EP1504251A1 - Vorrichtung und verfahren zur untersuchung chemischer und/oder biologischer proben - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur untersuchung chemischer und/oder biologischer proben

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Publication number
EP1504251A1
EP1504251A1 EP03752743A EP03752743A EP1504251A1 EP 1504251 A1 EP1504251 A1 EP 1504251A1 EP 03752743 A EP03752743 A EP 03752743A EP 03752743 A EP03752743 A EP 03752743A EP 1504251 A1 EP1504251 A1 EP 1504251A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
line
illumination
detector
detection device
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03752743A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Roland Stange
Jürgen Müller
Achim Kirsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Original Assignee
Evotec OAI AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evotec OAI AG filed Critical Evotec OAI AG
Publication of EP1504251A1 publication Critical patent/EP1504251A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • G—PHYSICS
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/082—Condensers for incident illumination only
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/063—Illuminating optical parts
    • G01N2201/0631—Homogeneising elements

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for examining chemical and / or biological samples, in particular in suspension, with the aid of luminescence spectroscopy.
  • samples for example cells, beads, vesicles, aggregates, DNA strands and the like. contain, excited with electromagnetic radiation, in particular light, and the radiation emitted due to luminescence is detected.
  • the particles are particularly marked with luminescent dye markers.
  • Dye markers of this type emit radiation of different wavelength ranges as a function of their binding to a particle and as a function of the type of particle to which they are connected. For example, these are receptor-ligand compounds.
  • ligands labeled with a dye marker are used here.
  • Luminescence spectroscopy is used in particular in pharmaceutical drug research. This is preferably done in high-throughput.
  • Medium-throughput screening ⁇ plants where a large number of samples are examined in a short time. Often, there are over 1000 per hour Samples examined.
  • titer plates with a large number of wells are used for this purpose. Typical titer plates have 1536 or 2080 wells.
  • the samples are small samples of sometimes only a few microliters per sample. In particular, the sample amounts are less than 50 ⁇ l, preferably less than 10 ⁇ l per well.
  • a suitable method for measuring the luminescence intensity distribution is described, for example, in WO 98/16814.
  • characteristic features such as existing bonds between molecules, concentration ratios and the number of specific particles in the solution can be determined from a heterogeneous brightness distribution of a sample.
  • a confocal microscope is used to carry out this method, which creates a point-like focus within the sample.
  • the focus is generated by an illumination device, in particular a laser.
  • Particles within the point focus, in particular dye markers are excited to luminescence by the radiation.
  • the luminescence radiation emitted by the sample is detected by a detection device.
  • the number of luminescence photons is detected in a time interval of a defined length.
  • a function of the specific brightness distribution is then calculated from this by the number of photons per time interval.
  • good measurement results with regard to the reaction of fluorescence-marked particles, for example molecules can be achieved.
  • this measuring method it is only possible with long measuring times to obtain meaningful statistics, for example on the respective number of individual different particles in the sample. Since the shortest possible measurement times have to be realized in particular in the case of high-throughput screening methods for operating such a system, such statistical analyzes are not economically possible with the method described in WO98 / 16814 and the device described.
  • a device for generating an image of a sample is known from US Pat. No. 6,025,601.
  • the sample To generate the image, the sample must be immobilized on a sample holder, for example a conventional glass slide. ' The sample holder is clamped in a sample table. The sample is illuminated line by line with the aid of an illumination device. The individual lines of the line illumination are recorded one after the other by a detection device and are combined to form an image with the aid of a computer. Since this is to be used to generate an image of a sample, an autofocus mechanism is also required in order to maintain a correct scan height.
  • the method which can be carried out with the aid of the device described in US Pat. No. 6,025,601 is particularly disadvantageous since time-consuming and cost-intensive immobilization of the sample is absolutely necessary. Since the image is built up line by line, the examination of a sample is extremely time-consuming. Such an examination method is not suitable for screening, especially high-throughput screening.
  • EP 0 501 008 describes a so-called imaging flow cytometer.
  • This device has a flow cell through which the sample liquid is moved at a high flow rate. The flowing sample is exposed to pulsed laser light or strobe lamps. To avoid smearing or blurring the image, very short exposure times are required.
  • flow cytometers it is in particular only possible with complex image processing to examine samples which have particles of different sizes.
  • Flow cytometers also have the disadvantage that due to the large-area detection, only a slight suppression of the background radiation is possible.
  • this device is not suitable for examining small particles such as micro and nanoparticles, since it is not possible to distinguish between individual small particles. Furthermore, small particles that are inside or on larger particles cannot be detected with this device.
  • Imaging flow cytometers usually have a point-measuring detector, so that the detector detects and integrates the entire fluorescence of the radiation emitted by the detected particles by this one detector device.
  • the object of the invention is to provide a method and a device for examining chemical and / or biological samples with the aid of luminescence spectroscopy, with which or with which samples having particles of different sizes and / or brightness can be examined. In particular, short examination times and meaningful statistics should be achievable.
  • the object is achieved according to the invention by a method according to claim 1 or by a device according to claim 7.
  • the device according to the invention has a sample holder, which, for example, holds a liquid sample.
  • the sample is particularly in suspension.
  • the sample is illuminated with the aid of an illuminating device, the illuminating device being designed such that it excites the particles contained in the sample to luminescence.
  • the device has an optical device.
  • the optical device is designed such that linear illumination is generated in the sample.
  • the radiation emitted by the sample along this line is detected with the aid of a detection device.
  • the detection device has a plurality of individual detectors. The detection device is connected to an evaluation device for the static evaluation of the radiation detected by the detection device.
  • the detection device is preferably a CCD camera, the individual pixels or pixel groups of the CCD camera being one Form single detector.
  • the radiation perceived by the individual detectors is converted into an electrical signal and transmitted to the evaluation device.
  • the device according to the invention thus performs a highly parallelized processing or evaluation of the radiation perceived by a large number of individual detectors.
  • linear illumination of a liquid sample enables highly parallelized detection of particles in the sample.
  • a considerably larger part of particles is excited to luminescence by a line-shaped illumination. Since this is recorded according to the invention by a detection device with a plurality of individual detectors which carries out a linear detection, a large amount of information can be detected in short examination periods.
  • a detection device with a plurality of individual detectors which carries out a linear detection, a large amount of information can be detected in short examination periods.
  • CCD sensors in which the individual pixel or pixel areas form the individual detectors
  • a very high number of parallelized detections can be carried out.
  • more than 200, preferably more than 500 and particularly preferably more than 1000 measurements can be carried out simultaneously.
  • the individual exposure time is preferably 5 to 100 ms. This means that such an individual detector can be re-detected after only 5 to 100 ms.
  • samples that have particles of different sizes can each be examined in short examination times, wherein particles of different sizes can be examined at the same time.
  • the particles can range from individual molecules to particles with a diameter of a few 100 ⁇ m. Because of the linear illumination, the particles can also diffuse at very low speeds and / or Sample solutions with high viscosity good measurement results can be achieved with short measurement times.
  • CCD detectors with 576 pixels per line are preferably used, each pixel serving in particular as an individual detector and being read out individually. 576 parallel measurements are thus carried out simultaneously.
  • CCD detectors that have 2048 or even 4096 pixels per line are also possible.
  • the individual pixel lengths or widths in the case of preferably used CCD detectors are at most 30 ⁇ m, preferably at most 20 ⁇ m.
  • the device according to the invention makes it possible to obtain structural information about the particles.
  • the linear illumination makes it possible, for example, to obtain information about individual cell areas.
  • the device according to the invention has a high sensitivity, so that even weak luminescence signals can be detected. This is particularly advantageous when analyzing specific cell information.
  • Another advantage of the device according to the invention is that immobilization of the particles on a glass carrier or the like is not necessary, since the device according to the invention is used for statistical evaluation of the detected luminescence signals from particles in suspension and no image of the sample is generated. Due to the linear lighting, a sufficient number of particles is obtained through the measurement volume, i.e. the area of the sample excited by the linear illumination.
  • Good statistics can be achieved by using the device according to the invention.
  • Good, ie meaningful statistics are available, for example, in comparison to confocal measurement methods.
  • confocal Measurement methods have a single focus that has very small dimensions, so that typically only a single particle can be observed in focus at the same time. Typical measuring times are 100 ⁇ s to 1 ms per particle. This results in total measuring times of 1 to 100 s.
  • a line is illuminated, which is preferably imaged on a line of a CCD detector with, for example, 576, 1280 or more pixels.
  • a linear illumination has the advantage over a spot illumination that the particles in the sample are excited to luminescence in a larger area and in particular at the same time.
  • Linear illumination is therefore a highly parallelized measurement focus.
  • the device according to the invention has the particular advantage that it is a simply constructed device. This leads to greater operational reliability than with known devices. In particular when measuring suspensions, the device has the advantage that a smaller amount of data has to be processed.
  • the optical device of the device according to the invention preferably has at least one cylindrical lens for generating the linear illumination. Because the intensity distribution of the radiation, in particular in a laser beam If a single cylindrical lens is provided, the intensity distribution in the longitudinal direction of the illumination line is also Gaussian. It is therefore preferred to use only the middle region of a line generated, in which a high radiation intensity is guaranteed. According to the invention, the device therefore preferably has a limiting device which limits the length of the illumination line. The edge areas on the generated lighting line, which have a low intensity, are thus cut off. For example, an aperture is suitable as a limiting device. As a result, the illumination line generated in the sample is homogenized in its longitudinal direction.
  • Such homogenization can also be achieved with a so-called line generator lens or a power lens.
  • the illumination line it is also possible to provide a plurality of cylindrical lenses in the optical device. These cylindrical lenses are preferably arranged next to one another so that they produce a common line of illumination. The distance between the individual cylindrical lenses is preferably selected such that regions generated by the individual cylindrical lenses overlap with a low intensity. As a result, an illumination line can be generated which has a homogenized high intensity in the longitudinal direction.
  • an illumination line that is as homogeneous as possible
  • a homogeneous lighting line is thus generated on the side of the slit diaphragm facing away from the lighting device.
  • optical fibers are provided, the fiber ends of which are arranged along a line.
  • several rows of optical fibers can be arranged side by side. This increases the width of the lighting line. However, this can be reduced again to the required width by means of downstream lenses. Radiation of the desired wavelength is coupled into the optical fibers with the aid of the illumination device.
  • the detection device is designed as a confocal detection device.
