FR2838132A1 - Vecteurs viraux comprenant une sequence nucleique derivee de virus leucemogenes murins pour le transfert de genes dans les cellules - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique issue d'un épissage alternatif dans la région gagpol d'un MLV (Virus Leucémogènes Murins) et codant une protéine SD' capable d'augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux. L'invention concerne aussi des vecteurs dérivés de virus, plus particulièrement de rétrovirus, pour la production de lignée d'encapsidation et les particules virales produites par ces lignées d'encapsidation.
Description
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VECTEURS VIRAUX COMPRENANT UNE SÉQUENCE NUCLÉIQUE DÉRIVÉE DE VIRUS LEUCEMOGENES MURINS POUR LE TRANFERT DE GÈNES DANS LES CELLULES.
La présente invention concerne des vecteurs pour le transfert de gène dans des cellules. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à des acides nucléiques contenant une séquence d'acide nucléique issue d'un épissage alternatif dans la région gagpol d'un MLV (Virus Leucémogènes Murins) et codant une protéine capable d'augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux utiles en thérapie génique.
Les vecteurs dérivés des MLV sont utilisés pour introduire de nouveaux gènes, ou transgènes, dans des cellules cibles sur la base des propriétés d'infection et d'intégration des rétrovirus. Les vecteurs rétroviraux présentent plusieurs avantages : facilité d'utilisation en biologie moléculaire, grande collection de variants permettant des expressions régulées, tolérance pour la taille du transgène (>8Kb), stabilité de l'expression du transgène due à l'insertion du vecteur dans l'ADN génomique des cellules cibles, faible pouvoir immunogène. Mais ils présentent un risque de recombinaison avec des séquences endogènes qui déboucherait sur la formation de virus disséminants, appelés RCR pour replication-competent retroviruses, et peuvent induire des phénomènes mutagènes potentiels sur les gènes cellulaires suite à leur intégration. En général, la limitation principale de leur utilisation réside dans l'efficacité de transfert et d'expression du transgène insuffisante pour corriger le défaut in vivo.
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Les Virus Leucémogènes Murins (MLV) sont des rétrovirus infectieux qui ont contribué à une meilleure compréhension des pathologies virales chez les eucaryotes, et des essais thérapeutiques ont été entrepris à partir de stratégies de transfert de gènes utilisant les MLV.
Les oncovirus MLV appartiennent à la famille des rétrovirus simples caractérisées par une organisation génomique élémentaire comprenant les gènes gag, pol et env, l'expression de ce dernier étant dépendante de son épissage. Ces oncorovirus possèdent un génome ARN qui va être copié en ADN dès son entrée dans la cellule hôte puis s'intégrer dans le génome de celle-ci. Le gène gag dirige la synthèse de protéines virales internes qui forment la matrice (MA), la capside (CA), et les structures de la nucléocapside (NC). Le gène pol code pour les enzymes protéase (PR), reverse transcriptase (RT), et intégrase (IN). Le gène en v contient l'information pour les composants de surface (SU) et transmembranaires (TM) des protéines de l'enveloppe virale (Leis, J. et al, 1988, Standardized and simplified nomenclature for proteins common to all retroviruses. J.
Virol., 62, 1808-1809). Après l'exportation nucléaire, le transcrit viral primaire a deux rôles essentiels : comme matrice ARNm pour la synthèse des protéines et comme ARN génomique pour l'encapsidation dans de nouveaux virions.
Les systèmes de régulation post-transcriptionnels recrutent des partenaires viraux et cellulaires.
Toutefois, les rétrovirus de type simple ne comportent pas toutes les protéines virales auxiliaires trouvées dans les rétrovirus complexes (HIV, HTLV), qui dérivent de messagers issus d'épissage alternatif unique ou multiple et qui régulent et coordonnent l'expression génique virale.
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En fait, l'ARN génomique viral cumule au moins trois fonctions qui impliquent des voies métaboliques différentes et potentiellement exclusives.
Après transcription, une partie des ARN viraux va être prise en charge par la machinerie d'épissage et va donner l'ARNm env alors qu'une autre partie des ARN génomiques va directement sortir du noyau sans subir d'épissage. Dans le cytoplasme, les ARN non épissés vont avoir à nouveau deux devenirs : soit être pris en charge par la machinerie de traduction et conduire à la synthèse des protéines Gag et Pol, soit être dirigés à la membrane plasmique et être encapsidés dans les nouvelles particules virales.
Or, les Inventeurs ont récemment montré un événement d'épissage alternatif dans le MLV, qui génère un ARN subgénomique de 4,4 Kb (Déjardin, J. et al, 2000, A novel subgenomic Murine Leukemia Virus RNA transcript results from Alernative splicing, J. Virol., vol. 74, No.
8, 3709-3714). Cet ARN dérive d'un épissage mettant en jeu un site d'épissage alternatif donneur, à l'intérieur de la séquence du gène gag codant pour la capside, qui a été désigné SD' et le site accepteur canonique de l'enveloppe. La conservation du site SD' chez tous les rétrovirus simples de mammifères suggère fortement que la séquence SD' et/ou l'ARN résultant de l'épissage a un rôle dans la réplication virale. En effet, une réduction du pouvoir infectieux de deux virus MLV prototypes (Friend et Moloney-MLV) a été observée après une mutagenèse dirigée du site destinée à entraîner une inactivation du site SD' sans changer la séquence en acides aminés du gène gag (Déjardin et al, 2000). De plus, de telles mutations étendent les propriétés leucémogènes du virus Moloney-MLV in vivo. Alors que le virus Moloney-MLV sauvage induit exclusivement le
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développement de lymphomes T lorsqu'il est inoculé à des souriceaux nouveau-nés, le virus mutant SD' peut induire le développement rapide d'un large spectre de types cellulaires leucémiques comme des lignées thymiques, érythroïdes et myélomonocytaires (Audit, M. et al, 1999, Introduction of a cis-acting mutation in the capsidcoding gene of Moloney Murine Leukemia Virus extends its leukemogenic Properties. J. Virol., vol. 73, No. 12, 10472-10479).
Les travaux antérieurs des Inventeurs portant sur la mutagenèse dirigée du site SD' chez un virus MLV capable de réplication, pour inactiver ce site sans changer la séquence en acides aminés de gag, a montré une réduction dans le pouvoir infectieux du mutant MLV (Déjardin et al, 2000). Bien que ces résultats évoquent un rôle de SD' dans la capacité de réplication, de multiples interprétations existent à cause des multiples effets observés. Plus particulièrement, l'inactivation par mutation du site SD' réduit la formation non seulement du nouvel ARN SD' subgénomique mais aussi de l'ARNm du gène env. En outre, cette mutation active la production d'un autre ARN subgénomique, désigné SD'' utilisant un site d'épissage cryptique en amont (SD'').
Ainsi, la mise en évidence d'un épissage alternatif chez les MLV offrait plusieurs interprétations notamment en raison de la multitude des sites sousoptimaux d'épissage chez ces ARN probablement détectables par RT-PCR ciblée, comme par exemple avec le site SD").
Cet ARN SD' pouvait être le produit d'un intermédiaire d'épissage ou pire d'une erreur d'épissage. Dans tous les cas, l'inactivation du site SD' entraînait un déséquilibre de la production de l'ARN épissé canonique codant pour l'enveloppe virale (Déjardin et al, 2000, J.
Virol, 74,3709-3714).
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Les travaux réalisés dans le cadre de la présente ont visé à déterminer la fonction de l'ARN SD' pendant les phases précoces et tardives du cycle de réplication d'un virus. Pour démontrer le rôle de ce transcrit subgénomique de 4,4 Kb dans le pouvoir infectieux, l'expression d'un ARN pré-épissé a été testé pour son pouvoir de complémenter en trans un virus SD' mutant de manière à rendre à ce mutant un titre infectieux normal. Il a ainsi maintenant été mis en évidence que l'ARN SD' ayant subi un épissage alternatif est incorporé dans les particules MLV, ce qui signifie que l'ARN génomique non épissé n'est pas l'unique composant ARN contenu dans le virion.
En outre, les résultats obtenus dans le cadre de la présente invention indiquent que l'ARN SD' pourrait agir comme un rétrovirus défectif puisqu'il a subi une transcription inverse et que son ADN copie a été intégrée dans le génome de l'hôte.
Enfin, l'étude de la capacité de codage de l'ARN SD' a révélé qu'il codait pour une polyprotéine Gag-intégrase susceptible d'agir comme une protéine régulatrice.
La mise en évidence de la protéine SD', sa localisation cellulaire (noyau/cytoplasme), sa présence dans les virions et la présence de signaux fonctionnels dans la séquence primaire de la protéine SD', offrent de nouvelles perspectives concernant la réplication des rétrovirus dits simples, comme MLV, qui jusqu'à la présente invention étaient caractérisés par l'absence de toute protéine régulatrice.
La présente invention a donc tout d'abord pour objet un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique issue d'un épissage alternatif dans la région gagpol d'un MLV (Virus Leucémogènes
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Murins) et codant une protéine capable d'augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux. Plus particulièrement, ladite séquence d'acide nucléique est issue d'un épissage alternatif qui recrute un site donneur d'épissage situé dans le domaine de la capside d'un MLV et le site accepteur qui est recruté pour la production d'ARNm d'enveloppe dudit MLV. Encore plus particulièrement, ladite séquence d'acide nucléique est issue d'un épissage alternatif de la séquence nucléotidique située entre le codon CUG ou le codon AUG du gène gag d'un MLV et le codon stop du gène pol du domaine de l'intégrase d'un MLV.
