EP1573042A1 - Verfahren zur bestimmung des enzymatischen status humaner haut in vitro - Google Patents
Verfahren zur bestimmung des enzymatischen status humaner haut in vitroInfo
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- EP1573042A1 EP1573042A1 EP03782279A EP03782279A EP1573042A1 EP 1573042 A1 EP1573042 A1 EP 1573042A1 EP 03782279 A EP03782279 A EP 03782279A EP 03782279 A EP03782279 A EP 03782279A EP 1573042 A1 EP1573042 A1 EP 1573042A1
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
Definitions
- the present invention relates to a method for determining the enzymatic status of human skin in vitro, test kits for determining the enzymatic status of human skin and the use of enzymes for determining the enzymatic status of human skin, furthermore a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical Active substances for the treatment of human skin as well as a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances for the treatment of human skin and a method for the production of a cosmetic or pharmaceutical preparation for the treatment of human skin.
- the relationship between skin physiology and the enzymes on the skin surface is known. It is known, for example, that proteases are involved in desquamation of the skin, that lipases regulate the fat content of the skin and that sulfatases are related to body odor.
- the present invention is therefore based on the object of providing a way of largely reducing the enzyme status of human skin Avoiding the disadvantages of the prior art set out above.
- a method for determining the enzymatic status of human skin in vitro which is characterized in that a) an enzyme mixture is obtained from the stratum corneum of human skin, b) the enzyme mixture is added to a plurality of cavities in a segmented reaction vessel , c) provides each cavity with a sufficient amount of substrate for the enzyme to be examined in this cavity, d) determines for each cavity whether and, if necessary, how intensively the reaction of the enzyme to be examined in this cavity is taking place and from the combined information from all cavities determines the enzyme status.
- the method according to the invention enables the investigation of stratum corneum enzymes from authentic milieu, both with regard to the quality and in terms of the quantity of the enzymes.
- the implementation is easy. No special equipment is required to carry out the test, and no extraction is required.
- the different enzyme assays can and should be carried out in parallel in one test batch.
- the method according to the invention opens up a number of possible uses, for example the characterization of different skin types, e.g. the distinction of oily, dry, sensitive skin or combination skin from normal skin. An examination of pathological skin conditions is also possible (acne, neurodermatitis). It is also possible to follow the regulation of these identified differences through cosmetics in the course of a "treatment”.
- the enzyme mixture is preferably obtained in step a) by means of "tape stripping", ie by applying and tearing off an adhesive strip to or from the skin (Redoules D. et al. "Characterization and Assay of Five Enzymatic Activities in the Stratum Corneum Using Tape strippings "skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 1999; 12: 182-192. ; Beisson F. et al. "Use of Tape Stripping Technique for Directly Quantifying Esterases Activities in Human Stratum Corneum” Anal. Biochem. 2001 .; 290: 179-185.) And subsequent elution.
- the eluate obtained is used in enzyme assays that take into account the typical skin enzymes (lipase, sulfatase, glucuroniadase, phosaphatase, various proteases, etc.).
- the segmented reaction vessel used in step b) of the method according to the invention is preferably a commercially available microtiter plate.
- step b) it is particularly preferred to use an analysis chip with several functional levels for electrofocused spotting, as described in DE-A-101 02 063.5-52, to which reference is hereby made in full.
- This analysis chip advantageously makes it possible to focus and immobilize samples regardless of their viscosity with the aid of electrodes at defined points on the dot matrix (arrays).
- a tension field is created by a defined time factor and a defined amount of sample solution is drawn off. Due to the electrically conductive sensor surface at the bottom of the cavity, the entire sample solution is electrically focused on one point, always of the same size.
- the existing cavity means that there are no restrictions due to cross-contamination from neighboring spots.
- the samples can be stored moist, by covering the cavities, or dry.