  • the detection device preferably has a slit diaphragm in the direction of the beam path in front of a detector. The position and dimensions of the slit diaphragm are adapted to the illumination line in the sample.
  • detectors that can count individual photons. This is, for example, an APD line array.
  • a line detector (APD line array, CCD line camera) can be provided.
  • a confocal structure of the detection device is realized by a CCD line camera.
  • a CCD line scan camera a CCD area scan camera can also be used, the pixels of which can be read out individually or line by line. This makes it possible to read out only one line of the CCD area camera, so that a confocal construction of the detection device is also realized by the CCD area camera. It is also possible to combine individual lines, for example two lines, into one line. This is possible through software as well as hardware.
  • the illumination device is preferably designed in such a way that it generates radiation for luminescence excitation in several wavelength ranges, typically in the range of 300-900 nm.
  • the individual luminescence wavelength ranges are preferably divided in the detection device.
  • the detection device can have an optical device which is independent of the optical device, by means of which linear illumination of the sample is caused.
  • at least parts of the optical device provided for generating the line illumination are preferably also used for the optical device to be assigned to the detection device.
  • the detection device preferably has a spectrograph. This breaks down the radiation emitted by the sample into spectral components, so that the luminescence radiation can be recorded independently of each spectral component. This has the advantage that a large number of measurement results can be achieved by a single excitation of the sample. It is therefore not necessary to illuminate the sample with radiation of different wavelength ranges at intervals. This significantly increases throughput, particularly in high-throughput screening plants.
  • a CCD area camera is preferably provided for the detection of the different luminescence wavelength ranges.
  • the individual wavelength ranges are split up by suitable optical elements, so that different, in particular parallel lines are generated for each wavelength range on the CCD area scan camera.
  • the individual lines of the CCD area camera, on each of which a spectral line is shown, can be read independently of one another. As a result, the detection of measurement data in different wavelength ranges is implemented in a simple manner.
  • the detection device preferably has at least one dichroic beam splitter or partially transparent mirror.
  • Another possibility for spectrally decomposing the radiation emitted by the sample is to provide a curved grating.
  • the at least one dichroic beam splitter and / or the curved grating is then assigned either a detector per wavelength range or, as described above, a CCD area scan camera, in which several lines can be read independently of one another.
  • the detection device preferably has two polarizing filters and a beam splitter, by means of which the differently polarized radiation emitted by the sample is divided into different polarization ranges.
  • a polarization beam splitter is preferably provided in the beam path, which splits the luminescence radiation into the two polarization directions.
  • a CCD area detector can be used to detect the radiation.
  • the evaluation device connected to the detection device evaluates the one emitted by the sample and detected by the detection device Radiation statistically.
  • the sample is preferably illuminated continuously.
  • the detectors that are preferably used, in particular CCD detectors, have a short exposure time.
  • the line exposure is preferably in the range from 16 ⁇ s to 100 ⁇ s.
  • slower line scan cameras can also be used, since these cameras can be read out after exposure if there are dead times.
  • a surface camera or a surface detector is used in special evaluation methods such as FCS (fluorescence correlation spectroscopy).
  • the evaluation device preferably distributes the intensity of different radiations emitted by the sample. It can thus be determined, for example, which particles occur how often in the sample and / or which bonds of the particles occur how often.
  • correlation methods and histograms can also be carried out in a preferred embodiment of the evaluation device. It is thus possible with the aid of the device according to the invention to obtain a large amount of information about the particles present in the sample in a short time. For example, the number or concentration of specific particles and their binding relationships can be examined with the aid of intensity distributions, anisotropy analyzes or moment analyzes (for example FIDA, FIMDA, C-Mafid).
  • the temporal correlation of the particles can be evaluated across the illumination line, for example.
  • a temporal correlation of the particles along the line can also be measured.
  • the diffusion rate of individual particles can be determined from this.
  • the spatial correlation can take place along a data line, for example in order to obtain structural data information about these particles.
  • the evaluation of the spatial correlation provides, for example, the correlation length as a result.
  • Additional information about the particles can be obtained via fluorescence lifetime measurements.
  • the fluorescence lifetime measurement can be carried out with a further preferred embodiment of the device according to the invention.
  • the sample is excited with pulsed laser light.
  • the detector is synchronized with the laser pulse.
  • the use of avalanche photodiode (APD) arrays is particularly advantageous since the synchronization with these can be carried out directly.
  • the device according to the invention has a movement device in order to realize a relative movement between the particles present in the sample and the illumination line.
  • a movement device makes it possible to obtain good measurement data even with particles with very little or no diffusion speed. It is not necessary to extend the measuring times. This prevents destruction of the particles or dye markers due to long exposure times.
  • the relative movement between sample particles and the illumination line can be realized, for example, by a tilting mirror provided in the optics device, which serves as a movement device for moving the illumination line. It is also possible to or the like the sample carrier with the help of a scanning table. in addition to or instead of moving the lighting line. Flow cells in which the sample flows can also be used. Another option is to use treadmills to move the sample holder.
  • the treadmills are made, for example, of transparent plastic with an optical quality.
  • the sample is preferably introduced into the treadmills in a previous work step, for example by vapor deposition. It is also possible for indentations, for example wells of a titer plate, to be introduced, for example punched, into the plastic band and then sealed with a film. If, for example, the wells have a volume of less than 10 ⁇ l, a drop can no longer because of the surface tension run out of the well even if the treadmill is wound up before the measurement.
  • stirring devices can be provided, for example, which cause the sample liquid to move.
  • the particles can also be moved within the sample holder by applying electrostatic or magnetic fields from the outside and by providing micro stirrers.
  • the device according to the invention and the measurement method that can be carried out with it have the advantage that the flow velocities in the sample or the relative movement between the illumination line and the particles of the sample do not have to be synchronized with the data acquisition.
  • the decisive factor for obtaining good statistics is rather the short measuring time in the method according to the invention.
  • the device according to the invention preferably has a control device for controlling exposure cycles.
  • the exposure cycles can take place at regular or irregular intervals.
  • the exposure time can be controlled by the control device.
  • the control unit preferably only specifies the exposure time of the detector and the read cycle. If, as described above, several lines are exposed in succession and only then read out, the control unit additionally specifies the vertical dock speed. Possibly. the control unit controls the scanning table and / or a stirring device and / or a galvo scanner.
  • the device according to the invention is suitable for high-throughput screening systems.
  • the samples are preferably arranged in titter plates with a large number of wells. Such titter plates have, for example, 1536 or 2080 depressions.
  • the amount of sample provided in each well is in particular less than 10 ⁇ l, preferably less than 5 ⁇ l.
  • the illumination line arranged in such a well preferably has a length of 500-1000 ⁇ m and a width of approximately 1-2 ⁇ m.
  • the invention further relates to a method for examining chemical and / or biological samples, in particular in suspensions, with the aid of luminescence spectroscopy.
  • a linear illumination of the sample which is preferably in suspension, takes place by means of an illumination device.
  • the radiation emitted by the sample along a line is detected in the next step, in particular by means of a detection device which has a plurality of individual detectors.
  • spatially separated subregions of the linear radiation are thus recorded by individual detectors.
  • the radiation received is converted into electrical signals by the individual detectors.
  • the signals emitted by the individual detectors are then processed or evaluated in parallel. This creates a highly parallelized evaluation method.
  • a large number of measurements are thus carried out in parallel or simultaneously. This is done, for example, by taking several measurements side by side in a row. respectively.
  • the linear illumination of the sample corresponds to a large number of individual measuring points arranged next to one another. In particular when using the device described above, each of these measuring points is in one focus.
  • a confocal aperture in the detection beam path in particular one Slit diaphragm or a slit-shaped detector, also in the direction of the optical axis, a spatial limitation of the measurement volumes achieved.
  • the invention it is also possible to carry out evaluations between a plurality of measurement value sequences, which are recorded, for example, in spatially adjacent measurement volumes. This is particularly advantageous for fluctuation measurements and allows, for example, the analysis of spatial correlations within the examined samples.
  • the duration of a measurement is preferably less than 10 ms and particularly preferably less than 1 ms.
  • the individual measurements preferably follow one another directly without a time interval. There may be a time interval between the individual measurements. In this case, poorer statistics of the measurement signals are accepted for a given total measurement period; however, the technical implementation can be simplified for certain types of detectors. This can be done in particular by using the device described above, in particular using CCD detectors with very short readout times.
  • the method according to the invention is, in particular, advantageously further developed, as described above with reference to the device according to the invention.
  • the individual detectors are read out rapidly, with individual pixels or pixel groups of a CCD detector, in particular an avalanche photodiode, preferably being used as individual detectors.
  • FIG. 1 shows a schematic basic illustration of a first embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 2 shows a schematic basic illustration of a second embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a further embodiment of the detection device according to the invention
  • FIG. 4 shows a schematic basic illustration in side view of a lighting device according to the invention.
  • Fig. 5 is a schematic basic illustration of the lighting device shown in Fig. 4 in plan view.
  • FIG. 1 The basic arrangement of the individual elements of the device according to the invention shown in FIG. 1 is greatly simplified and contains only that essential components of the device.
  • a line 14 is generated in an image plane 12 on the illumination side.
  • Line 14 is directed in the direction of an optical device 18 via a dichroic beam splitter or a partially transparent mirror 16.
  • a linear illumination 20 is generated in a sample 22 with the aid of the optical device 18.
  • the sample 22 is arranged in a titer plate 26 having a plurality of wells 24.
  • the illumination line is arranged within the sample 22 such that the edges of the wells 24 are preferably not touched.
  • the illumination line is arranged opposite a transparent base plate 28, for example made of glass, in such a way that the base plate 28 is not touched by the illumination line 20 either. In this way, negative influences of the base plate 28 and / or the walls of the wells 24 'are excluded.
  • the optical device 18 serves not only to image the radiation generated by the illumination device 10 in the sample 22, but also to direct the luminescent radiation emitted by the particles present in the sample in the direction of a detection device 30 ,
  • the radiation emitted by the sample is not deflected by the dichroic beam splitter.
  • a line 32 is imaged on the detector device 30, which is, for example, a CCD line camera. If the detector device 30 is not a CCD line camera, a slit diaphragm can be provided in the beam path in front of the detector 30 in order to image the line 32.
  • the camera line itself represents the aperture of a confocal structure.
  • the measurement signals occurring in the individual pixels of the CCD line camera are transmitted from the detection device 30 to the evaluation device 36 via a line 34 or more lines.
  • the evaluation device 36 is used for a static evaluation, for example with regard to the intensity distribution.