Les travaux de recherche effectués par les inventeurs sur l'ARN dérivant de cet épissage leur ont permis de cloner l'ADN correspondant à l'ARN SD' et de préparer la protéine SD' sans passer par l'épissage alternatif de l'ARN génomique viral.
En conséquence, l'invention se rapporte à un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine SD' d'un MLV.
L'analyse de la séquence de la protéine SD' a permis de mettre en évidence plusieurs caractéristiques importante de cette protéine : - La protéine SD' renferme les domaines entiers de la matrice (MA) et de la pl2. Bien que la fonction de la pl2 reste ambiguë, la matrice est connue pour contrôler le ciblage à la membrane plasmique.
Concernant la forme plus longue (60KDa) de la protéine SD', il apparaît que les 87 acides aminés (aa) supplémentaires dans le contexte du précurseur Gag (appelé Glycogag) confèrent au virus une meilleure dissémination ex vivo et in vivo.
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- Elle présente un signal de myristylation "MGQTVTT" situé entre les acides aminés aux positions 1 et 7 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV.
- Elle présente un signal RKRR situé entre les acides aminés aux positions 31 et 34 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV (figure 3) qui est un signal de localisation nucléaire (NLS) classique de type SV40.
- Le segment peptidique situé entre les acides aminés aux positions 102 et 148 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV une homologie avec les séquences de CTF/NFl qui sont une famille de protéines qui se fixent aux promoteurs viraux et cellulaires et qui interviennent dans l'activation de la transcription et de la réplication, donc de localisation nucléaire.
- Le segment peptidique situé entre les acides aminés aux positions 99 et 116 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV présente une homologie avec la synapsine qui se lie au cytosquelette.
- Le segment peptidique situé entre les acides aminés aux positions 395 et 404 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV présente une homologie avec l'ADN ligase ATP dépendante.
- Le segment peptidique situé entre les acides aminés aux positions 352 et 396 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV présente une homologie avec la famille des protéines nucléaires Ran de liaison au GTP qui sont impliquées dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARN (export) et des protéines (import).
L'invention a donc pour objet un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine SD' de MLV présentant au moins une des caractéristiques suivantes : - elle renferme les domaines entiers de la matrice (MA) et de la pl2 ;
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- elle présente un signal de myristylation "MGQTVTT" ; - elle présente un signal RKRR ; elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec les séquences de CTF/NFl ; elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec la synapsine qui se lie au cytosquelette ; elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec l'ADN ligase ATP dépendante ; - elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec la famille des protéines nucléaires Ran de liaison au GTP.
L'association de tous ces signaux en une même protéine confère un nouveau potentiel à cette protéine virale SD'. Plusieurs de ces signaux sont en faveur d'une localisation nucléaire de la protéine SD' ce qui confirme les observations expérimentales. Le motif 352-396, homologue aux protéines Ran-GTP suggère un rôle de la protéine SD' dans l'export de l'ARN viral. Cette séquence, située dans le domaine C-terminal de l'intégrase, est caractéristique des rétrovirus apparentés aux MLV (GaLV, FeLV) mais n'est pas retrouvée chez les rétrovirus de type HIV, HTLV, MPMV, et RSV. Chez ces derniers, les mécanismes d'export nucléaire de l'ARN viral non épissé ont été bien documentés, alors que chez les MLV, GaLV et FeLV le mécanisme d'export semble obéir à des règles différentes et pas encore comprises. En conséquence la protéine SD' constitue une nouvelle protéine régulatrice des MLV qui joue un rôle important dans le cycle de réplication des MLV ex vivo et in vivo.
L'analyse et la comparaison des protéines SD' des MLV, et plus particulièrement des protéines SD' de
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Moloney et Friend avec celles putatives de deux virus apparentés GaLV (gibbon ape leukemia virus) et FeLV (feline leukemia virus) a permis de mettre en évidence des régions particulièrement conservées qui permettent de mieux caractériser les protéines SD', leur fragment ou dérivés entrant dans le cadre de l'invention. Il s'agit des séquences comprises entre les acides aminés en positions 80-130,350-420 et 520-560 dans la SEQ ID NO.3 de Friend-MLV (figure 3).
L'ARN SD' a été traduit in vitro (lysats de réticulocytes de lapin) et ex vivo par expression de ce vecteur dans des cellules murines (NIH3T3) et humaines (293T). Dans tous les cas, l'ARN SD' code pour une protéine d'un poids moléculaire apparent de 50 KDa. Cette taille correspond à une traduction initiée à l'AUG de gag (position 621 chez Moloney et 619 chez Friend) c'est-àdire à partir du G en position 448 de la séquence SEQ ID NO.1 et qui se termine au codon stop de pol en position 2388 de la de la séquence SEQ ID NO.1. Ainsi, la protéine SD' comprend les 326 acides aminés amino-terminaux de Gag fusionnés aux 116 acides aminés carboxy-terminaux de Pol.
Afin de confirmer l'identité de la protéine SD', des anticorps anti-matrice et anti-intégrase qui doivent reconnaître respectivement la partie N-terminale et Cterminale de la nouvelle protéine ont été utilisés. Par analyse en western blot, la protéine de 50 KDa est révélée par l'anticorps anti-intégrase et l'anti-matrice confirmant ainsi l'identité de cette protéine. Sur les gels d'électrophorèse, une bande plus haute de 10 KDa et moins intense est également détectée qui correspond à une initiation de la traduction en amont, au codon d'initiation CUG de glycogag (position 357 chez Moloney et 355 chez Friend) . La détection de la forme à 60 KDa est plus aléatoire car beaucoup moins abondante.
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En outre, des expériences de fractionnement cellulaire ont été réalisées qui suggèrent la présence de la protéine SD' dans le noyau des cellules NIH3T3 transfectées.
Une protéine de fusion à la EGFP (enhance green fluorescent protein) a été clonée afin de visualiser la protéine SD' dans les cellules de mammifères (vecteur SD'/GFP) par microscopie. La protéine de fusion apparaît en microscopie sous l'aspect de petits points intenses et non sous forme diffuse comme la protéine GFP contrôle. Cet aspect est généralement associé à une localisation vésiculaire. Sa localisation est majoritairement cytoplasmique avec une légère accumulation à la périphérie nucléaire et à la membrane plasmique. Dans les cellules exprimant le plus fortement la protéine, quelques signaux sont également détectables dans le noyau.
La taille de la protéine SD' a été vérifiée par électrophorèse suivie d'une analyse par Western Blot avec un anti-GFP (SD' 50 KDa + GFP 27 KDa = 77 KDa) et la présence de la forme plus longue a été confirmée en la retrouvant après transfection de cellules murines (NIH3T3) et humaines (293T).
Enfin la présence de cette protéine de fusion a été détectée dans les particules virales, montrant que la protéine SD', tout comme son ARNm SD', font partie intégrante du virus.
L'invention se rapporte donc à un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine SD' de Friend-MLV dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.2 (figure 2) un fragment ou un dérivé de celle-ci.
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Un tel acide nucléique comprend la séquence d'acide nucléique qui est comprise entre les nucléotides situés aux positions 802 et 2388 de la de la séquence SEQ ID NO.1, un fragment ou un dérivé de celle-ci.
L'invention concerne aussi un acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique codant pour un fragment ou dérivé de la protéine SD' de FriendMLV.
En effet, la forte homologie des séquences MLV correspondant à la région dont est issue l'ARN SD' permet de sélectionner des fragments ou des dérivés de la protéine SD' de Friend-MLV qui ont la capacité d'augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux exprimant ladite protéine, un fragment ou un dérivé de celle-ci.
A titre d'exemple d'un tel fragment, l'invention envisage tout particulièrement la protéine de 50 KDa dont la séquence en acide aminé est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.3 (figure 3), un fragment ou un dérivé de celle-ci.
Un tel acide nucléique comprend la séquence d'acide nucléique qui est comprise entre les nucléotides situés aux positions 1066 et 2388 de la séquence SEQ ID NO.1, un fragment ou un dérivé de celle-ci.
Des dérivés de la protéine SD' , notamment de Friend-MLV sont ceux dont la séquence en acides aminés comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou supression et/ou addition ne modifie pas la capacité de la protéine à augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux exprimant ladite protéine. Un tel dérivé est plus particulièrement une protéine SD' d'un autre virus MLV que Friend-MLV, comme Moloney-MLV.
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De tels dérivés peuvent être analysés par l'homme du métier selon les techniques décrites dans les exemples donnés ci-après qui permettent de préparer des vecteurs exprimant une protéine SD', un fragment ou un dérivé de celle-ci, et de mettre en évidence leur capacité d'infection.
L'invention concerne aussi bien entendu une protéine SD' telle que définie précédemment et les compositions la contenant.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre une protéine SD' peuvent être préparés par les méthodes classiques décrites dans la littérature. Ces anticorps sont utiles pour rechercher la présence de protéines SD', mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine thérapeutique pour inhiber ou activer in vivo, grâce à leur spécificité, une protéine SD'.
Les vecteurs dérivés des MLV sont utilisés pour introduire des gènes dans des cellules cibles sur la base des propriétés d'infection et d'intégration des rétrovirus. La difficulté dans l'élaboration de ces vecteurs réside dans la recherche à la fois d'un vecteur qui porte le strict minimum de séquences virales afin d'éviter tout risque de recombinaison, et d'un vecteur qui peut facilement être produit à hauts titres. Or le métabolisme des ARN rétroviraux de MLV est soumis à de nombreuses régulations qui influencent directement le pouvoir infectieux de ces virus. Les bases moléculaires des mécanismes mis en jeu sont très mal connues. La présence de la protéine SD' dans les cellules infectées et dans les particules virales apporte un nouvel éclairage sur la réplication de ces rétrovirus MLV. La mise en évidence de la protéine SD' permet d'une part
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d'améliorer l'efficacité des vecteurs utilisés pour les stratégies de transfert de gène et d'autre part d'appréhender les phénomènes leucémogènes induits par ces virus.
