EP1713502A1 - Hochkonzentrierte, flüssige formulierungen von anti-egfr-antikörpern - Google Patents

Hochkonzentrierte, flüssige formulierungen von anti-egfr-antikörpern

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EP1713502A1
EP1713502A1 EP05701212A EP05701212A EP1713502A1 EP 1713502 A1 EP1713502 A1 EP 1713502A1 EP 05701212 A EP05701212 A EP 05701212A EP 05701212 A EP05701212 A EP 05701212A EP 1713502 A1 EP1713502 A1 EP 1713502A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
highly concentrated
liquid formulation
egfr antibody
egfr
formulations
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05701212A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Susanne Matheus
Hanns-Christian Mahler
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Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators

Definitions

  • the invention relates to processes for producing highly concentrated, liquid formulations comprising at least one anti-EGFR antibody and / or one of its variants and / or fragments, in particular monoclonal antibodies against the EGF receptor, particularly preferably Mab C225 (cetuximab) and Mab h425 (EMD 72000), by ultrafiltration.
  • EGF receptor particularly preferably Mab C225 (cetuximab) and Mab h425 (EMD 72000
  • the invention further relates to highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies, in particular of monoclonal antibodies against the EGF receptor, particularly preferably of Mab C225 (cetuximab) and Mab h425 (EMD 72000) and / or their variants and / or fragments, characterized in that the highly concentrated, liquid formulations have an anti-EGFR antibody content of 10-250, preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml and their use.
  • Protein medicinal products such as monoclonal antibodies are used, for example, in tumor therapy, for example for specific immunotherapy or tumor vaccination.
  • Therapeutic proteins are larger and more complex than conventional organic and inorganic active substances, and they have complex three-dimensional structures and numerous functional groups that can cause the biological activity of the protein or can also have undesirable effects.
  • Protein medicinal products are exposed to numerous exogenous influences during manufacture, storage and transport, which can reduce the stability of the protein active ingredient. It is therefore necessary to study the causes and mechanisms of the special degradation reactions carefully, for example by adding certain stabilizing additives
  • No. 6,252,055 describes the production of highly concentrated antibody formulations by means of ultrafiltration, but they do so produced antibody formulations a high proportion of soluble aggregates of ⁇ 4% immediately after production.
  • the antibody formulations obtained are not characterized in terms of their native structure and stability, which is very important, for example, with regard to the immunogenicity and effectiveness of the
  • Antibody formulation is to be considered.
  • Formulations containing Mab C225 (cetuximab) or Mab h425 (EMD 72000) are known from WO03053465 and from WO03007988, but the formulations known from WO03053465 have a relatively low protein concentration and they are not stable in the long term at room temperature.
  • the formulations known from WO03007988 also have a relatively low protein concentration and the preparation (lyophilisate) still has to be reconstituted before use.
  • Protein formulations are known, for example, from WO9300807 or WO9822136, but significant disadvantages of lyophilized preparations are that the user still has to reconstitute the lyophilisate before use, which is a considerable source of error in the preparation before use. Since there is another manufacturing process compared to liquid formulations, the process is in terms of additional effort for process development (ensuring stability in lyophilization), manufacturing (manufacturing costs and duration) and e.g. Validation unfavorable.
  • ultra-concentrated pharmaceutical preparations of anti-EGFR antibodies can be obtained with the aid of ultraflitration processes, the protein concentrations in a liquid formulation of 10-250 mg / ml, particularly preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml enable.
  • the formulations obtained by the ultrafiltration process are preferably stable over a longer period of time or, if necessary, they can be mixed with suitable stabilizing auxiliaries or stabilized by subsequent lyophilization.
  • the formulations according to the invention are physiologically well tolerated, easy to prepare, precisely metered and stable over the duration of storage, under mechanical stress and, for example, in the case of multiple freezing and thawing processes.
  • the highly concentrated formulations of anti-EGFR antibodies produced by the method according to the invention contain a monomer fraction of> 99%.
  • the highly concentrated, liquid formulations according to the invention obtained with a concentration of 10-250 mg / ml, particularly preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml are physically and chemically stable, i.e. that there is no change in the monomer content with a concomitant increase in soluble aggregates, which would be regarded as very critical in terms of effectiveness and immunogenic side effects (Schellekens H. (2002) Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals .: Nat. Rev. Drug Discov ., v. 1, p.
  • the ultrafiltration processes used also do not change the primary structure of the protein.
  • the characterized aggregation products for the highly concentrated, liquid antibody formulations according to the invention are in the range of the specified specifications.
  • formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention described below are surprisingly distinguished by one or more advantages, selected from: high protein concentration, high stability, low tendency to aggregate, low viscosity, high
  • the invention therefore relates to processes for the production of highly concentrated, liquid formulations comprising at least one anti-EGFR antibody and / or one of its variants and / or fragments by ultrafiltration.
  • Methods according to the invention are particularly characterized in that the highly concentrated, liquid formulations obtained have a content of at least one anti-EGFR antibody of 10-250 mg / ml, preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml.
  • anti-EGFR antibodies are monoclonal and of murine or human origin, preferably murine origin and chimeric or humanized.
  • the anti-EGFR antibodies Mab C225 (cetuximab) or Mab h425 (EMD72000) and / or their variants and / or fragments are particularly preferred.
  • Ultrafiltration processes such as stirred ultrafiltration and tangential flow filtration (TFF).
  • the ultrafiltration of the antibodies according to the invention is preferably carried out in a suitable buffer system, ie it is not necessary to stabilize the reaction solutions, for example by means of detergents.
  • a suitable buffer system ie it is not necessary to stabilize the reaction solutions, for example by means of detergents.
  • the use of detergents in preparations for parenteral use should generally be avoided or minimized, since they have a not inconsiderable toxic and immunogenic potential (Sweetana S. & Akers MJ (1996) Solubility principles and practices for parenteral drug dosage form development. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330-342) and they can also lead to changes in the secondary structure of proteins (Vermeer AWP & Norde W. (2000) The influence of the binding of Iow molecular weight surfactants on the thermal stability and secondary structure of IgG.
  • biologically active With regard to the anti-EGFR antibodies according to the invention and in the context of the present invention, “biologically active”, “native” and “effective” are understood to mean that anti-EGFR antibodies according to the invention can continue to exert their biological action even after conversion into formations according to the invention , in particular the binding to EGFR, inhibition of the binding of ligands, in particular EGF, to the EGFR, modulation, in particular inhibition of EGFR-mediated signal transduction and prophylaxis or therapy of EGFR-mediated diseases.
  • anti-EGFR antibodies are preferably monoclonal and of murine or human origin, particularly preferably they are of murine origin and chimeric or humanized.
  • the antibody directed against the receptor of the epidermal growth factor (EGFR) is particularly preferably Mab C225 (cetuximab) or Mab h425 (EMD 72000) and / or their variants or fragments.
  • Other antibodies directed against the EGFR are e.g. in EP0586002 and in J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528).
  • Mab C225 (Cetuximab, Erbitux TM): Mab C225 (Cetuximab) is a clinically proven antibody that binds to the EGF receptor. Mab C225 (cetuximab) is a chimeric antibody whose variable regions are murine and whose constant regions are of human origin. It was first developed by Naramura et al., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 and in WO 96/40210 A1.
  • Mab h425 (EMD 72000) is a humanized monoclonal antibody (Mab), which was obtained from the murine anti-EGFR antibody 425 (Mab 425) (EP0531472).
  • the murine monoclonal antibody Mab 425 was developed in the human carcinoma cell line A431 because it binds to an extracellular epitope of the epidermal growth factor receptor (EGFR). It has been found to inhibit EGF binding (Murthy et al., 1987). Increased expression of EGFR is found in malignant tissues from different sources, making Mab 425 a possible active ingredient for the diagnosis and therapeutic treatment of human tumors.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Mab 425 mediates tumor cytotoxicity in vitro and suppresses the tumor growth of cell lines of epidermoid and colorectal carcinomas in vitro (Rodeck et al., 1987). It was also shown that Mab 425 binds to xenografts of human malignant gliomas in mice (Takahashi et al., 1987). Its humanized and chimeric forms are, for example, from EP0531472; Kettleborough et al., Protein Engineering 1991, 4: 773-783; Bier et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier et al., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46:
  • Mab h425 (EMD 72000) is one in clinical
  • Range is composed of a K and a human ⁇ -1 chain
  • Human anti-EGFR antibodies can be provided according to XenoMouse technology, as described in WO9110741, WO9402602, WO9633735.
  • An antibody produced according to this technology and in clinical trials is, for example, ABX-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).
  • Antibody or immunoglobulin is used in the broadest scope in the context of the present invention and relates in particular to polyclonal antibodies and multispecific antibodies (for example bispecific antibodies) and particularly preferably intact monoclonal Antibodies (Mab) that are biologically active, as well as their variants and fragments. Heteroantibodies which consist of two or more antibodies or their fragments and / or have different binding specificities and are linked to one another are also included. Depending on the amino acid sequence of their constant regions, antibodies can be assigned to different “antibody (immunoglobulin) classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM.
  • Antibodies usually have a molecular weight of approximately 150 kDa and consist of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H).
  • Monoconal antibodies are obtained from a population of homogeneous cells. They are highly specific and are directed against a single epitope, while polyclonal antibodies comprise different antibodies which are directed against different epitopes.
  • Monoclonal antibodies can also be isolated from phage antibody libraries, for example using the methods described in Clackson et al. (Nature, 352: 624-628 (1991)) and Marks et al. (J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)).
  • Variants (muteins) of antibodies are structurally related proteins, for example those which are modified by modifying the primary sequence (amino acid sequence)
  • Variants of the glycosylation sites or structures, also deglycosylated proteins by PEGylation, by production in modified host cells or can be obtained by other techniques.
  • Variants according to the invention are not limited to the examples above, but include all variants of antibodies according to the invention known to the person skilled in the art. Fragments (subsegments) of antibodies are
  • Antibody cleavage products that are obtained, for example, by limited enzymatic digestion using papain, pepsin and plasmin, or by genetic engineering of the subsegments.
  • Typical sub-segments are, for example, the bivalent F (ab ') 2 fragment, the monovalent Fab fragment and the Fc fragment.
  • Fragments according to the invention are not limited to the examples above, but include all fragments of antibodies according to the invention known to the person skilled in the art.
  • composition The terms pharmaceutical formulation and pharmaceutical preparation are used synonymously in the context of the present invention.
  • pharmaceutically acceptable refers to drugs, carriers, excipients, stabilizers, solvents and other agents which enable the pharmaceutical preparations obtained from them to be administered to a mammal without undesirable physiological side effects, such as nausea, dizziness, digestive problems or the like.
  • highly concentrated, liquid formulations of anti- EGFR antibodies preferably have the advantage that direct use is possible, since physiologically harmless agents are used for the production.
  • the production of highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention with preferably simultaneously high yield of native and pharmaceutically acceptable protein of high purity is preferably simple, time-saving and inexpensive.
  • Ultrafiltration is a pressure-driven semi-permeable membrane process for the separation of dissolved and suspended materials.
  • the principle of separation is based on the size and extent of the molecule, i.e. Substances that are smaller than the pore size enter the filtrate (permeate), while substances that are larger than the pore size remain in the retentate (concentrate).
  • the necessary force to carry out the separation can be, for example, by
  • a gas pressure source e.g. nitrogen
  • a diaphragm pump can be applied.
  • Highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention can preferably be prepared by concentrating a solution containing anti-EGFR antibodies according to the invention by means of an ultrafiltration process.
  • a solution with a defined concentration of anti-EGFR antibodies according to the invention (for example for C225: 0.01 to 150 mg / ml, preferably 2 to 100 mg / ml, particularly preferably approximately 20 mg / ml, for EMD 72000) is expediently used : 0.01 to 150 mg / ml, preferably 5 to 100 mg / ml, particularly preferably approx. 20 mg / ml), as obtained in their manufacture, are added to the ultrafiltration unit and subjected to a concentration process under defined, controlled pressure conditions. If the antibody is a solid, for example as
  • Lyophilisate before, the highly concentrated, liquid formulation according to the invention can be prepared by anti-EGFR- Antibody is first dissolved in water or in an aqueous solution containing one or more of the other ingredients and then exposed to the ultrafiltration process.
  • the product obtained by the ultrafiltration process can then be stabilized by adding the auxiliaries listed below.
  • the solution thus obtained, containing the respective antibody is adjusted to a pH of 4 to 10, preferably pH 5 to 9, sterile filtered and, if necessary, converted into a solid form by a subsequent lyophilization step for stabilization.
  • the anti-EGFR antibodies in the highly concentrated, liquid formulations according to the invention are preferably in biologically active form and the methods according to the invention preferably do not result in the antibodies being denatured. In this way, the biological effectiveness of the protein is preferably retained.
  • polyethersulfone (PES) or regenerated cellulose can be used as ultrafiltration membranes: the theoretically conceivable cutoff is in the range between 5 and 500 kDa, preferably between 10 and 100 kDa, particularly preferably between 30 and 50 kDa.
  • the centrifugal forces used for Ultrafree centrifuge tubes are in the range from 1 to 20000 * g, preferably in the range from 1000 to 12000 * g, particularly preferably at 2000 * g.
  • the gas pressure used in the Amicon stirred cell is in the range of 0.1-5 psi, preferably 4 psi.
  • the inlet pressure used in the Labscale TFF system is in the range of 0.1 - 85 psi, preferably in the range of 10-30 psi, particularly preferably at 20 psi.
  • the outlet pressure used in the Labscale TFF system is in the range from 0.1 to 85 psi, preferably in the range from 5 to 20 psi, particularly preferably at 0 psi.
  • Phosphate buffer Na (or K) phosphate
  • Citrate buffer Na citrate or citric acid, possible pH ca 2.2 - 6.5, succinate buffer pH ca 4.8 - 6.3, acetate buffer, e.g. Sodium acetate, pH ca 2.5 - 6.0
  • isotizing agents for isotonization e.g. Na- (or K-) CI or other salts.
  • the buffers mentioned above can be used, for example, in the following concentrations: 1 mM to 200 mM, preferably 2 to 20 mM, particularly preferably about 10 mM.
  • the following isotonizing agents can preferably be used (customary concentrations): sodium chloride approx. 5 mM-305 mM; Potassium chloride; Glucose; glycerol; Dextrose 4-5.5 mM; Sodium sulfate 1- 1.6 mM.
  • the following substances can preferably be used to lower the viscosity: sodium chloride, arginine hydrochloride, Sodium thiocyanate, ammonium thiocyanate, ammonium sulfate, ammonium chloride, calcium chlorides, zinc chlorides, sodium acetate.
  • the following stabilizers can preferably be used: 1) amino acids
  • sucrose (approx. 1 - 200 mg / ml, particularly preferably 30-65 mg / ml) sucrose, lactose, glucose, mannose, maltose, galactose, fructose, sorbose, raffinose, trehalose, glucosamine, N-methylglucosamine, galactosamine, neuraminic acid. 3) Antioxidants
  • BHA butylhydroxyanisole
  • BHT butylhydroxytoluen
  • NDGA nordihydroguaiaretic acid
  • monothioglycerol 0.5% sodium bisulfite 0.15%
  • sodium bisulfite 0.15% sodium bisulfite 0.15%
  • Tocopherols 0.5% glutathione 0.1%.
  • Cclodextrins e.g. Hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutylethyl- ⁇ -cyclodextrin, y-cyclodextrin.
  • HSA Albumine Human Serum Albumin
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • Salts Acetate salts (e.g. sodium acetate), magnesium chloride, calcium chloride,
  • Tromethamine, EDTA e.g. Na-EDTA
  • the invention also encompasses all hydrates, salts and derivatives of the above-mentioned agents known and conceivable to those skilled in the art.