  • the expansion device 36 which is preferably a computer, can also be used to control the lighting device 10 and possibly other components to be controlled provided in the device according to the invention.
  • an optical device 18 which is used both for imaging the illumination line 20 generated by the lighting device 10 in the sample 22 and for imaging the luminescent radiation onto the detection device 30
  • two separate optical devices can also be provided.
  • the imaging of the illumination line 20 into the sample 22 is realized with the aid of one optical device and the imaging of the luminescent radiation onto the detection device 30 with the other illumination device.
  • the illumination of the sample 22 can take place from the opposite side of the sample carrier 26 with respect to FIG .
  • the protrusion of two separate optical devices has the advantage that they can be better matched to the illumination wavelength and the luminescence wavelength, for example. However, this is a more expensive device because two separate optical units are required.
  • Laser excitation is particularly suitable for excitation of the particles or luminescence markers in the sample 22.
  • a diffraction-limited illumination line 20 can be realized within the sample 22. This enables high resolution and good suppression of the background radiation to be achieved.
  • Optical devices with a numerical aperture which is higher than 0.7, in particular higher than 0.9, are preferably used in the invention. For example, very good measurement results are achieved with a 20x lens with a numerical aperture of 0.7 or a 40x lens with a numerical aperture of 0.95.
  • the imaging optical device is, for example, a typical microscope structure in which a lens and a tube lens are combined.
  • the lighting device has fiber-coupled lasers 15.
  • the structure of the lighting device in connection with the optics 38, which have lenses 70-76, corresponds to the structure described with reference to FIG. 4.
  • the beams are bundled with the aid of an optical system 38 and in turn generate a line 14 in the image plane 12 on the illumination side - shown as a dot in FIG. 2.
  • the optical system 38 is here a component of the optical device 18, which in the exemplary embodiment shown is an objective 40 and a tube lens 42 in order to image the illumination line 20 in the sample 22.
  • the lighting device is also constructed such that it generates laser light in different wavelength ranges in lasers, not shown, which then emerges divergently from the fiber end 15.
  • different dye markers contained in the sample 22 are simultaneously excited to luminescence.
  • the radiation emitted by the particles present in the sample 22 is transmitted through the dichroic beam splitter.
  • the dichroic beam splitter 16 in accordance with the beam splitter 16 shown in FIG. 1, in turn has the task of directing the radiation coming from the illumination device 10 in the direction of the sample 22 and of transmitting radiation emitted by the sample.
  • a further optical device 46 is provided behind an image plane 44 on the detection side, which corresponds to the surface of the CCD line camera 30 in FIG. 1.
  • the optics device 46 has a mirror 48, which of the Sample 22 incoming radiation is deflected in the direction of a curved grating 50.
  • the curved grating 50 spectrally decomposes the luminescence emitted by the sample into the individual luminescence wavelength ranges.
  • the individual wavelength ranges are imaged in a second detection-side image plane 52 by the curved grating 50.
  • a line 54, 56 shown as a dot in FIG. 2 is depicted in the image plane 52 for each wavelength range. Since the sample is only excited by the illumination device 10 with electromagnetic radiation of certain wavelength ranges and the sample also only has dye markers of certain colors, the curved grating 50 does not result in a continuous spectral division, but rather a division into individual lines.
  • a CCD area camera can be arranged in the image plane 52 in order to detect the radiation emitted by the sample 22 in different wavelength ranges.
  • the individual lines 54, 56 imaged on the CCD area camera are spaced apart from one another since the entire spectrum is not imaged. It is thus possible in a simple manner to obtain information about the individual spectral ranges by reading out individual pixels or individual lines of the CCD area camera. By adding the pixels of one or more adjacent lines, the intensity of the luminescence in the corresponding wavelength range can be increased.
  • the individual spectral lines (54, 56) can then be used to form a histogram or a correlation calculation.
  • the embodiment shown in FIG. 3 corresponds to the embodiment described with reference to FIG. 2 with regard to the illumination device 10 and the excitation of the sample 12. Again, the sample is excited simultaneously in different wavelength ranges.
  • the detection device has a prism 60 for the spectral separation of the luminescence radiation emitted by the sample in the different wavelength ranges. With the help of a lens 62 upstream of the prism and The individual spectral lines 54, 56 are formed in the second image plane 52 of the detection device by a lens 64 connected downstream of the prism.
  • a CCD area camera can in turn be provided as a detector at the level of the image plane 52.
  • a preferred embodiment of the lighting device for generating line 14 is shown.
  • the imaging of the illumination line 14 generated by the illumination device into the sample and the detection of the luminescence radiation emitted by the sample can be carried out as described above with the aid of FIGS. 1 to 3 described.
  • the lighting device has lasers, not shown, which couple light into a fiber, which is divergently scattered by the fiber end 15.
  • a Powell lens 70 is provided in front of the image plane 12 on the illumination side.
  • the Powell lens 70 homogenizes the beam, i.e. homogenization over the length of the lighting line. With known Powell lenses, homogenization down to 5% can be achieved.
  • the Powell lens 70 is followed by a cylindrical lens 72. Since the Powell lens is an aspherical cylindrical lens, the divergence is greatly increased in one direction and not influenced in the other direction.
  • the divergent part of the beam can be collimated by the cylindrical lens 72.
  • a very sharp illumination line 14 can be realized with the aid of a second cylindrical lens 74, which is rotated through 90 ° with respect to the first cylindrical lens 72.
  • the resolution of the device according to the invention can be improved by increasing the sharpness of the illumination line 14.
  • the beam path from the fiber 15 is better collimated before it enters the Powell lens 70.

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Abstract

Die Vorrichtung zur Untersuchung chemischer und/oder bio-logischer Proben insbesondere in Suspension mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie weist eine die Probe aufnehmenden Probenträger (26) auf. Die Probe wird mit Hilfe einer Beleuchtungseinrichtung (10) zur Lumineszenz von in der Probe enthaltenen Partikeln angeregt. Mit Hilfe einer Optikeinrichtung (18) wird in der Probe (22) die linienförmige Beleuchtung abgebildet. Gegenüber einer punktförmigen Beleuchtung wird somit ein erheblich grösserer Teil der Probe bei gleichbleibender hoher Intensität je Beleuchtungspunkt angeregt. Ferner weist die erfindungsgemässe Vorrichtung eine Detektionseinrichtung (30) zur Detektion der von der Probe (22) entlang einer LInie abgegebenen Strahlung auf. Mit der Detektionseinrichtung (30) ist eine Auswerteeinrichtung (36) zur statistischen Auswertung der von der Detektionseinrichtung (30) detektierten Strahlung verbunden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben, insbesondere in Suspension, mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie.
Bei der Lumineszenz-Spektroskopie werden Proben, die beispielsweise Zellen, Beads, Vesikel, Aggregate, DNA-Stränge u.dgl. enthalten, mit elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Licht, angeregt und die aufgrund von Lumineszenz abgegebene Strahlung detektiert. Neben der von manchen Partikeln selbst hervorgerufenen Lumineszenz werden die Partikel insbesondere mit lumineszierenden Farbstoffmarkern markiert. Derartige Farbstoffmarker emittieren Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche in Abhängigkeit ihrer Bindung mit einem Partikel sowie in Abhängigkeit der Art des Partikels mit dem sie verbunden sind. Beispielsweise handelt es sich hierbei um Rezeptor- Ligand-Verbindungen. Hierbei werden beispielsweise mit einem Farbstoffmarker markierte Liganden eingesetzt. Mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie kann beispielsweise das Vorhandensein von Bindungen unterschiedlicher Partikel untersucht werden.
Die Lumineszenz-Spektroskopie wird insbesondere in der pharmazeutischen Wirkstoffforschung eingesetzt. Diese erfolgt vorzugsweise in Hoch-Durchsatzbzw. Medium-Durchsatz-Screening^Anlagen, in denen eine Vielzahl von Proben in kurzer Zeit untersucht werden. Häufig werden hierbei je Stunde über 1000 Proben untersucht. Hierzu werden beispielsweise Titerplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen (Wells) verwendet. Typische Titerplatten weisen 1536 oder 2080 Wells auf. Bei den Proben handelt es sich um Kleinstproben von zum Teil nur wenigen Mikrolitern je Probe. Insbesondere sind die Probenmengen kleiner als 50 μl, bevorzugt kleiner als 10 μl je Well.
Ein geeignetes Verfahren zur Messung der Lumineszenz-Intensitätsverteilung ist beispielsweise in WO 98/16814 beschrieben. Mit Hilfe dieses Verfahrens können aus einer heterogenen Helligskeitsverteilung einer Probe charakteristische Merkmale wie beispielsweise vorhandene Bindungen zwischen Molekülen, Konzentrationsverhältnisse sowie die Anzahl spezifischer Partikel in der Lösung bestimmt werden. Zur Durchführung dieses Verfahrens wird ein konfokales Mikroskop verwendet, das einen punktförmigen Fokus innerhalb der Probe erzeugt. Der Fokus wird durch eine Beleuchtungseinrichtung, insbesondere einen Laser erzeugt. Innerhalb des Punktfokus vorhandene Partikel insbesondere Farbstoffmarker werden durch die Strahlung zur Lumineszenz angeregt. Die von der Probe abgegebene Lumineszenzstrahlung wird von einer Detektionseinrichtung detektiert. Bei dem in WO 98/16184 beschriebenen Verfahren wird die Anzahl der Lumineszenzphotonen in einem Zeitintervall definierter Länge detektiert. Hieraus wird sodann eine Funktion der spezifischen Helligkeitsverteilung durch die Anzahl der Photonen pro Zeitintervall errechnet. Mit Hilfe dieser Messmethode können gute Messergebnisse hinsichtlich der Reaktion fluoreszenzmarkierter Partikel, beispielsweise Moleküle, erzielt werden. Es ist bei diesem Messverfahren nur bei langen Messzeiten möglich, eine aussagekräftige Statistik, beispielsweise über die jeweilige Anzahl einzelner unterschiedlicher Partikel in der Probe zu erhalten. Da insbesondere bei Hochdurchsatz-Screening-Verfahren zum Betreiben einer derartigen Anlage möglichst kurze Messzeiten realisiert werden müssen, sind derartige statistische Untersuchungen mit dem in WO98/16814 beschriebenen Verfahren sowie der beschriebenen Vorrichtung wirtschaftlich nicht möglich. Aus US 6 025 601 ist eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes einer Probe bekannt. Zur Erzeugung des Bildes muss die Probe auf einem Probenträger, beispielsweise einem herkömmlichen Objektträger aus Glas immobilisiert werden.' Der Probenträger ist in einem Probentisch eingespannt. Mit Hilfe einer Beleuchtungseinrichtung wird die Probe zeilenweise beleuchtet. Die einzelnen Linien der Zeilenbeleuchtung werden nacheinander von einer Detektionseinrichtung erfasst und mit Hilfe eines Computers zu einem Bild zusammengesetzt. Da mit dieser ein Bild einer Probe erzeugt werden soll, ist ferner ein Autofokus-Mechanismus erforderlich, um eine korrekte Scanhöhe einzuhalten. Das mit Hilfe der in US 6 025 601 beschriebenen Vorrichtung durchführbare Verfahren ist insbesondere nachteilig, da eine zeitaufwendige und kostenintensive Immobilisierung der Probe zwingend erforderlich ist. Da ein zeilenweiser Bildaufbau erfolgt, ist die Untersuchung einer Probe äußerst zeitintensiv. Ein derartiges Untersuchungsverfahren ist für das Screening, insbesondere das Hochdurchsatz-Screening, nicht geeignet.
