amino acid shift were synthesized.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- the detection of an interaction between the peptides of a pair of peptides immobilized at the molecular fork is made by streptavidin as a detection molecule, which can not interact with interacting peptides, but with streptag II, which is not involved in a peptide-peptide interaction. can interact.
- peptide pairs were synthesized on MG2, whereby the constant peptide block Strep-tag Il was synthesized on the Dde side.
- Strep-tag Il was synthesized on the Dde side.
- overlapping 12m peptides that span the entire streptavidin sequence with a 2 amino acid shift were synthesized.
- ⁇ O ⁇ g streptavidin was incubated with 6 ⁇ g biotin in MP buffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl,
- Example 8 Mapping of the interaction site of the Raf peptide RQRSTpSTPNV on the 14-3-3 protein
- peptide pairs were synthesized on MG2 to synthesize the constant peptide block RQRSTpSTPNV (Raf peptide) at the Dde side.
- RQRSTpSTPNV Raf peptide
- overlapping 12m peptides spanning the entire 14-3-3 sequence with a 3 amino acid shift were synthesized. This resulted in 80 individual spots.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- the detection of an interaction between the peptides of a peptide pair immobilized on the molecular fork is carried out by 14-3-3 ⁇ / ⁇ as a detection molecule, which can interact with interacting peptides, but with Raf peptide, which is not in a peptide peptide Interaction is involved.
- peptide pairs were synthesized on MG2 to synthesize the constant peptide block ARSHpSYPA (mT peptide) at the Dde site.
- ARSHpSYPA mT peptide
- overlapping loops with a 2 amino acid shift spanning the entire 14-3-3 sequence were synthesized. This resulted in 120 individual spots.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- the detection of an interaction between the peptides of a peptide pair immobilized on the molecular fork is carried out by 14-3-3 ⁇ / ⁇ as a detection molecule, which can interact with interacting peptides, but with mT peptide, which not involved in a peptide-peptide interaction.
- FAP48 binding sites in FAP48 Two sequence regions were found in FAP48 that mediate interaction with FKBPl2, FAP48 Lys217-Ser229 (KCPLLTAQFFEQS) and FAP48 Leu307-His319 (LSPLYLLQFNMGH).
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- FKBP12 as a detection molecule which can not interact with interacting peptides, but with the corresponding FAP48 peptide which is not involved in a peptide-peptide interaction , can interact.
- Nitrocellulose membranes (0.45 ⁇ M, PALL Gelman, Germany) using a semi-dry blotter (Biometra, Germany) electrotransferiert.
- two nitrocellulose membranes were placed on both sides of the cellulosic peptide-modified molecular fork and this array was placed between blotting paper coated with transfer buffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 ⁇ l of glycine, 10% methanol).
- transfer buffer 25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 ⁇ l of glycine, 10% methanol.
- the electrotransfer was carried out at 0.8 mA / cm 2 for various times (first electrotransfer step 45 min, second electrotransfer step 90 min).
- the detection of FKBP12 was carried out by immunodetection and visualization by the ECL system (Amersham Pharmacia).
- FKBP12 binding sites in the cytosolic domain of the EGF receptor were mapped using classical SPOT technology and protein interaction analysis. Five sequence regions were found in EGFR that mediate interaction with FKBP12. Among these sequences, the sequence of a particularly highly interacting peptide was selected with PHVCRLLGICLTS (EGFR Pro 748 -Ser 760 ).
- peptide pairs were synthesized on MG2 to synthesize the constant peptide block Ac-PHVCRLLGICLTS at the Dde side.
- overlapping 13mers peptides with a 2 amino acid shift were used to shift the entire FKBP12 sequence span, synthesized. There were 48 individual spots each.
- the dry cellulose peptide-modified molecular fork was washed for 10 min with MeOH and 3 x 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl).
- FKBP12 FKBP12 as a detection molecule, which can not interact with interacting peptides, but with the corresponding
- EGFR peptide which is not involved in peptide-peptide interaction, can interact.
- Nitrocellulose membranes (0.45 ⁇ M, PALL Gelman, Germany) using a semi-dry blotter (Biometra, Germany) electrotransferiert. To do this, two nitrocellulose membranes were placed on both sides of the cellulosic peptide-modified molecular fork and this array was placed between blotting paper soaked in transfer buffer (25mM Tris-HCl, pH 8.3, 150mM Glycine, 10% methanol) Electrotransfer was carried out at 0.8 mA / cm 2 for various times (first electrotransfer step 45 min, second electrotransfer step 90 min). The detection of FKBP12 was carried out by immunodetection and visualization by the ECL system (Amersham Pharmacia).
- Example 12 Inhibition of streptavidin-peptide / strep-tag II interactions using biotin and / or its derivatives.
- the analysis was carried out by detecting the emission light at 510-530 nm after excitation with light of wavelength 366 nm by means of the Raytest DIANA Chemiluminescence detection system.
- FIG. 17B Differences in the fluorescence behavior of the spots with different peptide pairs were found; in the case of interacting peptide pairs, increased fluorescence emission was detected.
- the modified membrane was treated prior to analysis with high affinity, low affinity and non-affine drug having similar chemical properties.
- the cellulose was regenerated by treatment with Buffer A (Urea 48 g, SDS 1 g, mercaptoethanol 100 ⁇ l, making up water to 100 ml) and buffer B (water 40 ml, EtOH 50 ml, acetic acid 10 ml).
- Buffer A Urea 48 g, SDS 1 g, mercaptoethanol 100 ⁇ l, making up water to 100 ml
- buffer B water 40 ml, EtOH 50 ml, acetic acid 10 ml.
- the analysis of the fluorescence properties of the spots was carried out.
- the fluorescence emission of the spots was reduced, all spots showed very similar fluorescence behavior.
- the low-affinity diaminobiotin the fluorescence behavior was very similar to the original fluorescence behavior completely without active substance. This shows that in the presence of a high-affinity agent, but not in the presence of a low-affinity agent, inhibition of the interaction takes place (see FIG.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen umfassend einen Träger auf dem eine Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind, wobei an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren umfassend die Schritte des Bereitstellens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Einstellens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten Biopolymeren sowie des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei Biopolymeren hervorgerufenen Signals.
Description
VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR ANALYSE VON WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN
BIOMOLEKÜLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung umfassend eine Vielzahl von Biomolekülen, die auf der Oberfläche eines Substrats angeordnet sind, wobei die Biomoleküle paarweise beabstandet voneinander über einen Linker auf der Oberfläche immobilisiert sind. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen.
Für ein vergleichendes Studium der molekularen Erkennung zwischen Biomolekülen der gleichen oder verschiedener Strukturklassen ist der Einsatz großer kombinatorischer Bibliotheken von auf einem Substrat immobilisierten Bindungspartnern der in Lösung angebotenen Biomoleküle von großem Vorteil.
Unter dem Begriff "Biomoleküle" versteht der Fachmann beispielsweise Verbindungen aus den Klassen der Nukleinsäuren und deren Derivate, Proteine, Peptide und Kohlenhydrate. Diese Verbindungsklassen können ebenso als „Biopolymere" bezeichnet werden
Dieses Prinzip der wechselseitigen molekularen Erkennung findet insbesondere beim gezielten Aufbau von Polynukleotiden aus Nukleosidbausteinen und/oder Oligonukleotidbausteinen Anwendung. Der gezielte Polynukleotidaufbau wiederum ist für die Herstellung von DNA Chips, die eine hohe Dichte („high- density DNA-chip") von darauf angeordneten Polynukleotiden aufweisen von entscheidender Bedeutung.
DNA Chips, d.h. sogenannte Microarrays von Feldern auf einem Glas- oder Polymersubstrat immobilisierter DNA oder beliebig ausgewählter Oligonukleotide, die als Super-multiplex-Sonden für die molekulare Erkennung durch Hybridisierung fungieren, (S.P.A. Fodor, Science 277 (1997) 393, DNA Sequencing Massively Parallel Genomics) werden schon seit längerem beispielsweise in der Medizin und in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt
Neben Nukleinsäuren wurden Naturstoffe bzw. Bibliotheken davon, aber auch Anordnungen von Oligopeptiden und Proteinen auf derartige Chips aufgebracht. Als Trägermaterialien für diese Anordnungen wurden dabei neben den schon vorstehend erwähnten Materialien Zellulose, Glas, Polypropylen, Polyethylen Nitrozellulose, PTFE-Membranen und Spezialagar verwendet.
Mit der zunehmenden Bedeutung von Proteomics und deren biotechnologischen Anwendung rücken Peptide und Proteine in den Vordergrund des Interesses. Generell sind es Proteine, die nahezu alle biochemischen Reaktionen innerhalb und außerhalb der Zelle ermöglichen. Die Verwendung von Anordnungen von Nukleinsäuren, mit denen entweder die Messenger-RNA (mRNA) , die durch in der Zelle gerade aktive Gene generiert wurden, oder aber DNA-Kopien dieser mRNA nachgewiesen werden, sind zwar von großer Bedeutung, jedoch ist die damit erhältliche Information aus einer Reihe von Gründen nicht ausreichend, um die Vorgänge sowohl intrazellulärer wie auch extrazellulärer Prozesse zu verstehen und hiervon im Rahmen verschiedener biotechnologischer Anwendungen Gebrauch zu machen. Ein Grund dafür besteht darin, dass die Menge an mRNA in einer Zelle oft nicht mit der entsprechenden, in der Zelle produzierten
Proteinmenge korreliert. Außerdem können einmal hergestellte Proteine durch geringfügige chemische Modifikationen in der Zelle (post-translationale Modifikationen) erheblich in ihrer biologischen Funktion beeinflußt werden.
Somit besteht die Notwendigkeit, eine parallele Analyse der Bindungseigenschaften möglichst vieler Proteine durchzuführen. Eine derartige Analyse erlaubt es u. a. , die sehr schnelle Kartierung der Bindungsstellen, welche wiederum eine wichtige Voraussetzung für das Design von Wissens¬ basierten Inhibitoren ist, oder die selektive Prüfung von Pharmaka bzw. Pharmaka-Kandidaten bzw. Wirkstoffen.
Es ist bekannt, beispielsweise Nukleinsäuren, Peptide bzw.
