EP1697529A1 - Particules virales contenant un vecteur derive d'alpha virus et procede de preparation de ladite particule virale - Google Patents

Particules virales contenant un vecteur derive d'alpha virus et procede de preparation de ladite particule virale

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EP1697529A1
EP1697529A1 EP04805869A EP04805869A EP1697529A1 EP 1697529 A1 EP1697529 A1 EP 1697529A1 EP 04805869 A EP04805869 A EP 04805869A EP 04805869 A EP04805869 A EP 04805869A EP 1697529 A1 EP1697529 A1 EP 1697529A1
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EP
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virus
alpha
vector derived
viral
vector
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04805869A
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Inventor
Jean-Christophe Pages
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BOULIKAS PARTHENIOS (TENI)
Original Assignee
Universite Francois Rabelais de Tours
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Filing date
Publication date
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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the invention relates to new viral particles containing a vector derived from an alpha-virus rendered defective for autonomous propagation and therefore for replication. It also relates to the process for the preparation of said particles.
  • Semliki forest virus which falls into the category of alpha-viruses.
  • SSV Semliki forest virus
  • alpha-iruses can be considered, such as for example the Sindbis virus.
  • the alpha-virus genome is in the form of a single-strand RNA of positive polarity comprising two open reading phases, respectively a first phase coding the proteins with enzymatic function, and a second phase coding the structural proteins. Replication takes place in the cytoplasm of the cell.
  • the 5 ′ end of the genomic RNA is translated into a polyprotein (nsP 1-4) with RNA polymerase activity producing a negative strand complementary to the genomic RNA.
  • the negative strand is used as a template for the production of two RNAs, respectively:
  • the subgenomic RNA is transcribed from the p26S promoter present at the 3 ′ end of the RNA sequence coding for the nsp4 protein.
  • the ratio of positive genomic RNA / subgenomic RNA is regulated by the proteolytic self-cleavage of the polyprotein into nsp 1, nsp 2, nsp 3 and nsp 4.
  • expression of viral genes takes place in two phases. In a first phase, there is a main synthesis of positive genomic strands and negative strands. During the second phase, the synthesis of sub-genomic RNA is almost exclusive, thus leading to the production of structural proteins in very large quantities.
  • the first solution consists in deleting the structural genes of the Semliki RNA in favor of the transgene, the transgene being placed under the dependence of the p26S promoter.
  • Such a vector can be transferred to cells in the form of RNA or in the form of DNA.
  • this solution is of little interest for in vivo applications, insofar as there is a low transfer efficiency using these genetic elements used in the absence of particles.
  • a Semliki vector not in the form of DNA or RNA alone, but in the form of recombinant viral particles.
  • a cell line is transfected with at least two plasmids, respectively, a plasmid carrying the RNA of the Semliki vector devoid of structural genes and a second plasmid carrying the Semliki structural genes under the control of the p26S promoter.
  • viral particles which encapsulate only the defective RNA, that is to say the Semliki RNA carrying the transgene since it alone also carries an encapsidation sequence contained in the sequence of nsP2.
  • the Rolls documents (1, 2) describe an SFV vector whose genome has been modified by replacing the structural genes with the gene encoding the VSV-G envelope, possibly associated with a transgene.
  • the infectious particles thus obtained therefore consist of a VSV-G envelope and contain a vector derived from alpha virus.
  • the system described is particularly dangerous because of its ability to replicate autonomously.
  • An equivalent system is described in document WO 03/072771.
  • the document Lebedeva et al. (3) describes the coelectroporation of BHK cells by: the capsid and the envelope of SFV as a control, or a derived vector in which the env gene of SFV is replaced by env sequences of the MLV retrovirus (Moloney murine leukemia), and the analysis of the viral particles thus produced.
  • the mobilization of the vector SFV carrying the transgene in this case that of ⁇ -galactosidase, is dependent on the packaging of this recombinant genomic RNA by the capsid protein of SFV.
  • the problem which the invention proposes to solve is to improve the mode of mobilization of the vectors derived from alpha-virus, in particular from the Semliki forest virus (SFV), so as to avoid any risk of recombination within the producing lines which can generate replicative particles.
  • Another problem which the invention proposes to solve is to prepare viral particles containing a vector derived from alpha-virus, the tropism of which is not limited to the target cells of wild viruses.
  • the Applicant has succeeded in producing viral particles which simultaneously meet the two above objectives by expressing in trans, in a cell line, the genes coding for structural elements not derived from the alpha virus and the vector derived from alpha- virus made defective for replication.
  • the genes coding for structural elements not originating from the alpha-virus correspond to the only ENV gene of the vesicular stomatitis virus coding for the NSN-G envelope protein.
  • VSV-G Using a VSV-G envelope has several advantages.
  • the envelope protein of the vesicular stomatitis virus allows a mode of cellular entry by endocytosis which can be superimposed on that of alpha-viruses.
  • VSV-G is a very stable protein, capable of being concentrated by ultra-centrifugation and making it possible to envisage parenteral administrations.
  • this protein confers a very large tropism on the particles which contain it, thus widening the field of use of the viral particles of the invention to organisms as different as Drosophila and mammals.
  • the expression in trans is obtained by co-transfection advantageously carried out in two distinct stages respectively, the transfection of the line with the plasmid expressing the gene of the envelope VSV-G, then a second transfection by the vector derived from alpha virus.
  • co-transfection is carried out on 293T cells.
  • the genes coding for structural elements not derived from the alpha virus correspond to the genes coding for the structural proteins of a retro irus.
  • expression in trans is obtained by transfection of an encapsidation cell line, producer of retroviruses defective for replication, with the vector derived from alpha virus.
  • This type of line is well known in the art, such as Phoenix ® system (http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral systems / plixiitml).
  • packaging lines using structural genes of MLN can be used.
  • these lines are obtained by stable transfection of a first plasmid expressing the GAG-POL genes and of a second plasmid expressing an ENV gene of a retrovirus or of another enveloped virus (4).
  • the viral particles by triple transfection of a cell line, for example 293T cells, by introduction of a first viral element expressing the GAG and POL genes of retrovirus, of a second viral element expressing the ENV gene of retrovirus and of the vector derived from alpha-virus.
  • the vector derived from alpha-virus is made defective for replication. This property is in practice obtained by the deletion of structural genes or their substitution for the benefit of the transgene (s) of interest in the vector genome.
  • the genome of the vector derived from alpha-virus contains a signal allowing the packaging by the viral particle, called psi sequence.
  • the sequence psi corcespond to the extended packaging sequence of MLN vectors obtained by amplification by PCR method (polymerase chain reaction) of the vector PL ⁇ CX (Clontech ®) from primers: - 5 'primer: L ⁇ CX Psi 2a: 5'- GGGACCACCGACCCACCACC -3 'and - primer 3': L ⁇ CX Psi 2b: 5'- GATCCTCATCCTGTCTCTTG -3 '.
  • the psi sequence is reduced in size and corresponds to the minimum sequence.
  • This modification is interesting insofar as the psi sequence can have an anchor point function for the entry of ribosomes (IRES).
  • IRES ribosomes
  • the Applicant also demonstrated that the presence of a retroviral packaging signal was not necessarily necessary.
  • the quantity of AR ⁇ recombinants of the Semliki vector, found in the cytoplasm of the transfected cells is such that the latter are preferentially packaged in retroviral particles. This phenomenon is accentuated by the extinction of cellular genes, induced by the expression of the non-structural proteins of the Semliki virus.