- the substrates to be used in step c) of the method according to the invention can be selected by the person skilled in the art depending on the enzyme to be examined to be selected. Examples are those on the Internet at http://www.appliches.de/commun/biotabellen/09Enzymsub.html (as of December 17, 2002): Particularly preferred substrates are highly sensitive substrates that are easily accessible to optical detection, for example 4-methylumbelliferyl N-acetyl - ⁇ - D-galactosaminide; 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside; 4-methylumbelliferyl / j'-D-glucopyranoside; 4-methylumbelliferyl-? -D-glucuronide; 4-methylumbelliferyl phosphate, methylumbelliferyl palmitate,
- Methylumbelliferyl sulfate or 2 '- (Methylumbelliferyl) - ß -D-neuraminic acid Methylumbelliferyl sulfate or 2 '- (Methylumbelliferyl) - ß -D-neuraminic acid.
- inhibitors of the enzymes to be investigated are additionally used in step c) of the method according to the invention.
- Suitable inhibitors are selected, for example, from the inhibitors listed on the Internet at http://www.appliches.de/commun/biotabellen/08Enzyminhi.html (as of December 17, 2002).
- the mixture is preferably incubated at 37 ° C. and after a certain time can be buffered with a further buffer to pH 10.5 and the emitted fluorescence can be recorded with a fluorescence reader.
- the method according to the invention is suitable for determining an enzyme of the stratum corneum or several at the same time (phosphatase, lipase, sulfatase, glucuronidase, trypsin, chymotrypsin, elastase, various proteases, etc.) and thus determining the enzymatic status of the skin to be examined.
- an enzyme of the stratum corneum or several at the same time phosphatase, lipase, sulfatase, glucuronidase, trypsin, chymotrypsin, elastase, various proteases, etc.
- the method according to the invention enables the enzyme status of different skin areas of an individual or of different individuals to be compared with one another.
- the method advantageously allows normal values for a healthy enzyme status to be determined by screening a large number of skin-healthy individuals and the method is calibrated to these values.
- the enzyme status is preferably determined by means of the method according to the invention by examining the enzyme mixture obtained in step a) for the presence and optionally the intensity of the enzymatic reactions examined and assigning the enzyme mixture to healthy skin if it is has no or only slight deviations from the above-mentioned norm values, or assigns the enzyme mixture to diseased skin or skin in disturbed homeostasis if it shows significant deviations from the above-mentioned norm values.
- the method according to the invention can also be calibrated to normal values of a partially healthy individual.
- the normal values are then obtained by examining the healthy skin areas. This eliminates inter-individual differences in enzyme status.
- the enzyme status is preferably determined using the method according to the invention on the basis of about 1 to 50, in particular about 4 to 8, different enzymes.
- the present invention further provides a test kit for determining the enzymatic status of human skin in vitro, comprising means for carrying out the method according to the invention for determining the enzymatic status of human skin.
- the test kit according to the invention can comprise, for example, some adhesive strips, a microtiter plate, buffers and fluorescence-labeled, preferably highly sensitive, enzyme substrates.
- Another object of the present invention is a protein chip for determination to determine the enzymatic status of human skin in vitro, comprising i. a firm, d. H. rigid or flexible beams and ii. on this immobilized enzymes which were obtained from the stratum corneum as described above by means of step a) of the method according to the invention.
- a protein chip is a miniaturized functional element with proteins immobilized on a surface that can serve as specific interaction partners.
- protein chips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
- the base surfaces can also be formed, for example, by walls of one or more capillaries or by channels.
- the analysis chips mentioned in DE-A-100 28 257.1-52 and in DE-A-101 02 063.5-52 are particularly preferred for the production of small (up to about 500 probes) protein chips.
- the protein chip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 500, preferably approximately 1 to approximately 100, particularly preferably approximately 1 to approximately 50 and very particularly preferably approximately 4 to approximately 8 different probes.
- the probes which differ from one another, can each be present in duplicate on the chip.
- Another object of the present invention is the use of enzymes obtained from the stratum corneum as described above by means of step a) of the method according to the invention for determining the enzymatic status of human skin in vitro.