  • the invention further provides highly concentrated, liquid formulations comprising at least one anti-EGFR antibody and / or one of its variants and / or fragments.
  • These highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies can be prepared by the ultrafiltration methods described above.
  • Other conceivable methods of concentration are chromatographic methods, such as size exclusion chromatography (for example gel filtration), affinity chromatography (for example protein A chromatography) or ion exchange chromatography, membrane separation methods such as dialysis, electrodialysis, microfiltration, reverse osmosis, electrophoretic drying or drying processes such as vacuum oven drying, such as nitrogen oven drying , Lyophilization, washing in organic solvents and subsequent air drying, fluid bed drying, fluidized bed drying, spray drying, roller drying, layer drying, air drying at room temperature and subsequent reconstitution in a smaller volume of solvent.
  • Highly concentrated, liquid formulations of anti-EG FR antibodies according to the invention are particularly characterized in that they have a content of at least one anti-EGFR antibody of 10-250 mg / ml, preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml.
  • Highly concentrated, liquid formulations according to the invention are particularly characterized in that the anti-EGFR antibodies are monoclonal and of murine or human origin, preferably murine origin and chimeric or humanized.
  • the anti-EGFR antibodies Mab C225 (cetuximab) or Mab h425 (EMD72000) and / or their variants and / or fragments are particularly preferred.
  • the invention further relates to highly concentrated, liquid formulations comprising at least one anti-EGFR antibody and / or one of its variants and / or fragments obtainable by processes according to the invention, i.e. by the ultrafiltration method described above.
  • the invention also relates to highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention as storage-stable pharmaceuticals.
  • Highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention can optionally contain carriers and / or auxiliaries and / or further pharmaceutical active substances in addition to antibodies according to the invention.
  • the methods according to the invention preferably make it possible to prepare highly concentrated formulations without causing undesirable, undesirable aggregations of the antibodies according to the invention. Ready-to-use solutions with a high proportion of active ingredient can thus be prepared using the inventive methods. More recently, as possible, are increasing highly concentrated formulations of protein active ingredients required. Most of the antibodies used for therapy are dosed in the mg / kg range. A high dose and small volumes to be applied (for example approx. 1 to 1.5 ml with subcutaneous application) show the need for highly concentrated protein preparations with concentrations of more than 100 mg / ml.
  • highly concentrated protein formulations can be used in preclinical tests to investigate the safety and efficacy in vitro and in vivo (on animal models), in clinical tests to investigate the safety and efficacy in humans and in the clinical use of the product (especially for subcutaneous application).
  • the main advantages are that a lower volume of preparation has to be used.
  • Protein drug possible for the patient can have various reasons. For example, special targeting may be desired, which is related to a “therapeutic window”. Furthermore, subcutaneous application has the advantage that the patient can carry out the application himself without being dependent on medical personnel. The example of the insulin shows these advantages clearly, however, since the injections for subcutaneous administration can amount to a maximum of 1 - 1.5 ml, highly concentrated protein formulations with more than 100 mg / ml are often necessary.
  • highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies can be obtained with the method according to the invention, which formulate the protein concentrations of 10-250 mg / ml, preferably 50-180 mg / ml, particularly preferably 100-150 mg / ml Disadvantages not mentioned above.
  • the limit in known highly concentrated formulations of immunoglobulins is ready to use liquid formulations of antibodies normally at 2 - 50 mg / ml (Humira ®)
  • highly concentrated stable antibody formulations can be obtained by the method according to the invention, which has a reduced viscosity and tendency to aggregate compared to known highly concentrated, liquid antibody formulations and thereby thereby facilitates handling during parenteral administration.
  • Antibody-containing solutions with a pH of 4 to 10, preferably with a pH of 5 to 9, and an osmolality of 250 to 350 mOsmol / kg can advantageously be prepared from the formulations according to the invention.
  • Formulations according to the invention can thus be administered directly intravenously, intraarterially and also subcutaneously, largely without pain.
  • the preparation can also contain infusion solutions such as Glucose solution, isotonic saline or Ringer's solution, which can also contain other active ingredients, can be added so that even larger amounts of active ingredient can be applied.
  • the formulations according to the invention are physiologically well tolerated, easy to prepare, precisely metered and preferably stable over the duration of storage and transport and in the case of multiple freezing and thawing processes with regard to content, decomposition products and aggregates. They can preferably be stored stably at refrigerator temperature (2-8 ° C) and at room temperature (23-27 ° C) and 60% relative humidity (RH) over a longer period of time.
  • Formulations according to the invention are preferably comparatively stable even at higher temperatures and atmospheric humidity.
  • effective amount means the amount of a drug or active pharmaceutical ingredient that elicits a biological or medical response in a tissue, system, animal or human that is sought or sought by a researcher or medical professional, for example.
  • terapéuticaally effective amount means an amount which, compared to a subject who did not receive this amount, does the following: improves
  • the term "therapeutically effective amount” also includes the amounts that are effective in increasing normal physiological function.
  • Medicaments can be administered in the form of dose units which contain a predetermined amount of active ingredient per dose unit.
  • a unit can contain, for example, 0.5 mg to 1 g, preferably 1 mg to 800 mg, of an active ingredient according to the invention, depending on the condition of the disease being treated, the route of administration and the age, weight and condition of the patient.
  • Preferred dosage unit formulations are those which contain a daily dose or partial dose, as stated above, or a corresponding fraction thereof of an active ingredient.
  • such pharmaceuticals can be produced using one of the methods generally known in the pharmaceutical field.
  • Drugs can be administered for administration by any suitable route, including oral (including buccal or sublingual), rectal, pumonal, nasal, topical (including buccal, sublingual, or transdermal), vaginal, or parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intradermal) routes.
  • oral including buccal or sublingual
  • rectal including buccal or sublingual
  • pumonal nasal
  • topical including buccal, sublingual, or transdermal
  • vaginal including subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intradermal
  • parenteral including subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intradermal
  • Carrier (s) or auxiliary (s) is brought together.
  • Parenteral administration is preferably suitable for the administration of the medicaments according to the invention.
  • intravenous, subcutaneous or intradermal administration is particularly preferred.
  • intravenous administration the injection can take place directly or as an additive to infusion solutions.
  • Medicaments according to the invention are particularly suitable for subcutaneous or intradermal application, since with the aid of highly concentrated, liquid formulations according to the invention, the volumes to be administered which are low for subcutaneous administration can be achieved.
  • formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention are also suitable for the production of medicaments to be administered parenterally with controlled, uniform and / or delayed active substance release (slow-release, sustained-release, controlled release), for example also for the preparation of depot formulations which are advantageous for the patient, since application is only necessary at larger time intervals.
  • Pharmaceutical preparations according to the invention can also be injected directly into the tumor and thus have their effect directly at the intended site of action.
  • Drugs adapted for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injection solutions containing antioxidants, buffers, bacteriostatics and solutes, which render the formulation isotonic with the blood of the recipient to be treated; as well as aqueous and non-aqueous sterile
  • Suspensions that may contain suspending agents and thickeners.
  • the formulations can be in single dose or multiple dose containers, e.g. sealed ampoules and vials, presented and stored in the freeze-dried (lyophilized) state so that only the addition of the sterile carrier liquid, e.g. Water for injections is required immediately before use.
  • sterile carrier liquid e.g. Water for injections
  • Injection solutions and suspensions prepared according to the recipe can be made from sterile powders, granules and tablets.
  • the formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention can also be in the form of liposome delivery systems, such as e.g. administer small unilamellar vesicles, large unilamellar vesicles and multilamellar vesicles.
  • Liposomes can be made from various phospholipids, e.g. Cholesterol, stearylamine or phosphatidylcholines are formed.
  • Medicaments adapted for topical administration can be formulated into the formulations according to the invention as ointments, creams, suspensions, lotions, solutions, pastes, gels, sprays, aerosols or oils.
  • formulations are preferably introduced and applied in topical ointment or cream.
  • formulations according to the invention can be introduced either into a paraffinic or a water-miscible cream base.
  • a formulation according to the invention can be used in a cream an oil-in-water cream base or a water-in-oil base.
  • Drugs adapted to topical application to the eye include eye drops.
  • Drugs adapted for rectal administration can be given in the form of suppositories or enemas.
  • Medicaments adapted for administration by inhalation include fine particulate dusts or mists, which can be generated by means of various types of pressurized metering dispensers with aerosols, nebulizers or insufflators.
  • Medicines adapted for vaginal administration can be presented as pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or spray formulations.
  • the pharmaceuticals according to the invention can contain, in addition to the above-mentioned components mentioned in particular, other agents customary in the art with reference to the particular type of pharmaceutical formulation.
  • the invention further relates to sets (kits) consisting of separate packs of a) a formulation according to the invention, comprising an effective amount of an anti-EGFR antibody, preferably a monoclonal anti-EGFR antibody, particularly preferably Mab C225 (cetuximab) or Mab h425 (EMD 72000) and / or their variants or fragments, and b) a formulation containing an effective amount of a further active pharmaceutical ingredient.
  • the set contains suitable containers, such as boxes or cartons, individual bottles, bags or ampoules.
  • the set can contain, for example, separate ampoules, each of which contains a formulation according to the invention, containing an effective amount of an anti-EGFR antibody according to the invention and a formulation of a further active pharmaceutical ingredient in dissolved or in lyophilized form.
  • a therapeutically effective amount of an anti-EFGR antibody of the invention depends on a number of factors including, for example, the age and weight of the patient, the exact condition of the disease requiring treatment, as well as its severity, the nature of the formulation and the route of administration, and is ultimately determined by the attending doctor or veterinarian.
  • an effective amount of an anti-EFGR antibody according to the invention for the treatment of neoplastic growth, for example colon or breast carcinoma is generally in the range from 0.1 to 100 mg / kg body weight of the recipient (mammal) per day and particularly typically in the Range from 1 to 0 mg / kg body weight per day.
  • the actual amount per day would usually be between 70 and 700 mg, which amount as a single dose per day or more usually in a series of divided doses (such as two, three, four, five or six) per Day can be given so that the total daily dose is the same.
  • the suitable antibody titer is determined by methods known to those skilled in the art.
  • the dosage intended for administration is generally sufficient to achieve the desired tumor-inhibiting effect. However, the dosage should also be chosen to be as low as possible so that no side effects, such as undesirable cross-reactions, anaphylactic reactions or the like occur.
  • Medicaments according to the invention can be used in particular for prophylaxis and / or for the treatment of diseases and disease states.
  • Another object of the invention is therefore the use of highly concentrated, liquid formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of tumors and / or tumor metastases, the tumor being selected from the group consisting of brain tumor , Tumor of the genitourinary tract, tumor of the lymphatic system, stomach tumor,
  • Larynx tumor Larynx tumor, monocyte leukemia, lung adenocarcinoma, small cell lung carcinoma, pancreatic cancer, glioblastoma and breast carcinoma.
  • EGFR is blocked by antibodies at different levels against tumors, for example by inhibiting cancer cell proliferation, reducing tumor-mediated angiogenesis, inducing cancer cell apoptosis and increasing the toxic effects of radiation therapy and conventional chemotherapy ,
  • Medicaments containing formulations according to the invention can effectively regulate, modulate or inhibit EGFR and can therefore be used for the prevention and / or treatment of diseases in connection with unregulated or impaired EGFR activity.
  • the formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention can therefore be used in the treatment of certain forms of cancer, and in diseases such as diabetic retinopathy or inflammation caused by pathological angiogenesis.
  • Another object of the invention is therefore the use of formulations according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases caused, mediated and / or propagated by EGFR and / or by EGFR-mediated signal transduction.
  • Medicaments according to the invention are particularly suitable for the treatment and / or prophylaxis of cancer, including solid carcinomas, such as, for example, carcinomas (for example the lungs, pancreas, thyroid, bladder or colon), myeloid diseases (for example myeloid leukemia) or adenomas ( eg villous colon adenoma), pathological angiogenesis and metastatic cell migration.
  • solid carcinomas such as, for example, carcinomas (for example the lungs, pancreas, thyroid, bladder or colon), myeloid diseases (for example myeloid leukemia) or adenomas ( eg villous colon adenoma), pathological angiogenesis and metastatic cell migration.
  • the drugs are also useful in the treatment of complement activation dependent chronic inflammation (Niculescu et al. (2002) Immunol. Res., 24: 191-199) and immunodeficiency induced by HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1) (Popik et al. (1998)
  • EGFR-related diseases refers to pathological conditions that are dependent on EGFR activity.
  • EGFR is either directly or indirectly involved in the signal transduction pathways of various cell activities, including proliferation, adhesion, and migration, as well as differentiation associated with EGFR activity include tumor cell proliferation, pathological neovascularization that promotes the growth of solid tumors, neovascularization (diabetic retinopathy, age-related macular degeneration and the like), and inflammation (psoriasis, rheumatoid arthritis and the like).
  • the diseases discussed here are divided into two groups, hyperproliferative and non-hyperproliferative diseases.
  • psoriasis, arthritis, inflammation, endometriosis, scarring, benign prostatic hyperplasia, immunological diseases, autoimmune diseases and immune deficiency diseases are considered non-cancerous diseases, of which arthritis, inflammation, immunological diseases, autoimmune diseases and immune deficiency diseases are usually regarded as non-hyperproliferative diseases.
  • brain cancer, lung cancer, squamous cell cancer, bladder cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, kidney cancer, colorectal cancer, breast cancer, head cancer, neck cancer, esophageal cancer, gynecological cancer, thyroid cancer, lymphoma, chronic leukemia, all cancerous diseases and all types of acute leukemia belong to the group of hyperproliferative diseases.
  • cancerous cell growth and in particular cancerous cell growth mediated directly or indirectly by EGFR is a disease which is an object of the present invention.
  • the drugs according to the invention have an in vivo antiproliferative effect in a xenograft tumor model.
  • the medicaments according to the invention are administered to a patient with a hyperproliferative disease, e.g. For example, to inhibit tumor growth, to reduce the inflammation associated with a lymphoproliferative disease, to inhibit graft rejection or neurological damage due to tissue repair, etc.
  • the present drugs are useful for prophylactic or therapeutic purposes.
  • the term "treat" is used to refer to both the prevention of diseases and the treatment of pre-existing conditions.
  • the prevention of proliferation is accomplished by administering the pharmaceutical compositions of the invention prior to the development of the evident disease, e.g., to prevent tumor growth , Preventing metastatic growth, reducing cardiovascular disease Surgery associated restenosis, etc. achieved.
  • the drugs are used to treat persistent diseases by stabilizing or improving the patient's clinical symptoms.
  • the host or patient can belong to any mammalian species, e.g. a primate species, especially humans; Rodents, including mice, rats and hamsters; Rabbits; Horses, cattle, dogs, cats, etc. Animal models are of interest for experimental studies, providing a model for treating a human disease.
  • mammalian species e.g. a primate species, especially humans; Rodents, including mice, rats and hamsters; Rabbits; Horses, cattle, dogs, cats, etc. Animal models are of interest for experimental studies, providing a model for treating a human disease.
  • the susceptibility of a particular cell to treatment with the medicaments according to the invention can be determined by in vitro tests. Typically, a culture of the cell is incubated with a drug of the invention at various concentrations for a period of time sufficient to enable the drugs to induce cell death or to inhibit migration, usually between about an hour and a week. Cultured cells from a biopsy sample can be used for in vitro tests. The viable cells remaining after treatment are then counted.