  • the sub-cellular localization of the replication complexes of the SFV virus could also play an important role (5). Therefore, and in a preferred embodiment, the vector genome is devoid of psi sequence.
  • the applicant has also shown that it is possible to mobilize a vector as described above, containing a retroviral encapsidation sequence, by means of retroviral particles produced using a transcomplementation system based on vectors derived from the Semliki forest virus. (11).
  • a transcomplementation system based on vectors derived from the Semliki forest virus. (11).
  • D. is also demonstrated that the presence of a retroviral packaging signal improves the titer of the particles by approximately one log.
  • These particles are effectively used to transduce cells expressing the receptor for amphotropic viruses (Pit 2), corresponding to the retroviral envelope. used. This observation has a direct consequence on the biosecurity of the retroviral particles produced by the method of Li and Garoff (11).
  • the particles produced according to the method of Li and Garoff contain, in a titer close to 10 6 part ml, genomes of recombinant SFV vectors expressing the GAG / POL or ENV sequences of the retroviruses.
  • the Applicant has moreover found that the mode of transfection generally used for the recombinant ARs of the Semliki vectors, namely electroporation, leads to significant cellular suffering. Also, and to allow transfection of the producer cells by methods which are gentler than electroporation, the vector derived from alpha-virus has been modified to be expressed from a eukaryotic promoter, for example a CMN promoter positioned at 5 'of the vector sequence.
  • a eukaryotic promoter for example a CMN promoter positioned at 5 'of the vector sequence.
  • the p26S promoter of the alpha-virus vector is advantageously mutated.
  • a particle according to the invention is like a viral particle made up of structural elements not derived from an alpha-virus and containing a vector derived from alpha-virus made defective for replication, by deletion or replacement by at at least one transgene, structural genes, the structural elements of said particle not being encoded by the genome of the vector derived from alpha-virus.
  • the invention relates to the use of the viral particles according to the invention for infecting cells in vitro.
  • the Applicant has shown that the particles thus produced can infect a wide variety of eukaryotic cells, both human and non-human.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the viral particles of the invention. Likewise, it relates to the use of viral particles for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancer.
  • Figure 1 is a schematic representation of the structure of the vector derived from the Semliki Forest Virus (SFV).
  • SFV Semliki Forest Virus
  • Figure 2 shows the mutations made in the p26S promoter.
  • the mutations introduced into the p26Sml and p26Sm2 mutants with respect to the wild-type sequence (Wt) are boxed.
  • the amino acid in bold indicates a change in the coding sequence.
  • FIG. 3 is the result of a Northern-blot carried out from producer cells, expressing modified SFV vectors (pEGFPCl; 2: p26Sml; 3: p26Sm2; 4: SFV without transgene), with a GFP probe of pEGFPCl.
  • FIG. 4 shows the capacity of the 293T and BHK 21 cells to express the vectors derived from SFV (p26Sml and p26Sm2) and mobilized by the pseudo-particles VSV-G.
  • FIG. 5 is the result of a northern blot carried out from the cells infected with the supernatant of 293 T cells transfected with the plasmid pMDG and of the vectors
  • - HepG2 human hepatoma line cultivated in EM containing 10% FCS (ATCC HB-8065), - BHK21: baby hamster kidney line cultivated in GMEM containing 5% FCS and 8% liquid tryptose solution phosphate (ATCC CCL- 10), - CESC: Chicken embryo obtained and cultivated according to reference 26, - High Five cell cultivated at 27 ° C in a medium of Grace's insect cells (cat n ° B85502 Invitrogen) containing 10% FCS, - Sp2 / O: Murine line of lymphoplastoids cultivated in RPMI 1640 containing 10% FCS (ATCC CRL1581). 21 Construction of the SFV vector
  • the internal promoter 26S of the SFV is mutated by PCR from the vector pSFVl (Invitrogen), which is devoid of structural genes and used as template in the presence of two primers, respectively: - a primer 26SmlF containing the restriction site Bgl U appearing in bold in the following sequence: 5'-ATCCTCGAAGATCTAGGG-3 ', - a second mutated primer 26SmlR containing the Cla l restriction site appearing in bold in the following sequence: 5 -CAATATCGAT TACTAGCGAACTAATCTAGGA-3'.
  • Silent mutations are then introduced into the p26S promoter to lead to the p26Sml promoter as shown in FIG. 2.
  • the product thus amplified is then cloned into a plasmid pIRES2-EGFP (Invitrogen) (FIG. 1).
  • a retroviral sequence designated RS, derived from an MLV virus is then inserted between the 26S mutated promoter and the IRES sequence. Fragments containing the sequence 26S mutated, the MLV retroviral sequence and the EGFP gene are then excised with Bgl II and Hpa I and then cloned into the vector pSFVl between the Bgl JJ and Sma I restriction sites.
  • the 10.5 kbp fragment containing the modified SFV replicon is finally cloned between the promoter IE CMV and the polyadenylation signal SV40 pA in a vector pJRES2-EGFP in which the sequence IRES GFP has been deleted.
  • the internal promoter is mutated by PCR from the plasmid SFV1 used as template in the presence of two primers respectively, a first primer 26SmlF and a second primer 26Sm2R containing a restriction site appearing in bold in the following sequence:
  • the primer 26Sm2R leads to modifications of the p26S promoter as illustrated in FIG. 2.
  • the amplified product is then digested with Bgl JJ and Cla I and ligated into the vector 26Sml also digested with Bgl JJ and Cla I to remove the cross-cutting fragment .
  • the cells are transfected with 5 ⁇ g of the SFV 26Sml or 26Sm2 vectors.
  • the second transfection medium is left in contact with the cells between 1 pm and 5 pm.
  • the medium is removed and replaced with fresh medium allowing the release of the infecting particles.
  • the culture medium containing the viral particles is collected 5 to 6 hours later. 41 Transfection of the BHK21 cell line with the vectors SFV 26Sml or 26Sm2 and the vectors SFV GAGPOL and SFV ENV and collection of viral particles
  • the BHK 21 cells are electroporated 5 10 6 / ml (i.e. 4 10 6 cells), at a voltage of 350 V, and a capacitance of 750 ⁇ F.
  • the RNAs used for electroporation corresponding to the different vectors (26Sml or m2, SFV GAGPOL and SFV ENV), are transcribed using 1.5 ⁇ g of linearized DNA using an Invitrogen Sp6 polymerase kit.
  • 22 ⁇ l of the transcription product are electroporated.
  • the harvesting of the recombinant particles is carried out 14 to 16 hours later.
  • the supernatants are filtered and deposited on the target cells in the presence of 2 ⁇ g / ml of polybrene.
  • the supernatant of transfected 293T cell lines was collected and then filtered through 0.45 .mu.m filter (Millex ® HA, Millipore) and incubated with different cell lines in the presence of fresh medium containing polybrene used at 5 micrograms per ml (Sigma).
  • the control of GFP expression in infected cells is carried out using a 1 ⁇ 50 Olympus fluorescence microscope. Quantification of transfection is performed using a FACScalibur flow cytometer from Becton Dickinson ®.
  • RNAse A 10 ⁇ g per ml of RNAse A (Sigma), 1 ⁇ g per milliliter of actinomycin D (Sigma), 100 units per milliliter of DNAse I (Invitrogen), 1 mg per milliliter of geneticin (Sigma), and 3 ⁇ g per milliliter of puromycin (Cayla). 67 Concentration of viral particles
  • the supernatant of the transfected 293 cells is centrifuged at 150,000 g in a rotor SW41 for one hour at 4 ° C.