- Another object of the present invention is a test method for proving the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of human skin in vitro, characterized in that a) the enzymatic status of human skin is determined by a method according to the invention for determining the enzymatic status human skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or determined by means of a protein chip according to the invention, b) applying an active substance against diseases or impairments of the homeostasis of human skin to the skin one or more times, c) the skin status again human skin by a method according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or by means of a protein chip according to the invention, and d) the effectiveness of the active ingredient is determined by comparing the results from a) and c).
- Another object of the present invention is a test kit for detecting the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of human skin, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
- the present invention furthermore relates to the use of enzymes which were obtained from the stratum corneum as described above by means of step a) of the method according to the invention, for the detection of Efficacy of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of human skin, in particular against neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne, seborrhea, lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, skin cancer, skin sarcoma , Oily / dry facial skin ..
- Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of human skin in vitro, which is characterized in that a) the enzymatic status of human skin by an inventive method for determining the enzymatic status of human skin, or determined using a test kit according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or determined using a protein chip according to the invention, b) applying a potential active substance against diseases or impairments of the homeostasis of human skin to the skin one or more times, c) the enzymatic status of human skin by a method according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the enzymatic status of human skin, or by means of a Pr oteinchips determined, and d) active ingredients determined by comparing the results from a) and c).
- Another object of the present invention is the use of enzymes obtained from the stratum corneum as described above by means of step a) of the method according to the invention for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the homeostasis of human skin.
- Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against diseases or impairments of the homeostasis of human skin, characterized in that a) active ingredients with the aid of the screening method according to the invention, or the use for the identification of cosmetic or active pharmaceutical ingredients against diseases or impairments of the homeostasis of human skin and b) active ingredients found to be effective mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
- Example 1 Extraction of the enzymes from the stratum corneum
- 300 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 are added to 200 ⁇ l of a 10 mM methylumbelliferyl palmitate (from Bachern) in 500 ⁇ l 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0 and incubated at 37 ° C.
- 10 ⁇ l are taken from the batch, added to 190 ⁇ l 0.2 M NaHC0 3 solution pH 10.5, excited in the fluorescence reader at 360 nm and the emission measured at 460 nm.
- 300 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 are added to 200 ⁇ l of a 10 mM methylumbelliferyl- ⁇ -D-glucuronide (from Sigma) in 500 ⁇ l of 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0 and incubated at 37 ° C.
- 10 ⁇ l are taken from the batch, added to 190 ⁇ l 0.2 M NaHC0 3 solution pH 10.5, excited in the fluorescence reader at 360 nm and the emission measured at 460 nm.
- 300 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 become 200 ⁇ l of a 10 mM methylumbelliferyl phosphate (Sigma) solution in 500 ⁇ l 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0 added and incubated at 37 ° C.
- 10 ⁇ l are taken from the batch, added to 190 ⁇ l 0.2 M NaHC0 3 solution pH 10.5, excited in the fluorescence reader at 360 nm and the emission measured at 460 nm.
- 300 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 are added to 200 ⁇ l of a 10 mM methylumbelliferyl sulfate (from Sigma) in 500 ⁇ l 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0 and incubated at 37 ° C.
- 10 ⁇ l are taken from the batch, added to 190 ⁇ l 0.2 M NaHC0 3 solution pH 10.5, excited in the fluorescence reader at 360 nm and the emission measured at 460 nm.
- 300 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 are added to 200 ⁇ l of a 1 mM 2 ′ - (methylumbelliferyl) -DD-neuraminic acid (from Sigma) in 500 ⁇ l of 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 8.0 and incubated at 37 ° C. , To measure the substrate turnover, 10 ⁇ l are taken from the batch, added to 190 ⁇ l 0.2 M NaHC0 3 solution pH 10.5, excited in the fluorescence reader at 360 nm and the emission measured at 460 nm.