Les vecteurs habituellement décrits ne portent pas les séquences codant la nouvelle protéine SD'. Cette protéine, jouant un rôle dans la réplication virale, elle constitue un nouveau moyen d'améliorer les titres obtenus avec les vecteurs dérivés des MLV et ceci quelle que soit l'étape du cycle viral où elle intervient (précoce ou tardive).
L'invention a donc aussi pour un acide nucléique isolé constituant un vecteur pour transférer un gène dans une cellule hôte. Plus particulièrement, l'invention concerne un vecteur ou un ensemble de vecteurs pour la préparation de lignée d'encapsidation permettant la synthèse de particules virales et de virus portant un gène d'intérêt. La séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' est apportée soit en cis directement dans le vecteur portant le gène d'intérêt, soit en trans lors de l'élaboration stable ou transitoire de la lignée d'encapsidation.
Un vecteur selon l'invention pour la préparation de lignées d'encapsidation comprend une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' d'un MLV, défini précédemment, avec son codon d'initiation, une séquence d'encapsidation Psi en 5', et un signal d'arrêt de la transcription en 3' de ladite séquence codant une protéine SD'. Le vecteur comprend en 5' de la séquence Psi un promoteur comme un promoteur CMV.
Le signal d'arrêt de la transcription est un site de polyadénylation comme une longue répétition terminale (LTR) de type U3RU5. Le vecteur peut aussi contenir des séquences d'intégration att ( attachment
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site ou IR pour inverted repeat ) dans des LTR en 5' et 3' de la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD'.
Un vecteur ci-dessus est utilisé pour la préparation de lignées d'encapsidation stables ou transitoires produisant des particules virales exprimant un gène d'intérêt.
Dans une première forme de mise en #uvre, la séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' est apportée par un vecteur ci-dessus en trans.
Dans le cas de la préparation d'une lignée d'encapsidation stable, une lignée d'encapsidation exprimant les protéines gag, pol et env est transfectée par le vecteur comprenant la séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' ci-dessus et un vecteur viral délété des séquences codant les protéines gag, pol et env, et portant le gène d'intérêt, une séquence Psi et de part et d'autre de ceux-ci une LTR.
Dans le cas de la préparation d'une lignée d'encapsidation transitoire, une lignée d'encapsidation est transfectée par les vecteurs suivants : - le vecteur ci-dessus comprenant la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD', - un vecteur ci-dessus portant le gène d'intérêt, - un vecteur exprimant les protéines gag et pol, et - un vecteur exprimant la protéine env.
Dans une seconde forme de mise en #uvre, la séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' est apportée par un vecteur selon l'invention ci-dessus en cis. Il s'agit alors d'un vecteur bicistronique comprenant à la fois la séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' et le gène d'intérêt. Un tel vecteur est
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un vecteur viral tronqué comprenant dans le sens 5' vers 3' une LTR, une séquence d'encapsidation Psi, le gène d'intérêt avec son codon d'initiation, une séquence IRES, la séquence d'acide nucléique codant la protéine SD' avec son codon d'initiation et une LTR. Comme précédemment, ce vecteur bicistronique peut être utilisée pour transfecter une lignée d'encapsidation stable ou transitoire.
Dans le cas de la préparation d'une lignée d'encapsidation stable, une lignée d'encapsidation exprimant les protéines gag, pol et env est transfectée par le vecteur cistronique ci-dessus.
Dans le cas de la préparation d'une lignée d'encapsidation transitoire, une lignée d'encapsidation est transfectée par les vecteurs suivants : - le vecteur bicistronique ci-dessus, - un vecteur exprimant les protéines gag et pol, et - un vecteur exprimant la protéine env.
Ces vecteurs sont donc préferentiellement dérivés de virus, tout préférentiellement dérivés de MLV ou de lentivirus.
L'invention concerne aussi les procédés de préparation des lignées d'encapsidation stables ou transitoires mettant en #uvre les vecteurs ci-dessus ainsi que les lignées obtenues. L'invention concerne encore les particules virales et les virus issus de ces lignées d'encapsidation comprenant une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD', ainsi que les cellules hôtes contenant ces particules virales ou virus.
Ces particules virales, virus et cellules comprenant une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' et un gène d'intérêt constituent des principes actifs de compositions pharmaceutiques pour la thérapie génique somatique.
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D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant la mise en évidence de la protéine régulatrice SD' chez les MLV et de la préparation de nouveaux vecteurs rétroviraux. Il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - La figure 1 représente la séquence du gène SD' de Friend MLV. Sous la forme provirale avec les deux LTR (U3RU5) avec U3 en petit caractère italique, R en souligné, et les 2 codons d'initiation de la traduction en gras et souligné. La séquence de l'ARN démarre à R en 5' et fini à R en 3'.
- La figure 2 représente la séquence en acides aminés de la protéine SD' de 60 KDa de Friend MLV.
- La figure 3 représente la séquence de la protéine SD'initiée au codon CUG (50 KDa) de Friend MLV.
- La figure 4 est une représentation schématique de l'ARNm de la protéine SD' , qui est issu d'un nouvel épissage alternatif mettant en jeu un site donneur alternatif d'épissage, désigné SD' et le site accepteur canonique SA . Ce site SA est recruté lors de l'épissage canonique qui génère l'ARNm env. LTR : long terminal repeat contenant U3, R,U5. Psi : signald'enapsidation. MA : matrice, CA : capside, IN : intégrase, SU : unité de surface de l'enveloppe, TM : partie transmembranaire de l'enveloppe.
- La figure 5 représente les résultats des expériences de trans-complémentation. Dans cette figure 5, wt indique les titres infectieux obtenus avec les virus reconstitués à l'aide des trois vecteurs exprimant séparément Gag/Pol, Env et les ARN viraux sauvages. Dans cette figure 5, mutant indique les titres infectieux mesurés avec les virus reconstitués à l'aide des deux
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vecteurs exprimant Gag/Pol et Env et un troisième vecteur portant des mutations au site SD' inactivant l'épissage alternatif à ce site. Dans cette figure 5, wt + SD' et mutant + SD' indique les résultats obtenus avec des virus obtenus par l'addition d'un quatrième vecteur exprimant l'ARN SD' sauvage.
- La figure 6 représente la détection par RT- PCR de l'ARN SD' dans les particules virales produites par des cellules NIH3T3 infectées par Friend et Moloney- MLV. FL: ARN génomique non épissé. SD : ARNm env.
- La figure 7 représente la recherche par PCR d'une copie ADN résultant de la transcription inverse de l'ARN SD' dans les extraits d'ADN cellulaire de cellules infectées avec Friend ou Moloney-MLV ou non infectées (mock). Les infections ont été réalisées pendant 4 heures ou plusieurs semaines (infections chroniques). L'ADN proviral est détecté par PCR à l'aide d'amorces spécifiques de chaque type d'ADN proviral recherché. FL: ADN proviral entier provenant de la reverse transcription de l'ARN génomique viral non épissé. SD': ADN correspondant à la copie de l'ARN SD'. SD : couple d'amorces spécifiques pour la recherche d'un ADN copie de l'ARNm env. Vector : contrôle réalisée sur une préparation d'ADN plasmidique correspondant au clone moléculaire cDNA SD'.
La figure 8 représente le gel d'électrophorèse des produits de la traduction in vitro.
Le clone moléculaire de Friend-MLV, p57 (2LTR), l'ARN génomique (FL) et le clone moléculaire p57cDNASD'portant l'ARN SD' (SD') ont été linéarisés soit par PvuII soit par XhoI et incubés dans un essai de transcription/traduction en présence de méthionine (35S).
Le contrôle négatif a été réalisé avec des lysats de réticulocytes sans addition d'ADN. Le clone du virus
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entier linéarisé par XhoI, donne deux bandes : A et B correspondant respectivement à GlycoGag et à Gag. La linéarisation XhoI du clone SD' conduit aux protéines SD' de 60KDa (bande C) et de 50 KDa (bande D). La linéarisation par PvuII des deux clones conduit à un même profil de synthèse avec les bandes E (43 Kda) et F ( 33 KDa) qui correspondent aux produits Gag tronqués.
- La figure 9 représente l'expression du vecteur p57cDNASD'/GFP dans des cellules murines NIH3T3 et humaines 293T. Plus particulièrement, la figure 9 représente l'analyse par western blot (anti-GFP) correspondant à l'expression du clone p57cDNASD'/GFP dans les cellules murines et humaines avec un anticorps anti GFP. Les lignes 1 et 4 correspondent à la transfection du vecteur SD'/GFP dans les cellules NIH3T3 et 293T respectivement. Les lignes 2 et 3 correspondent à la transfection du vecteur contrôle GFP seule dans les cellules NIH3T3 et 293T respectivement.
- La figure 10 A représente l'analyse par western blot (anti-GFP) de la localisation subcellulaire de la protéine SD' et de la protéine contrôle, GFP, dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques des cellules productrices de virus. L'extrait protéique des virions produits est également analysé. Des cellules 293T ont été transfectées avec le système à trois vecteurs plus un quatrième vecteur exprimant soit la protéine GFP seule soit la protéine SD' / GFP. Les protéines ont été extraites des fractions nucléaires (N), cytoplasmique (C) et des virions produits purifiés (V). Le western blot a été révélé avec un anticorps anti-GFP qui permet de détecter la protéine GFP à 27 KDa et la protéine SD'/GFP avec un poids apparent de 77 KDa.