  • the concentrated viruses are resuspended in 300 ⁇ l of PBS and 25 ⁇ l of the solution are used to infect 5.10 5 cells (293T, BHK-21, Hela, HepG2, Sp2 / O, LMH, QM7).
  • RNA from the 10 6 transfected or infected cells is extracted using a total RNA isolation system (Promega ® ).
  • RNA from untransfected 293T cells is extracted as a control. 2 ⁇ g of each RNA is subjected to electrophoresis on a denaturing gel, formaldehyde, and the RNA is transferred to a positively charged nylon membrane (Hybond-XL; Amersham).
  • Hybond-XL a positively charged nylon membrane
  • the probes correspond to a fragment of 790 bp Age I-BamH I GFP plasmid pEGFPCl (Clontech), the fragment being labeled (Rediprime ® JJ DNA labeling system; Amersham) and column purified (ProbeQuant ® G-50 Micro Columns, Amersham ) before use.
  • the vectors SFV 26Sml and 26Sm2 correspond to vectors SFV, whose promoter 26S has been mutated in order to avoid possible competition between the packaging of the genomic RNA of SFV and the subgenomic RNA produced by transcription under the influence of the 26S promoter.
  • the functionality of the two vectors was checked by transfection of 293T cells. The intense expression of GFP observed suggests that the transcription and translation of the modified SFV vector are correct. This first result is then confirmed by analysis on Northern Blot from the RNA extracted from 293 cells transfected with the vector SFV 26Sml.
  • the GFP probe reveals the existence of two bands corresponding to genomic RNA and subgenomic RNA, the latter suggesting that the 26S promoter is still functional.
  • the same test is carried out on the second vector SFV 26Sm2 comprising additional mutations.
  • the detection of GFP and the analysis by Northern Blot confirm that the mutations made in the 26Sm2 promoter inhibit the production by transcription, of the subgenomic RNA (see FIG. 3, line 3).
  • 293T cells are co-transfected with the plasmid pMDG, then the vector SFV 26Sml or SFV 26Sm2 as indicated above.
  • the supernatant of the transfected cells is transferred to fresh 293T cells or to BHK 21 cells.
  • the strong and rapid expression of the GFP obtained shows that it is possible to mobilize SFV vectors by means of cells expressing the VSV-G envelope ( figure 4).
  • the highest titer is obtained with the BHK21 cells compared to the 293T and QM7 cells.
  • the expression of the GFP containing the target cells is due to a true transduction by the viral particles SFV
  • the following controls are carried out.
  • the SFV RNA is detected by Northern Blot from RNA extracted from the infected cells (see FIG. 5).
  • the producing cells in cells infected with the vector SFV 26Sml, both genomic RNA and subgenomic RNA are observed.
  • the genomic RNA is detected in cells infected with the vector SFV 26Sm2.
  • the signal strength suggests intense replication of the SFV vectors.
  • high concentration DNase I 1000 UJ / mi
  • RNA POL JJ RNA POL JJ
  • GFP can be passively transferred via retroviral particles independently of any expression.
  • the target cells are pretreated with two translation inhibitors, respectively geneticin and puromycin. After treatment, the target cells show a barely detectable expression of GFP, which shows that the observed GFP results from translation and not from passive transfer (Table 2).
  • the co-transfection of a plasmid pEGFPCl strongly expressing GFP with a plasmid coding for VSV-G does not lead to any pseudo-transduction of GFP.
  • Il Constructions The constructions described in example 1 were used. Two other derivative constructions, having a substitution of the CMV promoter by the prokaryotic promoter SP6, were also used: - The first construction, spSFV26Sml, is directly derived from SFV26Sml.
  • spSFV26Sml ⁇ The second construction, spSFV26Sml ⁇ , is obtained by digestion Bgl JJ- Sma I of a plasmid pSFNl (Invitrogen ® ), within which is cloned a fragment Bgl II- Hpa I of the plasmid ⁇ IRES2 GFP (Clontecb ® ), modified by introduction of a PCR fragment containing the 3 ′ end of the nsp4 gene and generated using the primers 26SmlF and 26SmlR (cf. example 1, section 2a).
  • Producing recombinant retroviruses cells derived from 293 cells, phoenix ® (http://www.stanford.edu/group/nolan/retiOviral systems / phx.html) are cultured in DMEM medium (GJJ3CO) in the presence of serum decomplemented fetal calf (Abcys).
  • the producer cells are transfected using the plasmids SFV26Sml or
  • the transfection is carried out using calcium phosphate (Calcium Phosphate transfection kit, Invitrogen ® ).
  • the transfection is carried out by electroporation: 40 ⁇ l of replicons produced in vitro are placed in the presence of 40 ⁇ 10 5 cells and electroporated using the EasyjecT system.
  • the medium is changed. 16 hours after this change, the medium is harvested to carry out the infections. During the harvest, the medium is filtered using 0.45 ⁇ m filters
  • the filtered supernatants are used to infect 293T cells, cultured in 12-well plates. Infection is carried out in the presence of a polycation necessary for virus / cell interactions, polybrene (Sigma ® ) at 5 ⁇ g / ml. On the day of infection, a well of 293T target cells is trypsinized for counting. 24 hours after infection, the cells are tryp sinized for a passage in flow cytometry (FACScalibur, Becton-Dickinson ® ). The percentage of cells expressing GFP, relative to the number of cells on the day of infection, makes it possible to calculate a titer of recombinant particles (JP / ml) (Table 3).
  • Controls identical to those carried out in Example 1, were carried out: - 10 ⁇ g per ml of RNAse A (Sigma ® ), 1 ⁇ g per milliliter of actinomycin D (Sigma ® ), - 100 units per milliliter of DNAse I (Invitrogen ® ), 1 mg per milliliter of geneticin (Sigma ® ).
  • retroviral particles containing either the SFV vectors used to express the transcomplementation sequences of the retroviruses, or the SFV vectors comprising the sequence of the recombinant retrovirus. This observation calls into question the use of these modes of production of retroviral vectors for clinical purposes, unlike the viral particles of the invention.
  • RNA is a structural element in retrovirus particles. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 5246-51. (2001).

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Abstract

Particule virale constituée d'éléments structuraux non issus d'un alpha-virus et contenant un vecteur dérivé d'alpha-virus rendu défectif pour la réplication, par délétion ou remplacement par au moins un transgene, des gènes structuraux caractérisée en ce que les éléments structuraux de ladite particule ne sont pas codés par le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus. procédé de production de ladite particule qui consiste A exprimer en trans, dans une lignée cellulaire, les gènes codant les éléments structuraux non issus de l'alpha-virus et le vecteur dérivé d'alpha-virus puis à récupérer les particules virales présentes dans le surnageant de la culture cellulaire.

Description

PARTICULES VIRALES CONTENANT UN VECTEUR DERIVE D'ALPHA VIRUS ET PROCEDE DE PREPARATION DE LADITE PARTICULE VIRALE
L'invention concerne de nouvelles particules virales contenant un vecteur dérivé d'un alpha-virus rendu défectif pour une propagation autonome et donc pour la réplication. Elle se rapporte également au procédé de préparation desdites particules.