In EP 0 501 008 ist ein sogenannter bildgebender Flow Cytometer beschrieben. Diese Vorrichtung weist eine Durchflusszelle auf, durch die die Probenflüssigkeit mit hoher Flussgeschwindigkeit bewegt wird. Die fließende Probe wird mit gepulstem Laserlicht oder Stroboskoplampen belichtet. Um ein Verschmieren oder Verwischen des Bildes zu vermeiden, sind sehr kurze Belichtungszeiten erforderlich. Mit Hilfe von Flow Cytometern ist es insbesondere nur mit aufwendiger Bildverarbeitung möglich, Proben zu untersuchen, die Partikel unterschiedlicher Größe aufweisen. Ferner weisen Flow Cytometer den Nachteil auf, dass aufgrund der großflächigen Detektion nur eine geringe Unterdrückung der Hintergrundstrahlung möglich ist. Insbesondere ist diese Vorrichtung nicht zur Untersuchung von kleinen Partikeln wie Mikro- und Nanopartikeln geeignet, da eine Unterscheidung einzelner kleiner Partikel nicht möglich ist. Ferner können kleine Partikel, die sich innerhalb oder an größeren Partikeln befinden, mit dieser Vorrichtung nicht detektiert werden. Ein weiterer Nachteil der Vorrichtung besteht darin, dass Durchflusszellen technisch aufwändig sind, da die Probe mit hoher Flussgeschwindigkeit bewegt werden muss. Bildgebende Flow Cytometer weisen üblicherweise einen punktförmig messenden Detektor auf, so dass von dem Detektor die gesamte Fluoreszenz der von den detektierten Partikeln abgegebenen Strahlung von dieser einen Detektoreinrichtung aufgenommen und aufintegriert wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie zu schaffen, mit denen bzw. mit dem Proben untersucht werden können, die Partikel unterschiedlicher Größe und/oder Helligkeit aufweisen. Insbesondere sollen kurze Untersuchungszeiten sowie aussagekräftige Statistiken erzielbar sein.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 7.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen eine beispielsweise flüssige Probe aufnehmenden Probenträger auf. Die Probe befindet sich insbesondere in Suspension. Die Probe wird mit Hilfe einer Beleuchtungseinrichtung beleuchtet, wobei die Beleuchtungseinrichtung derart ausgebildet ist, dass sie die in der Probe enthaltenen Partikel zur Lumineszenz anregt. Ferner weist die Vorrichtung eine Optikeinrichtung auf. Die Optikeinrichtung ist erfindungsgemäß derart ausgebildet, dass eine linienförmige Beleuchtung in der Probe erzeugt wird. Mit Hilfe einer Detektionseinrichtung erfolgt eine Detektion der von der Probe entlang dieser Linie abgegebenen Strahlung. Die Detektionseinrichtung weist erfindungsgemäß mehrere Einzeldetektoren auf. Die Detektionseinrichtung ist mit einer Auswerteeinrichtung zur statischen Auswertung der von der Detektionseinrichtung detektierten Strahlung verbunden.
Bei der Detektionseinrichtung handelt es sich vorzugsweise um eine CCD- Kamera, wobei die einzelnen Pixel oder Pixelgruppen der CCD-Kamera einen Einzeldetektor bilden. Die von den Einzeldetektoren wahrgenommene Strahlung wird in ein elektrisches Signal umgewandelt und an die Auswerteeinrichtung übermittelt. Es erfolgt somit mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine hochparallelisierte Bearbeitung bzw. Auswertung der von einer Vielzahl von Einzeldetektoren wahrgenommenen Strahlung.
Durch das erfindungsgemäße Vorsehen einer linienförmigen Beleuchtung einer flüssigen Probe ist eine hochparallelisierte Detektion von Partikeln in der Probe möglich. Im Unterschied zu einem punktförmigen Beleuchtungsvolumen in der Probe wird durch eine linienförmige Beleuchtung ein erheblich größerer Teil an Partikeln zur Lumineszenz angeregt. Da diese erfindungsgemäß durch eine eine linienförmige Detektion durchführende Detektionseinrichtung mit mehreren Einzeldetektoren aufgenommen wird, kann in kurzen Untersuchungszeiträumen eine Vielzahl an Informationen detektiert werden. Insbesondere bei der Verwendung von CCD-Sensoren, bei denen die einzelnen Pixel- oder Pixelbereiche, die Einzeldetektoren bilden, kann eine sehr hohe Anzahl parallelisierter Detektionen durchgeführt werden. Insbesondere können hierbei mehr als 200, vorzugsweise mehr als 500 und besonders bevorzugt mehr als 1000 Messungen gleichzeitig durchgeführt werden. Dies ist beispielsweise mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera, beispielsweise der unter der Bezeichnung DV 465 erhältlichen CCD-Kamera der Firma Andor oder einem APD-Zeilenarray möglich. Die einzelne Belichtungszeit beträgt hierbei vorzugsweise 5 bis 100 ms. Dies bedeutet, dass von einem derartigen Einzeldetektor bereits nach 5 bis 100 ms eine erneute Detektion durchgeführt werden kann.
Insbesondere können Proben, die Partikel mit unterschiedlicher Größe aufweisen, jeweils in kurzen Untersuchungszeiten untersucht werden, wobei hierbei gleichzeitig Partikel unterschiedlicher Größe untersucht werden können. Bei den Partikeln kann es sich um einzelne Moleküle bis hin zu Partikeln mit einigen 100 μm Durchmessern handeln. Aufgrund der linienförmigen Beleuchtung können auch bei sehr kleinen Diffusionsgeschwindigkeiten der Partikel und/oder bei Probenlösungen mit hoher Viskosität gute Messergebnisse bei kurzen Messzeiten erzielt werden.
Vorzugsweise werden CCD-Detektoren mit 576 Pixeln je Zeile verwendet, wobei insbesondere jedes Pixel als Einzeldetektor dient und einzeln ausgelesen wird. Es erfolgen somit 576 parallele Messungen gleichzeitig. Insbesondere ist es erfindungsgemäß wichtig, einen Detektor mit möglichst hoher Empfindlichkeit einzusetzen. Ebenso können auch CCD-Detektoren verwendet werden, die 2048 oder sogar 4096 Pixel je Zeile aufweisen. Die einzelnen Pixellängen bzw. -breiten betragen bei bevorzugt verwendeten CCD-Detektoren maximal 30 μm, vorzugsweise maximal 20 μm.
Bei großen Partikeln ist es mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglich, strukturelle Informationen über die Partikel zu gewinnen. Aufgrund der linienförmigen Beleuchtung ist es beispielsweise möglich, Informationen über einzelne Zellbereiche zu erhalten. Ferner weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine hohe Empfindlichkeit auf, so dass auch schwache Lumineszenzsignale detektiert werden können. Dies ist insbesondere bei der Analyse spezifischer Zellinformationen vorteilhaft. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass ein Immobilisieren der Partikel auf einem Glasträger oder ähnlichem nicht erforderlich ist, da mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine statistische Auswertung der detektierten Lumineszenzsignale von in Suspension befindlichen Partikeln erfolgt und kein Bild der Probe erzeugt wird. Aufgrund der linienförmigen Beleuchtung wird zur Erzielung einer aussagekräftigen Statistik eine ausreichende Anzahl an Partikeln durch das Messvolumen, d.h. den durch die linienförmige Beleuchtung angeregten Bereich der Probe, bewegt.
Durch das Verwenden der erfindungsgemäßen Vorrichtung können gute Statistiken erzielt werden. Eine gute, d.h. eine aussagekräftige Statistik liegt beispielsweise im Vergleich zu konfokalen Messverfahren vor. Konfokale Messverfahren weisen einen einzelnen Fokus auf, der sehr kleine Abmessungen hat, so dass typischerweise nur ein einziger Partikel gleichzeitig im Fokus beobachtet werden kann. Typische Messzeiten betragen hierbei 100 μs bis 1 ms pro Partikel. Es ergeben sich somit Gesamtmesszeiten von 1 bis 100 s. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird hingegen eine Linie beleuchtet, die vorzugsweise auf eine Zeile eines CCD-Detektors mit beispielsweise 576, 1280 oder mehr Pixeln abgebildet wird. Für kleine Partikel, bei denen kein oder nur ein geringer Crosstalk, d.h. Übersprechen von Pixel zu Pixel stattfindet, kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des später beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens bei gleichbleibender Leistung pro Pixel hingegen über einer Punktfokus-Messung ca. eine tausendfache Erhöhung der Datenmenge erreicht werden. Dies bedeutet, dass bei gleicher Aussagekraft der Statistik nur 1/1000 der Messzeit benötigt wird. Bei größeren Partikeln, die beispielsweise einige hundert μm groß sein können, kann trotz des auftretenden Crosstalks eine erhebliche, bis zu 500-fache Geschwindigkeitssteigerung erzielt werden.
Eine linienförmige Beleuchtung hat gegenüber einer punktförmigen Beleuchtung den Vorteil, dass die in der Probe befindlichen Partikel in einem größeren Bereich und insbesondere gleichzeitig zur Lumineszenz angeregt werden. Bei einer linienförmigen Beleuchtung handelt es sich somit um einen hochparallelisierten Messfokus.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist insbesondere den Vorteil auf, dass es sich um eine einfach aufgebaute Vorrichtung handelt. Dies führt zu einer höheren Betriebssicherheit als bei bekannten Vorrichtungen. Insbesondere bei der Messung von Suspensionen weist die Vorrichtung den Vorteil auf, dass eine geringere Datenmenge bearbeitet werden muss.