  • a therapeutic dose is sufficient to significantly reduce the undesired cell population in the target tissue while maintaining the patient's viability. Treatment generally continues until there is a substantial reduction, e.g. B. at least about 50% reduction in the specific cell number and can be continued until essentially no unwanted cells are detected in the body.
  • Various assay systems are available for the identification of EGFR inhibitors. In the scintillation proximity assay (Sorg et al., J. of. Biomolecular Screening, 2002, 7, 11-19) and the flash plate assay, the radioactive phosphorylation of a protein or peptide is considered
  • phospho-AK specific phospho-antibodies
  • the phospho-AK only binds the phosphorylated substrate. This binding can be detected with a second peroxidase-conjugated anti-sheep antibody by chemiluminescence (Ross et al., 2002, Biochem. J., immediately before publication, manuscript BJ20020786).
  • the diseases and disease states which can be treated, prevented or alleviated by the medicaments according to the invention include, but are not limited to, the diseases and disease states listed below.
  • the medicaments of the invention are useful in the treatment and / or prophylaxis of a number of different diseases and conditions in which proliferation and / or migration of smooth muscle cells and / or inflammatory cells into the intimal layer of a vessel occurs, resulting in reduced blood flow to this vessel, e.g. B. in neointimal occlusive lesions.
  • Transplant vascular diseases of interest include atherosclerosis, coronary vascular disease after transplantation, vein graft stenosis, peri-anastomotic prosthesis restenosis, restenosis after angioplasty or stent placement and the like.
  • the present invention comprises the use of the medicaments according to the invention for the treatment or prevention of cancer.
  • a particularly preferred object of the invention is therefore the use of liquid formulations according to the invention of anti-EGFR antibodies for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of tumors and / or tumor metastases, the tumor being particularly preferably selected from the group consisting of brain tumor , Tumor of the genitourinary tract, tumor of the lymphatic system, stomach tumor, larynx tumor, monocyte leukemia, lung adenocarcinoma, small cell lung carcinoma, pancreatic cancer, glioblastoma and breast carcinoma, but are not limited to this.
  • Another object of the invention is the use of medicaments according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases, selected from the group of cancerous diseases consisting of squamous cell cancer, bladder cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, colorectal cancer, breast cancer, head cancer, neck cancer, esophageal cancer, gynecological Cancer, thyroid cancer, lymphoma, chronic leukemia and acute leukemia.
  • diseases selected from the group of cancerous diseases consisting of squamous cell cancer, bladder cancer, stomach cancer, liver cancer, kidney cancer, colorectal cancer, breast cancer, head cancer, neck cancer, esophageal cancer, gynecological Cancer, thyroid cancer, lymphoma, chronic leukemia and acute leukemia.
  • the medicaments according to the invention can be administered to patients for the treatment of cancer.
  • the present drugs inhibit tumor angiogenesis and thus influence the growth of tumors (J. Rak et al. Cancer Research, 55: 4575-4580, 1995).
  • the angiogenesis-inhibiting properties of the invention Medicines are also useful for treating certain forms of blindness associated with retinal vascularization.
  • the invention therefore also relates to the use of formulations according to the invention for anti-EGFR antibodies for
  • Such a disease, in which angiogenesis is involved, is one
  • Eye disease such as retinal vascularization, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration and the like.
  • the invention therefore also relates to the use of anti-EGFR antibody formulations according to the invention
  • a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases selected from the group consisting of retinal vascularization, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration and / or inflammatory diseases.
  • Another object of the invention is the use of formulations according to the invention of anti-EGFR antibodies for the treatment and / or prophylaxis of diseases, selected from the group consisting of psoriasis, rheumatoid arthritis, contact dermatitis, late type of hypersensitivity reaction, inflammation, endometriosis, scarring, benign prostatic hyperplasia, immunological diseases, autoimmune diseases and immune deficiency diseases.
  • diseases selected from the group consisting of psoriasis, rheumatoid arthritis, contact dermatitis, late type of hypersensitivity reaction, inflammation, endometriosis, scarring, benign prostatic hyperplasia, immunological diseases, autoimmune diseases and immune deficiency diseases.
  • the invention also relates to the use of formulations according to the invention of anti-EGFR antibodies for the treatment and / or prophylaxis of bone pathologies, selected from the group consisting of osteosarcoma, osteoarthritis and rickets.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be used to provide additive or synergistic effects in certain existing cancer chemotherapy and radiation treatments, and / or can be used to improve the efficacy of certain existing ones
  • the invention therefore also relates to the use of formulations according to the invention of anti-EGFR antibodies for the production of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases, a therapeutically effective amount of an anti-EGFR antibody according to the invention in combination with a compound from group 1 ) Estrogen receptor modulator, 2) androgen receptor modulator, 3) retinoid receptor modulator, 4) cytotoxic, 5) antiproliferative agent, 6) prenyl protein transferase inhibitors, 7) HMG-CoA reductase inhibitors, 8) HIV protease inhibitors, 9) reverse inhibitors, 9 Transcriptase inhibitors, 10) growth factor receptor inhibitors and 11) angiogenesis inhibitors is administered.
  • a compound from group 1 Estrogen receptor modulator, 2) androgen receptor modulator, 3) retinoid receptor modulator, 4) cytotoxic, 5) antiproliferative agent, 6) prenyl protein transferase inhibitors, 7) HMG-CoA reduc
  • the invention therefore also relates to the use of formulations according to the invention of anti-EGFR antibodies for the production of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases, a therapeutically effective amount of an anti-EGFR antibody according to the invention in combination with radiotherapy and a compound from the Group 1) estrogen receptor modulator, 2) androgen receptor modulator, 3) retinoid receptor modulator, 4) cytotoxic agent, 5) antiproliferative agent, 6) prenyl protein transferase inhibitors, 7) HMG-CoA reductase inhibitors, 8) HIV protease inhibitors, 9) Reverse transcriptase inhibitors, 10) growth factor receptor inhibitors and 11) angiogenesis inhibitors is administered.
  • compositions according to the invention can thus also be administered together with other well-known therapeutic agents, which are selected on the basis of their particular suitability for the condition being treated.
  • therapeutic agents which are selected on the basis of their particular suitability for the condition being treated.
  • combinations which have bisphosphonates with an anti-resorptive effect such as alendronate and
  • integrin blockers such as ⁇ vß3 antagonists, conjugated estrogens used in hormone therapy such as Prempro®, Premarin® and Endometrion®; contain selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as raloxifene, droloxifene, CP-336,156 (Pfizer) and lasofoxifene, cathepsin K inhibitors and ATP proton pump inhibitors.
  • SERMs selective estrogen receptor modulators
  • the present drugs are also suitable for combination with known anti-cancer agents.
  • known anti-cancer agents include the following: estrogen receptor modulators, androgen receptor modulators, retinoid receptor modulators, cytotoxics, antiproliferative agents, prenyl protein transferase inhibitors, HMG-CoA reductase inhibitors, HIV protease inhibitors, and inhibitor inhibitors, reverse transgene inhibitors, reverse transcriptors ,
  • the present compounds are particularly suitable for joint use with radiotherapy.
  • Estrogen receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of estrogen to the receptor, regardless of how this is done.
  • the estrogen receptor modulators include, for example, tamoxifen, raloxifene, idoxifene, LY353381, LY 117081, toremifene, fulvestrant , 4- [7- (2,2-), raloxifene, idoxifene, LY353381, LY 117081, toremifene, fulvestrant , 4- [7- (2,2-
  • Androgen receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of androgens to the receptor, regardless of how this is done Androgen receptor modulators include, for example, finasteride and other 5 ⁇ -reductase inhibitors, nilutamide, flutamide, bicalutamide, liarozole and
  • Retinoid receptor modulators refers to compounds that interfere with or inhibit the binding of retinoids to the receptor, regardless of how this is done.
  • retinoid receptor modulators include, for example, bexarotene, tretinoin, 13-cis-retinoic acid, 9- cis-retinoic acid, ⁇ -difluoromethylornithine, ILX23-7553, trans-N- (4'-hydroxyphenyl) retinamide and N-4-carboxyphenylretinamide.
  • Cytotoxics refers to compounds that are primarily affected by direct action on cell function lead to cell death or which inhibit or interfere with cell myosis, including alkylating agents, tumor necrosis factors, intercalating agents, microtubulin inhibitors and topoisomerase inhibitors.
  • Cytotoxic agents include, for example tirapazimine, sertenef, cachectin, ifosfamide, tasonermin, lonidamine, carboplatin, altretamine, prednimustine, Dibromdulcit, ranimustine, fotemustine, nedaplatin, oxaliplatin, temozolomide, heptaplatin, estramustine, improsulfan tosylate, trofosfamide, nimustine, Dibrospidium- chloride, Pumitepa, lobaplatin, satraplatin, profiromycin, cisplatin, irofulven, dexifosfamide, cis-amine dichloro (2-methylpyridine) platinum, benzylguanine, glufosfamide, GPX100, (trans, trans, trans) -bis-mu- (hexane-1, 6 -diamine) -mu-
  • microtubulin inhibitors include, for example, paclitaxel, vindesine sulfate, S ' ⁇ ' - Dideshydro ⁇ '- deoxy- ⁇ '-norvincaleukoblastin, docetaxol, Rhizoxin, dolastatin, mivobulin isethionate, auristatin, cemadotin, RPR109881, BMS184476, vinflunine, cryptophycin, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N- (3-fluoro-4-methoxyphenyl) benzenesulfonamide, anhydrovinblastine, N, N - dimethyl-L-valyl-L-valyl-N-methyl-L-valyl-L-prolyl-L-prolin-t-butylamide, TDX258 and BMS188797.
  • paclitaxel vindesine sulfate
  • Topoisomerase inhibitors are, for example, topotecan, hycaptamine, irinotecan, rubitecan, 6-ethoxypropionyl-3 ', 4 * -O-exo-benzylidene-chartreusin, 9-methoxy-N, N-dimethyl-5-nitropyrazolo [3,4, 5-kl] acridin-2- (6H) propanamine, 1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1 H, 12H-benzo [de] pyrano [ 3 ', 4 * : b, 7] indolizino [1, 2b] quinoline-10, 13 (9H, 15H) - dione, lurtotecan, 7- [2- (N-isopropylamino) ethyl] - (20S) camptothecin, BNP1350 , BNPI1100, BN80915, BN80942,
  • antiproliferative agents include antisense RNA and DNA oligonucleotides such as G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 and INX3001, as well as antimetabolites such as enocitabine, Carmofur, Tegafur, pentostatin, doxifluridine, trimetrexate, flabinarababin, capud ocfosfate, fosteabin sodium hydrate, raltitrexed, paltitrexid, emitefur, tiazofurin, decitabine, nolatrexed, pemetrexed, nelzarabine, 2'-deoxy-2'-methylidencytidine, 2'-fluoromethylene-2'-deoxycytidine, N- [5- 3- dihydrobenzofuryl) sulfonyl] -N '- (3,4-dichlorophenyl) urea, N6- [4-deoxy- 4- [N
  • antiproliferative agents include monoclonal antibodies to growth factors other than those already mentioned under the “angiogenesis inhibitors”, such as trastuzumab, and tumor suppressor genes, such as p53, which can be released via recombinant virus-mediated gene transfer (see, for example, US Pat. No. 6,069,134).
  • Medicaments according to the invention can also be used in combination mi t all other therapeutic antibodies known to the person skilled in the art or pharmaceutical active substances suitable in connection with the abovementioned diseases are administered.
  • formulations of anti-EGFR antibodies according to the invention can be used to isolate and to study the activity or expression of EGFR. They are also particularly suitable for use in diagnostic procedures for diseases related to unregulated or impaired EGFR activity.
  • Antibodies according to the invention can, for example, be radioactively labeled for diagnostic purposes.
  • a preferred labeling method is the iodogen method (Fraker et al., 1978).
  • the antibody is particularly preferably used as an F (ab ') 2 fragment. This gives excellent results so that no background subtraction is necessary.
  • F (ab ') 2 fragment can be produced by known methods (eg, Herlyn et al., 1983). In general, pepsin digestion is performed at acidic pH and the fragments separated from undigested IgG and heavy chain fragments by Protein A-Sepharose TM chromatography.
  • the anti-EGFR antibodies preferably show an advantageous biological activity in formulations according to the invention, which is easily detectable in enzyme assays, as described in the examples.
  • the antibodies according to the invention preferably show and bring about an inhibitory effect which is usually documented by IC 50 values in a suitable range, preferably in the micromolar range and more preferably in the nanomolar range.
  • IC 50 values in a suitable range, preferably in the micromolar range and more preferably in the nanomolar range.
  • Glycosylation patterns of the antibodies according to the invention in formulations according to the invention include, but are not limited to, SE-HPLC, peptide mapping (digestion), N-terminal sequencing, SDS page, Tris-glycine gradient gel (non-reducing), FTIR method (Fourier transform infrared spectra), CD (circular dichroism), RAMAN spectroscopy, carbohydrate staining (PAS method), oligosaccharide profiling, determination of the monosaccharide composition or isoelectric focusing.
  • the stability of formulations according to the invention can be determined, for example, without being restricted thereto, using stability programs, for example storage at 25 ° C. and 60% relative atmospheric humidity and at 40 ° C. and 70% relative atmospheric humidity over a longer period of time and determination of the stability or structural integrity of the protein at regular intervals, for example, by the detection methods mentioned above (SE-HPLC, FT-IR; SDS-PAGE (reducing or non-reducing)).
  • Detection methods for the biological activity or effectiveness of antibodies according to the invention in formulations according to the invention include, but are not limited to, ELISA, biological cell assays, FTIR or CD.
  • Detection methods of reduced tendency towards aggregation of highly concentrated formulations include, but are not limited to, visual control, sub-visible particle analysis, nephelometry or turbidimetry, dynamic light scattering characterization.
  • Example 1 Preparation of a highly concentrated liquid anti-EGFR antibody formulation by tangential flow filtration (TFF)
  • 25 ml protein (10 mg / ml in 10 mM phosphate + 145 mM NaCl, pH 7.2) are concentrated using an Amicon stirred cell with built-in polyethersulfone ultrafiltration membrane with a cutoff of 30 kDa for 144 min at a nitrogen gas pressure of 4 bar.
  • the retentate obtained has a protein concentration of approx. 92 mg / ml.
  • the yield is 95%.
  • Example 3 Preparation of a highly concentrated liquid formulation of anti-EGFR antibodies by ultrafiltration under the action of centrifugal forces
  • the retentate obtained has a protein concentration of approximately 116 mg / ml.
  • the yield is 95%.
  • Example 4 Examination for soluble aggregates of the highly concentrated liquid formulation of anti-EGFR antibodies The retentates obtained in Examples 1 to 3 were examined by SE-HPLC for the content of soluble aggregates. The concentration of monomer after concentration was> 99%.
  • Example 5 Examination for nativity of the highly concentrated liquid formulation of anti-EGFR antibodies
  • Example 2 The retentates obtained in Example 1 were examined by FT-IR spectrometry.
  • the amides were I-2. Derivation spectra of the starting material before concentration by means of tangential flow filtration and the retentate obtained congruent.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung hochkonzentrierter, flüssiger Formulierungen enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente, insbesondere monoklonale Antikörpern gegen den EGF-Rezeptor, besonders bevorzugt von Mab C225 (Cetuximab) und Mab h425 (EMD 72000), durch Ultrafiltration. Die Erfindung betrifft weiterhin hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern gegen den EGF-Rezeptor, besonders bevorzugt Mab C225 (Cetuximab) und Mab h425 (EMD 72000) und/oder deren Varianten und/oder Fragmente, dadurch gekennzeichnet, dass die hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen einen Gehalt von anti-EGFR-Antikörpern von 10 - 250, bevorzugt 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml aufweisen und deren Verwendung.