- La figure 10 B représente l'analyse par western blot (anti IN) de l'expression des clones
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p57cDNASD' et p57cDNASD'/GFP dans les cellules murines infectées ou non par Friend. La localisation nucléaire est également évaluée. Les extraits protéiques de cellules NIH3T3, infectées ou non par Friend-MLV, ont été séparés sur gel d'électrophorèse puis analysé par western blot avec un anticorps anti-intégrase. Les lettres T et N correspondent respectivement aux fractions totales et nucléaires des extraits. Ce gel révèle l'intégrase (45 KDa), la protéine SD' avec un poids apparent de 50KDa, et la protéine SD' fusionnée à la GFP avec un poids apparent de 77 KDa. A l'exception du vecteur SD'/GFP exprimé dans les NIH3T3 infectées,, les protéines plus longues, avec initiation au codon CUG, sont en général plus faiblement détectées. Le mock correspond à des cellules NIH3T3 non transfectées.
- La figure 11 représente des vecteurs rétroviraux prototypes dérivés des MLV.
- La figure 12 représente des vecteurs pour la production de la protéine SD'.
- La figure 13 représente un schéma de production de particules MLV contenant un transgène selon l'invention.
- La figure 14 représente la comparaison des protéines SD' de Moloney et Friend avec celles putatives de deux virus apparentés GaLV (gibbon ape leukemia virus) et FeLV (féline leukemia virus). Les acides aminés qui différent du consensus sont encadrés.
I - MATERIEL ET METHODE.
1.1 - Culture cellulaire.
Les lignées cellulaires NIH3T3, Mus Dunni (fibroblastes de souris) et 293T (cellules humaines de rein f#tal) sont cultivées à 37 C dans un milieu
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constitué de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) complété avec 10% (v/v) de sérum de veau f#tal (Gibco) décomplémenté, 2 mM de glutamine, 100 IU/ml de pénicilline et 2 g/ml de streptomycine.
1.2 - Constructions. p57(2LTR) : ce vecteur contient le clone moléculaire entier du virus Friend-MLV avec ces deux LTR en 5' et 3' que nous avons construit à partir du clone moléculaire de Friend-MLV permuté (p57/A) avec un LTR unique.
P57cDNASD' : Le vecteur Sp72 (Promega) porte inséré aux sites ClaI et PvuII, l'ADN complémentaire de l'ARN SD' alternativement épissé avec ses deux LTR. Le plasmide pS72 présente en amont de l'ADNcSD', le promoteur de l'ARN polymérase du phage T7 qui permet également de faire la transcription in vitro de l'ADNc.
P57cDNASD'/GFP : Le fragment SpeI (position 282nt)-SacII (2240nt) du clone p57cDNASD' a été inséré dans le vecteur pEGFP-N2 ouvert par NheI et SacII (Clontech) afin d'exprimer une protéine SD' fusionnée à la GFP en C-terminal sous le contrôle du promoteur de CMV. Contrairement à la construction p57cDNASD', la partie 5' du gène SD' est tronquée des 282 premiers nucléotides non codants, correspondants à la LTR 5' et au début du signal d'encapsidation. En raison de la construction, la protéine SD' est également tronquée en C-terminal de 2 acides aminés.
Les vecteurs utilisés pour l'expression indépendante des constituants de la particule virale en vue des expériences de reconstitution de virus sont les suivants :
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- Vecteur "capside virale" : exprimant les protéines Gag/Pol de Friend-MLV sous le contrôle du promoteur CMV. Le signal d'encapsidation a été remplacé par l'intron de la beta globine afin que l'ARN produit ne soit pas retrouvé dans les particules virales.
- Vecteur "env" qui contient uniquement le gène d'enveloppe de Friend MLV sous le contrôle des LTR virales MLV.
- Vecteur "ARN viral" porte le LTR MLV en 5', le signal d'encapsidation, suivi de plusieurs codons stop afin d'empêcher sa traduction, puis suivent les gènes gag et pol qui ne pourront être traduit. Le gène env a été substitué par la séquence codante de la phosphatase alcaline précédée d'une IRES permettant l'expression indépendante du gène rapporteur. En effet, ce vecteur n'apporte que les éléments viraux ARN (l'ARN viral génomique et l'ARN SD' alternativement épissé) qui seront encapsidés dans les particules virales reconstituées par ce système à trois vecteurs indépendants.
- Vecteur "ARN viral Fl" une version mutée de ce vecteur "ARN viral" présente les mêmes mutations ponctuelles que le virus Fl (Déjardin et al, 2000, J.
Virol. 74, 3709-3714).
1.3 - Test de transcomplémentation.
Le test de transcomplémentation a été effectué par co-transfection (méthode de précipitation au CaCl2, Maniatis et al.) dans des cellules 293T des constructions permettant la constitution de particules virales sauvages (vecteurs "capside virale", "env" et "ARN viral") et mutantes (vecteurs "capside virale", "env" et "ARN viral Fl") en présence ou en l'absence de la construction p57cDNASD' exprimant l'ARN viral SD'. Les surnageants contenant les particules virales ont été
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récoltés après 48 heures de transfection, filtrés (0,2 m) et titrés par infection de cellules cibles NIH3T3 et comptage des foyers d'expression de la phosphatase alcaline.
1.4 - Extraction et analyse des ARN viraux et cellulaires.
L'ARN viral a été isolé des particules virales comme décrit dans Mougel et al., 1996, J.
Virol,70, 5043-5050). L'ARN cellulaire total a été isolé par la méthode du TriReagent TM (Sigma) conformément aux instructions données par le fabriquant. Les ARN ainsi obtenus ont été traités à la DNase (RQ1, Promega) pour éliminer toute contamination d'ADN, et quantifiés par mesure de l'absorbance à 260 nm. L'analyse par RT-PCR des ARN extraits des virions ou cellulaires a été effectuée à l'aide des réactifs : 5X reverse transcriptase buffer, 10x PCR buffer, ExpandTM reverse transcriptase et ExpandTM long template PCR system, fournis par Boehringer Mannheim Biochemicals. 5 g d'ARN cellulaire ont été dénaturés durant 10 minutes à 65 C en présence de 220 nanogrammes d'oligonucléotide (dT)15 et incubés 5 minutes à 4 C. La réaction de reverse-reverse-transcription, d'un volume total de 20 l contenant 4 l de tampon de RT, 10 mM d'un mélange de dNTP, 10 mM en DTT, 20 u de RNasin (Promega), et 50 u de ExpandTM reverse transcriptase, a été incubée durant 1 heure à 42 C, 30 minutes à 52 C, stoppée 2 minutes à 95 C et portée à 4 C. Un cinquième de la réaction a été utilisé pour chacune des réactions d'amplification par PCR. Les quatre paires d'oligonucléotides suivantes ont été utilisées pour détecter les différents transcrits de MuLV (s et a désignant respectivement l'orientation sens ou antisens,
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suivi de la position et de la taille du fragment amplifié) : s3350 et a3600 (250pb) pour la détection du transcrit non épissé, s76 et a5600 (259 pb) pour l'ARNm d'enveloppe, sl450 et a5620 (276 pb) pour l'ARN alternativement épissé SD' et s6153 et a6418 (256 pb) pour la détection de la totalité des transcrits de MLV.
Les réactions PCR, contenant 10 mM d'un mélange de dNTP, du PCR buffer, 1,5 u de ExpandTM DNA polymérase mix et 220 ng de chacun des oligonucléotides sens et antisens, ont été conduites dans les conditions suivantes : dénaturation à 94 C, hybridation à 57 C et extension à 68 C. L'analyse des produits de PCR est effectué par électrophorèse sur gel d'agarose 2% et coloration au Bromure d'éthidium.
1.5 - Analyse de l'ADN proviral dans les cellules infectées.
1x10-7 cellules Mus Dunni Néo-infectées (4 heures d'infection), chroniquement infectées (4 jours d'infection) et non infectées sont rincées 2x au PBS froid. Les cellules sont incubées dans un tampon 100 mM NaCl, 50mM Tris pH 7,5,5 mM EDTA et 0,5% SDS contenant 200 g/ml de protéinase K, durant 12 heures à 37 C sous faible agitation. Après deux extractions au phénol chloroforme, l'ADN cellulaire est précipité à l'éthanol et repris dans l'eau. L'ADN proviral est détecté par amplification PCR en utilisant les mêmes paires d'oligonucléotides que ceux utilisés pour l'analyse des ARN messagers viraux (s3350-a3600, sl450-a5620 et s76a5620 pour la détection de l'ARN génomique, de l'ARN SD' et de l'ARNm env respectivement).
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1.6 - Analyse de la protéine SD' par traduction in vitro.
Les clones moléculaires du virus Friend-MLV p57 (2LTR) et de l'ADNcSD', linéarisée soit par XhoI et soit par PvuII ont été utilisées comme matrices dans le système de transcription/traduction in vitro TNT# Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega), en présence de méthionine L-[35S], dans les conditions préconisées par le fabriquant. Après ajout d'un volume de tampon de charge 2x (125 mM Trishydrochloride [pH 6,8], 4% SDS, 20% glycerol, 0,25% bromophenol blue, 5% B-mercaptoethanol, 40 mM DTT) aux réactions en fin de traduction et chauffage 5 minutes à 100 C, les échantillons sont séparés par électrophorèse sur gel 10% acrylamide puis transférés sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell). Les produits de traduction sont ensuite détectés par autoradiographie de la membrane.
1.7 - Analyse des protéines SD' et SD'GFP dans un système cellulaire.