Dans la suite de la description, l'invention est plus particulièrement illustrée en relation avec le virus de la forêt de Semliki (SFV) entrant dans la catégorie des alpha- virus. Bien entendu, cet exemple particulier ne limite en rien la portée de l'invention et tous les alpha- irus peuvent être envisagés, tels que par exemple le virus Sindbis.
Le génome des alpha-virus se présente sous la forme d'un ARN simple brin de polarité positive comprenant deux phases ouvertes de lecture, respectivement une première phase codant les protéines à fonction enzymatique, et une seconde phase codant les protéines structurales. La réplication s'effectue dans le cytoplasme de la cellule. Dans la première étape du cycle infectieux, l'extrémité 5' de l'ARN genomique est traduite en une polyprotéine (nsP 1-4) à activité RNA-polymérase produisant un brin négatif complémentaire de l'ARN genomique. Dans une seconde étape, le brin négatif est utilisé comme matrice pour la production de deux ARN, respectivement :
- un ARN genomique positif correspondant au génome des virus secondaires produisant, par traduction, d'autres protéines nsp et servant de génome aux virus, - un ARN sub-génomique codant les protéines de structure du virus formant les particules infectieuses.
Plus précisément, l'ARN sub-génomique est transcrit à partir du promoteur p26S présent au niveau de l'extrémité 3' de la séquence ARN codant la protéine nsp4. Le rapport ARN genomique positif/ ARN sub-génomique est régulé par l'auto- clivage protéolytique de la polyprotéine en nsp 1, nsp 2, nsp 3 et nsp 4. En pratique, l'expression des gènes viraux se déroule en deux phases. Dans une première phase, il y a synthèse principale de brins génomiques positifs et de brins négatifs. Pendant la seconde phase, la synthèse d'ARN sub-génomique est quasiment exclusive conduisant ainsi à la production de protéines structurales en très grande quantité.
La connaissance du mode de réplication des alpha-viridae et la simplicité de leur génome a conduit à l'émergence de systèmes de transfert de gènes utilisant ces virus, ces derniers permettant d'obtenir une forte expression du transgène dans la cellule cible.
L'une des conditions incontournables pour qu'un vecteur dérivé d'alpha-virus puisse être utilisé en thérapie génique est qu'il ne présente aucune capacité à se répliquer. Plusieurs solutions ont été proposées pour rendre le virus Semliki défectif pour la réplication.
La première solution consiste à déléter les gènes de structure de l'ARN de Semliki au profit du transgène, le transgène étant placé sous la dépendance du promoteur p26S. Un tel vecteur peut être transféré sur des cellules sous forme d'ARN ou sous forme d'ADN. Toutefois, cette solution est peu intéressante pour les applications in vivo, dans la mesure où l'on observe une faible efficacité de transfert à l'aide de ces éléments génétiques utilisés en l'absence de particules.
Une autre solution consiste à infecter les cellules cibles avec un vecteur Semliki non pas sous forme d'ADN ou d'ARN seul, mais sous forme de particules virales recombinantes. Pour ce faire, on transfecte une lignée cellulaire par au moins deux plasmides, respectivement, un plasmide portant l'ARN du vecteur Semliki dénué de gènes de structure et un second plasmide portant les gènes de structure de Semliki sous la dépendance du promoteur p26S. Au sein de la cellule sont formées des particules virales qui n'encapsident que l'ARN défectif, c'est-à-dire l'ARN de Semliki portant le transgène puisque lui seul porte également une séquence d'encapsidation contenue dans la séquence de la nsP2. Même si, en théorie, ce procédé ne génère aucune particule réplicative, les événements de recombinaison restent fréquents du fait, notamment, du chevauchement des séquences de complémentation et du virus recombinant, et de l'abondance des ARN viraux dans le cytoplasme des cellules productrices.
Les documents Rolls (1, 2) décrivent un vecteur SFV dont le génome a été modifié par remplacement des gènes structuraux par le gène codant l'enveloppe VSV-G, éventuellement associé à un transgène. Les particules infectieuses ainsi obtenues sont donc constituées d'une enveloppe VSV-G et contiennent un vecteur dérivé d'alpha- virus. Cependant, le système décrit est particulièrement dangereux du fait de son aptitude à se répliquer de manière autonome. Un système équivalent est décrit dans le document WO 03/072771.
Le document Lebedeva et al. (3) décrit la coélectroporation de cellules BHK par : - un vecteur assurant les fonctions de réplication (Srepβgal : gène codant la réplicase du vecteur Semliki (SFV) et la β-galactosidase comme transgène), un vecteur codant les gènes structuraux : ScapSenv codant la capside et l'enveloppe de SFV comme témoin, ou un vecteur dérivé dans lequel le gène env de SFV est remplacé par des séquences env du rétrovirus MLV (Moloney murine leukemia), et l'analyse des particules virales ainsi produites. Cependant, dans ce système, la mobilisation du vecteur SFV véhiculant le transgène, en l'occurrence celui de la β- galactosidase, est sous la dépendance de l'encapsidation de cet ARN genomique recombinant par la protéine de capside de SFV.
En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention est d'améliorer le mode de mobilisation des vecteurs dérivés d'alpha- virus, en particulier du virus de la forêt de Semliki (SFV), de manière à éviter tout risque de recombinaison au sein des lignées productrices pouvant générer des particules réplicatives. Un autre problème que se propose de résoudre l'invention est de préparer des particules virales contenant un vecteur dérivé d'alpha- virus, dont le tropisme ne soit pas limité aux cellules cibles des virus sauvages.
Le Demandeur a réussi à produire des particules virales qui répondent simultanément aux deux objectifs ci-dessus en exprimant en trans, dans une lignée cellulaire, les gènes codant des éléments structuraux non issus de l'alpha-virus et le vecteur dérivé d'alpha- virus rendu défectif pour la réplication.
Selon un premier mode de réalisation, les gènes codant des éléments structuraux non issus de l'alpha-virus correspondent au seul gène ENV du virus de la stomatite vésiculeuse codant la protéine d'enveloppe NSN-G.
L'utilisation d'une enveloppe VSV-G présente plusieurs avantages. Tout d'abord, la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse permet un mode d'entrée cellulaire par endocytose superposable à celui des alpha-virus. En outre, la VSV-G est une protéine très stable, susceptible d'être concentrée par ultra-centrifugation et permettant d'envisager des administrations parentérales. Par ailleurs, cette protéine confère un très large tropisme aux particules qui la contiennent, élargissant ainsi le champ d'utilisation des particules virales de l'invention à des organismes aussi différents que la drosophile et les mammifères.
Selon ce premier mode de réalisation, l'expression en trans est obtenue par co- transfection avantageusement effectuée en deux étapes distinctes respectivement, la transfection de la lignée par le plasmide exprimant le gène de l'enveloppe VSV-G, puis une seconde transfection par le vecteur dérivé d'alpha- virus. En pratique, la co- transfection est effectuée sur des cellules 293T.
Dans un second mode de réalisation, les gènes codant des éléments structuraux non issus de l'alpha-virus corcespondent aux gènes codant les protéines structurales d'un rétro irus. Dans ce cas, l'expression en trans est obtenue par transfection d'une lignée cellulaire d'encapsidation, productrice de rétrovirus défectifs pour la réplication, par le vecteur dérivé d'alpha- virus. Ce type de lignée est bien connu de l'homme du métier, par exemple le système Phoenix® (http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral systems/plixiitml). On peut utiliser en particulier des lignées d'encapsidation utilisant des gènes structuraux du MLN (muiïne leukemia virus).