Proteine auf verschiedenen Oberflächen zu immobilisieren, wie Glas (J. Robles et al.; 1999, Tetrahedron, 55, 13251-13264),
Zellulose (D.R. Englebretsen, D.R.K. Harding; 1994, Pept.
Res., 7, 322-326,), Nitrozellulose (S.J. Hawthorne, et al.;
1998, Anal. BLochern. , 261, 131-138), PTFE-Membranen (T.G.
Vargo et al.; 1995 J. Biomed. Hat. Res. , 29, 161-IIB), Titanoxid (SJ. Xiaoet al.; 1997, J. Materials Science-
Materials in Medicine, 8, 867-872), Siliziumoxid (T. Koyano et al.; 1996, Biotech. Progress. , 12, 141-144) oder Gold
(B.T. Houseman, M. Meksich; 1998, J. Org. Chem. , 63, 7552-
7555) oder direkt auf einer entsprechenden funktionalisierten oder nicht funktionalisierten Glasoberfläche (S.P.A. Fodor et al.; 1991, Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao;
2000, J. Comb. Chem., 2, 355-360) oder auf Zellulose
(R.Frank, 1992, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J.
Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by:
S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F. et al.
Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900) oder auf Polypropylen (M.
Stankova et al.; 1994, Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul et
al.; 200O7 Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh et al.; 2000, Biopolymers, 55, 188-206) oder auf Chitin (W. Neugebauer et al.; 1996, Int. J. Pept. Prot. Res. , 47, 269- 275) oder auf Sepharose (W. Tegge, R. Frank, 1997, J. Peptides Res., 49, 355-362, R. Gast; 1999, Anal. Biochem. ,
276, 227-241) und anschließend wird die schrittweise Synthese der Peptide durchgeführt.
Jedoch ist eine parallele Analyse der Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen immobilisierten Biopolymeren, bzw. Biopolymerseguenzen (vide infra) , insbesondere von Nukleinsäuren, Zuckern, Peptiden bzw. Proteinen bislang nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel für den parallelen Nachweis von Wechselwirkungen zwischen mindestens zwei verschiedenen Biopolymeren, wie zum Beispiel Peptiden, Nukleinsäuren (DNA, RNA, PLA etc), und deren Derivaten, bereitzustellen, das zum einen geeignet ist, in einem System mit hohem Durchsatz verwendet zu werden, und zum anderen nur ein geringes Probenvolumen benötigt. Dabei ist es insbesondere wünschenswert, dass ein derartiges Mittel im Gegensatz zu den Mitteln aus dem Stand der Technik, auch beispielsweise nur die aus den Sequenzendatenbanken verfügbare Information für die Kartierung von Protein- Protein-Wechselwirkungen benötigt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem immobilisierten Biomolekül, insbesondere einem Biopolymer mit mindestens einem anderen, vom ersten verschiedenen, immobilisierten Biomolekül, bzw. Biopolymer und weiter ein Verfahren zur Bestimmung der Effektivität und Selektivität eines Wirkstoffes zur Verfügung zu stellen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen umfassend einen Träger auf dem eine Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen
Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind, wobei an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind.
Bevorzugt weist der Linker eine im wesentlichen gabelförmige Struktur auf. Der Vorteil dieser gabelförmigen Struktur besteht in der Möglichkeit, Biomoleküle gezielt in unmittelbarer Nachbarschaft und gerichtet auf der Oberfläche zu positionieren, sowie je nach konkreter Ausgestaltung der gabelförmigen Struktur (der sogenannten „Molekülgabel") in einem definierten Abstand zueinander anzuordnen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform enthält der Linker drei reaktive Gruppen und ist über eine dieser reaktiven Gruppe kovalent an die Trägeroberfläche gebunden.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Biomoleküle Biopolymere, die ganz besonders bevorzugt aus regelmäßigen oder unregelmäßigen Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, die Biopolymere direkt aus den Monomerbausteinen auf der Oberfläche fixiert in-situ zu synthetisieren.
Vorzugsweise sind die Biopolymere ausgewählt aus Terpenen, Nukleinsäureseguenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid-Glyσokonjugat-sequenzen.
Ganz besonders bevorzugt ist, daß die an einem Linker gebundenen Biopolymersequenzen durch einen Abstandshalter in
einem definierten Abstand zueinander angeordnet sind. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, Biopolymersequenzen in bestimmten Abständen auch gegeneinander verschoben zu positionieren, da häufig Interaktionen von den korrekten Abständen der beteiligten chemischen Gruppierungen abhängen.
Das Material des Trägers ist bevorzugterweise ausgewählt aus Glas, Keramik, Metallen und deren Legierungen, Zellulose, Chitin und synthetische Polymere. Der Vorteil solcher Trägermaterialien besteht darin i)eine mechanisch feste planare Oberfläche zu bieten und ii) die Möglichkeit zur chemischen Modifizierbarkeit zu geben.
Weiter wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren gelöst umfassend die Schritte:
a) des Bereitsteilens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
b) des Einstellens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten voneinander unterschiedlichen Biopolymeren
c) des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei unterschiedlichen Biopolymeren hervorgerufenen Signals
Es entsteht ein meßbares Signal, wenn sich mindestens zwei verschiedene immobilisierte Biomoleküle durch Wechselwirkungen räumlich sehr nahe kommen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung an Aminosäuresequenzen erfolgt. Der
Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, durch diese Wechselwirkungen Protein/Protein-Wechselwirkungen zu erfassen, die durch andere Untersuchungsmethoden schwer zugänglich sind. Weiterhin ist bei manchen Ausführungsformen vorgesehen, dass die Aminosäuresequenz mit fluoreszierenden Resten, wie z. B. der o-Aminobenzoesäure oder einem Fluoresceinrest modifiziert wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung durch das in-Kontakt-bringen der Vorrichtung mit einem weiteren Molekül erfolgt, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass in Folge mehrere verschiedene weitere Moleküle zugegeben werden können, so dass die gleiche Anordnung mit verschiedenen Nachweismethoden analysiert werden kann.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das die Anwesenheit des zugegebenen Moleküls anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradiographie, Plasmonresonanzspektroskopie, Immunologie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst. Ein Vorteil bei der Verwendung eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Erfassung der Wechselwirkungen.
Außerdem ist in noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung direkt erfolgt unter Nutzung eines Nachweisverfahrens, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, wie z. B. Peptiden, und nicht miteinander wechselwirkenden,
immobilisierten Biopolymeren, wie z. B. Peptiden, zu unterscheiden. Der Vorteil des direkten Nachweises der Wechselwirkung besteht in der Unabhängigkeit von weiteren Nachweisreagenzien, die mit einer Wechselwirkung interferieren können.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung unter Nutzung eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass verschiedene Signale für unterschiedliche Abstände zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren ergibt.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das die
Abstandsänderung anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kern-Magnetische-Resonanz-Spektroskopie, Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie, CD-Spektroskopie, Massen-Spektrometrie, FT-Infrarot-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst. Ein Vorteil bei der
Verwendung eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Erfassung der Wechselwirkungen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung unter Nutzung eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass nach Zugabe mit Hilfsstoffen bevorzugt deuterierte verschiedene Signale für miteinander wechselwirkende, immobilisierte Biopolymere und nicht miteinander wechselwirkende, immobilisierte Biopolymere ergibt.
Bevorzugt erfolgt dabei der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren, das die
Änderung der Austauschgeschwindigkeit von Amid-Deuteronen anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI- Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR- Spektroskopie umfasst.
Es ist weiter bevorzugt, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das nach Bestrahlung der Aminosäuresequenzgruppen mit Licht geeigneter Frequenz und Intensität selektiv zu einer kovalenten Bindung zwischen den wechselwirkenden Aminosäuresequenzen führt und das Auslesen des entsprechenden Mess-Signals ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen- Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass eine Wechselwirkung stabil durch eine kovalente Verknüpfung fixiert wird und anschließend weiteren
Untersuchungsmethoden, die spezifisch für stabil verknüpfte Verbindungen sind, zugänglich ist.
In noch einer bevorzugten weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Vorrichtung mit einem Reagenz kontaktiert wird, bevor die Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch eines der oben genannten Nachweisverfahren nachgewiesen wird.
Es ist weiter vorgesehen, dass die Vorrichtung mit einem Reagenz kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Wirkstoffe, potentielle Wirkstoffe, organische Moleküle und Naturstoffe umfaßt. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der gezielten Hochdurchsatz-tauglichen Suche nach Inhibitoren für Interaktionen zwischen Biopolymeren sogar in Abwesenheit beider Interaktionspartner in Substanz.
Die vorliegenden Erfindung wird nun anhand eines als nicht einschränkend verstandenen Beispiels, nämlich einer Vorrichtung mit auf einer Oberfläche immobilisierten Aminosäuresequenzgruppen, bevorzugt Aminosäuresequenzquartetts und gan2 besonders bevorzugt Aminosäuresequenzpaaren noch näher im Detail beschrieben.
Es versteht sich, dass die nachstehenden Ausführungen für alle vorstehend erwähnten Biopolymer gelten. Insbesondere gilt dies natürlich auch, wenn an der erfindungsgemäßen sogenannten Molekülgabel in weiteren bevorzugten Ausführungsformen zwei unterschiedliche Biopolymere, zB. eine Nukleinsauresequenz und eine Aminosäuresequenz, oder ein Zucker und eine Nukleinsauresequenz oder eine Aminosäuresequenz gebunden sind.
Erfindungsgemäß sind die Aminosäuresequenzen über eine erfindungsgemäße Molekül-Gabel (vgl. Fig. 4) auf der Oberfläche immobilisiert. Bevorzugt ist die Oberfläche eine planare Oberfläche. Damit können Wechselwirkungen bzw. Bindungsereignisse zwischen zwei oder mehreren der immobilisierten Aminosäuresequenzen nachgewiesen werden.
Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt es im Falle von Aminosäuresequenzen überraschenderweise, eine Protein-Protein-Wechselwirkung in eine Vielzahl von Peptid- Peptid-Wechselwirkungen zu zerlegen. Dabei ist besonders vorteilhaft, dass im Falle des direkten Nachweises der Wechselwirkung zwischen auf der Molekül-Gabel immobilisierten Aminosäuresequenzen in einem besonders bevorzugten Falle nur die Sequenzinformation zweier Proteine, nicht aber die Proteine in Substanz, notwendig sind, um die
Wechselwirkungsflächen bzw. Bindungsstellen der beiden Proteine zu kartieren.