Les constructions p57cDNASD' et p57cDNASD'/GFP ont été transfectées dans les cellules NIH3T3 à la lipofectamineTM (invitrogen) dans les conditions préconisées par le fabriquant. 48 heures après transfection, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et lysées dans un tampon 20 mM Tris pH 7,5,1 mM EDTA, 0,01 % SDS, 0,5% sodium deoxycholate (Sigma), 1% Triton X100, 0,02% azide de sodium et 150 mM NaCl. Après centrifugation 10 minutes à 13 000 rpm à 4 C, le surnageant constituant l'extrait protéique est prélevé et additionné d'un volume de tampon de charge 2x, chauffé à 100 C pendant 5 minutes, et séparé par électrophorèse sur gel d'acrylamide 10%. Après électrotransfert sur membrane de cellulose (Schleicher & Schuell), les protéines SD' et
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SD'/GFP sont détectées en incubant les membranes avec les anticorps anti-matrice, anti-intégrase et/ou anti-GFP et leurs anticorps secondaires respectifs couplés à la peroxydase et révélé par la méthode classique de chemiluminescence (kit ECL).
II - RESULTATS.
II.1 - Importance du nouveau transcrit subgénomique pour l'obtention d'un pouvoir infectieux optimal.
Afin d'évaluer l'importance du nouveau transcrit subgénomique pour l'obtention d'un pouvoir infectieux optimal, il a été mis au point des expériences basées sur la reconstitution de particules virales à partir de trois plasmides distincts qui permettent l'expression séparément de Gag/Pol, Env, et d'un ARN génomique. Une version mutante du vecteur génomique a été créée à partir du précédent virus mutant Friend (FI) qui montre trois points de mutations dans le site SD' (Déjardin et al, 2000).
Les cellules 293T ont été transfectées de manière transitoire avec le système d'expression à trois plasmides et la production d'ARN viral et de protéines virales a été analysée respectivement par RT-PCR et par Western blot comme décrit précédemment (Déjardin et al, 2000). Les virus produits ont été titrés sur des cellules NIH3T3 et les titres viraux ont été mesurés par visualisation de l'activité de la phosphatase alcaline portée par le vecteur génomique. Alors que les virions reconstitués sauvages montrent un titre médiocre de 1700 FFU/ml, les mutations SD' dans le contexte de ce système à trois vecteurs ont maintenu une baisse de 10 fois du
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titre viral en dépit de la trans-production des protéines Env et Gag/Pol (Figure 5).
Pour être sûr que cette réduction du pouvoir infectieux est due à une perte de l'ARN SD' , nous avons analysé avec ce système l'effet de l'introduction d'un quatrième vecteur exprimant soit l'ARN SD' pré-épissé de 4,4 Kb, soit l'ARN SD'' ayant subi un épissage cryptique en trans. Comme on peut le voir dans la figure 5, l'expression de l'ADNc SD' augmente le pouvoir infectieux du mutant défectif au niveau de l'épissage alternatif, alors qu'elle n'a pas changé le titre viral des particules sauvages. De plus, aucun effet d'inhibition n'a été observé sur le titre de virus sauvages par l'addition d'un ADNc correspondant à l'ARN SD'' (données non montrées). Considérés ensemble, ces résultats démontrent l'importance de l'ARN SD' pour l'obtention d'un pouvoir infectieux optimal.
II.2 - Incorporation d'ARN SD' dans des particules de MLV.
Les résultats présentés ci-dessus ont montré la capacité de l'ARN SD' à améliorer le pouvoir infectieux, mais le mécanisme de cette amélioration demeure inconnu. C'est pourquoi les différentes phases de la réplication virale dans lesquelles l'ARN SD' peut potentiellement jouer un rôle ont été examinées.
L'épissage alternatif entretient la séquence non codante de 350 nucléotides (appelée Psi) en amont du site d'épissage donneur 5' (Man et Baltimore, 1983,Cell, 33,153-159). Cette région contient les quatre structures en épingle à cheveux qui ont été décrites comme étant la condition minimale requise pour une encapsidation spécifique de l'ARN du virus Moloney-MLV dans des particules MLV (Mougel et al, 1996, J.Virol,70,5043-
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5050). Ainsi, la présence de l'ARN SD' dans les particules MLV a été examinée. Les virions produits à partir des cellules NIH3T3 infectées avec le virus Friend- ou Moloney-MLV ont été collectées et le contenu en ARN des virions MLV a été contrôlé par analyse RT-PCR.
Trois réactions différentes de PCR ont été menées à partir d'une unique réaction RT afin de détecter la présence séparément de l'ARN génomique non-épissé fulllength , de l'ARN SD' et de l'ARNm env. Comme attendu, l'ARN en v, auquel manque la séquence Psi, reste indécelable dans les virions libres dans la cellule, alors qu'à la fois l'ARN non épissé et l'ARN SD' ont été détectés dans les particules MLV (Figure 6). Malgré le niveau plus faible d'ARN SD' dans les cellules infectées comparé à ceux de l'ARN viral génomique et de l'ARN env (Déjardin et al, 2000, J.Virol, 74, 3709-3714), l'ARN SD' est incorporé de manière efficace dans les virions descendants, ce qui suggère la participation d'un procédé d'encapsidation actif. Ainsi, ces données ont montré pour la première fois deux espèces d'ARN différentes préférentiellement enveloppées dans les virions MLV : l'ARN génomique full-length et l'ARN SD'.
II.3 - L'ARN SD' et les phases d'infection précoces.
En considérant que l'ARN SD' est présent dans les particules infectieuses, il pourrait participer aux phases précoces du cycle de vie, qui consistent en l'entrée du virus, déshabillage, transcription inverse et entrée dans le noyau de l'ADN viral suivie par l'intégration de l'ADN proviral dans le génome hôte. L'ARN SD' héberge tous les signaux cis requis pour la transcription inverse incluant un tRNA-Binding Site (PBS) et une région polypurine (PTT) pour l'initiation de la
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synthèse du premier ou du second brin d'ADN, et une région répétée (R) aux deux extrémités de l'ARN viral requis pour le transfert de la synthèse d'ADN entre les matrices, ainsi que les séquences répétées inversées situées aux extrémités des LTRs viraux requis pour l'intégration. La transcription inverse initiée dans les virions est réalisée dès la première heure après l'infection. Ainsi, le contenu en ADN proviral a été examiné 4 heures après l'infection. Dès lors, les mêmes investigations ont été menées sur des cellules infectées de manière chronique afin de détecter spécifiquement les formes intégrées de l'ADN viral. En effet, dans les cellules infectées de manière chronique, les formes intégrées constituent les espèces d'ADN viral prédominantes du fait que la transcription inverse de novo est restreinte par la résistance à la surinfection des cellules infectées. Dans la pratique, les cellules NIH3T3 ont été infectées par le Friend- ou Moloney- MLV et l'ADN cellulaire total a été extrait 4 heures après l'infection, 3 jours après l'infection (néo-infection) ou plusieurs semaines après l'infection (infection chronique). Utilisant les mêmes conditions que ci-dessus sans la phase préalable de réverse transcription, deux espèces virales ont été détectées dans toutes les conditions infectieuses (Figure 7). Ces deux ADN proviraux correspondent à l'ADN proviral full-length attendu et au transcrit inverse ADN SD' subgénomique additionnel. De manière attendue, aucune copie ADN de l'ARNm en v n'a été détectée, puisque l'ARNm en v est absent des virions (données non montrées). Une amplification avec chaque combinaison d'amorces a aussi été effectuée sur des cellules NIH3T3 non infectées comme contrôle négatif (Figure 7). Considérés ensemble ces résultats indiquent que l'ARN SD' partage plusieurs
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étapes essentielles avec l'ARN génomique full-length incluant l'encapsidation, la transcription inverse et l'intégration.
II.4 - Analyse de la capacité codante de l'ARN SD'. a) Couplage de la transcription et de la traduction dans les systèmes de lysats de réticulocytes.
L'épissage alternatif étant un événement décrit comme générant de nouveaux produits de traduction à partir d'un unique ARN précurseur chez les eucaryotes, il est important de considérer que la capacité de codage de l'ARN SD' peut être directement impliquée dans la capacité d'infection des particules rétrovirales. Le potentiel codant est vaste puisqu'il inclut tous les codons d'initiation de la traduction des cadres ouverts de lecture glycogag, gag et env qui sont utilisés dans l'ARN full-length et l'ARN subissant un épissage canonique, tout comme les codons d'initiation putatifs dans tous les autres cadres ouverts de lecture. La traduction de l'ARN SD' a été examinée dans un système de lysat de réticulocytes de lapins (RRL). Pour ce faire, le plasmide ADNc SD' linéarisé SD'au site XhoI, situé dans le vecteur en aval du LTR3', a été utilisé comme matrice pour produire une réaction couplée de transcription/traduction. Comme décrit dans la Figure 8, deux produits principaux ont été synthétisés avec une masse moléculaire apparente de respectivement 50 et 60 kDa. En parallèle, le clone moléculaire de Friend-MLV (p57(2LTR)) a été utilisé comme contrôle positif. L'ARN génomique MLV dirige la synthèse de deux protéines relatives à gag : Pr65gag, le précurseur gag avec MA, pl2, CA, et NC et Pr75glyco-gag, le précurseur de gag glycosylé.
La traduction de Pr65gag commence à un AUG (position 619
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pour Friend-MLV) alors que Pr75glyco-gag est initié à un CUG (position 355 pour Friend-MLV) dans le cadre avec AUGgag (Evans et al, 1977, J. Virol, 24,865 ; Saris et al, 1983, J. Virol, 46, 841 ; Edwards et Fan, J. Virol, 1979,30, 551-563 ; Prats, AC, et al, JMB, 205,363-372) (Figure 8).