- Example 2 55 ⁇ l of the enzyme eluate obtained according to the description in Example 1 are added to 45 ⁇ l of a multifluorophore-casein solution (50 ⁇ g / ml). The fluorescence emission is monitored over 120 min (Ex / Em 485/520 nm).
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut sowie die Verwendung von Enzymen zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung humaner Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung humaner Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung humaner Haut.
Description
Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut sowie die Verwendung von Enzymen zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung humaner Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Behandlung humaner Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung humaner Haut.
Der Zusammenhang zwischen Hautphysiologie und den Enzymen auf der Hautoberfläche (Stratum corneum) ist bekannt. Man weiss z.B., dass bei der Abschuppung der Haut Proteasen involviert sind, daß Lipasen den Fettgehalt der Haut regulieren und daß Sulfatasen mit dem Körpergeruch zusammenhängen.
Bisher gibt es keine Möglichkeit den "Enzymstatus" einer Haut individuell oder in Typengruppen (fettig, schuppig, Akne) zu bestimmen. Bislang werden Wirkstoffen für Skin-care auf Wirkeffekte mit kommerziell erhältlichen Enzymen untersucht, die meist prokaryotischen Ursprungs sind. Dieses Screening berücksichtigt nicht die authentischen Enzyme der Haut, nicht die Spezifitäten der Enzyme, nicht deren Quantität und nicht die physiologische Beschaffenheit der Haut.
Wird für ein solches Screening ein in vivo Hautmodell genutzt, so ist eine höhere Durchsatzrate nicht gegeben, da die Verfügbarkeit begrenzt ist. Wird ein solches Screening an einem Probanden durchgeführt, so ist eine höhere Durchsatzrate ebenfalls nicht gegeben, darüberhinaus sind derartige Probandenexprimente ohne toxikologische Absicherung oft nicht zulässig.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit bereitzustellen, den Enzymstatus menschlicher Haut unter weitgehender
Vermeidung der oben ausgeführten Nachteile des Standes der Technik zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) Ein Enzymgemisch aus dem Stratum corneum menschlicher Haut gewinnt, b) das Enzymgemisch in eine Mehrzahl von Kavitäten eines segmentierten Reaktionsgefäßes gibt, c) jede Kavität mit einer ausreichenden Menge Substrat für das in dieser Kavität zu untersuchende Enzym versieht, d) für jede Kavität bestimmt, ob und gegebenenfalls wie intensiv die Reaktion des in dieser Kavität zu untersuchenden Enzyms abläuft und aus der kombinierten Information aus allen Kavitäten den Enzymstatus bestimmt.
Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Untersuchung von Enzymen des Stratum corneum aus authentischem Mileu, sowohl hinsichtlich der Qualität als auch in Bezug auf die Quantität der Enzyme. Im Gegensatz zu anderen Methoden ist die Durchführung einfach. Es ist weder eine spezielle Apparatur zur Durchführung des Tests, noch eine Extraktion erforderlich. Die verschiedenen Enzymassays können und sollen parallel in einem Testansatz durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet eine Reihe von Einsatzmöglichkeiten, beispielsweise die Charakterisierung verschiedener Hauttypen, z.B. die Unterscheidung fettiger, trockener, empfindlicher Haut bzw. Mischhaut von normaler Haut. Auch eine Untersuchung pathologischer Hautzustände ist möglich (Akne, Neurodermitis). Möglich ist auch, die Regulierung dieser festgestellten Unterschiede durch Kosmetika im Verlauf einer "Behandlung" zu verfolgen.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) das Enzymgemisch mittels "Tape Stripping", d. h. durch Aufbringen und Abreißen eines Klebestreifens auf die Haut bzw. von der Haut (Redoules D. et al. "Charactersisation and Assay of five Enzymatic Activities in the Stratum corneum using Tape Strippings" Skin
Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 1999; 12: 182-192. ; Beisson F. et al. "Use of Tape Stripping Technique for Directly Quantifying Esterases Activities in Human Stratum Corneum" Anal. Biochem. 2001.; 290: 179-185.) und nachfolgende Eluierung. Das gewonnen Eluat wird in Enzymassays eingesetzt, die die typischen Hautenzyme (Lipase, Sulfatase, Glucuroniadase, Phosaphatase, div. Proteasen, etc.) berücksichtigen.