In diesem Fall werden die beiden wechselwirkenden Proteine A und B in Peptide, bevorzugt sogenannte überlappende Peptide, zerlegt. Anschließend werden alle Kombinationen, bevorzugt binären Kombinationen, der von den Proteinen A und B abgeleiteten Peptide entweder Schritt-für-Schritt direkt oder durch gerichtete Immobilisierung auf eine entsprechend gestaltete Molekül-Gabel aufgebracht.
Neben der Möglichkeit, dass die auf der Molekül-Gabel immobilisiereten Peptide nicht miteinander wechselwirken (Fig. 2A), gibt es die in Fig. 2B und 2C gezeigten Möglichkeiten für eine intramolekulare Wechselwirkung. Dabei sind erfindungsgemäß nur solche Wechselwirkungen von Interesse, bei denen Biopolymersequenzen, die entweder auf einer Molekül-Gabel (Fig. 2Cl) oder auf verschiedenen Molekül-Gabeln (Fig. 2C2, gezeigt für eine binäre Molekül- Gabel) immobilisiert sind, in einer Form miteinander interagieren, die den Wechselwirkungen der jeweiligen nativen Proteine entsprechen.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung einer Vielzahl von Aminosäuresequenzgruppen, die über Molekül-Gabeln auf einer Oberfläche aufgebracht sind, ist die Oberfläche das Substrat, auf dem die Vielzahl von Aminosäuresequenzgruppen immobilisiert ist. Die Immobilisierung kann dabei so erfolgen, dass sie über eine kovalente Bindung erfolgt. Neben der kovalenten Immobilisierung sind jedoch andere Formen der Immobilisierung, insbesondere der adsorptiven Immobilisierung oder der Immobilisierung über spezifische Wechselwirkungssysteme möglich. In Bezug auf die Art der Immobilisierung besonders bevorzugt ist die Immobilisierung
über eine kovalente Bindung, wobei hier eine chemoselektive Bindung der Aminosäuresequenz an die Oberfläche des Trägermaterials erfolgt. Hierzu können eine Reihe von Reaktionen verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als solche bekannt sind (Lemieux, G.A. & Bertozzi, CR., 1998, TIBTECH1 16, 506-513, vgl. hierzu Fig. 3).
Grundsätzlich soll mit Blick auf die erforderliche gerichtete, chemoselektive Immobilisierung sichergestellt werden, dass unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen im wesentlichen nur eine spezielle Verbindung zwischen den Aminosäuresequenzen der Aminosäuresequenzgruppen und Bereichen der Molekül-Gabel auf der Oberfläche hergestellt wird (Fig. 4). Typischerweise werden bei den chemoselektiven Reaktionen in der Aminosäuresequenz enthaltene Amino- bzw. Carboxylgruppen nicht beeinträchtigt.
Beispiele für geeignete Reaktionen sind die Bildung von Thioethern aus Halo-Carbonsäuren und Thiolen, von Thioethern aus Thiolen und Maleinimiden, von Amidbindungen aus Thioestern und 1,2-Aminothiolen, von Thioamidbindungen aus Dithioestern und 1,2-Aminothiolen, von Thiazolidinen aus Aldehyden und 1,2-Aminothiolen, von Oxazolidinen aus Aldehyden/Ketonen und 1,2-Aminoalkoholen, von Imidazolen aus Aldehyden/Ketonen und 1,2-Diaminen, (vgl. hierzu auch Fig. 3) von Thiazolen aus Thioamiden und alpha-Halo-Ketonen, von Aminothiazolen aus Amino-oxy-Verbindungen und alpha-
Isothiocyanato-Ketonen, von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Aldehyden, von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Ketonen, von Hydrazonen aus Hydrazinen und Aldehyden, von Hydrazonen aus Hydraziden und Ketonen. Dabei können die in Fig. 3 aufgezeigten Reste R1-R5 bzw. die Reste in den oben aufgeführten chemoselektiven Reaktionen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen
sein, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C1-20-Al]CyI, C3_20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1. 12-Alkyl, C3.12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1-6-Alkyl, C3_6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-20-Alkyl-O-C2-20- alkenyl, C1-20(-0/S-C2-20)2-2oalkenyl, Aryl-C2_2O-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2_20-alkenyl, C3-20- Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-12- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (-0/S-C2-12)2- 12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (- 0/S-C2-8)2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-20 (-0/S-C2-20)2.20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (- 0/S-C2-12)2-12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (- 0/S-C2-8)2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C3-40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3.15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl- Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono- bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-
10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen. Zusätzlich kann am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bevorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituent einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, SuIfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Saure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat,und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril
Unter gerichteter, chemoselektiver Immobilisierung soll hierin insbesondere verstanden werden, dass jede Biopolymersequenz, insbesondere eine Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenzgruppe über eine definierte reaktive Gruppe oder Ansammlung reaktiver Gruppen an der Molekül-Gabel gebunden wird. Infolge dieser Bindungsspezifität wird erreicht, dass sich im Rahmen der üblichen Reaktionsbedingungen die einzelnen Aminosäuresequenzen in einem definierten Verhältnis auf der Molekül-Gabel immobilisiert befinden werden.
Unter dem Begriff „Anordnung (Array) von Aminosäuresequenzgruppen" wird hierin insbesondere verstanden, dass eine jede Aminosäuresequenzgruppe an einem bestimmten Ort auf einer Oberfläche über eine Molekül-Gabel immobilisiert ist. Bevorzugterweise kann dabei jeder dieser Orte identifiziert werden. Bei den Orten handelt es sich somit um distinkte Orte, an denen jeweils im wesentlichen
eine Gruppe von Aminosäuresequenz immobilisiert ist. Mit anderen Worten, es existiert eine Karte, aus der die Lage einer jeden der immobilisierten Aminosäuresequenzgruppen auf der Oberfläche abgeleitet werden kann.
Die einzelne Aminosäuresequenzgruppe kann dabei eine Vielzahl von Molekülen darstellen, die jedoch hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz-Zusammensetzung, d.h. der Art und Abfolge der sie aufbauenden Aminosäuren im wesentlichen identisch sind. Die Identität der Aminosäuresequenzen wird im wesentlichen durch das Herstellungsverfahren der einzelnen Aminosäuresequenzen bestimmt. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen in situ auf der Oberfläche der Anordnung synthetisiert werden, wobei hier alle möglichen Formen denkbar sind, d. h. sequentielles Anfügen der die Aminosäuresequenz aufbauenden einzelnen Aminosäuren, ebenso wie die Verwendung von Block- Synthesetechniken, bei denen Gruppierungen von Aminosäuren zusammengefügt werden und dann die einzelnen Blöcke sequentiell aneinandergereiht werden und die Blöcke oder Aneinanderreihungen davon sodann immobilisiert werden bzw. an bereits immobilisierte Aminosäuresequenzen angefügt werden.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass infolge der nicht immer vollständigen Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte bzw. Kopplungsschritte gewisse Heterogenitäten in den verschiedenen Aminosäuresequenzen im vorstehend beschriebenen Sinne entstehen können. Insbesondere bei Synthesen, die viele Reaktionsschritte erfordern, wie dies bei der Synthese von Amiosäuresequenzen der Fall ist (pro Aminosäurebaustein eine Kupplungsreaktion und eine Schutzgruppen-Abspaltung und am Ende der Synthese im allgemeinen eine Reaktion für die simultane Abspaltung aller Schutzgruppen der Seitenkettenfunktionen) .
So ist zum Beispiel bei der Synthese einer Aminosäuresequenz, die aus 20 Aminosäurebausteinen oder 40 Aininosäurebausteinen besteht, und einer angenommenen durchschnittlichen Ausbeute von 95% für die nötigen 41 bzw. 81 Reaktionsschritte die zu erwartende theoretische Ausbeute nur noch 0.9541 = 0.122 (12.2 %) bzw. 0.9581 = 0.0157 (1.57 %). Selbst bei einer angenommen durchschnittlichen Ausbeute von 99 % ergeben sich für die oben aufgeführten Beispiele nur 66.2 % bzw. 44.3 %. Damit ist eine spezifische oder auch gerichtete, chemoselektive Immobilisierung von großem Vorteil. Hier erfolgt in einem Immobilisierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Molekül- Gabel auf der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindnung immobilisiert wird, jeweils in der gleichen Art und Weise und alle Verbindungen sind in einer definierten und vorhersagbaren Orientierung auf oder an Molekül-Gabel an der Oberfläche gebunden.
Es versteht sich, dass die Anordnung eine bestimmte Anzahl von verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen umfasst. Dabei kann vorgesehen sein, dass die gleiche
Aminosäuresequenzgruppe an mehreren distinkten Orten auf der Oberfläche bzw. dem Trägermaterial vorhanden ist. Damit kann zum einen ein interner Standard realisiert werden, zum anderen aber auch mögliche Randeffekte dargestellt und erfasst werden.
Als Materialien für die Oberfläche bzw. als Trägermaterialien können im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle bioverträglichen, funktionalisierten bzw. funktionalisierbaren Materialien verwendet werden. Diese Materialien können beispielsweise als feste Trägerplatten (monolithische Blöcke), Membranen, Filme oder Laminate vorliegen. Geeignete Materialien sind dabei Polyolefine, wie
z. B. Polyethylen, Polypropylen, halogenierte Polyolefine (PVDF, PVC, etc.) sowie Polytetrafluoroethylen. Auf seiten der anorganischen Materialien können beispielsweise Keramik, Silikate, Silizium und Glas verwendet werden. Obwohl nicht- metallische Trägerplatten bevorzugt sind, ist es jedoch auch im Umfang der vorliegenden Erfindung, metallische Trägermaterialien zu verwenden, trotz deren Tendenz zur Ausbildung potentiell unspezifischer Adsorptionseffekte. Beispiele für derartige Materialien sind Gold oder Metalloxide, wie beispielsweise Titanoxid.