Description

Hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR- Antikörpern
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betπfft Verfahren zur Herstellung hochkonzentrierter, flüssiger Formulierungen enthaltend wenigstens einen anti-EGFR- Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente, insbesondere monoklonale Antikörpern gegen den EGF-Rezeptor, besonders bevorzugt Mab C225 (Cetuximab) und Mab h425 (EMD 72000), durch Ultrafiltration. Die Erfindung betrifft weiterhin hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpem, insbesondere von monoklonalen Antikörpern gegen den EGF-Rezeptor, besonders bevorzugt von Mab C225 (Cetuximab) und Mab h425 (EMD 72000) und/oder deren Varianten und/oder Fragmente, dadurch gekennzeichnet, dass die hochkonzentrierten, flüssigen Formulierungen einen Gehalt von anti-EGFR-Antikörpern von 10 - 250, bevorzugt 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml aufweisen und deren Verwendung.
Fortschritte im Bereich der Biotechnologie machten es im Laufe der letzten 10 Jahre möglich eine Reihe von Proteinen zur pharmazeutischen Anwendung mittels rekombinanter DNA-Techniken herzustellen. Proteinarzneimittel wie monoklonale Antikörper finden ihre Anwendung beispielsweise in der Tumortherapie, z.B. zur spezifischen Immuntherapie oder Tumorvakzinierung. Therapeutische Proteine sind größer und komplexer als herkömmliche organische und anorganische Wirkstoffe und sie weisen komplexe dreidimensionale Strukturen und zahlreiche funktioneile Gruppen auf, die die biologische Aktivität des Proteins bedingen oder auch unerwünschte Wirkungen hervorrufen können. Proteinarzneimittel sind während Herstellung, Lagerung und Transport zahlreichen exogenen Einflüssen ausgesetzt, die sich stabilitätsmindernd auf den Proteinwirkstoff auswirken können. Es ist daher erforderlich, die Ursachen und Mechanismen der speziellen Abbaureaktionen genau zu studieren, um z.B. durch Zusatz bestimmter stabilisierender Hilfsstoffe das
Protein stabilisieren zu können (siehe z.B. Manning M.C., Patel K., & Borchardt R.T. (1989) Stability of protein pharmaceuticals. Pharm. Res. 6, 903-918).
Aus der Literatur sind zahlreiche Formulierungen therapeutischer Proteine bekannt. Die Anforderungen an die Zusammensetzung einer pharmazeutischen Zubereitung von Proteinwirkstόffen können jedoch sehr unterschiedlich sein und im Allgemeinen ist es aufgrund spezifischer physikochemischer Eigenschaften und Abbaureaktionen der unterschiedlichen Proteine nicht möglich, bereits etablierte
Proteinformulierungen auf neue Protein-Wirkstoffe zu übertragen. Deshalb sind geeignete pharmazeutische Formulierungen dieser neuartigen Wirkstoffe noch immer eine große Herausforderung.
In bisheriger Literatur wird zwar die Ultrafiltration als Standardmethode im Downstreamprocessing bei der Aufreinigung von rekombinaten Proteinen beschrieben (Taylor and Francis (2000) Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, London, p. 1-212; McPherson A. (1989) Separation Methods, Preparation and Analysis of Protein Crystals: New York, Robert E. Krieger Publishing Co., Inc., p. 1-51) allerdings werden beim Downstreamprocessing keine vorteilhaft hohen Konzentrationen erzielt. Zudem kann es durch nachfolgende Aufreinigungs- und Chromatographieschritte wieder zur Verdünnung der erhaltenen Prozesslösungen kommen.
Die US 6,252,055 beschreibt zwar die Herstellung von hochkonzentrierten Antikörperformulierungen mittels Ultrafiltration, allerdings weisen die so hergestellten Antikörperformulierungen bereits direkt nach Herstellung einen hohen Anteil an löslichen Aggregaten von ≥ 4% auf. Zudem werden die erhaltenen Antikörperformulierungen nicht hinsichtlich ihrer nativen Struktur und Stabilität charakterisiert, was beispielsweise als sehr wichtig im Hinblick auf die Immunogenität und Wirksamkeit der
Antikörperformulierung anzusehen ist.
Der nachteilige Einfluss von Aggregaten auf die verstärkte Immunogenität und verminderte Wirksamkeit sowie die reduzierte Bioverfügbarket von Proteinformulierungen ist bereits aus der Literatur bekannt (S. A. Marshall, G. A. Lazar, A. J. Chirino, and J. R. Desjarlais. Rational design and engineering of therapeutic proteins. Drug Discovery Today 8 (5):212-221 , 2003; Schellekens H. Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov 1 (6):457-462, 2002).
Aus obengenannten Gründen wird klar, dass sich die Herstellung von flüssigen hochkonzentrierten Formulierungen von Antikörpern, die über eine ausreichend lange Zeit stabil sind, für den Fachmann als äußerst schwierig gestaltet. Zudem war die Herstellung einer hochkonzentrierten flüssigen Formulierung für den Fachmann unattraktiv, da die stark ausgeprägte Aggregationstendenz von Proteinen und insbesondere von Antikörpern schon bei niedrigen Konzentrationsbereichen hinreichend bekannt war (S. A. Marshall, G. A. Lazar, A. J. Chirino, and J. R. Desjarlais. Rational design and engineering of therapeutic proteins. Drug Discovery Today 8 (5):212-221 , 2003). So wird in der Literatur die Aggregation von Proteinen als die am häufigsten auftretende physiskalische Instabilitätsreaktion beschrieben (W. Wang. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. Int .Pharm. 185 (2):129-188. 1999). Formulierungen enthaltend Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD 72000) sind zwar aus der WO03053465 und aus der WO03007988 bekannt, jedoch weisen die aus der WO03053465 bekannten Formulierungen eine relativ geringe Proteinkonzentration auf und sie sind langfristig bei Raumtemperatur nicht stabil. Die aus der WO03007988 bekannten Formulierungen weisen ebenfalls eine relativ geringe Proteinkonzentration auf und die Zubereitung (Lyophilisat) muss vor Anwendung noch rekonstituiert werden.
Der Prozess der Lyophilisierung zur Stabilisierung von
Proteinformulierungen ist beispielsweise aus der WO9300807 oder WO9822136 bekannt, jedoch bestehen signifikante Nachteile von lyophilisierten Zubereitungen darin, dass der Anwender das Lyophilisat vor Anwendung noch rekonstituieren muss, was eine erhebliche Fehlerquelle bei der Zubereitung vor der Anwendung darstellt. Da ein weiterer Herstellungsprozess im Vergleich zu flüssigen Formulierungen hinzukommt, ist der Prozess hinsichtlich zusätzlichem Aufwand für Prozessentwicklung (Gewährleistung der Stabilität bei der Lyophilisierung), Herstellung (Herstellungskosten und -dauer) und z.B. Validierung ungünstig.
Bei den bisher bekannten Formulierungen geringer Proteinkonzentration, werden bei intervenöser Verabreichung hohe Infusionsvolumina notwendig. Aufgabe der Erfindung war deshalb die Aufkonzentrierung erfindungsgemäßer Antikörper, so dass durch Reduktion der zu appliziernden Volumina auch eine subkutane Applikation in Betracht gezogen werden kann. Subkutan zu applizierende Formulierungen dürfen ein Volumen von 1 ,0 - 1 , 5 ml nicht überschreiten und müssen ferner euhydrisch (pH 7,2 bzw. pH 4,0 - 9,0) und isotonisch (ca. 290 mOsm) sein. Ein weiterer Vorteil subkutaner Formulierungen liegt in der
Möglichkeit der Selbstverabreichung durch den Patienten. Allerdings sollte bei der Aufkonzentrierung die Stabilität des Proteins nicht beeinträchtigt werden, d.h. der Anstieg an Zersetzungs- und Aggregationsprodukten sollte im Rahmen der Spezifikationen akzeptabel sein. Weiterhin sollten solche Formulierungen frei von toxikologisch bedenklichen Stoffen sein bzw. diese nur in physiologisch unbedenklichen Konzentrationen enthalten.
Da sich durch die zu erwartenden Schwierigkeiten bereits etablierte Proteinformulierungen im Allgemeinen nicht auf neue Protein-Wirkstoffe übertragen lassen, war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue stabile, hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen für für therapeutische Proteine, insbesondere monoklonale Antikörper gegen den EGF-Rezeptor, beispielsweise Mab C225 (Cetuximab) und Mab h425 (EMD 72000), zu finden, die eine erhöhte Stabilität gegenüber Stressbedingungen, wie erhöhter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und/oder Scherkräften aufweisen, so dass bei Herstellung, Lagerung, Transport und Applikation deren
Wirksamkeit erhalten bleibt und diese Formulierungen keine toxikologisch bedenklichen Hilfsstoffe enthalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Überraschenderweise lassen sich mit Hilfe von Ultraflitrationsverfahren hochkonzentierte pharmazeutische Zubereitungen von anti-EGFR- Antikörpem erhalten, die in einer flüssigen Formulierung Proteinkonzentrationen von 10 - 250 mg/ml, besonders bevorzugt von 50 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml ermöglichen. Die durch den Ultrafiltrationsprozess erhaltenen Formulierungen sind vorzugweise über einen längeren Zeitraum stabil oder sie können bei Bedarf mit geeigneten stabilisierenden Hilfsstoffen versetzt oder durch nachfolgende Lyophilisierung stabilisiert werden. Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind physiologisch gut verträglich, leicht herstellbar, exakt dosierbar und über die Dauer der Lagerung, bei mechanischer Belastung und z.B. bei mehrfachen Einfrier- und Auftauvorgängen stabil.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die durch erfindungsgemäße Verfahren hergestellten hochkonzentrierten Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern einen Monomeranteil von > 99% enthalten. Die erhaltenen erfindungsgemäßen hochkonzentrierten, flüssigen Formulierungen mit einer Konzentration von 10 - 250 mg/ml, besonders bevorzugt von 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml sind physikalisch und chemisch stabil, d.h. der es kommt zu keiner Veränderung des Monomerengehaltes mit einhergehender Zunahme von löslichen Aggregaten, was als sehr kritisch im Hinblick auf Wirksamkeit und auf immunogene Nebenwirkungen anzusehen wäre (Schellekens H. (2002) Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.: Nat. Rev. Drug Discov., v. 1 , p. 457-462). Auch kommt es durch die angewandten Ultrafiltrationsverfahren zu keiner Änderung der Primärstruktur des Proteins. Außerdem zeigen sich hinsichtlich der mechanischen Stabilität und der thermischen Stabilität keine Nachteile gegenüber den niedrig konzentrierten Proteinformulierungen. Insbesondere liegen die charakterisierten Aggregationsprodukte auch für die erfindungsgemäßen hochkonzentrierten, flüssigen Antikörperformulierungen im Bereich der festgesetzen Spezifikationen.
Dies war nicht zu erwarten, da bei hochkonzentrierten Proteinformulierungen die Tendenz zur Instabilität weitaus größer ist als bei verdünnten Proteinformulierungen (Fields, G Alonso, D., Stiger, D., Dill, K. (1992) "Theory for the aggregation of proteins and copolymers." J. Phys. Chem. 96, 3974-3981). Bei einer hohen Proteinkonzentration ist die "Packungsdichte" der Proteinmoleküle erhöht. Eine vermehrte Anzahl an Kollisionen ist demnach anzunehmen und es kann zu gelegentlichen Protein-Assoziationen kommen. Dieser Prozess erfolgt in der Regel durch Nukleations- und Wachstumsmechanismen, bei der die kritischen Nuklei oft lösliche assoziierte Proteine darstellen, die sich jedoch schnell in unlösliche Proteinpräzipitate (denaturiertes Protein) umwandeln können (Reithel, J.F. (1962) „The dissociation and association of protein structures", Adv. Protein Chem. 18, 123). Die Größe der Proteinaggregate erhöht sich mit steigender Proteinkonzentration, wie für das ß- Lactoglobulin bereits gezeigt werden konnte (Roefs, S.P.F.M., De Kruif, K.G. (1994) "A model for the denaturation and aggregation of ß+- lactoglobulin" Eur. J. Biochem. 226, 883-889).
Die nachfolgend beschriebenen erfindungsgemäßen Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpem zeichnen sich überraschenderweise durch einen oder mehrere Vorteile aus, ausgewählt unter: hohe Proteinkonzentration, hohe Stabilität, geringe Aggregationstendenz, geringe Viskosität, hohe
Reinheit, Abwesenheit pharmazeutisch bedenklicher Agenzien und damit hohe Sicherheit, gute Verträglichkeit und Möglichkeit der direkten Verwendung.
Nachfolgend beschriebene erfindungsgemäße Herstellungsverfahren zeichnen sich überraschenderweise durch einen oder mehrere Vorteile aus, ausgewählt unter: Einfachheit, Zeit- und Kostenersparnis, Verwendung pharmazeutisch unbedenklicher Agenzien, hohe Ausbeute. Erfindungsgemäße Verfahren sind somit in der Durchführung vorzugsweise wesentlich einfacher, zeitsparender und kosteneffektiver als die in der Literatur beschriebenen Techniken, da überraschenderweise durch Ultrafiltration stabile, hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpem erhalten werden, die obengenannte Vorteile aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb Verfahren zur Herstellung hochkonzentrierter, flüssiger Formulierungen enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente durch Ultrafiltration. Erfindungsgemäße Verfahren sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen hochkonzentrierten, flüssigen Formulierungen einen Gehalt wenigstens eines anti-EGFR- Antikörpers von 10 - 250 mg/ml, bevorzugt 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt 100 - 150 mg/ml aufweisen.
Weiterhin sind erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die anti-EGFR-Antikörper monoklonal sind und muriner oder humaner Herkunft, bevorzugt muriner Herkunft und chimär oder humanisiert. Besonders bevorzugt sind die anti-EGFR-Antikörper Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD72000) und/oder deren Varianten und/oder Fragmente.
Erfindungsgemäße Verfahren der Ultrafiltration Ultrafiltrationsverfahren wie gerührte Ultrafiltration und Tangentialflussfiltration (TFF).
Die Ultrafiltration der erfindungsgemäßen Antikörper erfolgt vorzugsweise in einem geeigneten Puffersystem, d.h. es ist keine Stabilisierung der Reaktionslösungen wie z.B. durch Detergenzien notwendig. Die Verwendung von Detergenzien in Zubereitungen zur parenteralen Anwendung ist generell zu vermeiden bzw. zu minimieren, da von ihnen ein nicht unerhebliches toxisches und immunogenes Potential ausgeht (Sweetana S. & Akers M.J. (1996) Solubility principles and practices for parenteral drug dosage form development. PDA J. Pharm. Sei. Technol. 50, 330-342) und sie auch zur Veränderung der Sekundärstruktur von Proteinen führen können (Vermeer A.W.P. & Norde W. (2000) The influence of the binding of Iow molecular weight surfactants on the thermal stability and secondary strueture of IgG. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 161, 139-150). Außerdem gestaltet sich die Prozessführung einer Ultrafiltration von Detergenz- haltigen Formulierungen als schwierig, da es aufgrund möglicher Mizellbildung des Detergens zu einer unvorteilhaften und unkontrollierbaren Anreicherung des Detergenz im Produkt kommen kann.
