DE102004033122A1

DE102004033122A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen

Info

Publication number: DE102004033122A1
Application number: DE102004033122A
Authority: DE
Inventors: Gunter Fischer; Cordelia Schiene-Fischer; Miroslav Malesevic; Mike Schutkowski
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-02-09
Also published as: EP1766402A2; CA2579414A1; AU2005261870A1; WO2006005519A2; WO2006005519A3; US20100009860A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen, umfassend einen Träger, auf dem eine Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind, wobei an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren, umfassend die Schritte des Bereitstellens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Einstellens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten Biopolymeren sowie des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei Biopolymeren hervorgerufenen Signals.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung umfassend eine Vielzahl von Biomolekülen, die auf der Oberfläche eines Substrats angeordnet sind, wobei die Biomoleküle paarweise beabstandet voneinander über einen Linker auf der Oberfläche immobilisiert sind. Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen.
Für ein vergleichendes Studium der molekularen Erkennung zwischen Biomolekülen der gleichen oder verschiedener Strukturklassen ist der Einsatz großer kombinatorischer Bibliotheken von auf einem Substrat immobilisierten Bindungspartnern der in Lösung angebotenen Biomoleküle von großem Vorteil.
Unter dem Begriff "Biomoleküle" versteht der Fachmann beispielsweise Verbindungen aus den Klassen der Nukleinsäuren und deren Derivate, Proteine, Peptide und Kohlenhydrate. Diese Verbindungsklassen können ebenso als „Biopolymere" bezeichnet werden
Dieses Prinzip der wechselseitigen molekularen Erkennung findet insbesondere beim gezielten Aufbau von Polynukleotiden aus Nukleosidbausteinen und/oder Oligonukleotidbausteinen Anwendung. Der gezielte Polynukleotidaufbau wiederum ist für die Herstellung von DNA Chips, die eine hohe Dichte („highdensity DNA-chip") von darauf angeordneten Polynukleotiden aufweisen von entscheidender Bedeutung.

DNA Chips, d.h. sogenannte Microarrays von Feldern auf einem Glas- oder Polymersubstrat immobilisierter DNA oder beliebig ausgewählter Oligonukleotide, die als Super-multiplex-Sonden für die molekulare Erkennung durch Hybridisierung fungieren, (S.P.A. Fodor, Science 277 (1997) 393, DNA Sequencing Massively Parallel Genomics) werden schon seit längerem beispielsweise in der Medizin und in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt

Neben Nukleinsäuren wurden Naturstoffe bzw. Bibliotheken davon, aber auch Anordnungen von Oligopeptiden und Proteinen auf derartige Chips aufgebracht. Als Trägermaterialien für diese Anordnungen wurden dabei neben den schon vorstehend erwähnten Materialien Zellulose, Glas, Polypropylen, Polyethylen Nitrozellulose, PTFE-Membranen und Spezialagar verwendet.

Mit der zunehmenden Bedeutung von Proteomics und deren biotechnologischen Anwendung rücken Peptide und Proteine in den Vordergrund des Interesses. Generell sind es Proteine, die nahezu alle biochemischen Reaktionen innerhalb und außerhalb der Zelle ermöglichen. Die Verwendung von Anordnungen von Nukleinsäuren, mit denen entweder die Messenger-RNA (mRNA), die durch in der Zelle gerade aktive Gene generiert wurden, oder aber DNA-Kopien dieser mRNA nachgewiesen werden, sind zwar von großer Bedeutung, jedoch ist die damit erhältliche Information aus einer Reihe von Gründen nicht ausreichend, um die Vorgänge sowohl intrazellulärer wie auch extrazellulärer Prozesse zu verstehen und hiervon im Rahmen verschiedener biotechnologischer Anwendungen Gebrauch zu machen. Ein Grund dafür besteht darin, dass die Menge an mRNA in einer Zelle oft nicht mit der entsprechenden, in der Zelle produzierten Proteinmenge korreliert. Außerdem können einmal hergestellte Proteine durch geringfügige chemische Modifikationen in der Zelle (post-translationale Modifikationen) erheblich in ihrer biologischen Funktion beeinflußt werden.

Somit besteht die Notwendigkeit, eine parallele Analyse der Bindungseigenschaften möglichst vieler Proteine durchzuführen. Eine derartige Analyse erlaubt es u. a., die sehr schnelle Kartierung der Bindungsstellen, welche wiederum eine wichtige Voraussetzung für das Design von Wissensbasierten Inhibitoren ist, oder die selektive Prüfung von Pharmaka bzw. Pharmaka-Kandidaten bzw. Wirkstoffen.

Es ist bekannt, beispielsweise Nukleinsäuren, Peptide bzw. Proteine auf verschiedenen Oberflächen zu immobilisieren, wie Glas (J. Robles et al.; 1999, Tetrahedron, 55, 13251-13264), Zellulose (D.R. Englebretsen, D.R.K. Harding; 1994, Pept. Res., 7, 322-326,), Nitrozellulose (S.J. Hawthorne, et al.; 1998, Anal. Biochem., 261, 131-138), PTFE-Membranen (T.G. Vargo et al.; 1995 J. Biomed. Mat. Res., 29, 767-778), Titanoxid (SJ. Xiaoet al.; 1997, J. Materials Science-Materials in Medicine, 8, 867-872), Siliziumoxid (T. Koyano et al.; 1996, Biotech. Progress., 12, 141-144) oder Gold (B.T. Houseman, M. Meksich; 1998, J. Org. Chem., 63, 7552-7555) oder direkt auf einer entsprechenden funktionalisierten oder nicht funktionalisierten Glasoberfläche (S.P.A. Fodor et al; 1991, Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, J. Comb. Chem., 2, 355-360) oder auf Zellulose (R.Frank, 1992, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited by: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F. et al. Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900) oder auf Polypropylen (M. Stankova et al.; 1994, Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul et al.; 2000, Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh et al.; 2000, Biopolymers, 55, 188-206) oder auf Chitin (W. Neugebauer et al.; 1996, Int. J. Pept. Prot. Res., 47, 269-275) oder auf Sepharose (W. Tegge, R. Frank, 1997, J. Peptides Res., 49, 355-362, R. Gast; 1999, Anal. Biochem., 276, 227-241) und anschließend wird die schrittweise Synthese der Peptide durchgeführt.

Jedoch ist eine parallele Analyse der Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen immobilisierten Biopolymeren, bzw. Biopolymersequenzen (vide infra), insbesondere von Nukleinsäuren, Zuckern, Peptiden bzw. Proteinen bislang nicht möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel für den parallelen Nachweis von Wechselwirkungen zwischen mindestens zwei verschiedenen Biopolymeren, wie zum Beispiel Peptiden, Nukleinsäuren (DNA, RNA, PLA etc), und deren Derivaten, bereitzustellen, das zum einen geeignet ist, in einem System mit hohem Durchsatz verwendet zu werden, und zum anderen nur ein geringes Probenvolumen benötigt. Dabei ist es insbesondere wünschenswert, dass ein derartiges Mittel im Gegensatz zu den Mitteln aus dem Stand der Technik, auch beispielsweise nur die aus den Sequenzendatenbanken verfügbare Information für die Kartierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen benötigt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem immobilisierten Biomolekül, insbesondere einem Biopolymer mit mindestens einem anderen, vom ersten verschiedenen, immobilisierten Biomolekül, bzw. Biopolymer und weiter ein Verfahren zur Bestimmung der Effektivität und Selektivität eines Wirkstoffes zur Verfügung zu stellen.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen umfassend einen Träger auf dem eine Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind, wobei an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind.

Bevorzugt weist der Linker eine im wesentlichen gabelförmige Struktur auf. Der Vorteil dieser gabelförmigen Struktur besteht in der Möglichkeit, Biomoleküle gezielt in unmittelbarer Nachbarschaft und gerichtet auf der Oberfläche zu positionieren, sowie je nach konkreter Ausgestaltung der gabelförmigen Struktur (der sogenannten „Molekülgabel") in einem definierten Abstand zueinander anzuordnen.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform enthält der Linker drei reaktive Gruppen und ist über eine dieser reaktiven Gruppe kovalent an die Trägeroberfläche gebunden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Biomoleküle Biopolymere, die ganz besonders bevorzugt aus regelmäßigen oder unregelmäßigen Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, die Biopolymere direkt aus den Monomerbausteinen auf der Oberfläche fixiert in-situ zu synthetisieren.

Vorzugsweise sind die Biopolymere ausgewählt aus Terpenen, Nukleinsäuresequenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid-Glycokonjugat-sequenzen.

Ganz besonders bevorzugt ist, daß die an einem Linker gebundenen Biopolymersequenzen durch einen Abstandshalter in einem definierten Abstand zueinander angeordnet sind. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, Biopolymersequenzen in bestimmten Abständen auch gegeneinander verschoben zu positionieren, da häufig Interaktionen von den korrekten Abständen der beteiligten chemischen Gruppierungen abhängen.

Das Material des Trägers ist bevorzugterweise ausgewählt aus Glas, Keramik, Metallen und deren Legierungen, Zellulose, Chitin und synthetische Polymere. Der Vorteil solcher Trägermaterialien besteht darin i)eine mechanisch feste planare Oberfläche zu bieten und ii) die Möglichkeit zur chemischen Modifizierbarkeit zu geben.

Weiter wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren gelöst umfassend die Schritte:

a) des Bereitstellens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
b) des Einstellens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten voneinander unterschiedlichen Biopolymeren
c) des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei unterschiedlichen Biopolymeren hervorgerufenen Signals

Es entsteht ein meßbares Signal, wenn sich mindestens zwei verschiedene immobilisierte Biomoleküle durch Wechselwirkungen räumlich sehr nahe kommen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung an Aminosäuresequenzen erfolgt. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der Möglichkeit, durch diese Wechselwirkungen Protein/Protein-Wechselwirkungen zu erfassen, die durch andere Untersuchungsmethoden schwer zugänglich sind. Weiterhin ist bei manchen Ausführungsformen vorgesehen, dass die Aminosäuresequenz mit fluoreszierenden Resten, wie z. B. der o-Aminobenzoesäure oder einem Fluoresceinrest modifiziert wird.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung durch das in-Kontakt-bringen der Vorrichtung mit einem weiteren Molekül erfolgt, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass in Folge mehrere verschiedene weitere Moleküle zugegeben werden können, so dass die gleiche Anordnung mit verschiedenen Nachweismethoden analysiert werden kann.