Das in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommende segmentierte Reaktionsgefäß ist bevorzugtermaßen eine handelsübliche Mikrotiterplatte. Besonders bevorzugt verwendet man in Schritt b) einen Analysechip mit mehreren funktionalen Ebenen für elektrofokussiertes Spotten, wie in der DE-A-101 02 063.5-52 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Dieser Analysechip ermöglicht es vorteilhafterweise, Proben unabhängig von ihrer Viskosität mit Hilfe von Elektroden an definierten Punkten des Punktrasters (Arrays) zu fokussieren und zu immobilisieren.
Durch die Fokussierfähigkeit erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung der lokalen Konzentration der Proben und so eine höhere Spezifität. Während der Analyse selbst besteht die Möglichkeit das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren. So kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen Sensitivität aufgespürt werden.
Unabhängig von der Viskosität der Lösung, wird durch einen festgelegten Zeitfaktor ein Spannungsfeld angelegt und dadurch eine definierte Menge an Probenlösung abgezogen. Durch die elektrisch leitfähige Sensorfläche am Boden der Kavität wird die gesamte Probenlösung auf einen Punkt, mit immer der gleichen Größe, elektrisch fokussiert.
Durch die vorhandene Kavität gibt es keine Einschränkungen aufgrund von Kreuzkontaminationen durch benachbarte Spots. Die Proben können feucht, durch Abdecken der Kavitäten, oder trocken gelagert werden.
Die in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens einzusetzenden Substrate können durch den Fachmann in Abhängigkeit von dem zu untersuchenden Enzym
ausgewählt werden. Beispielhaft seien die im Internet unter http://www.applichem.de/produkte/biotabellen/09Enzymsub.html (Stand: 17. Dezember 2002) genannt: Besonders bevorzugte Substrate sind hochsensitive und der optischen Detektion leicht zugängliche Substrate, beispielsweise 4- Methylumbelliferyl-N-acetyl-^-D-galactosaminid; 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galacto- pyranosid; 4-Methylumbelliferyl-/j'-D-glucopyranosid; 4-Methylumbelliferyl- ?-D- glucuronid; 4-Methylumbelliferyl-phosphat, Methylumbelliferylpalmitat,
Methylumbelliferylsulfat oder 2'-(Methylumbelliferyl)- ß -D-neuraminsäure.
Gewünschtenfalls setzt man in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens zusätzlich Inhibitoren der zu untersuchenden Enzyme ein. Geeignete Inhibitoren sind beispielsweise ausgewählt unter den im Internet unter http://www.applichem.de/produkte/biotabellen/08Enzyminhi.html (Stand: 17. Dezember 2002) aufgelisteten Inhibitoren.
Der Ansatz wird vorzugsweise bei 37°C inkubiert und kann nach einer gewissen Zeit mit einem weiteren Puffer auf pH 10,5 umgepuffert werden und die emittierte Fluoreszenz kann mit einem Fluoreszenzreader aufgenommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, ein Enzym des Stratum corneum oder mehrere zugleich (Phosphatase, Lipase, Sulfatase, Glucuronidase, Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, diverse Proteasen, etc.) zu bestimmen und damit den enzymatischen Status der zu untersuchenden Haut festzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den Vergleich des Enzymstatus verschiedener Hautareale eines Individuums oder verschiedener Individuen miteinander. Das Verfahren erlaubt vorteilhafterweise durch Screening einer großen Zahl hautgesunder Individuen Normwerte für einen gesunden Enzymstatus zu ermitteln und das Verfahren auf diese Werte zu eichen.