Bezüglich der erfindungsgemäßen anti-EGFR-Antikörper und im Rahmen der vorliegenden Erfindung, versteht man unter „biologisch aktiv", "nativ" und „wirksam", dass erfindungsgemäße anti-EGFR-Antikörper auch nach Überführung in erfindungsgemäße For uierungen ihre biologische Wirkung ausüben können, insbesondere die Bindung an EGFR, Inhibition der Bindung von Liganden, insbesondere EGF, an den EGFR, Modulation, insbesondere Inhibition der EGFR-vermittelten Signaltransduktion und Prophylaxe oder Therapie von EGFR-vermittelten Erkrankungen.
anti-EGFR-Antikörper: Erfindungsgemäße anti-EGFR-Antikörper sind vorzugsweise monoklonal und muriner oder humaner Herkunft, besonders bevorzugt sind sie muriner Herkunft und chimär oder humanisiert. Bei dem gegen den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) gerichteten Antikörper handelt es sich besonders bevorzugt um Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD 72000) und/oder deren Varianten oder Fragmente. Weitere gegen den EGFR gerichtete Antikörper sind z.B. in der EP0586002 sowie in J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528) beschrieben.
Mab C225 (Cetuximab, Erbitux™): Mab C225 (Cetuximab) ist ein klinisch erprobter Antikörper, der an den EGF-Rezeptor bindet. Mab C225 (Cetuximab) ist ein chimärer Antikörper, dessen variable Regionen murinen und dessen konstante Regionen humanen Ursprungs sind. Er wurde erstmals von Naramura et al., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 sowie in WO 96/40210 A1 beschrieben.
Mab h425 (EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper (Mab), der aus dem murinen anti-EGFR- Antikörper 425 (Mab 425) erhalten wurde (EP0531472). Der murine monoklonale Antikörper Mab 425 wurde in der humanen Karzinomzelllinie A431 entwickelt, da er hier an ein extrazelluläres Epitop des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) bindet. Es wurde gefunden, dass er die Bindung von EGF inhibiert (Murthy et al., 1987). Erhöhte Expression von EGFR wird in malignen Geweben aus unterschiedlichen Quellen gefunden, so dass Mab 425 ein möglicher Wirkstoff zur Diagnose und therapeutischen Behandlung von humanen Tumoren ist. So wurde gefunden, dass Mab 425 in vitro Tumorzytotoxizität vermittelt und in vitro das Tumorwachstum von Zellinien epidermoider und colorektaler Karzinome unterdrückt (Rodeck et al., 1987). Außerdem konnte gezeigt werden, dass Mab 425 an Xenografts von humanen malignen Gliomen in Mäusen bindet (Takahashi et al., 1987). Seine humanisierten und Chimären Formen sind z.B. aus EP0531472; Kettleborough et al., Protein Engineering 1991 , 4: 773-783; Bier et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2001 , 47: 519-524; Bier et al., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46:
167-173 bekannt. Mab h425 (EMD 72000) ist dabei ein in der klinischen
Phase l/ll befindlicher humanisierter Antikörper (h425), dessen konstanter
Bereich sich aus einer K und einer humanen γ-1 -Kette zusammensetzt
(EP0531472).
Humane anti-EGFR-Antikörper können nach der XenoMouse-Technologie bereitgestellt werden, wie in der WO9110741 , WO9402602, WO9633735 beschrieben. Ein gemäß dieser Technologie hergestellter, in der klinischen Erprobung befindlicher Antikörper ist beispielsweise auch ABX-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001 , 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).
Antikörper: Antikörper oder Immunglobulin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung im breitesten Umfang verwendet und betrifft insbesondere polyklonale Antikörper und multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) und besonders bevorzugt intakte monoklonale Antikörper (Mab), die biologisch wirksam sind, sowie deren Varianten und Fragmente. Es sind auch Heteroantikörper, die aus zwei oder mehreren Antikörpern oder deren Fragmenten bestehen und/oder verschiedene Bindungsspezifitäten aufweisen und miteinander verbunden sind, umfasst. In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz ihrer konstanten Regionen können Antikörper verschiedenen „Antikörper- (Immunglobulin-) Klassen zugeordnet werden: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Mehrere davon können weiter in Subklassen (Isotypen) unterteilt werden, beispielsweise lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 und lgA2. Antikörper haben gewöhnlich ein Molekulargewicht von etwa 150 kDa, bestehen aus zwei identischen leichten Ketten (L) und zwei identischen schweren Ketten (H). Monokonale Antikörper werden aus einer Population homogener Zellen erhalten. Sie sind hochspezifisch und gegen ein einziges Epitop gerichtet, während polyklonale Antikörper verschiedene Antikörper umfassen, die gegen unterschiedliche Epitope gerichtet sind. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper umfassen beispielsweise die von Kohler und Milstein (Nature 256, 495 (1975)) und in Burdon et al., (1985) "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas", Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam beschriebene Hybridommethode. Sie können insbesondere durch bekannte rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden (siehe z.B. US4816567). Monoklonale Antikörper können auch aus Phagenantikörperbibliotheken isoliert werden beispielsweise mithilfe der in Clackson et al. (Nature, 352:624-628 (1991)) und Marks et al. (J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991)) beschriebenen Techniken.
Varianten und Fragmente: Bei Varianten (Muteine) von Antikörpern handelt es sich um strukturverwandte Proteine, beispielsweise solche, die durch Modifikation der Primärsequenz (Aminosäuresequenz), durch
Glycoengineering (Varianten der Glykosylierungsstellen bzw -Strukturen, auch deglykosylierte Proteine), durch PEGylierung, durch Herstellung in modifizierten Wirtszellen oder durch andere Techniken erhalten werden können. Erfindungsgemäße Varianten sind hierbei nicht auf die vorstehenden Beispiele beschränkt, sondern umfassen alle dem Fachmann bekannten Varianten erfindungsgemäßer Antikörper. Bei Fragmenten (Teilsegmenten) von Antikörpern handelt es sich um
Spaltungsprodukte von Antikörpern, die beispielsweise durch limitierte enzymatische Verdauung mithilfe von Papain, Pepsin und Plasmin oder durch gentechnische Herstellung der Teilsegmente gewonnen werden. Typische Teilsegmente sind beispielsweise das bivalente F(ab')2- Fragment, das monovalente Fab-Fragment sowie das Fc-Fragment.
(Lottspeich F. , H. Zorbas (ed.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin:Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) pp.1035). Erfindungsgemäße Fragmente sind hierbei nicht auf die vorstehenden Beispiele beschränkt, sondern umfassen alle dem Fachmann bekannten Fragmente erfindungsgemäßer Antikörper.
Pharmazeutische Zubereitung: Die Begriffe pharmazeutische Formulierung und pharmazeutische Zubereitung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Synonyme verwendet.
Wie hier verwendet bezieht sich „pharmazeutisch verträglich" auf Arzneimittel, Trägerstoffe, Hilfsstoffe, Stabilisatoren, Lösungsmittel und sonstige Agenzien, die die Verabreichung der daraus erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen ohne unerwünschte physiologische Nebenwirkungen, wie Übelkeit, Schwindel, Verdauungsprobleme o.a. an ein Säugetier ermöglichen .
Bei pharmazeutischen Zubereitungen zur parenteralen Verabreichung besteht die Forderung nach Isotonie, Euhydrie sowie nach Verträglichkeit und Sicherheit der Formulierung (geringe Toxizität), der eingesetzten Hilfsstoffe und des Primärpackmittels. Überraschenderweise haben erfindungsgemäße hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern vorzugsweise den Vorteil, dass eine direkte Verwendung möglich ist, da zur Herstellung physiologisch unbedenkliche Agenzien verwendet werden. Somit ist die Herstellung erfindungsgemäßer hochkonzentrierter, flüssiger Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpem bei vorzugsweise gleichzeitig hoher Ausbeute an nativem und pharmazeutisch unbedenklichem Protein hoher Reinheit, vorzugsweise einfach, zeitsparend und kostengünstig.
Bei der Ultrafiltration handelt es sich um ein druckgetriebenes semipermeable Membranverfahren zur Separation gelöster und suspendierter Materialen. Das Trennprinzip beruht auf der Größe und Ausmaß des Moleküls, d.h. Substanzen, die kleiner als die Porengröße sind, gelangen ins Filtrat (Permeat), während Substanzen, die größer als die Porengröße sind, im Retentat (Konzentrat) verbleiben. Die nötige Kraft, um die Trennung durchzuführen, kann beispielsweise durch
Zentrifugalkräfte, eine Gas-Druckquelle (z.B. Stickstoff) oder eine Membranpumpe aufgebracht werden.
Erfindungsgemäße hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern können bevorzugt hergestellt werden, indem eine erfindungsgemäße anti-EGFR-Antikörper enthaltende Lösung mittels eines Ultrafiltrationsverfahrens aufkonzentriert wird. Zweckmäßigerweise wird hierzu einer Lösung mit einer definierten Konzentration an erfindungsgemäßen anti-EGFR-Antikörpern (beispielsweise für C225: 0,01 bis 150 mg/ml, bevorzugt 2 bis 100 mg/ml, besonders bevorzugt ca. 20 mg/ml, für EMD 72000: 0,01 bis 150 mg/ml, bevorzugt 5 bis 100 mg/ml, besonders bevorzugt ca 20 mg/ml), wie sie bei deren Herstellung gewonnen wird, in die Ultrafiltrationseinheit gegeben und unter definierten, kontrollierten Druckbedingungen einem Konzentrationsprozess unterzogen. Liegt der Antikörper als Feststoff, beispielsweise als
Lyophilisat, vor, kann die erfindungsgemäße hochkonzentrierte, flüssige Formulierung hergestellt werden, indem erfindungsgemäße anti-EGFR- Antikörper zunächst in Wasser oder einer einen oder mehrere der weiteren Inhaltsstoffe enthaltenden wässrigen Lösung gelöst und anschließend dem Ultrafiltrationsprozess ausgesetzt wird. Das durch den Ultrafiltrationsprozess erhaltene Produkt kann anschließend durch Zusatz der weiter unten aufgeführten Hilfsstoffe stabilisiert werden. Die so erhaltene, den jeweiligen Antikörper enthaltende Lösung wird auf einen pH-Wert von 4 bis 10, bevorzugt pH 5 bis 9 eingestellt, sterilfiltriert und eventuell nach Bedarf durch einen nachfolgenden Lyophilisierungsschritt zur Stabilisierung in eine feste Form überführt.
Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Hilfsstoffe oder des erfindungsgemäßen Antikörpers ist weitgehend unabhängig vom Herstellungsverfahren und liegt im Ermessen des Fachmanns.
Die anti-EGFR-Antikörper liegen in erfindungsgemäßen hochkonzentrierten, flüssigen Formulierungen vorzugsweise in biologisch aktiver Form vor und es kommt bei erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise nicht zu einer Denaturierung der Antikörper. So bleibt die biologische Wirksamkeit des Proteins vorzugsweise erhalten.
In erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise Polyethersulfon (PES) oder regenerierte Cellulose als Ultrafiltrations- Membranen verwendet werden: Der theoretisch denkbare Cutoff liegt im Bereich zwischen 5 und 500 kDa, vorzugsweise zwischen 10 und 100 kDa, besonders bevorzugt zwischen 30 und 50 kDa.
Die für Ultrafree-Zentrifugenröhrchen (Millipore) verwandten Zentrifugalkräfte liegen im Bereich von 1 - 20000*g, vorzugsweise im Bereich von 1000 - 12000*g, besonders bevorzugt bei 2000*g. Der bei der Amicon-Rührzelle (Millipore) angewandte Gasdruck liegt im Bereich von 0,1-5 psi, vorzugsweise bei 4 psi. Der bei der Labscale-TFF-Anlage (Millipore) angewandte Eingangsdruck liegt im Bereich von 0,1 - 85 psi, vorzugsweise im Bereich von 10 - 30 psi, besonders bevorzugt bei 20 psi. Der bei der Labscale-TFF-Anlage (Millipore) angewandte Ausgangsdruck liegt im Bereich von 0,1 - 85 psi, vorzugsweise im Bereich von 5 - 20 psi, besonders bevorzugt bei 0 psi.
In erfindungsgemäßen Verfahren können beispielsweise folgende Puffer verwendet werden: Phosphatpuffer: Na- (oder K-)Phosphat; möglicher pH ca 6,0 - 8,2; Citrat-Puffer: Na-Citrat oder Citronensäure, möglicher pH ca 2,2 - 6,5, Succinat-Puffer pH ca 4.8 - 6.3, Acetat-Puffer, z.B. Natriumacetat, pH ca 2.5 - 6.0; Histidin-Puffer pH ca 6,0 - 7.8;
Glutaminsäure pH 8,0 bis 10,2; Glycin (N,N-bis(2-Hydroxyethyl)glycin) pH ca. 8,6 bis 10,6; Glycinat-Puffer pH ca 6.5 - 7.5; Imidazol pH 6,2 bis 7,8; Kaliumchlorid pH ca. 1 ,0 bis 2,2; Lactat-Puffer pH ca 3.0 - 6.0; Maleat- Puffer pH ca 2.5 - 5.0; Tartrat-Puffer pH ca 3.0 - 5.0; Tris: pH ca 6.8 - 7.7; Phosphat-Citrat-Puffer. Es ist auch der Zusatz von Isotisierungsmitteln zur Isotonisierung denkbar (z.B. Na-(oder K-)CI oder auch andere Salze).
In erfindungsgemäßen Verfahren können vorstehend genannte Puffer beispielsweise in folgenden Konzentrationen verwendet werden: 1mM bis 200 mM, bevorzugt 2 - 20 mM, besonders bevorzugt ca. 10 mM.
Vorzugsweise können nachfolgende pH-Bereiche verwendet werden: pH 4 - 10, bevorzugt ist pH = IEP +/- 2 pH-Einheiten (2 pH Einheiten um den isoelektrischen Punkt des Proteins).
Vorzugsweise können nachfolgende Isotonisierungsmittel verwendet werden (übliche Konzentrationen): Natriumchlorid ca. 5 mM - 305 mM; Kaliumchlorid; Glucose; Glycerin; Dextrose 4-5.5 mM; Natriumsulfat 1- 1.6 mM.
Vorzugsweise können nachfolgende Stoffe zur Viskositätserniedrigung verwendet werden: Natrumchlorid, Argininhydrochlorid, Natriumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Calciumchloride, Zinkchloride, Natriumacetat.
Vorzugsweise können nachfolgende Stabilisatoren verwendet werden: 1) Aminosäuren
(ca. 1 - 100 mg/ml, besonders bevorzugt 3-10 mg/ml, als Hydrochlorid) Arginin, Omithin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Isoleucin, Leucin, Alanin, Phenylaianin, Tyrosin, Tryptophan, Methionin, Serin, Prolin. 2) Zucker und Zuckeralkohole
(ca. 1 - 200 mg/ml, besonders bevorzugt 30-65 mg/ml) Saccharose, Lactose, Glucose, Mannose, Maltose, Galactose, Fructose, Sorbose, Raffinose, Trehalose, Glucosamin, N-Methylglucosamin, Galactosamin, Neuraminsäure. 3) Antioxidantien
Acetonnatriumbisulfit 0.2%, Ascorbinsäure 0.01 %, Ascorbinsäureester 0.015%, Butylhydroxyanisol (BHA) 0.02%,, Butylhydroxytoluen (BHT) 0.02%, Cystein 0.5%, Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA) 0.01 %, Monothioglycerol 0.5%, Natriumbisulfit 0.15%, Natriummetabisulfit 0.2%, Tocopherole 0.5%, Glutathion 0.1%.
4) Konservierungsmittel m-Cresol ca 0,1 - 0,3%, Chlrocresol ca. 0,1 - 0,3%, Phenol ca. 0,5%, Benzylalkohol ca. 1 ,0 - 2,0 %, Methylparaben ca. 0,2 %, Propylparaben ca. 0,02%, Butylparaben ca. 0,015%, Chlorbutanol ca. 0,25 - 0,5%, Phenylmercurinitrat ca. 0,002%, Phenylmercuriacetat ca. 0,002%, Thimersal ca. 0,01 - 0,02%, Benzalkoniumchlorid ca. 0,01 %, Benzethoniumchlorid ca. 0,01%.