Die Oberflächenstruktur kann dabei variieren. Es ist grundsätzlich möglich, dass die Oberfläche, an der Molekül- Gabeln angebracht sind, an denen wiederum die gerichtete Immobilisierung der Aminosäuresequenzen erfolgt, gleichzeitig das Trägermaterial darstellt. Es ist jedoch auch möglich, dass die die Molekül-Gabeln tragende Oberfläche verschieden ist von dem Trägermaterial. Eine derartige Ausgestaltung ist beispielsweise dann gegeben, wenn das die (bevorzugt planare) Oberfläche ausbildende Material in Form eines Films vorliegt, der dann, nicht zuletzt zu Stabilisierungszwecken, auf einem weiteren Basisträgermaterial aufgebracht ist.
Zu Zwecken der Aufbringung der Molekül-Gabeln, insbesondere wenn diese durch kovalente Bindung auf einem Trägermaterial erfolgt, kann die Oberfläche der Trägerplatte funktionalisiert werden. Grundsätzlich sind mehrere aufeinanderfolgende Funktionalisierungen möglich, es kann jedoch in Abhängigkeit vom ausgewählten Trägermaterial auch eine Funktionalisierung unterbleiben.
Eine erste Funktionalisierung, welche bereits geeignet ist, eine kovalente Bindung der Molekül-Gabeln an die Oberfläche zu bewerkstelligen, kann in der Bereitstellung von Amino- und/oder Carboxylgruppen als reaktive Gruppen erfolgen. Eine
derartige Funktionalisierung wird, unabhängig von der chemischen Natur der aufgebrachten reaktiven Gruppen, hierin auch als erste Funktionalisierung bezeichnet.
Die Erzeugung von Carboxylgruppen kann, beispielsweise, ausgehend von Polyolefinen, als das die Oberfläche bereitstellendes Material, durch Oxidation mit Chromsäure erfolgen. Alternativ kann dies beispielsweise durch Hochdruckreaktion mit Oxalylchlorid sowie Plasmaoxidation, radikalische oder Licht-induzierte Addition von Acrylsäure und dergleichen bewerkstelligt werden. Halogenierte
Materialien wie halogenierte Polyolefine können durch Basen¬ katalysierte Eliminationsprozesse, die zu Doppelbindungen an der Oberfläche führen, sowohl zur Erzeugung von Amino- als auch Carboxy-reaktiven Gruppen führen, wobei anschließend die reaktiven Doppelbindungen Carboxy- oder Amino- funktionalisiert werden.
Keramik, Gläser Siliziumdioxid und Titanoxid können einfach mit den in einer Vielzahl kommerziell erhältlicher substituierter Silane, wie z. B. Aminopropyltriethoxysilan, funktionalisiert werden. Trägerplatten mit Hydroxylgruppen auf der Oberfläche sind durch eine Vielzahl von Reaktionen zu modifizieren. Besonders vorteilhaft sind Umsetzungen mit Biselektrophilen, wie zum Beispiel die direkte Carboxymethylierung mit Bromessigsäure; Acylierung mit einem entsprechenden Aminosäureabkömmling, wie z. B. die
Dimethylaminopyridin-katalysierte Carbodiimid-Kupplung mit Fluorenylmethoxycarbonyl-3-aminopropansäure oder die Generation von Iso(thio-)cyanaten durch Mono-Uxnsetzung mit entsprechenden Bis-Iso(thio)cyanaten. Eine besonders vorteilhafte Methode ist die Reaktion mit Carbonyldiimidazol oder Phosgen oder Triphosgen oder p-Nitrophenyl-Chloroformiat bzw. Thiocarbonyldiimidazol, gefolgt durch die Reaktion mit
Diamin oder einfach geschützten Diaminen, um Aminofunktionen über eine stabile Urethanbindung auf der Oberfläche zu den Trägermaterialien anzubringen.
Als Molekül-Gabeln können alle chemischen Verbindungen und Strukturen angesehen werden, die einerseits eine kovalente Bindung zur Oberfläche des Trägermaterials zulassen und andererseits mindestens zwei weitere chemische Funktionen besitzen, die entweder die schrittweise Synthese oder die chemoselektive Immobilisierung von Biopolymersequenzen unter Ausbildung weiterer kovalenter Bindungen erlauben (siehe Fig. 1).
Insbesondere geeignet sind dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen sein, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C1_20-Alkyl, C3-20- Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1-12- Alkyl, C3_12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1-6-AIkVl, C3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2_20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-20-Alkyl-O-C2_20-alkenyl, C1-20(- O/S-C2_20)2_20alkenyl, Aryl-C2_20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2_20-alkenyl, C3_20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2_12-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (-0/S-C2-12)2_12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6- Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (-0/S-C2-8)2-8alkenyl- Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-20 (-0/S-C2-20)2_ 20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-12- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (-0/S-C2-12)2- 12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-5 (- 0/S-C2-8)2_8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und
nicht-überbrückte C3_40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3_25-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3_15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-,
Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl- Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono- bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3- 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5
Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.
Zusätzlich kann am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituent einzeln oder in Kombination untereinander auftreten: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
Zum einen enthält die Molekülgabel eine erste chemisch reaktive Gruppe zur Immobilisierung auf einer
makromolekularen Oberfläche. Dabei ist vorgesehen, daß diese erste reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die Alkohole, Amine, Karbonsäuren, Carbonylverbindungen, Hydroxylamine, Aldehyde, Ketone, Acetale, Ketale, Amino-oxy- Verbindungen, Azide, Hydrazide, Thiole, Thiocarbonylverbindungen, Thioketale und Thioacetale, Sulfide, Sulfonate, Alkene, Alkine, Halogenverbindungen und Cyanoverbindungen umfaßt, so daß in bevorzugten Ausführungsformen die Verbindung zur funktionalisierten Oberfläche über —CONH—, —O—, —S—, —COO—, —CH.dbd.N— , —NHCONH—, —NHCSNH, —C-C— oder —NHNH— Gruppierungen erfolgt .
Zum anderen enthält die Molekülgabel mindestens eine zweite und eine dritte chemisch reaktive Gruppe zur Immobilisierung bzw. schrittweisen Synthese von Biopolymersequenzen. Diese Gruppe umfasst ist aber nicht beschränkt auf Alkohole, Amine, Karbonsäuren, Carbonylverbindungen, Hydroxylamine, Aldehyde, Ketone, Acetale, Ketale, Amino-oxy-verbindungen, Azide, Hydrazide, Thiole, Thiocarbonylverbindungen, Thioketale und Thioacetale, Sulfide, Sulfonate, Alkene, Alkine, Halogenverbindungen und Cyanoverbindungen umfaßt Diese können durch Schutzgruppen maskiert vorliegen.
Dabei müssen die für die Synthese bzw. chemoselektive Immobilisierung von Biomolekülen vorgesehenen chemischen
Funktionen nicht unbedingt unterschiedlicher chemischer Natur sein (vgl. Fig. 5 und 6). Es genügt, wenn diese chemischen Funktionen so maskiert sind, daß diese chemischen Funktionen mit dem Fachmann bekannten Methoden geordnet und in Beliebiger Reihenfolge entfernt werden können.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erlauben diese Molekül-Gabeln, daß die Anzahl der Biopolymersequenz-
Moleküle, die auf der einen Seite der Molekül-Gabel kovalent fixiert ist, sehr ähnlich bzw. gleich der Anzahl der Biopolymersequenz-Moleküle, die auf der einen Seite der Molekül-Gabel kovalent fixiert sind, ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass die auf der Molekül-Gabel immobilisierten Aminosäuresequenzen einen Abstandhalter aufweisen. Infolge der Verwendung derartiger Abstandhalter, hierin auch als „spacer" bezeichnet, gewinnen die Aminosäuresequenzen an zusätzlichen Freiheitsgraden um effektiver innerhalb einer
Aminosäuresequenzgruppe miteinander wechselwirken zu können. Ein Abstandhalter kann im wesentlichen jedes Molekül sein, insbesondere ein jedes biokompatibles Molekül, das mindestens zwei funktionelle bzw. funktionalisierbare Gruppen enthält. Der Abstandhalter ist im verwendeten Zustand als Element zwischen auf der Oberfläche angebrachten Molekül-Gabel und der Aminosäuresequenz eingebaut.
Als Abstandhalter eignen sich die folgenden Verbindungsklassen:
Alkane, verzweigt oder unverzweigt, insbesondere solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C30, insbesondere C4 bis C8; Polyether, d. h. Polymere des Polyethylenoxids oder des Polypropylenoxids, wobei die Polyether bevorzugt aus 1 bis 5 Polyethylenoxideinheiten bzw. Polypropylenöxideinheiten bestehen; Polyalkohole, verzweigt oder unverzweigt, wie
Polyglycol und Derivate davon, wie beispielsweise O,O'-Bis(2- Aminopropyl)-polyethylenglycol 500 und 2,2 '-(Ethylendioxid)- Diethylamin; Polyurethane, Polyhydroxysäuren, Polycarbonate, Polyimide, Polyamide, Polyester, Polysulfone, insbesondere solche bestehen aus 1-100 Monomereinheiten, ganz besonders bevorzugt bestehend aus 1-10 Monomereinheiten; Kombinationen der vorstehend genannten Alkane mit den vorstehend genannten
Polyethern; Polyurethanen, Polyhydroxysäure, Polycarbonaten, Polyimiden, Polyamiden, Polyaminosäuren, Polyestern und Polysulfonen; Diaminoalkane, verzweigt oder unverzweigt, bevorzugterweise solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C30, ganz besonders bevorzugt solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C8; beispielhaft seien hier genannt 1,3-Diaminopropan, 1, 6-Diaminohexan und 1, 8-Diaminooctan, sowie deren Kombinationen mit Polyethern, bevorzugterweise mit den vorstehend genannten Polyethern; wie zum Beispiel l,4-bis-(3- Aminopropoxy)butan; Dicarbonsäuren und deren Derivate, wie zum Beispiel Hydroxy-, Mercapto- und Amino-dicarbonsäuren, gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt, insbesondere C2 bis C30 Dicarbonsäuren, bevorzugterweise solche mit einer Kettenlänge von C2 bis ClO, ganz besonders bevorzugt solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C6; wie beispielsweise Bernsteinsäure und Glutarsäure; und Aminosäuren und Peptide, bevorzugterweise mit einer Länge von 1-20 Aminosäureresten, ganz besonders bevorzugt mit einer Läne von 1-3 Aminosäureresten, beispielsweise Trimere von Lysin, Dimere von 3-Aminopropionsäure und monomere 6- Aminocapronsäure.