Den Enzymstatus bestimmt man mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise, indem man das in Schritt a) gewonnene Enzymgemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Intensität der untersuchten enzymatischen Reaktionen untersucht und das Enzymgemisch gesunder Haut zuordnet, wenn es
keine oder nur geringe Abweichungen von den oben genannten Normwerten aufweist, oder das Enzymgemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es erhebliche Abweichungen von den obengenannten Normwerten aufweist.
In analoger Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch auf Normwerte eines partiell hautgesunden Individuums geeicht werden. Die Normwerte werden dann durch Untersuchung der gesunden Hautareale gewonnen. Hierdurch werden interindividuelle Unterschiede im Enzymstatus ausgeschlossen.
Vorzugsweise bestimmt man mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens den Enzymstatus anhand von etwa 1 bis 50, insbesondere etwa 4 bis 8 unterschiedlichen Enzymen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut. Das erfindungsgemäße Test-Kit kann beispielsweise einige Klebestreifen, eine Mikrotiterplatte, Puffer und fluoreszenzmarkierte, vorzugsweise hochsensitive Enzymsubstrate umfassen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Proteinchip zur Bestimmung zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Enzyme, die wie oben beschrieben, mittels Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Stratum corneum gewonnen wurden.
Bei einem Proteinchip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Proteinen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von Proteinen auf einem Chip
angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Im allgemeinen haben Proteinchips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie, die teilweise auf die Protein-Chiptechnologie übertragen werden können, liefern die Bücher "DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Für die Herstellung kleiner (bis etwa 500 Sonden umfassender) Proteinchips sind die in der DE-A-100 28 257.1-52 und in der DE-A-101 02 063.5-52 genannten Analysechips ganz besonders bevorzugt.
Der erfindungsgemäße Proteinchip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100, besonders bevorzugt etwa 1 bis etwa 50 und ganz besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa 8 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Proteinchips bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Proteinchips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zum Nachweis der
Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut, insbesondere gegen Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin, Vitiligo, Acne, Fettige / trockene Gesichthaut..
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Proteinchips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Proteinchips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Enzymen, die wie oben beschrieben, mittels Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiele
Beispiel 1 : Gewinnung der Enzyme aus dem Stratum corneum
Es werden nacheinander 10 Stripes von 10 cm Länge eines transparenten farblosen Tesafilms (Fa. Beiersdorf) auf die zu untersuchende Hautstelle aufgeklebt, fünfmal mit einer Rolle darüber gerollt und wieder abgezogen. Die Stripes werden in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 incl. 0.1% TritonX100 aufgenommen und 4 mal 5 min mit Ultraschall behandelt. Die Tapes werden anschließend verworfen und das die Hautenzyme enthaltene Eluat mit einem Miniplus Concentrator (YM10 Membran) um den Faktor 10 aufkonzentriert.
Beispiel 2: Durchführung des Lipaseassay
300 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10 mM Methylumbelliferylpalmitat (Fa. Bachern) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen, zu 190 μl 0.2 M NaHC03-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
Beispiel 3: Durchführung des Glucuronidaseassay
300 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10 mM Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen, zu 190 μl 0.2 M NaHC03-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
Beispiel 4: Durchführung des Phosphataseassay
300 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10 mM Methylumbelliferylphosphat (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl
0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen, zu 190 μl 0.2 M NaHC03-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
Beispiel 5: Durchführung des Sulfataseassay
300 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 10 mM Methylumbelliferylsulfat (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen, zu 190 μl 0.2 M NaHC03-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
Beispiel 6: Durchführung des Neuraminidaseassay
300 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 200 μl einer 1 mM 2'-(Methylumbelliferyl)-D-D-neuraminsäure (Fa. Sigma) Lösung in 500 μl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0 gegeben und bei 37°C inkubiert. Zur Messung des Substratumsatzes werden 10 μl aus dem Ansatz entnommen, zu 190 μl 0.2 M NaHC03-Lösung pH 10.5 gegeben, im Fluoreszenzreader bei 360 nm angeregt und die Emission bei 460 nm gemessen.