5) Cvclodextrine z.B. Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin, Sulfobutylethyl-ß-cyclodextrin, y- Cyclodextrin.
6) Albumine Humanes Serum Albumin (HSA), Bovines Serum Albumin (BSA): 7) Polvhvdrische Alkohole Glycerol, Ethanol, Mannitol. 8) Salze Acetat-Salze (z.B. Natriumacetat), Magnesiumchlorid, Calciumchlorid,
Tromethamin, EDTA (z.B. Na-EDTA).
Die Erfindung umfasst auch alle dem Fachmann bekannten und denkbaren Hydrate, Salze und Derivate der vorstehend genannten Agenzien.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente. Diese hochkonzentrierten, flüssigen Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpem können durch oben beschriebene Ultrafiltrationsverfahren hergestellt werden. Weitere denkbare Verfahren zur Aufkonzentrierung sind chromatographische Verfahren, wie beispielsweise Größenausschlußchromatorgraphie (z.B. Gelfiltration), Affinitätschromatographie (z.B. Protein A-Chromatographie) oder lonenaustauschchromatographie, Membrantrennverfahren wie beispielsweise Dialyse, Elektrodialyse, Mikrofiltration, Umkehrosmose, elektrophoretische Verfahren oder Trocknungsverfahren wie beispielsweise Stickstoffgastrocknung, Vakuumofen-Trocknung, Lyophilisation, Waschen in organischen Lösungsmitteln und anschließender Lufttrocknung, Flüssigbetttrocknung, Wirbelschichttrocknung, Sprühtrocknung, Walzentrocknung, Lagentrocknung, Lufttrocknung bei Raumtemperatur und anschließender Rekonstitution in einem geringeren Volumen an Lösungsmittel.
Erfindungsgemäße hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti- EG FR-Antikörpern sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt wenigstens eines anti-EGFR-Antikörpers von 10 - 250 mg/ml, bevorzugt von 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml aufweisen. Erfindungsgemäße hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die anti-EGFR-Antikörper monoklonal sind und muriner oder humaner Herkunft, bevozugt muriner Herkunft und chimär oder humanisiert. Besonders bevorzugt sind die anti- EGFR-Antikörper Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD72000) und/oder deren Varianten und/oder Fragmente.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente erhältlich durch erfindungsgemäße Verfahren, d.h. durch oben beschriebene Verfahren der Ultrafiltration.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem erfindungsgemäße, hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern als lagerstabile Arzneimittel.
Erfindungsgemäße, hochkonzentrierte, flüssige Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern können neben erfindungsgemäßen Antikörpern gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe und/oder weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Vorzugsweise ermöglichen erfindungsgemäße Verfahren, hochkonzentrierte Formulierungen herzustellen, ohne dass es zu ungünstigen unerwünschten Aggregationen der erfindungsgemäßen Antikörper kommt. So lassen sich mithilfe erfindungsgemäßer erfindungsgemäßer Verfahren applikationsfertige Lösungen mit hohem Wirkstoffanteil herstellen. In jüngerer Zeit werden vermehrt möglichst hochkonzentrierte Formulierungen von Proteinwirkstoffen gefordert. Die meisten Antikörper, die zur Therapie eingesetzt werden, werden im Bereich mg/kg dosiert. Eine hohe Dosis und geringe zu applizierende Volumina (z.B. ca. 1 bis 1 ,5 ml bei subkutaner Applikation) zeigen den Bedarf an hochkonzentrierten Proteinzubereitungen mit Konzentrationen von mehr als 100 mg/ml. Außerdem können hochkonzentrierte Proteinformulierungen in präklinischen Tests zur Untersuchung der Unbedenklichkeit und Wirksamkeit in-vitro und in-vivo (am Tiermodell), in klinischen Tests zur Untersuchung der Unbedenklichkeit und Wirksamkeit beim Menschen und in der klinischen Anwendung des Produktes (insbesondere bei der subkutanen Applikation) erhebliche Vorteile aufweisen. Ihre Vorteile bestehen insbesondere darin, dass ein geringeres Volumen der Zubereitung angewendet werden muss. Im Gegensatz zur Infusion oder Injektion von relativ niedrig konzentrierten Proteinarzneimitteln ist dadurch z.B. eine subkutane Applikation von
Proteinarzneimittein für den Patienten möglich. Die subkutane Applikation von Proteinarzneimitteln kann verschiedene Gründe haben. Beispielsweise kann ein spezielles Targeting erwünscht sein, welches in Zusammenhang mit einem „therapeutischen Fenster" steht. Des weiteren hat eine subkutane Applikation den Vorteil, dass der Patient selbst die Applikation vornehmen kann, ohne auf ärztliches Personal angewiesen zu sein. Das Beispiel des Insulins zeigt deutlich diese Vorteile. Da die Injektionen zur subkutanen Applikation jedoch maximal 1 - 1,5 ml betragen können, sind häufig hochkonzentrierte Proteinformulierungen mit mehr als 100 mg/ml nötig.
Überraschenderweise lassen sich mithilfe erfindungsgemäßer Verfahren hochkonzentierte, flüssige Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern erhalten, die die bei P rotein konzentrationen von 10 - 250 mg/ml, bevorzugt von 50 - 180 mg/ml, besonders bevorzugt von 100 - 150 mg/ml nicht obengenannte Nachteile aufweisen. Die Grenze bei bekannten hochkonzentrierten Formulierungen von Immunglobulinen liegt bei gebrauchsfertigen flüssigen Formulierungen von Antikörpern normalerweise bei 2 - 50 mg/ml (Humira®) Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich jedoch auch deutlich höher konzentrierte und dennoch stabile Formulierungen herstellen, was nicht zu erwarten war. Somit können durch erfindungsgemäße Verfahren hochkonzentrierte stabile Antikörperformulierungen erhalten werden, die eine veringerte Viskosität und Aggregationstendenz verglichen mit bekannten hochkonzentrierten, flüssigen Antikörperformulierungen und dadurch dadurch die Handhabbarkeit bei der parenteralen Verabreichung erleichtert wird.
Vorteilhaft können aus den erfindungsgemäßen Formulierungen antikörperhaltige Lösungen mit einem pH-Wert von 4 bis 10, bevorzugt mit einem pH-Wert von 5 bis 9, und einer Osmolalität von 250 bis 350 mOsmol/kg hergestellt werden. Erfindungsgemäße Formulierungen können somit weitgehend schmerzfrei intravenös, intraarteriell und auch subkutan direkt verabreicht werden. Daneben kann die Zubereitung auch Infusionslösungen, wie z.B. Glukoselösung, isotonische Kochsalzlösung oder Ringerlösung, die auch weitere Wirkstoffe enthalten können, zugesetzt werden, so dass auch größere Wirkstoffmengen appliziert werden können.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind physiologisch gut verträglich, leicht herstellbar, exakt dosierbar und vorzugsweise über die Dauer der Lagerung sowie des Transports und bei mehrfachen Einfrier- und Auftauvorgängen hinsichtlich Gehalt, Zersetzungsprodukten und Aggregaten stabil. Sie können bei Kühlschranktemperatur (2-8°C) und bei Raumtemperatur (23-27°C) und 60% relativer Luftfeuchtigkeit (r.F.) über einen längeren Zeitraum vorzugsweise stabil gelagert werden.
Vorzugsweise sind erfindungsgemäße Formulierungen auch bei höheren Temperaturen und Luftfeuchtigkeiten vergleichsweise stabil. Der Ausdruck "wirksame Menge" bedeutet die Menge eines Arzneimittels oder eines pharmazeutischen Wirkstoffes, die eine biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, System, Tier oder Menschen hervorruft, die z.B. von einem Forscher oder Mediziner gesucht oder angestrebt wird.
Darüber hinaus bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die, verglichen zu einem entsprechenden Subjekt, das diese Menge nicht erhalten hat, folgendes zur Folge hat: verbesserte
Heilbehandlung, Heilung, Prävention oder Beseitigung einer Krankheit, eines Krankheitsbildes, eines Krankheitszustandes, eines Leidens, einer Störung oder Verhinderung von Nebenwirkungen oder auch die Verminderung des Fortschreitens einer Krankheit, eines Leidens oder einer Störung. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" umfasst auch die Mengen, die wirkungsvoll sind, die normale physiologische Funktion zu erhöhen.
Arzneimittel können in Form von Dosiseinheiten, die eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff pro Dosiseinheit enthalten, dargereicht werden. Eine solche Einheit kann beispielsweise 0,5 mg bis 1 g, vorzugsweise 1 mg bis 800 mg, eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs enthalten, je nach dem behandelten Krankheitszustand, dem Verabreichungsweg und dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten. Bevorzugte Dosierungseinheits- formulierungen sind solche, die eine Tagesdosis oder Teildosis, wie oben angegeben, oder einen entsprechenden Bruchteil davon eines Wirkstoffs enthalten. Weiterhin lassen sich solche Arzneimittel mit einem der im pharmazeutischen Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren herstellen.
Arzneimittel lassen sich zur Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise auf oralem (einschließlich buccalem bzw. sublingualem), rektalem, pumonalen, nasalem, topischem (einschließlich buccalem, sublingualem oder transdermalem), vaginalem oder parenteralem (einschließlich subkutanem, intramuskulärem, intravenösem oder intradermalem) Wege, anpassen. Solche Arzneimittel können mit allen im pharmazeutischen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise der Wirkstoff mit dem bzw. den
Trägerstoff(en) oder Hilfsstoff(en) zusammengebracht wird.
Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel eignet sich vorzugsweise die parenterale Applikation. Im Falle der parenteralen Applikation sind die intravenöse, subkutane oder intradermale Applikation besonders bevorzugt. Im Falle der intravenösen Applikation kann die Injektion direkt oder auch als Zusatz zu Infusionslösungen erfolgen.
Insbesondere eignen sich erfindungsgemäße Arzneimittel zur subkutanen oder intradermalen Applikation, da sich mithilfe erfindungsgemäßer hochkonzentrierter, flüssiger Forumlierungen die für subkutane Verabreichung erforderlichen gering zu applizierenden Volumina realisieren lassen.
Die subkutane Applikation hat den Vorteil, dass der Patient ohne medizinische fachmännische Hilfe sich selbst das Arzneimittel verabreichen kann. Erfindungsgemäße Formulierungen von anti-EGFR- Antikörpern eignen sich auch zur Herstellung von parenteral zu applizierenden Arzneimitteln mit kontrollierter, gleichmäßiger und/oder verzögerter Wirkstofffreisetzung (slow-release, sustained-release, controlled release), beispielsweise auch zur Herstellung von Depot- Formulierungen, die für den Patienten vorteilhaft sind, da eine Applikation nur in größeren Zeitintervallen notwendig ist. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen können auch direkt in den Tumor injiziert werden und so direkt am bestimmungsgemäßen Wirkort ihre Wirkung entfalten. Zu den an die parenterale Verabreichung angepassten Arzneimitteln gehören wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Solute, durch die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des zu behandelnden Empfängers gemacht wird, enthalten; sowie wässrige und nichtwässrige sterile
Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdicker enthalten können. Die Formulierungen können in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, dargereicht und in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so dass nur die Zugabe der sterilen Trägerflüssigkeit, z.B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Rezepturmäßig hergestellte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern lassen sich auch in Form von Liposomenzuführsystemen, wie z.B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreichen. Liposomen können aus verschiedenen Phospholipiden, wie z.B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidyl- cholinen, gebildet werden.
An die topische Verabreichung angepasste Arzneimittel können als Salben, Cremes, Suspensionen, Lotionen, Lösungen, Pasten, Gele, Sprays, Aerosole oder Öle formuliert sein, in die erfindungsgemäße Formulierungen eingebracht werden.
Für Behandlungen des Auges oder anderer äußerer Gewebe, z.B. Mund und Haut, werden die Formulierungen vorzugsweise in topische Salbe oder Creme eingebracht und appliziert. Bei Formulierung zu einer Salbe können erfindungsgemäße Formulierungen entweder in eine paraffinische oder einer mit Wasser mischbare Cremebasis eingebracht werden. Alternativ kann eine erfindungsgemäße Formulierung zu einer Creme mit einer Öl-in-Wasser-Cremebasis oder einer Wasser-in-ÖI-Basis formuliert werden.
Zu den an die topische Applikation am Auge angepassten Arzneimittel gehören Augentropfen.
An die rektale Verabreichung angepasste Arzneimittel können in Form von Zäpfchen oder Einlaufen dargereicht werden.
An die Verabreichung durch Inhalation angepasste Arzneimittel umfassen feinpartikuläre Stäube oder Nebel, die mittels verschiedener Arten von unter Druck stehenden Dosierspendern mit Aerosolen, Verneblern oder Insufflatoren erzeugt werden können.
An die vaginale Verabreichung angepasste Arzneimittel können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen dargereicht werden.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Arzneimittel neben den obigen besonders erwähnten Bestandteilen andere im Fachgebiet übliche Mittel mit Bezug auf die jeweilige Art der pharmazeutischen Formulierung enthalten können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Sets (Kits) bestehend aus getrennten Packungen von a) einer erfindungsgemäßen Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge eines anti-EGFR-Antikörpers, bevorzugt eines monoklonalen anti-EGFR-Antikörpers, besonders bevorzugt von Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD 72000) und/oder deren Varianten oder Fragmenten, und b) einer Formulierung, enthaltend eine wirksamen Menge eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs. Das Set enthält geeignete Behälter, wie Schachteln oder Kartons, individuelle Flaschen, Beutel oder Ampullen. Das Set kann z.B. separate Ampullen enthalten, in denen jeweils eine erfindungsgemäße Formulierung, enthaltend eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen anti-EGFR-Antikörpers und einer Formulierung eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs in gelöster oder in lyophylisierter Form vorliegt.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen anti- EFGR-Antikörpers hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich z.B. dem Alter und Gewicht des Patienten, dem exakten Krankheitszustand, der der Behandlung bedarf, sowie seines Schweregrads, der Beschaffenheit der Formulierung sowie dem Verabreichungsweg, und wird letztendlich von dem behandelnden Arzt bzw. Tierarzt festgelegt. Jedoch liegt eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen anti-EFGR-Antikörpers für die Behandlung von neoplastischem Wachstum, z.B. Dickdarm- oder Brustkarzinom, im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Empfängers (Säugers) pro Tag und besonders typisch im Bereich von 1 bis 0 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Somit läge für einen 70 kg schweren erwachsenen Säuger die tatsächliche Menge pro Tag für gewöhnlich zwischen 70 und 700 mg, wobei diese Menge als Einzeldosis pro Tag oder üblicher in einer Reihe von Teildosen (wie z.B. zwei, drei, vier, fünf oder sechs) pro Tag gegeben werden kann, so dass die Gesamttägesdosis die gleiche ist. Die Bestimmung des geeigneten Antikörper-Titers erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Die für die Verabreichung vorgesehe Dosierung ist im Allgemeinen ausreichend, um die gewünschte tumor-hemmende Wirkung zu erzielen. Die Dosierung sollte jedoch auch möglichst gering gewählt werden, so dass keine Nebenwirkungen, wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen o.a. auftreten. Erfindungsgemäße Medikamente können insbesondere zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Krankheiten und Krankheitszuständen verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer hochkonzentrierter, flüssiger Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Tumormetastasen, wobei der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Gehirntumor, Tumor des Urogenitaltrakts, Tumor des lymphatischen Systems, Magentumor,
Kehlkopftumor, Monozytenleukämie, Lungenadenokarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom und Brustkarzinom.