De manière connue, ces lignées sont obtenues par transfection stable d'un premier plasmide exprimant les gènes GAG-POL et d'un second plasmide exprimant un gène ENV de rétrovirus ou d'un autre virus enveloppé (4).
Toutefois, il est également envisageable de préparer les particules virales par triple transfection d'une lignée cellulaire, par exemple des cellules 293T, par introduction d'un premier élément viral exprimant les gènes GAG et POL de rétrovirus, d'un second élément viral exprimant le gène ENV de rétrovirus et du vecteur dérivé d'alpha-virus.
n est possible d'accentuer davantage encore le caractère défectif des séquences retrovirales transcomplementantes par mutation, notamment délétion des séquences nucléotidiques du gène POL codant l'intégrase (IN) et la transcriptase inverse (RT).
Dans les deux modes de réalisation de l'invention tels que précédemment décrits, le vecteur dérivé d'alpha- virus est rendu défectif pour la réplication. Cette propriété est en pratique obtenue par la délétion des gènes de structure ou leur substitution au profit du(des) transgène(s) d'intérêt dans le génome du vecteur.
Selon une autre caractéristique, le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus contient un signal permettant l'encapsidation par la particule virale, appelé séquence psi. Selon un premier mode de réalisation, la séquence psi corcespond à la séquence de packaging étendue des vecteurs MLN, obtenue par amplification selon la méthode PCR (polymerase chain reaction) du vecteur PLΝCX (Clontech®) à partir des amorces : - amorce 5': LΝCX Psi 2a: 5'- GGGACCACCGACCCACCACC -3' et - amorce 3': LΝCX Psi 2b: 5'- GATCCTCATCCTGTCTCTTG -3'.
Avantageusement, la séquence psi est réduite en taille et correspond à la séquence minimale. Cette modification est intéressante dans la mesure où la séquence psi peut avoir une fonction de point d'ancrage pour l'entrée des ribosomes (IRES). La fonction IRES permet ainsi de supprimer le promoteur p26S du SFV, de sorte que la traduction du transgène est obtenue à partir de l'ARΝ genomique.
Paradoxalement, le Demandeur a également démontré que la présence d'un signal d'encapsidation rétroviral n'était pas forcément nécessaire. En effet, la quantité d'ARΝ recombinants du vecteur Semliki, retrouvée dans le cytoplasme des cellules transfectées, est telle que ces derniers sont préférentiellement encapsidés dans les particules retrovirales. Ce phénomène est accentué par l'extinction des gènes cellulaires, induite par l'expression des protéines non structurales du virus Semliki. La localisation sub-cellulaire des complexes de réplication du virus SFV pourrait également jouer un rôle important (5). Dès lors, et dans un mode de réalisation préféré, le génome du vecteur est dénué de séquence psi.
Le demandeur a également montré qu'il était possible de mobiliser un vecteur comme décrit précédemment, contenant une séquence retrovirale d'encapsidation, au moyen de particules retrovirales produites en utilisant un système de transcomplémentation basé sur les vecteurs dérivés du virus de la forêt de Semliki (11). Dans ce système, il est montré que l'on peut obtenir des tiu-es de l'ordre de 10 particules par millilitre. D. est également démontré que la présence d'un signal d'encapsidation rétroviral améliore le titre des particules d'environ un log. Ces particules sont utilisées efficacement pour transduire les cellules exprimant le récepteur aux virus amphotropes (Pit 2), correspondant à l'enveloppe retrovirale utilisée. Cette observation a une conséquence directe sur la biosécurité des particules retrovirales produites par le procédé de Li et Garoff (11). Dans ce cadre, il est démontré que les particules produites selon le procédé de Li et Garoff contiennent, à un titre proche de 106 part ml, des génomes de vecteurs SFV recombinants exprimant les séquences GAG/POL ou ENV des rétrovirus.
Le Demandeur a par ailleurs constaté que le mode de transfection généralement utilisé pour les AR recombinants des vecteurs Semliki, à savoir l'électroporation, entraînait une souffrance cellulaire importante. Aussi, et pour permettre la transfection des cellules productices par des méthodes plus douces que l'électroporation, le vecteur dérivé d'alpha-virus a été modifié pour être exprimé à partir d'un promoteur eucaryote, par exemple un promoteur CMN positionné en 5' de la séquence du vecteur.
Enfin, le promoteur p26S du vecteur d'alpha-virus est avantageusement muté. Le vecteur SFV 26Sm2, et dans une moindre mesure le vecteur SFV 26Sml, n'exprime plus d'AR sub-génomique détectable, susceptible de diminuer l'encapsidation des ARΝ génomiques par compétition.
Ainsi, une particule selon l'invention con-espond à une particule virale constituée d'éléments structuraux non issus d'un alpha-virus et contenant un vecteur dérivé d'alpha- virus rendu défectif pour la réplication, par délétion ou remplacement par au moins un transgène, des gènes structuraux, les éléments structuraux de ladite particule n'étant pas codés par le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus.
Par ailleurs, l'invention concerne l'utilisation des particules virales selon l'invention pour infecter in vitro des cellules. Le Demandeur a montré que les particules ainsi produites pouvaient infecter une grande variété de cellules eucaryotes, aussi bien humaines que non humaines.
L'invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant les particules virales de l'invention. De même, elle se rapporte à l'utilisation des particules virales pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront bien des exemples suivants.
La figure 1 est une représentation schématique de la structure du vecteur dérivé du virus de la forêt de Semliki (SFV).
La figure 2 montre les mutations effectuées dans le promoteur p26S. Les mutations introduites dans les mutants p26Sml et p26Sm2 par rapport à la séquence sauvage (Wt) sont encadrées. L'acide aminé en gras indique un changement dans la séquence codante.
La figure 3 est le résultat d'un Northern-blot effectué à partir de cellules productrices, exprimant des vecteurs SFV modifiés ( pEGFPCl; 2:p26Sml; 3:p26Sm2; 4:SFV sans transgène), avec une sonde GFP de pEGFPCl. La figure 4 montre la capacité des cellules 293T et BHK 21 à exprimer les vecteurs dérivés du SFV (p26Sml et p26Sm2) et mobilisés par les pseudo-particules VSV-G.
La figure 5 est le résultat d'un northern blot effectué à partir des cellules infectées par le surnageant de cellules 293 T transfectées par le plasmide pMDG et des vecteurs
SFV modifiés (LpEGFPCl; 2:p26Sml; 3:p26Sm2), avec une sonde GFP de pEGFPCl.