Vorzugsweise weist die Optikeinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mindestens eine Zylinderlinse zur Erzeugung der linienförmigen Beleuchtung auf. Da insbesondere in einem Laserstrahl die Intensitätsverteilung der Strahlung gaußförmig ist, ist beim Vorsehen einer einzelnen Zylinderlinse auch die Intensitätsverteilung in Längsrichtung der Beleuchtungslinie gaußförmig. Vorzugsweise wird daher nur der mittlere Bereich einer erzeugten Linie, in dem eine hohe Strahlungsintensität gewährleistet ist, verwendet. Erfindungsgemäß weist die Vorrichtung daher vorzugsweise eine die Länge der Beleuchtungslinie begrenzende Begrenzungseinrichtung auf. Die Randbereiche an der erzeugten Beleuchtungslinie, die eine geringe Intensität aufweisen, werden somit abgeschnitten. Als Begrenzungseinrichtung ist beispielsweise eine Blende geeignet. Hierdurch ist eine Homogenisierung der in der Probe erzeugten Beleuchtungslinie in ihrer Längsrichtung realisiert.
Eine derartige Homogenisierung ist ferner auch mit einer sogenannten Line- Generator-Linse oder einer Powellinse erreichbar.
Zur Homogenisierung der Beleuchtungslinie ist es auch möglich, mehrere Zylinderlinsen in der Optikeinrichtung vorzusehen. Diese Zylinderlinsen sind vorzugsweise nebeneinander angeordnet, so dass sie eine gemeinsame Beleuchtungslinie erzeugen. Der Abstand der einzelnen Zylinderlinsen ist hierbei vorzugsweise derart gewählt, dass sich von den einzelnen Zylinderlinsen erzeugte Bereiche mit geringer Intensität überlagern. Hierdurch ist eine Beleuchtungslinie erzeugbar, die in Längsrichtung eine homogenisierte hohe Intensität aufweist.
Zur Erzeugung einer möglichst homogenen Beleuchtungslinie ist es zusätzlich oder anstatt des Vorsehens einer oder mehrerer Zylinderlinsen auch möglich, eine Spaltblende vorzusehen, die von der Beleuchtungseinrichtung homogen beleuchtet wird. Auf der der Beleuchtungseinrichtung abgewandten Seite der Spaltblende ist somit eine homogene Beleuchtungslinie erzeugt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind zur Erzeugung einer homogenen Beleuchtungslinie mehrere optische Fasern vorgesehen, deren Faserenden entlang einer Linie angeordnet sind. Zur Erhöhung der Intensität können mehrere Reihen optischer Fasern nebeneinander angeordnet sein. Hierdurch wird die Breite der Beleuchtungslinie erhöht. Diese kann jedoch durch nachgeschaltete Linsen wieder auf die erforderliche jeweilige Breite reduziert werden. In die optischen Fasern wird mit Hilfe der Beleuchtungseinrichtung Strahlung der gewünschten Wellenlänge eingekoppelt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Detektionseinrichtung als konfokale Detektionseinrichtung ausgebildet. Hierdurch kann ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht werden, so dass auch bei schwachen Lumineszenz-Signalen Messungen durchgeführt werden können. Vorzugsweise weist die Detektionseinrichtung hierzu in Richtung des Strahlenganges vor einem Detektor eine Spaltblende auf. Die Lage und die Abmessungen der Spaltblende ist entsprechend an die Beleuchtungslinie in der Probe angepasst. Insbesondere bei der konfokalen Ausgestaltung der Detektionseinrichtung ist es vorteilhaft, Detektoren einzusetzen, die einzelne Photonen zählen können. Hierbei handelt es sich beispielsweise um ein APD-Zeilenarray.
Anstatt oder zusätzlich zu einer Spaltblende kann ein Zeilendetektor (APD- Zeilenarray, CCD-Zeilenkamera) vorgesehen sein. Auch ohne dem Vorsehen einer Spaltblende ist durch eine CCD-Zeilenkamera ein konfokaler Aufbau der Detektionseinrichtung realisiert. Anstatt einer CCD-Zeilenkamera kann auch eine CCD-Flächenkamera eingesetzt werden, deren Pixel einzeln oder zeilenweise auslesbar sind. Hierdurch ist es möglich, nur eine Zeile der CCD-Flächenkamera auszulesen, sodass auch durch die CCD-Flächenkamera ein konfokaler Aufbau der Detektionseinrichtung realisiert ist. Es ist auch möglich einzeln Zeilen, beispielsweise zwei Zeilen zu einer Zeile zusammenzufassen. Dies ist sowohl durch Software als auch durch Hardware möglich. Hierdurch erhöht sich jedoch das Signalrauschverhältnis, da die Signale einer Spalte, d.h. beispielsweise jeweils die Signale von zwei Pixeln zusammengefasst werden. Andererseits erhöht sich das Ausleserauschen der Kamera nicht. Dies tritt weiterhin nur einmal je Auslesevorgang auf. Ferner ist es durch das Verknüpfen von zwei oder mehr Zeilen zu einer Zeile möglich, die Spaltbreite eines konfokalen Systems zu variieren.
Um eine Probe untersuchen zu können, die beispielsweise unterschiedliche Farbstoffmarker aufweist, deren Anregung durch Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen erfolgt, ist die Beleuchtungseinrichtung vorzugsweise derart ausgebildet, dass sie Strahlungen zur Lumineszenzanregung in mehreren Wellenlängenbereichen, typischerweise im Bereich von 300-900 nm, erzeugt. Bei einer Anregung der Probe in mehreren Wellenlängenbereichen erfolgt in der Detektionseinrichtung vorzugsweise ein Aufteilen der einzelnen Lumineszenz- Wellenlängenbereiche. Hierzu kann die Detektionseinrichtung eine Optikeinrichtung aufweisen, die unabhängig von der Optikeinrichtung ist, durch die eine linienförmige Beleuchtung der Probe hervorgerufen wird. Vorzugsweise werden jedoch zumindest Teile der zur Erzeugung der Linienbeleuchtung vorgesehenen Optikeinrichtung auch für die der Detektionseinrichtung zuzuordnende Optikeinrichtung genutzt. Zur Aufteilung der unterschiedlichen Lumineszenz- Wellenlängen-Bereiche weist die Detektionseinrichtung vorzugsweise einen Spek- trographen auf. Dieser zerlegt die von der Probe abgegebene Strahlung in spektrale Anteile, so dass das Erfassen der Lumineszenzstrahlung je spektralem Anteil unabhängig voneinander erfolgen kann. Dies hat den Vorteil, dass durch eine einzige Anregung der Probe eine Vielzahl von Messergebnissen erzielt werden kann. Ein Beleuchten der Probe mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche in zeitlichem Abstand ist somit nicht erforderlich. Dies erhöht den Durchsatz insbesondere bei Hochdurchsatz-Screening-Anlagen erheblich.
Zur Detektion der unterschiedlichen Lumineszenz-Wellenlängenbereiche ist vorzugsweise eine CCD-Flächenkamera vorgesehen. Die einzelnen Wellenlängenbereiche werden durch geeignete optische Elemente aufgespalten, so dass auf der CCD-Flächenkamera unterschiedliche, insbesondere parallele Linien je Wellenlängenbereich erzeugt werden. Die einzelnen Zeilen der CCD- Flächenkamera, auf denen jeweils eine Spektral-Linie abgebildet ist, können unabhängig voneinander ausgelesen werden. Hierdurch ist auf einfache Weise die Detektion von Messdaten in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen realisiert.
Vorzugsweise weist die Detektionseinrichtung zum Aufteilen der Lumineszenz- Strahlung in unterschiedliche Wellenlängen-Bereiche mindestens einen dichroitischen Strahlteiler oder teildurchlässigen Spiegel auf. Eine weitere Möglichkeit zur spektralen Zerlegung der von der Probe abgegebenen Strahlung besteht darin, ein gekrümmtes Gitter vorzusehen. Dem mindestens einen dichroitischen Strahlteiler und/oder dem gekrümmten Gitter ist sodann entweder je Wellenlängenbereich ein Detektor oder wie vorstehend beschrieben eine CCD- Flächenkamera, bei der unabhängig voneinander mehrere Zeilen ausgelesen werden können, zugeordnet.
Es ist ferner möglich, die Probe mit linear polarisierter Strahlung anzuregen, wobei die Polarisierung der Strahlung vorzugsweise senkrecht oder parallel zur Einfallsebene ist. Dies kann zusätzlich oder anstelle der Anregung der Probe mit einem oder mehreren Wellenlängenbereichen erfolgen. Bei diesem Ausführungsbeispiel weist die Detektionseinrichtung vorzugsweise zwei Polfilter und einen Strahlteiler auf, durch den die unterschiedlich polarisierte von der Probe abgegebene Strahlung in unterschiedliche Polarisationsbereiche unterteilt wird. Vorzugsweise ist im Strahlengang ein Polarisationsstrahlteiler vorgesehen, der die Lumineszenz-Strahlung in die beiden Polarisationsrichtungen aufspaltet. Je nach verwendeter Ausführungsform des Polarisationsstrahlteilers kann beispielsweise ein CCD-Flächendetektor zur Detektion der Strahlung verwendet werden.