D'après la taille des deux bandes vues avec le vecteur SD' (50 et 60 kDa), la traduction de SD' pourrait correspondre au recrutement des codons CUGglyco-gag et AUGgag avec le codon stop pol naturel. L'usage de ces deux codons d'initiation est également testé par des expériences réalisées avec les mêmes plasmides p57(2LTR) et p57cDNASD' mais linéarisés cette fois au site PvuII (position 1528) situé en amont du site d'épissage SD'. Si les codons d'initiation recrutés sont ceux de Gag et GlycoGag alors les profils d'expression doivent être similaires entre les deux constructions. En effet, deux bandes, respectivement à des poids moléculaires apparents de 33 et 43 KDa, sont observées à la fois dans le contrôle et le clone SD', indiquant une même initiation de la traduction, aux codons AUG et CUG, et précocement stoppée par la linéarisation des vecteurs dans le gène gag (Figure 8). Pour confirmer l'identité des produits traduits, le gel de protéine a été électrotransféré sur une membrane de nitrocellulose pour effectuer un immunoblot. Alors que les protéines traduites à partir de l'ARN full-length ont été détectées avec un anticorps monoclonal anti CA (H187), ce dernier était incapable de détecter les produits transcrits à partir de l'ARN SD', ce qui suggère que les protéines SD' ne contenaient pas l'épitope correspondant. Le même résultat négatif a été observé en utilisant un anticorps monoclonal anti enveloppe (anti SU) excluant l'usage d'AUGenv. Pour finir, les deux protéines SD' ont réagi avec un anticorps anti IN. Considérées ensemble, ces données suggèrent que la
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traduction de l'ARNm SD' est initiée soit aux codons CUGglycogag (60 kDa) , soit au codon AUG gag (50 kDa) , et s'arrête au codon stop naturel de pol. Ainsi, la protéine SD' inclut MA, pl2, les 110 premiers acides aminés de CA, avec les 116 derniers acides aminés du cadre d'IN. c) Traduction dans les cellules murines.
La traduction in vitro pouvant masquer des caractères particuliers comme la translecture traductionnelle, l'initiation cap-indépendante, ou l'usage d'un codon d'initiation sub-optimal, qui sont communément rapportés dans la traduction rétrovirale, la capacité à coder de l'ARNm SD' a aussi été étudiée dans les cellules murines NIH3T3 et dans les cellules infectées avec Friend-MLV.
Premièrement, la traduction de l'ARNm SD' a été évaluée dans les trois cadres ouverts de lecture par clonage de l'ADNc dans des vecteurs comportant le gène codant pour la EGFP (enhanced fluroscent protein) dans différents cadres (pEGP-Nl, -N2 et-N3). Seule la construction hébergeant l'ARNm SD' dans le même cadre de lecture que la EGFP exprime la protéine SD' comme une fusion avec la séquence N-terminale de la EGFP. Ces trois constructions SD'/GFP ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules murine NIH3T3 et humaine 293T. L'analyse des protéines a été conduite par Western blot en utilisant un anticorps anti-GFP. Les protéines de fusion ont été vues seulement quand SD' a été insérée telle que son codon AUGga9 était dans le même cadre que EGFP (Figure 9). Cette approche n'a pas révélé de codon d'initiation fonctionnel dans d'autres cadres de lecture de l'ARNm SD'. La bande principale obtenue à la fois dans les cellules murines et les cellules humaines correspondent à une protéine de 77 kDa approximativement
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qui a probablement un rapport avec la protéine de 50 kDa observée dans la précédente traduction in vitro. Une bande mineure de 10 kDa plus lourde a aussi été observée dans les cellules NIH3T3 avec une masse moléculaire apparente (87 kDa) correspondant probablement à l'usage de CUGglycogag. Ces résultats sont corrélatifs avec ceux obtenus avec l'expression de l'ADNc SD' non fusionné dans les cellules NIH3T3, infectées ou pas par Friend-MLV.
Dans les deux cas, les protéines traduites SD' et SD'/GFP ont été détectées avec un anticorps anti-intégrase (IN) et un anti-matrice (MA) Ces expériences montrent que l'ARNm SD' code pour une polyprotéine incluant MA, pl2, la séquence N-terminale de CA et la séquence C-terminale de IN et une protéine plus lourde de 10 kDa utilisant le codon CUGglycogag situé en amont.
II.5 - Localisation intracellulaire des protéines SD'.
La localisation sub-cellulaire de la protéine SD' a été évaluée. Premièrement, la fluorescence directe de la protéine SD' fusionnée avec la EGFP dans les cellules NIH3T3 a été observée. Les cellules transfectées de manière transitoire ont été observées directement au microscope. Alors que la EGFP seule est uniformément distribuée d'un bout à l'autre de la cellule, la protéine de fusion SD'/GFP apparaît sous forme de petits points avec une distribution de la fluorescence à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau, avec un soulignement des membranes nucléaires et plasmidiques.
De plus, la localisation intracellulaire a été évaluée par fractionnement cellulaire permettant la discrimination entre les fractions cytoplasmique et nucléaire. Le contenu en protéines a été mesuré par analyse Western blot pour chaque compartiment cellulaire.
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Ces expériences ont été menées avec des cellules infectées ou non par Friend-MLV, et des cellules transfectées de manière transitoire avec des vecteurs exprimant soit SD', SD'/GFP ou EGFP (Figure 10 A). Comme prévu, la protéine contrôle EGFP s'est accumulée dans le cytoplasme soit des cellules NIH3T3 non-infectées, soit des cellules NIH3T3 infectées (Figure 10 A, B). En revanche, les protéines virales intégrases présentent préférentiellement une localisation nucléaire dans les cellules NIH3T3 infectées (Figure 10B). Ces deux observations soulignent l'efficacité de la procédure de fractionnement. Comme observé précédemment par microscopie, les protéines SD' et SD'/GFP sont également trouvées dans les fractions cytoplasmiques et nucléaires (Figure 10 A, B). Cette localisation n'est pas dépendante des autres composants viraux puisqu'elle a été aussi observée quand SD' ou SD'/GFP ont été surexprimés dans des cellules NIH3T3 non-infectées (Figure 10 B).
II.6 - La protéine SD' est associée aux virions.
La polyprotéine SD' inclut le domaine matrice (MA) qui s'avère contenir les signaux nécessaires pour diriger le transport au site d'assemblage de la capside à la membrane plasmidique. Ainsi, la polyprotéine SD' pourrait être ciblée au site d'assemblage et en conséquence pourrait être incorporée dans les virions. Le surnageant des cellules NIH3T3 infectées avec Friend-MLV surexprimant SD' ou non, a été collecté et filtré à travers un filtre 0,22 pm. Les virions ont été déposés sur gradient de sucrose et leur contenu protéique a été analysé par Western blot en utilisant des anticorps anti IN et anti GFP. Comme montré sur l'exemple de la Figure 10 A, la protéine SD' fusionnée à la GFP, a été retrouvée
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dans le culot lors de la centrifugation du surnageant de culture cellulaire de cellules productrices, indiquant son incorporation dans les particules virales. Bien qu'abondamment trouvée dans les cellules NIH3T3, la protéine GFP a été détectée seulement en tant que traces dans le milieu extracellulaire.
III - DISCUSSION.
III.1 - Importance de l'ARN SD' dans la réplication.
Les mutations SD' affectent le pouvoir infectieux même quand les composants de l'expression rétrovirale étaient dissociés. De plus, dans le cas de systèmes vectoriels comme le système vectoriel transitoire à trois plasmides, il a été constaté que les titres courant de virus spécialement produits dans les cellules 293T n'étaient pas absolument dépendants de la balance entre les vecteurs (Yap et al, 2000, J. Gen.
Virol.,81,2195-2202). Ainsi, l'effet des mutations SD' observées avec ce système ne pouvait pas résulter uniquement d'une déficience en ARNm env, contrairement à ce qui fut constaté dans le cas d'un virus capable de réplication (Déjardin et al, 2000 ; J.Virol.,74,3709- 3714). Les mutations SD' étant portées seulement par le vecteur ARN génomique, et non par le vecteur GagPol, le titre des virus mutants peut uniquement résulter de l'effet en cis des mutations du site SD'. Ceci pourrait expliquer la différence de réduction du titre observée dans le cas d'un MLV capable de réplication (une baisse de 100 fois) par rapport au système des trois vecteurs (baisse de 10 fois). De manière significative, l'ARN SD'' activé par l'inhibition de SD' dans Friend-MLV n'a pas d'effet inhibiteur sur le titre du virus sauvage. Ainsi,
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ces données montrent un rôle de l'ARN SD' dans la capacité de réplication virale.
A côté de l'influence de l'utilisation de SD' sur le profil d'épissage général des rétrovirus que nous avons précédemment décrit, des expériences ont été effectuées pour déterminer le rôle de l'ARN SD' dans les différentes étapes de la réplication virale.
III.2 - Encapsidation.
Les phases tardives du cycle de vie concernent tous les événements ayant lieu après l'intégration de l'ADN proviral. Pendant l'expression des génomes proviraux, les ARNs viraux nouvellement transcrits assument deux fonctions. En plus de leur rôle d'ARNm, les transcrits viraux non épissés sont encapsidés dans des particules d'assemblage comme l'ARN viral génomique. L'ARN rétroviral encapsidé implique des interactions entre la séquence Psi dans le génome ARN viral et le précurseur de la polyprotéine Gag (Aldovini, 1990, J.Virol.,64, 1920-1926 ; Gorelick, 1990, J.Virol.,64, 3207-3211 ; D'Souza et al, 2001, Nat. Med.,12, 1293-1300). On pensait communément que seul l'ARN non épissé était incorporé de manière efficace dans les virions (Man et Baltimore, 1985, J.Virol.,54, 401- 407). La présente invention montre que l'ARN SD' est aussi un composant structurel des virions MLV et de façon présumable des particules infectieuses puisque sa présence en tant que copie d'ADN a été trouvée dans les cellules 4 heures après l'infection. Ainsi, l'ARN SD' pourrait être co-encapsidé avec l'ARN génomique dans les virions. L'ARN SD' pourrait servir d'ARN accompagnateur pour fournir la structure ARN requise pour l'encapsidation spécifique.