EXEMPLE 1 : Production de particules virales à partir de lignées cellulaires exprimant l'enveloppe VSV-G METHODES
1/ Lignées et cultures cellulaires - 293T/17 : lignée primaire de reins embryonnaires humains (ATCC CRL- 11268), - Hela : lignée cellulaire humaine (ATCC CCL-2), - QM7 : lignée de muscle de caille (ATCC, CRL-1962), - LMH : lignée de foie de poulet (ATCC CRL-2117). Les quatre lignées cellulaires ci-dessus sont cultivées dans du DMEM (Invitrogen) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) (Biowest). - HepG2 : lignée d'hépatome humain cultivée dans du EM contenant 10 % de FCS (ATCC HB-8065), - BHK21 : lignée de rein de bébé hamster cultivée dans du GMEM contenant 5 % de FCS et 8 % de solution liquide de tryptose phosphate (ATCC CCL- 10), - CESC : Embryon de poulet obtenu et cultivé selon la référence 26, - Cellule High Five cultivée à 27 °C dans un milieu de cellules d'insectes de Grâce (Grace's insect médium) (cat n° B85502 Invitrogen) contenant 10 % de FCS, - Sp2/O : Lignée murine de lymphoplastoïdes cultivée dans du RPMI 1640 contenant 10 % de FCS (ATCC CRL1581). 21 Construction du vecteur SFV
La structure du vecteur SFV est représentée sur la figure 1.
a/ Vecteur 26Sml
Le promoteur interne 26S du SFV est muté par PCR à partir du vecteur pSFVl (Invitrogen), lequel est dénué de gènes de structure et utilisé comme matrice en présence de deux amorces, respectivement : - une amorce 26SmlF contenant le site de restriction Bgl U apparaissant en gras dans la séquence suivante : 5'-ATCCTCGAAGATCTAGGG-3', - une seconde amorce mutée 26SmlR contenant le site de restriction Cla l apparaissant en gras dans la séquence suivante : 5 -CAATATCGAT TACTAGCGAACTAATCTAGGA-3'.
Des mutations silencieuses sont ensuite introduites dans le promoteur p26S pour conduire au promoteur p26Sml comme représenté sur la figure 2. Le produit ainsi amplifié est ensuite clone dans un plasmide pIRES2-EGFP (Invitrogen) (figure 1). Une séquence retrovirale désignée RS, dérivée d'un virus MLV est alors insérée entre le promoteur muté 26S et la séquence IRES. Les fragments contenant la séquence 26S mutée, la séquence retrovirale de MLV et le gène EGFP sont ensuite excisés par Bgl II et Hpa I puis clones dans le vecteur pSFVl entre les sites de restriction Bgl JJ et Sma I. Le fragment de 10,5 kpb contenant le réplicon SFV modifié est enfin clone entre le promoteur IE CMV et le signal de polyadénylation SV40 pA dans un vecteur pJRES2-EGFP dans lequel la séquence IRES GFP a été délétée.
b/ Vecteur SFV26Sm2
Le promoteur interne est muté par PCR à partir du plasmide SFV1 utilisé comme matrice en présence de deux amorces respectivement, une première amorce 26SmlF et une seconde amorce 26Sm2R contenant un site de restriction apparaissant en gras dans la séquence suivante :
5'-ATATCGATTACTAGCGAACTAATCTACGACCCCCGTAAAGGTGT-3*.
L'amorce 26Sm2R conduit aux modifications du promoteur p26S comme illustré sur la figure 2. Le produit amplifié est ensuite digéré par Bgl JJ et Cla I et ligué dans le vecteur 26Sml également digéré par Bgl JJ et Cla I pour supprimer le fragment con-espondant.
31 Transfection de la lignée cellulaire 293T par les vecteurs SFV 26Sml ou 26Sm2 et le plasmide pMDG et collecte des particules virales Une transfection transitoire de cellules 293T au moyen d'un kit de transfection calcium / phosphate (Invitrogen) est effectuée. I s cellules 293T sont ensemencées à raison de 8.105 cellules par puits sur des plaques 6 puits et incubées à 37°C pendant une nuit, avant transfection. La transfection est effectuée en deux étapes. Le premier jour, les cellules 293T sont transfectées par 5 μg d'un plasmide pMDG contenant le gène codant pour l'enveloppe VSV-G, sous l'influence d'un promoteur JE CMV (6). Dans une seconde étape, le deuxième jour, les cellules sont transfectées par 5 μg des vecteurs SFV 26Sml ou 26Sm2. Le second milieu de transfection est laissé au contact des cellules entre 13 et 17 heures. Au jour No. 3, le milieu est retiré et remplacé par du milieu frais permettant la libération des particules infectantes. L^ milieu de culture contant les particules virales est collecté 5 à 6 heures plus tard. 41 Transfection de la lignée cellulaire BHK21 par les vecteurs SFV 26Sml ou 26Sm2 et les vecteurs SFV GAGPOL et SFV ENV et collecte des particules virales
Les cellules BHK 21 sont électroporées 5 106 /ml (soit 4 106 cellules), à un voltage .de 350 V, et une capacitance de 750 μF. Les ARN utilisés pour l'électroporation, correspondant aux différents vecteurs (26Sml ou m2, SFV GAGPOL et SFV ENV), sont transcrits en utilisant 1,5 μg d'ADN linéarisé à l'aide d'un kit Invitrogen Sp6 polymérase. Pour l'électroporation, 22 μl du produit de transcription sont électroporés. La récolte des particules recombinantes est effectuée 14 à 16 heures plus tard. Les surnageants sont filtrés et déposés sur les cellules cibles en présence de 2μg/mL de polybrène.
5/ Infection des lignées cellulaires par les particules virales
Le surnageant des lignées cellulaires 293T transfectées est collecté puis filtré sur filtre 0,45 μm (HA Millex®, Millipore) puis incubé avec différentes lignées cellulaires, en présence d'un milieu frais contenant du polybrène, utilisé à raison de 5 μg par ml (Sigma). Le contrôle de l'expression de la GFP dans les cellules infectées est effectué au moyen d'un microscope 1X50 Olympus à fluorescence. La quantification de la transfection est effectuée au moyen d'un cytomètre de flux FACScalibur® de Becton Dickinson. Pour les tests contrôles, les surnageants sont utilisés dans différents réactifs : 10 μg par ml de RNAse A (Sigma), 1 μg par millilitre d'actinomycine D (Sigma), 100 unités par millilitre de DNAse I (Invitrogen), 1 mg par millilitre de généticine (Sigma), et 3 μg par millilitre de puromycine (Cayla). 67 Concentration des particules virales
Le surnageant des cellules 293 transfectées est centrifugé à 150000 g dans un rotor SW41 pendant une heure à 4°C. Les virus concentrés sont remis en suspension dans 300 μl de PBS et 25 μl de la solution sont utilisés pour infecter 5.105 cellules (293T, BHK-21, Hela, HepG2, Sp2/O, LMH, QM7).
7/ Northern Blot
L'ARN des 106 cellules transfectées ou infectées est extrait au moyen d'un système d'isolation d'ARN total (Promega®). L'ARN de cellules 293T non transfectées est extrait en tant que contrôle. 2 μg de chaque ARN est soumis à une électrophorèse sur un gel dénaturant, formaldéhyde, et l'ARN est transféré sur une membrane nylon chargée positivement (Hybond-XL ; Amersham). L'hybridation du Northern Blot est effectuée selon les procédures standard. Les sondes correspondent à un fragment de 790 bp Age I-BamH I GFP du plasmide pEGFPCl (Clontech), le fragment étant marqué (Rediprime® JJ DNA labelling System ; Amersham) et purifié sur colonne (ProbeQuant® G-50 Micro Columns ; Amersham) avant utilisation.
IV RESULTATS 1/ Fonctionnalité des vecteurs
Les vecteurs SFV 26Sml et 26Sm2 coπespondent à des vecteurs SFV, dont le promoteur 26S a été muté dans le but d'éviter une éventuelle compétition entre l'empaquetage de l'ARN genomique du SFV et l'ARN sub-génomique produit par transcription sous l'influence du promoteur 26S. La fonctionnalité des deux vecteurs a été contrôlée par transfection de cellules 293T. L'expression intense de la GFP observée suggère que la transcription et la traduction du vecteur SFV modifié sont correctes. Ce premier résultat est ensuite confirmé par analyse sur Northern Blot à partir de l'ARN extrait des cellules 293 transfectées par le vecteur SFV 26Sml.