In verschiedenen in vitro und in vivo Studien konnte gezeigt werden, dass die Blockade des EGFR durch Antikörper auf unterschiedlichen Ebenen gegen Tumore, beispielsweise durch Hemmung der Krebszellproliferation, Verringerung der tumorvermittelten Angiogenese, Induktion der Krebszellapoptose und Verstärkung der toxischen Wirkungen der Strahlentherapie und der herkömmlichen Chemotherapie.
Arzneimittel enthaltend erfindungsgemäße Formulierungen können EGFR wirksam regulieren, modulieren oder hemmen und können deshalb zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit unregulierter oder gestörter EGFR-Aktivität eingesetzt werden. Insbesondere lassen sich die erfindungsgemäßen Formulierungen von anti- EGFR-Antikörpern deshalb bei der Behandlung gewisser Krebsformen einsetzen, sowie bei durch pathologische Angiogenese bedingten Erkrankungen wie diabetische Retinopathie oder Entzündungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von erfindungsgemäßen Formulierungen zur Hestellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die durch EGFR und/oder durch EGFR-vermittelte Signaltransduktion verursacht, vermittelt und/oder propagiert werden.
Erfindungsgemäße Arzneimittel eignen sich besonders zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebs, einschließlich solider Karzinome, wie zum Beispiel Karzinome (z.B. der Lungen, des Pankreas, der Schilddrüse, der Harnblase oder des Kolons), myeloische Erkrankungen (z.B. myeloische Leukämie) oder Adenome (z.B. villöses Kolonadenom), pathologische Angiogenese und metastatische Zellmigration. Die Arzneimittel sind ferner nützlich bei der Behandlung der Komplementaktivierungs-abhängigen chronischen Entzündung (Niculescu et al. (2002) Immunol. Res., 24:191- 199) und durch HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus Typ 1) induzierte Immunschwäche (Popik et al. (1998) J Virol, 72: 6406-6413).
Außerdem eignen sich die vorliegenden Arzneimittel als pharmazeutische Wirkstoffe für Säugetiere, insbesondere für den Menschen, bei der Behandlung von EGFR-bedingten Krankheiten. Der Ausdruck „EGFR- bedingte Krankheiten " bezieht sich auf pathologische Zustände, die von der EGFR-Aktivität abhängig sind. EGFR ist entweder direkt oder indirekt an den Signaltransduktionswegen verschiedener Zellaktivitäten, darunter Proliferation, Adhäsion und Migration sowie Differenzierung beteiligt. Zu den Krankheiten, die mit EGFR-Aktivität assoziiert sind, zählen die Proliferation von Tumorzellen, die pathologische Gefäßneubildung, die das Wachstum fester Tumore fördert, Gefäßneubildung im Auge (diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration und dergleichen) sowie Entzündung (Schuppenflechte, rheumatoide Arthritis und dergleichen).
Gewöhnlich werden die hier besprochenen Erkrankungen in zwei Gruppen eingeteilt, in hyperproliferative und nicht-hyperproliferative Erkrankungen. In diesem Zusammenhang werden Psoriasis, Arthritis, Entzündungen, Endometriose, Vernarbung, gutartige Prostatahyperplasie, immunologi- sche Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten als nicht-krebsartige Krankheiten angesehen, von denen Arthritis, Entzündung, immunologische Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten gewöhnlich als nicht-hyperproliferative Erkrankungen angesehen werden.
In diesem Zusammenhang sind Hirnkrebs, Lungenkrebs, Piattenepithelkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Ösophaguskrebs, gynäkologischer Krebs, Schilddrüsenkrebs, Lymphome, chronische Leukämie und akute Leukämie als krebsartige Erkrankungen anzusehen, die alle gewöhnlich zur Gruppe der hyper- proliferative Erkrankungen gezählt werden. Insbesondere krebsartiges Zellwachstum und insbesondere durch EGFR direkt oder indirekt vermitteltes krebsartiges Zellwachstum ist eine Erkrankung, die ein Ziel der vorliegenden Erfindung darstellt.
Es kann gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Arzneimittel in einem Xenotransplantat-Tumor-Modell eine in vivo antiproliferative Wirkung aufweisen. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden an einen Patienten mit einer hyperproliferativen Erkrankung verabreicht, z. B. zur Inhibition des Tumorwachstums, zur Verminderung der mit einer lympho- proliferativen Erkrankung einhergehenden Entzündung, zur Inhibition der Transplantatabstoßung oder neurologischer Schädigung aufgrund von Gewebereparatur usw. Die vorliegenden Arzneimittel sind nützlich für prophylaktische oder therapeutische Zwecke. Wie hierin verwendet, wird der Begriff „behandeln" als Bezugnahme sowohl auf die Verhinderung von Krankheiten als auch die Behandlung vorbestehender Leiden verwendet. Die Verhinderung von Proliferation wird durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel vor Entwicklung der evidenten Krankheit, z. B. zur Verhinderung des Tumorwachstums, Verhinderung metastatischen Wachstums, der Herabsetzung von mit kardiovaskulärer Chirurgie einhergehenden Restenosen usw. erreicht. Als Alternative werden die Arzneimittel zur Behandlung andauernder Krankheiten durch Stabilisation oder Verbesserung der klinischen Symptome des Patienten verwendet.
Der Wirt oder Patient kann jeglicher Säugerspezies angehören, z.B. einer Primatenspezies, besonders Menschen; Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern; Kaninchen; Pferden, Rindern, Hunden, Katzen usw. Tiermodelle sind für experimentelle Untersuchungen von Interesse, wobei sie ein Modell zur Behandlung einer Krankheit des Menschen zur Verfügung stellen.
Die Empfänglichkeit einer bestimmten Zelle gegenüber der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Arzneimitteln kann durch in vitro-Tests bestimmt werden. Typischerweise wird eine Kultur der Zelle mit einem erfindungsgemäßen Arzneimittel bei verschiedenen Konzentrationen für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreicht, um den Wirkstoffen zu ermöglichen, Zelltod zu induzieren oder Migration zu inhibieren, gewöhnlich zwischen ungefähr einer Stunde und einer Woche. Zu in vitro-Tests können kultivierte Zellen aus einer Biopsieprobe verwendet werden. Die nach der Behandlung zurückbleibenden lebensfähigen Zellen werden dann gezählt.
Die Dosis variiert abhängig von den verwendeten spezifischen Arzneimitteln, der spezifischen Erkrankung, dem Patientenstatus usw.. Typischerweise ist eine therapeutische Dosis ausreichend, um die unerwünschte Zellpopulation im Zielgewebe erheblich zu vermindern, während die Lebensfähigkeit des Patienten aufrechterhalten wird. Die Behandlung wird im Allgemeinen fortgesetzt, bis eine erhebliche Reduktion vorliegt, z. B. mindestens ca. 50 % Verminderung der spezifischen Zellzahl und kann fortgesetzt werden, bis im Wesentlichen keine unerwünschten Zellen mehr im Körper nachgewiesen werden. Zur Identifikation von EGFR-Inhibitoren stehen verschiedene Assay- Systeme zur Verfügung. Beim Scintillation-Proximity-Assay (Sorg et al., J. of. Biomolecular Screening, 2002, 7, 11-19) und dem Flash Plate-Assay wird die radioaktive Phosphorylierung eines Proteins oder Peptids als
Substrat mit γATP gemessen. Bei Vorliegen einer inhibitorischen Verbindung ist kein oder ein vermindertes radioaktives Signal nachweisbar. Ferner sind die Homogeneous Time-resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer- (HTR-FRET-) und Fluoreszenzpolarisations- (FP-) Technologien als Assay-Verfahren nützlich (Sills et al., J. of Biomolecular Screening, 2002, 191-214).
Andere nicht radioaktive ELISA-Assay-Verfahren verwenden spezifische Phospho-Antikörper (Phospho-AK). Der Phospho-AK bindet nur das phosphorylierte Substrat. Diese Bindung ist mit einem zweiten Peroxidase- konjugierten Anti-Schaf-Antikörper durch Chemilumineszenz nachweisbar (Ross et al., 2002, Biochem. J., unmittelbar vor der Veröffentlichung, Manuskript BJ20020786).
Es gibt viele mit einer Deregulation der Zeilproliferation und des Zelltods (Apoptose) einhergehende Erkrankungen und Krankheitszustände. Die Erkrankungen und Krankheitszustände, die durch erfindungsgemäße Arzneimittel behandelt, verhindert oder gelindert werden können umfassen die nachfolgend aufgeführten Erkrankungen und Krankheitszustände, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind nützlich bei der Behandlung und/oder Prophylaxe einer Reihe verschiedener Erkrankungen und Krankheitszustände, bei denen Proliferation und/oder Migration glatter Muskelzellen und/oder Entzündungszellen in die Intimaschicht eines Gefäßes vorliegt, resultierend in eingeschränkter Durchblutung dieses Gefäßes, z. B. bei neointimalen okklusiven Läsionen. Zu okklusiven
Transplantat-Gefäßerkrankungen von Interesse zählen Atherosklerose, koronare Gefäßerkrankung nach Transplantation, Venentransplantat- stenose, peri-anastomotische Prothesenrestenose, Restenose nach Angioplastie oder Stent-Platzierung und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs. Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung erfindungsgemäßer flüssiger Formulierungen von anti-EGFR- Antikörpern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Tumormetastasen, wobei der Tumor besonders bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Gehirntumor, Tumor des Urogenitaltrakts, Tumor des lymphatischen Systems, Magentumor, Kehlkopftumor, Monozytenleukämie, Lungenadenokarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom und Brustkarzinom, ohne darauf beschränkt zu sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, ausgewählt aus der Gruppe der krebsartigen Erkrankungen bestehend aus Plattenepithelkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Ösophaguskrebs, gynäkologischem Krebs, Schilddrüsenkrebs, Lymphom, chronischer Leukämie und akuter Leukämie.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können an Patienten zur Behandlung von Krebs verabreicht werden. Die vorliegenden Arzneimittel hemmen die Tumorangiogenese und beeinflussen so das Wachstum von Tumoren (J. Rak et al. Cancer Research, 55:4575-4580, 1995). Die angiogenesehemmenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Arzneimittel eignen sich auch zur Behandlung bestimmter Formen von Blindheit, die mit Retina-Gefäßneubildung in Zusammenhang stehen.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb außerdem die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die durch Angiogenese verursacht, vermittelt und/oder propagiert werden.
Eine derartige Krankheit, an der Angiogenese beteiligt ist, ist eine
Augenkrankheit, wie Retina-Vaskularisierung, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makula-Degeneration und dergleichen.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retina- Vaskularisierung, diabetischer Retinopathie, altersbedingter Makula- Degeneration und/oder Entzündungskrankheiten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Kontaktdermatitis, Spät-Typ der Überempfindlichkeitsreaktion, Entzündungen, Endometriose, Vernarbung, gutartiger Prostatahyperplasie, immunologischer Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Knochen-Pathologien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Osteosarkom, Osteoarthritis und Rachitis. Weiterhin können die erfindungsgemäße Arzneimittel verwendet werden, um bei gewissen existierenden Krebschemotherapien und -bestrahlungen additive oder synergistische Effekte bereitzustellen, und/oder können dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit gewisser existierender
Krebschemotherapien und -bestrahlungen wiederherzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, wobei eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen anti-EGFR-Antikörpers in Kombination mit einer Verbindung aus der Gruppe 1) Östrogenrezeptormodulator, 2) Androgen- rezeptormodulator, 3) Retinoidrezeptormodulator, 4) Zytotoxikum, 5) antiproliferatives Mittel, 6) Prenyl-Proteintransferaseinhibitoren, 7) HMG- CoA-Reduktase-lnhibitoren, 8) HlV-Protease-lnhibitoren, 9) Reverse- Transkriptase-Inhibitoren, 10) Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitoren sowie 11) Angiogenese-Inhibitoren verabreicht wird.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer Formulierungen von anti-EGFR-Antikörpern zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, wobei eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen anti-EGFR-Antikörpers in Kombination mit Radiotherapie und einer Verbindung aus der Gruppe 1) Östrogenrezeptormodulator, 2) Androgenrezeptormodulator, 3) Retinoidrezeptormodulator, 4) Zytotoxikum, 5) antiproliferatives Mittel, 6) Prenyl-Protein- transferaseinhibitoren, 7) HMG-CoA-Reduktase-lnhibitoren, 8) HIV- Protease-Inhibitoren, 9) Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, 10) Wachstumsfaktorrezeptor-Inhibitoren sowie 11) Angiogenese-Inhibitoren verabreicht wird. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können so auch gemeinsam mit anderen gut bekannten Therapeutika, die aufgrund ihrer jeweiligen Eignung für das behandelte Leiden ausgewählt werden, verabreicht werden. So wären zum Beispiel bei Knochenleiden Kombinationen günstig, die antiresorptiv wirkende Bisphosphonate, wie Alendronat und
Risedronat, Integrinblocker (wie sie weiter unten definiert werden), wie αvß3-Antagonisten, bei der Hormontherapie verwendetete konjugierte Östrogene wie Prempro®, Premarin® und Endometrion®; selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMs) wie Raloxifen, Droloxifen, CP- 336,156 (Pfizer) und Lasofoxifen, Kathepsin-K-Inhibitoren und ATP- Protonenpumpeninhibitoren enthalten.
Die vorliegenden Arzneimittel eignen sich auch zur Kombination mit bekannten Antikrebsmitteln. Zu diesen bekannten Antikrebsmitteln zählen die folgenden: Östrogenrezeptormodulatoren, Androgenrezeptor- modulatoren, Retinoidrezeptormodulatoren, Zytotoxika, antiproliferative Mittel, Prenyl-Proteintransferaseinhibitoren, HMG-CoA-Reduktase- Inhibitoren, HlV-Protease-lnhibitoren, Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, Wachstumsfaktor-Inhibitoren sowie Angiogeneseinhibitoren. Die vorliegenden Verbindungen eignen sich insbesondere zur gemeinsamen Anwendung mit Radiotherapie.
„Östrogenrezeptormodulatoren" bezieht sich auf Verbindungen, die die Bindung von Östrogen an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu den Östrogenrezeptormodulatoren zählen zum Beispiel Tamoxifen, Raloxifen, Idoxifen, LY353381 , LY 117081 , Toremifen, Fulvestrant, 4-[7-(2,2-
Dimethyl-1-oxopropoxy-4-methyl-2-[4-[2-(1- piperidinyl)ethoxy]phenyl]-2H- 1-benzopyran-3-ylJphenyl-2,2-dimethylpropanoat, 4,4'- Dihydroxybenzophenon-2,4-dinitrophenylhydrazon und SH646, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. „Androgenrezeptormodulatoren" bezieht sich auf Verbindungen, die die Bindung von Androgenen an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu den Androgenrezeptormodulatoren zählen zum Beispiel Finasterid und andere 5α-Reduktase-lnhibitoren, Nilutamid, Flutamid, Bicalutamid, Liarozol und
Abirateron-acetat.