In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das die Anwesenheit des zugegebenen Moleküls anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradiographie, Plasmonresonanzspektroskopie, Immunologie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst. Ein Vorteil bei der Verwendung eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Erfassung der Wechselwirkungen.

Außerdem ist in noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung direkt erfolgt unter Nutzung eines Nachweisverfahrens, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, wie z. B. Peptiden, und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, wie z. B. Peptiden, zu unterscheiden. Der Vorteil des direkten Nachweises der Wechselwirkung besteht in der Unabhängigkeit von weiteren Nachweisreagenzien, die mit einer Wechselwirkung interferieren können.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung unter Nutzung eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass verschiedene Signale für unterschiedliche Abstände zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren ergibt.

In noch einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das die Abstandsänderung anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kern-Magnetische-Resonanz-Spektroskopie, Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie, CD-Spektroskopie, Massen-Spektrometrie, FT-Infrarot-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst. Ein Vorteil bei der Verwendung eines solchen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Erfassung der Wechselwirkungen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis der Wechselwirkung unter Nutzung eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass nach Zugabe mit Hilfsstoffen bevorzugt deuterierte verschiedene Signale für miteinander wechselwirkende, immobilisierte Biopolymere und nicht miteinander wechselwirkende, immobilisierte Biopolymere ergibt.

Bevorzugt erfolgt dabei der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren, das die Änderung der Austauschgeschwindigkeit von Amid-Deuteronen anzeigt und das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst.

Es ist weiter bevorzugt, dass der Nachweis der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch ein Verfahren erfolgt, das nach Bestrahlung der Aminosäuresequenzgruppen mit Licht geeigneter Frequenz und Intensität selektiv zu einer kovalenten Bindung zwischen den wechselwirkenden Aminosäuresequenzen führt und das Auslesen des entsprechenden Mess-Signals ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass eine Wechselwirkung stabil durch eine kovalente Verknüpfung fixiert wird und anschließend weiteren Untersuchungsmethoden, die spezifisch für stabil verknüpfte Verbindungen sind, zugänglich ist.

In noch einer bevorzugten weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Vorrichtung mit einem Reagenz kontaktiert wird, bevor die Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere durch eines der oben genannten Nachweisverfahren nachgewiesen wird.

Es ist weiter vorgesehen, dass die Vorrichtung mit einem Reagenz kontaktiert wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Wirkstoffe, potentielle Wirkstoffe, organische Moleküle und Naturstoffe umfaßt. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht in der gezielten Hochdurchsatz-tauglichen Suche nach Inhibitoren für Interaktionen zwischen Biopolymeren sogar in Abwesenheit beider Interaktionspartner in Substanz.

Die vorliegenden Erfindung wird nun anhand eines als nicht einschränkend verstandenen Beispiels, nämlich einer Vorrichtung mit auf einer Oberfläche immobilisierten Aminosäuresequenzgruppen, bevorzugt Aminosäuresequenzquartetts und ganz besonders bevorzugt Aminosäuresequenzpaaren noch näher im Detail beschrieben.

Es versteht sich, dass die nachstehenden Ausführungen für alle vorstehend erwähnten Biopolymer gelten. Insbesondere gilt dies natürlich auch, wenn an der erfindungsgemäßen sogenannten Molekülgabel in weiteren bevorzugten Ausführungsformen zwei unterschiedliche Biopolymere, zB. eine Nukleinsäuresequenz und eine Aminosäuresequenz, oder ein Zucker und eine Nukleinsäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz gebunden sind.

Erfindungsgemäß sind die Aminosäuresequenzen über eine erfindungsgemäße Molekül-Gabel (vgl. 4) auf der Oberfläche immobilisiert. Bevorzugt ist die Oberfläche eine planare Oberfläche. Damit können Wechselwirkungen bzw. Bindungsereignisse zwischen zwei oder mehreren der immobilisierten Aminosäuresequenzen nachgewiesen werden.

Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt es im Falle von Aminosäuresequenzen überraschenderweise, eine Protein-Protein-Wechselwirkung in eine Vielzahl von Peptid-Peptid-Wechselwirkungen zu zerlegen. Dabei ist besonders vorteilhaft, dass im Falle des direkten Nachweises der Wechselwirkung zwischen auf der Molekül-Gabel immobilisierten Aminosäuresequenzen in einem besonders bevorzugten Falle nur die Sequenzinformation zweier Proteine, nicht aber die Proteine in Substanz, notwendig sind, um die Wechselwirkungsflächen bzw. Bindungsstellen der beiden Proteine zu kartieren.

In diesem Fall werden die beiden wechselwirkenden Proteine A und B in Peptide, bevorzugt sogenannte überlappende Peptide, zerlegt. Anschließend werden alle Kombinationen, bevorzugt binären Kombinationen, der von den Proteinen A und B abgeleiteten Peptide entweder Schritt-für-Schritt direkt oder durch gerichtete Immobilisierung auf eine entsprechend gestaltete Molekül-Gabel aufgebracht.

Neben der Möglichkeit, dass die auf der Molekül-Gabel immobilisiereten Peptide nicht miteinander Wechselwirken (2A), gibt es die in 2B und 2C gezeigten Möglichkeiten für eine intramolekulare Wechselwirkung. Dabei sind erfindungsgemäß nur solche Wechselwirkungen von Interesse, bei denen Biopolymersequenzen, die entweder auf einer Molekül-Gabel (2C1) oder auf verschiedenen Molekül-Gabeln (2C2, gezeigt für eine binäre Molekül-Gabel) immobilisiert sind, in einer Form miteinander interagieren, die den Wechselwirkungen der jeweiligen nativen Proteine entsprechen.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung einer Vielzahl von Aminosäuresequenzgruppen, die über Molekül-Gabeln auf einer Oberfläche aufgebracht sind, ist die Oberfläche das Substrat, auf dem die Vielzahl von Aminosäuresequenzgruppen immobilisiert ist. Die Immobilisierung kann dabei so erfolgen, dass sie über eine kovalente Bindung erfolgt. Neben der kovalenten Immobilisierung sind jedoch andere Formen der Immobilisierung, insbesondere der adsorptiven Immobilisierung oder der Immobilisierung über spezifische Wechselwirkungssysteme möglich. In Bezug auf die Art der Immobilisierung besonders bevorzugt ist die Immobilisierung über eine kovalente Bindung, wobei hier eine chemoselektive Bindung der Aminosäuresequenz an die Oberfläche des Trägermaterials erfolgt. Hierzu können eine Reihe von Reaktionen verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als solche bekannt sind (Lemieux, G.A. & Bertozzi, C.R., 1998, TIBTECH, 16, 506-513, vgl. hierzu 3).

Grundsätzlich soll mit Blick auf die erforderliche gerichtete, chemoselektive Immobilisierung sichergestellt werden, dass unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen im wesentlichen nur eine spezielle Verbindung zwischen den Aminosäuresequenzen der Aminosäuresequenzgruppen und Bereichen der Molekül-Gabel auf der Oberfläche hergestellt wird (4). Typischerweise werden bei den chemoselektiven Reaktionen in der Aminosäuresequenz enthaltene Amino- bzw. Carboxylgruppen nicht beeinträchtigt.

Beispiele für geeignete Reaktionen sind die Bildung von Thioethern aus Halo-Carbonsäuren und Thiolen, von Thioethern aus Thiolen und Maleinimiden, von Amidbindungen aus Thioestern und 1,2-Aminothiolen, von Thioamidbindungen aus Dithioestern und 1,2-Aminothiolen, von Thiazolidinen aus Aldehyden und 1,2-Aminothiolen, von Oxazolidinen aus Aldehyden/Ketonen und 1,2-Aminoalkoholen, von Imidazolen aus Aldehyden/Ketonen und 1,2-Diaminen, (vgl. hierzu auch 3) von Thiazolen aus Thioamiden und alpha-Halo-Ketonen, von Aminothiazolen aus Amino-oxy-Verbindungen und alpha-Isothiocyanato-Ketonen, von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Aldehyden, von Oximen aus Amino-oxy-Verbindungen und Ketonen, von Hydrazonen aus Hydrazinen und Aldehyden, von Hydrazonen aus Hydraziden und Ketonen. Dabei können die in 3 aufgezeigten Reste R1-R5 bzw. die Reste in den oben aufgeführten chemoselektiven Reaktionen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen sein, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1- ₁₂-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(-O/S-C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20-alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2- ₁₂alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20 (-O/S-C_2-20)_2-20alkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Peenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3- 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen. Zusätzlich kann am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bevorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituent einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril Unter gerichteter, chemoselektiver Immobilisierung soll hierin insbesondere verstanden werden, dass jede Biopolymersequenz, insbesondere eine Aminosäuresequenz der Aminosäuresequenzgruppe über eine definierte reaktive Gruppe oder Ansammlung reaktiver Gruppen an der Molekül-Gabel gebunden wird. Infolge dieser Bindungsspezifität wird erreicht, dass sich im Rahmen der üblichen Reaktionsbedingungen die einzelnen Aminosäuresequenzen in einem definierten Verhältnis auf der Molekül-Gabel immobilisiert befinden werden.

Unter dem Begriff „Anordnung (Array) von Aminosäuresequenzgruppen" wird hierin insbesondere verstanden, dass eine jede Aminosäuresequenzgruppe an einem bestimmten Ort auf einer Oberfläche über eine Molekül-Gabel immobilisiert ist. Bevorzugterweise kann dabei jeder dieser Orte identifiziert werden. Bei den Orten handelt es sich somit um distinkte Orte, an denen jeweils im wesentlichen eine Gruppe von Aminosäuresequenz immobilisiert ist. Mit anderen Worten, es existiert eine Karte, aus der die Lage einer jeden der immobilisierten Aminosäuresequenzgruppen auf der Oberfläche abgeleitet werden kann.