Comme le montre la figure 3, ligne 2, la sonde GFP révèle l'existence de deux bandes correspondant à de l'ARN genomique et de l'ARN sub-génomique, ce dernier suggérant que le promoteur 26S est encore fonctionnel. Le même test est réalisé sur le second vecteur SFV 26Sm2 comportant des mutations supplémentaires. La détection de la GFP et l'analyse par Northern Blot confirment que les mutations apportées dans le promoteur 26Sm2 inhibent la production par transcription, de l'ARN sub-génomique (voir figure 3, ligne 3).
2/ Production de particules virales Des cellules 293T sont co-transfectées par le plasmide pMDG, puis le vecteur SFV 26Sml ou SFV 26Sm2 comme indiqué précédemment. Le surnageant des cellules transfectées est transféré sur des cellules fraîches 293T ou des cellules BHK 21. La forte et rapide expression de la GFP obtenue montre qu'il est possible de mobiliser des vecteurs SFV au moyen de cellules exprimant l'enveloppe VSV-G (figure 4).
3/ Capacité des particules virales obtenues à infecter les lignées cellulaires BHK21. 293T et OM7 Les résultats sont reportés dans le tableau ci-après. Les titres viraux sont détectés 24 heures après infection par analyse FACS. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP, rapporté au nombre de cellules au jour de l'infection, permet de calculer un titre de particules recombinantes (IP/ml).
Tableau 1
Comme le montre ce tableau, le titre le plus élevé est obtenu avec les cellules BHK21 comparées aux cellules 293T et QM7. 41 L'expression de la GFP contenant les cellules cibles est due à une véritable transduction par les particules virales SFV Pour s'assurer que l'expression de la GFP est due à l'expression des vecteurs SFV et non à la mobilisation de plasmides issus de la transfection initiale ou d'une pseudo- transduction de GFP libre, les contrôles suivants sont effectués.
Tout d'abord, l'ARN de SFV est détecté par Northern Blot à partir d'ARN extrait des cellules infectées (voir figure 5). Comme pour les cellules productrices, on observe dans les cellules infectées par le vecteur SFV 26Sml, à la fois de l'ARN genomique et de l'ARN sub-génomique. Au contraire, dans les cellules infectées avec le vecteur SFV 26Sm2, seul l'ARN genomique est détecté. L'intensité du signal suggère une réplication intense des vecteurs SFV. Cependant, pour s'assurer que la forte expression de la GFP dans les cellules cibles correspond bien à la mobilisation de l'ARN de SFV, et donc que les plasmides ont bien été transférés dans les cellules cibles, en l'espèce les cellules 293T, de la DNase I à haute concentration (1000 UJ/mi) est ajoutée au surnageant de transduction. Les titres en particules virales SFV sont similaires aux titres obtenus en l'absence de DNase I, ce qui suggère une transduction plus qu'une seconde transfection. Toutefois, un tel résultat pourrait être obtenu dans l'hypothèse où le plasmide serait encapsulé dans les cellules transfectées après son entrée et délivrées ensuite dans la cellule transduite. Pour contrôler ce phénomène éventuel, les cellules cibles sont pré-traitées avec de l'actinomycine D à raison d'un microgram e par millilitre, puis incubées avec le surnageant infectieux. L'actinomycine D inhibe l'expression des gènes contrôlée par la RNA POL JJ, comme le génome du vecteur SFV dans le plasmide pSFV26Sml ou m2, mais n'a aucune action sur la replicase des SFV. Une expression similaire de la GFP est observée en présence ou en l'absence d'actinomycine D, ce qui confirme que c'est bien un ARN qui est transféré (voir tableau 2).
On vérifie ensuite si l'expression de la GFP est bien due à l'expression des vecteurs SFV ou à une pseudo-transduction dans les cellules cibles. En effet, certaines publications (7) ont montré que la GFP pouvait être transférée passivement par l'intermédiaire de particules retrovirales indépendamment de toute expression. Pour s'assurer du contraire, les cellules cibles sont pré-traitées par deux inhibiteurs de traduction, respectivement la généticine et la puromycine. Après traitement, les cellules cibles montrent une expression de la GFP à peine détectable ce qui montre que la GFP observée résulte d'une traduction et non d'un transfert passif (tableau 2). En outre, la co-transfection d'un plasmide pEGFPCl exprimant fortement la GFP avec un plasmide codant pour la VSV-G ne conduit à aucune pseudo-transduction de la GFP. De la même manière, les surnageants provenant des cellules transfectées avec des vecteurs SFV seuls n'induisent pas l'expression de la GFP, ce qui prouve que la VSV-G doit être présente pour promouvoir la formation des pseudoparticules. Pour confirmer que l'ARN de SFV est protégé dans les vésicules VSV-G, les sumageants sont traités avec de la RNase A, avant transduction. Il apparaît que le traitement par la RNase A n'a pas d'effet sur les titres infectieux confirmant que l'ARN de SFV est véritablement protégé (tableau 2). Au vu de l'ensemble de ces résultats, on déduit que l'expression de la GFP dans les cellules cibles est due à une véritable transduction par les particules virales SFV.
Tableau 2
EXEMPLE 2 :
V METHODES
Il Constructions : Les constructions décrites dans l'exemple 1 ont été utilisées. Deux autres constructions dérivées, présentant une substitution du promoteur CMV par le promoteur procaryote SP6, ont également été utilisées : - La première construction, spSFV26Sml, est directement dérivée de SFV26Sml. - La deuxième construction, spSFV26SmlΨ, est obtenue par digestion Bgl JJ- Sma I d'un plasmide pSFNl (Invitrogen®), au sein duquel est clone un fragment Bgl II- Hpa I du plasmide ρIRES2 GFP (Clontecb®), modifié par introduction d'un fragment PCR contenant l'extrémité 3' du gène nsp4 et généré en utilisant les amorces 26SmlF et 26SmlR (cf. exemple 1, section 2a).
Ces constructions sont transcrites in vitro puis les ARΝ sont introduits par electroporation dans les cellules productrices. La transcription in vitro est réalisée après linéarisation des plasmides par coupure BstB I. La transcription est réalisée en présence d'analogue de coiffe (Invitrogen®), de polymérase SP6 (Invitrogen®) et de ribonucléotides (Promega®). 2/ Cellules :
Les cellules productrices de rétrovirus recombinants, dérivées de cellules 293, phoenix® (http://www.stanford.edu/group/nolan/retiOviral systems/phx.html), sont cultivées en milieu DMEM (GJJ3CO) en présence de sérum de veau fœtal décomplémenté (Abcys). Les cellules productrices sont transfectées à l'aide des plasmides SFV26Sml ou
26Sm2, à raison de 4 μg d'ADN pour 5.105 cellules, dans un puit de plaque six puits.
La transfection est réalisée en utilisant le phosphate de calcium (Calcium Phosphate transfection kit, Invitrogen®).
Pour les deux constructions exprimant les vecteurs SFV sous forme d'ARN, la transfection est réalisée par electroporation: 40 μl de replicons produits in vitro sont mis en présence de 40.105 cellules et électroporés en utilisant le système EasyjecT
Plus (Equibio®).