„Retinoidrezeptormodulatoren" bezieht sich auf Verbindungen, die die Bin- düng von Retinoiden an den Rezeptor stören oder diese hemmen, und zwar unabhängig davon, wie dies geschieht. Zu solchen Retinoidrezeptormodulatoren zählen zum Beispiel Bexaroten, Tretinoin, 13-cis-Retinsäure, 9-cis-Retinsäure, α-Difluormethylornithin, ILX23-7553, trans-N-(4'-Hydroxy- phenyl)retinamid und N-4-CarboxyphenyIretinamid. „Zytotoxika" bezieht sich auf Verbindungen, die in erster Linie durch direkte Einwirkung auf die Zellfunktion zum Zelltod führen oder die die Zellmyose hemmen oder diese stören, darunter Alkylierungsmittel, Tumomekrose- faktoren, interkaliernde Mittel, Mikrotubulin-Inhibitoren und Topoisomerase-Inhibitoren. Zu den Zytotoxika zählen zum Beispiel Tirapazimin, Sertenef, Cachectin, Ifosfamid, Tasonermin, Lonidamin, Carboplatin, Altretamin, Prednimustin, Dibromdulcit, Ranimustin, Fotemustin, Nedaplatin, Oxaliplatin, Temozolomid, Heptaplatin, Estramustin, Improsulfan-tosylat, Trofosfamid, Nimustin, Dibrospidium-chlorid, Pumitepa, Lobaplatin, Satraplatin, Profiromycin, Cisplatin, Irofulven, Dexifosfamid, cis-Amindichlor(2- methylpyridin)platin, Benzylguanin, Glufosfamid, GPX100, (trans,trans,trans)-bis-mu-(hexan-1 ,6-diamin)-mu-[diamin- platin(ll)]bis[diamin(chlor)platin(ll)]-tetrachlorid, Diarizidinylspermin, Arsentrioxid, 1-(11-Dodecylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin, Zorubicin, Idarubicin, Daunorubicin, Bisantren, Mitoxantron, Pirarubicin,
Pinafid, Valrubicin, Amrubicin, Antineoplaston, 3'-Desamino-3'-morpholino- 13-desoxo-10-hydroxycarminomycin, Annamycin, Galarubicin, Elinafid, MEN10755 und 4-Desmethoxy-3-desamino-3-aziridinyl-4-methylsulfonyl- daunorubicin (siehe WO 00/50032), was jedoch keine Einschränkung darstellen soll.
Zu den Mikrotubulin-Inhibitorenn zählen zum Beispiel Paclitaxel, Vindesin- sulfat, S'^'-Dideshydro^'-desoxy-δ'-norvincaleukoblastin, Docetaxol, Rhizoxin, Dolastatin, Mivobulin-isethionat, Auristatin, Cemadotin, RPR109881 , BMS184476, Vinflunin, Cryptophycin, 2,3,4,5,6-pentafluor-N- (3-fluor-4-methoxyphenyl)benzolsulfonamid, Anhydrovinblastin, N,N- dimethyl-L-valyl-L-valyl-N-methyl-L-valyl-L-prolyl-L-prolin-t-butylamid, TDX258 und BMS188797.
Topoisomerase-Inhibitoren sind zum Beispiel Topotecan, Hycaptamin, Irinotecan, Rubitecan, 6-Ethoxypropionyl-3',4*-O-exo-benzyliden- chartreusin, 9-Methoxy-N,N-dimethyl-5-nitropyrazolo[3,4,5-kl]acridin-2- (6H)propanamin, 1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl- 1 H, 12H-benzo[de]pyrano[3',4*:b,7]indolizino[1 ,2b]chinolin-10, 13(9H,15H)- dion, Lurtotecan, 7-[2-(N-lsopropylamino)ethyl]-(20S)camptothecin, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, Etoposid-phosphat, Teniposid, Sobuzoxan, 2*-Dimethylamino-2'-desoxy-etoposid, GL331 , N-[2- (Dimethylamino)ethyl]-9-hydroxy-5,6-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazol-1- carboxamid, Asulacrin, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(Dimethylamino)ethylj- N-methylamino]ethyl]-5-[4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl]-5,5a,6,8,8a,9- hexohydrofuro(3*,4':6,7)naphtho(2,3-d)-1 ,3-dioxol-6-on, 2,3- (Methylendioxy)-5-methyl-7-hydroxy-8-methoxybenzo[c]phenanthridinium, 6,9-Bis[(2-aminoethyl)amino]benzo[g]isochinolin-5, 10-dion, 5-(3-Amino- propylamino)-7, 10-dihydroxy-2-(2-hydroxyethylaminomethyl)-6H- pyrazolo[4,5,1-de]acridin-6-on, N-[1-[2(Diethylamino)ethylamino]-7- methoxy-9-oxo-9H-thioxanthen-4-ylmethyl]formamid, N-(2-(Dimethyl- amino)-ethyl)acridin-4-carboxamid, 6-[[2-(Dimethylamino)-ethyl]amino]-3- hydroxy-7H-indeno[2,1-c]chinolin-7-on und Dimesna. Zu den „antiproliferativen Mitteln" zählen Antisense-RNA- und -DNA- Oligonucleotide wie G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 und INX3001 , sowie Antimetaboliten wie Enocitabin, Carmofur, Tegafur, Pentostatin, Doxifluridin, Trimetrexat, Fludarabin, Capecitabin, Galocitabin, Cytarabin-ocfosfat, Fosteabin-Natriumhydrat, Raltitrexed, Paltitrexid, Emitefur, Tiazofurin, Decitabin, Nolatrexed, Pemetrexed, Nelzarabin, 2'- Desoxy-2'-methylidencytidin, 2'-Fluormethylen-2'-desoxycytidin, N-[5-(2,3- Dihydrobenzofuryl)sulfonyl]-N'-(3,4-dichlorphenyl)hamstoff, N6-[4-Desoxy- 4-[N2-[2(E),4(E)-tetradecadienoyl]glycylamino]-L-glycero-B-L-manno- heptopyranosyljadenin, Aplidin, Ecteinascidin, Troxacitabine, 4-[2-Amino- 4-oxo-4,6,7,8-tetrahydro-3H-pyrimidino[5,4-b][1,4]thiazin-6-yl-(S)-ethyl]- 2,5-thienoyl-L-glutaminsäure, Aminopterin, 5-Flurouracil, Alanosin, 11- Acetyl-8-(carbamoyloxymethyl)-4-formyl-6-methoxy-14-oxa-1 , 11 -diaza- tetracyclo(7.4.1.0.0)-tetradeca-2,4,6-trien-9-ylessigsäureester, Swainsonin, Lometrexol, Dexrazoxan, Methioninase, 2*-cyan-2*-desoxy-N4-palmitoy(-1- B-D-Arabinofuranosylcytosin und 3-Aminopyridin-2-carboxaldehyd- thiosemicarbazon. Die „antiproliferativen Mittel" beinhalten auch andere monoklonale Antikörper gegen Wachstumsfaktoren als bereits unter den „Angiogenese-Inhibitorenn" angeführt wurden, wie Trastuzumab, sowie Tumorsuppressorgene, wie p53, die über rekombinanten virusvermittelten Gentransfer abgegeben werden können (siehe z.B. US-Patent Nr. 6,069,134). Erfindungsgemäße Arzneimittel können auch in Kombination mit allen weiteren dem Fachmann bekannten therapeutischen Antikörpern oder im Zusammenhang mit obengenannter Krankheiten geeigneten pharmazeutischen Wirkstoffen verabreicht werden.
Weiterhin können erfindungsgemäße Formulierungen von anti-EGFR- Antikörpern zur Isolierung und zur Untersuchung der Aktivität oder Expression von EGFR verwendet werden. Außerdem eignen sie sich insbesondere zur Verwendung in diagnostischen Verfahren zu Erkrankungen im Zusammenhang mit unregulierter oder gestörter EGFR- Aktivität.
Für diagnostische Zwecke können erfindungsgemäße Antikörper beispielsweise radioaktiv markiert werden. Ein bevorzugtes Markierungsverfahren ist die lodogen-Methode (Fraker et al., 1978). Für diagnostische Zwecke wird der Antikörper besonders bevorzugt als F(ab')2 Fragment verwendet. Dadurch werden hervorragende Ergebnisse erzielt, so dass keine Hintergrund-Subtraktion notwendig ist. Solche Fragmente können nach bekannten Methoden hergestellt werden (e.g., Herlyn et al., 1983). Im Allgemeinen wird ein Pepsin-Verdau in bei saurem pH-Wert duchgeführt und die Fragmente durch Protein A-Sepharose™ Chromatographie von unverdautem IgG und Fragmenten schwerer Ketten getrennt.
Die anti-EGFR-Antikörper zeigen in erfindungsgemäßen Formulierungen bevorzugt eine vorteilhafte biologische Aktivität, die in Enzym-Assays, wie in den Beispielen beschrieben, leicht nachweisbar ist. In derartigen auf Enzymen basierenden Assays zeigen und bewirken die erfindungsgemäßen Antikörper bevorzugt einen inhibierenden Effekt, der gewöhnlich durch ICso-Werte in einem geeigneten Bereich, bevorzugt im mikromolaren Bereich und bevorzugter im nanomolaren Bereich dokumentiert wird. Nachweise von Proteingröße, struktureller Integrität, Reinheit oder
Glykosylierungsmuster der erfindungsgemäßen der erfindungsgemäßen Antikörper in erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, SE-HPLC, Peptid-Mapping (Verdau), N-terminale Sequenzierung, SDS-Page, Tris-Glycin-Gradient-Gel (nicht-reduzierend), FTIR-Methode (Fourier transform infrared spectra), CD (circular dichroism), RAMAN Spektroskopie, Kohlenhydratfärbung (PAS-Methode), Oligosaccharid-Profiling, Bestimmung der Monosaccharid- Zusammensetzung oder isoelektrische Fokussierung.
Die Stabilität erfindungsgemäßer Formulierungen lässt sich beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, mithilfe von Stabilitätsprogrammen bestimmen, z.B. einer Lagerung bei 25°C und 60% relativer Luftfeuchte und bei 40°C und 70% relativer Luftfeuchte über einen längeren Zeitraum hinweg und Bestimmung der Stabilität oder strukturellen Intergrität des Proteins in regelmäßigen Intervallen beispielsweise durch obengenannte Nachweismethoden (SE-HPLC, FT- IR; SDS-PAGE (reduzierend oder nicht-reduzierend)) nachweisen. Nachweismethoden zur biologischen Aktivität oder Wirksamkeit erfindungsgemäßer Antikörper in erfindungsgemäßen Formulierungen umfassen beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, ELISA, biologische Zellassays, FTIR oder CD.
Nachweismethoden verminderter Aggregationstendenz erfindungsgemäßer hochkonzentrierte Formulierungen umfassen beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, visuelle Kontrolle, Sub- visible particles Analyse, Nephelometrie oder Turbidimetrie, Dynamic Light Scattering Characterization.
Beispiel 1: Herstellung einer hochkonzentrierten flüssigen anti-EGFR- Antikörperformulierung durch Tangentialflussfiltration (TFF)
380 ml Protein (17 mg/ml in 10 mM Phosphat + 145 mM NaCI, pH 7.2) werden mittels einer Labscale-TFF-Analge (Millipore) mit eingebauter Polyethersulfon-Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 30 kDa für 22 6min bei einem Eingangsdruck von 20 psi und einem Ausgangsdruck von 10 psi aufkonzentriert. Das erhaltene Retentat weist eine
Proteinkonzentration von ca. 132 mg/ml auf. Die Ausbeute beträgt 85%.
oder
470 ml Protein (1 7mg/ml in 10mM Citrat) werden mittels einer Labscale- TFF-Analge (Millipore) mit eingebauter Polyethersulfon- Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 30 kDa für 226 min bei einem Eingangsdruck von 20 psi und einem Ausgangsdruck von 10 psi aufkonzentriert. Das erhaltene Retentat weist eine Proteinkonzentration von ca. 123mg/ml auf. Die Ausbeute beträgt 95%. Beispiel 2: Herstellung einer hochkonzentrierten flüssigen Formulierung von anti-EGFR-Antikörpern durch gerührte Ultrafiltration
25 ml Protein (10 mg/ml in 10 mM Phosphat + 145 mM NaCI, pH 7.2) werden mittels einer Amicon-Rührzelle mit eingebauter Polyethersulfon- Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 30 kDa für 144 min bei einem Stickstoff-Gasdruck von 4 bar aufkonzentriert. Das erhaltene Retentat weist eine Proteinkonzentration von ca. 92 mg/ml auf. Die Ausbeute beträgt 95%.
oder
25 ml Protein (10 mg/ml in 10 mM Citrat, pH 5,5) werden mittels einer Amicon-Rührzelle mit eingebauter Polyethersulfon-Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 30 kDa für 168min bei einem Stickstoff-Gasdruck von 4bar aufkonzentriert. Das erhaltene Retentat weist eine Proteinkonzentration von ca. 82 mg/ml auf. Die Ausbeute beträgt 95%.
Beispiel 3: Herstellung einer hochkonzentrierten flüssigen Formulierung von anti-EGFR-Antikörpern durch Ultrafiltration unter Einwirkung von Zentrifugalkräften
15 ml Protein (2 mg/ml in 10 mM Phosphat + 145 mM NaCI, pH 7.2) werden in einem Ultrafree-Zentrifugenröhrchen (Millipore) mit einer
Polyethersulfon-Ultrafiltrationsmembran mit einem Cutoff von 30 kDa bei: 2000*g für 90 min zentrifugiert. Das erhaltene Retentat weist eine Proteinkonzentration von ca. 116mg/ml auf. Die Ausbeute beträgt 95%.
Beispiel 4: Untersuchung auf lösliche Aggregate der hochkonzentrierten flüssigen Formulierung von anti-EGFR-Antikörpern Die in den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Retentate wurden mittels SE- HPLC auf den Gehalt an löslichen Aggregaten untersucht. Dabei war der Anteil an Monomer nach Aufkonzentrierung >99%.
Beispiel 5: Untersuchung auf Nativität der hochkonzentrierten flüssigen Formulierung von anti-EGFR-Antikörpern
Die im Beispiel 1 erhaltenen Retentate wurden FT-IR-spektrometrisch untersucht. Dabei waren die Amid I-2. Ableitung-Spektren des Ausgangsmaterials vor Aufkonzentrierung mittels Tangentialflussfiltration und des erhaltenen Retentats kongruent.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer hochkonzentrierten, flüssigen Formulierung enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente durch Ultrafiltration.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 10 - 250 mg/ml aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 50 - 180 mg/ml aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 100 - 150 mg/ml aufweist.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der anti-EGFR-Antikörper monoklonal ist und muriner oder humaner Herkunft ist.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der anti-EGFR-Antikörper muriner Herkunft ist und chimär oder humanisiert ist.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der anti-EGFR-Antikörper Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD72000) ist.
8. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente.
9. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 10 - 250 mg/ml aufweist.
10. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 50 - 180 mg/ml aufweist.
11. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hochkonzentrierte, flüssige Formulierung einen Gehalt eines anti-EGFR-Antikörpers von 100 - 150 mg/ml aufweist.
12. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der anti- EGFR-Antikörper monoklonal ist und muriner oder humaner Herkunft ist.
13. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der anti- EGFR-Antikörper muriner Herkunft ist und chimär oder humanisiert ist.
14. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der anti- EGFR-Antikörper Mab C225 (Cetuximab) oder Mab h425 (EMD72000) ist.
15. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung enthaltend wenigstens einen anti-EGFR-Antikörper und/oder eine seiner Varianten und/oder Fragmente erhältlich durch ein Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7.
16. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 15 als lagerstabiles Arzneimittel.
17. Hochkonzentrierte, flüssige Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet dass sie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe und/oder weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthält.
18. Verwendung einer hochkonzentrierten, flüssigen Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments.
19. Verwendung einer hochkonzentrierten, flüssigen Formulierung nach einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Tumormetastasen.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Tumor aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Gehirntumor, Tumor des Urogenitaltrakts, Tumor des lymphatischen Systems, Magentumor, Kehlkopftumor, Monozytenleukämie, Lungenadenokarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom und Brustkarzinom.
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