Die einzelne Aminosäuresequenzgruppe kann dabei eine Vielzahl von Molekülen darstellen, die jedoch hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz-Zusammensetzung, d.h. der Art und Abfolge der sie aufbauenden Aminosäuren im wesentlichen identisch sind. Die Identität der Aminosäuresequenzen wird im wesentlichen durch das Herstellungsverfahren der einzelnen Aminosäuresequenzen bestimmt. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminosäuresequenzen in situ auf der Oberfläche der Anordnung synthetisiert werden, wobei hier alle möglichen Formen denkbar sind, d. h. sequentielles Anfügen der die Aminosäuresequenz aufbauenden einzelnen Aminosäuren, ebenso wie die Verwendung von Block-Synthesetechniken, bei denen Gruppierungen von Aminosäuren zusammengefügt werden und dann die einzelnen Blöcke sequentiell aneinandergereiht werden und die Blöcke oder Aneinanderreihungen davon sodann immobilisiert werden bzw. an bereits immobilisierte Aminosäuresequenzen angefügt werden.

Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass infolge der nicht immer vollständigen Ausbeuten der einzelnen Syntheseschritte bzw. Kopplungsschritte gewisse Heterogenitäten in den verschiedenen Aminosäuresequenzen im vorstehend beschriebenen Sinne entstehen können. Insbesondere bei Synthesen, die viele Reaktionsschritte erfordern, wie dies bei der Synthese von Amiosäuresequenzen der Fall ist (pro Aminosäurebaustein eine Kupplungsreaktion und eine Schutzgruppen-Abspaltung und am Ende der Synthese im allgemeinen eine Reaktion für die simultane Abspaltung aller Schutzgruppen der Seitenkettenfunktionen).

So ist zum Beispiel bei der Synthese einer Aminosäuresequenz, die aus 20 Aminosäurebausteinen oder 40 Aminosäurebausteinen besteht, und einer angenommenen durchschnittlichen Ausbeute von 95% für die nötigen 41 bzw. 81 Reaktionsschritte die zu erwartende theoretische Ausbeute nur noch 0.95⁴¹ = 0.122 (12.2 %) bzw. 0.95⁸¹ = 0.0157 (1.57 %). Selbst bei einer angenommen durchschnittlichen Ausbeute von 99 % ergeben sich für die oben aufgeführten Beispiele nur 66.2 % bzw. 44.3 %. Damit ist eine spezifische oder auch gerichtete, chemoselektive Immobilisierung von großem Vorteil. Hier erfolgt in einem Immobilisierungsereignis der Kontakt zwischen der zu immobilisierenden Verbindung und der Molekül-Gabel auf der Oberfläche, auf bzw. an der die Verbindnung immobilisiert wird, jeweils in der gleichen Art und Weise und alle Verbindungen sind in einer definierten und vorhersagbaren Orientierung auf oder an Molekül-Gabel an der Oberfläche gebunden.

Es versteht sich, dass die Anordnung eine bestimmte Anzahl von verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen umfasst. Dabei kann vorgesehen sein, dass die gleiche Aminosäuresequenzgruppe an mehreren distinkten Orten auf der Oberfläche bzw. dem Trägermaterial vorhanden ist. Damit kann zum einen ein interner Standard realisiert werden, zum anderen aber auch mögliche Randeffekte dargestellt und erfasst werden.

Als Materialien für die Oberfläche bzw. als Trägermaterialien können im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle bioverträglichen, funktionalisierten bzw. funktionalisierbaren Materialien verwendet werden. Diese Materialien können beispielsweise als feste Trägerplatten (monolithische Blöcke), Membranen, Filme oder Laminate vorliegen. Geeignete Materialien sind dabei Polyolefine, wie z. B. Polyethylen, Polypropylen, halogenierte Polyolefine (PVDF, PVC, etc.) sowie Polytetrafluoroethylen. Auf Seiten der anorganischen Materialien können beispielsweise Keramik, Silikate, Silizium und Glas verwendet werden. Obwohl nichtmetallische Trägerplatten bevorzugt sind, ist es jedoch auch im Umfang der vorliegenden Erfindung, metallische Trägermaterialien zu verwenden, trotz deren Tendenz zur Ausbildung potentiell unspezifischer Adsorptionseffekte. Beispiele für derartige Materialien sind Gold oder Metalloxide, wie beispielsweise Titanoxid.

Die Oberflächenstruktur kann dabei variieren. Es ist grundsätzlich möglich, dass die Oberfläche, an der Molekül-Gabeln angebracht sind, an denen wiederum die gerichtete Immobilisierung der Aminosäuresequenzen erfolgt, gleichzeitig das Trägermaterial darstellt. Es ist jedoch auch möglich, dass die die Molekül-Gabeln tragende Oberfläche verschieden ist von dem Trägermaterial. Eine derartige Ausgestaltung ist beispielsweise dann gegeben, wenn das die (bevorzugt planare) Oberfläche ausbildende Material in Form eines Films vorliegt, der dann, nicht zuletzt zu Stabilisierungszwecken, auf einem weiteren Basisträgermaterial aufgebracht ist.

Zu Zwecken der Aufbringung der Molekül-Gabeln, insbesondere wenn diese durch kovalente Bindung auf einem Trägermaterial erfolgt, kann die Oberfläche der Trägerplatte funktionalisiert werden. Grundsätzlich sind mehrere aufeinanderfolgende Funktionalisierungen möglich, es kann jedoch in Abhängigkeit vom ausgewählten Trägermaterial auch eine Funktionalisierung unterbleiben.

Eine erste Funktionalisierung, welche bereits geeignet ist, eine kovalente Bindung der Molekül-Gabeln an die Oberfläche zu bewerkstelligen, kann in der Bereitstellung von Amino- und/oder Carboxylgruppen als reaktive Gruppen erfolgen. Eine derartige Funktionalisierung wird, unabhängig von der chemischen Natur der aufgebrachten reaktiven Gruppen, hierin auch als erste Funktionalisierung bezeichnet.

Die Erzeugung von Carboxylgruppen kann, beispielsweise, ausgehend von Polyolefinen, als das die Oberfläche bereitstellendes Material, durch Oxidation mit Chromsäure erfolgen. Alternativ kann dies beispielsweise durch Hochdruckreaktion mit Oxalylchlorid sowie Plasmaoxidation, radikalische oder Licht-induzierte Addition von Acrylsäure und dergleichen bewerkstelligt werden. Halogenierte Materialien wie halogenierte Polyolefine können durch Basenkatalysierte Eliminationsprozesse, die zu Doppelbindungen an der Oberfläche führen, sowohl zur Erzeugung von Amino- als auch Carboxy-reaktiven Gruppen führen, wobei anschließend die reaktiven Doppelbindungen Carboxy- oder Amino-funktionalisiert werden.

Keramik, Gläser Siliziumdioxid und Titanoxid können einfach mit den in einer Vielzahl kommerziell erhältlicher substituierter Silane, wie z. B. Aminopropyltriethoxysilan, funktionalisiert werden. Trägerplatten mit Hydroxylgruppen auf der Oberfläche sind durch eine Vielzahl von Reaktionen zu modifizieren. Besonders vorteilhaft sind Umsetzungen mit Biselektrophilen, wie zum Beispiel die direkte Carboxymethylierung mit Bromessigsäure; Acylierung mit einem entsprechenden Aminosäureabkömmling, wie z. B. die Dimethylaminopyridin-katalysierte Carbodiimid-Kupplung mit Fluorenylmethoxycarbonyl-3-aminopropansäure oder die Generation von Iso(thio-)cyanaten durch Mono-Umsetzung mit entsprechenden Bis-Iso(thio)cyanaten. Eine besonders vorteilhafte Methode ist die Reaktion mit Carbonyldiimidazol oder Phosgen oder Triphosgen oder p-Nitrophenyl-Chloroformiat bzw. Thiocarbonyldiimidazol, gefolgt durch die Reaktion mit Diamin oder einfach geschützten Diaminen, um Aminofunktionen über eine stabile Urethanbindung auf der Oberfläche zu den Trägermaterialien anzubringen.

Als Molekül-Gabeln können alle chemischen Verbindungen und Strukturen angesehen werden, die einerseits eine kovalente Bindung zur Oberfläche des Trägermaterials zulassen und andererseits mindestens zwei weitere chemische Funktionen besitzen, die entweder die schrittweise Synthese oder die chemoselektive Immobilisierung von Biopolymersequenzen unter Ausbildung weiterer kovalenter Bindungen erlauben (siehe 1).

Insbesondere geeignet sind dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen sein, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(-O/S-C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20-alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20(-O/S-C_2-20)₂-Zoalkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)₂-₁₂alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-CYcloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Peenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige monobi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5-, 6- und 10-gliedrige mono-, bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.

Zusätzlich kann am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituent einzeln oder in Kombination untereinander auftreten: Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.

Zum einen enthält die Molekülgabel eine erste chemisch reaktive Gruppe zur Immobilisierung auf einer makromolekularen Oberfläche. Dabei ist vorgesehen, daß diese erste reaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die Alkohole, Amine, Karbonsäuren, Carbonylverbindungen, Hydroxylamine, Aldehyde, Ketone, Acetale, Ketale, Amino-oxy-verbindungen, Azide, Hydrazide, Thiole, Thiocarbonylverbindungen, Thioketale und Thioacetale, Sulfide, Sulfonate, Alkene, Alkine, Halogenverbindungen und Cyanoverbindungen umfaßt, so daß in bevorzugten Ausführungsformen die Verbindung zur funktionalisierten Oberfläche über --CONH--, --O--, --S--, --COO--, --CH.dbd.N---NHCONH--, --NHCSNH, --C-C-- oder --NHNH-- Gruppierungen erfolgt.

Zum anderen enthält die Molekülgabel mindestens eine zweite und eine dritte chemisch reaktive Gruppe zur Immobilisierung bzw. schrittweisen Synthese von Biopolymersequenzen. Diese Gruppe umfasst ist aber nicht beschränkt auf Alkohole, Amine, Karbonsäuren, Carbonylverbindungen, Hydroxylamine, Aldehyde, Ketone, Acetale, Ketale, Amino-oxy-verbindungen, Azide, Hydrazide, Thiole, Thiocarbonylverbindungen, Thioketale und Thioacetale, Sulfide, Sulfonate, Alkene, Alkine, Halogenverbindungen und Cyanoverbindungen umfaßt Diese können durch Schutzgruppen maskiert vorliegen.