Die mit der Detektionseinrichtung verbundene Auswerteeinrichtung wertet die von der Probe abgegebene und von der Detektionseinrichtung detektierte Strahlung statistisch aus. Vorzugsweise wird die Probe erfindungsgemäß kontinuierlich beleuchtet. Die vorzugsweise verwendeten Detektoren, insbesondere CCD-Detektoren, weisen eine kurze Belichtungszeit auf. Die Zeilenbelichtung liegt hierbei vorzugsweise im Bereich von 16 μs bis 100 μs. Bei der Messung von Intensitätsverteilungen können auch langsamere Zeilenkameras eingesetzt werden, da diese Kameras nach der Belichtung, wenn es zu Totzeiten kommt, ausgelesen werden können. Je nach eingesetztem Auswerteverfahren kann es vorteilhaft sein, gepulste oder getaktete Belichtung vorzusehen. Dies ist insbesondere bei Lebenszeit-Messungen vorteilhaft. Beispielsweise wird bei speziellen Auswerteverfahren wie FCS (Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie) eine Flächenkamera bzw. ein Flächendetektor eingesetzt. Da dieser einen sehr hohen vertikalen dock speed aufweist, so dass sehr kurze Belichtungen möglich sind. Ferner ist es bei Flächendetektoren möglich, die Zeilen durchzutakten, ohne sie auszulesen, d.h. den Flächendetektor relativ zum Strahlengang der Belichtung zu verschieben, so dass eine Zeile nach der anderen belichtet wird. Erst wenn sämtliche oder eine vorgegebene Anzahl von Zeilen belichtet worden ist, wird der CCD-Detektor vollständig ausgelesen. Hierbei entsteht annähernd keine Lücke zwischen den einzelnen Belichtungen, so dass eine im Wesentlichen kontinuierliche Belichtung möglich ist. Innerhalb der Belichtungszeit des Detektors wird die Lumineszenz und/oder Polarität der Partikel bzw. der Farbstoffmarker, die sich durch die Beleuchtungslinie bewegen, erfasst. Gegenüber dem Stand der Technik besteht der Vorteil, dass eine Synchronisierung der Datenaufnahme beispielsweise mit der Bewegung eines Probentisches nicht erforderlich ist.
Vorzugsweise erfolgt durch die Auswerteeinrichtung eine Intensitätsverteilung unterschiedlicher von der Probe abgegebener Strahlungen. Es kann somit beispielsweise ermittelt werden, welche Partikel wie häufig in der Probe vorkommen und/oder welche Bindungen der Partikel wie häufig auftreten. Zusätzlich oder anstatt der Intensitätsverteilung können bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Auswerteeinrichtung auch Korrelationsverfahren durchgeführt sowie Histogramme erstellt werden. Es ist somit mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglich, eine Vielzahl von Informationen über die in der Probe vorhandenen Partikel in kurzer Zeit zu erlangen. Beispielsweise kann die Anzahl bzw. Konzentration spezifischer Teilchen und deren Bindungsverhältnisse mit Hilfe von Intensitätsverteilungen, Anisotropie-Analysen oder Momenten-Analysen untersucht werden (beispielsweise FIDA, FIMDA, C-Mafid). Ferner kann zum Beispiel die Auswertung der zeitlichen Korrelation der Partikel quer zur Beleuchtungslinie erfolgen. Bei kleinen Partikeln, deren Durchmesser im Wesentlichen der Breite der Beleuchtungslinie entspricht, kann ferner eine zeitliche Korrelation der Partikel entlang der Linie gemessen werden. Hieraus lässt sich insbesondere die Diffusionsgeschwindigkeit einzelner Partikel ermitteln. Bei größeren Partikeln kann die räumliche Korrelation entlang einer Datenzeile erfolgen, um beispielsweise strukturelle Dateninformationen über diese Partikel zu erhalten. Die Auswertung der räumlichen Korrelation liefert als Ergebnis beispielsweise die Korrelationslänge. Zusätzliche Informationen über die Partikel (beispielsweise Zellen, Beads oder Moleküle) können über Fluoreszenz- Lebenszeit-Messungen erlangt werden. Die Fluoreszenz-Lebenszeit-Messung kann mit einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden. Hierzu wird die Probe mit gepulstem Laserlicht angeregt. Der Detektor wird mit dem Laserpuls synchronisiert. Hierzu ist insbesondere die Verwendung von Avalanche-Fotodioden- (APD) Arrays vorteilhaft, da die Synchronisation mit diesen direkt durchführbar ist.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es ferner möglich, dass auch bei kleinen Partikeln innerhalb kurzer Messzeiten, von beispielsweise weniger als 100 Millisekunden gute Statistiken erzielt werden können. Insbesondere aufgrund der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielbaren guten Unterdrückung der Hintergrundstrahlung und aufgrund der hohen Parallelisierung durch Untersuchung der Probe entlang einer Beleuchtungslinie ist das Erzielen guter Statistiken möglich. Bei großen Partikeln kann, wie vorstehend beschrieben, eine Vielzahl von Strukturinformationen ermittelt werden. Dies ist beispielsweise durch Erstellen eines Histogramms möglich, so dass von spezifischen Zellteilen wie Zellkernen und Zellplasma strukturelle Rückschlüsse auf die Wirkung eines Wirkstoffs (z.B. Translakationsassay) bzw. die Bindung von Molekülen und Partikeln geschlossen werden können.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform weist die erfin- dungsgemäße Vorrichtung eine Bewegungseinrichtung auf, um eine Relativbewegung zwischen der in der Probe vorhandenen Partikeln sowie der Beleuchtungslinie zu realisieren. Durch eine derartige Bewegungseinrichtung ist es möglich, auch bei Partikeln mit sehr geringer oder keiner Diffusionsgeschwindigkeit gute Messdaten zu erzielen. Hierbei ist es nicht erforderlich, die Messzeiten zu verlängern. Eine Zerstörung der Partikel oder Farbstoffmarker aufgrund langer Belichtungszeiten wird somit vermieden.
Die Relativbewegung zwischen Probenpartikeln und der Beleuchtungslinie kann beispielsweise durch einen in der Optikeinrichtung vorgesehenen Kippspiegel, der als Bewegungseinrichtung zum Bewegen der Beleuchtungslinie dient, realisiert werden. Ebenso ist es möglich, den Probenträger mit Hilfe eines Scantisches o.dgl. zusätzlich oder anstatt der Bewegung der Beleuchtungslinie zu bewegen. Ferner können Durchflusszellen verwendet werden, in denen die Probe strömt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Laufbänder zur Bewegung des Probenträgers einzusetzen. Die Laufbänder sind beispielsweise aus durchsichtigem Kunststoff mit optischer Qualität hergestellt. In die Laufbänder ist die Probe vorzugsweise in einem vorherigen Arbeitsschritt, beispielsweise durch Aufdampfen fest eingebracht. Es ist ferner möglich, dass Vertiefungen, beispielsweise Wells einer entsprechend einer Titerplatte, in das Kunststoffband eingebracht, z.B. eingestanzt werden und anschließend mit einer Folie verschlossen werden. Weisen die Wells beispielsweise ein Volumen von weniger als 10 μl auf, so kann ein Tropfen aufgrund der Oberflächenspannung nicht mehr aus dem Well herauslaufen, selbst wenn das Laufband vor der Messung aufgewickelt wird.
Es ist ferner möglich, eine Bewegung der Partikel innerhalb einer Vertiefung des Probenträgers, wie beispielsweise einem Well einer Titerplatte zu realisieren. Auch eine derartige Bewegung der Probe führt zu einer Relativbewegung zwischen den in der Probe enthaltenen Partikeln und der Beleuchtungslinie. Hierzu können beispielsweise Rühreinrichtungen vorgesehen sein, die ein Bewegen der Probenflüssigkeit hervorrufen. Auch durch das Anlegen elektrostatischer oder magnetischer Felder von außen sowie das Vorsehen von Mikrorührern kann ein Bewegen der Partikel innerhalb der Probenaufnahme erfolgen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie das mit ihr durchführbare Messverfahren weist bei dieser Ausführungsform den Vorteil auf, dass die Strömungsgeschwindigkeiten in der Probe bzw. die Relativbewegung zwischen der Beleuchtungslinie und den Partikeln der Probe nicht mit der Datenaufnahme synchronisiert werden muss. Entscheidend für das Gewinnen guter Statistiken ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vielmehr die kurze Messzeit.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist vorzugsweise eine Steuereinrichtung zum Steuern von Belichtungszyklen auf. Die Belichtungszyklen können in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen erfolgen. Ferner kann durch die Steuereinrichtung die Belichtungszeit gesteuert werden. Die Steuereinheit gibt vorzugsweise lediglich die Belichtungszeit des Detektors und den Auslesetakt vor. Wenn, wie vorstehend beschrieben mehrere Zeilen nacheinander belichtet und erst anschließend ausgelesen werden, gibt die Steuereinheit zusätzlich noch den vertikal dock speed vor. Ggf. steuert die Steuereinheit den Scanntisch, und/oder eine Rühreinrichtung und/oder einen Galvoscanner. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Vorrichtung für Hochdurchsatz- Screening-Anlagen geeignet. Hierbei werden die Proben vorzugsweise in Titterplatten mit einer Vielzahl von Vertiefungen (Wells) angeordnet. Derartige Titterplatten weisen beispielsweise 1536 oder 2080 Vertiefungen auf. Die in jedem Well vorgesehene Probenmenge ist hierbei insbesondere kleiner als 10 μl, vorzugsweise kleiner als 5 μl. Die in einem derartigen Well angeordnete Beleuchtungslinie weist hierbei vorzugsweise eine Länge von 500-1000 μm sowie eine Breite von ca. 1-2 μm auf.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben, insbesondere in Suspensionen mit Hilfe der Lumineszenzspektroskopie. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt eine linienförmige Beleuchtung der vorzugsweise in Suspension befindlichen Probe mittels einer Beleuchtungseinrichtung. Die von der Probe entlang einer Linie abgegebene Strahlung wird im nächsten Schritt insbesondere mittels einer Detektionseinrichtung, die mehrere Einzeldetektoren aufweist, detektiert. Erfindungsgemäß werden somit räumlich getrennte Teilbereiche der linienförmigen Strahlung von Einzeldetektoren aufgenommen. Durch die Einzeldetektoren wird die empfangene Strahlung in elektrische Signale umgewandelt. Die von den einzelnen Detektoren abgegebenen Signale werden sodann parallel bearbeitet bzw. ausgewertet. Hierdurch ist ein hochparallelisiertes Auswerteverfahren geschaffen.
Erfindungsgemäß werden somit parallel bzw. gleichzeitig eine Vielzahl von Messungen durchgeführt. Dies erfolgt beispielsweise, indem mehrere Messungen nebeneinander in einer Reihe . erfolgen. Hierbei entspricht die linienförmige Beleuchtung der Probe einer Vielzahl von einzelnen nebeneinander angeordneten Messpunkten. Insbesondere bei Einsatz der vorstehend beschriebenen Vorrichtung liegt jeder einzelne dieser Messpunkte in einem Fokus. Vorzugsweise wird durch Kombination der linienförmigen Beleuchtung mit einer konfokal angeordneten Blende im Detektionsstrahlengang, insbesondere einer Schlitzblende oder einem schlitzförmigen Detektor, auch in Richtung der optischen Achse eine räumliche Begrenzung der Messvolumina erreicht.