Beispiel 7: Durchführung des Proteaseassays
55 μl des nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnenen Enzymeluats werden zu 45 μl einer Multifluorophor-Casein-Lösung (50 μg/ml) gegeben. Die Fluoreszenzemission wird über 120 min verfolgt (Ex/Em 485/520 nm).
Claims
1. Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a. Ein Enzymgemisch aus dem Stratum corneum menschlicher Haut gewinnt, b. das Enzymgemisch in eine Mehrzahl von Kavitäten eines segmentierten Reaktionsgefäßes gibt, c. jede Kavität mit einer ausreichenden Menge Substrat für das in dieser Kavität zu untersuchende Enzym versieht, d. für jede Kavität bestimmt, ob und gegebenenfalls wie intensiv die Reaktion des in dieser Kavität zu untersuchenden Enzyms abläuft und aus der kombinierten Information aus allen Kavitäten den Enzymstatus bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Enzymgemisch mittels durch Aufbringen und Abreißen eines Klebestreifens auf die Haut bzw. von der Haut und nachfolgende Eluierung gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) als segmentiertes Reaktionsgefäß eine handelsübliche Mikrotiterplatte oder vorzugsweise einen Analysechip mit mehreren funktionalen Ebenen für elektrofokussiertes Spotten, wie in der DE-A-101 02 063.5-52 beschrieben, einsetzt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt c) Substrate einsetzt, die ausgewählt sind unter 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-yS-D-galactosaminid; 4-Methylumbelliferyl- 5'- D-galactopyranosid; 4-Methylumbelliferyl- ?-D-glucopyranosid; 4-Methylumbelli- feryl-yS-D-glucuronid; 4-Methylumbelliferyl-phosphat, Methylumbelliferylpalmitat, Methylumbelliferylsulfat oder 2'-(Methylumbelliferyl)- ß -D-neuraminsäure.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Schritt a) gewonnene Enzymgemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Intensität der untersuchten enzymatischen Reaktionen untersucht und das Enzymgemisch gesunder Haut zuordnet, wenn es keine oder nur geringe Abweichungen von den oben genannten Normwerten aufweist, oder das Enzymgemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es erhebliche Abweichungen von den obengenannten Normwerten aufweist.
6. Test-Kit zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut.
7. Test-Kit nach Anspruch 6, umfassend Klebestreifen, eine Mikrotiterplatte, Puffer und fluoreszenzmarkierte, vorzugsweise hochsensitive Enzymsubstrate.
8. Proteinchip zur Bestimmung zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Enzyme, die mittels Schritt a) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aus dem Stratum corneum gewonnen wurden.
9. Proteinchip nach Anspruch 8, umfassend etwa 1 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100, besonders bevorzugt etwa 1 bis etwa 50 und ganz besonders bevorzugt etwa 4 bis etwa 8 voneinander verschiedene Sonden.
10.Verwendung von Enzymen, die mittels Schritt a) des Verfahrens aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Bestimmung des enzymatischen Status humaner Haut in vitro.
11. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 6 oder 7, oder mittels eines Proteinchips nach Anspruch 8 oder 9 bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den enzymatischen Status humaner Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 6 oder 7, oder mittels eines Proteinchips nach Anspruch 8 oder 9 bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
12. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut, umfassend Mittel zur Durchführung des Testverfahrens nach Anspruch 11.
13. Verwendung von Enzymen, die mittels Schritt a) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut.
14. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 6 oder 7, oder mittels eines Proteinchips nach Anspruch 8 oder 9 bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) den enzymatischen Status humaner Haut durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 6 oder 7, oder mittels eines Proteinchips nach Anspruch 8 oder 9 bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
15. Verwendung von Enzymen, die mittels Schritt a) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aus dem Stratum corneum gewonnen wurden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut.
16. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Homeostase humaner Haut, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 6 oder 7, oder mittels eines Proteinchips nach Anspruch 8 oder 9 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägem vermischt.
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