Dabei müssen die für die Synthese bzw. chemoselektive Immobilisierung von Biomolekülen vorgesehenen chemischen Funktionen nicht unbedingt unterschiedlicher chemischer Natur sein (vgl. 5 und 6). Es genügt, wenn diese chemischen Funktionen so maskiert sind, daß diese chemischen Funktionen mit dem Fachmann bekannten Methoden geordnet und in Beliebiger Reihenfolge entfernt werden können.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erlauben diese Molekül-Gabeln, daß die Anzahl der Biopolymersequenz- Moleküle, die auf der einen Seite der Molekül-Gabel kovalent fixiert ist, sehr ähnlich bzw. gleich der Anzahl der Biopolymersequenz-Moleküle, die auf der einen Seite der Molekül-Gabel kovalent fixiert sind, ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorgesehen sein, dass die auf der Molekül-Gabel immobilisierten Aminosäuresequenzen einen Abstandhalter aufweisen. Infolge der Verwendung derartiger Abstandhalter, hierin auch als „spacer" bezeichnet, gewinnen die Aminosäuresequenzen an zusätzlichen Freiheitsgraden um effektiver innerhalb einer Aminosäuresequenzgruppe miteinander Wechselwirken zu können. Ein Abstandhalter kann im wesentlichen jedes Molekül sein, insbesondere ein jedes biokompatibles Molekül, das mindestens zwei funktionelle bzw. funktionalisierbare Gruppen enthält. Der Abstandhalter ist im verwendeten Zustand als Element zwischen auf der Oberfläche angebrachten Molekül-Gabel und der Aminosäuresequenz eingebaut.

Als Abstandhalter eignen sich die folgenden Verbindungsklassen:
Alkane, verzweigt oder unverzweigt, insbesondere solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C30, insbesondere C4 bis C8; Polyether, d. h. Polymere des Polyethylenoxids oder des Polypropylenoxids, wobei die Polyether bevorzugt aus 1 bis 5 Polyethylenoxideinheiten bzw. Polypropylenoxideinheiten bestehen; Polyalkohole, verzweigt oder unverzweigt, wie Polyglycol und Derivate davon, wie beispielsweise O,O'-Bis(2-Aminopropyl)-polyethylenglycol 500 und 2,2'-(Ethylendioxid)-Diethylamin; Polyurethane, Polyhydroxysäuren, Polycarbonate, Polyimide, Polyamide, Polyester, Polysulfone, insbesondere solche bestehen aus 1-100 Monomereinheiten, ganz besonders bevorzugt bestehend aus 1-10 Monomereinheiten; Kombinationen der vorstehend genannten Alkane mit den vorstehend genannten Polyethern; Polyurethanen, Polyhydroxysäure, Polycarbonaten, Polyimiden, Polyamiden, Polyaminosäuren, Polyestern und Polysulfonen; Diaminoalkane, verzweigt oder unverzweigt, bevorzugterweise solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C30, ganz besonders bevorzugt solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C8; beispielhaft seien hier genannt 1,3-Diaminopropan, 1,6-Diaminohexan und 1,8-Diaminooctan, sowie deren Kombinationen mit Polyethern, bevorzugterweise mit den vorstehend genannten Polyethern; wie zum Beispiel 1,4-bis-(3-Aminopropoxy)butan; Dicarbonsäuren und deren Derivate, wie zum Beispiel Hydroxy-, Mercapto- und Amino-dicarbonsäuren, gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt, insbesondere C2 bis C30 Dicarbonsäuren, bevorzugterweise solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C10, ganz besonders bevorzugt solche mit einer Kettenlänge von C2 bis C6; wie beispielsweise Bernsteinsäure und Glutarsäure; und Aminosäuren und Peptide, bevorzugterweise mit einer Länge von 1-20 Aminosäureresten, ganz besonders bevorzugt mit einer Läne von 1-3 Aminosäureresten, beispielsweise Trimere von Lysin, Dimere von 3-Aminopropionsäure und monomere 6-Aminocapronsäure.

Grundsätzlich ist es infolge der Tatsache, dass der Abstandhalter zwei funktionale Enden aufweist, möglich, diese Funktionalitäten so auszuwählen, dass die auf der Oberfläche zu immobilisierenden Aminosäuresequenzen entweder über ihren C-Terminus oder ihren N-Terminus oder über eine andere funktionelle Gruppierung innerhalb der zu immobilisierenden Aminosäuresequenz immobilisiert werden. Soll eine Immobilisierung über den C-Terminus erfolgen, wird die am C-Terminus angreifende funktionale Gruppe des Abstandhalters bevorzugterweise eine Aminogruppe sein. Sollen die Aminosäuresequenzen vermittels des N-Terminus an die Oberfläche immobilisiert werden, ist die entsprechende funktionelle Gruppe des Abstandhalters eine Carboxylgruppe.

Bei der erfindungsgemäßen Anordnung kann vorgesehen sein, dass der Abstandhalter ein verzweigter Abstandshalter ist. Derartige verzweigte Abstandshalter werden auch als dendrimere Strukturen oder kurz Dendrimere bezeichnet, und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Dendrimere Strukturen zur Immobilisierung von Nukleinsäuren sind beispielsweise beschrieben in Beier, M. & Hoheisel, J.D., 1999, Versatile derivatisation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips, 9, 1970-1977. Die Funktion derartiger dendrimerer Strukturen besteht darin, die Anzahl der reaktiven Gruppen pro Flächeneinheit der Oberfläche und damit die Signalintensität zu erhöhen. Dendrimere Strukturen können mit fast allen funktionellen oder funktionalisierbaren Gruppen versehen werden, die sodann eine Immobilisierung der Aminosäuresequenzen erlauben. Infolge der Verwendung derartiger dendrimerer Strukturen kann die Anzahl der reaktiven Gruppen pro Flächeneinheit der Planaren Oberfläche um den Faktor 2 bis 100, bevorzugterweise um den Faktor 2 bis 20 und bevorzugtererweise um den Faktor 2 bis 10 gesteigert werden.

Nach dem Aufbringen eines Abstandhalters auf die Molekül-Gabel kann eine weitere Funktionalisierung erfolgen. Mit anderen Worten, die verbliebene reaktive Gruppe des Abstandhalters wird durch zusätzliche Maßnahmen weitergehend funktionalisiert. Diese zweite Funktionalisierung kann dabei direkt an der Molekül-Gabel, an der mit einem Abstandshalter versehenen Molekül-Gabel oder an einer dendrimeren Struktur erfolgen.

Ein Grund für die zweite Funktionalisierung besteht darin, dass infolge der auch in den Aminosäuresequenzen vorhandenen Amino- und Carboxylgruppen, Thiolfunktionen, Imidazolfunktionen und Guanidofunktionen keine einheitliche Immobiliserung bezogen auf die Orientierung der Aminosäuresequenz auf der Molekül-Gabel zu erzielen ist. Eine zweite Funktionalisierung bietet den Zugang zu weiteren chemoselektiven Reaktionen, um eine gerichtete Immobilisierung zu erreichen.

Für diese zweite Funktionalisierung eignen sich all jene Verbindungen, die sich durch ein Vorhandensein von nicht-proteinogenen funktionellen Gruppen auszeichnen. Beispielhaft seien ohne als Einschränkung verstanden zu werden die folgenden Verbindungen genannt: Maleinimido-Verbindungen wie Maleinimido-amine oder Maleinimido-carbonsäuren; alpha-Halo-Ketone wie Brombrenztraubensäure oder 4-Carboxy-alpha-Brom-Acetophenon, alpha-Isothiocyanato-Ketone wie 4-Carboxy-alpha-Isothiocyanato-Acetophenon, Aldehyde wie Carboxybenzaldehyd, Ketone wie Lävulinsäure, Thiosemicarbazide, Thioamide wie Bernsteinsäuremonothioamid, alpha-Brom-Carbonsäuren wie Bromessigsäure, Hydrazine wie 4-Hydrazinobenzoesäure, O-Alkylhydroxylamine wie Amino-oxy-essigsäure, und Hydrazide wie Glutarsäuremonohydrazid.

Als weitere Maßnahme ist bei der Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen sein, dass diejenigen Stellen oder Bereiche der Oberfläche, die nicht mit einer Aminosäuresequenzgruppe versehen sind, blockiert sind. Durch die Blockierung wird gewährleistet, dass während oder nach der chemoselektiven Reaktion der Aminosäuresequenzen mit den funktionalisierten Molekül-Gabeln noch nicht umgesetzte, aber noch reaktive Gruppierungen oder Gruppen auf der Molekül-Gabel bzw. Oberfläche inaktiviert werden. Diese Blockierungsreaktion ist notwendig, da sonst die zugesetzten Proteine oder andere Bestandteile der eingesetzten biologischen Probe unspezifisch mit diesen, noch nicht blockierten, reaktiven Gruppen reagieren und damit eventuell für ein großes Hintergrundsignal sorgen können. Solche unspezifischen Reaktionen mit Oberflächen sind eine häufige Ursache für ungünstige Signal-Rausch-Verhältnisse bei biochemischen Analysen. Für dieses Blockieren eignen sich solche Verbindungen, die sterisch nicht anspruchsvoll sind, sehr gut mit den zu blockierenden Gruppen reagieren und möglichst günstige Oberflächeneigenschaften generieren. Die Auswahl dieser Verbindungen wird in Abhängigkeit von der Art der Probe bzw. des Wechselwirkungspartners, der mit einer der Aminosäuresequenzgruppe in Wechselwirkung tritt, abhängen.