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III.3 - Transcription inverse et intégration.
Cette co-encapsidation pourrait influencer la recombinaison par saut de brin entre les transcrits viraux hétérologues coencapsidés pendant la transcription inverse ce qui permettrait aux rétrovirus d'élargir et d'augmenter leur éventail d'hôte, d'échapper aux défenses de l'hôte, et d'échapper à la thérapie anti-rétrovirale.
Cette co-encapsidation pourrait influencer la recombinaison par saut de brin entre les transcrits viraux hétérologues coencapsidés pendant la transcription inverse ce qui permettrait aux rétrovirus d'élargir et d'augmenter leur éventail d'hôte, d'échapper aux défenses de l'hôte, et d'échapper à la thérapie anti-rétrovirale.
Ceci pourrait expliquer pourquoi le fait de maintenir l'ARN SD' est avantageux pour les rétrovirus MLV.
L'intégration de la copie ADN SD' provirale est un moyen d'une part de stabiliser l'ADN viral contre la dégradation et d'autre part de constituer une voie additionnelle pour produire l'ARN SD' par transcription directe en détournant l'épissage alternatif.
Enfin, l'ARN SD' partage toutes les caractéristiques des virus défectifs, puisqu'il intervient lors des étapes d'encapsidation, de transcription inverse et d'intégration. Ceci pourrait avoir une conséquence sur la dissémination virale in vivo et la pathogénicité des rétrovirus MLV. En effet, ils sont impliqués dans les tumeurs murines telles que les leucémies. Le mécanisme commun utilisé pour induire la formation d'une tumeur est la mutagenèse par insertion, dans laquelle les rétrovirus s'intègrent à l'intérieur du génome de l'hôte et affectent la transcription des gènes voisins. L'ARN SD' considéré comme le génome du virus défectif MLV pourrait influencer de manière définitive le processus pathogène. Il est important de souligner que le site SD' est directement impliqué dans les réarrangements c-myb précédant la leucémie promonocytaire induite par Moloney chez les souris adultes (Mukhpadhaya et al, 1994, J.Virol.,68, 5100-5107; Shenong & Wolff, 1987, J.Virol.,61, 3721-3725).
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III.4 - Traduction.
L'épissage alternatif étant un événement communément décrit pour générer de nouveaux produits de traduction à partir d'un unique précurseur chez les eucaryotes, la protéine codée par l'ARNm SD' pourrait aussi participer à la capacité d'infection des virus.
L'ARN SD' dirige la synthèse de deux polyprotéines apparentées à gag avec des initiations de traduction aux codons AUGgag et CUGglycogag (Prats,AC et al, 1989,JMB,205, 363-372). Ces derniers sont déjà recrutés pour la synthèse des pércurseurs Gag (Pr65) et de Glycogag (Pr75) via un mécanisme interne d'entrée dans le ribosome (Berlioz & Darlix, J. Virol, 1995,69, 2214-22 + Prats, AC, 1989,J. Molec. Biol.,205,363-372). Ces nouvelles polyprotéines SD' différent des précurseurs classiques Gag par la fusion d'un domaine N-terminal de Gag incluant MA, pl2, et les 110 premiers acides aminés de CA avec les 116 acides aminés de l'intégrase. La collaboration à la fois des domaines de Gag et de l'intégrase doit fournir de nouvelles propriétés aux polyprotéines SD'. Ainsi, la partie Gag de ces nouvelles polyprotéines contient des signaux requis pour le ciblage au site de bourgeonnement, pour l'assemblage du virus, et pour la propagation in vivo et la pathogénicité de MLV (Corbin,A. et al,1994,J.Virol.,68,3857-3867; Soneoka,Y et al, 1997,J.Virol.,71,5549-5559; Yuan, B et al, 2000,J.Virol.,74,7250-7260; Alin,K and Goff,SP, Virology,1996,222,339-351). Des études de mutagenèse invoquent aussi des fonctions dans les événements précoces du cycle viral comme la synthèse de l'ADN viral et l'import nucléaire (Yuan, B, et al,1999,EMBO Journal,18,4700-4710; Bukrinsky,MI, Nature,1993,365,666- 669). De plus, la portion C-terminale de l'intégrase MLV a été caractérisée comme le site de liaison non
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spécifique de l'ADN, et est requise pour les activités d'intégration et de désintégration (Jonsson et al., 1996, J.Virol., 70,4585-4597). De manière intéressante, ce domaine de l'intégrase MLV contient une insertion spécifique aux virus apparentés aux MLV, et qui n'est pas conservée chez les autres rétrovirus. En plus d'un rôle probable de l'ARN SD' en cis, la polyprotéine SD' pourrait fonctionner comme une protéine régulatrice.
Ainsi, compte tenu de l'événement d'épissage alternatif et de l'existence de la protéine régulatrice SD', les rétrovirus MLV deviennent des rétrovirus complexes.
IV - VECTEURS DERIVES DES MLV ET PRODUCTION DE PARTICULES MLV CONTENANT UN TRANSGENE.
IV.1 - Vecteurs prototypes.
Plusieurs constructions de vecteurs dérivés des MLV peuvent être utilisées. Les vecteurs représentés à la figure 11 contiennent le signal étendu d'encapsidation (Psi) #+. Leurs caractéristiques distinctives principales ont été signalées par un encadré.
Le vecteur LXSN (Miller et al., 1989, Biotechniques, 7, 980) est caractérisé par des LTR 5' et 3' différents, et une mutation de l'ATG d'initiation de la traduction de Gag en codon stop ; la LTR 5' dérivé du virus sarcomateux de Moloney (MSV) qui dirige la synthèse d'ARN viral dans les lignées d'encapsidation, alors que la LTR 3', dérivée du MLV de Moloney (Mo-MLV), dirige la transcription de l'ARNm du gène d'intérêt après intégration du provirus transduit dans les cellules cibles. LXSN comprend aussi le gène de résistance à la
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néomycine (neor) placé sous le contrôle du promoteur SV40 (SV).
Le vecteur MFG (Rivière et al., PNAS, 1995,92,6733) est entièrement basé sur les séquences du MLV de Moloney qui a la particularité d'enchaîner à la partie tronquée de gag (Agag) les déterminants du site accepteur d'épissage (SA) ainsi que le contexte ATG natif de l'enveloppe MLV.
Le vecteur MFG (B2) (Rivière et al., PNAS, 1995,92, 6733) est dérivé de MFG et est utilisé pour la thérapie génique d'enfants immunodéficients (CavazzanaCalvo et al, Science, 2000,288, 669), avec une mutation ponctuelle du PBS qui lève le blocage de la transcription MLV dans les cellules non différenciées.
Les vecteurs MESV (Laker et al., J.Virol., 1998,72, 339) et MND (Challita et al. ,J.Virol., 1995, 69,748) sont de structure similaire avec trois caractéristiques distinctives : - contrôle de la transcription du transgène, après transcription inverse, par U3 de MPSV en LTR 3'; - délétion d'une région de contrôle négatif (ou NCR pour Négative Control Région) dans U3, et LTR 5' soit de MPSV (vecteurs MESV), soit du MLV de Moloney (vecteurs MND) ; - substitution du PBS natif MLV reconnu par l'ARNtPro par la séquence PBS d'un mutant de MLV reconnu par l'ARNtGln (Colicelli et Goff, J. Virol., 1986,57, 37).
Il convient de noter que le prototype MFG(B2) (Hacein-Bey, S et al., Blood, 1998, 92,4090-4097) a été utilisé dans le premier cas décrit de thérapie génique réussie. En effet, prototype MFG (B2), le
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transgène yc, a été introduit ex vivo dans des cellules précurseurs hématopoïétiques CD34+, et une correction du défaut immunitaire caractéristique de ces patients a pu être observée dès le deuxième mois après implantation (Cavazzana-Calvo, M. et al., Science, 2000, 288, 669-72).
Dans ces vecteurs prototypes, les séquences requises pour la production de la protéine SD' sont absentes, or conformément à la présente invention, la présence du site SD' est nécessaire à l'obtention de titres viraux élevés (Déjardin et al., 2000). En outre, les résultats observés sur des souris inoculées avec un MLV ne portant pas le site SD' (mutant MSD1), pourraient résulter du fait que la présence du site SD' restreint les événements de recombinaison entre le virus et les séquences cellulaires (Audit et al, J. Virol, 1999, déjà cité).
La production de la protéine SD' découlant de l'utilisation du site SD' est donc à prendre en considération dans ces stratégies, au même titre que la production des protéines régulatrices (Tat, Rev, Vpr, etc. ) dans les stratégies utilisant les vecteurs lentiviraux (Zufferey, J. Virol., 1998,72, 9873 ; Srinivasakumar, N and Schuening,F, 1999,J.Virol.,73,9589- 9598).
IV.2 - Vecteurs pour la production de la protéine SD'.
La protéine SD' pourra être apportée en trans en co-transfectant avec le vecteur portant le gène d'intérêt, l'ADNc de la protéine SD' (portant Psi, donc présent dans les cellules cibles).
Il est aussi possible d'utiliser un seul vecteur portant à la fois le gène d'intérêt suivi de
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l'ADNc SD' placé en aval d'un IRES (site d'entrée interne de ribosome) on parlera alors de vecteur bicistronique (figure 12). L'IRES de l'encephalomyocarditis (ECMV) est le plus couramment utilisé (Morgan et al., Nucleic Acids res., 1992, 20, 1293) et devra être inséré juste en amont de l'ATG de SD'.