Zusätzlich zu einem parallelen, d.h. gleichzeitigen, Erfassen mehrerer Messungen erfolgt vorzugsweise je Messpunkt ein Erfassen und statistisches Auswerten zeitlich aufeinanderfolgender Messwerte. Dies erfolgt vorzugsweise mit Hilfe jedes Einzeldetektors, bei dem es sich insbesondere um einzelne Pixel oder Pixelgruppen eines CCD-Detektor handeln kann. Vorzugsweise erfolgt hierbei eine statistische Auswertung der Intensitäten zu unterschiedlichen Messzeitpunkten. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist . es somit möglich, in kurzer zeitlicher Abfolge Messungen an ein und derselben Stelle in der Probe durchzuführen und zusätzlich mehrere derartige Messfolgen nebeneinander an unterschiedlichen Messpunkten durchzuführen. Insbesondere ist es bei Verwendung der im vorherigen Absatz beschriebenen konfokalen Messanordnung möglich, beispielsweise Anzahl, Fluktuationen von Molekülen, Zellen, Aggregaten oder anderen Partikeln, in den durch die konfokale Anordnung definierten kleinen Messvolumina zu beobachten.
Erfindungsgemäß ist es ferner möglich, Auswertungen zwischen mehreren Messwertfolgen, die beispielsweise in räumlich benachbarten Messvolumina aufgenommen werden, durchzuführen. Dies ist insbesondere bei Fluktuationsmessungen vorteilhaft und erlaubt beispielsweise die Analyse räumlicher Korrelationen innerhalb der untersuchten Proben. Die Dauer einer Messung ist vorzugsweise kleiner als 10 ms und besonders bevorzugt kleiner als 1 ms. Vorzugsweise folgen die Einzelmessungen jeweils ohne zeitlichen Abstand direkt aufeinander. Wahlweise kann zwischen den Einzelmessungen jeweils ein zeitlicher Abstand liegen. In diesem Fall wird eine schlechtere Statistik der Messsignale bei gegebener Gesamtmessdauer in Kauf genommen; die technische Realisierung kann jedoch für bestimmte Detektortypen vereinfacht werden. Dies kann insbesondere durch Verwenden der vorstehend beschriebenen Vorrichtung, insbesondere unter Verwendung von CCD-Detektoren mit sehr kurzen Auslesezeiten, erzielt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere, wie vorstehend anhand der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschrieben, vorteilhaft weitergebildet. Insbesondere erfolgt ein schnelles Auslesen der Einzeldetektoren, wobei als Einzeldetektoren vorzugsweise einzelne Pixel oder Pixelgruppen eines CCD- Detektors, insbesondere einer Avalanche-Fotodiode verwendet werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische prinzipielle Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 eine schematische prinzipielle Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Detektionseinrichtung,
Fig. 4 eine schematische prinzipielle Darstellung in Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Beleuchtungseinrichtung, und
Fig. 5 eine schematische prinzipielle Darstellung der in Fig. 4 dargestellten Beleuchtungseinrichtung in Draufsicht.
Die in Fig. 1 dargestellte prinzipielle Anordnung der einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist stark vereinfacht und enthält nur die wesentlichen Bestandteile der Vorrichtung. Mit Hilfe einer Beleuchtungseinrichtung 10 wird in einer beleuchtungsseitigen Bildebene 12 eine Linie 14 erzeugt. Die Linie 14 wird über einen dichroitischen Strahlteiler oder einen teildurchlässigen Spiegel 16 in Richtung einer Optikeinrichtung 18 gelenkt. Mit Hilfe der Optikeinrichtung 18 wird eine linienförmige Beleuchtung 20 in einer Probe 22 erzeugt. Die Probe 22 ist in einer mehrere Wells 24 aufweisenden Titterplatte 26 angeordnet. Hierbei ist die Beleuchtungslinie derart innerhalb der Probe 22 angeordnet, dass die Ränder der Wells 24 vorzugsweise nicht berührt werden. Ferner ist die Beleuchtungslinie gegenüber einer transparenten, beispielsweise aus Glas bestehenden Bodenplatte 28 derart angeordnet, dass auch die Bodenplatte 28 von der Beleuchtungslinie 20 nicht berührt wird. Hierdurch sind negative Einflüsse der Bodenplatte 28 und/oder der Wände der Wells 24' ausgeschlossen.
Bei dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel dient die Optikeinrichtung 18 nicht nur dazu, die von der Beleuchtungseinrichtung 10 erzeugte Strahlung in der Probe 22 abzubilden, sondern auch dazu, die von den in der Probe vorhandenen Partikeln abgegebene Lumineszenzstrahlung in Richtung einer Detektionseinrichtung 30 zu lenken. Hierbei wird die von der Probe abgegebene Strahlung durch den dichroitischen Strahlteiler nicht abgelenkt. Auf der Detektoreinrichtung 30, bei der es sich beispielsweise um eine CCD-Zeilenkamera handelt, wird eine Linie 32 abgebildet. Zur Abbildung der Linie 32 kann, wenn es sich bei der Detektoreinrichtung 30 nicht um eine CCD-Zeilenkamera handelt, eine Spaltblende in dem Strahlengang vor dem Detektor 30 vorgesehen sein. Bei Verwendung einer CCD-Zeilenkamera als Detektoreinrichtung 30 stellt die Kamerazeile selbst die Blende eines konfokalen Aufbaus dar. Die in den einzelnen Pixeln der CCD-Zeilenkamera auftretenden Messsignale werden über eine Leitung 34 oder mehrere Leitungen von der Detektionseinrichtung 30 an die Auswerteeinrichtung 36 übermittelt. Mit Hilfe der Auswerteeinrichtung 36 erfolgt eine statische Auswertung, beispielsweise hinsichtlich der Intensitätsverteilung. Die Ausweiteeinrichtung 36, bei der es sich vorzugsweise um einen Computer handelt, kann ferner zur Steuerung der Beleuchtungseinrichtung 10 und ggf. weiterer in der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehener zu steuernder Bauelemente genutzt werden.
Anstelle einer Optikeinrichtung 18, die sowohl zum Abbilden der von der Beleuchtungseinrichtung 10 erzeugten Beleuchtungslinie 20 in der Probe 22 und dem Abbilden der Lumineszenzstrahlung auf die Detektionseinrichtung 30 dient, können auch zwei gesonderte Optikeinrichtungen vorgesehen werden. Hierbei wird mit Hilfe der einen Optikeinrichtung die Abbildung der Beleuchtungslinie 20 in die Probe 22 realisiert und mit der anderen Beleuchtungseinrichtung die Abbildung der Lumineszenzstrahlung auf die Detektionseinrichtung 30. Beispielsweise kann die Beleuchtung der Probe 22 von der bezüglich Fig. 1 gegenüberliegenden Seite des Probenträgers 26 erfolgen. Das Vorstehen zweier gesonderte Optikeinrichtungen hat den Vorteil, dass diese beispielsweise auf die Beleuchtungswellenlänge und die Lumineszenzwellenlänge besser abgestimmt werden können. Es handelt sich hierbei jedoch um eine teurere Vorrichtung, da zwei getrennte Optikeinheiten erforderlich sind.
Zur Anregung der in der Probe 22 befindlichen Partikel bzw. Lumineszenzmarker ist insbesondere eine Laserlichtanregung geeignet.
Bei Verwendung von Optikeinrichtungen mit großer numerischer Apertur kann eine beugungsbegrenzte Beleuchtungslinie 20 innerhalb der Probe 22 realisiert werden. Hierdurch kann eine hohe Auflösung sowie eine gute Unterdrückung der Hintergrundstrahlung erzielt werden. Vorzugsweise werden bei der Erfindung Optikeinrichtungen mit einer numerischen Appertur eingesetzt, die höher als 0,7, insbesondere höher als 0,9 ist. Beispielsweise werden bei einem 20-fach Objektiv mit einer numerischen Appertur von 0,7 oder einem 40-fach Objektiv mit einer numerischen Appertur von 0,95 sehr gute Messergebnisse erzielt. Bei der abbildenden Optikeinrichtung handelt es sich beispielsweise um einen typischen Mikroskopaufbau, in dem ein Objektiv und eine Tubuslinse kombiniert ist.
Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsform sind identische oder ähnliche Bauteile der Vorrichtung mit denselben Bezugszeichen wie in Fig. 1 bezeichnet. Die Beleuchtungseinrichtung weist in diesem Beispiel fasergekoppelte Laser 15 auf. Der Aufbau der Beleuchtungseinrichtung in Verbindung mit der Optik 38, die Linsen 70-76 aufweist, entspricht dem anhand Fig. 4 beschriebenen Aufbau. Die Strahlen werden mit Hilfe einer Optik 38 gebündelt und erzeugen wiederum in der beleuchtungsseitigen Bildebene 12 eine - in Fig. 2 als Punkt dargestellte - Linie 14. Die Optik 38 ist hierbei Bestandteil der Optikeinrichtung 18, die im dargestellten Ausführungsbeispiel ein Objektiv 40 sowie eine Tubuslinse 42 aufweist, um die Beleuchtungslinie 20 in der Probe 22 abzubilden.
Die Beleuchtungseinrichtung ist in dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel ferner derart aufgebaut, dass sie in nicht dargestellten Lasern Laserlicht in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erzeugt, das dann divergent aus dem Faserende 15 austritt. Somit werden beispielsweise in der Probe 22 enthaltene unterschiedliche Farbstoffmarker gleichzeitig zur Lumineszenz angeregt.
Entsprechend dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel wird die von den in der Probe 22 vorhandenen Partikeln abgegebene Strahlung durch den dichroitischen Strahlteiler transmittiert. Der dichroitische Strahlteiler 16 hat entsprechend dem in Fig. 1 dargestellten Strahlteiler 16 wiederum die Aufgabe, die von der Beleuchtungseinrichtung 10 kommende Strahlung in Richtung der Probe 22 zu lenken und von der Probe abgegebene Strahlung zu transmittieren. Hinter einer detektionsseitigen Bildebene 44, die in Fig. 1 der Oberfläche der CCD-Zeilenkamera 30 entspricht, ist eine weitere Optikeinrichtung 46 vorgesehen. Die Optikeinrichtung 46 weist einen Spiegel 48 auf, der die von der Probe 22 kommende Strahlung in Richtung eines gekrümmten Gitters 50 umlenkt. Durch das gekrümmte Gitter 50 erfolgt eine spektrale Zerlegung der von der Probe abgegebenen Lumineszenz in die einzelnen Lumineszenz- Wellenlängenbereiche. Durch das gekrümmte Gitter 50 werden die einzelnen Wellenlängenbereiche in eine zweite detektionsseitige Bildebene 52 abgebildet. In der Bildebene 52 wird je Wellenlängenbereich eine in Fig. 2 als Punkt dargestellte Linie 54,56 abgebildet. Da die Probe von der Beleuchtungseinrichtung 10 nur mit elektromagnetische Strahlung bestimmter Wellenlängenbereiche angeregt wird und die Probe ferner nur Farbstoffmarker bestimmter Farben aufweist, erfolgt durch das gekrümmte Gitter 50 keine kontinuierliche spektrale Aufteilung sondern eine Aufteilung in einzelne Linien.