Grundsätzlich ist es infolge der Tatsache, dass der Abstandhalter zwei funktionale Enden aufweist, möglich, diese Funktionalitäten so auszuwählen, dass die auf der Oberfläche zu immobilisierenden Aminosäuresequenzen entweder über ihren C-Terminus oder ihren N-Terminus oder über eine andere funktionelle Gruppierung innerhalb der zu immobilisierenden Aminosäuresequenz immobilisiert werden. Soll eine Immobilisierung über den C-Terminus erfolgen, wird die am C- Terminus angreifende funktionale Gruppe des Abstandhalters bevorzugterweise eine Aminogruppe sein. Sollen die Aminosäuresequenzen vermittels des N-Terminus an die
Oberfläche immobilisiert werden, ist die entsprechende funktionelle Gruppe des Abstandhalters eine Carboxylgruppe.
Bei der erfindungsgemäßen Anordnung kann vorgesehen sein, dass der Abstandhalter ein verzweigter Abstandshalter ist. Derartige verzweigte Abstandshalter werden auch als dendrimere Strukturen oder kurz Dendrimere bezeichnet, und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Dendrimere Strukturen zur Immobilisierung von Nukleinsäuren sind beispielsweise beschrieben in Beier, M. & Hoheisel, J.D., 1999, Versatile derivatisation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips, 9, 1970-1977. Die Funktion derartiger dendrimerer Strukturen besteht darin, die Anzahl der reaktiven Gruppen pro Flächeneinheit der Oberfläche und damit die Signalintensität zu erhöhen.
Dendrimere Strukturen können mit fast allen funktionellen oder funktionalisierbaren Gruppen versehen werden, die sodann eine Immobilisierung der Aminosäuresequenzen erlauben. Infolge der Verwendung derartiger dendrimerer Strukturen kann die Anzahl der reaktiven Gruppen pro Flächeneinheit der planaren Oberfläche um den Faktor 2 bis 100, bevorzugterweise um den Faktor 2 bis 20 und bevorzugtererweise um den Faktor 2 bis 10 gesteigert werden.
Nach dem Aufbringen eines Abstandhalters auf die Molekül- Gabel kann eine weitere Funktionalisierung erfolgen. Mit anderen Worten, die verbliebene reaktive Gruppe des Abstandhalters wird durch zusätzliche Maßnahmen weitergehend funktionalisiert. Diese zweite Funktionalisierung kann dabei direkt an der Molekül-Gabel, an der mit einem Abstandshalter versehenen Molekül-Gabel oder an einer dendrimeren Struktur erfolgen.
Ein Grund für die zweite Funktionalisierung besteht darin, dass infolge der auch in den Aminosäureseguenzen vorhandenen Amino- und Carboxylgruppen, Thiolfunktionen, Imidazolfunktionen und Guanidofunktionen keine einheitliche Immobiliserung bezogen auf die Orientierung der
Aminosäuresequenz auf der Molekül-Gabel zu erzielen ist. Eine zweite Funktionalisierung bietet den Zugang zu weiteren chemoselektiven Reaktionen, um eine gerichtete Immobilisierung zu erreichen.
Für diese zweite Funktionalisierung eignen sich all jene Verbindungen, die sich durch ein Vorhandensein von nicht¬ proteinogenen funktionellen Gruppen auszeichnen. Beispielhaft seien ohne als Einschränkung verstanden zu werden die folgenden Verbindungen genannt: Maleinimido-Verbindungen wie Maleinimido-amine oder Maleinimido-carbonsäuren; alpha-Halo- Ketone wie Brombrenztraubensäure oder 4-Carboxy-alpha-Brom- Acetophenon, alpha-Isothiocyanato-Ketone wie 4-Carboxy-alpha- Isothiocyanato-Acetophenon, Aldehyde wie Carboxybenzaldehyd, Ketone wie Lävulinsäure, Thiosemicarbazide, Thioamide wie Bernsteinsäuremonothioamid, alpha-Brom-Carbonsäuren wie Bromessigsäure, Hydrazine wie 4-Hydrazinobenzoesäure, O- Alkylhydroxylamine wie Amino-oxy-essigsäure, und Hydrazide wie Glutarsäuremonohydrazid.
Als weitere Maßnahme ist bei der Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sein, dass diejenigen Stellen oder Bereiche der Oberfläche, die nicht mit einer Aminosäuresequenzgruppe versehen sind, blockiert sind. Durch die Blockierung wird gewährleistet, dass während oder nach der chemoselektiven Reaktion der Aminσsäuresequenzen mit den funktionalisierten Molekül-Gabeln noch nicht umgesetzte, aber noch reaktive Gruppierungen oder Gruppen auf der Molekül-Gabel bzw. Oberfläche inaktiviert
werden. Diese Blockierungsreaktion ist notwendig, da sonst die zugesetzten Proteine oder andere Bestandteile der eingesetzten biologischen Probe unspezifisch mit diesen, noch nicht blockierten, reaktiven Gruppen reagieren und damit eventuell für ein großes Hintergrundsignal sorgen können. Solche unspezifischen Reaktionen mit Oberflächen sind eine häufige Ursache für ungünstige Signal-Rausch-Verhältnisse bei biochemischen Analysen. Für dieses Blockieren eignen sich solche Verbindungen, die sterisch nicht anspruchsvoll sind, sehr gut mit den zu blockierenden Gruppen reagieren und möglichst günstige Oberflächeneigenschaften generieren. Die Auswahl dieser Verbindungen wird in Abhängigkeit von der Art der Probe bzw. des Wechselwirkungspartners, der mit einer der Aminosäureseguenzgruppe in Wechselwirkung tritt, abhängen.
Die Verbindung ist bevorzugt hydrophil ausgestaltet, wenn die eingesetzten Proteine bevorzugt an hydrophoben Oberflächen unspezifisch binden und hydrophob, wenn die eingesetzten Proben bevorzugt an hydrophilen Oberflächen unspezifisch bindet. So ist es dem Fachmann bekannt, dass ein Biomolekül, wie zum Beispiel ein Protein, eine dreidimensionale, genau definierte Struktur für die korrekte biologische Funktion benötigt. Diese Tertiärstruktur ist deutlich von der Umgebung abhängig. So besitzt ein Protein in Wasser, einem hydrophilen Lösungsmittel, die Tendenz, alle oder besser gesagt möglichst viele hydrophobe Gruppierungen im Inneren zu verbergen.
Gelangt ein solches Protein in eine mehr hydrophobe Umgebung (hydrophobe Oberfläche), kann es deshalb zum Um- bzw. Auffalten des Proteins und damit zur Inaktivierung kommen. Auf der anderen Seite sind Proteine bekannt, die in ihrer natürlichen Vorkommensweise innerhalb von (hydrophoben) Biomembranen vorliegen. Solche Proteine würden sich beim Inkontaktkommen mit einer hydrophilen Oberfläche umfalten und
dabei denaturieren bzw. inaktiviert werden. In einem solchen Fall ist eine hydrophobe Oberfläche wünschenswert.
Die Bestandteile der Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Aminosäuren, die bevorzugterweise ausgewählt sind aus der Gruppe, die L- und D- Aminosäuren umfasst. Weiterhin sind die Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe die natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren umfasst. Eine bevorzugte Gruppe innerhalb einer jeden der vorstehenden Gruppen von Aminosäuren sind die entsprechenden alpha-Aminosäuren. Die Aminosäuresequenzen bestehen beispielsweise aus einer Abfolge von Aminosäuren aus einer jeden beliebigen der vorstehenden Gruppe. So liegt beispielsweise eine Kombination aus D- und L-Aminosäuren im Umfang der Erfindung ebenso wie Aminosäuresequenzen, die entweder ausschließlich aus D- oder aus L- Aminosäuren bestehen. Die Bestandteile der Aminosäuresequenzen können darüberhinaus auch andere Moleküle umfassen als Aminosäuren Beispiele hierfür sind Thioxo-Aminosäuren, Hydroxy-Säuren, Mercapto-Säuren, Dicarbonsäuren, Diamine, Dithioxocarbonsäuren, Säuren und Amine. Eine weitere Form von derivatisierten Aminosäuresequenzen sind die sogenannten PNAs (engl, peptide nucleic acids)
Die Dichte der Aminosäuresequenzgruppen beträgt l/cm2 bis 1000/cm2, wobei die Dichte bevorzugt l/cm2 bis 500/cm2 und ganz besonders bevorzugt l/cm2 bis 200/cm2 beträgt. Derartige Dichten von distinkten Orten auf einer Oberfläche, die jeweils eine Aminosäuresequenzgruppen enthalten, können unter Verwendung verschiedener Techniken erreicht werden, so beispielsweise mit piezoelektrisch betriebenen Pipettier- Robotern, mit feinen Nadeln aus verschiedenen Materialien wie Polypropylen, Edelstahl oder Wolfram bzw. entsprechender Legierungen, mit sogenannten „Pin-tools", die entweder
geschlitzte Nadeln darstellen oder aufgebaut sind aus einem Ring, der die zu applizierende Substanzmischung enthält, und einer Nadel, die durch die in diesem Ring enthaltene Substanzmischung hindurch diese auf der entsprechenden Oberfläche absetzt. Aber auch mit einer motorgetriebenen
Spritze verbundene Kapillaren sind dafür geeignet (Spotter). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die zu immobilisierenden Aminosäuresequenzen durch geeignete Stempelchen aufzubringen.
Aber auch das Auftragen der zu immobilisierenden
Aminosäuresequenzen mittels geeigneter Pipetten bzw. sogenannter Multipetten per Hand ist möglich. Weiterhin ist es möglich, die oben angegebenen Dichten von distinkten Orten durch die direkte in situ Synthese der Aminosäuresequenzen auf den Molekül-Gabeln der Oberfläche zu erzeugen. (M.
Stankova et al. 1994, Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul et al.; 2000, Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh et al.; 2000, Biopolymer. , 55, 188-206, R.Frank, 1992, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F. et al., J., 2001, Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900, S.P.A. Fodor et al. ; 1991, Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, J. Comb. Chem., 2, 355-360).