20 heures après la transfection, quelle que soit la méthode de transfection utilisée, le milieu est changé. 16 heures après ce changement, le milieu est récolté pour réaliser les infections. Lors de la récolte, le milieu est filtré à l'aide de filtres 0,45 μm
(Millipore®). 3/ Infections:
Les surnageants filtrés sont utilisés pour infecter des cellules 293T, mises en culture dans des plaques 12 puits. L'infection est réalisée en présence d'un polycation nécessaire aux interactions virus/cellules, le polybrène (Sigma®) à 5 μg/ml. Le jour de l'infection, un puit de cellules cibles 293T est trypsinisé pour comptage. 24 heures après l'infection, les cellules sont tryp sinisées pour un passage en cytométrie de flux (FACScalibur, Becton-Dickinson®). Le pourcentage de cellules exprimant la GFP, rapporté au nombre de cellules au jour de l'infection, permet de calculer un titre de particules recombinantes (JP/ml) (Tableau 3).
4/ Contrôles:
Des contrôles, identiques à ceux réalisés dans l'exemple 1, ont été réalisés: - 10 μg par ml de RNAse A (Sigma®), 1 μg par millilitre d'actinomycine D (Sigma®), - 100 unités par millilitre de DNAse I (Invitrogen®), 1 mg par millilitre de généticine (Sigma®).
117 RÉSULTATS 1/ Infections :
Les résultats des infections sont rapportés dans le Tableau 3. IP/ml: particules infectieuses par ml; NR: non réalisé.
Tableau 3
La présence de cellules exprimant la GFP confirme la possibilité de mobiliser les ARN recombinants SFV par le truchement d'une particule retrovirale. Cependant, les faibles titres observés indiquent qu'il est nécessaire de contrôler la cytotoxicité du vecteur SFV pour obtenir des titres plus importants. En effet, il existe un antagonisme entre la production des ARN du SFV et la production des protéines retrovirales. Ces dernières voient leur production diminuer lorsque la production des protéines du SFV augmente. Plusieurs mutants des SFV ont, à ce jour, été décrits et pourront être utilisés avec profit (8).
La présence ou l'absence de la séquence d'encapsidation des rétrovirus ne semble pas avoir d'influence importante sur l'efficacité de l'encapsidation. Ici, l'importante concentration intracellulaire en ARN semble avoir un rôle déterminant pour promouvoir l'encapsidation, en accord avec les observations de Muriaux et al. (9). L'influence de la séquence retrovirale psi devra être réévaluée dans le contexte de vecteurs à toxicité réduite. Par ailleurs, ces résultats semblent indiquer qu'il existe probablement une contamination des productions de rétrovirus recombinants lorsque l'on utilise un système "helper" basé sur les vecteurs SFV (10, 11). Ces contaminants sont formés de particules retrovirales contenant soit les vecteurs SFV servant à exprimer les séquences de transcomplémentation des rétrovirus, soit les vecteurs SFV comprenant la séquence du rétrovirus recombinant. Cette observation remet en cause l'utilisation de ces modes de production des vecteurs rétroviraux à des fins cliniques, contrairement aux particules virales de l'invention.
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10. Walilfors JJ, Xanthopoulos KG, Morgan RA. Semliki Forest virus-mediated production of rétroviral vector RNA in rétro viral packaging cells. Hum Gène Ther 8, 2031-41. (1997)
11. Li ICJ, Garoff H. Packaging of intron-containing gènes into rétrovirus vectors by alphavirus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A 95,3650-4. (1998).

Claims

REVENDICATIONS
1/ Particule virale constituée d'éléments structuraux non issus d'un alpha-virus et contenant un vecteur dérivé d'alpha-virus rendu défectif pour la réplication, par délétion ou remplacement par au moins un transgène, des gènes structuraux caractérisée en ce que les éléments structuraux de ladite particule ne sont pas codés par le génome du vecteur dérivé d'alpha- virus.
2/ Particule virale selon la revendication 1, caractérisée en ce que les éléments structuraux correspondent à la protéine d'enveloppe VSV-G seule.
3/ Particule virale selon la revendication 1, caractérisée en ce que les éléments structuraux correspondent aux protéines structurales d'un rétrovirus.
4/ Particule selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'alpha-virus est un virus de la forêt de SEMLJKI.
5/ Particule selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus contient la séquence de packaging étendue des vecteurs MLV.
6/ Particule selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha- virus est dénué de séquence psi.
Il Particule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha- virus comporte un promoteur eucaryote positionné en 5'.
8/ Particule selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le vecteur dérivé d'alpha- virus contient un promoteur p26S muté. 9/ Utilisation de la particule virale objet de l'une des revendications 1 à 8 pour infecter une cellule eucaryote in vitro.
10/ Composition pharmaceutique comprenant la particule virale objet de l'une des revendications 1 à 8.
11/ Utilisation de la particule virale objet de l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
12/ Procédé d'obtention de particules virales, constituées d'éléments structuraux non issus d'un alpha- virus et contenant un vecteur dérivé d'alpha- irus rendu défectif pour la réplication, par délétion ou remplacement par au moins un transgène, des gènes structuraux consistant : à exprimer en trans, dans une lignée cellulaire, les gènes codant les éléments structuraux non issus de l'alpha-virus et le vecteur dérivé d'alpha- virus, à récupérer les particules virales présentes dans le surnageant de la culture cellulaire.
13/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les éléments structuraux correspondent à la protéine d'enveloppe VSV-G.
14/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'expression en trans est obtenue par co-transfection d'une lignée cellulaire par le vecteur d'expression de l'enveloppe VSV-G et le vecteur dérivé d'alpha-virus, la co-transfection étant effectuée en deux étapes distinctes respectivement, la transfection de la lignée par le vecteur exprimant le gène de l'enveloppe VSV-G, puis une seconde transfection par le vecteur dérivé d'alpha- virus.
15/ Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la lignée cellulaire transfectée est une lignée de cellules 293T. 16/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les éléments structuraux correspondent aux protéines structurales d'un rétrovirus.
17/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'expression en trans est obtenue par transfection d'une lignée cellulaire d'encapsidation, productrice de rétrovirus défectifs pour la réplication, par le vecteur dérivé d'alpha- virus.
18/ Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la lignée cellulaire d'encapsidation est obtenue par transfection stable d'une lignée cellulaύ-e par un premier élément viral exprimant les gènes GAG et POL de rétrovirus et d'un second élément viral exprimant le gène ENV de rétrovirus.
19/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'expression en trans est obtenue par triple transfection d'une lignée cellulaire 293 T, par introduction d'un premier élément viral exprimant les gènes GAG et POL de rétrovirus, d'un second élément viral exprimant le gène ENV" de rétrovirus et du vecteur dérivé d'alpha- virus.
20/ Procédé selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisé en ce que l'alpha-virus est un virus de la forêt de SEMLIKI.
21/ Procédé selon l'une des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus contient la séquence de packaging étendue des vecteurs MLV.
22/ Procédé selon l'une des revendications 12 à 21, caractérisé en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus est dénué de séquence psi.
23/ Procédé selon l'une des revendications 12 à 22, caractérisé en ce que le génome du vecteur dérivé d'alpha-virus comporte un promoteur eucaryote positionné en 5'.
24/ Procédé selon l'une des revendications 12 à 23, caractérisé en ce que le vecteur dérivé d'alpha- virus contient un promoteur p26S muté.
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