In der Bildebene 52 kann zur Detektion der von der Probe 22 abgegebenen Strahlung in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen eine CCD-Flächenkamera angeordnet sein. Die einzelnen auf der CCD-Flächenkamera abgebildeten Linien 54,56 weisen einen Abstand zueinander auf, da nicht das gesamte Spektrum abgebildet wird. Es ist somit auf einfache Weise möglich, durch Auslesen einzelner Pixel bzw. einzelner Zeilen der CCD-Flächenkamera Informationen über die einzelnen spektralen Bereiche zu erhalten. Durch das Addieren der Pixel einer oder mehrerer benachbarter Zeilen kann die Intensität der Lumineszenz in dem entsprechenden Wellenlängenbereich erhöht werden. Mit den einzelnen spektralen Linien (54,56) kann sodann die Bildung eines Histogramms oder eine Korrelationsberechnung erfolgen.
Die in Fig. 3 dargestellte Ausführungsform entspricht hinsichtlich der Beleuchtungseinrichtung 10 und der Anregung der Probe 12 beispielsweise der anhand Fig. 2 beschriebenen Ausführungsform. Es erfolgt wiederum eine Anregung der Probe gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Zur spektralen Auftrennung der von der Probe abgegebenen Lumineszenz-Strahlung in den unterschiedlichen Wellenlängenbereichen weist die Detektonseinrichtung ein Prisma 60 auf. Mit Hilfe einer dem Prisma vorgeschalteten Linse 62 sowie einer dem Prisma nachgeschalteten Linse 64 werden die einzelnen Spektrallinien 54,56 in der zweiten Bildebene 52 der Detektionseinrichtung gebildet. Als Detektor kann auf Höhe der Bildebene 52 wiederum eine CCD-Flächenkamera vorgesehen sein.
In den Fign. 4 und 5 ist eine bevorzugte Ausführungsform der Beleuchtungseinrichtung zum Erzeugen der Linie 14 dargestellt. Das Abbilden der durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugten Beleuchtungslinie 14 in die Probe sowie das Detektieren der von der Probe abgegebenen Lumineszenz-Strahlung kann wie vorstehend anhand der Fign. 1 bis 3 beschrieben, erfolgen.
Die Beleuchtungseinrichtung weist nicht dargestellte Laser auf, die in eine Faser Licht einkoppeln, das divergent von dem Faserende 15 gestreut wird. Vor der beleuchtungsseitigen Bildebene 12 ist eine Powell-Linse 70 vorgesehen. Durch die Powell-Linse 70 erfolgt eine Homogenisierung des Strahlenbündels, d.h. eine Homogenisierung über die Länge der Beleuchtungslinie. Mit bekannten Powell- Linsen kann eine Homogenisierung bis auf 5 % erreicht werden. Zur Bestimmung der geforderten Länge der Beleuchtungslinie 20 innerhalb der Probe 22 ist der Powell-Linse 70 eine Zyliriderlinse 72 nachgeschaltet. Da es sich bei der Powell- Linse um eine asphärische Zylinderlinse handelt, wird die Divergenz in der einen Richtung stark vergrößert und in der anderen Richtung nicht beeinflusst. Durch die Zylinderlinse 72 kann der divergente Teil des Strahlenbündels kollimiert werden. Mit Hilfe einer zweiten Zylinderlinse 74, die gegenüber der ersten Zylinderlinse 72 um 90° gedreht ist, ist eine sehr scharfe Beleuchtungslinie 14 realisierbar. Durch Erhöhung der Schärfe der Beleuchtungslinie 14 kann die Auflösung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbessert werden.
Mit Hilfe einer der Powell-Linse 70 vorgeschalteten Linse 76 erfolgt eine bessere Kollimierung der Bündelung des Strahlengangs aus der Faser 15 vor dem Eintritt in die Powell-Linse 70.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, mit den Schritten:
Beleuchten der Probe entlang einer Linie mittels einer Beleuchtungseinrichtung (10) zur Lumineszenzanregung von einer Partikel enthaltenden Probe (22),
Detektieren der von der Probe (22) entlang einer Linie abgegebenen Strahlung, wobei räumlich getrennte Bereiche der entlang einer Linie abgegebenen Strahlung von Einzeldetektoren aufgenommen werden,
Umwandeln der empfangenen Strahlung in elektrische Signale durch die Einzeldetektoren und
paralleles statistisches Auswerten der von den Einzeldetektoren erzeugten Signale.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem je , Einzeldetektor zeitlich aufeinanderfolgende Messwerte, insbesondere Intensitätsmesswerte, statistisch ausgewertet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem mehr als 200, insbesondere mehr als 500 und besonders bevorzugt mehr als 1000 Messungen in einer Probe parallel durchgeführt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, bei welchem Auswertungen, insbesondere Vergleiche, Korrelationen oder Koinzidenzanalysen, zwischen mehreren parallel zueinander durchgeführten Messfolgen durchgeführt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, bei welchem die Dauer einer einzelnen Messung kleiner als 10 ms, insbesondere kleiner als 1 ms, ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, bei welchem zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen kein zeitlicher Abstand ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, bei welchem als Einzeldetektoren die Pixel oder Pixelgruppen eines CCD-Detektors oder eines Photodiodenarrays, insbesondere eines Avalanche-Detektors verwendet werden.
8. Vorrichtung zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, mit
einem die Probe (22) aufnehmenden Probenträger (26),
einer Beleuchtungseinrichtung (10) zur Lumineszenzanregung von in der Probe (22) enthaltenen Partikeln,
einer Optikeinrichtung (18) zur Abbildung einer linienförmigen Beleuchtung (22) in der Probe,
eine mehrere Einzeldetektoren aufweisende Detektionseinrichtung (30) zur Detektion der von der Probe (22) entlang einer Linie abgegebenen Strahlung, und
einer mit der Detektionseinrichtung (30) verbundenen Auswerteeinrichtung (36) zur statistischen Auswertung der von der Detektionseinrichtung (30) detektierten Strahlung.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektionseinrichtung ein CCD-Detektor oder ein Photodiodenarray vorgesehen ist, wobei jedes Pixel einer Detektorzeile als Einzeldetektor oder eine Gruppe von Pixeln jeweils als Einzeldetektor dient.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Pixel bzw. Pixelgruppen von der Auswerteeinrichtung parallel ausgewertet werden.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) mindestens eine Zylinderlinse zur Erzeugung einer Beleuchtungslinie (20) in der Probe (22) aufweist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) zur Homogenisierung der Beleuchtungslinie (14) über ihre Länge eine Begrenzungseinrichtung aufweist, die derart ausgebildet ist, dass nur ein Mittenbereich mit hoher Intensität der von der Zylinderlinse erzeugten Linie in die Probe (22) gelenkt wird.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens fünf Zylinderlinsen oder ein Zylinderlinsen-Array mit mehr als 100 Zylinderlinsen zur Erzeugung einer gemeinsamen Beleuchtungslinie (20) vorgesehen sind.
14. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) eine Line-Generator-Linse und/oder eine Powell-Linse aufweist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Optikeinrichtung (18) zur Erzeugung einer Linienbeleuchtung (20) eine von der Beleuchtungseinrichtung (10) beleuchtete Spaltblende aufweist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Optikeinrichtung mehrere, vorzugsweise mindestens vier und besonders bevorzugt mindestens 20 optische Fasern aufweist, deren Faserenden entlang einer Linie angeordnet sind und die Beleuchtungseinrichtung (10) Strahlung in die Faserenden einkoppelt.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) Laserlicht erzeugt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-17, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) als konfokale Detektionseinrichtung ausgebildet ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) in Richtung des Strahlengangs vor einem Detektor eine Spaltblende aufweist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-19, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) einen Zeilendetektor, insbesondere eine CCD-Kamera oder ein- oder zweidimensionale Zeilenkamera aufweist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) Strahlung zur Lumineszenzanregung in mehreren vorzugsweise drei Wellenlängenbereichen, insbesondere 488,531 und 633 nm, erzeugt.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) einen Spektrographen aufweist, der die von der Probe abgegebene Strahlung in spektrale Anteile zerlegt.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) einen zweidimensionalen Detektor, vorzugsweise eine CCD-Flächenkamera aufweist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-23, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) mindestens einen dichroitischen Strahlteiler oder mindestens einen teildurchlässigen Spiegel (16) aufweist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-24, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) zur spektralen Zerlegung der von der Probe abgegebenen Strahlung ein gekrümmtes Gitter (50) aufweist.
26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) für jeden Wellenlängenbereich einen Detektor, vorzugsweise eine CCD-Kamera oder Zeilenkamera aufweist.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-26, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) linear polarisierte Strahlung erzeugt.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (30) mindestens ein Polarisationsfilter und vorzugsweise mehrere Detektoren und/oder mindestens einen zweidimensionalen Detektor aufweist.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-28, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung (36) eine Intensitätsverteilung unterschiedlicher von der Probe abgegebener Strahlungen, insbesondere gesondert für einzelne Spektralbereiche durchführt.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-29, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung (36) ein Korrelationsverfahren durchführt.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-30, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinrichtung (36) ein Histogramm erstellt.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-31, gekennzeichnet durch eine Bewegungseinrichtung zum Bewegen der Beleuchtungslinie (20) relativ zur Probe (22).
33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Bewegungseinrichtung einen Kippspiegel aufweist.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-33, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungseinrichtung (10) mit einer Steuereinrichtung zum Steuern von Beleuchtungszyklen verbunden ist.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8-34, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger (26) mehrere jeweils eine Probe aufnehmende Vertiefungen aufweist.
36. Verwenden der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7-35 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-6, insbesondere zur Durchführung von FIDA-, FIMDA-, C-Mafid- und/oder Lifetime- Untersuchungen.
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