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung und deren verschiedenen Verwendungen und Anwendungen ist vorgesehen, dass die verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen aus zwei verschiedenen Sequenzen bestehen und das eine dieser Sequenzen in den verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen identisch ist (Fig. 7). Oder aber, es liegen zwei chemisch voneinander verschiedene Sequenzen
vor, wie zB eine Nukleinsäuresequenz und eine Aminosäuresequenz etc. Die Summe aller zweiten (nicht identischen) Sequenzen stellt im Falle von
Aminosäuresequenzen überlappende Peptide dar, die die gesamte Primärstruktur eines Proteins abdecken.
Der Nachweis darüber, dass innerhalb einer oder mehrerer der verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen ein Bindungsereignis erfolgt ist, kann dabei unter Verwendung von verschiedenen Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. So ist es möglich, eine Wechselwirkung zwischen unterschiedlichen
Aminosäuresequenzen-Derivaten durch Änderung der Fluoreszenz zu verfolgen. Prinzipiell können alle Reaktionen und physikalischen Phänomene, die abstands-sensitiv sind, zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen Aminosäuresequenzen innerhalb einer Aminosäuresequenz-Gruppe benutzt werden.
Beispiel für solche Reaktionen und physikalischen Phänomene sind Fluoreszenz-Energie-Resonanz-Transfer (FRET), Dexter- Transfer, Elektronen-Spin-Resonanz, Magnetische-Kern-Spin- Resonanz (NMR) , besonders 19F-NMR und Lichtblitz-induzierte Radikalreaktionen.
Alternativ können für Nachweis darüber, dass innerhalb einer oder mehrerer der verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen ein Bindungsereignis stattgefunden hat, und den Aminosäuresequenzen HilfStrukturen dergestalt angebracht sein, dass nur im Fall einer Wechselwirkung zwischen den
Aminosäuresequenzen einer Aminosäuresequenzgruppe sich eine neue Struktur aus den über die
Aminosäuresequenzwechselwirkungen in Kontakt gebrachten Hilfsstrukturen bildet, die wiederum selektiv nachweisbar ist.
Solch eine Struktur kann eine dem Fachmann als diskontinuierliches Epitop bekannte Struktur sein, die
selektiv durch Bindung geeigneter Antikörpern nachgewiesen werden kann. Andererseits können diese Hilfsstrukturen Elemente sein, die, unter gewissen Bedingungen, nur dann, wenn eine Wechselwirkung zwischen den Aminosäuresequenzen einer Aminosäuresequenzgruppe stattfindet, zur Dimerisierung bzw. Oligomerisierung neigt. Beispiele für solche Hilfstrukturen sind komplementäre DNA bzw. RNA, bzw. PNA Stränge. Weitere Beispiele für solche Hilfstrukturen sind kurze Oligo-Prolin-Sequenzen, von denen dem Fachmann bekannt ist, dass diese bei einer entsprechenden Vor-Orientierung eine sogenannte Polyprolin- bzw. Tripel-Helix ausbilden, die wiederum jeweils ein spezifisches CD-Signal erzeugen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, Substanzen zu suchen, die die Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere inhibieren können. Dazu wird nach Kontaktierung der Anordnung mit einem Reagenz, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Wirkstoffe, potentiellen Wirkstoffe, organischen Moleküle und Naturstoffe, die Änderung eines Signals, dass sich durch eines der oben beschriebenen Nachweisverfahren ergibt, ausgelesen.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind aus den beigefügten Figuren ersichtlich. Es versteht sich von selbst, dass die vorliegende Erfindung nicht nur auf die im Einzelnen offenbarten Merkmale beschränkt ist, sondern auch auf eine beliebige Kombination der vorstehend erläuterten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale.
Fig.l zeigt den schematischen Aufbau einer Molekül-Gabel, die einerseits auf einer Trägeroberfläche immobilisiert ist und die andererseits zwei verschiedenen Biopolymersequenzen trägt,
Fig. 2 zeigt schematisch die Möglichkeiten für Wechselwirkungen von zwei verschiedenen Biopolymeren, die über eine binäre Molekül-Gabel auf einer Oberfläche immobilisiert sind,
Fig. 3 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen,
Fig. 4 zeigt schematisch die Vorgehensweise für die Beladung einer binären Molekül-Gabel mit zwei verschiedenen Aminosäuresequenzen durch aufeinanderfolgende chemoselektive
Immobilisierungsreaktionen.
Fig. 5 zeigt die chemische Struktur der Beispiel-Molekül- Gabel MGl,
Fig. 6 zeigt die chemische Struktur der Beispiel-Molekül- Gabel MG2,
Fig. 7 zeigt eine Darstellung einer besonderen Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 8 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Beispiel-Molekül-
Gabel MGl.
Fig. 9 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II
Interaktion unter Verwendung der Beispiel-Molekül- Gabel MG2.
Fig.10 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II
Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2 an aminofunktionalisierten APEG-Amino-Polypropylen- Oberflächen
Fig. 11 zeigt die Kartierung der Länge der
Streptavidin/Strep-tag II Interaktionsbereiche unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2 und der in Fig. 7 gezeigten besonderen Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 12 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Inhibierung mit Naturstoff Biotin.
Fig. 13 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle des Raf-Peptides (RQRSTpSTPNV) am 14-3-3 Protein.
Fig. 14 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle des mT- Peptides (ARSHpSYPA) am 14-3-3 Protein.
Fig. 15 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle der FKBP12/FAP48 Interaktion.
Fig. 16 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle der FKBP12/EGF-Rezeptor Interaktion.
Fig. 17 zeigt die Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Strep- tag II Interaktionen unter Verwendung des Naturstoffes Biotin und seiner Derivate.
In Figur 1 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 gezeigt, bei dem zwei verschiedene Biopolymersequenzen 101 und 102 über eine binäre Molekül-Gabel 103 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 104 immobilisiert sind.
In Figur 2 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Anordnung 200 gezeigt, wobei in Figur 2 A zwei nicht miteinander interagierende Biopolymersequenzen 201 und 202 über eine binäre Molekül-Gabel 203 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 204 immobilisiert sind. Figur 2 B ist die mögliche Interaktion gleicher Biopolymersequenzen 208, 209, die auf verschiedenen, räumlich benachbarten Molekül-Gabeln 205, 206 immobilisiert sind, schematisch gezeigt. In Figur 2C2 ist die Interaktion verschiedener Biopolymersequenzen 213, 214, 215, 216, die auf verschiedenen, räumlich benachbarten Molekül-Gabeln 218, 219 immobilisiert sind, schematisch gezeigt. Figur 2Cl zeigt außerdem die Interaktion von zwei verschiedenen Biopolymersequenzen 211, 212, die auf einer Molekül-Gabel immobilisiert sind. Dabei ist es für den Fachmann offensichtlich, dass der Anteil der Fälle B und C2 in großem Ausmaß von der Dichte der beladenen Molekül-Gabeln auf der Trägeroberfläche abhängig ist.
Figur 3 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen nach dem Stand der Technik: A) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und Amino-oxy-Verbindungen reagieren zu Oximen, B) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und Thiosemicarbazide reagieren zu Thiosemicarbazonen, C) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und Hydrazide reagieren zu Hydrazonen, D) Aldehyde (R4=H) oder Ketone (R4 nicht H) und 1,2-Aminothiole reagieren zu Thiazolinen (X=S) bzw. 1,2-Aminoalkohole zu Oxazolinen (X=O) bzw. 1,2-Diamine
reagieren zu Imidazolinen (X=NH), E) Thiocarboxylate und alpha-Halocarbonyle reagieren zu Thioestern, F) Thioester und ß-Aminothiole reagieren zu ß-Mercaptoamiden, G) Mercaptane und Maleinimide reagieren zu Sucσinimiden.
Der Rest R1 stellt dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen dar und die Reste R4-R5 stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C^^-Alkyl, C3-20-
Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1-12- Alkyl, C3_12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C1-6-Alkyl, C3_6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C2_20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-20-Alkyl-O-C2_20-alkenyl, C1-20(- 0/S-C2-20)2_20alkenyl, Aryl-C2_20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl- C2.20-alkenyl, C3_20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2_12-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (-O/S-C2.12)2_12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-
Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (-0/S-C2-8)2-8alkenyl- Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C2-20- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-20 (-0/S-C2-20)2_ 20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-12- Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-12 (-0/S-C2-12J2, 12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C1-6 (- 0/S-C2-8)2_8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C3.40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C3-15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-,
Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl- Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono- bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3- 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5
Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5,6 und 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.
Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, lod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
In Figur 4 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 400 gezeigt, bei der zwei verschiedene Biopolymersequenzen 403, 404 über eine binäre Molekül-Gabel 401 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 405 durch dem Fachmann an sich bekannt und in Figur 3 erläuterte chemoselektive Reaktionen immobilisiert werden. Dabei wird zuerst die erste Biopolymersequenz 403 durch eine chemoselektive Immobilisierungsreaktion unter Ausbildung
einer chemischen Bindung auf der Molekül-Gabel verankert (Reaktionsschritt A). In einer nachfolgenden Reaktion B wird die zweite Biopolymersequenz 404 durch eine chemoselektive Immobilisierungsreaktion/ die sich bevorzugterweise von der ersten Immobilisierungs-Reaktion unterscheidet, unter
Ausbildung einer chemischen Bindung 407 ebenfalls auf der Molekül-Gabel 401 verankert. Die dadurch gebildete, vollständig beladene, binäre Molekül-Gabel 401 stellt eine Ausführungsform der Erfindung vor.
In Figur 5 ist die Struktur der Molekül-Gabel MGl gezeigt, die über zwei ß-Alanin-Moleküle als Abstandhalter mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist. Dabei stellen Fmoc und Dde dem Fachmann bekannte Schutzgruppen dar, die nach selektiver Entfernung die Beladung der Molekül-Gabel mit entsprechenden Biomolekülen erlauben.
In Figur 6 ist die Struktur der Molekül-Gabel MG2 gezeigt, die über zwei ß-Alanin-Moleküle als Abstandhalter mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist. Dabei stellen Fmoc und Dde dem Fachmann bekannt Schutzgruppen dar, die nach selektiver Entfernung die Beladung der Molekül-Gabel mit entsprechenden Biomolekülen erlauben.