Die Verbindung ist bevorzugt hydrophil ausgestaltet, wenn die eingesetzten Proteine bevorzugt an hydrophoben Oberflächen unspezifisch binden und hydrophob, wenn die eingesetzten Proben bevorzugt an hydrophilen Oberflächen unspezifisch bindet. So ist es dem Fachmann bekannt, dass ein Biomolekül, wie zum Beispiel ein Protein, eine dreidimensionale, genau definierte Struktur für die korrekte biologische Funktion benötigt. Diese Tertiärstruktur ist deutlich von der Umgebung abhängig. So besitzt ein Protein in Wasser, einem hydrophilen Lösungsmittel, die Tendenz, alle oder besser gesagt möglichst viele hydrophobe Gruppierungen im Inneren zu verbergen. Gelangt ein solches Protein in eine mehr hydrophobe Umgebung (hydrophobe Oberfläche), kann es deshalb zum Um- bzw. Auffalten des Proteins und damit zur Inaktivierung kommen. Auf der anderen Seite sind Proteine bekannt, die in ihrer natürlichen Vorkommensweise innerhalb von (hydrophoben) Biomembranen vorliegen. Solche Proteine würden sich beim Inkontaktkommen mit einer hydrophilen Oberfläche umfalten und dabei denaturieren bzw. inaktiviert werden. In einem solchen Fall ist eine hydrophobe Oberfläche wünschenswert.

Die Bestandteile der Aminosäuresequenzen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Aminosäuren, die bevorzugterweise ausgewählt sind aus der Gruppe, die L- und D- Aminosäuren umfasst. Weiterhin sind die Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe die natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren umfasst. Eine bevorzugte Gruppe innerhalb einer jeden der vorstehenden Gruppen von Aminosäuren sind die entsprechenden alpha-Aminosäuren. Die Aminosäuresequenzen bestehen beispielsweise aus einer Abfolge von Aminosäuren aus einer jeden beliebigen der vorstehenden Gruppe. So liegt beispielsweise eine Kombination aus D- und L-Aminosäuren im Umfang der Erfindung ebenso wie Aminosäuresequenzen, die entweder ausschließlich aus D- oder aus L- Aminosäuren bestehen. Die Bestandteile der Aminosäuresequenzen können darüberhinaus auch andere Moleküle umfassen als Aminosäuren Beispiele hierfür sind Thioxo-Aminosäuren, Hydroxy-Säuren, Mercapto-Säuren, Dicarbonsäuren, Diamine, Dithioxocarbonsäuren, Säuren und Amine. Eine weitere Form von derivatisierten Aminosäuresequenzen sind die sogenannten PNAs (engl. peptide nucleic acids) Die Dichte der Aminosäuresequenzgruppen beträgt 1/cm² bis 1000/cm², wobei die Dichte bevorzugt 1/cm² bis 500/cm² und ganz besonders bevorzugt 1/cm² bis 200/cm² beträgt. Derartige Dichten von distinkten Orten auf einer Oberfläche, die jeweils eine Aminosäuresequenzgruppen enthalten, können unter Verwendung verschiedener Techniken erreicht werden, so beispielsweise mit piezoelektrisch betriebenen Pipettier-Robotern, mit feinen Nadeln aus verschiedenen Materialien wie Polypropylen, Edelstahl oder Wolfram bzw. entsprechender Legierungen, mit sogenannten „Pin-tools", die entweder geschlitzte Nadeln darstellen oder aufgebaut sind aus einem Ring, der die zu applizierende Substanzmischung enthält, und einer Nadel, die durch die in diesem Ring enthaltene Substanzmischung hindurch diese auf der entsprechenden Oberfläche absetzt. Aber auch mit einer motorgetriebenen Spritze verbundene Kapillaren sind dafür geeignet (Spotter). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die zu immobilisierenden Aminosäuresequenzen durch geeignete Stempelchen aufzubringen.

Aber auch das Auftragen der zu immobilisierenden Aminosäuresequenzen mittels geeigneter Pipetten bzw. sogenannter Multipetten per Hand ist möglich. Weiterhin ist es möglich, die oben angegebenen Dichten von distinkten Orten durch die direkte in situ Synthese der Aminosäuresequenzen auf den Molekül-Gabeln der Oberfläche zu erzeugen. (M. Stankova et al. 1994, Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul et al.; 2000, Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh et al.; 2000, Biopolymer., 55, 188-206, R.Frank, 1992, Tetrahedron, 48, 9217-9232; A.Kramer und J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol 87: Combinatorial Peptide Library Protocols, S. 25-39, edited byc S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F. et al., J., 2001, Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900, S.P.A. Fodor et al.; 1991, Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, J. Comb. Chem., 2, 355-360).

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung und deren verschiedenen Verwendungen und Anwendungen ist vorgesehen, dass die verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen aus zwei verschiedenen Sequenzen bestehen und das eine dieser Sequenzen in den verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen identisch ist (7). Oder aber, es liegen zwei chemisch voneinander verschiedene Sequenzen vor, wie zB eine Nukleinsäuresequenz und eine Aminosäuresequenz etc. Die Summe aller zweiten (nicht identischen) Sequenzen stellt im Falle von Aminosäuresequenzen überlappende Peptide dar, die die gesamte Primärstruktur eines Proteins abdecken.

Der Nachweis darüber, dass innerhalb einer oder mehrerer der verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen ein Bindungsereignis erfolgt ist, kann dabei unter Verwendung von verschiedenen Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. So ist es möglich, eine Wechselwirkung zwischen unterschiedlichen Aminosäuresequenzen-Derivaten durch Änderung der Fluoreszenz zu verfolgen. Prinzipiell können alle Reaktionen und physikalischen Phänomene, die abstands-sensitiv sind, zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen Aminosäuresequenzen innerhalb einer Aminosäuresequenz-Gruppe benutzt werden. Beispiel für solche Reaktionen und physikalischen Phänomene sind Fluoreszenz-Energie-Resonanz-Transfer (FRET), Dexter-Transfer, Elektronen-Spin-Resonanz, Magnetische-Kern-Spin-Resonanz (NMR), besonders ¹⁹F-NMR und Lichtblitz-induzierte Radikalreaktionen.

Alternativ können für Nachweis darüber, dass innerhalb einer oder mehrerer der verschiedenen Aminosäuresequenzgruppen ein Bindungsereignis stattgefunden hat, und den Aminosäuresequenzen Hilfstrukturen dergestalt angebracht sein, dass nur im Fall einer Wechselwirkung zwischen den Aminosäuresequenzen einer Aminosäuresequenzgruppe sich eine neue Struktur aus den über die Aminosäuresequenzwechselwirkungen in Kontakt gebrachten Hilfsstrukturen bildet, die wiederum selektiv nachweisbar ist.