La figure 12 représente ces deux types de vecteurs pour la production de la protéine SD' : - en "version trans" comme vecteur indépendant tel que construit pour l'analyse de la traduction de l'ARNm SD' ; - en "version cis", c'est-à-dire sur un vecteur bicistronique qui permet à la fois l'expression du transgène et la traduction du cDNA SD' grâce à l'insertion d'une entrée interne des ribosomes (IRES).
IV.3 - Délivrance dans les cellules cibles.
Le recours à des lignées d'encapsidation est le cas le plus fréquent. Ces lignées d'encapsidation produisent de façon stable ou transitoire les protéines Gag, Pol et Env exprimées en général par deux vecteurs différents (Figure 13). Les limites actuelles de cette approche portent sur le risque de génération de RCR à la suite de recombinaison avec le vecteur portant le gène d'intérêt et les vecteurs présents dans la lignée et sur l'obtention de titres viraux élevés.
En plus du rôle possible de la protéine SD' lors de l'expression du transgène dans la cellule cible, on peut également espérer améliorer les qualités des lignées d'encapsidation par l'augmentation du titre viral et par une diminution du risque de recombinaison en considérant la présence ou non de la protéine SD'.
Il est parfois difficile de trouver dans la littérature la description au nucléotide près des
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vecteurs utilisés, toutefois, il semble que dans l'hypothèse du maintien du site accepteur d'épissage en position canonique, le vecteur portant les gènes gag-pol puisse théoriquement produire un ARN alternativement épissé. Cet ARN épissé, jamais décrit auparavant, serait tronqué de sa séquence d'encapsidation et donc absent des particules virales produites par ces lignées. Il ne présenterait donc pas le codon d'initiation CUG permettant l'initiation de la version longue de la protéine SD' et serait tronqué de toute sa région 3' (env, LTR 3'). Cependant, cet ARN pourrait coder la protéine SD' puisque l'ATG est présent.
La production de la protéine SD' peut être réalisée soit en cis (bicistroniqe) soit en trans. Les lignées ainsi modifiées permettront la formation de particules virales qui transporteront les vecteurs portant le gène d'intérêt et le l'ADNc SD'.
Il est également possible que l'inactivation de l'épissage alternatif (mutagenèse du site SA) dans les lignées d'encapsidation actuelles, améliore leur performance.
La figure 13 représente : - A gauche : une lignée d'encapsidation, exprimant de façon constitutive les gènes gag, pol et en v, qui est transfectée avec le vecteur rétroviral portant le gène d'intérêt et la séquence d'encapsidation #. Cette stratégie conduit à l'établissement de lignées stables d'encapsidation.
- A droite : une stratégie de production transitoire. Dans ce cas, une lignée cellulaire hautement transfectable est cotransfectée simultanément avec le vecteur rétroviral ainsi que des plasmides exprimant gagpol et env.
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Dans les deux cas, l'expression de la protéine SD' pourra être obtenue par la transfection transitoire ou stable de l'un ou l'autre des vecteurs décrit pour l'expression de SD' en cis (vecteur bicistronique) ou en trans (Figure 13). Seul le cas d'une expression en trans a été représenté sur la figure 13.
Claims (32)
1) Acide nucléique isolé contenant une séquence d'acide nucléique issue d'un épissage alternatif dans la région gagpol d'un MLV (Virus Leucémogènes Murins) et codant une protéine capable d'augmenter le pouvoir infectieux de vecteurs viraux.
2) Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique est issue d'un épissage alternatif qui recrute un site donneur d'épissage situé dans le domaine de la capside d'un MLV et le site accepteur qui est recruté pour la production d'ARNm d'enveloppe dudit MLV.
3) Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique est issue d'un épissage alternatif de la séquence nucléotidique située entre le codon CUG ou le codon AUG du gène gag d'un MLV et le codon stop du gène pol du domaine de l'intégrase d'un MLV.
4) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine SD' d'un MLV.
5) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine SD' d'un MLV d'un poids moléculaire apparent de 50 KDa.
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6) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine SD' d'un MLV d'un poids moléculaire apparent de à 60 Kda.
7) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine présentant au moins une des caractéristiques suivantes : - elle renferme les domaines entiers de la matrice (MA) et de la pl2 ; - elle présente un signal de myristylation "MGQTVTT" ; - elle présente un signal RKRR ; elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec les séquences de CTF/NFl ; elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec la synapsine qui se lie au cytosquelette ; - elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec l'ADN ligase ATP dépendante ; - elle contient un segment peptidique présentant une homologie avec la famille des protéines nucléaires Ran de liaison au GTP.
8) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine comprenant au moins une des séquences en acides aminés comprises entre les acides aminés en positions 80-130, 350-420 et 520-560 de la SEQ ID NO.3.
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9) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour la protéine SD' de Friend-MLV dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.2, un fragment ou un dérivé de celle-ci.
10) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour la protéine SD' de Friend-MLV dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO.3, un fragment ou un dérivé de celle-ci.
11) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour la protéine SD' de Friend-MLV.
12) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique est comprise entre les nucléotides situés aux positions 802 et 2388 de la séquence SEQ ID NO.1, un fragment ou un dérivé de celleci.
13) Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite séquence d'acide nucléique est comprise entre les nucléotides situés aux positions 1066 et 2388 de la séquence SEQ ID NO.1, un fragment ou un dérivé de celleci.
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14) Protéine SD' de MLV codée par une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications précédentes.
15) Un anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre une protéine selon la revendication 14.
16) Acide nucléique isolé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 constituant un vecteur pour transférer un gène dans une cellule hôte.
17) Vecteur pour la préparation de lignées d'encapsidation selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' d'un MLV défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 13, avec son codon d'initiation, une séquence d'encapsidation Psi en 5', et un signal d'arrêt de la transcription en 3' de ladite séquence codant une protéine SD'.
18) Vecteur selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce qu'il comprend en 5' de la séquence Psi un promoteur.
19) Vecteur selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le signal d'arrêt de la transcription est un site de polyadénylation comme une longue répétition terminale (LTR) de type U3RU5.
20) Vecteur selon l'une des revendications 17 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend des séquences d'intégration ATT dans des LTR en 5' et 3' de la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD'.
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21) Procédé de préparation d'une lignée d'encapsidation permettant la synthèse de particules virales et de virus portant un gène d'intérêt, mettant en #uvre un vecteur selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' est apportée soit en cis directement dans un vecteur portant le gène d'intérêt, soit en trans lors de l'élaboration d'une lignée d'encapsidation stable ou transitoire.
22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' est apportée par un vecteur selon l'une des revendications 16 à 20 en trans.
23) Procédé de préparation d'une lignée d'encapsidation stable selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend la transfection d'une lignée d'encapsidation stable exprimant les protéines gag, pol et env par (i) un vecteur comprenant la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' selon l'une des revendications 16 à 20 et (ii) un vecteur viral délété des séquences codant les protéines gag, pol et env, et portant le gène d'intérêt, une séquence Psi et de part et d'autre de ceux-ci une LTR.
24) Procédé de préparation d'une lignée d'encapsidation transitoire selon l'une des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend la transfection d'une lignée d'encapsidation transitoire par (i) un vecteur comprenant la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' selon l'une des revendications 16 à 20, (ii) un vecteur viral délété des séquences codant les protéines gag, pol et env, et
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portant le gène d'intérêt, une séquence Psi et de part et d'autre de ceux-ci une LTR, (iii) un vecteur exprimant les protéines gag et pol, et (iv) un vecteur exprimant la protéine env.
25) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' est apportée par un vecteur selon l'une des revendications 16 à 20 en cis.
26) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit vecteur est un vecteur bicistronique comprenant à la fois la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' et le gène d'intérêt.
27) Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que ledit vecteur est un vecteur viral tronqué comprenant dans le sens 5' vers 3' une LTR, une séquence d'encapsidation Psi, le gène d'intérêt avec son codon d'initiation, une séquence IRES, la séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' avec son codon d'initiation et une LTR.
28) Procédé de préparation d'une lignée d'encapsidation stable selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend la transfection d'une lignée d'encapsidation stable exprimant les protéines gag, pol et env par ledit vecteur bicistronique.
29) Procédé de préparation d'une lignée d'encapsidation transitoire selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend la transfection d'une lignée d'encapsidation transitoire
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par (i) ledit vecteur bicistronique, (ii) un vecteur exprimant les protéines gag et pol, et (iii) vecteur exprimant la protéine env.
30) Une lignée d'encapsidation obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 29 comprenant (i) une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' et (ii) un gène d'intérêt.
31) Une particule virale ou un virus produit par une lignée d'encapsidation selon la revendication 30 comprenant (i) une séquence d'acide nucléique codant une protéine SD' et (ii) un gène d'intérêt.
32) Une composition pharmaceutique comprenant une lignée d'encapsidation selon la revendication 30 ou des particules virales ou virus selon la revendication 31.
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Citations (2)
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| WO2001040488A1 (fr) * | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Novartis Ag | Expression transgenique accrue dans des vecteurs retroviraux possedant une region d'attachement sar |
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-
2003
- 2003-03-31 WO PCT/FR2003/000996 patent/WO2003085117A1/fr not_active Application Discontinuation
- 2003-03-31 AU AU2003259740A patent/AU2003259740A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
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| AU2003259740A8 (en) | 2003-10-20 |
| AU2003259740A1 (en) | 2003-10-20 |
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|---|---|---|---|
| TQ | Partial transmission of property | ||
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20051230 |