In Figur 7 ist eine besondere Ausführungsform 700 der Erfindung unter Nutzung binärer Molekül-Gabeln gezeigt. Dabei wird auf einer Seite der Molekül-Gabel 701, 702, 703 die gleiche Biopolymersequenz 704 entweder immobilisiert oder schrittweise synthetisiert (schwarze Kugeln entsprechen den Biomonomeren; die jeweils linke Biopolymersequenz ist in diesem Beispiel identisch). Auf der zweiten Seite der Molekül-Gabel werden Biopolymerteilsequenzen 705, 706, 707, z. B. Peptide, entweder immobilisiert oder schrittweise synthetisiert, die die Sequenz eines in der Natur vorkommenden Biopolymers, z. B. eines Proteins, als
überlappende Biopolymerteilstücke darstellen. Dabei kann die vollständige Sequenz oder aber auch nur ein oder mehrere Teilbereiche der Sequenz durch die Gesamtheit der Teilsequenzstücke abgebildet werden. Im gezeigten Beispiel wird die gewünschte Biopolymersequenz 705, 706, 707 durch überlappende trimere Teilsequenzen mit zwei überlappenden Biomonomeren dargestellt. Selbstverständlich sind verschiedenen Überlappungsgrade, auch ein Überlappungsgrad von Null = keine Überlappung, möglich, die auch wiederum von der Gesamtlänge der Teilsequenz abhängen. Wenn Proteine als Biopolymersequenzen mittels überlappender Teilsequenzen dargestellt werden, ist die Gesamtheit der Teilsequenzen dem Fachmann als Peptid-Scan bekannt. In der vorliegenden Figur 7 liegt also die Besonderheit darin, daß sich einerseits alle binären Molekül-Gabeln 701, 702, 703 in einem Molekül gleichen, aber mit der zweiten Hälfte 705, 706, 707 einen Biopolymer-Scan bilden.
In Figur 8 sind die Interaktionen von 50 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden gezeigt, die die Streptavidin- Sequenz repräsentieren und dem Strep-Tag II Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MGl mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
A) Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Dde- Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide mit einer Überlappung von 9 Aminosäuren synthetisiert, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der
Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. B) Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Fmoc-Seite synthetisiert. An der Dde-Seite wurden überlappende 12mere Peptide mit einer Überlappung von 9 Aminosäuren synthetisiert, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar.
Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 9 zeigt die Interaktionen in 75 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden überlappenden Dodekapeptiden, die die
Streptavidin-Sequenz repräsentieren und Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der
Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die Streptavidin- Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 10 zeigt die Interaktionen in 75 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül- Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte APEG-Amino- Polypropylen-oberflache wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Strep- tag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc- Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2- Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 11 zeigt die Interaktionen in Peptidpaaren Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden längenvariierten Peptiden, die die
Streptavidin-Sequenz Arg59-AlalOO repräsentieren und Strep- Tag II-Peptid. Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde
an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere bis βmere Peptide die mit einem 2- Aminosäure-shift die Streptavidin-Sequenz Arg59-Alal00 überspannen, synthetisiert. Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 50 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot- Analyse und Immundetektion analysiert.
Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren und damit das minimale Bindungsmotiv repräsentieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 12 zeigt die durch Biotin blockierte Bindung von Streptavidin an Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MGl mit Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung eines vorgebildeten Biotin/Streptavidin-Komplexes (60 μg Streptavidin/6μg Biotin, Ih Vorinkubation) gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. A) An der MGl wurde nur jeweils eine Seite mit Oligopeptiden des Streptavidin-Scans synthetisiert. Die andere Seite wurde durch eine Acetylierungsreaktion modifiziert. B) An der MGl wurde nur jeweils eine Seite mit Oligopeptiden des Streptavidin-Scans synthetisiert und an der anderen Seite das Strep-Tag II-Peptid synthetisiert. Die so erhaltene Ausführungsform entspricht der im Fig. 7 aufgezeigten Variante der Erfindung.
Figur 13 zeigt die Interaktionen in 80 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die Sequenz des 14-3-3 Proteins repräsentieren und dem Raf-Peptid RQRSTpSTPNV (ps = phosphoSerin) . Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit
Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von
150 nM 14-3-3 Protein gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock Raf-Peptid wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3- Protein-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die 14-3-3-Protein- Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 14 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 120 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dekapeptiden, die die Sequenz des 14-3-3 Proteins repräsentieren und ARSHpSYPA (mT peptide; pS = phosphoSerin) . Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM 14-3-3 Protein gefolgt von Westernblot- Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock mT peptide wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende lOmere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3 - Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio- Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit
einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die 14-3-3-Protein-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
Figur 15 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 48 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die FKBP12-Sequenz repräsentieren und von FAP48 abgeleiteten Peptiden, die mit FKBP12 interagieren.
A) Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Acetyl-KCPLLTAQFFEQS von FAP (Lys217-Ser229) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. B) Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Ac- LSPLYLLQFNMGH von FAP (Leu307-His319) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12- Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-
Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar.
In beiden Experimenten wurde als Interaktionsregion im FKBP12 die Region Met21-Gluβ9 festgestellt.
Figur 16 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 48 Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die FKBP12-Sequenz repräsentieren und von der cytoplasmatischen Domäne des EGF-Rezeptors abgeleiteten Peptiden,- die mit FKBP12 interagieren.
Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Acetyl-PHVCRLLGICLTS vom EGF-Rezeptor (Pro748-Ser760) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12- Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio- Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Als Interaktionsregion im FKBP12 wurde die Region Met21-Ser67 festgestellt.
Figur 17 zeigt die Kartierung der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion mittels 75 Peptidpaare, die aus überlappenden Dodekapeptiden, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und dem Strep-Tag II Peptid bestehen. Gezeigt ist das Auslesen des Signals über Fluoreszenz und die Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Strep-tag II Interaktionen unter Verwendung des Naturstoffes Biotin und seiner Derivate.
A) Die chemische Struktur der Beispiel-Molekülgabel MG3. B) Die Zellulose wurde über Molekül-Gabeln der Form MG3 mit Peptidpaaren entsprechend der in Fig. 7 gezeigten
Ausführungsform modifiziert. Dabei wurde das an der Fmoc- Seite befindliche Peptid mit einem Dansyl-Rest und das an der Aloe-Seite befindliche Peptid mit Fluorescein markiert. Die Analyse erfolgte über Detektion des Emissionslichtes bei 510-530 nm nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm mittels des Raytest DIANA Chemiluminescence Detektionssystemes. C) Die wie unter B) beschrieben modifizierte Membran wurde vor der Analyse 30 min in einer Lösung, die 0.5 mM Biotin, 1 mM 2-Iminobiotin (Ka=8.0*106 M"1) bzw. Diaminobiotin (G.O. Reznik, S. Vajda, T. Sano, CR. Cantor; 1998, A streptavidin mutant with altered ligand- binding speeificity, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 13525- 13530) enthielt, inkubiert.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel (MGl, Fig. 5) an aminofunktionalisierte Zellulose-Oberflächen
Die Aminosäurederivate Fmoc-Lys(Dde)-OH und Boc-Lys(Fmoc)-OH wurden in 0.3 M in DMF gelöst und durch Zugabe von einem
Äquivalent PyBOP unter Anwesenheit von DIEA (10%, v/v) aktiviert. Fmoc-Lys(Dde)-OH wurde an den (ß-Ala)2 Spacer der aminofunktionalisierten Zelluloseoberfläche in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der Nα- Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde Boc-Lys(Fmoc)-OH in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der Nα- Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde mit DMF (3 x 10 min) und Methanol (2 x 5 min) gewaschen und die Zellulose getrocknet. Die jeweils erste Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) durchgeführt.
Nach der Beendigung der Synthese der ersten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Anschließend wurde die Dde-Schutzgruppe an der Molekül-Gabel unter Verwendung von 2 % Hydrazin in DMF für 3 x 3 min entfernt. Die Synthese der zweiten Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch durchgeführt und nach der Beendigung der Synthese der zweiten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von 50 % TFA/DCM mit 2 % Triisopropylsilan und 3 % Wasser für 3 h bei RT unter leichtem Schütteln. Anschließend wurde die Zellulose jeweils zweimal 5 min mit DCM, dreimal 15 min mit DMF und zweimal 10 min mit MeOH gewaschen, getrocknet und zur weiteren Verwendung bei -2O0C gelagert.
Beispiel 2. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel (MG2, Fig 6) an aminofunktionalisierte Zellulose-Oberflächen.
Zuerst wurden die durch PyBOP aktivierten Aminosäurederivate Fmoc-Lys(Dde)-OH und Fmoc-Glu(OtBu)-OH sequentiell an Rink- Amid- MBHA-Harz in DMF über Fmoc-basierende
Peptidsynthesestrategie gekoppelt (Chan, W.C. and White, P.D. 2000, Fields, G.B. and Noble, R.L. 1990). Anschließend wurde Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH2 mittels 95 % TFA, 2 % Triisopropylsilan, 3 % Wasser für 1 h bei RT vom Polymer freigesetzt. Das gereinigte Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH2 (0.3 M) wurde an der _-Carboxylgruppe von GIu durch 0.3 M PyBOP in DMF mit DIEA (10% v/v) aktiviert and an den (B-AIa)2 Spacer der aminofunktionalisierten Zelluloseoberfläche in DMF dreimal für je 20 min gekoppelt. Die Abspaltung der Nα- Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde mit DMF (3 x 10 min) und Methanol (2 x 5 min) gewaschen und die Zellulose getrocknet. Anschließend erfolgte die zweimalige Kopplung von mit 0.3 M PyBOP aktiviertem Boc-Lys(Fmoc)-OH (0.3 M) in DMF mit DIEA (10% v/v) .
Die Abspaltung der Nα- Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Die jeweils erste Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) durchgeführt.
Nach der Beendigung der Synthese der ersten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min
acetyliert. Anschließend wurde die Dde-Schutzgruppe an der Molekül-Gabel unter Verwendung von 2 % Hydrazin in DMF für 3 x 3 min entfernt. Die Synthese der zweiten Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch durchgeführt und nach der Beendigung der Synthese der zweiten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von 50 % TFA/DCM mit 2 % Triisopropylsilan und 3 % Wasser für 3 h bei RT unter leichtem Schütteln. Anschließend wurde die Zellulose jeweils zweimal 5 min mit DCM, dreimal 15 min mit DMF und zweimal 10 min mit MeOH gewaschen, getrocknet und zur weiteren Verwendung bei —20°C gelagert.
Beispiel 3. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel an aminofunktionalisierte APEG-Ämino- Polypropylen-Oberflachen.
Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH2 wurde wie in Beispiel 2 erläutert hergestellt und durch PyBOP aktiviert. Anschließend erfolgt die Kopplung an den (ß-Ala)2 Spacer der APEG-Amino- Polypropylen-oberflachen (AMIS Scientific Products GmbH, Germany) . Die weitere Synthese erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 4. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MGl.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Peptidpaare an MGl synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite
wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3- Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Seguenz überspannen, synthetisiert (Fig 8A) . Parallel dazu wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, Peptidpaare an MGl synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Fmoc- Seite synthetisiert wurde. An der Dde-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert (Fig. 8B). Es resultierten jeweils 50 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Strep-tag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
100 nM Streptavidin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH
7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (40C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM
Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min,
zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) . Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 8)
Beispiel 5. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2- Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 75 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül- Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Strep- tag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann. 100 nM Streptavidin in MP- Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 40C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein
wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül- Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster
Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min) . Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) .
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 9)
Analog dazu wurde mittels Immobilisierung von Peptidpaaren über MG2 an aminofunktionalisierte APEG-Amino-Polypropylen- oberflächen die Streptavidin/Strep-tag II Interaktion analysiert. (Fig. 10)
Beispiel 6. Kartierung der Länge der Streptavidin/Strep-tag II Interaktionsbereiche unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2
wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II
an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden 6mere bis 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure- shift die Sequenz des Streptavidin-Fragmentes Arg59-Ala100 überspannen, synthetisiert. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris- HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül- Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Strep- tag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
50 nM Streptavidin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min) . Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) .
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein
GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist,, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 11)
Beispiel 7. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Inhibierung mit Biotin
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag Il an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2- Aminosäure-shift, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. βOμg Streptavidin wurde mit 6 μg Biotin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl,
6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) 60 min vorinkubiert und anschließend über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (40C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM
Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min) . Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und
Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) .
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad), (vgl. Fig. 12).
Beispiel 8. Kartierung der Interaktionsstelle des Raf- Peptides RQRSTpSTPNV am 14-3-3 Protein
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock RQRSTpSTPNV (Raf-Peptid) an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 80 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch 14-3-3 ζ/δ als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Raf peptide, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
150 nM 14-3-3 Protein in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (40C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde
zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von 14- 3-3 Protein erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) .
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von 14-3-3 Protein festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von 14-3-3 Protein zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 13)
Beispiel 9. Kartierung der Interaktionsstelle des ARSHpSYPA (mT peptide) am 14-3-3 Protein
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock ARSHpSYPA (mT peptide) an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc- Seite wurden überlappende lOmere Peptide die mit einem 2- Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3-Seguenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 120 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch 14-3-3 ζ/δ als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit mT peptide, welches
nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM 14-3-3 Protein in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 40C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (40C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von 14- 3-3 Protein erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia) .
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von 14-3-3 ζ/δ festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von 14-3-3 Protein zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 14).
Beispiel 10. Analyse der FKBP12/FAP48 Interaktion
Zunächst wurden mittels klassischer SPOT-Technologie und Proteininteraktionsanalyse die FKBP12-Bindungsstellen in
FAP48 kartiert. Dabei wurden zwei Sequenzbereiche in FAP48 gefunden, die eine Interaktion zu FKBPl2 vermitteln, FAP48 Lys217-Ser229 (KCPLLTAQFFEQS) und FAP48 Leu307-His319 (LSPLYLLQFNMGH) .
Anschließend wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben,
Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei die konstanten Peptidblöcke Ac-KCPLLTAQFFEQS bzw. Ac-LSPLYLLQFNMGH an der Dde-Seite synthetisiert wurden. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten jeweils 48 individuelle Spots.
Nach der Synthese wurde die trockene, über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch FKBP12 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit dem entsprechenden FAP48-Peptid, welches nicht in einer Peptid-Peptid- Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM FKBP12 in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 40C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf
Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM
Tris-HCl, pH 8.3, 150 itiM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min) . Die Detektion von FKBP12 erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von FKBP12 festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von FKBP12 zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 15A und 15B).
Beispiel 11. Analyse der Interaktion zwischen FKBP12 und der cytosolischen Domäne des EGF-Rezeptors (Aminosäurereste 645- 1186)
Zunächst wurden mittels klassischer SPOT-Technologie und Proteininteraktionsanalyse die FKBP12-Bindungsstellen in der cytosolischen Domäne des EGF-Rezeptors (EGFR) kartiert. Dabei wurden fünf Sequenzbereiche in EGFR gefunden, die eine Interaktion zu FKBP12 vermitteln. Unter diesen Seguenzbereichen wurde mit PHVCRLLGICLTS (EGFR Pro748-Ser760) die Sequenz eines besonders stark interagierenden Peptides ausgewählt.
Anschließend wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Ac- PHVCRLLGICLTS an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz
überspannen, synthetisiert. Es resultierten jeweils 48 individuelle Spots.
Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch FKBP12 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit dem entsprechenden
EGFR-Peptid, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM FKBP12 in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20, 5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf
Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm2 für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von FKBP12 erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine
Bindung von FKBP12 festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von FKBPl2 zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten, (vgl. Fig. 16)
Beispiel 12. Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Strep-tag II Interaktionen unter Verwendung von Biotin und/oder seiner Derivate.
Peptidpaare wurden an MG3 (Fig. 17A) synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Aloe-Seite synthetisiert und mit einem Fluoresceinrest markiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert und mit einem Dansylrest markiert. Es resultierten jeweils 75 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit MeOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 inM KCl) gewaschen. Die Analyse erfolgte über Detektion des Emissionslichtes bei 510-530 nm nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm mittels des Raytest DIANA Chemiluminescence Detektionssystemes. (Fig 17B) Es ergaben sich Unterschiede im Fluoreszenzverhalten der Spots mit unterschiedlichen Peptidpaaren, bei interagierenden Peptidpaaren wurde eine erhöhte Fluoreszenzemission festgestellt.
Zur Inhibierung der Interaktion der Peptidpaare wurde die modifizierte Membran vor der Analyse mit hochaffinen, niedrigaffinen und nichtaffinen Wirkstoff mit ähnlichen chemischen Eigenschaften behandelt. In diesem Beispiel erfolgte die Inkubation für 30 min in einer Lösung, die 0.5 mM Biotin, 1 mM 2-Iminobiotin (Ka=8.0*106 M"1) bzw.
Diaminobiotin (G.O. Reznik, S. Vajda, T. Sano, CR. Cantor; 1998, A streptavidin mutant with altered ligand-binding speσificity, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 13525-13530) enthielt (Fig. 17 C). Nach der Behandlung mit einem Wirkstoff wurde die Zellulose regeneriert durch Behandlung mit Puffer A (Urea 48 g, SDS 1 g, Merkaptoethanol 100 μl, Wasser auf 100 ml auffüllen) und Puffer B (Wasser 40 ml, EtOH 50 ml, Essigsäure 10 ml) Anschliessend erfolgte die Analyse der Fluoreszenzeigenschaften der Spots. Dabei wurde in Gegenwart des hochaffinen Inhibitors Biotin die Fluoreszenzemission der Spots herabgesetzt, alle Spots zeigten sehr ähnliches Fluoreszenzverhalten. In Gegenwart des niedrigaffinen Diaminobiotin war das Fluoreszenzverhalten sehr ähnlich zu dem ursprünglichen Fluoreszenzverhalten komplett ohne Wirkstoff. Das zeigt, dass in Gegenwart eines hochaffinen Wirkstoffes, aber nicht in Gegenwart eines niedrigaffinen Wirkstoffes eine Inhibierung der Interaktion stattfindet, (vgl. Fig. 17)
Claims
1. Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen umfassend einen Träger auf dem eine
Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind,
dadurch gekennzeichnet, dass an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine im wesentlichen gabelförmige Struktur aufweist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker drei reaktive Gruppen enthält.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker über eine reaktive Gruppe kovalent an die Trägeroberfläche gebunden ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle
Biopolymere sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere aus Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere ausgewählt sind aus Terpenen, Nukleinsäuresequenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid-Glycokonjugat-sequenzen.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die an einem Linker gebundenen Biopolymersequenzen durch einen Abstandshalter in einem definierten Abstand zueinander angeordnet sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Material des Trägers ausgewählt ist aus Glas, Keramik, Metallen und deren Legierungen, Zellulose, Chitin und synthetische Polymere.
10. Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren umfassend die Schritte:
a) des Bereitsteilens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
b) des Einsteilens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten voneinander unterschiedlichen Biopolymeren
c) des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei unterschiedlichen Biopolymeren hervorgerufenen Signals.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Biopolymere aus Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen und ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Terpene, Nukleinsäuresequenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid- Glycokonjugat-sequenzen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) die immobilisierten Biopolymere mit einem weiteren Molekül in-Kontakt-gebracht werden, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, die Proteine, Antikörper und Lektine, umfaßt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Wechselwirkung zwischen den immobilisierten Biopolymeren durch ein
Verfahren erfolgt, das die Anwesenheit des zugegebenen Moleküls anzeigt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, das das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradiographie, Plasmonresonanzspektroskopie,
Immunologie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Wechselwirkung direkt mittels eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisverfahren unterschiedliche Signale für unterschiedliche Abstände zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren ergibt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kern- Magnetische-Resonanz-Spektroskopie, Elektronen-Spin- Resonanz-Spektroskopie, CD-Spektroskopie, Massen- Spektrometrie, FT-Infrarot-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.
19. Verfahren nach Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Messung der Wechselwirkung ein Hilfsstoff zugegeben wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff eine deuterierte Verbindung ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung die Änderung der Austauschgeschwindigkeit von Amid-Deuteronen ermittelt.
22. Verfahren nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, das die Messung mit einem Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, vor der Messung der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere Aminosäuresequenzgruppen mit Licht geeigneter Frequenz und Intensität selektiv bestrahlt werden, wobei eine kovalente Bindung zwischen den wechselwirkenden Aminosäuresequenzen entsteht.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet dass die Wechselwirkung mit einem Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen- Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR- Spektroskopie umfasst.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) die immobilisierten Biopolymere mit einem Reagenz in Kontakt gebracht werden.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Wirkstoffe, potentielle Wirkstoffe, organische Moleküle und Naturstoffe umfasst.
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