Solch eine Struktur kann eine dem Fachmann als diskontinuierliches Epitop bekannte Struktur sein, die selektiv durch Bindung geeigneter Antikörpern nachgewiesen werden kann. Andererseits können diese Hilfsstrukturen Elemente sein, die, unter gewissen Bedingungen, nur dann, wenn eine Wechselwirkung zwischen den Aminosäuresequenzen einer Aminosäuresequenzgruppe stattfindet, zur Dimerisierung bzw. Oligomerisierung neigt. Beispiele für solche Hilfstrukturen sind komplementäre DNA bzw. RNA, bzw. PNA Stränge. Weitere Beispiele für solche Hilfstrukturen sind kurze Oligo-Prolin-Sequenzen, von denen dem Fachmann bekannt ist, dass diese bei einer entsprechenden Vor-Orientierung eine sogenannte Polyprolin- bzw. Tripel-Helix ausbilden, die wiederum jeweils ein spezifisches CD-Signal erzeugen.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, Substanzen zu suchen, die die Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere inhibieren können. Dazu wird nach Kontaktierung der Anordnung mit einem Reagenz, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Wirkstoffe, potentiellen Wirkstoffe, organischen Moleküle und Naturstoffe, die Änderung eines Signals, dass sich durch eines der oben beschriebenen Nachweisverfahren ergibt, ausgelesen.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung sind aus den beigefügten Figuren ersichtlich. Es versteht sich von selbst, dass die vorliegende Erfindung nicht nur auf die im Einzelnen offenbarten Merkmale beschränkt ist, sondern auch auf eine beliebige Kombination der vorstehend erläuterten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale.
1 zeigt den schematischen Aufbau einer Molekül-Gabel, die einerseits auf einer Trägeroberfläche immobilisiert ist und die andererseits zwei verschiedenen Biopolymersequenzen trägt,
2 zeigt schematisch die Möglichkeiten für Wechselwirkungen von zwei verschiedenen Biopolymeren, die über eine binäre Molekül-Gabel auf einer Oberfläche immobilisiert sind,
3 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen,
4 zeigt schematisch die Vorgehensweise für die Beladung einer binären Molekül-Gabel mit zwei verschiedenen Aminosäuresequenzen durch aufeinanderfolgende chemoselektive Immobilisierungsreaktionen.
5 zeigt die chemische Struktur der Beispiel-Molekül-Gabel MG1,
6 zeigt die chemische Struktur der Beispiel-Molekül-Gabel MG2,
7 zeigt eine Darstellung einer besonderen Ausführungsform der Erfindung,
8 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Beispiel-Molekül-Gabel MG1.
9 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Beispiel-Molekül-Gabel MG2.
10 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2 an aminofunktionalisierten APEG-Amino-Polypropylenoberflächen
11 zeigt die Kartierung der Länge der Streptavidin/Strep-tag II Interaktionsbereiche unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2 und der in 7 gezeigten besonderen Ausführungsform der Erfindung,
12 zeigt die Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Inhibierung mit Naturstoff Biotin.
13 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle des Raf-Peptides (RQRSTpSTPNV) am 14-3-3 Protein.
14 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle des mT-Peptides (ARSHpSYPA) am 14-3-3 Protein.
15 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle der FKBP12/FAP48 Interaktion.
16 zeigt die Kartierung der Interaktionsstelle der FKBP12/EGF-Rezeptor Interaktion.
17 zeigt die Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Streptag II Interaktionen unter Verwendung des Naturstoffes Biotin und seiner Derivate.
In 1 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 gezeigt, bei dem zwei verschiedene Biopolymersequenzen 101 und 102 über eine binäre Molekül-Gabel 103 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 104 immobilisiert sind.
In 2 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Anordnung 200 gezeigt, wobei in 2A zwei nicht miteinander interagierende Biopolymersequenzen 201 und 202 über eine binäre Molekül-Gabel 203 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 204 immobilisiert sind. 2B ist die mögliche Interaktion gleicher Biopolymersequenzen 208, 209, die auf verschiedenen, räumlich benachbarten Molekül-Gabeln 205, 206 immobilisiert sind, schematisch gezeigt. In 2C2 ist die Interaktion verschiedener Biopolymersequenzen 213, 214, 215, 216, die auf verschiedenen, räumlich benachbarten Molekül-Gabeln 218, 219 immobilisiert sind, schematisch gezeigt. 2C1 zeigt außerdem die Interaktion von zwei verschiedenen Biopolymersequenzen 211, 212, die auf einer Molekül-Gabel immobilisiert sind. Dabei ist es für den Fachmann offensichtlich, dass der Anteil der Fälle B und C2 in großem Ausmaß von der Dichte der beladenen Molekül-Gabeln auf der Trägeroberfläche abhängig ist.
3 zeigt eine Übersicht verschiedener chemoselektiver Reaktionen nach dem Stand der Technik: A) Aldehyde (R⁴=H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Amino-oxy-Verbindungen reagieren zu Oximen, B) Aldehyde (R⁴=H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Thiosemicarbazide reagieren zu Thiosemicarbazonen, C) Aldehyde (R⁴=H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und Hydrazide reagieren zu Hydrazonen, D) Aldehyde (R⁴=H) oder Ketone (R⁴ nicht H) und 1,2-Aminothiole reagieren zu Thiazolinen (X=S) bzw. 1,2-Aminoalkohole zu Oxazolinen (X=O) bzw. 1,2-Diamine reagieren zu Imidazolinen (X=NH), E) Thiocarboxylate und alpha-Halocarbonyle reagieren zu Thioestern, F) Thioester und β-Aminothiole reagieren zu β-Mercaptoamiden, G) Mercaptane und Maleinimide reagieren zu Succinimiden.
Der Rest R¹ stellt dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen dar und die Reste R⁴-R⁶ stellen dabei Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- oder Aryl-Reste, bzw. Heterocyclen oder Oberflächen oder H, D, bzw. T dar, wobei Alkyl für verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl, C_3-20-Cycloalkyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-12-Alkyl, C_3-12-Cycloalkyl und besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_1-6-Alkyl, C_3-6-Cycloalkyl-Reste steht. Alkenyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20-Alkyl-O-C_2-20-alkenyl, C_1-20(– O/S-C_2-20)_2-20alkenyl, Aryl-C_2-20-alkenyl, verzweigte und unverzweigte Heterocyclyl-C_2-20-alkenyl, C_3-20-Cycloalkenyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2-12alkenyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkenyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkenyl-Reste; Alkinyl steht für verzweigte und unverzweigte C_2-20-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-20(-O/S-C_2-20)_2- Zualkinyl, bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-12-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-12(-O/S-C_2-12)_2- ₁₂alkinyl, besonders bevorzugt für verzweigte und unverzweigte C_2-6-Alkinyl, verzweigte und unverzweigte C_1-6(-O/S-C_2-8)_2-8alkinyl-Reste; Cycloalkyl steht für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-40-Cycloalkyl, bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-26-Cycloalkyl, besonders bevorzugt für überbrückte und nicht-überbrückte C_3-15-Cycloalkyl-Reste, Aryl steht für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl, Fluorenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, bevorzugtfür substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Azulenyl-, Anthracenyl-, Indenyl-, Indacenyl-, Acenaphtyl-, Fluorenyl, besonders bevorzugt für substituierte und unsubstituierte mono-oder multi-verknüpfte Phenyl-, Pentalenyl-, Anthracenyl-Reste, sowie deren teilhydrierte Derivate. Heterocyclen können sein ungesättigte und gesättigte 3-15-gliedrige monobi und tricyclische Ringe mit 1-7 Heteroatomen, bevorzugt 3-10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-5 Heteroatomen und besonders bevorzugt: 5,6 und 10-gliedrige mono-bi und tricyclische Ringe mit 1-3 Heteroatomen.
Zusätzlich können am Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroatome, Heterocyclen, Biomolekül oder Naturstoff 0 bis 30 (bervorzugt 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5) der folgende Substituenten einzeln oder in Kombination untereinander auftreten; Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Acetal, Ketal, Thiol, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Peroxyd, Sulfonsäure, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, wobei folgende bevorzugt sind: Fluor, Chlor, Brom, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Amin, Ether, Phosphat, Sulfat, Sulfoxyd, Thioether, Nitril, Harnstoffe, Carbamat, und besonders bevorzugt: Chlor, Hydroxyl, Amid, Ester, Säure, Ether, Nitril.
In 4 ist der schematische Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 400 gezeigt, bei der zwei verschiedene Biopolymersequenzen 403, 404 über eine binäre Molekül-Gabel 401 auf einer geeigneten Träger-Oberfläche 405 durch dem Fachmann an sich bekannt und in 3 erläuterte chemoselektive Reaktionen immobilisiert werden. Dabei wird zuerst die erste Biopolymersequenz 403 durch eine chemoselektive Immobilisierungsreaktion unter Ausbildung einer chemischen Bindung auf der Molekül-Gabel verankert (Reaktionsschritt A). In einer nachfolgenden Reaktion B wird die zweite Biopolymersequenz 404 durch eine chemoselektive Immobilisierungsreaktion, die sich bevorzugterweise von der ersten Immobilisierungs-Reaktion unterscheidet, unter Ausbildung einer chemischen Bindung 407 ebenfalls auf der Molekül-Gabel 401 verankert. Die dadurch gebildete, vollständig beladene, binäre Molekül-Gabel 401 stellt eine Ausführungsform der Erfindung vor.
In 5 ist die Struktur der Molekül-Gabel MG1 gezeigt, die über zwei β-Alanin-Moleküle als Abstandhalter mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist. Dabei stellen Fmoc und Dde dem Fachmann bekannte Schutzgruppen dar, die nach selektiver Entfernung die Beladung der Molekül-Gabel mit entsprechenden Biomolekülen erlauben.
In 6 ist die Struktur der Molekül-Gabel MG2 gezeigt, die über zwei β-Alanin-Moleküle als Abstandhalter mit der Oberfläche des Trägers verbunden ist. Dabei stellen Fmoc und Dde dem Fachmann bekannt Schutzgruppen dar, die nach selektiver Entfernung die Beladung der Molekül-Gabel mit entsprechenden Biomolekülen erlauben.
In 7 ist eine besondere Ausführungsform 700 der Erfindung unter Nutzung binärer Molekül-Gabeln gezeigt. Dabei wird auf einer Seite der Molekül-Gabel 701, 702, 703 die gleiche Biopolymersequenz 704 entweder immobilisiert oder schrittweise synthetisiert (schwarze Kugeln entsprechen den Biomonomeren; die jeweils linke Biopolymersequenz ist in diesem Beispiel identisch). Auf der zweiten Seite der Molekül-Gabel werden Biopolymerteilsequenzen 705, 706, 707, z. B. Peptide, entweder immobilisiert oder schrittweise synthetisiert, die die Sequenz eines in der Natur vorkommenden Biopolymers, z. B. eines Proteins, als überlappende Biopolymerteilstücke darstellen. Dabei kann die vollständige Sequenz oder aber auch nur ein oder mehrere Teilbereiche der Sequenz durch die Gesamtheit der Teilsequenzstücke abgebildet werden. Im gezeigten Beispiel wird die gewünschte Biopolymersequenz 705, 706, 707 durch überlappende trimere Teilsequenzen mit zwei überlappenden Biomonomeren dargestellt. Selbstverständlich sind verschiedenen Überlappungsgrade, auch ein Überlappungsgrad von Null = keine Überlappung, möglich, die auch wiederum von der Gesamtlänge der Teilsequenz abhängen. Wenn Proteine als Biopolymersequenzen mittels überlappender Teilsequenzen dargestellt werden, ist die Gesamtheit der Teilsequenzen dem Fachmann als Peptid-Scan bekannt. In der vorliegenden 7 liegt also die Besonderheit darin, daß sich einerseits alle binären Molekül-Gabeln 701, 702, 703 in einem Molekül gleichen, aber mit der zweiten Hälfte 705, 706, 707 einen Biopolymer-Scan bilden.
In 8 sind die Interaktionen von 50 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden gezeigt, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und dem Strep-Tag II Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MG1 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
A) Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide mit einer Überlappung von 9 Aminosäuren synthetisiert, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. B) Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Fmoc-Seite synthetisiert. An der Dde-Seite wurden überlappende 12mere Peptide mit einer Überlappung von 9 Aminosäuren synthetisiert, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar.
Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
9 zeigt die Interaktionen in 75 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden überlappenden Dodekapeptiden, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
10 zeigt die Interaktionen in 75 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte APEG-Amino-Polypropylen-oberfläche wurde unter Benutzung von 100 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Streptag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
11 zeigt die Interaktionen in Peptidpaaren Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden längenvariierten Peptiden, die die Streptavidin-Sequenz Arg59-Ala100 repräsentieren und Strep-Tag II-Peptid. Der konstante Peptidblock Strep-tag II wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere bis 6mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die Streptavidin-Sequenz Arg59-Ala100 überspannen, synthetisiert. Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 50 nM Streptavidin gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Die Streptavidin-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren und damit das minimale Bindungsmotiv repräsentieren, sind tabellarisch dargestellt.
12 zeigt die durch Biotin blockierte Bindung von Streptavidin an Strep-Tag II-Peptid. Die über Molekül-Gabeln der Form MG1 mit Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung eines vorgebildeten Biotin/Streptavidin-Komplexes (60 μg Streptavidin/6μg Biotin, 1h Vorinkubation) gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. A) An der MG1 wurde nur jeweils eine Seite mit Oligopeptiden des Streptavidin-Scans synthetisiert. Die andere Seite wurde durch eine Acetylierungsreaktion modifiziert. B) An der MG1 wurde nur jeweils eine Seite mit Oligopeptiden des Streptavidin-Scans synthetisiert und an der anderen Seite das Strep-Tag 12-Peptid synthetisiert. Die so erhaltene Ausführungsform entspricht der im 7 aufgezeigten Variante der Erfindung.
13 zeigt die Interaktionen in 80 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die Sequenz des 14-3-3 Proteins repräsentieren und dem Raf-Peptid RQRSTpSTPNV (pS = phosphoSerin). Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 150 nM 14-3-3 Protein gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock Raf-Peptid wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3-Protein-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die 14-3-3-Protein-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
14 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 120 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dekapeptiden, die die Sequenz des 14-3-3 Proteins repräsentieren und ARSHpSYPA (mT peptide; pS = phosphoSerin). Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM 14-3-3 Protein gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert.
Der konstante Peptidblock mT peptide wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 10mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3 – Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Die 14-3-3-Protein-Sequenzen, die zu den interagierenden Peptiden korrespondieren, sind tabellarisch dargestellt.
15 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 48 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die FKBP12-Sequenz repräsentieren und von FAP48 abgeleiteten Peptiden, die mit FKBP12 interagieren.
A) Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Acetyl-KCPLLTAQFFEQS von FAP (Lys217-Ser229) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. B) Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Ac-LSPLYLLQFNMGH von FAP (Leu307-His319) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio- Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar.
In beiden Experimenten wurde als Interaktionsregion im FKBP12 die Region Met21-Glu69 festgestellt.
16 zeigt den Nachweis der Interaktionen in 48 Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform mit überlappenden Dodekapeptiden, die die FKBP12-Sequenz repräsentieren und von der cytoplasmatischen Domäne des EGF-Rezeptors abgeleiteten Peptiden, die mit FKBP12 interagieren.
Die über Molekül-Gabeln der Form MG2 mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose wurde unter Benutzung von 200 nM FKBP12 gefolgt von Westernblot-Analyse und Immundetektion analysiert. Der konstante Peptidblock Acetyl-PHVCRLLGICLTS vom EGF-Rezeptor (Pro748-Ser760) wurde an der Dde-Seite synthetisiert. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Die densitometrische Analyse wurde mittels eines GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad) durchgeführt. Die Ordinate repräsentiert die Differenz aus dem reziproken Wert der Intensität jedes analysierten Spots und dem reziproken Wert der durchschnittlichen Spotintensitäten. Große positive Werte korrespondieren mit einem schwachen Signal im Blot und zeigen potentielle Interaktion im Peptidpaar. Als Interaktionsregion im FKBP12 wurde die Region Met21-Ser67 festgestellt.
17 zeigt die Kartierung der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion mittels 75 Peptidpaare, die aus überlappenden Dodekapeptiden, die die Streptavidin-Sequenz repräsentieren und dem Strep-Tag II Peptid bestehen. Gezeigt ist das Auslesen des Signals über Fluoreszenz und die Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Strep-tag II Interaktionen unter Verwendung des Naturstoffes Biotin und seiner Derivate.
A) Die chemische Struktur der Beispiel-Molekülgabel MG3. B) Die Zellulose wurde über Molekül-Gabeln der Form MG3 mit Peptidpaaren entsprechend der in 7 gezeigten Ausführungsform modifiziert. Dabei wurde das an der Fmoc-Seite befindliche Peptid mit einem Dansyl-Rest und das an der Aloc-Seite befindliche Peptid mit Fluorescein markiert. Die Analyse erfolgte über Detektion des Emissionslichtes bei 510-530 nm nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm mittels des Raytest DIANA Chemiluminescence Detektionssystemes. C) Die wie unter B) beschrieben modifizierte Membran wurde vor der Analyse 30 min in einer Lösung, die 0.5 mM Biotin, 1 mM 2-Iminobiotin (Ka=8.0×10⁶ M^–1) bzw. Diaminobiotin (G.O. Reznik, S. Vajda, T. Sano, C.R. Cantor; 1998, A streptavidin mutant with altered ligandbinding specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13525-13530) enthielt, inkubiert.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel (MG1, 5) an aminofunktionalisierte Zellulose-Oberflächen
Die Aminosäurederivate Fmoc-Lys(Dde)-OH und Boc-Lys(Fmoc)-OH wurden in 0.3 M in DMF gelöst und durch Zugabe von einem Äquivalent PyBOP unter Anwesenheit von DIEA (10%, v/v) aktiviert. Fmoc-Lys(Dde)-OH wurde an den (β-Ala)₂ Spacer der aminofunktionalisierten Zelluloseoberfläche in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der N^α-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde Boc-Lys(Fmoc)-OH in DMF gekoppelt. Die Abspaltung der N^α-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde mit DMF (3 × 10 min) und Methanol (2 × 5 min) gewaschen und die Zellulose getrocknet. Die jeweils erste Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) durchgeführt.
Nach der Beendigung der Synthese der ersten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Anschließend wurde die Dde-Schutzgruppe an der Molekül-Gabel unter Verwendung von 2 % Hydrazin in DMF für 3 × 3 min entfernt. Die Synthese der zweiten Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch durchgeführt und nach der Beendigung der Synthese der zweiten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von 50 % TFA/DCM mit 2 % Triisopropylsilan und 3 % Wasser für 3 h bei RT unter leichtem Schütteln. Anschließend wurde die Zellulose jeweils zweimal 5 min mit DCM, dreimal 15 min mit DMF und zweimal 10 min mit McOH gewaschen, getrocknet und zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Beispiel 2. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel (MG2, 6) an aminofunktionalisierte Zellulose-Oberflächen.
Zuerst wurden die durch PyBOP aktivierten Aminosäurederivate Fmoc-Lys(Dde)-OH und Fmoc-Glu(OtBu)-OH sequentiell an Rink-Amid- MBHA-Harz in DMF über Fmoc-basierende Peptidsynthesestrategie gekoppelt (Chan, W.C. and White, P.D. 2000, Fields, G.B. and Noble, R.L. 1990). Anschließend wurde Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH₂ mittels 95 % TFA, 2 % Triisopropylsilan, 3 % Wasser für 1 h bei RT vom Polymer freigesetzt. Das gereinigte Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH₂ (0.3 M) wurde an der -Carboxylgruppe von Glu durch 0.3 M PyBOP in DMF mit DIEA (10% v/v) aktiviert and an den (β-Ala)₂ Spacer der aminofunktionalisierten Zelluloseoberfläche in DMF dreimal für je 20 min gekoppelt. Die Abspaltung der N^α-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Anschließend wurde mit DMF (3 × 10 min) und Methanol (2 × 5 min) gewaschen und die Zellulose getrocknet. Anschließend erfolgte die zweimalige Kopplung von mit 0.3 M PyBOP aktiviertem Boc-Lys(Fmoc)-OH (0.3 M) in DMF mit DIEA (10% v/v).
Die Abspaltung der N^α-Fmoc-Schutzgruppe erfolgte unter Verwendung von 20 % Piperidine in DMF zweimal für 5 min bzw. 15 min bei RT. Die jeweils erste Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch mit dem Gerät Autospot ASP 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) durchgeführt.
Nach der Beendigung der Synthese der ersten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Anschließend wurde die Dde-Schutzgruppe an der Molekül-Gabel unter Verwendung von 2 % Hydrazin in DMF für 3 × 3 min entfernt. Die Synthese der zweiten Peptidkette wurde nach der Standard-SPOT-Synthesemethode automatisch durchgeführt und nach der Beendigung der Synthese der zweiten Peptidkette wurden die freien N-terminalen Aminogruppen unter Verwendung von 5 % Essigsäureanhydrid/2 % DIEA in DMF für 30 min acetyliert. Die Abspaltung der permanenten Schutzgruppen erfolgte unter Verwendung von 50 % TFA/DCM mit 2 % Triisopropylsilan und 3 % Wasser für 3 h bei RT unter leichtem Schütteln. Anschließend wurde die Zellulose jeweils zweimal 5 min mit DCM, dreimal 15 min mit DMF und zweimal 10 min mit McOH gewaschen, getrocknet und zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Beispiel 3. Immobilisierung von Peptidpaaren über eine Molekül-Gabel an aminofunktionalisierte APEG-Amino-Polypropylen-Oberflächen.
Fmoc-Glu-Lys(Dde)-CONH₂ wurde wie in Beispiel 2 erläutert hergestellt und durch PyBOP aktiviert. Anschließend erfolgt die Kopplung an den (β-Ala)₂ Spacer der APEG-Amino-Polypropylen-oberflächen (AMIS Scientific Products GmbH, Germany). Die weitere Synthese erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 4. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MG1.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG1 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert (8A). Parallel dazu wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, Peptidpaare an MG1 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Fmoc-Seite synthetisiert wurde. An der Dde-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert (8B). Es resultierten jeweils 50 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Strep-tag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
100 nM Streptavidin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia). Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 8)
Beispiel 5. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 75 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Streptag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann. 100 nM Streptavidin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 9) Analog dazu wurde mittels Immobilisierung von Peptidpaaren über MG2 an aminofunktionalisierte APEG-Amino-Polypropylenoberflächen die Streptavidin/Strep-tag II Interaktion analysiert. (10)
Beispiel 6. Kartierung der Länge der Streptavidin/Strep-tag II Interaktionsbereiche unter Verwendung der Molekül-Gabel MG2
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden 6mere bis 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäureshift die Sequenz des Streptavidin-Fragmentes Arg⁵⁹-Ala¹⁰⁰ überspannen, synthetisiert. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch Streptavidin als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Streptag II, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
50 nM Streptavidin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von Streptavidin festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von Streptavidin zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 11)
Beispiel 7. Analyse der Streptavidin/Strep-tag II Interaktion unter Verwendung der Inhibierung mit Biotin
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift, die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert. 60μg Streptavidin wurde mit 6 μg Biotin in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) 60 min vorinkubiert und anschließend über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von Strepatvidin erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). (vgl. 12).
Beispiel 8. Kartierung der Interaktionsstelle des Raf-Peptides RQRSTpSTPNV am 14-3-3 Protein
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock RQRSTpSTPNV (Raf-Peptid) an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide die mit einem 3-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 80 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch 14-3-3 ζ/6 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit Raf peptide, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
150 nM 14-3-3 Protein in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von 14-3-3 Protein erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von 14-3-3 Protein festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von 14-3-3 Protein zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 13)
Beispiel 9. Kartierung der Interaktionsstelle des ARSHpSYPA (mT peptide) am 14-3-3 Protein
Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock ARSHpSYPA (mT peptide) an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 10mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte 14-3-3-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten 120 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch 14-3-3 ζ/6 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit mT peptide, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM 14-3-3 Protein in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von 14-3-3 Protein erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von 14-3-3 ζ/6 festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von 14-3-3 Protein zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 14).
Beispiel 10. Analyse der FKBP12/FAP48 Interaktion
Zunächst wurden mittels klassischer SPOT-Technologie und Proteininteraktionsanalyse die FKBP12-Bindungsstellen in FAP48 kartiert. Dabei wurden zwei Sequenzbereiche in FAP48 gefunden, die eine Interaktion zu FKBP12 vermitteln, FAP48 Lys217-Ser229 (KCPLLTAQFFEQS) und FAP48 Leu307-His319 (LSPLYLLQFNMGH).
Anschließend wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei die konstanten Peptidblöcke Ac-KCPLLTAQFFEQS bzw. Ac-LSPLYLLQFNMGH an der Dde-Seite synthetisiert wurden. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten jeweils 48 individuelle Spots.
Nach der Synthese wurde die trockene, über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch FKBP12 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit dem entsprechenden FAP48-Peptid, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM FKBP12 in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von FKBP12 erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von FKBP12 festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von FKBP12 zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 15A und 15B).
Beispiel 11. Analyse der Interaktion zwischen FKBP12 und der cytosolischen Domäne des EGF-Rezeptors (Aminosäurereste 645-1186)
Zunächst wurden mittels klassischer SPOT-Technologie und Proteininteraktionsanalyse die FKBP12-Bindungsstellen in der cytosolischen Domäne des EGF-Rezeptors (EGFR) kartiert. Dabei wurden fünf Sequenzbereiche in EGFR gefunden, die eine Interaktion zu FKBP12 vermitteln. Unter diesen Sequenzbereichen wurde mit PHVCRLLGICLTS (EGFR Pro⁷⁴⁸-Ser⁷⁶⁰) die Sequenz eines besonders stark interagierenden Peptides ausgewählt.
Anschließend wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, Peptidpaare an MG2 synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Ac- PHVCRLLGICLTS an der Dde-Seite synthetisiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 13mere Peptide die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte FKBP12-Sequenz überspannen, synthetisiert. Es resultierten jeweils 48 individuelle Spots.
Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Der Nachweis einer Interaktion zwischen den Peptiden eines an der Molekül-Gabel immobilisierten Peptidpaares erfolgt durch FKBP12 als Nachweismolekül, welches mit miteinander wechselwirkenden Peptiden keine Interaktion eingehen kann, jedoch mit dem entsprechenden EGFR-Peptid, welches nicht in einer Peptid-Peptid-Interaktion involviert ist, interagieren kann.
200 nM FKBP12 in MP-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl, 0.05 % Tween 20,5 % Sucrose) wurde über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit der Zellulose inkubiert. Ungebundenes Protein wurde durch Waschen mit TBS (4°C) entfernt, gebundenes Protein wurde auf Nitrozellulosemembranen (0.45 μM, PALL Gelman, Deutschland) mittels eines semi-dry blotter (Biometra, Deutschland) elektrotransferiert. Dazu wurden zwei Nitrozellulosemembranen auf beide Seiten der über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose gelegt und diese Anordnung wurde zwischen Blotpapier gelegt, das mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM Glycine, 10 % Methanol) eingeweicht war Der Elektrotransfer wurde bei 0.8 mA/cm² für verschiedene Zeiten durchgeführt (erster Elektrotransferschritt 45 min, zweiter Elektrotransferschritt 90 min). Die Detektion von FKBP12 erfolgte mittels Immundetektion und Visualisierung durch das ECL System (Amersham Pharmacia).
Zur Quantifizierung der Signale erfolgte eine densitometrische Analyse der Intensität jedes Spots durch ein GS-700 Imaging Densitometer (Bio-Rad). Spots, bei denen eine Bindung von FKBP12 festzustellen ist, enthalten nicht miteinander wechselwirkende Peptide während Spots, bei denen keine Bindung von FKBP12 zu detektieren ist, miteinander wechselwirkende Peptide enthalten. (vgl. 16) Beispiel 12. Inhibierung der Streptavidin-Peptid/Strep-tag II Interaktionen unter Verwendung von Biotin und/oder seiner Derivate.
Peptidpaare wurden an MG3 (17A) synthetisiert, wobei der konstante Peptidblock Strep-tag II an der Aloc-Seite synthetisiert und mit einem Fluoresceinrest markiert wurde. An der Fmoc-Seite wurden überlappende 12mere Peptide, die mit einem 2-Aminosäure-shift die gesamte Streptavidin-Sequenz überspannen, synthetisiert und mit einem Dansylrest markiert. Es resultierten jeweils 75 individuelle Spots. Nach der Synthese wurde die trockene über Molekül-Gabeln mit Peptidpaaren modifizierte Zellulose 10 min mit McOH und 3 mal 20 min TBS (30 mM Tris-HCl, pH 7.6, 170 mM NaCl, 6.4 mM KCl) gewaschen. Die Analyse erfolgte über Detektion des Emissionslichtes bei 510-530 nm nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 366 nm mittels des Raytest DIANA Chemiluminescence Detektionssystemes. (17B) Es ergaben sich Unterschiede im Fluoreszenzverhalten der Spots mit unterschiedlichen Peptidpaaren, bei interagierenden Peptidpaaren wurde eine erhöhte Fluoreszenzemission festgestellt.
Zur Inhibierung der Interaktion der Peptidpaare wurde die modifizierte Membran vor der Analyse mit hochaffinen, niedrigaffinen und nichtaffinen Wirkstoff mit ähnlichen chemischen Eigenschaften behandelt. In diesem Beispiel erfolgte die Inkubation für 30 min in einer Lösung, die 0.5 mM Biotin, 1 mM 2-Iminobiotin (Ka=8.0×10⁶ M^–1) bzw.
Diaminobiotin (G.O. Reznik, S. Vajda, T. Sano, C.R. Cantor; 1998, A streptavidin mutant with altered ligand-binding specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13525-13530) enthielt (17C). Nach der Behandlung mit einem Wirkstoff wurde die Zellulose regeneriert durch Behandlung mit Puffer A (Urea 48 g, SDS 1 g, Merkaptoethanol 100 μl, Wasser auf 100 ml auffüllen) und Puffer B (Wasser 40 ml, EtOH 50 ml, Essigsäure 10 ml) Anschliessend erfolgte die Analyse der Fluoreszenzeigenschaften der Spots. Dabei wurde in Gegenwart des hochaffinen Inhibitors Biotin die Fluoreszenzemission der Spots herabgesetzt, alle Spots zeigten sehr ähnliches Fluoreszenzverhalten. In Gegenwart des niedrigaffinen Diaminobiotin war das Fluoreszenzverhalten sehr ähnlich zu dem ursprünglichen Fluoreszenzverhalten komplett ohne Wirkstoff. Das zeigt, dass in Gegenwart eines hochaffinen Wirkstoffes, aber nicht in Gegenwart eines niedrigaffinen Wirkstoffes eine Inhibierung der Interaktion stattfindet. (vgl. 17)

Claims

Vorrichtung zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen umfassend einen Träger auf dem eine Vielzahl von Biomolekülen in einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Anordnung über Linker auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass an jedem Linker je zwei Biomoleküle gebunden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine im wesentlichen gabelförmige Struktur aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker drei reaktive Gruppen enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker über eine reaktive Gruppe kovalent an die Trägeroberfläche gebunden ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Biopolymere sind.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere aus Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere ausgewählt sind aus Terpenen, Nukleinsäuresequenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid-Glycokonjugat-sequenzen.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die an einem Linker gebundenen Biopolymersequenzen durch einen Abstandshalter in einem definierten Abstand zueinander angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Material des Trägers ausgewählt ist aus Glas, Keramik, Metallen und deren Legierungen, Zellulose, Chitin und synthetische Polymere.
Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen von auf einer Oberfläche immobilisierten Biopolymeren umfassend die Schritte: a) des Bereitstellens einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, b) des Einstellens eines definierten Abstands zwischen zwei auf der Oberfläche immobilisierten voneinander unterschiedlichen Biopolymeren c) des Messens eines durch die Wechselwirkung zwischen den zwei unterschiedlichen Biopolymeren hervorgerufenen Signals.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Biopolymere aus Sequenzen von Monomerbausteinen bestehen und ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Terpene, Nukleinsäuresequenzen, Zuckersequenzen, Aminosäuresequenzen und Peptid-Glycokonjugat-sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) die immobilisierten Biopolymere mit einem weiteren Molekül in-Kontakt-gebracht werden, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren, nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, die Proteine, Antikörper und Lektine, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Wechselwirkung zwischen den immobilisierten Biopolymeren durch ein Verfahren erfolgt, das die Anwesenheit des zugegebenen Moleküls anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, das das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe, die Autoradiographie, Plasmonresonanzspektroskopie, Immunologie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Wechselwirkung direkt mittels eines Nachweisverfahrens erfolgt, dass in der Lage ist, zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren zu unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisverfahren unterschiedliche Signale für unterschiedliche Abstände zwischen miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren und nicht miteinander wechselwirkenden, immobilisierten Biopolymeren ergibt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, das Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe, die Kern-Magnetische-Resonanz-Spektroskopie, Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie, CD-Spektroskopie, Massen-Spektrometrie, FT-Infrarot-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Messung der Wechselwirkung ein Hilfsstoff zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff eine deuterierte Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung die Änderung der Austauschgeschwindigkeit von Amid-Deuteronen ermittelt.
Verfahren nach Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, das die Messung mit einem Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, vor der Messung der Wechselwirkung der immobilisierten Biopolymere Aminosäuresequenzgruppen mit Licht geeigneter Frequenz und Intensität selektiv bestrahlt werden, wobei eine kovalente Bindung zwischen den wechselwirkenden Aminosäuresequenzen entsteht.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet dass die Wechselwirkung mit einem Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die MALDI-Massen-Spektrometrie, ESI-Massen-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) die immobilisierten Biopolymere mit einem Reagenz in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Wirkstoffe, potentielle Wirkstoffe, organische Moleküle und Naturstoffe umfasst.